DE3587949T2

DE3587949T2 - Synthetische polypeptide und antikörper gegen epstein-barr-virus nuklearantigen.

Info

Publication number: DE3587949T2
Application number: DE3587949T
Authority: DE
Inventors: Dennis Carson; Richard Houghten; Gary Rhodes; John Vaughan
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1984-08-08
Filing date: 1985-08-02
Publication date: 1995-07-06
Anticipated expiration: 2005-08-03
Also published as: EP0191813A4; NZ213035A; AU4721085A; IE851954L; DK156786A; AU585529B2; IL76037A; ZA855971B; USRE33897E; WO1986001210A1; CA1292839C; EP0191813A1; IE65391B1; DK172035B1; US4654419A; ES545971A0; DK156786D0; JPS62500027A; ES8700442A1; JPH0678359B2

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Immunogene, Antigene, Inokula, Antikörper, Verfahren und Systeme, die bei der Behandlung und Diagnose von mit Epstein-Barr-Virus in Zusammenhang stehenden Erkrankungen nützlich sind, und sein nukleäres Antigen.

Hintergrund der Erfindung

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein Mitglied der Herpesvirenfamilie und das verursachende Agens der infektiösen Mononukleose (IM) in Menschen. EBV ist weiterhin in die Pathogenese von Burkitt's Lymphomen, Nasopharyngealkarzinomen und B-Lymphozytenneoplasmen, die in immunsupprimierten Patienten entstehen, verwickelt. Es gibt weiterhin Indizien, die auf eine mögliche Rolle dieses Virus in menschlichen Autoimmunerkrankungen hinweisen, wie beispielsweise der rheumatoiden Arthritis und dem Sjogren's Syndrom.
EBV ist ein extrem weit verbreitetes Agens, das weltweit 80 bis 100% der Bevölkerung infiziert. Die ursprüngliche oder Primärinfektion kann akut oder subklinisch verlaufen. Ihr folgt ein langer Zeitraum, währenddessen die EBV-Infektion in den im zirkulierenden Blut, in den Lymphknoten und in der Milz vorhandenen B-Lymphozyten latent ist.
Latenz ist ein Prozeß, durch den ein Virus intrazellulär in einem nichtexprimierenden oder teilweise exprimierenden Zustand vorhanden ist. Diese Latenz kann reaktiviert werden. Obwohl die Wirtsfaktoren, die die Latenz in vivo kontrollieren, kaum bekannt sind, gibt es einige Hinweise, die nahelegen, daß das Versagen eines oder mehrerer Immunmechanismen ein bedeutender Faktor ist. Es ist berichtet worden, daß zytotoxische und suppressive T-Zellelemente der Immunantwort gegen EBV für die Suppression einer akuten Infektion durch EBV bei der infektiösen Mononukleose sehr wichtig sind. Sie sind außerdem bedeutsam bei der Verhinderung des unkontrollierten Wachstums von latent mit EBV infizierten B-Lymphozyten.
Man nimmt an, daß das Versagen des T-Zell-Suppressormechanismus wichtig ist, um das Entstehen des afrikanischen Burkitt-Lymphoms, des Nasopharyngealkarzinoms, von B-Zell-Lymphomen, die als Folge einer immunsuppressiven Therapie entstehen, die zur Verhinderung der Abstoßung von Organtransplantaten eingesetzt wird, und von Lymphomen, die während der Behandlung von verschiedenen Autoimmunerkrankungen entstehen, zuzulassen. Epstein und Achong, Hrsg., "The Epstein-Barr Virus", Springer-Verlag, Heidelberg (1970), und Crawford et al., Lancet, 1355 (1980). Weiterhin wird angenommen, daß das Versagen dieser T-Zell-Mechanismen und des daraus folgenden Überwachstums von EBV-infizierten Lymphozyten eine Rolle bei der rheumatoiden Arthritis spielt. Slaughter et al, J. Exp. Med., 148:1429 (1978); Depper et al, J. Immunology, 127:1899 (1981) und Tosato et al, N. Engl. J. Med. 305:1238 (1981).
Die serologischen und zellvermittelten Immunantworten, die der Primärinfektion mit EBV folgen, sind gut dokumentiert und reflektieren die Wirtsantwort auf die während des Infektionsverlaufs exprimierten viralen Antigene. Das Profil dieser Antworten sowie der Nachweis des Antigens in Geweben werden für die Diagnose von EBV-assoziierten Erkrankungen zunehmend nützlich.
Das früheste EBV-assoziierte Antigen, das nach einer Infektion nachgewiesen werden kann, ist EBV-induziertes nukleäres Antigen (EBNA). EBNA ist im Kern von latent infizierten Wachstums-transformierten B-Lymphozyten nachgewiesen worden. EBNA ist auch in den Kernen von Lymphoblasten aus afrikanischen Burkitt-Tumoren und anaplastischen Nasopharyngealkarzinomzellen nachgewiesen worden. Die Konzentration von EBNA in den Zellkernen von EBV-infizierten B-Lymphozyten fluktuiert während verschiedener Phasen des Zellvermehrungszyklus. Es wird daher angenommen, daß EBNA zyklisch synthetisiert und abgebaut wird. Als ein Ergebnis eines solchen Abbaus durchqueren Proteinfragmente (Polypeptide) von EBNA das zelluläre Zytoplasma und man nimmt an, daß sie auf der äußeren Membran existieren oder exprimiert werden. Es sind jedoch bis heute keine spezifischen EBNA-Abbaupolypeptide identifiziert worden.
Es wird angenommen, daß, während sie in oder auf der äußeren Zellmembran sind, die EBNA-Abbaupolypeptide einen bedeutenden Stimulus für die T-Lymphozyten des Wirtes darstellen und die Immunantwort initiieren, die zur Erzeugung von anti-EBNA-Antikörpern führt. Es wird weiter angenommen, daß die spezifische T-Zell-Antwort auf B-Zellen, die EBNA-Abbau-Polypeptide aufihren Oberflächen exprimieren, zur Erzeugung von zytotoxischen und suppressiven T-Zellen beitragen, die für die Beschränkung des Wachstums von EBNA enthaltenden (EBV-infizierten) B-Lymphozyten wichtig sind.
Tests auf die Gegenwart von sowohl EBNA als auch anti-EBNA-Antikörpern sind daher in verschiedenen häufigen klinischen Situationen von Bedeutung. Zusätzlich wäre ein Impfstoff gegen EBV-infizierte B-Lymphozyten ebenfalls von klinischer Bedeutung. anti-EBNA-Antikörper werden typischerweise unter Verwendung des mühsamen anti-Komplement-Immunfluoreszenzverfahrens (ACIF) getestet. Reedman et al., Int. J. Cancer, 11:499-520 (1973). Dieser Test involviert die Fixierung von EBV-transformierten humanen B-Zellen auf Objektträgern für das Mikroskop. Den fixierten Zellen werden dann unterschiedlichen Verdünnungen eines Patientenserums zugefügt. Weil antikomplementäre Seren zu falsch negativen Reaktionen oder Prozonen führen können, wenn sie mit dem Komplement gemischt werden (ein zweistufiges Verfahren), ist es unbedingt erforderlich, die Testzellabstriche nacheinander mit Serum, Komplement und dem anti-Komplement-Fluoreszenz-Konjugat zu beladen (ein dreistufiges Verfahren).
Bei diesem Test gibt es verschiedene Probleme. Diese umfassen die Tatsache, daß der Test relativ unempfindlich ist und eine durch das Komplement vermittelte Amplifikation erfordert. Zusätzlich ist dieser Test nicht vollständig spezifisch und kann bei Patienten, deren Serum Antikörper gegen Säugetierzellkerne enthält, nicht interpretiert werden. Weiterhin sind quantitative Ergebnisse, die unter Verwendung eines anti-Komplement-Immunfluoreszenztests erhalten wurden, schwer zu reproduzieren. Als Folge dieser und anderer Gründe sind die Tests für anti-EBNA-Antikörper im allgemeinen auf einige wenige spezialisierte Laboratorien beschränkt geblieben.
Die obenerwähnten Schwierigkeiten beim Testen auf anti-EBNA-Antikörper beruhen auf dem Fehlen von relativ reinem EBNA. Die Reinigung von EBNA aus Säugetierzellgewebekulturen ist wegen der geringen Konzentration und Polymorphologie des Antigens komplex. Obwohl es leichter und weniger kostspielig ist, ganze Zellen, die EBNA exprimieren, zu verwenden, wie in dem gegenwärtigen Verfahren, sind die Probleme der Spezifität und Reproduzierbarkeit die direkte Folge der Verwendung ganzer Zellen.
Die Technologien genetischer Manipulation und synthetischer Polypeptide haben neuerdings Lösungen für das Problem der Herstellung großer Mengen von Proteinen und Polypeptidantigenen bereitgestellt. Jedoch sind beide Verfahren nur dann effektiv, wenn die Aminosäuresequenz des nativen Proteins bekannt ist.
Die Aminosäuresequenz eines natürlichen Proteins kann aus dem Protein selbst bestimmt werden, aber dies ist oft schwierig. Die Nukleotidsequenz des Gens, das für das Protein kodiert, kann ebenso die Aminosäuresequenz des Proteins ergeben. Jedoch haben alle DNA-Sequenzen drei mögliche Leseraster, deren jedes ein unterschiedliches Protein ergibt. Daher muß das korrekte Leseraster bekannt sein, um die richtige Aminosäuresequenz eines Proteins aus seinem Gen abzuleiten.
Das korrekte Leseraster einer für ein Protein kodierenden DNA-Sequenz, und daher die Aminosäuresequenz des Proteins, kann durch die Verwendung von Antikörpern bestimmt werden. Diese Strategie involviert das Herstellen einer stattlichen Reihe von Proteinfragmenten oder Polypeptiden, deren Aminosäuresequenzen den bei den drei möglichen Genprodukten erhaltenen Sequenzen entsprechen. Die Proteinfragmente oder Polypeptide, die Antikörper induzieren, die mit dem natürlichen Proteinprodukt des Genes immunreagieren, identifizieren dadurch das korrekte Leseraster des Genes. Umgekehrt wird die Beziehung zwischen Gen und Protein auch etabliert, wenn Antikörper gegen das natürliche Protein die hergestellten Proteinfragmente oder Polypeptide erkennen.
Heller et al., J. Viro., 44:311-320 (1982), berichteten über die DNA-Sequenz für einen Teil des EBV-Genomes, von der festgestellt wurde, daß sie einen internen Bereich enthält, der IR3 genannt wurde, und aus drei direkten Wiederholungen einer Hexanukleotid- und zwei Nonanukleotidsequenzen besteht. Sie führten Beweise an, die nahelegen, daß die IR3 umgebende und umfassende Sequenz das für EBNA kodierende Gen enthält. Da es jedoch nicht bekannt war, welcher der drei möglichen Leseraster der DNA-Sequenz translatiert wurde, waren Heller et al., s.o., jedenfalls nicht in der Lage, die Aminosäuresequenz für das mögliche EBNA-Protein definitiv abzuleiten.
Im September 1983 berichteten Hennessy und Kieff, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 80:5665-5669 (1983) über die Etablierung des natürlichen Leserasters für die von Heller et al., s.o., publizierte EBV DNA-Sequenz. Im wesentlichen isolierten sie IR3-DNA, spalteten sie in kleine zufällige Stücke und insertierten die Stücke in das lacZ-Gen eines E. coli-Expressionsvektors so, daß alle drei Leseraster des EBNA-Genes exprimiert wurden, jeder in einem anderen Klon. Das lacZ-Gen kodiert für beta-Galaktosidase, ein bakterielles Enzym. Das IR3-lacZ-Gen-Fusionsprodukt wird in E. coli als Fusionsprotein exprimiert, wobei die IR3-Protein-Sequenz zwischen den Aminosäuren 7 und 9 (8 wird während des Konstruktionsverfahrens deletiert) des β-Galaktosidaseproteinmoleküles insertiert wird.
Hennessy und Kieff identifizierten eine IR3-lacZ-Genfusion, die IR3-DNA in ihrem natürlichen Leseraster exprimierte, indem sie nach Fusionsproteinen suchten, die von anti-EBNA-positiven Humanseren erkannt wurden. Ein so identifiziertes Plasmid wurde pKH182-44 genannt.
Um zu bestätigen, daß das von pKH182-44 exprimierte Protein EBNA- spezifische antigene Determinanten enthielt, erzeugten Hennessy und Kieff, s.o., in Kaninchen Antiseren gegen Bromcyan(CNBr)-gespaltenes IR3-Galaktosidasefusionsprotein. Das Bromcyanfragment, das als ein Immunogen verwendet wurde, enthielt 53 Aminosäuren, die zu EBNA homolog waren, und 89 Aminosäuren, die zu beta- Galaktosidase homolog waren. Diese Antiseren erkannten bei Verwendung indirekter Immunfluoreszenz in EBV-infizierten Zellen natürliches EBNA.
Die Ergebnisse von Hennessy und Kieff scheinen von der repetitiven Natur der EBNA-IR3-Domäne abhängig zu sein. Das von pkH182-44 erzeugte Fusionsprotein enthält ein relativ langes Segment, das zu der IR3-Domäne homolog ist (z.B., 53 Aminosäuren). Es ist daher nicht überraschend, daß das Fusionsprotein und dessen Bromcyanfragment antigene Determinanten enthielten. Weiter bestimmten Hennessy und Kieff nicht, welche der in ihrem Fragment wiederholten Sequenzen als antigene Determinanten wirkten.
Obwohl Hennessy und Kieff in der Lage waren, ein Material genetisch herzustellen, das von anti-EBNA-Antikörpern in menschlichem Serum erkannt wird, wäre dessen klinische Verwendung wegen seines Aufbaus mühsam. Das Segment mit 53 Aminosäureresten aus ihrem Fusionsprotein, das homolog zu EBNA ist, ist physisch und chemisch Teil des beta-Galaktosidaseproteines. Seine immunologischen Eigenschaften werden daher durch jene Teile des beta-Galaktosidasemoleküles beeinflußt, von denen es nicht getrennt werden kann. Tatsächlich reagierten alle in ihrer Untersuchung verwendeten Humanseren mit beta-Galaktosidase und erforderten eine Behandlung mit beta-Galaktosidase, um diese Reaktivität zu adsorbieren und entfernen, bevor die Spezifität gegen das genetisch hergestellte Protein getestet wurde.
Ein anderer Ansatz zu den in Zusammenhang stehenden Problemen der Bestimmung des korrekten Leserasters eines Genes und der Herstellung großer Mengen von Pathogen-verwandten Antigenen (Immunogenen) für klinische und diagnostische Zwecke ist die Verwendung der synthetischen Polypeptidchemie. Dieses Verfahren der Herstellung von Antigenen (Immunogenen) hat im Vergleich zu den oben beschriebenen Verfahren der genetischen Manipulation Vorteile. Synthetische Polypeptidantigene enthalten keine natürlichen Proteinnebenprodukte oder Fragmente davon und daher schließt deren Verwendung die Möglichkeit einer unerwünschten Kreuzreaktivität und die Notwendigkeit, Serumproben wie in der Untersuchung von Hennessy und Kieff vorzubehandeln, aus.
Während das allgemeine Konzept der Herstellung synthetischer Antigene (Immunogene) und deren Verwendung zur Induktion von Antikörpern einer vorbestimmten Spezifität beschrieben worden ist, bleibt ein großer Bereich dieser Technologie, der sich weiterhin einer Vorhersagbarkeit entzieht. Dafür gibt es mindestens zwei Gründe. Erstens induziert ein synthetisches Antigen (Immunogen) nicht notwendigerweise Antikörper, die mit dem intakten Protein in seiner nativen Umgebung immunreagieren. Zweitens immunreagieren die natürlichen Antikörper eines Wirtes gegen ein natürlich auftretendes Immunogen, beispielsweise ein virales Protein, kaum mit einem Polypeptid, das einem kurzen linearen Teil der Aminosäuresequenz des Immunogenes entspricht. Von dem letztgenannten Phänomen wird angenommen, darauf zu beruhen, daß den kurzen linearen Polypeptiden die erforderlichen sekundären und tertiären Konformationsstrukturen fehlen.
