JP4104665B2 - Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ診断薬 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に細菌性診断技術に関する。特に、本発明は、生物学的試料においてH.pylori感染を正確に検出するため、およびH.pylori感染した患者の抗体的処置の経過をモニタするための方法に関する。
発明の背景
元の名称がCampylobacter pyloriであるヘリコバクターピロリは、高いウレアーゼ活性とカタラーゼ活性を示す、湾曲した、微好気性の、グラム陰性細菌である。最近の研究は、H.pyroli感染が、Ｂ型胃炎、十二指腸潰瘍、そして胃ガンの原因か、またはコファクターのいずれかになり得ることを示唆する。例えば、Blaser、Gastroenterology（1987）93:371-383;Dooleyら、New Eng.J.Med.（1989）321:1526-1566;Personnetら、New Eng.J.Med.（1991）325:l127-l131を参照のこと。この点について、H.pyroliは、ヒト胃粘膜を転位増殖し、そして十年間持続し得る感染の原因となる。この条件を有する多くの人々は無症候性であるが、しかし十二指腸潰瘍そして／または胃腺ガンへ進展する無視できないリスクがある。H.pyloriおよび胃性疾患におけるその役割の総説に関して、Telfordら、Trends in Biotech.（1994）12:420-426およびBlaser,M.J.,Scientific Americam（February 1996）:104-107を参照のこと。
H.pylori細菌は、特殊なタンパク質の存在または非存在に基づいてI型とII型に分けられる。この点について、H.pyloriは、感染を確立し、そして維持するために機能するいくつかの因子を生じる。例えば、I型とII型細菌の両方が、胃の胃粘膜層の運動性を助ける鞭毛を含む。細菌の両方の型はまた、おそらく、胃の酸性環境を中和するためのウレアーゼを産生する。さらに、細菌の２つの型は、多くの組織特異的コロニー形成を生じる。一方、H.pylori型I株のみが、CagA、CAI抗原またはtagAとして周知の細胞毒性発現と関連する表面−露出免疫優性抗原と同様、VacAまたはCTとして公知である細胞毒素を生じる。VacAそしてCagAの説明に関して、International Publication No.WO 93/18150,1993年９月16日発行、を参照のこと。
十二指腸潰瘍をもつ患者は、VacAとCagAに対する抗体を産生することが示されており、抗体価は疾患の重症度と関係するようである。例えば、ある研究で、十二指腸潰瘍または十二指腸炎をもつ患者の９５％以上、そして胃潰瘍をわずらっている患者の70％以上は、CagA血清陽性であることがわかった。Telfordら，Trends in Biotech.（1994）12:420-426。さらに、相関関係がCagA血清反応と胃潰瘍との間に示されている。Telfordら、前出。加えて細胞毒性株のみは、実験動物モデルにおいて胃傷害を生じ得る。例えば、Telfordら、J.Exp.Med.（1994）179:1653-1658を参照のこと。従って、H.pylori I型に感染した個体のみが重篤な疾患へ進展する。
いくつかの分析は、H.pylori感染の診断に関して進展している。これらの分析は、多くの障害から不運に見舞われている。例えば、細菌培養分析は、H.pyloriの検出に関して記載されてきている。米国特許番号第5,498,528は、サルビア中のH.pyloriのような検出に関する方法を記載する。この分析は、H.pyloriの選択的増殖を支持するような培養培地を使用して、試験サンプルをインキュベートすることを要求する。細菌の存在は、上述したように、H.pyloriが産生される酵素ウレアーゼの活性により検出される。ウレアーゼは、培養培地のpH増加の原因となるアンモニウムへの尿素の変化を触媒化する。pH変化は、pH感受性インジケーターの存在により、培地への色の変化により検出し得る。しかしながら、細菌は生長に数日を要求するので、この分析は、時間消費が大きい。この分析は、また不便であり、そして細菌サンプルは、分解されるかまたは研究室への輸送の間にコンタミネーションされる。
抗体検出試験は、細菌培養の代わりの物を提供する。この事については、H.pyloriによりコロニー化される被験体は、体液性免疫反応を増加させて、そして診断の基礎として使用され得る細菌に対する抗体を産生する。IgA抗体は胃液中でみられる一方、IgG抗体は循環中にみられる。しかし、そのような試験は、H.pyloriがCamplycobacter jejuniおよびC.coliと抗原的に交差反応性であるようであるので特異性の欠失を被り得る。
米国特許第4,882,271号は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）において、ウレアーゼ活性を有する交差反応性を伴う問題を回避する試みで、300kDaから700kDaのオーダーの、高分子量細胞結合タンパク質を利用するH.pyloriアッセイを記載する。
国際公開番号WO 96/12965（1996年５月２日公開）は、免疫ブロットアッセイを記述する。ここでは、血清学的サンプルが、19.5kDa、26.5kDaまたは30kDaの分子量を有する２つの抗原成分と反応させられるか、または35kDa、89kDa、116kDaまたは180kDaの分子量に対応する任意の１つの抗原成分と反応させられる。19.5kDaタンパク質がフェリチン様タンパク質であり、26.5kDaおよび30kDaのタンパク質がウレアーゼであり、89kDaタンパク質がVacAであること、ならびに116kDaのタンパク質がCagAであることが発明者により提唱される。35kDaおよび180kDaは特徴付けされなかった。
最後に、欧州特許公開第329,570号1989年８月23日公開は、いくつかのH.pylori株の超音波処理物のプールされた懸濁物を使用する感染ならびに精製されたH.pylori鞭毛を使用する免疫アッセイに関して記載する。
細菌培養よりも早くそしてより高感度であるけれども、上記のような抗体検出試験は、偽陽性と偽陰性の結果を生じ得、そしてH.pylori I型とH.pylori II型感染とを一般的に区別できない。従って、感染がH.pylori I型によるものかもしくはII型によるものかを決定するために付加的な試験が実施されなければならない。
従って、I型感染とII型感染とを容易に区別するH.pyloriに関する正確で効果的な分析の広範囲に広がる利用性は、症候性個体と無症候性個体との両方における感染の診断に関して重要となり得る。
発明の要旨
本発明は、H.pylori感染を診断するための、ならびにH.pylori I型感染とH.pylori II型感染とを区別するために簡便で極めて正確で、効果的な方法を提供する。従って、この方法は、H.pylori I型感染を有する個体のスクリーニングに関する技術を提供する。I型感染が検出される場合、個体は、Ｂ型胃炎、ペプチド性潰瘍、そして胃ガンを処置するかまたは抑制する抗生剤を与えられ得る。この方法はまた、H.pylori感染を有する患者における処置経過のモニタリングに有用である。このアッセイ法は、型−共通抗原ならびに細菌由来の特別型−特異的抗原の両方を利用する。
従って、１つの実施態様では、本発明は、H.pylori感染の検出方法に関し、以下の工程を含む：
（a）生物学的サンプルを提供する工程；
（b）生物学的サンプルに存在する場合、H.pylori抗体がH.pylori型−共通抗原および／または型−特異的抗原と結合する条件下で、１つまたはそれより多いH.pylori−共通抗原と生物学的サンプルとを反応させる工程および１つまたはそれより多い精製されたH.pylori I型抗原と生物学的サンプルとを反応させる工程、
それによって、H.pylori感染の存在または非存在を検出する工程。
他の実施態様では、本発明は、生物学的サンプル中のH.pylori I型とH.pylori II型感染とを区別する方法、またはHelicobacter pylori感染に対する治療を受ける被験体をモニタリングする方法に関する。その方法は以下を含む：
（a）１つまたはそれより多いH.pylori型−共通抗原例えば、H.pylori溶解物および／またはH.pyloriウレアーゼを固定化する工程、ならびに１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原例えば、H.pyloriVacAおよび／またはH.pyloriCagAをニトロセルロース片（strip）上に固定化すること；
（b）生物学的サンプル中に存在する場合、抗H.pylori I型抗体および抗H.pylori II型抗体が溶解物中のH.pylori型−共通抗原およびまたは型−特異的H.pylori I型抗原と結合する条件下で、工程（a）のニトロセルロース片と生物学的サンプルとを接触させる工程；
（c）結合しない抗体を除去する工程；
（d）検出可能に標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を提供する工程；および、
（e）生物学的サンプル中の結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体の存在もしくは非存在を検出する工程、
それによって、H.pylori I型またはH.pylori II型感染の存在または非存在を検出する工程。
特に好ましい実施態様において、生物学的サンプルは、ヒト血清サンプルである。
さらに好ましい実施態様において、本発明は、分散して固定化された、１つまたはそれより多いH.pylori型−共通抗原および１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原を含む膜支持体に関する。
他の実施態様では、本発明は、以下を含有するニトロセルロース支持体に関する；
（a）H.pylori I型VacAポリペプチド；
（b）H.pylori I型CagAポリペプチド；
（c）H.pyloriウレアーゼ；および
（d）ヒトIgG、
ここでH.pyloriポリペプチドおよびウレアーゼ、ならびにヒトIgGは、上記ニトロセルロース支持体上に分散型バンドとして固定化される。
さらなる実施態様では、本発明は、以下を含有するニトロセルロース支持体に関する：
（a）H.pylori I型VacAポリペプチド；
（b）H.pylori I型CagAポリペプチド；
（c）H.pylori溶解物；ならびに
（d）ヒトIgG
ここでH.pyloriおよび溶解物、ならびにヒトIgGは、上記ニトロセルロース支持体上に分散型バンドとして固定化される。
他の実施態様では、本発明は、H.pylori感染を検出するための免疫診断試験キットに関する。このキットは、（a）１つまたはそれより多いH.pylori型−共通抗原；（b）１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原；および（c）免疫診断試験を実施するための説明書からなる。
さらなる実施態様では、本発明は生物学的サンプル中のH.pylori I型とH.pylori II型感染とを区別するための、またはヘリコバクターピロリ感染に対する治療を受ける個体をモニタリングするための免疫診断試験キットに関する。この試験キットは、（a）ニトロセルロース片に固定化された１以上のH.pylori型−共通抗原、例えば、H.pylori溶解物および／またはH.pyloriウレアーゼ；（b）ニトロセルロース片に固定化された１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原例えば、H.pylori VacAおよび／またはH.pylori CagA；そして、（ｃ）免疫診断試験を実施するための説明書を含む。
本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮して当業者に容易に思い浮かぶ。
【図面の簡単な説明】
図１は、ストリップ（strip）イムノブロットアッセイ（SIA）に使用するための代表的な試験片（strip）を示す。ヒトIgGは、２つの異なるレベル（レベルI、低コントロール；そしてレベルII、高コントロール）の内部コントロールとして使用される。CagAおよびVacAは、型−特異的H.pylori I型抗原として使用され、そしてHP CEは、型−共通抗原を有するH.pylori溶解物を示す。
図２は、SIAに使用するための別の代表的な試験片を示す。上述のように、ヒトIgGは、２つの異なるレベル（レベルI、低コントロール；そしてレベルII、高コントロール）の内部コントロールとして使用される。CagAおよびVacAは、型−特異的H.pylori I型抗原として使用され、そしてまた、同様に、アッセイ感度を増強するため、ならびに処置に対する応答をモニタする２つの異なるレベルで使用される。ウレアーゼは、型−共通抗原として使用される。
図3A-3B（配列番号： ）は、実施例に記載されるSIAで使用される、H.pyloriVacA抗原に関するヌクレオチド配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す。
図4（配列番号： ）は、実施例に記載されるSIAで使用される、H.pyloriCagA抗原に関するヌクレオチド配列とそれに対応するアミノ酸配列を示す。
発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術間の免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技術を使用する。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（第２編、1989）；DNA Cloning:A Practical Approach I＆II巻（D.Glover編）；Methods In Enzymology（S.ColowickとN.Kaplan編、Academic Press,Inc.）；そしてHandbook of Experimental Immunology I-IV巻（D.M.WeirとC.C.Blackwell編Blackwell Scientific Publications）を参照のこと。
本明細書中および添付請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の参照体を包含する。加えて、ヌクレオチドとアミノ酸の標準的略号は本明細書で使用される。
I．定義
本発明の記述において、以下の言語が使用され、そして以下に記載されるように、定義されることが意図される。
「H.pylori溶解物」によって、以下に規定されるように、H.pylori I型とII型の両方に対して生成された抗体と反応する、１つまたはそれより多いH.pyloriポリペプチドを含むH.pylori I型またはII型全細菌に由来する抽出物または溶解物を意味する。このようなポリペプチドは、本明細書中の「型−共通」抗原と称される。従って、本明細書中で使用される場合、用語「溶解物」は、少なくとも溶解物中に存在する抗原の１つが型−共通抗原である限りは、いくつかのH.pylori抗原を有する粗抽出物を表す。この溶解物は、さらに精製した型−共通および／または型−特異的抗原を増強され得る。この用語はまた、１つまたは２、３のこのような型−共通抗原のみを含有する粗溶解物に由来する比較的に精製された組成物を示す。このような溶解物は、さらに以下で記載されるように、当該分野で公知の技術を使用して調製される。
単独または組合せのいずれかのこのような溶解物中に存在し得る代表的な抗原は、H.pylori付着因子（例えば、20kDa N-アセチルノイラミニラクトース−結合原線維赤血球凝集素（HpaA）、ホスファチジルエタノールアミンおよびガングリオテトラオシルセラミドと結合する63kDaタンパク質、および保存されたフィンブリン線毛様構造に由来する１つまたはそれより多い型−共通抗原エピトープを含むが、これらに限定されない。例えば、これらの抗原の説明に関して、Telfordら、Trends in Biotech.（1994）12:420-426を参照のこと。溶解物中に存在し得る他の型−共通抗原は、主要フラゲリンFlaAと微量なフラゲリンFlaBのような種々のフラゲリンのいくつかに由来する１つまたはそれより多い型−共通抗原エピトープを含有する。この点に関して、H.pyloriの鞭毛は、それぞれ約53kDaの分子量を有するFlaAおよびFlaBから構成される。FlaAそして／またはFlaBのいずれかまたは両方が、本発明での使用のための型−共通抗原の供給源として使用され得る。別の代表的な型−共通抗原は、細菌の外膜と周辺質のスペースと会合されるH.pyloriウレアーゼを含む。ホロ酵素は、それぞれ、26.5kDa（UreA）と61kDa（UreB）の２つのサブユニットから構成される大きな複合体である。サブユニットまたは３つの組合せのいずれかのホロ酵素に由来する型−共通エピトープは、型−共通抗原として存在し得る。溶解物中に存在し得るか、またはさらに精製された形態で使用され得る別の代表的な型−共通抗原は、「hsp60」として知られるH.pylori熱ショックタンパク質を含む。hsp60に関するDNAおよびそれに対応するアミノ酸配列は公知である。例えば、国際公開番号WO93/18150、1993年９月16日公開を参照のこと。示される全長のhsp60抗原は、約546のアミノ酸および約58kDaの分子量を有する。この溶解物は、本明細書において特に記載されない、他の型−共通抗原を含み得ると理解される。
「型−特異的H.pylori I型抗原」によって、以下に記載されるように、H.pylori I型に対する抗体と優位に反応するが、H.pylori II型に対する抗体とは反応しないH.pylori I型に由来するポリペプチドが意味される。代表的な型−特異的H.pylori I型抗原は以下のものを含む：CTとしても知られるH.pylori VacA；ならびにCAI抗原およびtagAとしても知られるH.pylori CagA；ならびにH.pylori I型に対する抗体と反応し得るが、H.pylori II型に対する抗体とは反応しないこれらの抗原に由来するエピトープ。VacAおよびCagAの両方とも、以下でさらに記載される。本明細書において特に記載されない他の型−特異的H.pylori I型抗原もまた、この定義により取り囲まれると理解し得る。
上記のような、VacA、CagAまたは任意の他の型特異的もしくは型共通抗原のような、型−共通または型−特異的H.pylori抗原に関して使用される場合、用語「ポリペプチド」は、天然、組換えまたは合成のいずれであろうが、多くのH.pylori株のいずれかに由来するVacA、CagAなどを表す。型−特異的H.pylori I型抗原の場合、このポリペプチドは、H.pylori I型株に由来する。型−共通抗原の場合、そのポリペプチドは、H.pylori I型またはII型のいずれかに由来し得る。このポリペプチドは、参照分子の全長アミノ酸配列を含むことを必要としないが、ポリペプチドが適切なH.pylori抗体と反応するために必要である大きさの分子のみを含み得る。従って、参考分子のただ１つまたは２、３のエピトープが存在すべき必要性がある。さらに、このポリペプチドは、全長参考分子または参考分子のフラグメントとH.pyloriポリペプチドの反応性を崩壊しない別のタンパク質との間の融合タンパク質を含み得る。従って、このポリペプチドが、フラグメント、切断された配列および部分的な配列ならびに参考分子のアナログおよび前駆体形態全長配列を含み得ることは容易に明らかである。この用語はまた、ポリペプチドがH.pylori抗体と反応する能力を保持する限り、参考配列の欠損、付加ならびに置換を意味する。
この点について、特に好ましい置換は、一般に本質的に保存的であり、すなわち、それらの側鎖に関係するアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。詳細には、アミノ酸は、一般に４ファミリーに分けられる：（1）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（2）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（4）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、セリンでのスレオニンの単離された置換体、または構造上関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似した保存的置換が、生物学的活性に主要な影響を有しないということは、合理的に予測され得る。それゆえ、参照タンパク分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の抗体結合能力に実質的に影響しない微小なアミノ酸置換を所有するタンパク質は、参照ポリペプチドの定義範囲内である。