Eine Postersitzung mit dem Titel "Mapping the Antigenic regions of Epstein-Barr nuclear Antigen using synthetic peptides" wurde von G. Rhodes et al beim Burroughs Wellcome-UCLA Symposium, Steamboat Springs, Colorado, U.S.A. (April 1984) präsentiert. Viele der Arbeiten zur Bindung von Peptiden durch Antikörper, die gegen Proteine hergestellt worden sind, sind in einem Review von Benjamini, E., et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 58:85- 134 (1972), zusammengefaßt. Die Rolle der Peptidstruktur bei der Antikörperbindung ist von Goodman, J. W., Immunochem 6:139-149 (1969), betont worden.
Die meisten der Untersuchungen, die sich damit befaßten, wie Sequenzveränderungen der peptide die Antikörperbindung beeinflussen, sind als Hinweis daraufinterpretiert worden, daß die Struktur der Antikörperbindungsstelle eine vorherrschende Rolle spielt. Die Wirkung von Sequenz- und Strukturveränderungen in diesen Untersuchungen ist vermischt und schwierig voneinander zu trennen. Einige dieser Untersuchungen können gleichermaßen gut durch Strukturveränderungen im Antigen, die die Bindung beeinflussen, erklärt werden.
Eine Antikörperantwort auf molekularer Ebene bezieht die Bindung eines Antigens definierter Sequenz (Primärstruktur) und in einer definierten Konformation (Sekundär- und Tertiärstruktur) ein. Die Immunantwort auf ProteinAntigene ist traditionell als gegen die primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur des Proteins gerichtet interpretiert worden.
Dieses Klassifizierungsschema mag einige Gültigkeit für Proteine mit gut definierter Gesamtstruktur bei physiologischen Temperaturen und Lösungen haben. Seine Gültigkeit ist jedoch für Peptid- Antigene mit einer dynamischeren Struktur zweifelhaft.
Einige Gruppen haben über Strukturuntersuchung von Polymeren einer sich wiederholenden Sequenz aus Glycin und Alanin oder Glycin und Serin berichtet, die als Modelle für Seidenfibroine (Anderson et al., J. Mol. Biol. 67:459-468 (1972)) und Kollagen (Anderson et al., BBRC 39:802-808 (1970)); Doyle et al., J. Mol. Biol. 51:47-59 (1970) synthetisiert worden sind. Die systematischsten Untersuchungen waren die von Brack et al., Biopolymers 11:563-386 (1972), der über die Synthese einer Reihe von Blockhomopolymerpolypeptiden berichtete, in denen die sich wiederholenden Einheiten des Homopolymerblockes die Formel (Alax-Glyx) hatten, wobei, wenn x = 1, y = 1, 2 und 3 ist; wenn x = 2, y = 1, 2 und 3 und wenn x = 3, y = 3.
Die Ergebnisse dieser letztgenannten Studie waren, daß im festen Zustand die Blockhomopolymere, die im wesentlichen aus Alanin zusammengesetzt sind, alpha-helikal waren, und daß solche, die im wesentlichen Glycin enthalten, ungeordnet waren. Weiter wurde berichtet, daß Polyalaninlösung alphahelikal war, aber Poly(Ala&sub2;- Gly&sub1;) in beta-antiparalleler Form vorlag. Es wurde angegeben, daß die glycinreicheren Polymere eine andere fixierte Struktur hatten, die weder eine Alphahelix, noch Betastruktur war.
Die Homopolymerblöcke aus Glycin und Alanin, über die von Brack et al berichtet worden war, wurden durch Kondensationspolymerisation von sich wiederholenden Di- bis Hexapeptideinheiten mit einem carboxyterminalen Glycylrest in aktiver Esterform hergestellt. Für Poly(Ala-Gly2) wurden Polymerisationsgrade von 2 bis 68 berichtet. Obwohl die in jenen Untersuchungen verwendeten Lösungsmittel physiologisch nicht verträglich waren, wie z.B. Wasser oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, veranschaulichen die Ergebnisse zwei Punkte: (1) Strukturveränderungen können auftreten, wenn sich die Sequenz des Polypeptides verändert, und (2) Strukturveränderungen treten auch während der Transition von Lösung zum festen Zustand auf.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein synthetisches Polypeptid, das die Erzeugung von Antikörpern, die mit dem nukleären Antigen von Epstein-Barr-Virus (EBNA) immunreagieren, induzieren kann. Das Polypeptid enthält bis zu 20 Aminosäurereste und schließt eine Sequenz ein, die, von links nach rechts und in der Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus genommen, durch die Formel dargestellt wird, die ausgewählt ist aus:
(i) -Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys-Arg- Pro-Met-;
(ii) -Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly-Leu- Gly-Glu-;
(iii) -Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-;
(iv) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Gly-Arg-;
(v) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;
(vi) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-;
(vii) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Ala-Gly-;
(viii) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-;
(ix) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;
(x) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala- Gly-Gly-Ala-Gly-;
(xi) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala- Gly-;
(xii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-;
(xiii) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Ala-Gly-;
pharmazeutisch verträgliche Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon. Bevorzugt sind außerdem die entsprechenden Polypeptide selber, d.h.:
(i) H-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys- Arg-Pro-Met-OH;
(ii) H-Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly- Leu-Gly-Glu-OH;
(iii) H-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-OH;
(iv) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Gly-Arg-OH;
(v) H-Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH;
(vi) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH;
(vii) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-OH;
(viii) H-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Cly-Gly-Gly-Ala-Gly- Gly-Ala-Gly-Gly-OH;
(ix) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH;
(x) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH;
(xi) H-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-OH;
(xii) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH;
(xiii) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-OH;
pharmazeutisch verträgliche Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein synthetisches Multimer, das eine Vielzahl von miteinander verbundenen synthetischen sich wiederholenden Polypeptideinheiten enthält, wobei mindestens eine der sich wiederholenden Einheiten eines der oben beschriebenen Polypeptide ist. Die sich wiederholenden Polypeptideinheiten können auf Kopf-zu-Schwanz-Weise durch Amidbindungen verbunden sein. Alternativ können die synthetischen Polypeptidmonomere miteinander durch andere als Amidbindungen verbunden sein, um ein polymeres Multimer zu bilden, beispielsweise durch die Verwendung von intramolekularen interpolypeptidischen Cysteindisulfid-Bindungen.
In einer anderen Ausführungsform wird eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptides in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel verwendet, um ein Inokulum zu bilden, das Antikörper induzieren kann, die mit EBNA immunreagieren. Zusätzlich zu seiner Verwendung für die Erzeugung von Antikörpern kann das erfindungsgemäße Inokulum als ein Impfstoff im Menschen, als ein Mittel zur Induktion einer aktiven Immunität gegen Lymphozyten, die EBNA oder Fragmente davon aufihrer Zelloberfläche exprimieren, verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Rezeptormolekül, das eine Antikörperbindungsstelle enthält, die mit EBNA immunreagieren kann. Der Rezeptor wird gegen ein synthetisches Immunogen erzeugt, das ein oben beschriebenes synthetisches Polypeptid alleine oder als Konjugat umfaßt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein diagnostisches System zum Testen auf die Gegenwart von EBNA. Das System umfaßt Rezeptormoleküle, wie oben beschrieben, und ein anzeigendes Mittel zum Signalisieren der Immunreaktion der Bindungsstellen mit EBNA. Außerdem betrifft die Erfindung ein diagnostisches System zum Testen auf die Gegenwart von Antikörpermolekülen gegen EBNA in einem Körperbestandteil. Ein solches System umfaßt ein besonders bevorzugtes, statistisches synthetisches Copolymerpolypeptid, wie oben beschrieben, und anzeigendes Mittel zum Signalisieren der Immunreaktion des Polypeptids mit den Antikörpermolekülen gegen EBNA. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform enthält dieses System außerdem einen festen Träger, der eine feste Matrix umfaßt, an der das besonders bevorzugte Polypeptid befestigt wird. Ein Mittel zum Identifizieren des Isotyps des Antikörpermoleküls, das immunreagiert hat, kann in das System ebenfalls eingeschlossen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Zubereitung zur passiven Immunisierung gegen B-Lymphozyten, die EBNA aufihren Zelloberflächen exprimieren. Die Zubereitung umfaßt eine wirksame Menge eines oben beschriebenen Rezeptormoleküles in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel. Wenn sie in einen Säugerwirt eingeführt wird, kann die Zubereitung die Wirkungen von B-Lymphozyten, die EBNA aufihren Zelloberflächen exprimieren, auf den Wirt verringern.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Figuren bilden einen Teil der Offenbarung dieser Erfindung. Figur 1 ist eine graphische Darstellung eines Zirkulardichroismusspektrums der Polypeptide (F), (B) und (E). Diese Polypeptide werden hier ebenfalls als Polypeptide F13, F62 bzw. F12 bezeichnet. Jedes Spektrum ist der Durchschnitt von 10 aufeinanderfolgenden Messungen eines Polypeptids in einer physiologischen Lösung (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) bei einer Konzentration 1 Milligramm/Milliliter (mg/ml). Die optische Drehung wird in Milliradian ausgedrückt und gegen die Wellenlänge des polarisierten Lichtes aufgetragen, die in Nanometern (nm) ausgedrückt wird. Das relativ merkmalslose Diagramm für das Polypeptid F (F13) zeigt eine zufällige Konformation an; das ist das übliche Ergebnis, das mit Peptiden dieser Größe erhalten wird. Das Berg-und-Tal-Spektrum von Polypeptid B (P62) ist für eine relativ stabile Sekundärstruktur oder Konformation, wahrscheinlich ein beta-Faltblatt, charakteristisch. Obwohl die Daten nicht gezeigt sind, haben die Polypeptide P27, P60, F14 und F15 sehr ähnliche Spektren, was darauf hinweist, daß die stärker bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptide als ähnlich stabile Konformationen in physiologischen Lösungen vorliegen. Das Spektrum von Polypeptid E (F12) weist darauf hin, daß eine solche Konformation teilweise eingenommen worden ist.
Figur 2 ist eine Photographie eines Nitrozelluloseimmunblots ganzer Zellextrakte von EBV-transformierten WI-L2-Zellen unter Verwendung von Kaninchen-anti-Peptid-Antiseren gegen die synthetischen Polypeptide C (P60) und B (P62). Ein Humanserum (vom Patienten TJ), das zuvor als anti-EBNA-positiv definiert worden ist, d.h., anti-EBNA-Antikörper enthaltend, wurde als eine positive Kontrolle in Spur A in einer Verdünnung von 1:20 verwendet. Kaninchen-anti-P60 (C)-Serum in einer 1:50-Verdünnung (Spur B) und Kaninchen-anti-P62 (B) -Serum in einer Verdünnung von 1:10 (Spur D) immunreagierten mit der gleichen Bande wie die positive Kontrolle, was darauf hinweist, daß sie natürliches EBNA erkennen. Die Spuren A bis G sind am Boden der Figur identifiziert.
Die Erkennung von EBNA durch das anti-p60-Serum wurde inhibiert, indem anti-P60-Serum, 1:50 verdünnt, mit 40 Mikrogramm/ml (ug/ml) Polypeptid P60 eine Stunde lang vor dem Immunblotten (Spur 3) inkubiert wurde. Ähnlich wurde die Erkennung von EBNA durch das anti-P62-Serum durch Inkubieren von anti-p62, 1:10 verdünnt, mit 40 ug/ml Polypeptid P62 eine Stunde vor dem Immunblotten inhibiert.
Die antigenische Verwandtschaft von P60 und P62 wird in den Spuren 6 und 7 demonstriert. Spur 6 zeigt anti-P62-Serum, 1:10 verdünnt, das mit der EBNA-Bande immunreagiert. In Spur 7 wurde die Immunreaktivität von anti-P62-Serum mit der EBNA-Bande durch Inkubation mit 40 ug/ml Polypeptid P60 eine Stunde vor dem Immunblotten inhibiert.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung der Inhibition der anti- P62-Serum-Aktivität in EBNA-positivem Serum vom Patienten 1011 durch ein konkurrierendes Polypeptid in Lösung. Es wurde ein ELISA mit Polypeptid P62 als Festphasenziel unter Verwendung des Serums vom Patienten 1011, das eine Stunde mit einem der Polypeptide P27, P62, P60, P89 oder F16 vor der Verwendung in dem ELISA vorinkubiert worden war, durchgeführt. Die Polypeptide P27, P62, P60, P89 und P16 werden hier auch als Polypeptide A, B, C, D bzw. G bezeichnet. Der Prozentsatz an anti-Polypeptidaktivität ist auf der Ordinate gegen die Konzentration des konkurrierenden Polypeptids in Mikrogramm/Milliliter (ug/ml) aufgetragen.
Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die den parallelen Zeitverlauf des Auftretens von Antikörpern gegen EBNA (unterbrochene Linie, 0) und Polypeptid P62 (durchgezogene Linie, ) in einem Fall einer dokumentierten infektiösen Mononukleose (IM) veranschaulicht. Nach dem Ausbruch der Krankheit wurden nacheinander Seren gesammelt und auf anti-EBNA-Aktivität nach dem von Catalano, et al., J. Clin. Invest., 65:1238-1242 (l980) publizierten Verfahren getitert und auf der rechten Ordinate aufgetragen. Die Serumproben wurden außerdem in einem erfindungsgemäßen ELISA unter Verwendung von Polypeptid P62 als Festphasenziel getestet, wie auf der linken Ordinate gezeigt, auf der die optische Dichte bei 405 Nanometer (OD&sub4;&sub0;&sub5;) aufgetragen ist.
Figur 5 ist aus zwei graphischen Darstellungen zusammengesetzt, die den frühen Nachweis von Antikörpern gegen Polypeptid P62 (durchgezogene Linie, ) im Vergleich zu anti-EBNA (unterbrochene Linie, 0) unter Verwendung des Nachweises mit dem klassischen ACIF-VErfahren, beschrieben von Henle, G. et al., J. Infect. Dis., 130:231 (1974), veranschaulichen. Von zwei Patienten (#14 obere Reihe, #2 untere Reihe) mit klinisch dokumentierter infektiöser Mononukleose wurden aufeienanderfolgende Seren gesammelt. Die Seren wurden auf anti-EBNA-Aktivität getitert, wie von Catalano, et al., s.o. beschrieben. Eine anti-Polypeptid-Aktivität wurde unter Verwendung des erfindungsgemäßen ELISAs mit Polypeptid P62 als Festphasenziel gemessen, wobei die Aktivität wie in Figur 4 angegeben war.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

I. Einleitung

Mit Epstein-Barr-Virus (EBV) infizierte Menschen entwickeln Antikörper gegen ein virales nukleäres Antigen (EBNA), das in virustransformierten B-Lymphozyten vorhanden ist. Traditionelle klinische Verfahren, die zum Nachweis von EBNA und anti-EBNA- Antikörpern in Menschen verwendet werden, sind mühsam. Zusätzlich sind die gegenwärtigen Verfahren zur Reinigung von EBNA aus Zellkulturen nicht leicht auf eine Massenerzeugung umstellbar. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von synthetischer Polypeptidtechnologie, um einige der Probleme der gegenwärtigen Methoden zu überwinden. Kurze synthetische Polypeptide können antigene Determinanten auf einem natürlichen Protein immunologisch nachahmen und können daher verwendet werden, um Antikörper einer vorbestimmten Spezifität zu erzeugen, die das natürliche Protein erkennen.
Der Ausdruck "immunologisch nachahmen" wird hier verwendet, um zu bezeichnen, daß ein immunogenes erfindungsgemäßes Polypeptid die Erzeugung von Antikörpern induziert, die an das induzierende Polypeptid binden und ebenso an verwandte Sequenzen in intakten Proteinen. Dieses Phänomen kann sowohl experimentell als auch klinisch verwendet werden.
Experimentell können Antikörper gegen synthetische Polypeptide zur Etablierung des DNA-Leserasters und daher der Aminosäuresequenz eines klinisch bedeutsamen Proteins, wie z.B. EBNA, verwendet werden. Klinisch können Antikörper vorbestimmter Spezifität, die gegen ein synthetisches Polypeptid erzeugt worden sind, für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden.
Heller et al., s.o., berichteten über eine DNA-Nukleotidsequenz mit Merkmalen, die darauf hinwiesen, daß sie das für EBNA kodierende Gen enthalten könnte. Sie sagten voraus, daß, wenn die DNA in Protein translatiert würde, die drei möglichen Leseraster für eine IR3-Proteindomäne von mehr als 200 Aminosäureresten kodieren würden, die, in Abhängigkeit vom exprimierten DNA-Leseraster zusammengesetzt ist aus nur (i) Serin, Arginin und Glycin, (ii) Glycin und Alanin oder (iii) Glutamin, Glutamat und Glycin.
Die publizierten chemischen Eigenschaften des EBNA-Moleküles, zusammengenommen mit der Verteilung möglicher Stop-Kodons in dem EBNA-Gen, wiesen darauf hin, daß IR3 in erster Linie aus Glycin und Alaninresten zusammengesetzt war.
Um diesen Hinweis zu bestätigen, wurden kurze Polypeptide synthetisiert, deren Aminosäuresequenzen im wesentlichen der des EBNA- Proteines entsprechen, dessen IR3 ein statistisches Glycin-Alanin- Copolymer ist.

A. Synthetische Polypeptide

1. Sequenzen

Die für diese Untersuchung verwendete Reihe kleiner synthetischer Polypeptide (mit einer Länge von 5 - 21 Aminosäureresten) wurde mit dem Festphasenverfahren nach Merrifield synthetisiert. Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc.,85:2149-2154 (1963). Die Sequenzen wurden so ausgewählt, daß sie verschiedene Bereiche aus dem Inneren des vorgeschlagenen IR3-Bereiches von EBNA und gerade außerhalb des Bereiches repräsentierten.
Der Ausdruck "synthetisch", so wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß das Polypeptidmolekül oder die sich wiederholende Polypeptideinheit mit chemischen Mitteln aufgebaut worden ist, d.h., chemisch synthetisiert und nicht mit biologischen Mitteln hergestellt, wie z.B. durch Verfahren der genetischen Manipulation. Daher sind die die vorliegende Erfindung verkörpernden synthetischen Polypeptide frei von natürlich auftretenden Proteinen und Fragmenten davon.
Die chemisch synthetisierten Polypeptide unterscheiden sich daher auch von Abbauprodukten natürlich auftretender Proteine, wie sie durch die Wirkung von Bromcyan auf das Protein hergestellt werden. Die gut bekannte chemische Festphasensynthese, bei der blockierte Aminosäurereste nacheinander zugefügt werden, um das gewünschte Polypeptid zu erhalten, ist das bevorzugte Syntheseverfahren und wird im folgenden detaillierter diskutiert.
Alle hier identifizierten Aminosäurereste sind in der natürlichen oder L-Konfiguration. Im Einklang mit der Standardnomenklatur für Polypeptide sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste die folgenden: SYMBOL AMINOSÄURE 1-Buchstabenkode 3-Buchstabenkode L-Tyrosin L-Glycin L-Phenylalanin L-Methionin L-Alanin L-Serin L-Isoleucin L-Leucin L-Threonin L-Valin L-Prolin L-Lysin L-Histidin L-Glutamin L-Glutaminsäure L-Tryptophan L-Arginin L-Asparaginsäure L-Asparagin L-Cystein
Bevorzugte Aminsäuresequenzen umfassen die Sequenzen, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus genommen, durch die Formeln:
-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu- Lys-Arg-Pro-Met-;
-Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn- Gly-Leu-Gly-Glu- Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-;
dargestellt werden, die pharmazeutisch verträglichen Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind R¹ und R² Ala oder Gly. Beispielsweise kann R¹ Ala sein und R² kann Ala sein; R¹ kann Ala sein und R² kann Gly sein; R¹ kann Gly sein und R² kann Ala sein. Die besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen daher Sequenzen mit 5 Aminosäureresten, die durch eine Formel dargestellt werden, die aus der aus
(i) -Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;
(ii) -Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-; und
(iii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly--
bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Der Ausdruck "statistisches Copolymer" wird hier in seiner üblichen Bedeutung verwendet. Die Polypeptide sind Copolymere, weil sie eine Vielzahl verschiedener sich wiederholender Aminosäureresteinheiten enthalten. Die Copolymere sind im Vergleich zu alternierenden oder Blockcopolymeren statistisch, weil die individuellen Aminosäurereste der Polypeptide nicht in einer besonderen sich wiederholenden Sequenz vorhanden sind, wie es in den sich wiederholenden Sequenzen eines alternierenden Copolymers oder den Homoblockcopolymeren der Fall ist, die von Anderson et al., Doyle et al., oder Brack et al., s.o., hergestellt worden sind.
Der Ausdruck "Antigenisch verwandte Varianten" wird hier zur Bezeichnung von Polypeptiden mit sich unterscheidender Gesamtaminosäuresequenz verwendet, die mindestens einen Teil einer Antigenen Determinante gemeinsam haben und daher immunologisch kreuzreaktiv sind.
Der Ausdruck "Antigene Determinante", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet den Strukturbestandteil eines Moleküles, der für die spezifische Wechselwirkung mit entsprechenden Antikörper- (Immunglobulin)-Molekülen verantwortlich ist, die durch das gleiche oder ein verwandtes Antigen oder Immunogen hervorgerufen werden.
Der Ausdruck "immunogene Determinante", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet den Strukturbestandteil eines Moleküles, der in einem Wirt für die Induktion eines Antikörpers, der eine Antikörperbindungsstelle (Idiotyp) enthält, die an das Immunogen bindet, wenn es als Antigen verwendet wird, verantwortlich ist.
Der Ausdruck "Antigen", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Einheit, die von einem Antikörper gebunden wird.
Der Ausdruck "Immunogen", so wie er hier verwendet wird, beschreibt eine Einheit, die die Antikörpererzeugung in einem Wirtstier induziert. In einigen Fällen sind Antigen und Immunogen die gleiche Einheit, während in anderen Fällen die beiden Einheiten unterschiedlich sind.
Beispielsweise wurde das Polypeptid P62 zur Induktion der Erzeugung von Antikörpern in einem Kaninchen verwendet, wie im folgenden beschrieben werden wird, und wurde daher als Immunogen verwendet. Die so induzierten Antikörper binden an das Polypeptid P62, wenn es als Antigen verwendet wird. Polypeptid-P62 war daher sowohl ein Immunogen als ein Antigen. anti-EBNA-Antikörper binden sowohl an das Immunogen EBNA als auch an das Antigen EBNA sowie an das Polypeptid P62 als Antigen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die synthetischen, statistischen Copolypeptide P89, F12, F13, wie in Tabelle 1 unten gezeigt, die pharmazeutisch verträglichen Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon. TABELLE I SEQUENZEN SYNTHETISCHER POLYPEPTIDE Peptid* Sequenz
* In Klammern stehende große Buchstaben werden zur Bezeichnung des korrespondierenden Polypeptides in einigen der hier enthaltenen Figuren und Tabellen verwendet.
Die Ergebnisse der Polypeptid/Antipolypeptidrezeptorbindungs- und -bindungsinhibitionsuntersuchungen werden im folgenden in Abschnitt I D diskutiert. Diese Ergebnisse zeigen Kreuzreaktivitäten und kreuzinhibierende Wirkungen, die parallel zum Ausmaß der Sequenzhomologie zwischen den Polypeptiden verlaufen. Beispielsweise enthält das Polypeptid P60 ein Segment von 10 Aminosäuren, die mit P62 homolog sind. Polypeptid P27 enthält ein Segment von 8 Aminosäuren, das mit den Polypeptiden P60, P62 und D1 (Tabelle 2) homolog ist. Polypeptid D2 (Tabelle 2) enthält ein Segment von 7 Aminosäuren, das zu Segmenten der Polypeptide P27, P60, P62 und D1 homolog ist. Polypeptid P89, das in der Untersuchung nicht signifikant kreuzreagierte, enthält keine Sequenzhomologie mit den Polypeptiden P27, P62 und P60.
Wichtiger ist, daß die Sequenz von 8 Aminosäureresten, die den Polypeptiden P27, P62, P60 und D1 gemeinsam ist, mindestens eine Antigene Determinante enthält, die allen drei statistischen Copolymerpolypeptiden gemeinsam ist, wodurch diese drei Polypeptide zu Antigenisch verwandten Varianten gemacht werden. Zusätzlich umfaßt das gemeinsame Segment die Sequenz mit 6 Aminosäuren
-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly
und eine überlappende Sequenz, die durch die Formel
Gly-Ala-Gly-Ala-Gly
dargestellt wird.
Mit "überlappend" ist gemeint, daß die zweitgenannte Sequenz in einem Teil der erstgenannten Sequenz enthalten ist. Dieses Überlappen der Aminosäuresequenz wird beispielsweise für Polypeptid P62 durch die unten gezeigten überlappenden, mit Kästchen eingerahmten Sequenzteile, in denen der Einbuchstabenkode verwendet wird, veranschaulicht.
Besonders bevorzugte Aminosäuresequenzen umfassen die Sequenzen, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus genommen, durch die Formel dargestellt werden:
(i) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala- Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-;
(ii) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala- Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly--
(iii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-;
(iv) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala- Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-;
(v) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-;
(vi) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly- Ala-Gly-;
(vii) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly;
(viii) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-;
pharmazeutisch verträgliche Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon.
Es wird festgestellt, daß ein Bindestrich am Beginn oder Ende einer Aminosäuresequenz eine Bindung an einen Rest, wie z.B. H und OH, am Amino- bzw. Carboxyterminus anzeigt, oder eine weitere Sequenz von einer oder mehreren Aminosäureresten bis zu einer Gesamtanzahl von 40 Aminosäureresten in der Polypeptidkette.
Ebenso sind die entsprechenden Polypeptide selbst, d.h., Polypeptid P60, P27, P62, F14, F15 und F16, gezeigt in Tabelle 1, und D1 und D2, gezeigt in Tabelle 2, und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon besonders bevorzugt.
Der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliche Salze", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf nicht-toxische Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, die in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, einschließlich der Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium- und Ammoniumsalze und ähnlicher, die durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren hergestellt werden. Der Ausdruck umfaßt außerdem nicht-toxische Säureadditionssalze, die im allgemeinen durch Umsetzen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Repräsentative Salze umfassen das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Vorat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat und ähnliche.