「VacAポリペプチド」により、H.pylori I型細胞毒として公知である抗原から誘導され、そしてH.pylori I型に対する抗体と主に反応するが、H.pylori I型とは反応しない、先に定義したポリペプチドを意味する。VacAタンパク質は、組織培養中の上皮細胞において空胞化を誘導し、また広範囲の組織損傷の原因となり、そしてマウスへ経口投与した場合、潰瘍形成の原因となる。VacAのDNAとこれに対応するアミノ酸配列は公知であり、そして例えば、1993年９月16日に公開された国際公開第WO 93/18150号に報告されている。VacAポリペプチドの遺伝子は、約90〜100kDaの活性分子にプロセシングされる約１40kDaの前駆体をコードする。この分子は、次に、ゆっくりとタンパク質分解的に切断される完全な90kDa分子と同時精製される２つのフラグメントを生じる。Telfordら、Trends in Biotech.（1994）12:420-426を参照のこと。従って、本明細書中で使用される「VacAポリペプチド」の定義には、前駆体タンパク質、ならびにH.pylori I型感染を有する個体由来の生物学的サンプルに存在する抗体との特異的な反応性を保持する、プロセシングされた活性分子、そのタンパク質分解性フラグメント、またはその部分もしくはそのムテインが含まれる。例えば、図3A-3Bに示され、そして本明細書中に記載されるアッセイに使用されるVacAポリペプチドは、全長分子のGly-311からIle819までのVacAフラグメント（全長分子を含む）を含み、これは、組み換え体発現を促進するために、ヒトSODの５アミノ酸から154アミノ酸のリンカー配列により融合される。
「CagAポリペプチド」により、H.pylori I型細胞毒関連免疫優性抗原から誘導され、そして主にH.pylori I型に対する抗体と反応するが、H.pylori II型とは反応しない、先に定義したポリペプチドを意味する。CagAは、細菌表面に発現される。CagAのDNAとこれに対応するアミノ酸配列は公知である。例えば、1993年９月16日に公開された国際公開第WO 93/18150号、を参照のこと。そこで記載される全長CagA抗原は、約128kDaの推量分子量を有する約1147アミノ酸を含む。天然のタンパク質は、プロリンリッチなアミノ酸配列の繰り返しをコードする、102bpのDNAセグメントの可変数の繰り返しの存在により、種間でサイズの多様性を示す。Covacciら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1993）90:5791-5795を参照のこと。従って、CagAの報告された分子量は、約120〜135kDaの範囲内である。それゆえ、本明細書中で使用される「CagAポリペプチド」の定義には、H.pylori I型感染を有する個体由来の生物学的サンプル中の抗体と反応する能力を保持するが、H.pylori II型に対して生成した抗体と実質的に反応しない、任意の種々のCagA改変体、そのフラグメント、およびそのムテインが含まれる。例えば、図４に示され、そして本明細書に記載のアッセイで使用されるCagAポリペプチドは、268アミノ酸の短縮型タンパク質であり、全長分子のGlu-748〜Glu-1015（全長分子を含む）を含む。
「エピトープ」により、特異的Ｂ細胞およびＴ細胞が応答する抗原の部位を意味する。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。エピトープは、エピトープに独特の空間的コンフォメーションにおいて、３個以上のアミノ酸からなり得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、そしてより通常、少なくとも８〜10個のようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定するための方法は、当業者に公知であり、Ｘ−線結晶学および２−次元核磁気共鳴が含まれる。さらに、所与のタンパク質のエピトープの同定は、疎水性研究の使用により、そして部位特異的血清学によるような、当該分野で周知の技法を使用して容易に達成される。例えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1984）81:3998-4002（所与の抗原において免疫原性エピトープの位置を決定するためのペプチドを迅速に合成する一般的方法）；米国特許第4,708,871号（抗原のエピトープを同定しそして化学的に合成するための手順）；およびGeysenら、Molecular Immunology（1986）23:709-715（所与の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技法）もまた参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗原の結合をブロックするための１つの抗体の能力を示す簡便な免疫アッセイにおいて同定され得る。
「精製された」タンパク質またはポリペプチドは、組換え的にまたは合成的に産生される、または組成物中に存在するタンパク質量が、粗調製物中に存在量よりも実質的に多いように、天然の宿主から単離されるタンパク質である。一般に、精製されたタンパク質は、少なくとも約50%均一であり、そしてより好ましくは、少なくとも約80%から90%均一である。
本明細書中で使用されるように、「生物学的サンプル」は、固体から単離される組織または液体のサンプル、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆液、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚の外分泌液、気道、腸管、および尿生殖路、ならびに、胃上皮および胃粘膜由来のサンプル、涙、唾液、乳、血液細胞、器官、生検を含むが、これらに限定されない。そしてまた例えば、培養培地での細胞および組織の増殖から生じる馴化培地（例えば、組換え細胞）および細胞成分を含むがしかし限定されないインビトロ細胞培養成分のサンプル。
本明細書で使用されるように、用語「標識」および「検出し得る標識」は、検出可能な分子（放射活性同位体、蛍光剤、化学発光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド、（例えば、ビオチンまたはハプテン）などを含むが、これらに限定されない）をいう。用語「蛍光剤」は、検出可能領域に蛍光を示し得る物質またはその部分をいう。本発明下で使用され得る標識の具体例には、フルオロセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクラディマムエステル（acradimum ester）、NADPH、およびα−β−ガラクトシダーゼが含まれる。
II．発明の実施態様
本発明は、H.pylori感染を正確に検出し、そしてH.pylori I型感染とH.pylori II型感染とを識別するための新規の診断法の発見に基づく。この方法は、精製されたか、または細菌に由来する溶解物に存在するかのいずれかの１つ以上のH.pylori型−共通抗原、ならびに精製型−特異的H.pylori抗原を利用する。型−共通のそして型−特異的抗原の両方の使用は、偽陽性結果の出現率を減少させる。この方法は、単一アッセイに、感染の検出および存在する感染型の同定の両方を可能にする簡便な１工程アッセイ形式で実施し得る。この方法はまた、サンプルをまず、H.pylori型−共通抗原と反応させ、そして陽性の場合には、１つ以上の型−特異的I型抗原と反応させる、２工程で実施され得る。この方法はまた、型−特異的II型抗原を使用し得る。
さらに具体的には、H.pylori型−共通抗原の使用は、一般に、H.pylori感染の診断を可能にする。１つ以上の型−特異的抗原の存在は、細菌型、すなわち、感染がH.pylori I型および／またはH.pylori II型によって引き起こされるか否かの決定を可能にする。H.pylori型−共通抗原の存在により、陽性結果は、型決定が可能でないサンプルにおいてさえ生じる。それゆえ、偽陰性の出現率は減少される。さらに、H.pylori I型感染が存在する場合、個体は、B型胃炎、十二指腸潰瘍、そして胃ガンの処置または抑制のために抗生物質を投与され得る。さらに、本明細書で記載されるアッセイは、抗生物質治療が効果的か否かを決定するために、被験体の処置の過程のモニターに有用である。
被験体診断技術における使用のための抗原は、種々の技術の使用を生じ得る。
例えば、型−共通抗原は、当該分野で周知の方法を使用して得られ得る溶解物中で提供され得る。一般に、このような方法は、超音波処理、プレッシャーディスインテグレーション（pressure disintegration）、界面活性剤抽出、分画化などを使用して、H.pylori I型細菌またはH.pylori II型細菌のいずれか由来の型−共通タンパク質を抽出することを必要とする。このような溶解物中に存在する型−共通抗原は、標準的精製技術を使用して、所望される場合、さらに精製され得る。このような方法における使用のためのH.pylori株は、American Type Culture Collection（ATCC,Rockville,MD.）を含むいくつかの供給源から容易に入手可能である。例えば、ATCC株名NCTC 11637、11639、および11916は溶解物の供給源としての使用を見出す。別の有用な株は、当該分野で公知である。
型−特異的H.pylori I型抗原はまた、標準的精製技法を使用して得られ得る。この点から、特定の抗原は、カラムクロマトグラフィー、電気泳動法、HPLC、免疫吸着法、アフィニティークロマトグラフィーおよび免疫沈降法のような標準精製技法を使用して、I型H.pylori潰瘍産生株から単離され得る。例えば、H.pylori由来のいくつかの抗原の精製の説明に関しては、1996年５月２日に公開された国際公開第WO 96/12965号を参照のこと。例えば、ATCC株名NCTC 11916は、H.pyloriのI型潰瘍産生株であり、そして、それゆえ、本発明の使用に関して、１つまたはそれを超える型−特異的抗原の供給源として使用され得る。
H.pylori抗原はまた、当該分野で周知の組換え方法を使用して産生し得る。この点に関して、オリゴヌクレオチドプローブは、H.pyloriゲノムの公知の配列に基づいて創案され得、本発明において有用な抗原をコードするH.pylori遺伝子に関するゲノムまたはcDNAライブラリーをプローブするために使用され得る。次いで、この遺伝子は、標準的技術を使用して、そして所望される場合には、全長配列の所望部位で遺伝子を変異させるために用いられる制限酵素を使用して、さらに単離され得る。
同様に、H.pylori遺伝子は、フェノール抽出のような公知の方法を使用して、細菌性細胞から直接単離され得、そして、この配列は任意の所望の改変を生じるためにさらに操作され得る。DNAを得、そして単離するために使用される技術の説明に関しては、例えば、Sambrookら、前出、を参照のこと。最終的に、H.pylori抗原をコードする遺伝子は、公知の方法に基づいて、合成的に産生し得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に関する適切なコドンを用いて設計し得る。一般に、当業者は、配列が発現される意図する宿主のための好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法により調製されるオーバーラップするオリゴヌクレオチドから一般に組立てられ、そして完全なコドン配列へアセンブリされる。例えば、Edge,Nature（1981）292:756;Nambairら、Science（1984）223：1299;Jayら、J.Biol.Chem.（1984）259:6311を参照のこと。
一旦、所望のポリペプチドのコード配列が、単離または合成されると、それらは、昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルスおよび酵母の発現系（これらは全て当該分野で周知である）を含む、種々の系についての任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。特に、宿主細胞は、所望のコード配列に作動可能に連結されたコントロール配列を含有する発現ベクターにより形質転換される。
コントロール配列は、使用される特別な宿主細胞と適合性である。例えば、哺乳動物細胞発現に関して代表的なプロモーターには、とりわけ、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような他の非ウイルスプロモーターもまた、哺乳動物構築物における使用を見出す。哺乳動物発現は、プロモーターに依存して、恒常的であるかまたは制御されている（誘導性である）かのいずれかであり得る。代表的には、転写終止およびポリアデニル化配列はまた、転写終止コドンの３’側に位置して存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例には、SV40（Sambrookら、前出）由来のものが含まれる。スプライスドナーおよびアクセプターの部位を有するイントロンはまた、本発明の構築物へと設計され得る。
エンハンサーエレメントはまた、発現レベルを増加させるために哺乳動物構築物において使用され得る。例には、SV40初期遺伝子エンハンサー（Dijkemaら、EMBO J.（1985）4:761））およびRous Sarcomaウイルス（Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1982b）79:6777）の長末端反復（LTR）に由来するエンハンサー／プロモーターおよびヒトサイトメガロウイルス（Boshartら、Cell（1985）41:521）が含まれる。シグナルペプチドをコードする配列を含むリーダー配列もまた存在し得、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供する。好ましくは、リーダーフラグメントと目的の遺伝子との間に、リーダー配列がインビボまたはインビトロのいずれかで切断され得るように、コードされるプロセッシング部位が存在する。アデノウイルストリパタイト（tripartite）リーダーは、哺乳動物細胞中の外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
一旦完了すると、哺乳動物発現ベクターは、任意のいくつかの哺乳動物細胞の形質転換に使用され得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、当該分野で公知であり、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのDNAの直接的マイクロインジェクションを包含する。
発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞系はまた、公知であり、そしてチャイニーズハムスター卵巣細胞、KeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞性ガン細胞（例えば、Hep G2）、およびその他を含むがこれらに限定されないAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含する。
本発明の構築物はまた、酵母中で発現し得る。酵母ベクターのコントロール配列は、当該分野で公知であり、そしてアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）（欧州特許公報第284,044号）、エノラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPまたはGAPDH）プロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、3-ホスホグリセレートムターゼプロモーター、およびピルベートキナーゼ（PyK）プロモーター（欧州特許公報第329,203号）のようなプロモーターを含む。酸ホスファターゼをコードする酵母PHO5遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供する（Myanoharaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:1）。加えて、天然に生じない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターの上流活性化配列（UAS）が、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する。このようなハイブリッドプロモーターの例には、GAP転写活性化領域に連結されるADH調節領域が含まれる（米国特許第4,876,197号および同第4,880,734号）。ハイブリッドプロモーターの他の例には、GAPもしくはPyK（欧州特許公報第164,556号）のような糖分解酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わされたADH2、GAL4、GAL10またはPHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが含まれる。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼに結合し、そして転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に生じるプロモーターを含み得る。
酵母発現ベクターに含まれ得る他のコントロールエレメントは、ターミネーター（例えば、GAPDH由来およびエノラーゼ遺伝子（Holland,J.Biol Chem.（1981）256:1385）由来）、および分泌物のためのシグナル配列をコードするリーダー配列である。適切なシグナル配列をコードするDNAは、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開第012,873号;JPO公開第62,096,086号）およびα−因子遺伝子（米国特許第4,588,684号、同第4,546,083号、および同第4,870,008号；欧州特許公開第324,274号；PCT公開第WO89/02463号）のような分泌された酵母タンパク質遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーはまた、酵母における分泌を提供する（欧州特許公開第060,057号）。
染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかである、発現ベクターおよび形質転換ベクターは、多くの酵母への形質転換に関して開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母に関して開発されている：Saccharomyces cerevisiae（Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1978）75:1929;Itoら、Ｊ.Bacteriol.（1983）153:163）；Saccharomyces carlsbergenenis;Candida albicans（Kurtzら、Mol.Cell.Biol.（1986）6:142）；Candida maltosa（Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25:141）；Hansenula polymorpha（Gleesonら、J.Gen.Microbiol.（1986）132:3459;RoggenkampらMol.Gen.Genet.（1986）202:302）；Kluyveromyces fragilis（Dasら、J.Bacteriol.（1984）158:1165）；Kluyveromyces lactis（De Louvencourtら、J.Bacteriol.（1983）154:737;Van den Bergら、Bio/Technology（1990）8:135）；Pichia guillerimondii（Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25:141）；Pichia pastoris（Creggら、Mol.Cell.Biol.（1985）5:3376；米国特許第4,837,148号および同第4,929,555号）；Schizosaccharomyces pombe（BeachおよびNurse、Nature（1981）300:706）；およびYarrowia lipolytica（Davidowら、Curr.Genet.（1985）10:380471;Gaillardinら、Curr.Genet.（1985）10:49）。