2. Größe

Die Auswirkung einer Veränderung der Größe der synthetischen Polypeptide auf deren Fähigkeit, von anti-EBNA-Antikörpern gebunden zu werden, wurde untersucht. Es wurde allgemein festgestellt, daß mit abnehmender Polypeptidgröße seine Fähigkeit, von den Antikörpern gebunden zu werden, ebenfalls abnahm.
Polypeptid P62 besteht aus 20 Aminosäureresten, von denen die ersten neun Reste vom Amino-Terminus direkt wiederholt sind, wie in Tabelle 2 unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Kodes für Aminosäurereste gezeigt ist. Es wurde eine Reihe von zu P62 homologen Polypeptiden synthetisiert, in denen Aminosäure-Dreiergruppen vom Aminoterminus des vorhergehenden Peptides deletiert waren, um die Polypeptide D1, D2 und D3 zur Verfügung zu stellen, wie in Tabelle 2, unten, gezeigt. Zunehmende Teile der Sequenzsymmetrie von P62 fehlen daher in den Polypeptiden D1, D2 und D3. TABELLE 2 Polypeptid-Bezeichnung Aminosäuresequenz#
# Die Polypeptidsequenzen sind im Ein-Buchstaben-Kode und in der Richtung von links nach rechts und vom Aminoterminus zum Carboxy- Terminus gezeigt.
* Verbindungsstelle des direkt wiederholten 9-mers im Polypeptid P62.
Die Fähigkeit der D-Reihe von Polypeptiden, mit 3 humanen anti- EBNA-Seren und Kaninchen-anti-P62-Serum eine Immunreaktion einzugehen, wurde unter Verwendung der Polypeptide in der festen Phase des ELISAs untersucht, wie im folgenden beschrieben wird.
Die Antikörper-Bindung an D1 war für alle getesteten Seren nahezu die gleiche wie die an das Elter-Polypeptid P62. Im Gegensatz dazu gab es keine Bindung an das Festphasen-D3 für irgendein Serum mit Ausnahme des Kaninchen-anti-P62-Serums. Die Ergebnisse für D2 lagen dazwischen und waren vom untersuchten Serum abhängig. Die Antikörpererkennung dieser Reihe von Polypeptiden nahm daher mit abnehmender Polypeptidlänge von 20 auf 11 Aminosäurereste ab. Die Tatsache, daß die Antikörperbindung für alle Antiseren abnahm, spricht gegen die Möglichkeit, daß eine spezifische Antigene Determinante durch die sequentielle Elimination von Aminosäureresten deletiert worden war, da die Polypeptide 2 antigene Determinanten enthielten, von denen nur eine durch die Sequenzdeletionen betroffen war. Weiterhin stellte die Sequenzsymmetrie von P62 sicher, daß alle Sequenzen von 4 bis 8 Aminosäureresten, die in P62 vorhanden waren, auch in D3 vorhanden waren, mit Ausnahme jener, die sich über die Verbindung der sich wiederholenden Einheiten erstreckten.
Konformationsänderungen in den beim ELISA an den festen Träger gebundenen Polypeptiden können zur Unterdrückung der Antikörpererkennung beigetragen haben. Diese Möglichkeit wurde durch Inhibieren der Bindung (Immunreaktion) verschiedener Seren an Festphasengebundenes P62 unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von konkurrierenden Polypeptiden in Lösung untersucht. Die Antiseren wurden gemischt und mit Polypeptid P62, D1, D2 oder D3 für eine vorbestimmte Zeit, die ausreichend war, daß eine Immunreaktion (Bindung) auftreten konnte, bevor sie einer mit P62 beschichteten Mikrotiterplatte zugefügt wurden, in Lösung gehalten (inkubiert). Die Ergebnisse dieser Untersuchung mit Seren von 5 Patienten sind in Tabelle 3, unten, zusammengefaßt. TABELLE 3 Konzentration konkurrierender Polypeptide, die 50% Inhibition der Antikörperbindung an das Peptid P62* herbeiführen Konkurrierendes Peptid (Mikrogramm pro Milliliter) Seren
*Die für diese Bestimmungen verwendeten ELISA-Verfahren sind im folgenden in den Abschnitten IE(2) und IID beschrieben.
Die inhibitorische Wirkung von Polypeptid D1 auf die Antikörperbindung an P62 wird für von der inhibitorischen Wirkung von P62 selbst nicht unterscheidbar gehalten. Dies gilt für alle getesteten Seren.
Interessanter ist, daß das Polypeptid D3 einige der Seren, VM und N6, ungefähr so gut wie die größeren Polypeptide inhibierte. Diese starke inhibitorische Wirkung trat ungeachtet der Tatsache auf, daß keines dieser Seren irgendeine Bindung an D3, gebunden an den festen Träger im ELISA, zeigte. Es wird angenommen, daß diese Daten daraufhinweisen, daß das Polypeptid eine bestimmte Minimalmenge haben muß, mindestens ungefähr 15 Aminosäurereste, um die erforderliche Sekundärstruktur zu erhalten, wenn es an die Kunststoffoberfläche einer Mikrotiterplatte gebunden wird.
Die minimale Antigengröße, die für die Erkennung notwendig ist, wurde weiter unter Verwendung der Polypeptide A5, A6, A7, A8 und A9 untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, hat das Polypeptid A5 fünf Aminosäurereste, und jedes Mitglied der Serie A6 bis A9 war um einen Aminosäurerest länger als das vorhergehende Polypeptid bis hin zu den in A9 vorhandenen neun Resten. Kein getestetes Antiserum immunreagierte mit diesen Polypeptiden, wenn sie an die Mikrotiterplatten im im folgenden beschriebenen ELISA gebunden waren.
Die Daten für die Fähigkeit der A-Reihen-Polypeptide, die Bindung von humanem anti-EBNA-Antikörpern an Festphasen-P62 zu inhibieren, sind in Tabelle 4, unten, gezeigt. TABELLE 4 Inhibition der Antikörperbindung an Peptid P62 durch 100 Mikrogramm pro Milliliter konkurrierendes Peptid* Prozent nichtinhibierter Aktivität Seren
* Diese Untersuchungen wurden durchgeführt, wie für Tabelle 3 beschrieben.
Beinahe alle getesteten Serene wurden durch A9 inhibiert, obwohl sehr hohe Konzentrationen erforderlich waren (mehr als 100-fach höher als die Konzentrationen von P62 oder D1, die für eine äquivalente Inhibition benötigt wurden). Zusätzlich immunreagierten drei Seren mit und wurden inhibiert durch A8 und eines durch A7. Keines wurde durch die kürzeren Polypeptide A6 und A5 inhibiert. Die Abnahme der Immunreaktivität, die parallel einer Abnahme der Polypeptidgröße verläuft, scheint daher die Folge zweier Effekte zu sein: (1) Der Effekt der Deletion von der Antigenstelle, an der der Antikörper bindet, wie durch die A-Reihen-Polypeptide gezeigt, und (2) der Änderung der Konformation des Polypeptids bei dessen abnehmender Größe, wie durch die D-Reihenpolypeptide gezeigt wird.

3. Konformation

Die Konformationseigenschaften der erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide wurden unter Verwendung von Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) untersucht. Die CD-Spektren der Polypeptide P27, P60, P62, F13, F15 und F16 wurden bestimmt. Diese Daten, die zum Teil in Fig. 1 gezeigt sind, weisen darauf hin, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide eine relativ stabile Sekundärstruktur oder Konformation in einer physiologischen Lösung bei 20ºC einnehmen. Da die vorherrschende Konformation dieser Polypeptide relativ stabil ist, wird angenommen, daß die Aktivität humaner anti-EBNA- Antikörper als Antwort auf diese besondere Konformation auftritt.

B. Multimere

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein synthetisches Multimer, das eine Vielzahl von verbundenen synthetischen, statistischen sich wiederholenden Copolymerpolypeptideinheiten enthält, wobei mindestens eine der sich wiederholenden Einheiten eines der hier beschriebenen Polypeptide ist.
Die erfindungsgemäßen Multimere sind alleine oder an einen Träger gebunden fähig, die Produktion von Antikörpern, die an EBNA binden, zu induzieren, wenn sie in einer wirksamen Menge in einen Säugerwirt eingeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Multimere sind wie die sie darstellenden Polypeptide immunogen und für humane anti-EBNA-Antikörper Antigen. Diese Multimere können daher verwendet werden, um die Erzeugung von anti-EBNA-Antikörpern zu induzieren, die für im folgenden diskutierte diagnostische Verfahren und Systeme nützlich sind, und können auch als ein Antigen in entsprechenden diagnostischen Verfahren und Systemen verwendet werden.
Multimere, die weniger als ungefähr 35 Aminosäureresten im Gesamtmultimer enthalten, werden für die Verwendung als ein Immunogen typischerweise an einen Träger gebunden. Solche Multimere, die mehr als insgesamt ungefähr 35 Aminosäurereste enthalten, sind typischerweise ausreichend immunogen, um ohne einen Träger verwendet zu werden.
Polypeptidmultimere können hergestellt werden, indem die synthetisierten Polypeptidmonomere auf eine Kopf-an-Schwanz-Weise unter Verwendung des zuvor erwähnten Festphasenverfahrens aneinander gebunden werden; d.h., eine vollständige Polypeptidsequenz kann an dem Harz synthetisiert werden, gefolgt von einer oder mehreren der gleichen oder verschiedener Polypeptidsequenzen, wobei die gesamte Multimereinheit anschließend vom Harz gespalten und wie hier beschrieben verwendet wird. Solche Kopf-an-Schwanz-Polypeptidmultimere enthalten bevorzugt ungefähr 2 bis ungefähr 4 sich wiederholender Polypeptideinheiten.
Alternativ können Multimere als ein Polymer synthetischer, statistischer Copolymerpolypeptide, die als Monomere verwendet werden, hergestellt werden. So, wie er hier verwendet wird, ist der Ausdruck "Polymer" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen als ein Typ von Multimer definiert, der eine Vielzahl synthetischer, sich wiederholender statistischer Copolymerpolypeptideinheiten enthält, die aneinander durch andere als Peptidbindungen gebunden sind.
Ein beispielhaftes erfindungsgemäßes Polymer kann synthetisiert werden, indem die erfindungsgemäßen Polypeptidmonomere, die angefügte Cysteinreste sowohl am Amino- als auch am Carboxy-Terminus enthalten (diCys-Polypeptide), verwendet werden. Die diCys-Polypeptidmonomere können aneinander durch intramolekulare, interpolypeptidische Cysteindisulfid-Bindungen unter Verwendung eines Oxidationsverfahrens gebunden werden, um ein immunogenes Antigenes Polymer zu bilden. Das so hergestellte Polymer enthält eine Vielzahl der erfindungsgemäßen synthetischen, statistischen Copolymerpolypeptide als sich wiederholende Einheiten. Diese sich wiederholenden Einheiten sind aneinander durch die oben diskutierten oxidierten Cystein-(Cystin-)reste gebunden.
Die Gegenwart von einem oder zwei terminalen Cys-Resten in einem erfindungsgemäßen Polypeptid zum Zweck der Bindung des Polypeptides an einen Träger oder zum Herstellen eines Polymers soll nicht als die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen, sich wiederholenden Polypeptideinheiten verändernd verstanden werden.

C. Inokula

In einer anderen Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Polypeptide in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel verwendet, um ein Inokulum oder einen Impfstoff zu bilden, das (der), wenn es (er) in einer wirksamen Menge verabreicht wird, Antikörper induzieren kann, die mit EBNA immunreagieren.
Das Wort "Inokulum" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid als aktiven Bestandteil, der für die Erzeugung von Antikörpern gegen EBNA verwendet wird, enthält. Wenn ein Polypeptid verwendet wird, um Antikörper zu induzieren, ist zu verstehen, daß das Polypeptid alleine verwendet werden kann, an einen Träger gebunden oder als Multimer, aber im Interesse einer einfachen Ausdrucksweise werden diese Alternativen im folgenden nicht immer zum Ausdruck gebracht.
Für Polypeptide, die weniger als ungefähr 35 Aminosäurereste enthalten, ist es bevorzugt, einen Träger zum Zweck der Induktion der Erzeugung von Antikörpern zu verwenden. An einen Träger gebundenes oder damit verbundenes Polypeptid wird hier zur Veranschaulichung verwendet, wo Antikörper hergestellt werden.
Das Inokulum kann verwendet werden, um Antikörper für die Verwendung in diagnostischen Tests zu erzeugen, die EBNA-exprimierende Zellen nachweisen. Die von dem Inokulum erzeugten Antikörper können auch für eine Zubereitung zum Induzieren einer passiven Immunität gegen B-Lymphozyten, die EBNA auf ihren Zelloberflächen exprimieren, verwendet werden.
Das Wort "Impfstoff" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier verwendet, um einen Typ von Inokulum zu beschreiben, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid als aktiven Bestandteil enthält, der verwendet wird, um eine aktive Immunität in einem Säugerwirt zu induzieren. Da die aktive Immunität die Erzeugung von Antikörpern involviert, können ein Impfstoff oder ein Inokulum identische Bestandteile enthalten, aber ihre Verwendungen sind unterschiedlich. In den meisten Fällen sind die Bestandteile eines Impfstoffs und eines Inokulums verschieden, weil viele Adjuvantien, die in Tieren nützlich sind, im Menschen nicht verwendet werden dürfen.
Das vorliegende Inokulum oder der Impfstoff enthalten eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptides als ein Multimer, beispielsweise ein Polymer von individuellen Polypeptiden, die miteinander durch oxidierte, polypeptidterminale Cysteinreste verbunden sind, oder als Konjugat an einen Träger gebunden. Im Interesse einer einfachen Ausdrucksweise werden die verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Polypeptide hier kollektiv mit dem Ausdruck "Polypeptid" und seinen verschiedenen grammatikalischen Formen bezeichnet.
Die wirksame Menge Polypeptid pro Dosiseinheit hängt unter anderem von der Art des zu beimpfenden Tieres, dem Körpergewicht des Tieres und dem gewählten Impfplan ab, wie im Stand der Technik bekannt ist. Inokula und Impfstoffe enthalten typischerweise Polypeptidkonzentrationen von ungefähr 10 ug bis ungefähr 500 Milligramm pro Inokulation (Dosis). Die angegebenen Mengen von Polypeptid beziehen sich auf das Gewicht des Polypeptides ohne das Gewicht eines Trägers, wenn ein Träger verwendet wird. Spezifische, beispielhafte Inokula sind im folgenden beschrieben, wobei das Gewicht des Trägers mit dem Polypeptid (Konjugat) angegeben ist.
Der Ausdruck "Dosiseinheit" bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einzeldosen für Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge aktiven Materials enthält, das berechnet ist, den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d.h., einem Träger oder einem Vehikel, zu erzeugen. Die Spezifikationen für die neue erfindungsgemäße Dosiseinheit werden diktiert durch und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen des aktiven Materials und dem besonderen therapeutischen Effekt, der erzielt werden soll, und (b) den bei der Konfektionierung von solchem aktivem Material für die therapeutische Verwendung in Tieren inhärenten Beschränkungen, wie im einzelnen in der Beschreibung offenbart ist, wobei dieses Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Inokula werden typischerweise aus dem getrockneten, festen Polypeptidkonjugat oder Polypeptidpolymer durch Resuspendieren des Polypeptidkonjugates oder Polypeptidpolymers in einem physiologisch verträglichen (akzeptablen) Verdünnungsmittel, beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, hergestellt.
Inokula können außerdem ein Adjuvans enthalten. Adjuvantien, beispielsweise vollständiges Freunds Adjuvans (CFA), unvollständiges Freunds Adjuvans (IFA) und Alaun sind im Stand der Technik gut bekannte Materialien und sind von verschiedenen Herstellern kommerziell erhältlich.

D. Rezeptoren

Antikörper und im wesentlichen ganze Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide erzeugt sind (durch diese induziert sind) sowie Antikörperbindungsstellen, die aus solchen Antikörpern hergestellt worden sind, stellen eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung dar. Diese Moleküle werden insgesamt hier als Rezeptoren bezeichnet. Rezeptoren werden in Säugerwirten, beispielsweise Mäusen, Kaninchen, Pferden und ähnlichen durch Immunisieren unter Verwendung der oben beschriebenen Inokula erzeugt.
Geeignete monoklonale Rezeptoren, typischerweise ganze Antikörper, können auch unter Verwendung der Hybridomtechnologie, beschrieben von Niman et al., Proc. Natl. Sci., U.S.A., 80:4949-4953 (1983), hergestellt werden, wobei diese Beschreibung hier durch Verweis einbezogen ist. Kurz gesagt wird zur Bildung eines Hybridoms, von dem ein monoklonaler Rezeptor erzeugt wird, ein Myelom oder eine andere, sich selbst erhaltende Zellinie mit Lymphozyten fusioniert, die aus der Milz eines mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid hyperimmunisierten Säugetiers erhalten sind.
Es ist bevorzugt, daß die Myelomzellinie von der gleichen Spezies ist, wie die Lymphozyten. Typischerweise ist eine Maus des Stammes 129 GlX&spplus; das bevorzugte Säugetier. Geeignete Mausmyelome für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die Hypoxanthin- Aminopterin-Thymidin-sensitiven (HAT) Zellinien P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) und Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581).
Splenozyten werden typischerweise mit den Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) 1500 fusioniert. Fusionierte Hybride werden aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegen HAT selektioniert. Hybridome, die erfindungsgemäße Rezeptormoleküle erzeugen, werden unter Verwendung des im Abschnitt II D (Material und Methoden) beschriebenen enzymgebundenen Immunadsorptionstests (ELISA) identifiziert.
Monoklonale Rezeptoren brauchen nicht nur von Hybridomüberständen erhalten zu sein, sondern können ebenso in im allgemeinen konzentrierterer Form aus der Aszitesflüssigkeit von Säugern erhalten werden, in die das gewünschte Hybridom eingeführt worden ist. Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von Aszitesflüssigkeit ist gut bekannt und wird hier nicht weiter erläutert werden.
Ein erfindungsgemäßer Rezeptor bindet sowohl an das Polypeptid, gegen das er erzeugt ist, als auch an die korrespondierende Antigene EBNA-Determinante, die das erfindungsgemäße Polypeptid immunologisch nachahmt. Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann daher sowohl ein Immunogen als auch ein Antigen sein.
Die erfindungsgemäßen Rezeptoren können im Vergleich mit natürlich auftretenden polyklonalen Antikörpern als oligoklonal beschrieben werden, da sie gegen ein Immunogen mit im Vergleich zu den Epitopen eines intakten EBNA-Moleküls relativ wenigen Epitopen erzeugt worden sind. Folglich binden die erfindungsgemäßen Rezeptoren an Epitope des Polypeptids, während natürlich auftretende Antikörper, die gegen EBNA erzeugt worden sind, an Epitope über das ganze EBNA-Molekül binden.
Beispielhafte Rezeptormoleküle, die erfindungsgemäße Antikörperbindungsstellen gegen die in Tabelle 1 gezeigten Polypeptide enthalten und in Kaninchen erzeugt worden sind, wurden unter Verwendung des Immunblotverfahrens von Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 76:4350-4354 (1979) und Billings, et. al., Proc. Natl. Adad. Sci., U.S.A., 80:7104-7108 (1983) untersucht. Weitere Einzelheiten werden in dem Kapitel Material und Methoden (II) zur Verfügung gestellt.
Es wurde festgestellt, daß alle Polypeptide dieser Untersuchung Kaninchen-anti-Polypeptid-Antikörper hervorrufen, wenn sie an einen Proteinträger als ein Konjugat gebunden waren und in einer wirksamen Menge in die Kaninchenwirte in einem Inokulum, das im folgenden beschrieben wird, eingeführt wurden. Diese Rezeptormoleküle erkannten intaktes EBNA-Protein, das aus dem EBV-transformierten humanen B-Lymphoblastenzellinien WI-L2, Raji und Daudi isoliert worden war. Daten dieser Untersuchungen sind zum Teil in Fig. 2 gezeigt. In Kontrolluntersuchungen ergaben Proteinextrakte von B-Lymphozyten, die negativ für EBV-Infektion waren (BJAB-Zellen, erhältlich von der Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA) keine reaktiven Banden mit den anti-Polypeptid-Antiseren. Diese Daten weisen darauf hin, daß beispielhafte erfindungsgemäße Rezeptormoleküle mit einem EBV-infektionsspezifischen Protein immunreagieren.
Zusätzlich wurde festgestellt, daß die Immunreaktivität der Kaninchen-anti-Polypeptid-Antikörper mit intakten EBNA-Proteinen durch das induzierende, immunogene Polypeptid, das als ein Antigen verwendet wurde, blockiert werden konnte, wie auch in Fig. 2 gezeigt ist. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Idiotypen (Antikörperbindungsstellen) der anti-Polypeptid-Antiseren spezifisch für Antigene EBNA-Determinanten waren.
Der Kaninchen-anti-Polypeptid-Antikörper gegen Polypeptid P62 wurde in einer Kompetitionsuntersuchung verwendet, um die Antigene Verwandtschaft der Polypeptide P27, P62, P60 und P89 zu untersuchen. Dieser Antikörper kreuzreagiert ausgiebig mit den konjugierten und nicht konjugierten Polypeptiden in dem im folgenden beschriebenen ELISA. Die Bindung von anti-Polypeptid P62 an Polypeptid P62 in der festen Phase wurde zu 98% inhibiert, indem zuerst der Antikörper mit Polypeptid P62 inkubiert wurde. Auf die gleiche Weise wurde die Bindung von anti-Polypeptid P62 an Polypeptid P62 81% durch Polypeptid P60 und 36% durch Polypeptid P27 inhibiert. Polypeptid P89 inhibierte die anti-Polypeptid P62- Reaktivität überhaupt nicht.
Um zu bestimmen, ob oder ob nicht die Antikörper in humanem EBV- Immunserum diese Antigene Determinante auch erkannten, wurde eine Kompetitionsuntersuchung durchgeführt, bei der das Serum eines EBV-immunen, rheumatoiden Arthritispatienten (Serum 1011) verwendet wurde. Die Ergebnisse, gezeigt in Fig. 3, waren ähnlich denen, die bei Verwendung von anti-Polypeptid P62 erhalten worden waren. Das weist darauf hin, daß die Antigene Determinante, die den Polypeptiden P27, P62 und P60 gemeinsam ist, eine natürlich auftretende immunogene Determinante von EBNA nachahmt.

E. Diagnostische Testsysteme und Verfahren

Die Polypeptide, Antikörper und Antikörperbindungsstellen (Rezeptoren), die gegen die zuvor beschriebenen Polypeptide erzeugt werden, und die erfindungsgemäßen Verfahren können ebenso für diagnostische Tests verwendet werden, beispielsweise Immuntests. Solche diagnostischen Verfahren umfassen beispielsweise einen Enzymimmuntest, enzymamplifizierte Immuntestverfahren (EMIT), enzymgebundene Immunadsorption (ELISA), Radioimmuntest (RIA), Fluoreszenzimmuntest, entweder Einfach- oder DoppelAntikörperverfahren und andere Verfahren, in denen entweder der Rezeptor oder das Antigen mit einem nachweisbaren Marker oder anzeigenden Mittel markiert ist. Siehe allgemein Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, Ohio (1981); und Goldman, M., Flourescent antibody Methods, Academic Press, New York, N.Y. (1980). Spezielle Beispiele solcher Testverfahren und Systeme, die für die Durchführung dieser Verfahren nützlich sind, sind im folgenden diskutiert.

1. Tests auf EBNA

Ein Verfahren zum Testen auf die Gegenwart von EBNA in einer Körperprobe ist hier ebenfalls einbezogen. In einem allgemeinen Verfahren wird eine zu testende Körperprobe bereitgestellt und mit Rezeptormolekülen gemischt, die eine Antikörperbindungsstelle enthalten, die gegen ein erfindungsgemäßes synthetisches, statistisches Copolymerpolypeptid erzeugt sind. Die Mischung wird für einen vorbestimmten Zeitraum, der für die Rezeptormoleküle ausreichend ist, mit dem in der Körperprobe vorhandenen EBNA eine Immunreaktion einzugehen, gehalten. Die Menge der Immunreaktion wird dann gemessen, um zu bestimmen, ob EBNA-Moleküle in der getesteten Körperprobe anwesend oder abwesend waren.
Ein anschauliches diagnostisches System in Kit-Form, das einen Aspekt der vorliegenden Erfindung verkörpert und für den Nachweis von EBNA, das in einem Aliquot einer Körperprobe vorhanden ist, nützlich ist, enthält erfindungsgemäße Rezeptormoleküle, beispielsweise Antikörper, im wesentlichen ganze Antikörper, oder Antikörperbindungsstellen wie Fab und F(ab')&sub2;-Antikörperteile, die gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid erzeugt worden sind, in einer Packung. Dieses System umfaßt außerdem ein anzeigendes Mittel zum Signalisieren der Gegenwart einer Immunreaktion zwischen dem Rezeptor und dem Antigen.
Typische anzeigende Mittel umfassen Radioisotope, beispielsweise ¹²&sup5;J und ¹³¹J, Enzyme, beispielsweise alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, beta-D-Galaktosidase und Glucoseoxidase, und Fluorochromfarbstoffe, beispielsweise Fluorescein und Rhodamin. Das anzeigende Mittel kann direkt an den erfindungsgemäßen Rezeptor gebunden sein. Das anzeigende Mittel kann auch an ein separates Molekül gebunden sein, beispielsweise an einen zweiten Antikörper, eine Antikörperbindungsstelle oder an Staphylococcus aureus (S. aureus)-Protein A, das mit dem erfindungsgemäßen Rezeptor reagiert (daran bindet). Ein spezielles Beispiel eines anzeigenden Mittels als separates Molekül ist ¹²&sup5;J-markiertes S. aureus- Protein A.
Das anzeigende Mittel erlaubt den Nachweis des Immunreaktionsprodukts und wird getrennt vom Rezeptor verpackt, wenn es nicht direkt an den erfindungsgemäßen Rezeptor gebunden ist. Wenn es mit einer Körperprobe, beispielsweise einem Aceton-fixierten Abstrich mit peripheren Blutlymphozyten (PBL) gemischt wird, immunreagiert das Rezeptormolekül mit dem EBNA, um einen Immunreaktanten zu bilden, und das vorhandene anzeigende Mittel signalisiert dann die Bildung des Immunreaktionsprodukts.
Eine Ausführungsform eines diagnostischen Verfahrens für EBNA ist ein Immunfluoreszenztest, der ein amplifizierendes Reagens involviert. In einem solchen Test wird ein PBL-Abstrich auf einem ebenen Mikroskopobjektträger Aceton-fixiert. Ein Aliquot von Antikörpern, die erfindungsgemäß erzeugt worden sind, z.B. in Kaninchen erzeugt worden sind, im allgemeinen ungefähr 10 Mikrogramm bis ungefähr 500 Mikrogramm, wird mit dem Objektträger unter Verwendung gut bekannter Verfahren in Kontakt gebracht.
Nach dem Wegspülen von erfindungsgemäßen Antikörpern, die nicht immunreagiert haben, werden alle nicht spezifischen Bindungsstellen auf dem Objektträger typischerweise mit einem Protein blockiert, z.B. Kinderserumalbumin (BSA), wenn das gewünscht wird.
Ein zweites Reagens (amplifizierendes Reagens), beispielsweise Komplement, oder anti-Immunglobulin-Antikörper, z.B. Meerschweinchenkomplement, kann dann auf dem Testobjektträger inkubiert werden.
Nach dieser zweiten Inkubation werden nicht umgesetzte Anteile des amplifizierenden Reagens z.B. durch Spülen entfernt, wobei nur das, was an die erstgenannten Antikörper auf dem Testobjektträger gebunden ist, zurückbleibt. Ein drittes Reagens (anzeigendes Mittel), z.B. ein Antikörper, wie Ziege-anti-Meerschweinchenkomplement, wird dann auf dem Testobjektträger inkubiert. Das dritte Reagens wird markiert, indem es an einen Fluorochromfarbstoff, beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin B-Isothiocyanat (RITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), 4,4'-Diisothiocyanstilben-2,2'-disulfonsäure (DIDS), und ähnliche, die im Stand der Technik gut bekannt sind, gebunden wird.
Alles nicht umgesetzte dritte Reagens wird nach dieser dritten Inkubation weggespült, wobei alle FITC-markierten Ziege-anti-Meerschweinchenkomplement-Antikörper, die an das Komplement binden, auf dem Testobjektträger zurückbleiben. Die Gegenwart von FITC- markiertem drittem Reagens kann unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden und dadurch das Vorhandensein einer EBV-Infektion signalisieren.
B-Lymphozyten, von denen bekannt war, daß sie mit EBV infiziert waren, wurden auf die Gegenwart von EBNA unter Verwendung des Immunfluoreszenztestverfahrens, das oben und detaillierter im Abschnitt II (Material und Methoden) beschrieben ist, getestet. Kaninchenaktikörper, die gegen jedes der in Tabelle 1 gezeigten Polypeptide erzeugt wurden, waren in der Lage, EBNA in der EBV-infizierten Zellinie WI-L2 nachzuweisen.
Ein bevorzugtes diagnostisches System, bevorzugt in Kit-Form, das für die Durchführung des oben beschriebenen Testverfahrens nützlich ist, umfaßt in getrennten Packungen (a) erfindungsgemäße Rezeptoren (Antikörper), die mit EBNA reagieren, (b) ein zweites, amplifizierendes Reagens, beispielsweise Komplement, wie Meerschweinchenkomplement, anti-Immunglobulin-Antikörper oder S. aureus-Protein A, das mit dem Rezeptor reagiert, und (c) ein anzeigendes Mittel, das direkt mit dem amplifizierenden Mittel verbunden sein kann oder ein Teil eines separaten Moleküls sein kann, beispielsweise eines Antikörpers oder eines Antikörperteils, der (das) mit dem amplifizierenden Mittel reagiert. Das anzeigende Mittel signalisiert indirekt über die Vermittlung eines amplifizierenden Reagenses die Immunreaktion von Rezeptormolekül und EBNA.
Die Rezeptormoleküle und getrennten anzeigenden Mittel jedes hier beschriebenen diagnostischen Systems, sowie das oben beschriebene amplifizierende Reagens, können in Lösung bereitgestellt werden, als eine flüssige Dispersion oder als ein im wesentlichen trockenes Pulver, z.B. in lyophilisierter Form. Wo das anzeigende Mittel ein vom amplifizierenden Reagens verschiedenes Molekül ist, ist es bevorzugt, daß das anzeigende Mittel getrennt verpackt wird. Wo das anzeigende Mittel ein Enzym ist, kann das Substrat des Enzyms ebenfalls in einer getrennten Packung des Systems bereitgestellt werden. Ein fester Träger, wie beispielsweise der zuvor beschriebene Mikroskopobjektträger, ein oder mehrere Puffer und Aceton können ebenfalls als separat verpackte Elemente in dem diagnostischen Testsystem eingeschlossen sein.
Die hier in Zusammenhang mit dem diagnostischen System diskutierten Packungen sind solche, die gewöhnlich in diagnostischen Systemen verwendet werden. Solche Packungen umfassen Glas und Kunststoff (z.B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat), Flaschen, Röhrchen, Kunststoff und kunststoffolienlaminierte Hüllen und ähnliches.
Die Verwendung von ganzen, intakten, biologisch aktiven Antikörpern ist in vielen diagnostischen Systemen, beispielsweise dem oben beschriebenen Immunfluoreszenztest, nicht notwendig. Anstelle dessen kann nur die immunologisch aktive, den Idiotyp enthaltende, das Antigen-bindende Rezeptorerkennungsstelle, d.h., die Antikörperbindungsstelle, des Antikörpermoleküls verwendet werden. Beispiele solcher Antikörperbindungsstellen sind die im Stand der Technik als Fab und F(ab')&sub2;-Antikörperteile bekannten, die durch Proteolyse unter Verwendung von Papain bzw. Pepsin hergestellt werden, wie im Stand der Technik gut bekannt ist.