酵母宿主への外来DNAの導入方法は、当該分野で周知であり、代表的には、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオンで処理された完全な酵母細胞の形質転換のいずれかを包含する。
細菌発現系はまた、本発明の構築物とともに使用され得る。細菌における使用のためのコントロールエレメントは、オペレーター配列およびリボソーム結合部位を必要に応じて含むプロモーターを含有する。有用なプロモーターには、ガラクトース、ラクトース（lac）およびマルトースのような糖代謝酵素に由来する配列が含まれる。さらなる例には、トリプトファン（trp）のような生合成酵素、b-ラクタマーゼ（bla）プロモーター系、バクテリオファージλPL、およびT5に由来するプロモーター配列が含まれる。さらに、天然に生じないtacプロモーター（米国特許第4,551,433号）のような合成プロモーターはまた、細菌宿主細胞におけると同様に機能する。
前述の系は、E.coliと特に適合性である。しかし、とりわけ、Bacillus spp.、Streptococcus spp.、およびStreptomyces spp.のような細菌宿主における使用のための多数の他の系がまた公知である。これら宿主への外来DNAの導入のための方法は、代表的には、CaCl2または、二価カチオンおよびDMSOのような他の薬剤の使用を包含する。DNAはまた、エレクトロポーレーションにより細菌細胞へ導入され得る。
所望の抗原の発現のための他の系には、昆虫細胞およびこれら細胞における使用に適切なベクターを含む。最も一般的に使用される系は、バキュロウイルスAutographa californica多核体病ウイルス（AcNPV）に由来する。一般に、発現系の成分はトランスファーベクター、通常は、細菌プラスミド（これはバキュロウイルスゲノムのフラグメントおよび発現される異種遺伝子または遺伝子の挿入のための便利な制限部位の両方を有する）を含む。；トランスファーベクター（これはバキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組換えを可能にする）においてバキュロウイルス特異的フラグメントと相同な配列を有する野生型バキュロウイルス；ならびに、適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
ベクターにおける使用のためのプロモーターは、代表的に構造遺伝子由来であり、ウイルスの感染周期の後期に豊富に転写される。例としては、ウイルスポリヘドロン（polyhedron）タンパク質をコードする遺伝子由来の配列が含まれる（Friesenら、（1986）「The Regulation of Baculovirus Gene Expression」：The Molecular Bioligy of Baculoviruses（Walter Doerfler編）；欧州特許公開番号第127,839号および第155,476号；ならびに、p10タンパク質をコードする遺伝子Vlakら、J.Gen.Virol.（1988）69:765）。また、プラスミドは通常、ポリヘドリン（polyhedrin）ポリアデニル化シグナルを含有（Millerら、Ann.Rev.Microbiol.（1988）42:177）し、そして原核生物アンピシリン耐性（amp）遺伝子ならびにE.coliの選択および増殖のための複製起点を含む。適切なシグナル配列をコードするDNAもまた、含まれ、そして一般的に、分泌型昆虫タンパク質または分泌型バキュロウイルスタンパク質（例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Carbonellら、Gene（1988）73:409）、ならびに哺乳動物シグナル配列（例えば、ヒトα-インターフェロンをコードする遺伝子由来の配列（Maedaら、Nature（1985）315:592）；ヒトガストリン放出ペプチド（Lebacq-Verheydenら、Molec.Cell.Biol.（1988）8:3129；ヒトIL-2（Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）82:8404；マウスIL-3（Miyajimaら、Gene（1987）58:273；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Martinら、DNA（1988）7:99）の遺伝子由来である。
現在、外来遺伝子をAcNPVに導入するために最も一般的に用いられる導入ベクターは、pAc373である。また、当業者に公知の多くの他のベクターが、設計されている。これらには、例えば、pVL985（これはポリヘドリン開始コドンをATGからATTに変更し、そしてATTから32bp下流にBamHIクローニング部位を導入する；LuckowおよびSummers、Virology（1989）17:31を参照のこと）。
所望のDNA配列は、公知の技術（SummersおよびSmith、前出;Smithら、Mol.Cell.Biol.（1983）3:2156；ならびにLuckowおよびSummers（1989）を参照のこと）を使用して導入ベクターに挿入され、そして昆虫細胞宿主は、導入ベクター、および野生型バキュロウイルスのゲノムDNAの異種DNAを用いて、同時形質転換される（通常、同時トランスフェクションによる）。ベクターおよびウイルスゲノムは、組み換えが可能である。パッケージされた組換えウイルスが発現され、そして組換え体のプラークが同定され、精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形式で、例えばInvitrogen,San Diego CA（「MaxBac」キット）から、市販されている。これらの技術は一般に、当業者に公知であり、SummersおよびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555（1987）（本明細書中以下「SummersおよびSmith」）に、充分に記載されている。
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、種々の昆虫細胞への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に：Aedes aegypti、Autographa californica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia ni、について開発されている。
上記の系を用いて調製されたポリペプチドは融合ポリペプチドであることが、しばしば所望される。非融合型タンパク質を用いる場合、これらのタンパク質は細胞内で発現され得るか、または細胞から増殖培地へ分泌され得る。
さらに、例えば、マルチプルタイプ特異的H.pylori I型抗原、またはマルチプルタイプ共通抗原をコードするキメラ遺伝子配列を含むプラスミドが、構築され得る。遺伝子配列は、２シストロン遺伝子配置中に存在し得る。付加的な制御エレメントは、遠位コード領域からのRNAの翻訳に効果的な種々の遺伝子の間に適合され得る。あるいは、複数の抗原をコードする、単一のオープンリーディングフレームを有するキメラ転写単位もまた、構築され得る。融合物が、キメラタンパク質の合成を可能にするように作製され得、あるいはタンパク質プロセシングシグナルが、プロテアーゼによる切断を提供するように操作され得、従って、鋳型RNAの翻訳由来の２つ以上のタンパク質の遊離を可能にする。プロセシングプロテアーゼはまた、この系において、独立して、または抗原コード領域（単数もしくは複数）を有するキメラの一部としてのいずれかで発現され得る。
また、ウイルス系、例えばワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系もまた、Tomeiら、J.Virol.（1993）67:4017-4026およびSelbyら、J.Gen.Virol.（1993）74:1103-1113に記載されるように、本発明を用いた使用を見出す。この系において、細胞は最初に、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体でインビトロでトランスフェクトされる。このポリメラーゼは、T7プロモーターを保有する鋳型のみを転写するという点で、精巧な特異性を表す。感染の後、細胞は目的のDNAでトランスフェクトされ、T7プロモーターによって駆動される。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質において発現されたポリメラーゼは、トランスフェクトされたDNAをRNAに転写し、次いでこのRNAは宿主翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。本方法は、高レベルの一時的な、大量のRNAの細胞質産物、およびその翻訳産物を提供する。
発現系および選択された宿主に依存して、本発明の抗原は、目的の抗原が発現されることによる条件下で、発現ベクターによって形質転換された宿主細胞の増殖によって産生される。次いで、抗原は宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系が抗原の分泌を提供する場合、抗原は培地から直接精製され得る。抗原が分泌されない場合、抗原は細胞溶解物から単離される。適切な増殖条件の選択および回収方法は、当該分野の内にある。
H.pylori抗原はまた、当業者に公知の方法を使用して、化学合成（例えば、固相または液体ペプチド合成によって）産生され得る。ペプチドの化学合成は、問題の抗原が比較的小さい場合に、望ましいとされ得る。例えば、固相ペプチド合成技術については、J.M.StewartおよびJ.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL（1984）、ならびにG.BaranyおよびR.B.Merrifield、The Peptide:Analysis、Synthesis、Biology、E.GrossおよびJ.Meienhofer編、第２巻、Academic Press、New York、（1980）、3-254頁、；ならびに、古典的な溶液合成については、M.Bodansky、Principles of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Berlin（1984）およびE.GrossおよびJ.Meienhofer、編、The Peptides:Analysis、Synthesis、Biology、上述、第１巻を参照のこと。
H.pylori型共通、およびH.pylori型特異的H.pylori I型抗原は、本明細書中で、生物学的サンプル中のバクテリアに対して指向される反応性抗体の存在を検出するための診断薬として用いられる。さらに、抗原は、治療の最初に得られた結果と、処置経過の最中および後に得られた結果とを比較することにより、抗体治療の経過をモニターするために用いられ得る。例えば、型共通および／または型特異的H.pylori抗原に反応性である抗体の存在は、標準的な電気泳動技術および免疫診断技術（これには競合、直接的な反応、またはサンドイッチ型アッセイのような免疫アッセイが含まれる）を用いて検出され得る。このようなアッセイには、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識免疫アッセイおよび酵素媒介免疫アッセイ（例えばELISA）；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；イムノ電気泳動；免疫沈降などが含まれるが、これらに限定されない。一般に反応には、検出標識（例えば蛍光、化学発光、放射活性、酵素標識、または染料分子）、または、抗原と抗体との間の複合体の形成、もしくはその複合体と反応した抗体を検出する他の方法が含まれる。
前述のアッセイには、一般に、抗原−抗体複合体が結合した、液相における非結合抗体の、固相支持体からの分離を含む。本発明の実施に用いられ得る固体支持体には以下のような基質を含む：ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態）；塩化ポリビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポロスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；フッ化ポリビニリジン；ジアゾ化ペーパー；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなど。
代表的に、固体支持体は、化合物が充分に支持体に固定されているような、適切な結合条件下で、最初に固相成分（例えば、１つ以上の型共通および／または１つ以上の型特異的H.pylori I型抗原）と反応される。あるときには、抗原の支持体への固定は、より良い結合特性での抗原のタンパク質への最初の結合によって増強され得る。適切な結合タンパク質には、血清アルブミンのような巨大分子（ウシ血清アルブミン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、および当業者に周知の他のタンパク質を含む）が挙げられるが、これに限定されない。抗原を支持体に結合させるために用いられ得る他の分子には、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。このような分子、およびこれらの分子を抗原に結合する方法は当業者に周知である。例えば、Brinkley,M.A.,Bioconjugate Chem.（1992）3:2-13;Hashidaら、J.Appl.Biochem.（1984）6:56-63;ならびにAnjaneyuluおよびStaros,International J.of Peptide and Protein Res.（1987）30:117-124を参照のこと。
固体支持体の固相成分との反応後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって支持体から除去され、次いで支持体結合型成分は、リガンド部分を含むと予想される生物学的サンプル（例えば、固定化抗原に対する抗体）と、適切な結合条件下で接触される。いかなる非結合リガンドも除去するための洗浄の後、第２の結合部分は、適当な結合条件下で添加され、ここで、第２の結合物は、選択的に結合リガンドと結合され得る。第２の結合物の存在は、次いで当該分野で周知の技術を用いて検出され得る。
さらに特に、ELIZA法が用いられ得、ここでマイクロタイタープレートのウェルは、H.pylori型共通および／または型特異的H.pylori I型抗原（単数および複数）でコートされる。抗H.pylori免疫グロブリン分子を含む、または含むと予想される生物学的サンプルが、次いでコートされたウェルに添加される。一つのマイクロタイタープレートを用いることが所望されるアッセイにおいて、選択された数のウェルが、例えば第１の型特異的抗原部分でコートされ、異なる１セットのウェルが第２の型特異的抗原部分でコートされ、そして第３セットのウェルがH.pylori型共通抗原などでコートされ得る。代わりに、一連のELISAが続々と行われ得、ここで、独立したプレートが、それぞれ型共通、および型特異的抗原部分に用いられる。抗体が固定化抗原に結合するのを可能にするに充分なインキュべーション時間の後、プレート（単数および複数）は非結合型部分を除去するために洗浄され、そして検出可能な標識化第２の結合分子が添加され得る。第２の結合分子は、任意の捕獲サンプル抗体と反応され得、プレートは洗浄され、そして当該分野で周知の方法を用いて第２の結合分子の存在が検出される。
従って、１つの特定の実施態様において、生物学的サンプル由来の、抗型特異的抗原リガンド、および／または抗H.pylori型共通抗原リガンドの結合の存在は、抗体リガンドに指向された抗体を含む第２の結合物を用いて容易に検出され得る。多数の抗ヒト免疫グロブリン（Ig）分子は、当該分野において公知である（例えば、市販されている、ヤギ抗ヒトIgまたはウサギ抗ヒトIg）。本明細書中での使用のためのIg分子は、好ましくはIgG、またはIgA型のものであるが、IgMもまた、ある例においては適切であり得る。Ig分子は、とりわけ、当業者に公知の方法を用いて、容易に検出可能な酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびウレアーゼ）と、容易に結合され得る。次いで、適切な酵素基質が、検出可能なシグナルを産生するために用いられる。他の関連した実施態様において、競合型ELISA技術は、当業者に公知の方法を用いて実施され得る。
アッセイはまた、細菌性タンパク質、およびそれらの細菌性タンパク質に特異的な抗体が、沈降条件下で複合体を形成するように、溶液中で行われ得る。１つの特定の実施態様においては、H.pylori型共通抗原および／または型特異的抗原が、固相粒子（例えば、アガロースビーズなど）に、当該分野で公知の結合技術を用いて（例えば、直接的な化学結合、または間接的な結合）結合され得る。次いで、抗原コート粒子は、H.pylori I型、またはII型の抗体を含有すると予測される生物学的サンプルとの適切な結合条件下で、接触される。結合抗体間での架橋は、粒子−抗原−抗体複合凝集体の形成を生じる。この凝集体は、洗浄および／または遠心分離を用いてサンプルから沈降、ならびに分離し得る。反応混合物は、任意の多数の標準的な方法、例えば、上記の免疫診断法を用いて、抗体抗原複合体の存在の有無を分析し得る。
なおさらなる実施態様において、免疫親和性マトリックスは、抗H.pylori抗体を含むと予想される生物学的サンプルからのポリクローナル抗体集団が基質に固定されている場合に、提供され得る。これに関して、サンプルの最初の親和性精製は、固定化抗原を用いて行われ得る。従って、得られたサンプル調製物は、親和性支持体における強力な非特異的結合特性を回避して、抗H.pylori部分のみを含有する。多量に、そして抗原結合活性の良好な保持を有する免疫グロブリンを固定化（インタクトな免疫グロブリン、または特異的フラグメントの中の、いずれかに）する多数の方法が、当該分野において公知である。任意の特定の方法によって制限されることなく、固定化したプロテインA、またはプロテインGは、免疫グロブリンを固定するために用いられ得る。
従って、一旦、免疫グロブリン分子が免疫親和性マトリックスを提供するために固定されると、別々の、および異なった標識を有する、H.pylori型共通抗原および型特異的抗原が、適切な結合条件下で結合抗体と接触される。任意の非特異的結合抗原が免疫親和性支持体から洗浄された後に、結合抗原の存在は、当該分野で公知の方法を用いて、各々の特異的な標識についてアッセイすることにより、決定され得る。
H.pylori感染を診断するための、および本発明を用いた処置の経過をモニターするための特に好ましい方法は、例えば、伝統的なウエスタンブロッティング、およびドットブロッティング技術（例えば、RIBA▲Ｒ▼（Chiron Corp.,Emeryville,CA）試験）を組み合わせた、当該分野で公知の、ストリップ（strip）イムノブロットアッセイ（SIA）技術の使用を含む。これらのアッセイにおいて、H.pylori型共通、および型特異的H.pylori I型抗原は、個々に、別々の部分として、例えば、バンドまたはドットとして、膜状支持体上に固定される。従って、膜支持体上に「別々に固定化される」ことによって、抗原が混合されずに別々の成分として存在し、その結果、各々の抗原提示との反応性、または反応性の欠損が評価され得ることが意味される。H.pylori抗原に対する抗体を含むと予想される生物学的サンプルは、次いで試験膜と反応される。生物学的サンプル中の、抗H.pylori反応性の可視化は、比色酵素基質との結合において、抗ヒトIgG酵素結合物を用いて達成される。ヒトIgMおよびヒトIgGのような内部コントロールもまた、片（strip）上に提示され得る。アッセイは、手動で行われ得るか、または自動化された形式で用いられ得る。
一般に、VacAおよびCagAのような型特異的抗原は、約0.5μg/ml〜約５μg/ml、より好ましくは約0.5μg/ml〜３μg/ml、そして最も好ましくは約１〜２μg/mlの濃度中で片に適応される。あるいは、抗原の２つの濃度（例えば、低濃度および高濃度）が存在し得、感染の診断のため、および処置に対する応答をモニターするため、の両方に用いられ得る片を提供する。従って、例えば、VacAおよび／またはCagAは、上記のような特別な濃度、ならびに１つ以上の追加のバンドにおいて、約0.005μg/ml〜0.4μg/ml、より好ましくは約0.008μg/ml〜３μg/ml、および最も好ましくは約0.1g/ml〜0.2g/mlの濃度で、提供され得る。