2. Tests auf anti-EBNA-Antikörper

Ein weiteres erfindungsgemäßes diagnostisches Verfahren ist ein ELISA, der anti-EBNA-Antikörper in einer Körperprobe nachweist. Hier wird ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Polypeptid, wie beispielsweise das Polypeptid P62, als Antigen verwendet, und es wird bevorzugt an eine feste Matrix, beispielsweise an ein quervernetztes Dextran, das unter dem Warenzeichen SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey) verfügbar ist, Agarose, Glasperlen, Polyvinylchlorid, Polystyrol, quervernetztes Acrylamid, Nitrocellulose oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, gebunden (daran adsorbiert) oder anderweitig damit verbunden, um einen festen Träger zu bilden.
Das besonders bevorzugte Polypeptid wird mit der zu untersuchenden bereitgestellten Körperprobe gemischt. Die Mischung wird für einen vorbestimmten Zeitraum aufbewahrt, der für die in der Körperprobe vorhandenen anti-EBNA-Antikörper ausreichend ist, mit dem Polypeptid eine Immunreaktion einzugehen. Das Vorhandensein einer solchen Immunreaktion wird dann mit einem anzeigenden Mittel zum Signalisieren der Gegenwart von anti-EBNA-Antikörpern in der getesteten Körperprobe bestimmt.
Ein beispielhafter ELISA, der von den obenerwähnten Verfahren Gebrauch macht, verwendet einen festen Träger, der ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Polypeptid umfaßt, das an eine feste Matrix, die aus den Wänden einer Mikrotiterplatte mit 12 oder 96 Vertiefungen besteht und aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid gemacht ist, adsorbiert ist. Unspezifische Bindungsstellen an den Wänden der Mikrotiterplattenvertiefungen werden anschließend typischerweise mit einem Protein, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), blockiert. Ungebundenes Polypeptid und BSA werden aus der Mikrotitervertiefung z.B. durch Spülen entfernt.
Ein Aliquot einer Körperprobe, beispielsweise Humanserum, Blut oder Plasma, wird mit dem oben beschriebenen festen Träger mit daran gebundenem Polypeptid gemischt, um eine Mischung zu bilden, die feste und flüssige Phasen enthält. Die Mischung aus fester und flüssiger Phase wird für eine Zeit aufbewahrt, die für in der Körperprobe vorhandene anti-EBNA-Antikörper ausreichend ist, mit dem PolypeptidAntigen eine Immunreaktion einzugehen. Die festen und flüssigen Phasen werden anschließend im allgemeinen getrennt.
Eine Lösung eines zweiten markierten, ein anzeigendes Mittel enthaltenden Antikörpers, einer Antikörperbindungsstelle oder von S. aureus-Protein A, der bzw. die bzw. das mit dem erstgenannten Antikörper reagiert, wird dann mit der festen Phase gemischt, um eine andere Mischung aus fester und flüssiger Phase zu bilden. Ein beispielhafter zweiter Antikörper ist ein Peroxidase-markierter Ziege-anti-Human-Ig-Antikörper, wo die zuerst genannten Antikörper von einer menschlichen Körperprobe stammen. Zusätzlich umfassen nützliche Enzymmarkierungen alkalische Phosphatase, beta-D- Galaktosidase und Glucoseoxidase. Die aus der festen Phase und der zweiten markierten Antikörperlösung gebildete Mischung wird dann für einen vorbestimmten Zeitraum (z.B. 30 min) aufbewahrt (inkubiert), der ausreichend ist, einen Reaktanten zwischen dem erstgenannten Antikörper und dem anzeigenden Mittel zu bilden, beispielsweise eine Immunreaktion zwischen den beiden Antikörpern. Die festen und die flüssigen Phasen werden anschließend getrennt. Der oben beschriebene zweite Antikörper kann auch spezifisch für nur eine der Immunglobulinklassen (z.B. IgG, IgM, IgE, IgA oder IgD) sein und nur damit immunreagieren. Solche Antikörper stellen die Fähigkeit zur Identifizierung der Immunglobulinklasse für anti-EBNA-Antikörper, die in der Körperprobe vorhanden sind, zur Verfügung, wie in Tabelle 6 im folgenden gezeigt wird. Zusätzlich kann der zweite Antikörper oder die Antikörperbindungsstelle spezifisch für nur eine der beiden Typen von leichten Immunglobulinketten (z.B. Kappa oder Lambda) sein und nur damit immunreagieren. Diese Antikörper stellen die Möglichkeit zur Verfügung, den Isotyp des in der Körperprobe vorhandenen Immunglobulinmoleküls zu identifizieren.
Anschließend wird eine Lösung, die ein Substrat für den Enzymmarker enthält, beispielsweise Wasserstoffperoxid für Peroxidase, und ein farbbildender Farbstoffvorläufer, beispielsweise o-Phenylendiamin oder p-Nitrophenylphosphat für alkalische Phosphatase, mit der festen Phase gemischt. Die optische Dichte bei einer vorgewählten Wellenlänge (z.B. 490 bzw. 405 nm) kann dann nach Ablauf eines vorbestimmten Zeitraums (z.B. 60 min) bestimmt werden und mit der optischen Dichte einer Kontrolle verglichen werden, um festzulegen, ob in der Körperprobe anti-EBNA-Antikörper vorhanden waren.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein diagnostisches System in Kit-Form, das einen festen Träger umfaßt, der eine feste Matrix, beispielsweise einen Mikrotiterstreifen aus Polystyrol mit 12 Vertiefungen, und ein erfindungsgemäßes Polypeptid, das an die feste Matrix adsorbiert (gebunden) ist oder auf andere Weise daran befestigt ist, um eine feste Matrix zu bilden, umfaßt. Dieses System umfaßt bevorzugt auch separat verpackte anti-Human-Ig-Antikörper mit einem daran gebundenen anzeigenden Mittel, beipielsweise Peroxidase-markierte Ziege-anti-Human-Ig- Antikörper, und kann weiterhin ein Substrat für das verbundene anzeigende Mittel umfassen, beispielsweise Wasserstoffperoxid und einen farbbildenden Farbstoffvorläufer, beispielsweise o-Phenylendiamin, in weiteren getrennten Packungen. Wasserstoffperoxid wird seiner relativen Instabilität wegen typischerweise nicht in den Test-Kit einbezogen, und wird typischerweise vom Endverbraucher bereitgestellt. Puffersalze, die in einem Test bei Verwendung dieses Systems nützlich sind, können ebenfalls in einer oder mehreren getrennten Packungen in trockener oder flüssiger Form vorgesehen werden. Getrennte Packungen, die humane anti-EBNA-Antikörper und humane Antikörper, die frei von anti-EBNA-Antikörpern sind (normale humane Antikörper), enthalten, können als positive bzw. negative Kontrollen einbezogen werden. Ein Test auf die Gegenwart von anti-EBNA-Antikörpern in einer Körperprobe, beispielsweise Serum, kann mit diesem diagnostischen System unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.
Ein beispielhafter ELISA, der dem zuvor beschriebenen ähnlich ist und detailliert in Abschnitt II (Material und Methoden) beschrieben wird, wurde verwendet, um die Seren von 91 Leuten mit anti- EBNA-positiven Serotypen, die unter Verwendung des anti-Komplement-Immunfluoreszenztests (ACIF), der zuvor beschrieben worden ist, etabliert worden sind, auf die Gegenwart von anti-Polypeptid- Immunoglobin zu durchmustern. Wenn die Seren mit einer Verdünnung von 1:20 getestet wurden, waren alle 91 positiv für (banden an) die Polypeptide P27, P62, P60 und F16, F14 und F15. Selbst bei einer höheren Verdünnung von 1:320 gingen 83 der 91 EBNA-positiven Seren eine Immunreaktion mit Polypeptid P62 im ELISA ein. Es scheint daher eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem anti- EBNA-Antikörpertiter, der durch ACIF etabliert wird, und der anti- Peptidaktivität jedes Serums zu bestehen.
Die Ergebnisse illustrieren zusätzlich eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem ACIF-Verfahren und dem vorliegenden ELISA-Verfahren, das einfacher ist und leichter zu verwenden ist. Weiter illustrieren die Ergebnisse die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide für einen diagnostischen Test auf anti-EBNA- Antikörper.
Tabelle 5, unten, zeigt die Reaktivitäten der von zwei Personen erhaltenen Seren bevor und nachdem sie sich eine EBV-induzierte infektiöse Mononucleose (IM) zugezogen haben. In beiden Fällen waren Antikörper, die an die Polypeptide P27, P62 und P60 binden, vor der Infektion abwesend, erschienen aber hinterher. Im Gegensatz dazu wurden von keiner dieser Personen Antikörper, die an das Polypeptid P89 binden, erzeugt.
In einer weiteren Untersuchung wurden die aufbewahrten Seren einer zuvor besprochenen Reihe von 27 nicht immunen EBV-Donoren (Catalano et al., J. Clin. Invest., 65:1238-1245 (1980)) auf die Bindung an Polypeptide P62 und P60 in dem zuvor beschriebenen ELISA durchmustert. Der EBV-Immunstatus der verwendeten Seren wurde über die Gegenwart oder Abwesenheit des viralen Capsid- Antigens (VCA) des Epstein-Barr-Virus definiert. Personen, die keine SerumAntikörper gegen VCA haben (VCA-) sind niemals mit EBV infiziert gewesen. VCA-positive (VCA+) Individuen haben eine EBV- Infektion gehabt und tragen typischerweise einen niedrigen Spiegel von anti-EBNA-Antikörpern. Keines der Seren wies eine signifikante Reaktivität für jedes der Polypeptide auf, wie aus Tabelle 5 unten ersichtlich ist. Tabelle 5 ANTIKÖRPER GEGEN EBNA-PEPTIDE IN HUMANSEREN¹ Patient OD&sub4;&sub0;&sub5;x10³ erhalten² mit Patientenantikörpern gegen: VCA+ Normal SB vor Mononucleose SB nach Mononucleose MV vor Mononucleose MV nach Mononucleose VCA bei Normalen (n=27)
1 Alle Seren wurden bei einer Verdünnung von 1:20 getestet.
2 Optische Dichte, gemessen nach 30 min Substratinkubation bei 405 nm.
3 VCA&spplus;-Seren von Personen, die keine klinischen Zeichen einer vorliegenden EBV-verwandten Erkrankung aufweisen.
4 Seren von 21 Individuen, die keine klinischen Zeichen einer mit EBV im Zusammenhang stehenden durchgemachten oder bestehenden Krankheit aufweisen, wie durch die Abwesenheit von Antikörpern gegen VCA angezeigt wird.
5 Durchschnittliche optische Dichte ± einer Standardabweichung.
6 Nicht bestimmt.
Um die Korrelation zwischen den diagnostischen Verfahren ELISA und ACIF während des Infektionsverlaufs zu bestimmen, wurden die gelagerten Seren von acht Studenten im Collegealter, die nacheinander nach dem Ausbruch von infektiöser Mononucleose (IM) gesammelt worden waren, in dem zuvor beschriebenen ELISA unter Verwendung von Polypeptid P62 untersucht. Alle Studenten entwickelten 1 Monat bis 1 Jahr nach Infektion anti-EBNA-Titer, die mit den klassischen Verfahren, d.h., ACIF, gemessen wurden. (Henle, et al., J. Infect. Dis.,130:231-239, (1974)).
In einer Hälfte der Subjekte stiegen die anti-P62-Antikörper parallel mit den entsprechenden anti-EBNA-Titern, wie es für Patient 15 in Fig. 4 gezeigt ist. In der anderen Hälfte wurden die Antikörper gegen Polypeptid P62 im ersten Monat nach dem Auftreten von Symptomen beobachtet, während diese Antikörper bei Verwendung des ACIF-Verfahrens zu einem späteren Zeitpunkt entdeckt wurden. Diese Ergebnisse sind für die Patienten 14 und 2 in Fig. 5 gezeigt. anti-P62-Antikörper waren daher bei Verwendung des erfindungsgemäßen ELISA nachweisbar, bevor anti-EBNA-Antikörper bei Verwendung des üblichen anti-Komplement-Immunfluoreszenztests nachweisbar waren.
Um die Immunglobulinklasse zu differenzieren, die für die Immunantwort einer Person zu einem gegebenen Zeitpunkt während des Verlaufs der infektiösen Nononucleose (IM) überwiegend verantwortlich ist, wurden sekundäre (anzeigende) Antikörper, die spezifisch für Human-IgG oder -IgM waren, in dem ELISA verwendet, wie in Abschnitt II (Material und Methoden) beschrieben ist. Tabelle 6, unten, zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchung mit den Seren von zwei Personen zu verschiedenen Zeitpunkten während der EBV-Infektion, gemessen gegen Polypeptid P62 in dem ELISA. Tabelle 6 POLYPEPTID P62-GEBUNDENES, DURCH ELISA NACHGEWIESENES ERSCHEINEN EINER ANTI-PEPTIDAKTIVITÄT NACH MONONUCLEOSEINFEKTION Patient Zeit nach Infektion Vor Infektion Woche Monat Monate
1 Die IgM-Spiegel der Patienten wurden unter Verwendung eines zweiten, für humanes IgM spezifischen Antikörpers nachgewiesen.
2 Die IgG-Spiegel der Patienten wurden unter Verwendung eines zweiten, für humanes IgG spezifischen Antikörpers nachgewiesen.
3 Optische Dichte, gemessen bei 405 nm Wellenlänge.
4 Nicht bestimmt.
Unter Verwendung dieses ELISA-Verfahrens sind die Anstiege der IgM-Antikörperwerte, wenn auch klein, so doch wiederholbar und werden in allen getesteten aufeinanderfolgenden Seren gefunden. Die Immunantwort, die durch den ELISA-Test gemessen wird, ist normal dahingehend, daß IgM während der EBV-Infektion klassischerweise vor IgG auftritt. Das Auftreten von IgM-Antikörpern vor IgG- Antikörpern zeigt sich besonders gut bei Patient 15 in Tabelle 6. Die obigen Ergebnisse zeigen erneut, daß die Infektion mit EBV die Erzeugung von Antikörpern verursacht, die mit mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid reagieren.
In einer größeren anti-Polypeptid-ELISA-Untersuchung wurde die Reihe von 19 VCA--Seren, die zuvor beschrieben worden sind, gegen die Polypeptide P27, P62, P60, F12, F13, F14, F15 und F16 durchmustert. Von keinem der VCA--Seren wurde festgestellt, daß es positiv reagiert. Typische Daten sind in Tabelle 7, unten, gezeigt. Seren von klinisch normalen Individuen, die positiv für VCA-Antikörper waren, wurden bei zwei Verdünnungen getestet. Typische Ergebnisse, gezeigt in Tabelle 7, unten, weisen darauf hin, daß alle VCA&spplus;-Personen positiv für jedes der Polypeptide waren, d.h., Antikörper hatten, die daran banden.
Die Seren einer Anzahl von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) wurden in dem ELISA ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 7 zusammengefaßt. Tabelle 7 IM ELISA BESTIMMTE DURCHSCHNITTLICHE ANTIPEPTIDSPIEGEL IN HUMANEN SEREN Patientengruppe Anzahl der Seren Durchschnittliche Antikörperaktivität gegen Polypeptide¹
1 Aktivität, gemessen als optische Dichte bei 405 nm Lichtwellenlänge nach 30 min Seruminkubation.
2 VCA-negative Individuen.
3 Verdünnung, bei der die Seren getestet wurden.
4 VCA-positive Personen.
5 Personen mit diagnostizierter rheumatoider Arthritis.
Der Unterschied zwischen den normalen, VCA-positiven (Kontroll-) und RA-Patienten kann am besten bei einer Serumverdünnung von 1:320 gesehen werden. Die Antikörperspiegel in den RA-Patienten waren signifikant höher für jedes bei dieser Verdünnung getestete Polypeptid, wenn die Analyse unter Verwendung der Wilcox Rank Sum Method (Signifikanzniveau größer als 99%) durchgeführt wurde.
Patienten mit Sjögrens-Syndrom, systemischem Lupus erythematodes (SLE) und Progressiver Systemischer Sklerose (PSS) wurden ebenfalls sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Serumverdünnungen durchmustert. Der einzige Unterschied, der zwischen diesen Patientengruppen und normalen Personen gefunden wurde, war ein relativ hoher durchschnittlicher Titer der PSS-Patienten gegen die Polypeptide P27, P62, P60, F16, F14 und F15. Man nimmt an, daß diese Ergebnisse möglicherweise auf einer früheren EBV-verwandten Infektion oder der Beteiligung von EBV bei diesen Autoimmunerkrankungen beruht. Diese Daten schmälern die Nützlichkeit des ELISAs als diagnostisches Verfahren nicht.