型共通抗原、例えば、H.pylori溶解物が、約0.25μg/ml〜２μg/ml、より好ましくは約0.25μg/ml〜1.5μg/ml、そして最も好ましくは約0.5μg/ml〜１μg/mlの濃度で、適応され得る。試験片に適応される抗原の濃度が、用いられる特異的抗原に依存して変化すること、そして当業者によって容易に決定され得ることが、容易に明らかである。
IgGのようなIgコントロールは、一つの濃度、または２つの濃度（一方は低く、他方は高い）において存在し得る。例えば、IgGは、約50ng/ml〜250ng/ml、より好ましくは約75ng/ml〜200ng/ml、そして最も好ましくは約100ng/ml〜185ng/mlの濃度で存在し得る。より高い濃度のIgGはまた、低濃度のIgGと共に、例えば、約400ng/ml〜1200ng/ml、より好ましくは約450ng/ml〜1000ng/ml、そして最も好ましくは約500ng/ml〜950ng/mlの濃度で存在し得、別の内部コントロールを提供する。
H.pylori溶解物、および適切に固体支持体上に固定された型特異的抗原を含む上記のアッセイ試薬は、上記の免疫アッセイを行うため、適切な使用説明書および他の必要な試薬とともに、キット中に提供され得る。また、キットは、用いられる特定の免疫アッセイ、適切な標識、ならびに他のパッケージされた試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）に依存して、含まれ得る。上記のような標準的な免疫アッセイは、これらのキットを用いて行われ得る。
III．実施例
以下は本発明を行うための特別な実施態様の実施例である。実施例は例示的な目的のためにのみ与えられ、そしていかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図しない。
用いた数（例えば、量、温度など）の正確さを確実にするための努力が行われたが、もちろん、いくつかの実験的誤差および偏差が可能である。
実施例１
H.pylori VacAポリペプチドの産生
VacAポリペプチドは、154アミノ酸のヒトスーパーオキシドジスムダーゼ（SOD）の（Hallewellら、Nucl.Acids Res.（1985）13:2017-2134）、５アミノ酸のリンカー（Asn-Leu-Gly-Ile-Leu）、およびH.pylori CCUG17874のVacAアミノ酸配列のGly-311〜Ile-819（Covacciら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1993）90:5791〜5795;Telfordら、J.Exp.Med.（1994）179:1653〜1658）を含む、71.2kDaの融合タンパク質として、組み換え的に産生する。
特に、短縮型VacAタンパク質をコードするDNAを、PCRによって合成し、そしてSODをコードするDNA配列とインフレームで融合する。次いで、グルコース調節ADH2/GAPDHプロモーター（Cousensら、Gene（1984）61:265-275）を、増幅したフラグメントの5’末端に組み込み、そして得られたカセットを酵母発現ベクターpBS24.1にクローン化する（Pichuantesら、Protein Eng.,Principle and Prac.（1996）5:129-161）。このベクターは、酵母での自己増殖のための２μ、かつ逆方向反復（IR）配列、転写終結を確実にするためのα−因子ターミネーター、選択のためのleu-2およびURA3酵母遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子ならびにE.coliでの選択および増殖のためのColE1複製起点を含む。高発現レベルのH.pylori VacA組換えタンパク質が、SDS-PAGEにより分離された酵母タンパク質のクーマシーブルー染色およびイムノブロット分析により示されるように、Saccharomyces cerevisiae JSC310（Mat a、leu2、ura3-52、prbl-1122、pep4-3、prcl-407、::pDM15（G418R）、［cir0］）において得られた。VacA組換えタンパク質のヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列を、図3A〜図3Bに示す（配列番号：＿）。
培地からブドウ糖を枯渇して数時間後に収集した酵母細胞から、VacA組換えタンパク質を精製した。この状態は、ADH2/GAPDHプロモーターを活性化、および外来タンパク質の産生をはじめるために必要である（Pichuantesら、J.Biol.Chem.（1990）265:13890-13898）。細胞を、ガラスビーズで、Dynomill中で、溶解緩衝液（これは50mM Tris-HCl（pH8.0）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSFを含有する）を用いて破壊した。タンパク質を、溶解緩衝液中の尿素の量を増加（１M〜３M）させながら不溶性画分（48,400×gで30分の遠心から得られた）から回収した。48,400×gで30分の遠心の後、氷上で30分間撹拌しながら、目的のタンパク質を含む沈殿を、４Mの尿素、50mM DTT、１N NaOHを含む溶解緩衝液で溶解した。遠心分離によって細胞の残骸を除去した後、すぐに懸濁液を６N NaOHで、pH8.0まで滴定して戻した。上清を2.3％SDSにし、３分間煮沸し、室温まで冷却し、そしてPBS、0.1mM EDTA、0.1％SDS、pH7.4を含む緩衝液を用いてSephacryl S-400ゲル濾過カラム（Pharmacia）にロードした。組換えVacAタンパク質を含む画分をプールし、そしてAmicon concentrator（YM-10膜）で濃縮した。SDSを2.3％に、およびDTTを50mMに調整した後、さらなる画分のために、懸濁液を同じS-400カラムに戻し、ロードした。この手順は、＞90純粋なVacAタンパク質を収集した。
実施例２
H.pylori CagAポリペプチドの産生
268アミノ酸から29.2kDaの分子量を有するCagAポリペプチド（Helicobacter pyloriのChilean株のCagAタンパク質のGlu-748〜Glu-1015アミノ酸を含む）Chetx-1を、以下のように組み換え的に産生した。この縮重型CagAタンパク質をコードするDNAをPCRによって合成し、そして増幅フラグメントの5’末端に開始コドンATGを導入した。ADH2/GAPDHハイブリッドプロモーター（Cousensら、Gene（1984）61:265-275）を、次いでPCR合成フラグメントの5’末端に組み込み、そして得られたカセットを、本質的には上記のように、酵母発現ベクターpBS24.1にクローン化した。得られた組換えプラスミドは、Saccharomyces cerevisiae AD3（Mat a、leu2、ura3-52、prbl-1122、pep4-3、prcl-407、::pDM15（G418R）、LEU2（ΔAD）、［CIR0］）を形質転換するために用い、そして組換え抗原の発現を、SDS-PAGEによって分画された酵母タンパク質の、クーマシーブルー染色およびイムノブロット分析によってモニターした。CagA組換えタンパク質のヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列を図４に示す。
CagA組換えタンパク質を、溶解緩衝液（50mM Tris-HCl、150mM NaCl、lmM EDTA、1mM PMSF、pH8.0）中に懸濁した酵母細胞から精製し、そしてDynomill中でガラスビーズと共に破壊した。48,400×gで30分の遠心分離の後、上清を4M尿素にし、S Sepharose IEC平衡緩衝液でOD289＝0.00まで1/10（v/v）に希釈し、そしてタンパク質を0M NaCl〜0.5M NaClの直線勾配の平衡緩衝液で溶出した。CagAタンパク質を含む溶出ピークを回収し、そして30％硫酸アンモニウムで沈殿した。17,700×gで30分の遠心分離の後、沈殿を捨て、そして上記の条件下で、さらに10％固体硫酸アンモニウムで上清を沈殿させる。得られた沈殿物を、48,400×gで30分の遠心分離の後、最小量のPBS/8M尿酸に溶解し、2.3％SDS/50mM DTTに調整し、３分間煮沸し、室温まで冷却し、そしてPBS、0.1mM SDS、1mM EDTA、pH7.4を含む緩衝液を用いてSephacryl S-300ゲル濾過カラム（Pharmacia）にロードした。目的のタンパク質を含む画分を回収し、そしてAmicon concentrator（YM-10膜）で濃縮した。濃縮した物質を、2.3％SDS/50mM DTTにした後、第２の画分のために、懸濁液を同じS-300カラムに戻し、ロードした。この手順は、＞90％純粋なCagAタンパク質を収集した。
実施例３
型特異H.pylori抗原、および型共通H.pylori抗原を用いる、H.pylori片免疫ブロットアッセイ（SIA）
A.SIAは以下のようにして行った。型共通抗原を含む抗原の混合物を含む、H.pylori抽出物を、Bioseed、Inc.、Hillsborough、CAから得た。簡単には、抽出物を、ATCC 43504というATCC株名称を有するアメリカンタイプカルチャーコレクションから得たH.pylori細菌から調製した。抽出物を界面活性剤抽出および超音波処理を用いて調製した。
実施例１、および実施例２においてそれぞれ記載されるVacA型特異的抗原およびCagA型特異的抗原を、ニトロセルロース片上の、別々のバンドに１μg/ml〜２μg/mlの濃度で適用した。型共通抗原を含む溶解物を、同じニトロセルロースフィルター片上に0.5μg/ml〜１μg/mlの濃度で別の別個のバンドとしてコーティングした。内部コントロールとして、さらなるバンドを、精製ヒトIgGを低濃度（100ng/ml〜185ng/ml）、および高濃度（500ng/ml〜925ng/ml）で含ませた。他の片を上記のように抗原および溶解物でコーティングしたが、しかしこれらの片上では、溶解物はまず、0.5μg/ml〜１μg/mlの濃度（VacA）および0.5μg/ml以上の濃度（CagA）で溶解物に添加したVacA抗原、およびCagA抗原によって、増強した。図１は、上記のような抗原を有するニトロセルロース片の図である。
イムノブロットアッセイを、１バッチあたり30片を有するバッチ様式で処理した。全ての工程は、室温で行った。それぞれの片に番号を付け、次いで別のチューブに入れ、そこに１mlの希釈液（ウシタンパク質安定剤、ならびに保存剤として、界面活性剤、0.1％アジ化ナトリウム、および0.05％硫酸ゲンタマイシンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS））を添加し、そして、H.pylori I型に感染したとわかっている個体、H.pylori I型に感染したことが疑われている血清サンプル、およびコントロール被験体からの血清サンプルを、30μl適用した。チューブをゆっくりと４時間振盪し、吸引によって溶液を除去し、そして１mlの新鮮な希釈液を各チューブに添加した。チューブを30分間振盪し、吸引によって溶液を除去し、そして１mlの洗浄緩衝液（洗浄緩衝液濃縮物（50×）（保存剤として0.01％チメロサールを含むリン酸緩衝化界面活性剤溶液）から作製した）を各チューブに添加した。各チューブの中身を空にして１つの洗浄容器に移し、そして20秒間、旋回させることにより洗浄した。洗浄緩衝液を傾けて取り除き、そして30mlの新しい緩衝液を添加し、そしてこのプロセスを繰り返した。残留溶液は吸引によって取り除き、そして20mlの結合溶液（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（重鎖および軽鎖）、ウシタンパク質安定剤、保存剤として0.01％チメロサールを含む）を添加した。容器を110rpmで10分間回転させ、結合溶液を傾けて取り除き、そしてこの洗浄工程を３回繰り返した。残留溶液を吸引によって再び取り除き、そして20mlの基質／顕色剤（メタノール／リン酸緩衝化過酸化水素中の4-クロロ-1-ナフトール（napthol））を添加し、続いて15〜20分間110rpmで回転した。溶液をデカントして、そして片を蒸留水で２回洗浄した。発色した片を吸い取り紙と向かい合わせて置き、そして暗所で30分間乾燥させた。次いで片を、３時間の乾燥中に読みとった。H.pylori抗原バンドの色の強度は、以下のアルゴリズムを用いて-（0）〜4+の範囲の値を割り当てた。低いIgGバンドは1+の値を割り当て、高いIgGバンドには3+の値を割り当てた。次いで、それらのバンドの強度を、IgGコントロールバンドの強度と比較する方法に従って、溶解物のバンド、ならびにVacAのバンド、およびCagAのバンドを０から4+で評価する。
溶解物のバンドに対して1+以上と評価されたH.pylori抗原バンドのいずれかを有するサンプルは、H.pylori感染に陽性であると判断する。CagAおよび／またはVacAのバンドに対して1+以上の反応性に加えて、溶解物のバンドに対する1+以上の反応性は、H.pylori I型感染について陽性であると判断する。どのバンドに対しても1+以上の反応性を示さないサンプルは、陰性と判断する。
このアッセイを用いて、内視鏡検査によって、H.pylori感染に陽性であると決定された個体から得た29サンプル（十二指腸潰瘍を有するのが12、胃潰瘍を有するのが9、胃炎を有するのが8）を、反応性について試験した。別の試験において、十二指腸潰瘍を有するとわかっている80個体を試験した。本結果を、表１および表２にそれぞれ示す。理解され得るように、本アッセイは、H.pylori感染について非常に的中する。
上のアッセイはまた、H.pylori感染の抗生物質治療を行っている個体からのサンプルを試験するためにも用いた。表３は抗生物質治療に反応する人（応答者（responder））と、治療に反応しない人（非応答者（non-responder））との比較を示す。応答者からのサンプルは１、３、６、９、および12ヶ月目で得、非応答者からのサンプルは８、および16ヶ月目で得た。表３に示すように、応答者の抗原との反応性は、時間と共に減少したが、非応答者では有意に変化しなかった。
別の試験において、サンプルは、表４に示すように、３個の異なる型の抗生物質養生法を行っている個体から得た。理解され得るように、報告された反応割合は、上記のアッセイを用いた結果は、３種、および単独の抗生物質養生法を受けている個体の結果と相関した。
これらの２つの研究は、本アッセイが個体が処置に応答するかどうかを、決定するのに有用であることを示す。
B．別のSIAは、以下のように行った。H.pylori潰瘍は、ニトロセルロース片に狭いバンドとして１μg/ml〜２μg/mlの濃度で適用した。上記のVacA抗原は、同じ片上に１μg/ml〜２μg/ml、および0.1μg/ml〜0.2μg/mlの２つの濃度で適応した。CagA型特異的抗原もまた、その片上に同じ２つの濃度で適用した。内部コントロールとして、さらなるバンドは、精製ヒトIgGを低濃度（100ng/ml〜185ng/ml）、および高濃度（500ng/ml〜925ng/ml）で含んだ。図２は上記のような抗原を有するニトロセルロース片の図である。
アッセイは上記のように行った。
また、H.pylori抗原バンドの色の強度を、上記のように割り当てた。
従って、H.pylori感染検出するための新規の方法、ならびにH.pylori I型およびII型を区別する方法、ならびに処理の経過をモニターする方法を開示する。本発明の好ましい実施態様が、いくつか詳細に記載されているが、明らかな改変が、添付の請求の範囲によって規定されるとおりの、本発明の精神および範囲から逸脱せずに行われ得ることが理解される。
発明の分野
本発明は、一般に細菌性診断技術に関する。特に、本発明は、生物学的試料においてH.pylori感染を正確に検出するため、およびH.pylori感染した患者の抗体的処置の経過をモニタするための方法に関する。
発明の背景
元の名称がCampylobacter pyloriであるヘリコバクターピロリは、高いウレアーゼ活性とカタラーゼ活性を示す、湾曲した、微好気性の、グラム陰性細菌である。最近の研究は、H.pyroli感染が、Ｂ型胃炎、十二指腸潰瘍、そして胃ガンの原因か、またはコファクターのいずれかになり得ることを示唆する。例えば、Blaser、Gastroenterology（1987）93:371-383;Dooleyら、New Eng.J.Med.（1989）321:1526-1566;Personnetら、New Eng.J.Med.（1991）325:l127-l131を参照のこと。この点について、H.pyroliは、ヒト胃粘膜を転位増殖し、そして十年間持続し得る感染の原因となる。この条件を有する多くの人々は無症候性であるが、しかし十二指腸潰瘍そして／または胃腺ガンへ進展する無視できないリスクがある。H.pyloriおよび胃性疾患におけるその役割の総説に関して、Telfordら、Trends in Biotech.（1994）12:420-426およびBlaser,M.J.,Scientific Americam（February 1996）:104-107を参照のこと。
H.pylori細菌は、特殊なタンパク質の存在または非存在に基づいてI型とII型に分けられる。この点について、H.pyloriは、感染を確立し、そして維持するために機能するいくつかの因子を生じる。例えば、I型とII型細菌の両方が、胃の胃粘膜層の運動性を助ける鞭毛を含む。細菌の両方の型はまた、おそらく、胃の酸性環境を中和するためのウレアーゼを産生する。さらに、細菌の２つの型は、多くの組織特異的コロニー形成を生じる。一方、H.pylori型I株のみが、CagA、CAI抗原またはtagAとして周知の細胞毒性発現と関連する表面−露出免疫優性抗原と同様、VacAまたはCTとして公知である細胞毒素を生じる。VacAそしてCagAの説明に関して、International Publication No.WO 93/18150,1993年９月16日発行、を参照のこと。
十二指腸潰瘍をもつ患者は、VacAとCagAに対する抗体を産生することが示されており、抗体価は疾患の重症度と関係するようである。例えば、ある研究で、十二指腸潰瘍または十二指腸炎をもつ患者の９５％以上、そして胃潰瘍をわずらっている患者の70％以上は、CagA血清陽性であることがわかった。Telfordら，Trends in Biotech.（1994）12:420-426。さらに、相関関係がCagA血清反応と胃潰瘍との間に示されている。Telfordら、前出。加えて細胞毒性株のみは、実験動物モデルにおいて胃傷害を生じ得る。例えば、Telfordら、J.Exp.Med.（1994）179:1653-1658を参照のこと。従って、H.pylori I型に感染した個体のみが重篤な疾患へ進展する。
いくつかの分析は、H.pylori感染の診断に関して進展している。これらの分析は、多くの障害から不運に見舞われている。例えば、細菌培養分析は、H.pyloriの検出に関して記載されてきている。米国特許番号第5,498,528は、サルビア中のH.pyloriのような検出に関する方法を記載する。この分析は、H.pyloriの選択的増殖を支持するような培養培地を使用して、試験サンプルをインキュベートすることを要求する。細菌の存在は、上述したように、H.pyloriが産生される酵素ウレアーゼの活性により検出される。ウレアーゼは、培養培地のpH増加の原因となるアンモニウムへの尿素の変化を触媒化する。pH変化は、pH感受性インジケーターの存在により、培地への色の変化により検出し得る。しかしながら、細菌は生長に数日を要求するので、この分析は、時間消費が大きい。この分析は、また不便であり、そして細菌サンプルは、分解されるかまたは研究室への輸送の間にコンタミネーションされる。
抗体検出試験は、細菌培養の代わりの物を提供する。この事については、H.pyloriによりコロニー化される被験体は、体液性免疫反応を増加させて、そして診断の基礎として使用され得る細菌に対する抗体を産生する。IgA抗体は胃液中でみられる一方、IgG抗体は循環中にみられる。しかし、そのような試験は、H.pyloriがCamplycobacter jejuniおよびC.coliと抗原的に交差反応性であるようであるので特異性の欠失を被り得る。
米国特許第4,882,271号は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）において、ウレアーゼ活性を有する交差反応性を伴う問題を回避する試みで、300kDaから700kDaのオーダーの、高分子量細胞結合タンパク質を利用するH.pyloriアッセイを記載する。