3. Zubereitung für die passive Immunisierung

Ein Patient mit latent infizierten B-Lymphocyten, die EBNA auf ihren Zelloberflächen exprimieren, kann mit erfindungsgemäßen Rezeptoren, bevorzugt als ganze Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide erzeugt worden sind, die mit EBNA immunreagieren, behandelt werden. Die Rezeptoren werden in einer Dosiseinheit mit einer wirksamen Menge von in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel dispergierten Rezeptoren verabreicht.
Eine wirksame Menge solcher Antikörper variiert in Abhängigkeit von der Reaktivität und dem Typ der Antikörper. Im allgemeinen werden 0,5 mg bis ungefähr 25 mg Antikörper pro kg Patientenkörpergewicht für wirksam gehalten. Die Antikörper können intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht werden, wobei einige Verabreichungen in Intervallen von 3 bis 20 Tagen gegeben werden. Die Antikörper können außerdem in Verbindung mit chirurgischen oder chemischen Behandlungen verabreicht werden.
Die Antikörper können aus dem Serum oder Plasma einer Tierart erhalten werden, die sich vom zu behandelnden Patienten unterscheidet, indem Antikörper gegen das erfindungsgemäße Polypeptid unter Verwendung der zuvor beschriebenen Inokula erzeugt werden. Diese Antikörper können außerdem aus monoklonalen Quellen, beispielsweise Aszitesflüssigkeit, erhalten werden, indem eine Hybridomzellinie unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt wird. Ganze Antikörper sind als Bindungsstelle bevorzugt, da sie das Komplementsystem aktivieren können, wenn ein Immunkomplex gebildet wird.

II. Material und Methoden

A. Synthese von Polypeptiden

Die erfindungsgemäßen Polypeptide wurden chemisch mittels der Festphasenverfahren synthetisiert, wie von Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) und Houghten et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 16:311-320 (1980), beschrieben. Das Festphasenverfahren der Polypeptidsynthese wurde unter Verwendung eines Beckman Model 990B Polypeptidsyntheseapparates, der kommerziell von der Beckman Instrument Co., Berkeley, CA, U.S.A., erhältlich ist, durchgeführt.
Bei Polypeptiden mit weniger als 35 Resten, die als Inokula verwendet wurden, wurde an den Aminoterminus oder an den Carboxylterminus ein Cysteinrest angefügt, um die Kopplung an einen Proteinträger zu unterstützen, wie unten beschrieben. Die Zusammensetzungen aller Polypeptide wurde durch Aminosäureanalyse bestätigt. Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptids nach dem oben erwähnten Festphasenverfahren werden die Aminosäurereste an ein Harz (feste Phase) über eine Esterbindung vom endständigen Carboxyrest gebunden. Wenn das Polypeptid an den Träger über einen Cys-Rest gebunden werden soll oder über endständige Cys-Reste polymerisiert werden soll, ist es bequem, den Cys-Rest, der über eine Esterbindung mit dem Harz verbunden ist, als carboxyterminalen Rest zu verwenden.
Die Alpha-Aminogruppe jeder hinzugefügten Aminosäure wird typischerweise durch eine Tertiär-Butoxycarbonyl (t-BOC)-Gruppe geschützt, bevor die Aminosäure der wachsenden Polypeptidkette zugefügt wird. Die t-BOC-Gruppe wird dann vor dem Zufügen der nächsten Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette entfernt.
Reaktive Aminosäureseitenketten wurden während der Synthese der Polypeptide ebenfalls geschützt. Übliche Seitenketten schützende Gruppen wurden für die übrigen Aminosäurereste wie folgt verwendet: O-(p-Brombenzyloxycarbonyl) für Tyrosin; O-Benzyl für Threonin, Serin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, S-Methoxybenzyl für Cystein, Dinitrophenyl für Histidin, 2-Chlorbenzoxycarbonyl für Lysin und Tosyl für Arginin.
Geschützte Aminosäuren wurden aus geeigneten Lösungsmitteln umkristallisiert, so daß sie bei der Dünnschichtchromatographie einzelne Flecken ergaben. Die Kopplungen wurden üblicherweise unter Verwendung eines zehnfachen molaren Überschusses sowohl der geschützten Aminosäure als auch des Dicyclohexylcarbodiimids über die Anzahl Milliäquivalente von ursprünglicher N-terminaler Aminosäure durchgeführt. Ein 2-molarer Überschuß beider Reagentien kann ebenfalls verwendet werden. Für Asparagin wurde der geschützten Aminosäure eine gleiche molare Menge N-Hydroxybenztriazol zugefügt und Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet. Alle Kopplungsreaktionen waren nach dem Pikrinsäuretest von Gisin, Anal. Chem. Acta. 58:248-249 (1972), mehr als 99% vollständig.
Nach der Herstellung eines gewünschten Polypeptids wurde ein Teil des resultierenden, geschützten Polypeptids (ungefähr 1 g) mit 2 ml Anisol behandelt, und wasserfreies Wasserstofffluorid, ungefähr 20 ml, wurde im Reaktionsgefäß bei Trockeneistemperatur kondensiert. Die resultierende Mischung wurde bei ungefähr 4ºC ungefähr 1 Std. gerührt, um die Schutzgruppen abzuspalten und das Polypeptid von der Kette zu entfernen. Nach dem Verdampfen von Wasserstofffluorid bei einer Temperatur von 4ºC mit einem N&sub2;-Strom wurde der Rückstand mit wasserfreiem Diethylether dreimal extrahiert, um Anisol zu entfernen, und der Rest wurde im Vakuum getrocknet.
Das vakuumgetrocknete Material wurde mit 5% wässeriger Essigsäure (3 mal 50 ml) extrahiert, um das freie Polypeptid vom Harz zu trennen. Die extrakthaltige Lösung wurde lyophilisiert, um ein monomeres nicht oxidiertes Polypeptid bereitzustellen.
Das erzeugte synthetische Polypeptid kann im enzymgebundenen Immunadsorptionstest (ELISA) zum Nachweis von anti-EBNA-Antikörpern als Reagens verwendet werden. Das synthetische Polypeptid kann außerdem verwendet werden, um ein Inokulum zu erzeugen, gewöhnlich, indem es mit einem Träger zur Bildung eines Konjugates verbunden wird und dann eine wirksame Menge des Konjugates in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel dispergiert wird, wie später diskutiert wird.
Weiter ist festzustellen, daß ein erfindungsgemäßes synthetisches Multimer mit dem Festphasensyntheseverfahren aus einer Vielzahl der erfindungsgemäßen Polypeptide, die miteinander Ende-an-Ende (Kopf an Schwanz) durch eine Amidbindung zwischen dem carboxyterminalen Rest eines Polypeptides und dem aminoterminalen Rest eines zweiten Polypeptides vorhanden sind, hergestellt werden kann. Solche synthetischen Multimere werden bevorzugt als einzelnes, langes Polypeptidmultimer synthetisiert, können jedoch genauso als individuelle Polypeptide hergestellt werden, die miteinander nach ihrer individuellen Synthese unter Verwendung eines Carbodiimidreagenses, beispielsweise 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid in Wasser, verbunden werden. Die Gesamtzahl von Aminosäureresten, die in einem als einer einzelnen Polypeptidkette hergestellten Multimer enthalten ist, beträgt bevorzugt weniger als ungefähr 50, so daß bis zu ungefähr 8 erfindungsgemäße Polypeptide in eine einzelne Kopf-an-Schwanz-Multimerkette, die als ein einzelnes Polypeptid synthetisiert wird, eingebaut werden können. Ein synthetisches Kopf-an-Schwanz-Multimer enthält bevorzugt zwei bis ungefähr vier Blöcke verbundener synthetischer erfindungsgemäßer statistischer Copolymerpolypeptide und eine Gesamtzahl von weniger als ungefähr 40 Aminosäureresten.

B. Herstellung von Polymeren

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können miteinander verbunden werden, um ein Antigenes und/oder immunogenes Polymer (synthetisches Multimer) zu bilden, das eine Vielzahl von sich wiederholenden Polypeptideinheiten enthält. Ein solches Polymer hat typischerweise den Vorteil einer erhöhten Immunogenizität und Antigenizität. Zusätzlich wird typischerweise kein Träger benötigt, wenn ein polymeres Immunogen verwendet wird. Wo unterschiedliche Polypeptidmonomere verwendet werden, um das Polymer zu bilden, wird die Fähigkeit zur Immunreaktion mit Antikörpern gegen verschiedene Antigene EBNA-Determinanten erworben. Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit eines solchen Polymers, wenn es als Inokulum verwendet wird, Antikörper zu induzieren, die mit verschiedenen Antigenen Determinanten von EBNA immunreagieren.
Ein erfindungsgemäßes Polymer kann durch Synthese der Polypeptide, wie oben beschrieben, die Cysteinreste an sowohl dem Aminoterminus als auch dem Carboxyterminus enthalten, um ein Polypeptid mit Cys- Resten an beiden Enden ("diCys-endiges" Polypeptid) zu bilden, hergestellt werden. Beispielsweise kann jedes der Polypeptide aus Tabelle 1 und Polypeptide D1 und D2 aus Tabelle 2 so synthetisiert werden, daß sie einen zusätzlichen Cysteinrest an sowohl dem Amino- als auch dem Carboxyterminus enthalten, um diCys-endige Polypeptide in ihrer reduzierten Form bereitzustellen. Nach der Synthese werden in einem typischen Laboransatz 10 mg des diCys- Polypeptids (das Cysteinreste in nicht oxidierter Form enthält) in 250 Milliliter (ml) 0,1-molarem (M) Ammoniumbicarbonatpuffer gelöst. Das gelöste diCys-endige Polypeptid wird dann an der Luft oxidiert, indem die resultierende Lösung sanft über einen Zeitraum von ungefähr 18 Std. oder bis kein durch den Ellman-Test nachweisbares freies Mercaptan mehr vorhanden ist, an der Luft gerührt wird. (Siehe Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959)).
Das so hergestellte Polymer (synthetische Multimer) enthält eine Vielzahl von synthetischen, sich wiederholenden statistischen Copolymerpolypeptideinheiten, die durch Oxidieren von Cystein- (Cystin)-Resten aneinandergebunden werden. Solche Polymere enthalten typischerweise ihre sich wiederholenden Polypeptideinheiten auf Kopf-an-Schwanz-Weise sowie auf Kopf-an-Kopf- und Schwanz-an- Schwanz-Weise aneinander gebunden; d.h., die Aminotermini der beiden sich wiederholenden Polypeptideinheiten können aneinander über einen einzelnen Cystinrest gebunden werden, genauso auch zwei Carboxyltermini, da die verbindenden Gruppen an beiden Polypeptidtermini identisch sind.