国際公開番号WO 96/12965（1996年５月２日公開）は、免疫ブロットアッセイを記述する。ここでは、血清学的サンプルが、19.5kDa、26.5kDaまたは30kDaの分子量を有する２つの抗原成分と反応させられるか、または35kDa、89kDa、116kDaまたは180kDaの分子量に対応する任意の１つの抗原成分と反応させられる。19.5kDaタンパク質がフェリチン様タンパク質であり、26.5kDaおよび30kDaのタンパク質がウレアーゼであり、89kDaタンパク質がVacAであること、ならびに116kDaのタンパク質がCagAであることが発明者により提唱される。35kDaおよび180kDaは特徴付けされなかった。
最後に、欧州特許公開第329,570号1989年８月23日公開は、いくつかのH.pylori株の超音波処理物のプールされた懸濁物を使用する感染ならびに精製されたH.pylori鞭毛を使用する免疫アッセイに関して記載する。
細菌培養よりも早くそしてより高感度であるけれども、上記のような抗体検出試験は、偽陽性と偽陰性の結果を生じ得、そしてH.pylori I型とH.pylori II型感染とを一般的に区別できない。従って、感染がH.pylori I型によるものかもしくはII型によるものかを決定するために付加的な試験が実施されなければならない。
従って、I型感染とII型感染とを容易に区別するH.pyloriに関する正確で効果的な分析の広範囲に広がる利用性は、症候性個体と無症候性個体との両方における感染の診断に関して重要となり得る。
発明の要旨
本発明は、H.pylori感染を診断するための、ならびにH.pylori I型感染とH.pylori II型感染とを区別するために簡便で極めて正確で、効果的な方法を提供する。従って、この方法は、H.pylori I型感染を有する個体のスクリーニングに関する技術を提供する。I型感染が検出される場合、個体は、Ｂ型胃炎、ペプチド性潰瘍、そして胃ガンを処置するかまたは抑制する抗生剤を与えられ得る。この方法はまた、H.pylori感染を有する患者における処置経過のモニタリングに有用である。このアッセイ法は、型−共通抗原ならびに細菌由来の特別型−特異的抗原の両方を利用する。
従って、１つの実施態様では、本発明は、H.pylori感染の検出方法に関し、以下の工程を含む：
（a）生物学的サンプルを提供する工程；
（b）生物学的サンプルに存在する場合、H.pylori抗体がH.pylori型−共通抗原および／または型−特異的抗原と結合する条件下で、１つまたはそれより多いH.pylori−共通抗原と生物学的サンプルとを反応させる工程および１つまたはそれより多い精製されたH.pylori I型抗原と生物学的サンプルとを反応させる工程、
それによって、H.pylori感染の存在または非存在を検出する工程。
他の実施態様では、本発明は、生物学的サンプル中のH.pylori I型とH.pylori II型感染とを区別する方法、またはHelicobacter pylori感染に対する治療を受ける被験体をモニタリングする方法に関する。その方法は以下を含む：
（a）１つまたはそれより多いH.pylori型−共通抗原例えば、H.pylori溶解物および／またはH.pyloriウレアーゼを固定化する工程、ならびに１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原例えば、H.pyloriVacAおよび／またはH.pyloriCagAをニトロセルロース片（strip）上に固定化すること；
（b）生物学的サンプル中に存在する場合、抗H.pylori I型抗体および抗H.pylori II型抗体が溶解物中のH.pylori型−共通抗原およびまたは型−特異的H.pylori I型抗原と結合する条件下で、工程（a）のニトロセルロース片と生物学的サンプルとを接触させる工程；
（c）結合しない抗体を除去する工程；
（d）検出可能に標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を提供する工程；および、
（e）生物学的サンプル中の結合した抗ヒト免疫グロブリン抗体の存在もしくは非存在を検出する工程、
それによって、H.pylori I型またはH.pylori II型感染の存在または非存在を検出する工程。
特に好ましい実施態様において、生物学的サンプルは、ヒト血清サンプルである。
さらに好ましい実施態様において、本発明は、分散して固定化された、１つまたはそれより多いH.pylori型−共通抗原および１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原を含む膜支持体に関する。
他の実施態様では、本発明は、以下を含有するニトロセルロース支持体に関する；
（a）H.pylori I型VacAポリペプチド；
（b）H.pylori I型CagAポリペプチド；
（c）H.pyloriウレアーゼ；および
（d）ヒトIgG、
ここでH.pyloriポリペプチドおよびウレアーゼ、ならびにヒトIgGは、上記ニトロセルロース支持体上に分散型バンドとして固定化される。
さらなる実施態様では、本発明は、以下を含有するニトロセルロース支持体に関する：
（a）H.pylori I型VacAポリペプチド；
（b）H.pylori I型CagAポリペプチド；
（c）H.pylori溶解物；ならびに
（d）ヒトIgG
ここでH.pyloriおよび溶解物、ならびにヒトIgGは、上記ニトロセルロース支持体上に分散型バンドとして固定化される。
他の実施態様では、本発明は、H.pylori感染を検出するための免疫診断試験キットに関する。このキットは、（a）１つまたはそれより多いH.pylori型−共通抗原；（b）１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原；および（c）免疫診断試験を実施するための説明書からなる。
さらなる実施態様では、本発明は生物学的サンプル中のH.pylori I型とH.pylori II型感染とを区別するための、またはヘリコバクターピロリ感染に対する治療を受ける個体をモニタリングするための免疫診断試験キットに関する。この試験キットは、（a）ニトロセルロース片に固定化された１以上のH.pylori型−共通抗原、例えば、H.pylori溶解物および／またはH.pyloriウレアーゼ；（b）ニトロセルロース片に固定化された１つまたはそれより多い精製された型−特異的H.pylori I型抗原例えば、H.pylori VacAおよび／またはH.pylori CagA；そして、（ｃ）免疫診断試験を実施するための説明書を含む。
本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮して当業者に容易に思い浮かぶ。
【図面の簡単な説明】
図１は、ストリップ（strip）イムノブロットアッセイ（SIA）に使用するための代表的な試験片（strip）を示す。ヒトIgGは、２つの異なるレベル（レベルI、低コントロール；そしてレベルII、高コントロール）の内部コントロールとして使用される。CagAおよびVacAは、型−特異的H.pylori I型抗原として使用され、そしてHP CEは、型−共通抗原を有するH.pylori溶解物を示す。
図２は、SIAに使用するための別の代表的な試験片を示す。上述のように、ヒトIgGは、２つの異なるレベル（レベルI、低コントロール；そしてレベルII、高コントロール）の内部コントロールとして使用される。CagAおよびVacAは、型−特異的H.pylori I型抗原として使用され、そしてまた、同様に、アッセイ感度を増強するため、ならびに処置に対する応答をモニタする２つの異なるレベルで使用される。ウレアーゼは、型−共通抗原として使用される。
図3A-3B（配列番号： ）は、実施例に記載されるSIAで使用される、H.pyloriVacA抗原に関するヌクレオチド配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示す。
図4（配列番号： ）は、実施例に記載されるSIAで使用される、H.pyloriCagA抗原に関するヌクレオチド配列とそれに対応するアミノ酸配列を示す。
発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術間の免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技術を使用する。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（第２編、1989）；DNA Cloning:A Practical Approach I＆II巻（D.Glover編）；Methods In Enzymology（S.ColowickとN.Kaplan編、Academic Press,Inc.）；そしてHandbook of Experimental Immunology I-IV巻（D.M.WeirとC.C.Blackwell編Blackwell Scientific Publications）を参照のこと。
本明細書中および添付請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の参照体を包含する。加えて、ヌクレオチドとアミノ酸の標準的略号は本明細書で使用される。
I．定義
本発明の記述において、以下の言語が使用され、そして以下に記載されるように、定義されることが意図される。
「H.pylori溶解物」によって、以下に規定されるように、H.pylori I型とII型の両方に対して生成された抗体と反応する、１つまたはそれより多いH.pyloriポリペプチドを含むH.pylori I型またはII型全細菌に由来する抽出物または溶解物を意味する。このようなポリペプチドは、本明細書中の「型−共通」抗原と称される。従って、本明細書中で使用される場合、用語「溶解物」は、少なくとも溶解物中に存在する抗原の１つが型−共通抗原である限りは、いくつかのH.pylori抗原を有する粗抽出物を表す。この溶解物は、さらに精製した型−共通および／または型−特異的抗原を増強され得る。この用語はまた、１つまたは２、３のこのような型−共通抗原のみを含有する粗溶解物に由来する比較的に精製された組成物を示す。このような溶解物は、さらに以下で記載されるように、当該分野で公知の技術を使用して調製される。
単独または組合せのいずれかのこのような溶解物中に存在し得る代表的な抗原は、H.pylori付着因子（例えば、20kDa N-アセチルノイラミニラクトース−結合原線維赤血球凝集素（HpaA）、ホスファチジルエタノールアミンおよびガングリオテトラオシルセラミドと結合する63kDaタンパク質、および保存されたフィンブリン線毛様構造に由来する１つまたはそれより多い型−共通抗原エピトープを含むが、これらに限定されない。例えば、これらの抗原の説明に関して、Telfordら、Trends in Biotech.（1994）12:420-426を参照のこと。溶解物中に存在し得る他の型−共通抗原は、主要フラゲリンFlaAと微量なフラゲリンFlaBのような種々のフラゲリンのいくつかに由来する１つまたはそれより多い型−共通抗原エピトープを含有する。この点に関して、H.pyloriの鞭毛は、それぞれ約53kDaの分子量を有するFlaAおよびFlaBから構成される。FlaAそして／またはFlaBのいずれかまたは両方が、本発明での使用のための型−共通抗原の供給源として使用され得る。別の代表的な型−共通抗原は、細菌の外膜と周辺質のスペースと会合されるH.pyloriウレアーゼを含む。ホロ酵素は、それぞれ、26.5kDa（UreA）と61kDa（UreB）の２つのサブユニットから構成される大きな複合体である。サブユニットまたは３つの組合せのいずれかのホロ酵素に由来する型−共通エピトープは、型−共通抗原として存在し得る。溶解物中に存在し得るか、またはさらに精製された形態で使用され得る別の代表的な型−共通抗原は、「hsp60」として知られるH.pylori熱ショックタンパク質を含む。hsp60に関するDNAおよびそれに対応するアミノ酸配列は公知である。例えば、国際公開番号WO93/18150、1993年９月16日公開を参照のこと。示される全長のhsp60抗原は、約546のアミノ酸および約58kDaの分子量を有する。この溶解物は、本明細書において特に記載されない、他の型−共通抗原を含み得ると理解される。
「型−特異的H.pylori I型抗原」によって、以下に記載されるように、H.pylori I型に対する抗体と優位に反応するが、H.pylori II型に対する抗体とは反応しないH.pylori I型に由来するポリペプチドが意味される。代表的な型−特異的H.pylori I型抗原は以下のものを含む：CTとしても知られるH.pylori VacA；ならびにCAI抗原およびtagAとしても知られるH.pylori CagA；ならびにH.pylori I型に対する抗体と反応し得るが、H.pylori II型に対する抗体とは反応しないこれらの抗原に由来するエピトープ。VacAおよびCagAの両方とも、以下でさらに記載される。本明細書において特に記載されない他の型−特異的H.pylori I型抗原もまた、この定義により取り囲まれると理解し得る。
上記のような、VacA、CagAまたは任意の他の型特異的もしくは型共通抗原のような、型−共通または型−特異的H.pylori抗原に関して使用される場合、用語「ポリペプチド」は、天然、組換えまたは合成のいずれであろうが、多くのH.pylori株のいずれかに由来するVacA、CagAなどを表す。型−特異的H.pylori I型抗原の場合、このポリペプチドは、H.pylori I型株に由来する。型−共通抗原の場合、そのポリペプチドは、H.pylori I型またはII型のいずれかに由来し得る。このポリペプチドは、参照分子の全長アミノ酸配列を含むことを必要としないが、ポリペプチドが適切なH.pylori抗体と反応するために必要である大きさの分子のみを含み得る。従って、参考分子のただ１つまたは２、３のエピトープが存在すべき必要性がある。さらに、このポリペプチドは、全長参考分子または参考分子のフラグメントとH.pyloriポリペプチドの反応性を崩壊しない別のタンパク質との間の融合タンパク質を含み得る。従って、このポリペプチドが、フラグメント、切断された配列および部分的な配列ならびに参考分子のアナログおよび前駆体形態全長配列を含み得ることは容易に明らかである。この用語はまた、ポリペプチドがH.pylori抗体と反応する能力を保持する限り、参考配列の欠損、付加ならびに置換を意味する。
この点について、特に好ましい置換は、一般に本質的に保存的であり、すなわち、それらの側鎖に関係するアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。詳細には、アミノ酸は、一般に４ファミリーに分けられる：（1）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（2）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（4）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、セリンでのスレオニンの単離された置換体、または構造上関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似した保存的置換が、生物学的活性に主要な影響を有しないということは、合理的に予測され得る。それゆえ、参照タンパク分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の抗体結合能力に実質的に影響しない微小なアミノ酸置換を所有するタンパク質は、参照ポリペプチドの定義範囲内である。
「VacAポリペプチド」により、H.pylori I型細胞毒として公知である抗原から誘導され、そしてH.pylori I型に対する抗体と主に反応するが、H.pylori I型とは反応しない、先に定義したポリペプチドを意味する。VacAタンパク質は、組織培養中の上皮細胞において空胞化を誘導し、また広範囲の組織損傷の原因となり、そしてマウスへ経口投与した場合、潰瘍形成の原因となる。VacAのDNAとこれに対応するアミノ酸配列は公知であり、そして例えば、1993年９月16日に公開された国際公開第WO 93/18150号に報告されている。VacAポリペプチドの遺伝子は、約90〜100kDaの活性分子にプロセシングされる約１40kDaの前駆体をコードする。この分子は、次に、ゆっくりとタンパク質分解的に切断される完全な90kDa分子と同時精製される２つのフラグメントを生じる。Telfordら、Trends in Biotech.（1994）12:420-426を参照のこと。従って、本明細書中で使用される「VacAポリペプチド」の定義には、前駆体タンパク質、ならびにH.pylori I型感染を有する個体由来の生物学的サンプルに存在する抗体との特異的な反応性を保持する、プロセシングされた活性分子、そのタンパク質分解性フラグメント、またはその部分もしくはそのムテインが含まれる。例えば、図3A-3Bに示され、そして本明細書中に記載されるアッセイに使用されるVacAポリペプチドは、全長分子のGly-311からIle819までのVacAフラグメント（全長分子を含む）を含み、これは、組み換え体発現を促進するために、ヒトSODの５アミノ酸から154アミノ酸のリンカー配列により融合される。
「CagAポリペプチド」により、H.pylori I型細胞毒関連免疫優性抗原から誘導され、そして主にH.pylori I型に対する抗体と反応するが、H.pylori II型とは反応しない、先に定義したポリペプチドを意味する。CagAは、細菌表面に発現される。CagAのDNAとこれに対応するアミノ酸配列は公知である。例えば、1993年９月16日に公開された国際公開第WO 93/18150号、を参照のこと。そこで記載される全長CagA抗原は、約128kDaの推量分子量を有する約1147アミノ酸を含む。天然のタンパク質は、プロリンリッチなアミノ酸配列の繰り返しをコードする、102bpのDNAセグメントの可変数の繰り返しの存在により、種間でサイズの多様性を示す。Covacciら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1993）90:5791-5795を参照のこと。従って、CagAの報告された分子量は、約120〜135kDaの範囲内である。それゆえ、本明細書中で使用される「CagAポリペプチド」の定義には、H.pylori I型感染を有する個体由来の生物学的サンプル中の抗体と反応する能力を保持するが、H.pylori II型に対して生成した抗体と実質的に反応しない、任意の種々のCagA改変体、そのフラグメント、およびそのムテインが含まれる。例えば、図４に示され、そして本明細書に記載のアッセイで使用されるCagAポリペプチドは、268アミノ酸の短縮型タンパク質であり、全長分子のGlu-748〜Glu-1015（全長分子を含む）を含む。
「エピトープ」により、特異的Ｂ細胞およびＴ細胞が応答する抗原の部位を意味する。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。エピトープは、エピトープに独特の空間的コンフォメーションにおいて、３個以上のアミノ酸からなり得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、そしてより通常、少なくとも８〜10個のようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定するための方法は、当業者に公知であり、Ｘ−線結晶学および２−次元核磁気共鳴が含まれる。さらに、所与のタンパク質のエピトープの同定は、疎水性研究の使用により、そして部位特異的血清学によるような、当該分野で周知の技法を使用して容易に達成される。例えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1984）81:3998-4002（所与の抗原において免疫原性エピトープの位置を決定するためのペプチドを迅速に合成する一般的方法）；米国特許第4,708,871号（抗原のエピトープを同定しそして化学的に合成するための手順）；およびGeysenら、Molecular Immunology（1986）23:709-715（所与の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技法）もまた参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗原の結合をブロックするための１つの抗体の能力を示す簡便な免疫アッセイにおいて同定され得る。
「精製された」タンパク質またはポリペプチドは、組換え的にまたは合成的に産生される、または組成物中に存在するタンパク質量が、粗調製物中に存在量よりも実質的に多いように、天然の宿主から単離されるタンパク質である。一般に、精製されたタンパク質は、少なくとも約50%均一であり、そしてより好ましくは、少なくとも約80%から90%均一である。
本明細書中で使用されるように、「生物学的サンプル」は、固体から単離される組織または液体のサンプル、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆液、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚の外分泌液、気道、腸管、および尿生殖路、ならびに、胃上皮および胃粘膜由来のサンプル、涙、唾液、乳、血液細胞、器官、生検を含むが、これらに限定されない。そしてまた例えば、培養培地での細胞および組織の増殖から生じる馴化培地（例えば、組換え細胞）および細胞成分を含むがしかし限定されないインビトロ細胞培養成分のサンプル。
本明細書で使用されるように、用語「標識」および「検出し得る標識」は、検出可能な分子（放射活性同位体、蛍光剤、化学発光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド、（例えば、ビオチンまたはハプテン）などを含むが、これらに限定されない）をいう。用語「蛍光剤」は、検出可能領域に蛍光を示し得る物質またはその部分をいう。本発明下で使用され得る標識の具体例には、フルオロセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクラディマムエステル（acradimum ester）、NADPH、およびα−β−ガラクトシダーゼが含まれる。
II．発明の実施態様
本発明は、H.pylori感染を正確に検出し、そしてH.pylori I型感染とH.pylori II型感染とを識別するための新規の診断法の発見に基づく。この方法は、精製されたか、または細菌に由来する溶解物に存在するかのいずれかの１つ以上のH.pylori型−共通抗原、ならびに精製型−特異的H.pylori抗原を利用する。型−共通のそして型−特異的抗原の両方の使用は、偽陽性結果の出現率を減少させる。この方法は、単一アッセイに、感染の検出および存在する感染型の同定の両方を可能にする簡便な１工程アッセイ形式で実施し得る。この方法はまた、サンプルをまず、H.pylori型−共通抗原と反応させ、そして陽性の場合には、１つ以上の型−特異的I型抗原と反応させる、２工程で実施され得る。この方法はまた、型−特異的II型抗原を使用し得る。
さらに具体的には、H.pylori型−共通抗原の使用は、一般に、H.pylori感染の診断を可能にする。１つ以上の型−特異的抗原の存在は、細菌型、すなわち、感染がH.pylori I型および／またはH.pylori II型によって引き起こされるか否かの決定を可能にする。H.pylori型−共通抗原の存在により、陽性結果は、型決定が可能でないサンプルにおいてさえ生じる。それゆえ、偽陰性の出現率は減少される。さらに、H.pylori I型感染が存在する場合、個体は、B型胃炎、十二指腸潰瘍、そして胃ガンの処置または抑制のために抗生物質を投与され得る。さらに、本明細書で記載されるアッセイは、抗生物質治療が効果的か否かを決定するために、被験体の処置の過程のモニターに有用である。
被験体診断技術における使用のための抗原は、種々の技術の使用を生じ得る。
例えば、型−共通抗原は、当該分野で周知の方法を使用して得られ得る溶解物中で提供され得る。一般に、このような方法は、超音波処理、プレッシャーディスインテグレーション（pressure disintegration）、界面活性剤抽出、分画化などを使用して、H.pylori I型細菌またはH.pylori II型細菌のいずれか由来の型−共通タンパク質を抽出することを必要とする。このような溶解物中に存在する型−共通抗原は、標準的精製技術を使用して、所望される場合、さらに精製され得る。このような方法における使用のためのH.pylori株は、American Type Culture Collection（ATCC,Rockville,MD.）を含むいくつかの供給源から容易に入手可能である。例えば、ATCC株名NCTC 11637、11639、および11916は溶解物の供給源としての使用を見出す。別の有用な株は、当該分野で公知である。
型−特異的H.pylori I型抗原はまた、標準的精製技法を使用して得られ得る。この点から、特定の抗原は、カラムクロマトグラフィー、電気泳動法、HPLC、免疫吸着法、アフィニティークロマトグラフィーおよび免疫沈降法のような標準精製技法を使用して、I型H.pylori潰瘍産生株から単離され得る。例えば、H.pylori由来のいくつかの抗原の精製の説明に関しては、1996年５月２日に公開された国際公開第WO 96/12965号を参照のこと。例えば、ATCC株名NCTC 11916は、H.pyloriのI型潰瘍産生株であり、そして、それゆえ、本発明の使用に関して、１つまたはそれを超える型−特異的抗原の供給源として使用され得る。
H.pylori抗原はまた、当該分野で周知の組換え方法を使用して産生し得る。この点に関して、オリゴヌクレオチドプローブは、H.pyloriゲノムの公知の配列に基づいて創案され得、本発明において有用な抗原をコードするH.pylori遺伝子に関するゲノムまたはcDNAライブラリーをプローブするために使用され得る。次いで、この遺伝子は、標準的技術を使用して、そして所望される場合には、全長配列の所望部位で遺伝子を変異させるために用いられる制限酵素を使用して、さらに単離され得る。
同様に、H.pylori遺伝子は、フェノール抽出のような公知の方法を使用して、細菌性細胞から直接単離され得、そして、この配列は任意の所望の改変を生じるためにさらに操作され得る。DNAを得、そして単離するために使用される技術の説明に関しては、例えば、Sambrookら、前出、を参照のこと。最終的に、H.pylori抗原をコードする遺伝子は、公知の方法に基づいて、合成的に産生し得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に関する適切なコドンを用いて設計し得る。一般に、当業者は、配列が発現される意図する宿主のための好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法により調製されるオーバーラップするオリゴヌクレオチドから一般に組立てられ、そして完全なコドン配列へアセンブリされる。例えば、Edge,Nature（1981）292:756;Nambairら、Science（1984）223：1299;Jayら、J.Biol.Chem.（1984）259:6311を参照のこと。
一旦、所望のポリペプチドのコード配列が、単離または合成されると、それらは、昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルスおよび酵母の発現系（これらは全て当該分野で周知である）を含む、種々の系についての任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。特に、宿主細胞は、所望のコード配列に作動可能に連結されたコントロール配列を含有する発現ベクターにより形質転換される。
コントロール配列は、使用される特別な宿主細胞と適合性である。例えば、哺乳動物細胞発現に関して代表的なプロモーターには、とりわけ、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが含まれる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような他の非ウイルスプロモーターもまた、哺乳動物構築物における使用を見出す。哺乳動物発現は、プロモーターに依存して、恒常的であるかまたは制御されている（誘導性である）かのいずれかであり得る。代表的には、転写終止およびポリアデニル化配列はまた、転写終止コドンの３’側に位置して存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例には、SV40（Sambrookら、前出）由来のものが含まれる。スプライスドナーおよびアクセプターの部位を有するイントロンはまた、本発明の構築物へと設計され得る。
エンハンサーエレメントはまた、発現レベルを増加させるために哺乳動物構築物において使用され得る。例には、SV40初期遺伝子エンハンサー（Dijkemaら、EMBO J.（1985）4:761））およびRous Sarcomaウイルス（Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1982b）79:6777）の長末端反復（LTR）に由来するエンハンサー／プロモーターおよびヒトサイトメガロウイルス（Boshartら、Cell（1985）41:521）が含まれる。シグナルペプチドをコードする配列を含むリーダー配列もまた存在し得、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供する。好ましくは、リーダーフラグメントと目的の遺伝子との間に、リーダー配列がインビボまたはインビトロのいずれかで切断され得るように、コードされるプロセッシング部位が存在する。アデノウイルストリパタイト（tripartite）リーダーは、哺乳動物細胞中の外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
一旦完了すると、哺乳動物発現ベクターは、任意のいくつかの哺乳動物細胞の形質転換に使用され得る。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、当該分野で公知であり、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのDNAの直接的マイクロインジェクションを包含する。
発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞系はまた、公知であり、そしてチャイニーズハムスター卵巣細胞、KeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞性ガン細胞（例えば、Hep G2）、およびその他を含むがこれらに限定されないAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含する。
本発明の構築物はまた、酵母中で発現し得る。酵母ベクターのコントロール配列は、当該分野で公知であり、そしてアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）（欧州特許公報第284,044号）、エノラーゼプロモーター、グルコキナーゼプロモーター、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPまたはGAPDH）プロモーター、ヘキソキナーゼプロモーター、ホスホフルクトキナーゼプロモーター、3-ホスホグリセレートムターゼプロモーター、およびピルベートキナーゼ（PyK）プロモーター（欧州特許公報第329,203号）のようなプロモーターを含む。酸ホスファターゼをコードする酵母PHO5遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供する（Myanoharaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:1）。加えて、天然に生じない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターの上流活性化配列（UAS）が、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する。このようなハイブリッドプロモーターの例には、GAP転写活性化領域に連結されるADH調節領域が含まれる（米国特許第4,876,197号および同第4,880,734号）。ハイブリッドプロモーターの他の例には、GAPもしくはPyK（欧州特許公報第164,556号）のような糖分解酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わされたADH2、GAL4、GAL10またはPHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが含まれる。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼに結合し、そして転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然に生じるプロモーターを含み得る。
酵母発現ベクターに含まれ得る他のコントロールエレメントは、ターミネーター（例えば、GAPDH由来およびエノラーゼ遺伝子（Holland,J.Biol Chem.（1981）256:1385）由来）、および分泌物のためのシグナル配列をコードするリーダー配列である。適切なシグナル配列をコードするDNAは、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開第012,873号;JPO公開第62,096,086号）およびα−因子遺伝子（米国特許第4,588,684号、同第4,546,083号、および同第4,870,008号；欧州特許公開第324,274号；PCT公開第WO89/02463号）のような分泌された酵母タンパク質遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーはまた、酵母における分泌を提供する（欧州特許公開第060,057号）。
染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかである、発現ベクターおよび形質転換ベクターは、多くの酵母への形質転換に関して開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母に関して開発されている：Saccharomyces cerevisiae（Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1978）75:1929;Itoら、Ｊ.Bacteriol.（1983）153:163）；Saccharomyces carlsbergenenis;Candida albicans（Kurtzら、Mol.Cell.Biol.（1986）6:142）；Candida maltosa（Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25:141）；Hansenula polymorpha（Gleesonら、J.Gen.Microbiol.（1986）132:3459;RoggenkampらMol.Gen.Genet.（1986）202:302）；Kluyveromyces fragilis（Dasら、J.Bacteriol.（1984）158:1165）；Kluyveromyces lactis（De Louvencourtら、J.Bacteriol.（1983）154:737;Van den Bergら、Bio/Technology（1990）8:135）；Pichia guillerimondii（Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25:141）；Pichia pastoris（Creggら、Mol.Cell.Biol.（1985）5:3376；米国特許第4,837,148号および同第4,929,555号）；Schizosaccharomyces pombe（BeachおよびNurse、Nature（1981）300:706）；およびYarrowia lipolytica（Davidowら、Curr.Genet.（1985）10:380471;Gaillardinら、Curr.Genet.（1985）10:49）。
酵母宿主への外来DNAの導入方法は、当該分野で周知であり、代表的には、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオンで処理された完全な酵母細胞の形質転換のいずれかを包含する。
細菌発現系はまた、本発明の構築物とともに使用され得る。細菌における使用のためのコントロールエレメントは、オペレーター配列およびリボソーム結合部位を必要に応じて含むプロモーターを含有する。有用なプロモーターには、ガラクトース、ラクトース（lac）およびマルトースのような糖代謝酵素に由来する配列が含まれる。さらなる例には、トリプトファン（trp）のような生合成酵素、b-ラクタマーゼ（bla）プロモーター系、バクテリオファージλPL、およびT5に由来するプロモーター配列が含まれる。さらに、天然に生じないtacプロモーター（米国特許第4,551,433号）のような合成プロモーターはまた、細菌宿主細胞におけると同様に機能する。
前述の系は、E.coliと特に適合性である。しかし、とりわけ、Bacillus spp.、Streptococcus spp.、およびStreptomyces spp.のような細菌宿主における使用のための多数の他の系がまた公知である。これら宿主への外来DNAの導入のための方法は、代表的には、CaCl2または、二価カチオンおよびDMSOのような他の薬剤の使用を包含する。DNAはまた、エレクトロポーレーションにより細菌細胞へ導入され得る。
所望の抗原の発現のための他の系には、昆虫細胞およびこれら細胞における使用に適切なベクターを含む。最も一般的に使用される系は、バキュロウイルスAutographa californica多核体病ウイルス（AcNPV）に由来する。一般に、発現系の成分はトランスファーベクター、通常は、細菌プラスミド（これはバキュロウイルスゲノムのフラグメントおよび発現される異種遺伝子または遺伝子の挿入のための便利な制限部位の両方を有する）を含む。；トランスファーベクター（これはバキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組換えを可能にする）においてバキュロウイルス特異的フラグメントと相同な配列を有する野生型バキュロウイルス；ならびに、適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
ベクターにおける使用のためのプロモーターは、代表的に構造遺伝子由来であり、ウイルスの感染周期の後期に豊富に転写される。例としては、ウイルスポリヘドロン（polyhedron）タンパク質をコードする遺伝子由来の配列が含まれる（Friesenら、（1986）「The Regulation of Baculovirus Gene Expression」：The Molecular Bioligy of Baculoviruses（Walter Doerfler編）；欧州特許公開番号第127,839号および第155,476号；ならびに、p10タンパク質をコードする遺伝子Vlakら、J.Gen.Virol.（1988）69:765）。また、プラスミドは通常、ポリヘドリン（polyhedrin）ポリアデニル化シグナルを含有（Millerら、Ann.Rev.Microbiol.（1988）42:177）し、そして原核生物アンピシリン耐性（amp）遺伝子ならびにE.coliの選択および増殖のための複製起点を含む。適切なシグナル配列をコードするDNAもまた、含まれ、そして一般的に、分泌型昆虫タンパク質または分泌型バキュロウイルスタンパク質（例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Carbonellら、Gene（1988）73:409）、ならびに哺乳動物シグナル配列（例えば、ヒトα-インターフェロンをコードする遺伝子由来の配列（Maedaら、Nature（1985）315:592）；ヒトガストリン放出ペプチド（Lebacq-Verheydenら、Molec.Cell.Biol.（1988）8:3129；ヒトIL-2（Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）82:8404；マウスIL-3（Miyajimaら、Gene（1987）58:273；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Martinら、DNA（1988）7:99）の遺伝子由来である。
現在、外来遺伝子をAcNPVに導入するために最も一般的に用いられる導入ベクターは、pAc373である。また、当業者に公知の多くの他のベクターが、設計されている。これらには、例えば、pVL985（これはポリヘドリン開始コドンをATGからATTに変更し、そしてATTから32bp下流にBamHIクローニング部位を導入する；LuckowおよびSummers、Virology（1989）17:31を参照のこと）。
所望のDNA配列は、公知の技術（SummersおよびSmith、前出;Smithら、Mol.Cell.Biol.（1983）3:2156；ならびにLuckowおよびSummers（1989）を参照のこと）を使用して導入ベクターに挿入され、そして昆虫細胞宿主は、導入ベクター、および野生型バキュロウイルスのゲノムDNAの異種DNAを用いて、同時形質転換される（通常、同時トランスフェクションによる）。ベクターおよびウイルスゲノムは、組み換えが可能である。パッケージされた組換えウイルスが発現され、そして組換え体のプラークが同定され、精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形式で、例えばInvitrogen,San Diego CA（「MaxBac」キット）から、市販されている。これらの技術は一般に、当業者に公知であり、SummersおよびSmith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555（1987）（本明細書中以下「SummersおよびSmith」）に、充分に記載されている。
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、種々の昆虫細胞への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に：Aedes aegypti、Autographa californica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia ni、について開発されている。
上記の系を用いて調製されたポリペプチドは融合ポリペプチドであることが、しばしば所望される。非融合型タンパク質を用いる場合、これらのタンパク質は細胞内で発現され得るか、または細胞から増殖培地へ分泌され得る。
さらに、例えば、マルチプルタイプ特異的H.pylori I型抗原、またはマルチプルタイプ共通抗原をコードするキメラ遺伝子配列を含むプラスミドが、構築され得る。遺伝子配列は、２シストロン遺伝子配置中に存在し得る。付加的な制御エレメントは、遠位コード領域からのRNAの翻訳に効果的な種々の遺伝子の間に適合され得る。あるいは、複数の抗原をコードする、単一のオープンリーディングフレームを有するキメラ転写単位もまた、構築され得る。融合物が、キメラタンパク質の合成を可能にするように作製され得、あるいはタンパク質プロセシングシグナルが、プロテアーゼによる切断を提供するように操作され得、従って、鋳型RNAの翻訳由来の２つ以上のタンパク質の遊離を可能にする。プロセシングプロテアーゼはまた、この系において、独立して、または抗原コード領域（単数もしくは複数）を有するキメラの一部としてのいずれかで発現され得る。
また、ウイルス系、例えばワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系もまた、Tomeiら、J.Virol.（1993）67:4017-4026およびSelbyら、J.Gen.Virol.（1993）74:1103-1113に記載されるように、本発明を用いた使用を見出す。この系において、細胞は最初に、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体でインビトロでトランスフェクトされる。このポリメラーゼは、T7プロモーターを保有する鋳型のみを転写するという点で、精巧な特異性を表す。感染の後、細胞は目的のDNAでトランスフェクトされ、T7プロモーターによって駆動される。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質において発現されたポリメラーゼは、トランスフェクトされたDNAをRNAに転写し、次いでこのRNAは宿主翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。本方法は、高レベルの一時的な、大量のRNAの細胞質産物、およびその翻訳産物を提供する。
発現系および選択された宿主に依存して、本発明の抗原は、目的の抗原が発現されることによる条件下で、発現ベクターによって形質転換された宿主細胞の増殖によって産生される。次いで、抗原は宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系が抗原の分泌を提供する場合、抗原は培地から直接精製され得る。抗原が分泌されない場合、抗原は細胞溶解物から単離される。適切な増殖条件の選択および回収方法は、当該分野の内にある。
H.pylori抗原はまた、当業者に公知の方法を使用して、化学合成（例えば、固相または液体ペプチド合成によって）産生され得る。ペプチドの化学合成は、問題の抗原が比較的小さい場合に、望ましいとされ得る。例えば、固相ペプチド合成技術については、J.M.StewartおよびJ.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL（1984）、ならびにG.BaranyおよびR.B.Merrifield、The Peptide:Analysis、Synthesis、Biology、E.GrossおよびJ.Meienhofer編、第２巻、Academic Press、New York、（1980）、3-254頁、；ならびに、古典的な溶液合成については、M.Bodansky、Principles of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Berlin（1984）およびE.GrossおよびJ.Meienhofer、編、The Peptides:Analysis、Synthesis、Biology、上述、第１巻を参照のこと。
H.pylori型共通、およびH.pylori型特異的H.pylori I型抗原は、本明細書中で、生物学的サンプル中のバクテリアに対して指向される反応性抗体の存在を検出するための診断薬として用いられる。さらに、抗原は、治療の最初に得られた結果と、処置経過の最中および後に得られた結果とを比較することにより、抗体治療の経過をモニターするために用いられ得る。例えば、型共通および／または型特異的H.pylori抗原に反応性である抗体の存在は、標準的な電気泳動技術および免疫診断技術（これには競合、直接的な反応、またはサンドイッチ型アッセイのような免疫アッセイが含まれる）を用いて検出され得る。このようなアッセイには、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識免疫アッセイおよび酵素媒介免疫アッセイ（例えばELISA）；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；イムノ電気泳動；免疫沈降などが含まれるが、これらに限定されない。一般に反応には、検出標識（例えば蛍光、化学発光、放射活性、酵素標識、または染料分子）、または、抗原と抗体との間の複合体の形成、もしくはその複合体と反応した抗体を検出する他の方法が含まれる。
前述のアッセイには、一般に、抗原−抗体複合体が結合した、液相における非結合抗体の、固相支持体からの分離を含む。本発明の実施に用いられ得る固体支持体には以下のような基質を含む：ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態）；塩化ポリビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポロスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；フッ化ポリビニリジン；ジアゾ化ペーパー；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなど。
代表的に、固体支持体は、化合物が充分に支持体に固定されているような、適切な結合条件下で、最初に固相成分（例えば、１つ以上の型共通および／または１つ以上の型特異的H.pylori I型抗原）と反応される。あるときには、抗原の支持体への固定は、より良い結合特性での抗原のタンパク質への最初の結合によって増強され得る。適切な結合タンパク質には、血清アルブミンのような巨大分子（ウシ血清アルブミン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、および当業者に周知の他のタンパク質を含む）が挙げられるが、これに限定されない。抗原を支持体に結合させるために用いられ得る他の分子には、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。このような分子、およびこれらの分子を抗原に結合する方法は当業者に周知である。例えば、Brinkley,M.A.,Bioconjugate Chem.（1992）3:2-13;Hashidaら、J.Appl.Biochem.（1984）6:56-63;ならびにAnjaneyuluおよびStaros,International J.of Peptide and Protein Res.（1987）30:117-124を参照のこと。
固体支持体の固相成分との反応後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって支持体から除去され、次いで支持体結合型成分は、リガンド部分を含むと予想される生物学的サンプル（例えば、固定化抗原に対する抗体）と、適切な結合条件下で接触される。いかなる非結合リガンドも除去するための洗浄の後、第２の結合部分は、適当な結合条件下で添加され、ここで、第２の結合物は、選択的に結合リガンドと結合され得る。第２の結合物の存在は、次いで当該分野で周知の技術を用いて検出され得る。
さらに特に、ELIZA法が用いられ得、ここでマイクロタイタープレートのウェルは、H.pylori型共通および／または型特異的H.pylori I型抗原（単数および複数）でコートされる。抗H.pylori免疫グロブリン分子を含む、または含むと予想される生物学的サンプルが、次いでコートされたウェルに添加される。一つのマイクロタイタープレートを用いることが所望されるアッセイにおいて、選択された数のウェルが、例えば第１の型特異的抗原部分でコートされ、異なる１セットのウェルが第２の型特異的抗原部分でコートされ、そして第３セットのウェルがH.pylori型共通抗原などでコートされ得る。代わりに、一連のELISAが続々と行われ得、ここで、独立したプレートが、それぞれ型共通、および型特異的抗原部分に用いられる。抗体が固定化抗原に結合するのを可能にするに充分なインキュべーション時間の後、プレート（単数および複数）は非結合型部分を除去するために洗浄され、そして検出可能な標識化第２の結合分子が添加され得る。第２の結合分子は、任意の捕獲サンプル抗体と反応され得、プレートは洗浄され、そして当該分野で周知の方法を用いて第２の結合分子の存在が検出される。
従って、１つの特定の実施態様において、生物学的サンプル由来の、抗型特異的抗原リガンド、および／または抗H.pylori型共通抗原リガンドの結合の存在は、抗体リガンドに指向された抗体を含む第２の結合物を用いて容易に検出され得る。多数の抗ヒト免疫グロブリン（Ig）分子は、当該分野において公知である（例えば、市販されている、ヤギ抗ヒトIgまたはウサギ抗ヒトIg）。本明細書中での使用のためのIg分子は、好ましくはIgG、またはIgA型のものであるが、IgMもまた、ある例においては適切であり得る。Ig分子は、とりわけ、当業者に公知の方法を用いて、容易に検出可能な酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびウレアーゼ）と、容易に結合され得る。次いで、適切な酵素基質が、検出可能なシグナルを産生するために用いられる。他の関連した実施態様において、競合型ELISA技術は、当業者に公知の方法を用いて実施され得る。
アッセイはまた、細菌性タンパク質、およびそれらの細菌性タンパク質に特異的な抗体が、沈降条件下で複合体を形成するように、溶液中で行われ得る。１つの特定の実施態様においては、H.pylori型共通抗原および／または型特異的抗原が、固相粒子（例えば、アガロースビーズなど）に、当該分野で公知の結合技術を用いて（例えば、直接的な化学結合、または間接的な結合）結合され得る。次いで、抗原コート粒子は、H.pylori I型、またはII型の抗体を含有すると予測される生物学的サンプルとの適切な結合条件下で、接触される。結合抗体間での架橋は、粒子−抗原−抗体複合凝集体の形成を生じる。この凝集体は、洗浄および／または遠心分離を用いてサンプルから沈降、ならびに分離し得る。反応混合物は、任意の多数の標準的な方法、例えば、上記の免疫診断法を用いて、抗体抗原複合体の存在の有無を分析し得る。
なおさらなる実施態様において、免疫親和性マトリックスは、抗H.pylori抗体を含むと予想される生物学的サンプルからのポリクローナル抗体集団が基質に固定されている場合に、提供され得る。これに関して、サンプルの最初の親和性精製は、固定化抗原を用いて行われ得る。従って、得られたサンプル調製物は、親和性支持体における強力な非特異的結合特性を回避して、抗H.pylori部分のみを含有する。多量に、そして抗原結合活性の良好な保持を有する免疫グロブリンを固定化（インタクトな免疫グロブリン、または特異的フラグメントの中の、いずれかに）する多数の方法が、当該分野において公知である。任意の特定の方法によって制限されることなく、固定化したプロテインA、またはプロテインGは、免疫グロブリンを固定するために用いられ得る。
従って、一旦、免疫グロブリン分子が免疫親和性マトリックスを提供するために固定されると、別々の、および異なった標識を有する、H.pylori型共通抗原および型特異的抗原が、適切な結合条件下で結合抗体と接触される。任意の非特異的結合抗原が免疫親和性支持体から洗浄された後に、結合抗原の存在は、当該分野で公知の方法を用いて、各々の特異的な標識についてアッセイすることにより、決定され得る。
H.pylori感染を診断するための、および本発明を用いた処置の経過をモニターするための特に好ましい方法は、例えば、伝統的なウエスタンブロッティング、およびドットブロッティング技術（例えば、RIBA▲Ｒ▼（Chiron Corp.,Emeryville,CA）試験）を組み合わせた、当該分野で公知の、ストリップ（strip）イムノブロットアッセイ（SIA）技術の使用を含む。これらのアッセイにおいて、H.pylori型共通、および型特異的H.pylori I型抗原は、個々に、別々の部分として、例えば、バンドまたはドットとして、膜状支持体上に固定される。従って、膜支持体上に「別々に固定化される」ことによって、抗原が混合されずに別々の成分として存在し、その結果、各々の抗原提示との反応性、または反応性の欠損が評価され得ることが意味される。H.pylori抗原に対する抗体を含むと予想される生物学的サンプルは、次いで試験膜と反応される。生物学的サンプル中の、抗H.pylori反応性の可視化は、比色酵素基質との結合において、抗ヒトIgG酵素結合物を用いて達成される。ヒトIgMおよびヒトIgGのような内部コントロールもまた、片（strip）上に提示され得る。アッセイは、手動で行われ得るか、または自動化された形式で用いられ得る。
一般に、VacAおよびCagAのような型特異的抗原は、約0.5μg/ml〜約５μg/ml、より好ましくは約0.5μg/ml〜３μg/ml、そして最も好ましくは約１〜２μg/mlの濃度中で片に適応される。あるいは、抗原の２つの濃度（例えば、低濃度および高濃度）が存在し得、感染の診断のため、および処置に対する応答をモニターするため、の両方に用いられ得る片を提供する。従って、例えば、VacAおよび／またはCagAは、上記のような特別な濃度、ならびに１つ以上の追加のバンドにおいて、約0.005μg/ml〜0.4μg/ml、より好ましくは約0.008μg/ml〜３μg/ml、および最も好ましくは約0.1g/ml〜0.2g/mlの濃度で、提供され得る。
型共通抗原、例えば、H.pylori溶解物が、約0.25μg/ml〜２μg/ml、より好ましくは約0.25μg/ml〜1.5μg/ml、そして最も好ましくは約0.5μg/ml〜１μg/mlの濃度で、適応され得る。試験片に適応される抗原の濃度が、用いられる特異的抗原に依存して変化すること、そして当業者によって容易に決定され得ることが、容易に明らかである。
IgGのようなIgコントロールは、一つの濃度、または２つの濃度（一方は低く、他方は高い）において存在し得る。例えば、IgGは、約50ng/ml〜250ng/ml、より好ましくは約75ng/ml〜200ng/ml、そして最も好ましくは約100ng/ml〜185ng/mlの濃度で存在し得る。より高い濃度のIgGはまた、低濃度のIgGと共に、例えば、約400ng/ml〜1200ng/ml、より好ましくは約450ng/ml〜1000ng/ml、そして最も好ましくは約500ng/ml〜950ng/mlの濃度で存在し得、別の内部コントロールを提供する。
H.pylori溶解物、および適切に固体支持体上に固定された型特異的抗原を含む上記のアッセイ試薬は、上記の免疫アッセイを行うため、適切な使用説明書および他の必要な試薬とともに、キット中に提供され得る。また、キットは、用いられる特定の免疫アッセイ、適切な標識、ならびに他のパッケージされた試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）に依存して、含まれ得る。上記のような標準的な免疫アッセイは、これらのキットを用いて行われ得る。
III．実施例
以下は本発明を行うための特別な実施態様の実施例である。実施例は例示的な目的のためにのみ与えられ、そしていかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図しない。
用いた数（例えば、量、温度など）の正確さを確実にするための努力が行われたが、もちろん、いくつかの実験的誤差および偏差が可能である。
実施例１
H.pylori VacAポリペプチドの産生
VacAポリペプチドは、154アミノ酸のヒトスーパーオキシドジスムダーゼ（SOD）の（Hallewellら、Nucl.Acids Res.（1985）13:2017-2134）、５アミノ酸のリンカー（Asn-Leu-Gly-Ile-Leu）、およびH.pylori CCUG17874のVacAアミノ酸配列のGly-311〜Ile-819（Covacciら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1993）90:5791〜5795;Telfordら、J.Exp.Med.（1994）179:1653〜1658）を含む、71.2kDaの融合タンパク質として、組み換え的に産生する。
特に、短縮型VacAタンパク質をコードするDNAを、PCRによって合成し、そしてSODをコードするDNA配列とインフレームで融合する。次いで、グルコース調節ADH2/GAPDHプロモーター（Cousensら、Gene（1984）61:265-275）を、増幅したフラグメントの5’末端に組み込み、そして得られたカセットを酵母発現ベクターpBS24.1にクローン化する（Pichuantesら、Protein Eng.,Principle and Prac.（1996）5:129-161）。このベクターは、酵母での自己増殖のための２μ、かつ逆方向反復（IR）配列、転写終結を確実にするためのα−因子ターミネーター、選択のためのleu-2およびURA3酵母遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子ならびにE.coliでの選択および増殖のためのColE1複製起点を含む。高発現レベルのH.pylori VacA組換えタンパク質が、SDS-PAGEにより分離された酵母タンパク質のクーマシーブルー染色およびイムノブロット分析により示されるように、Saccharomyces cerevisiae JSC310（Mat a、leu2、ura3-52、prbl-1122、pep4-3、prcl-407、::pDM15（G418R）、［cir0］）において得られた。VacA組換えタンパク質のヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列を、図3A〜図3Bに示す（配列番号：＿）。
培地からブドウ糖を枯渇して数時間後に収集した酵母細胞から、VacA組換えタンパク質を精製した。この状態は、ADH2/GAPDHプロモーターを活性化、および外来タンパク質の産生をはじめるために必要である（Pichuantesら、J.Biol.Chem.（1990）265:13890-13898）。細胞を、ガラスビーズで、Dynomill中で、溶解緩衝液（これは50mM Tris-HCl（pH8.0）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSFを含有する）を用いて破壊した。タンパク質を、溶解緩衝液中の尿素の量を増加（１M〜３M）させながら不溶性画分（48,400×gで30分の遠心から得られた）から回収した。48,400×gで30分の遠心の後、氷上で30分間撹拌しながら、目的のタンパク質を含む沈殿を、４Mの尿素、50mM DTT、１N NaOHを含む溶解緩衝液で溶解した。遠心分離によって細胞の残骸を除去した後、すぐに懸濁液を６N NaOHで、pH8.0まで滴定して戻した。上清を2.3％SDSにし、３分間煮沸し、室温まで冷却し、そしてPBS、0.1mM EDTA、0.1％SDS、pH7.4を含む緩衝液を用いてSephacryl S-400ゲル濾過カラム（Pharmacia）にロードした。組換えVacAタンパク質を含む画分をプールし、そしてAmicon concentrator（YM-10膜）で濃縮した。SDSを2.3％に、およびDTTを50mMに調整した後、さらなる画分のために、懸濁液を同じS-400カラムに戻し、ロードした。この手順は、＞90純粋なVacAタンパク質を収集した。
実施例２
H.pylori CagAポリペプチドの産生
268アミノ酸から29.2kDaの分子量を有するCagAポリペプチド（Helicobacter pyloriのChilean株のCagAタンパク質のGlu-748〜Glu-1015アミノ酸を含む）Chetx-1を、以下のように組み換え的に産生した。この縮重型CagAタンパク質をコードするDNAをPCRによって合成し、そして増幅フラグメントの5’末端に開始コドンATGを導入した。ADH2/GAPDHハイブリッドプロモーター（Cousensら、Gene（1984）61:265-275）を、次いでPCR合成フラグメントの5’末端に組み込み、そして得られたカセットを、本質的には上記のように、酵母発現ベクターpBS24.1にクローン化した。得られた組換えプラスミドは、Saccharomyces cerevisiae AD3（Mat a、leu2、ura3-52、prbl-1122、pep4-3、prcl-407、::pDM15（G418R）、LEU2（ΔAD）、［CIR0］）を形質転換するために用い、そして組換え抗原の発現を、SDS-PAGEによって分画された酵母タンパク質の、クーマシーブルー染色およびイムノブロット分析によってモニターした。CagA組換えタンパク質のヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列を図４に示す。
CagA組換えタンパク質を、溶解緩衝液（50mM Tris-HCl、150mM NaCl、lmM EDTA、1mM PMSF、pH8.0）中に懸濁した酵母細胞から精製し、そしてDynomill中でガラスビーズと共に破壊した。48,400×gで30分の遠心分離の後、上清を4M尿素にし、S Sepharose IEC平衡緩衝液でOD289＝0.00まで1/10（v/v）に希釈し、そしてタンパク質を0M NaCl〜0.5M NaClの直線勾配の平衡緩衝液で溶出した。CagAタンパク質を含む溶出ピークを回収し、そして30％硫酸アンモニウムで沈殿した。17,700×gで30分の遠心分離の後、沈殿を捨て、そして上記の条件下で、さらに10％固体硫酸アンモニウムで上清を沈殿させる。得られた沈殿物を、48,400×gで30分の遠心分離の後、最小量のPBS/8M尿酸に溶解し、2.3％SDS/50mM DTTに調整し、３分間煮沸し、室温まで冷却し、そしてPBS、0.1mM SDS、1mM EDTA、pH7.4を含む緩衝液を用いてSephacryl S-300ゲル濾過カラム（Pharmacia）にロードした。目的のタンパク質を含む画分を回収し、そしてAmicon concentrator（YM-10膜）で濃縮した。濃縮した物質を、2.3％SDS/50mM DTTにした後、第２の画分のために、懸濁液を同じS-300カラムに戻し、ロードした。この手順は、＞90％純粋なCagAタンパク質を収集した。
実施例３
型特異H.pylori抗原、および型共通H.pylori抗原を用いる、H.pylori片免疫ブロットアッセイ（SIA）
A.SIAは以下のようにして行った。型共通抗原を含む抗原の混合物を含む、H.pylori抽出物を、Bioseed、Inc.、Hillsborough、CAから得た。簡単には、抽出物を、ATCC 43504というATCC株名称を有するアメリカンタイプカルチャーコレクションから得たH.pylori細菌から調製した。抽出物を界面活性剤抽出および超音波処理を用いて調製した。
実施例１、および実施例２においてそれぞれ記載されるVacA型特異的抗原およびCagA型特異的抗原を、ニトロセルロース片上の、別々のバンドに１μg/ml〜２μg/mlの濃度で適用した。型共通抗原を含む溶解物を、同じニトロセルロースフィルター片上に0.5μg/ml〜１μg/mlの濃度で別の別個のバンドとしてコーティングした。内部コントロールとして、さらなるバンドを、精製ヒトIgGを低濃度（100ng/ml〜185ng/ml）、および高濃度（500ng/ml〜925ng/ml）で含ませた。他の片を上記のように抗原および溶解物でコーティングしたが、しかしこれらの片上では、溶解物はまず、0.5μg/ml〜１μg/mlの濃度（VacA）および0.5μg/ml以上の濃度（CagA）で溶解物に添加したVacA抗原、およびCagA抗原によって、増強した。図１は、上記のような抗原を有するニトロセルロース片の図である。
イムノブロットアッセイを、１バッチあたり30片を有するバッチ様式で処理した。全ての工程は、室温で行った。それぞれの片に番号を付け、次いで別のチューブに入れ、そこに１mlの希釈液（ウシタンパク質安定剤、ならびに保存剤として、界面活性剤、0.1％アジ化ナトリウム、および0.05％硫酸ゲンタマイシンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS））を添加し、そして、H.pylori I型に感染したとわかっている個体、H.pylori I型に感染したことが疑われている血清サンプル、およびコントロール被験体からの血清サンプルを、30μl適用した。チューブをゆっくりと４時間振盪し、吸引によって溶液を除去し、そして１mlの新鮮な希釈液を各チューブに添加した。チューブを30分間振盪し、吸引によって溶液を除去し、そして１mlの洗浄緩衝液（洗浄緩衝液濃縮物（50×）（保存剤として0.01％チメロサールを含むリン酸緩衝化界面活性剤溶液）から作製した）を各チューブに添加した。各チューブの中身を空にして１つの洗浄容器に移し、そして20秒間、旋回させることにより洗浄した。洗浄緩衝液を傾けて取り除き、そして30mlの新しい緩衝液を添加し、そしてこのプロセスを繰り返した。残留溶液は吸引によって取り除き、そして20mlの結合溶液（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（重鎖および軽鎖）、ウシタンパク質安定剤、保存剤として0.01％チメロサールを含む）を添加した。容器を110rpmで10分間回転させ、結合溶液を傾けて取り除き、そしてこの洗浄工程を３回繰り返した。残留溶液を吸引によって再び取り除き、そして20mlの基質／顕色剤（メタノール／リン酸緩衝化過酸化水素中の4-クロロ-1-ナフトール（napthol））を添加し、続いて15〜20分間110rpmで回転した。溶液をデカントして、そして片を蒸留水で２回洗浄した。発色した片を吸い取り紙と向かい合わせて置き、そして暗所で30分間乾燥させた。次いで片を、３時間の乾燥中に読みとった。H.pylori抗原バンドの色の強度は、以下のアルゴリズムを用いて-（0）〜4+の範囲の値を割り当てた。低いIgGバンドは1+の値を割り当て、高いIgGバンドには3+の値を割り当てた。次いで、それらのバンドの強度を、IgGコントロールバンドの強度と比較する方法に従って、溶解物のバンド、ならびにVacAのバンド、およびCagAのバンドを０から4+で評価する。
溶解物のバンドに対して1+以上と評価されたH.pylori抗原バンドのいずれかを有するサンプルは、H.pylori感染に陽性であると判断する。CagAおよび／またはVacAのバンドに対して1+以上の反応性に加えて、溶解物のバンドに対する1+以上の反応性は、H.pylori I型感染について陽性であると判断する。どのバンドに対しても1+以上の反応性を示さないサンプルは、陰性と判断する。
このアッセイを用いて、内視鏡検査によって、H.pylori感染に陽性であると決定された個体から得た29サンプル（十二指腸潰瘍を有するのが12、胃潰瘍を有するのが9、胃炎を有するのが8）を、反応性について試験した。別の試験において、十二指腸潰瘍を有するとわかっている80個体を試験した。本結果を、表１および表２にそれぞれ示す。理解され得るように、本アッセイは、H.pylori感染について非常に的中する。
B．別のSIAは、以下のように行った。H.pylori潰瘍は、ニトロセルロース片に狭いバンドとして１μg/ml〜２μg/mlの濃度で適用した。上記のVacA抗原は、同じ片上に１μg/ml〜２μg/ml、および0.1μg/ml〜0.2μg/mlの２つの濃度で適応した。CagA型特異的抗原もまた、その片上に同じ２つの濃度で適用した。内部コントロールとして、さらなるバンドは、精製ヒトIgGを低濃度（100ng/ml〜185ng/ml）、および高濃度（500ng/ml〜925ng/ml）で含んだ。図２は上記のような抗原を有するニトロセルロース片の図である。
アッセイは上記のように行った。
また、H.pylori抗原バンドの色の強度を、上記のように割り当てた。
従って、H.pylori感染検出するための新規の方法、ならびにH.pylori I型およびII型を区別する方法、ならびに処理の経過をモニターする方法を開示する。本発明の好ましい実施態様が、いくつか詳細に記載されているが、明らかな改変が、添付の請求の範囲によって規定されるとおりの、本発明の精神および範囲から逸脱せずに行われ得ることが理解される。
Claims (44)
- 被験体においてHelicobacter pylori感染を検出する方法であって、以下：
（a）該被験体から生物学的サンプルを提供する工程；ならびに
（b）H.pylori抗体が該生物学的サンプル中に存在する場合に、H.pylori抗体がH.pylori型共通抗原、および／または型特異的H.pylori抗原と結合可能にする条件下で、該生物学的サンプルと、１つ以上の該H.pylori型共通抗原とを反応させる工程、ならびに該生物学的サンプルと、１つ以上の精製した該型特異的H.pylori I型抗原とを反応させる工程、
これらによって、被験体中のH.pylori感染の存在または非存在を検出する工程、を包含する方法。 - 前記H.pylori感染が、H.pylori I型である、請求項１に記載される方法。
- 前記H.pylori感染が、H.pylori II型である、請求項１に記載される方法。
- 請求項１に記載される方法であって、さらに以下の工程：
（c）結合していない抗体を除去する工程；
（d）前記結合した抗体と結合し得る１つ以上の部分を提供する工程；および
（e）該１つ以上の部分の存在または非存在を検出する工程、
これらによって、H.pylori感染の存在または非存在を検出する工程を包含する方法。 - 前記１つ以上の部分が検出可能に標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体を含有する、請求項４に記載される方法。
- 前記検出可能な標識が蛍光物質または酵素である、請求項５に記載される方法。
- 前記１つ以上の型共通抗原、および前記１つ以上の型特異的抗原が、固体支持体上に固定されている、請求項１に記載される方法。
- 前記１つ以上の型共通抗原、および前記１つ以上の型特異的抗原が、同じ該固体支持体上に固定されている、請求項７に記載される方法。
- 前記１つ以上の型共通抗原、および前記１つ以上の型特異的抗原が、異なる固体支持体上に固定されている、請求項７に記載される方法。
- 前記固体支持体がニトロセルロース片である、請求項７に記載される方法。
- 前記１つ以上の型特異的抗原が、H.pylori I型VacAポリペプチドおよびH.pylori I型CagAポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載される方法。
- 前記１つ以上の型共通抗原が、H.pyloriの溶解物中に提供される、請求項１に記載される方法。
- 前記１つ以上の型共通抗原が、H.pyloriウレアーゼを含む、請求項１に記載される方法。
- 前記生物学的サンプルがヒト血清サンプルである、請求項１に記載される方法。
- 生物学的サンプル中において、Helicobacter pylori I型感染とHelicobacter pylori II型感染とを区別する方法であって、該方法が以下の工程：
（a）ニトロセルロース片上の、１つ以上のH.pylori型共通抗原を含むH.pylori溶解物を固定する工程、およびニトロセルロース片上に、１つ以上の精製した型特異的H.pylori I抗原を固定する工程；
（b）工程（a）由来の、該ニトロセルロース片を、該生物学的サンプルと、抗H.pylori I型抗体および抗H.pylori II型抗体が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、該溶解物中に存在するH.pylori型共通抗原および／または該型特異的H.pylori I型抗原と結合可能にする条件下で、接触させる工程；
（c）結合していない抗体を除去する工程；
（d）検出可能に標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体を提供する工程；ならびに
（e）該生物学的サンプル中の結合型抗ヒトイムノグロブリン抗体の存在の有無を検出する工程、
これらによってH.pylori I型感染、および／またはH.pylori II型感染の存在の有無を検出する工程を包含する方法。 - 前記１つ以上の型共通抗原、および前記１つ以上の型特異的抗原が、同じ前記ニトロセルロース片上に固定されている、請求項１５に記載される方法。
- 前記１つ以上の型共通抗原、および前記１つ以上の型特異的抗原が、異なるニトロセルロース片上に固定されている、請求項１５に記載される方法。
- 前記１つ以上の型特異的抗原が、H.pylori I型VacAポリペプチド、およびH.pylori I型CagAポリペプチドからなる群から選択される、請求項１５に記載される方法。
- 前記生物学的サンプルがヒト血清サンプルである、請求項１５に記載される方法。
- Helicobacter pylori感染のための治療を受けている被験体をモニターする方法であって、以下の工程：
（a）該被験体から生物学的サンプルを提供する工程；
（b）１つ以上のH.pylori型共通抗原を含むH.pylori溶解物をニトロセルロース片上に固定する工程、および１つ以上の精製した型特異的H.pylori I型抗原をニトロセルロース片上に固定する工程；
（c）工程（b）由来の、該ニトロセルロース片を、該生物学的サンプルと、抗H.pylori I型抗体および抗H.pylori II型抗体が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、該溶解物中に存在するH.pylori型共通抗原、および／または該型特異的H.pylori I型抗原と結合可能にする条件下で、接触させる工程；
（d）結合していない抗体を除去する工程；
（e）検出可能に標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体を提供する工程；ならびに
（f）該生物学的サンプル中の結合型抗ヒトイムノグロブリン抗体の存在の有無を検出する工程、
これらによって、該感染の処置の経過をモニターする工程を包含する、方法。 - 前記１つ以上の型共通抗原、および前記１つ以上の型特異的抗原が、同じ該ニトロセルロース片上に固定されている、請求項２０に記載される方法。
- 前記１つ以上の型共通抗原、および前記１つ以上の型特異的抗原が、異なるニトロセルロース片上に固定されている、請求項２０に記載される方法。
- 前記１つ以上の型特異的抗原が、H.pylori I型VacAポリペプチド、およびH.pylori I型CagAポリペプチドからなる群から選択される、請求項２０に記載される方法。
- 前記生物学的サンプルがヒト血清サンプルである、請求項２０に記載される方法。
- 別々にその上に固定化した、１つ以上のH.pylori型共通抗原、および１つ以上の精製型特異的H.pylori I型抗原を含む、膜支持体。
- 前記１つ以上の型特異的抗原が、H.pylori I型VacAポリペプチド、およびH.pylori I型CagAポリペプチドからなる群から選択される、請求項２５に記載される膜支持体。
- 前記１つ以上の型共通抗原が、H.pyloriの溶解物中に提供される、請求項２５に記載される膜支持体。
- 前記１つ以上の型共通抗原が、H.pyloriウレアーゼを含む、請求項２５に記載される膜支持体。
- さらに、別々にその上に固定化したヒトイムノグロブリンを含む、請求項２５に記載される膜支持体。
- 前記膜支持体がニトロセルロース片である、請求項２５に記載される膜支持体。
- ニトロセルロース支持体であって、以下：
（a）H.pylori I型VacAポリペプチド；
（b）H.pylori I型CagAポリペプチド；
（c）H.pyloriウレアーゼ；および
（d）ヒトIgG、
を含み、ここで、該H.pyloriポリペプチドおよびウレアーゼ、および該ヒトIgGが、該ニトロセルロース支持体上に別々のバンドとして固定されている、
ニトロセルロース支持体。 - ニトロセルロース支持体であって、以下：
（a）H.pylori I型VacAポリペプチド；
（b）H.pylori I型CagAポリペプチド；
（c）H.pylori溶解物；および
（d）ヒトIgG、
を含み、ここで該H.pyloriポリペプチドおよび溶解物、および該ヒトIgGが、該ニトロセルロース支持体上に別々のバンドとして固定化されている、
ニトロセルロース支持体。 - H.pylori感染を検出するための免疫診断試験キットであって、以下：
（a）１つ以上のH.pylori型共通抗原；
（b）１つ以上の精製型特異的H.pylori I型抗原；および
（c）該免疫診断試験を行うための使用説明書、
を含む、免疫診断キット。 - 前記１つ以上の型特異的抗原が、H.pylori I型VacAポリペプチド、およびH.pylori I型CagAポリペプチドからなる群から選択される、請求項３３に記載の免疫診断試験キット。
- 前記１つ以上の型共通抗原が、H.pyloriの溶解物中に提供される、請求項３３に記載の免疫診断試験キット。
- 前記１つ以上の型共通抗原がH.pyloriウレアーゼを含む、請求項３３に記載の免疫診断試験キット。
- 生物学的サンプル中において、H.pylori I型感染、H.pylori II型感染とを区別する免疫診断試験キットであって、該試験キットが以下：
（a）ニトロセルロース片上に固定された１つ以上のH.pylori型共通抗原を含むH.pylori溶解物；
（b）ニトロセルロース片上に固定された１つ以上の精製型特異的H.pylori I型抗原；および
（c）該免疫診断試験を行うための使用説明書、
を含む、キット。 - 前記１つ以上の型特異的抗原が、H.pylori I型VacAポリペプチド、およびH.pylori I型CagAポリペプチドからなる群から選択される、請求項３７に記載の免疫診断試験キット。
- 前記溶解物、および前記１つ以上の型特異的抗原が、同じ該ニトロセルロース片上に固定化されている、請求項３７に記載の免疫診断試験キット。
- 前記溶解物、および前記１つ以上の型特異的抗原が、異なるニトロセルロース片上に固定化されている、請求項３７に記載の免疫診断試験キット。
- Helicobacter pylori感染の治療を受けている被験体をモニターする免疫診断試験キットであって、該試験キットが以下：
（a）ニトロセルロース片上に固定された１つ以上のH.pylori型共通抗原を含むH.pylori溶解物；
（b）ニトロセルロース片上に固定された１つ以上の精製型特異的H.pylori I型抗原；および
（c）該免疫診断試験を行うための使用説明書、
を含む、キット。 - 前記１つ以上の型特異的抗原が、H.pylori I型VacAポリペプチド、およびH.pylori I型CagAポリペプチドからなる群から選択される、請求項４１に記載の免疫診断試験キット。
- 前記溶解物、および前記１つ以上の型特異的抗原が、同じ該ニトロセルロース片上に固定化されている、請求項４１に記載の免疫診断試験キット。
- 前記溶解物、および前記１つ以上の型特異的抗原が、異なるニトロセルロース片上に固定化されている、請求項４１に記載の免疫診断試験キット。
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