C. Kopplung an Träger

Die synthetischen Polypeptide wurden mit dem von Liu et al., Biochem., 80:690 (1979), beschriebenen Verfahren an Napfschnecken (keyhole limpet)-Hämocyanin (KLH) als Träger gekoppelt. Kurz gesagt wurden 4 Milligramm (mg) des Trägers mit 0,51 mg m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester aktiviert und anschließend mit 5 mg des Polypeptids über ein amino- oder carboxylterminales Cystein umgesetzt, um ein Konjugat bereitzustellen, das ungefähr 10 bis ungefähr 35 Gew.-% Polypeptid enthält.
Es können ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste an den Amino- oder Carboxyterminus des synthetischen Polypeptids angefügt werden, um die Bindung des Polypeptids an den Träger zu unterstützen. Wie zuvor diskutiert, haben sich an die Amino- oder Carboxytermini des synthetischen Polypeptids angefügte Cysteinreste als besonders nützlich zur Bildung von Polymeren via Disulfidbindungen erwiesen. Es können jedoch auch andere im Stand der Technik gut bekannte Verfahren zum Herstellen von Konjugaten verwendet werden. Beispielhafte zusätzliche Bindungsverfahren umfassen die Verwendung von Michael-Additionsreaktionsprodukten, Dialdehyden, beispielsweise Glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983), und ähnlichen, oder die Verwendung der Carbodiimidtechnologie wie bei der Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimides zur Bildung von Amidbindungen an den Träger, wie zuvor diskutiert, für das Aneinanderbinden einer Vielzahl von Polypeptiden zur Bildung eines synthetischen Multimeres.
Im Stand der Technik sind nützliche Träger gut bekannt und sind im allgemeinen selbst Proteine. Beispiele für solche Träger sind Napfschnecken-(keyhole limpet)-Hämocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine, z.B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Humanserumalbumin (HSA), rote Blutkörperchen, beispielsweise Schaferythrocyten (SRBC), Tetanustoxoid, Choleratoxoid, sowie Polyaminosäuren, beispielsweise Poly(D-Lysin:D-Glutaminsäure), und ähnliche.
Wie im Stand der Technik ebenfalls gut bekannt ist, ist es oft vorteilhaft, ein synthetisches Polypeptid an seinen Träger mittels einer dazwischenliegenden Verbindungsgruppe zu binden. Wie oben festgestellt, ist Glutaraldehyd eine solche Verbindungsgruppe. Wenn jedoch Cystein verwendet wird, ist die dazwischenliegende Verbindungsgruppe bevorzugt ein m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid (MBS), wie es hier verwendet wurde.
Zusätzlich kann MBS zuerst dem Träger durch eine Ester-Amid-Austauschreaktion zugefügt werden, wie von Liu et al., s.o., offenbart. Anschließend kann der Addition das Zufügen einer blockierten Mercaptogruppe, beispielsweise Thiolessigsäure (CH&sub3;COSH), über die Maleimidodoppelbindung folgen. Nach Spaltung der acylblockierenden Gruppen wird eine Disulfidbindung zwischen der deblockierten Verbindungsgruppe Mercaptan und dem Mercaptan des zugefügten Cysteinrestes des synthetischen Polypeptids gebildet.
Die Wahl des Trägers hängt mehr von der letztendlichen Verwendung des Immunogens ab als von dem Determinantenteil des Immunogens und beruht auf Kriterien, die die vorliegende Erfindung nicht besonders betrifft. Beispielsweise sollte, wenn ein Inokulum in Tieren verwendet werden soll, ein Träger ausgewählt werden, der keine nachteilhafte Reaktion in dem besonderen Tier hervorruft.

D. ELISA

Anti-Peptid-Antikörperbindungs- und -inhibitionsuntersuchungen wurden mit einem enzymgebundenen Immunadsorptionstest (ELISA) wie unten beschrieben durchgeführt.
Kurz gesagt wurden Mikrotiterplattenvertiefungen (Costar, #3590, Cambridge, MA) mit den individuellen Polypeptiden als Antigenen beschichtet, indem 100 Mikroliter (ul) BBS (10 millimolar (mM) Natriumborat (pH 8,3), 150 mM NaCl), die das Polypeptid in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter (ug/ml) enthielten, zugefügt wurde. Der Kontakt zwischen den Vertiefungen und der antigenhaltigen Lösung wurde für einen vorbestimmten Zeitraum aufrechterhalten, typischerweise 15 min, und bei 20ºC, um eine antigenbeschichtete feste Phase zu bilden. Die festen und flüssigen Phasen wurden getrennt und die Vertiefungen dreimal mit BBS gewaschen.
Die unspezifischen Bindungsstellen wurden durch Zumischen von 200 Mikrolitern 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) in jeder Vertiefung zur Bildung einer weiteren Fest/Flüssigphasenmischung und 30 min Aufbewahren der Fest-Flüssigphasenmischung bei 20ºC blockiert. Die Phasen wurden getrennt und überschüssiges ungebundenes BSA durch dreimaliges Waschen mit BBS entfernt.
Kaninchen- und Humanseren (Körperproben Aliquots) wurden auf anti- Polypeptid-Aktivität getestet, indem 100 Mikroliter eines 1:20 in BBS verdünnten Serums pro Vertiefung zugefügt wurden, um eine Fest/Flüssigphasenzusammensetzung zu bilden. Der Kontakt zwischen den verdünnten Seren und der Antigen-beschichteten Festphase wurde für einen vorbestimmten Zeitraum, beispielsweise 1 Std., bei 20ºC aufrechterhalten, damit sich ein Immunreaktionsprodukt bildete.
Die feste und die flüssige Phase wurden getrennt und die feste Phase, d.h., die Antigen-beschichteten, Immunreaktionsprodukt-haltigen Vertiefungen wurden dann dreimal mit BBS gewaschen.
Die Antikörper in humanen Seren, die mit einem adsorbierten Polypeptid immunreagierten, wurden unter Verwendung eines anzeigenden Mittels nachgewiesen, das mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziege-anti-Human-Ig-Antikörper (Tago, Burlington, CA) umfaßte. Die Antikörper in Kaninchenseren, die mit einem adsorbierten Polypeptid immunreagierten, wurden unter Verwendung eines anzeigenden Mittels nachgewiesen, das mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziege-anti-Kaninchen-Ig-Antikörper (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) umfaßte. In jedem Fall wurden 100 ul des anzeigenden Antikörpers, 1:300 in BBS verdünnt, pro Vertiefung zugefügt, um eine weitere Fest-Flüssig-Phasenzusammensetzung zu bilden. Diese Fest-Flüssig-Phasenzusammensetzung wurde für einen vorbestimmten Zeitraum, 1 Std., zur Bildung eines Reaktionsprodukts zwischen den an die Festphase gebundenen humanen Antikörpern und dem anzeigenden Mittel bei 20ºC gehalten. Die Phasen wurden getrennt und die feste Phase dreimal mit BBS gewaschen.
An die polypeptidspezifischen Antikörper gebundene, mit alkalischer Phosphatase konjugierte Antikörper wurde nachgewiesen, indem spektrophotometrisch die enzymatische Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat zu p-Nitrophenol gemessen wurde. Kurz gesagt wurden jeder Vertiefung 100 Mikroliter p-Nitrophenylphosphat (1 Milligramm pro Milliliter in 2 mM MgCl&sub2;, (pH 9,8), 50 mM Natriumcarbonat) zugesetzt. Die enzymatische Reaktion wurde 1 Std. laufen gelassen und dann die optische Dichte bei 405 nm in einem TITERTEK-Spektrophotometer, erhältlich von Flow Laboratories, Inglewood, CA, bestimmt.

E. Zellkultur

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle, mit in Zellen erzeugtem EBNA eine Immunreaktion einzugehen, wurde unter Verwendung der Zellinien WI-L2, Raji, Daudi und BJAB wie oben beschrieben untersucht. WI-L2-Zellen (ATCC CRL 8155 W1L2-NS, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) sind eine für das EBV-Genom positive, nicht produzierende B-Lymphoblastenlinie, die von einem menschlichen Patienten mit erblicher Kugelzellenanämie abgeleitet ist. Levy, et al., Cancer 22:517-524 (1968).
Raji-Zellen (ATCC CCL 86, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) sind eine EBV-Genom-positive, EBNA-erzeugende lymphoblastenähnliche Zellinie aus einem Burkitt-Lymphom. Epstein, J. Nat. Cancer Inst. 34:231 (1965). Daudi-Zellen (ATCC CCL 213, American Type Culture Collection, Bethesda, MD) sind ebenfalls eine EBNA-erzeugende Zellinie. BJAB-Zellen sind eine nicht-EBNA- erzeugende Lymphozytenzellinie, die von der Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA, erhältlich ist.
Die obengenannten Zellinien wurden in RPMI 1640-Medium (Moore, J. Am. Med. Assoc. 199:519-524 (1967); und Morton, In Vitro 6:89- 100 (1970)), das mit 2 mM L-Glutamin und 10% fötalem Kälberserum supplementiert war, kultiviert.

F. Gesamtzellextrakte

Extrakte von EBNA-erzeugenden und -nicht-erzeugenden (Kontroll-) Zellen wurden hergestellt, um zu bestimmen, ob die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle für die Diagnose der EBNA-Expression nützlich sind. Zellen aus den oben beschriebenen Kulturen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 150 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, enthaltend 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) gewaschen, 5 min in Retikulozyten-Standardpuffer (RSB; 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) quellen gelassen und durch Beschallen in 3-5 Volumen RBS, eingestellt auf 0,2 bis 0,35 molar (M) NaCl lysiert. Nach 30 Minuten auf Eis wurde die ultraschallbehandelte Lösung bei 10000 x g 15 Minuten zentrifugiert, um zelluläre Zelltrümmer zu entfernen.

G. Verfahren zur Durchführung von Immunblots

Die oben erhaltenen Zellextrakte wurden unter Verwendung von Humanseren, von denen bekannt war, daß sie anti-EBNA-Antikörper enthielten, oder beispielhaften erfindungsgemäßen Rezeptormolekülen auf EBNA getestet. Die Extrakte wurden jeweils durch 18 Std. Präzipitation mit 2 Volumen Ethanol bei -20ºC konzentriert und wurden dann in Probenpuffer [SB; 10% Glycerin, 2% 2-Mercaptoethanol, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,002% Bromphenolblau, 40 mM Tris-HCl (pH 7,4)] gelöst oder 1:6 in Probenpuffer für SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) verdünnt. 7,5% Polyacrylamidgele wurden im Einklang mit dem Verfahren von Laemmli, Nature, 277:680- 685 (1970), gegossen und laufen gelassen, wobei 50 bis 200 Mikrogramm Gesamtprotein pro Spur aufgetragen wurden.
Nach der Elektrophorese wurden die Proteinbanden aus den SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch auf einen festen Träger in Form von Nitrocelluloseblättern (Schleicher und Schuell, Detroit, MI) nach dem Verfahren von Towbin et al., Proc. Natl. Adac. Sci., U.S.A., 76:4350-5354 (1979), übertragen. Dies wurde unter Verwendung einer Bio-Rad Trans-Blot-Vorrichtung (Bio-Rad, Richmond, CA) bei 70 Volt 2-3 Std. in 12,5 mM Trishydroxid, 96 mM Glycin und 20% Methanol erreicht.
Nach dem Transfer wurden die Nitrocellulosefilter oder Blots eine Stunde in entweder 2% BSA (w/v) in PBS oder 2% pulverförmiger Milch (w/v) in PBS gesättigt, um eine unspezifische Bindung zu verringern. Die Blots wurden dann einer Immunreaktion mit 0,1 ml entweder EBNA-positivem Humanserum oder Kaninchen-anti-Polypeptid- Antikörpern in 2 ml PBS oder 2% Milch 1 Std. bei 37ºC unterworfen.
An EBNA-Protein gebundene anti-Peptid-Antikörper wurden durch Reagierenlassen der Blots mit einem anzeigenden Mittel nachgewiesen. In diesem Fall wurden 20 ml ¹²&sup5;J-markiertes [200000 gezählte Zerfälle pro Minute pro Milliliter (cpm/ml), 10&sup6; gezählte Zerfälle pro Minute pro Milligramm (cpm/mg)] S. aureus-Protein A (Calbiochem, La Jolla, CA) mit dem Immunreaktionsprodukt 30 Minuten bei 37ºC in Kontakt gebracht. Die Blots wurden mit PBS gewaschen und mit Kodak XAR-Röntgenfilmen über Nacht bei -70ºC exponiert.

H. Immunisierungen

Die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle umfassen ganze Antikörper, die in Säugern erzeugt worden sind, indem diese mit Inokula, die ein Polypeptid und/oder Multimer, wie hier beschrieben, umfassen, immunisiert wurden. Es können sowohl Polypeptide als auch Multimere verwendet werden, in Inokula alleine einbezogen oder an ein Trägerprotein, beispielsweise Napfschneckenhämocyamin (KLH), konjugiert. Die Polypeptide werden jedoch bevorzugt als ein Konjugat und die Multimere bevorzugt alleine verwendet.
Kaninchen wurden mit Inokula, enthaltend 1,0 mg Konjugat in vollständigem Freundschem Adjuvans (CFA), immunisiert und die Impfungen einen Monat später mit 1,0 mg Konjugat in unvollständigem Freundschem Adjuvans (IFA) aufgefrischt. Jede Immunisierung bestand aus einer subkutanen Injektion in die hintere Hüfte. Den Kaninchen wurde 1 und 2 Monate nach der Auffrischungsimpfung Blut entnommen.
Die immunologisch aktive Antikörper enthaltenden Seren wurden dann aus dem entnommenen Blut durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gewonnen. Diese Antikörper immunreagierten mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Polypeptide und einer Antigenen EBNA-Determinante. Sie können daher in einem System zum Test auf EBNA verwendet werden.
Die einzelnen Inokula wurden mit CFA oder IFA wie folgt zubereitet: Eine Menge des Konjugats, die ausreichend ist, die gewünschte Menge von Polypeptid pro Inokulation bereitzustellen (z.B. 1 mg), wurde in PBS (ungefähr 0,5 ml) bei pH 7,2 gelöst. Gleiche Volumen von CFA oder IFA wurden dann mit den Konjugatlösungen gemischt, um ein Konjugat, Wasser und Adjuvans enthaltendes Inokulum bereitzustellen, in dem das Wasser-zu-Öl-Verhältnis 1:1 betrug. Die Mischung wurde anschließend homogenisiert, um die Inokula bereitzustellen. Das Volumen des so hergestellten Inokulums war typischerweise größer als 1 ml, und etwas von Konjugat, PBS und Adjuvans ging während der Emulgierung verloren. Im wesentlichen die gesamte Emulsion, die zurückgewonnen werden konnte, wurde in eine Spritze gefüllt und dann in die Kaninchen eingeführt, wie zuvor diskutiert. Die Menge des in die Kaninchen eingeführten Inokulums wird mit ungefähr 90% der vor dem Emulgierungsschritt vorhandenen eingeschätzt.
Die oben bechriebenen Inokula-Stammlösungen sind beispielhaft für die erfindungsgemäßen Inokula. Wie hier gezeigt wird, können sie zur Erzeugung von Rezeptormolekülen, die mit EBNA reagieren, verwendet werden.

I. Immunfluoreszenzverfahren

Ein weiteres anschauliches Verfahren zum Testen auf EBNA in einer Körperprobe verwendet erfindungsgemäße Rezeptormoloküle und ein fluorochromatisches anzeigendes Mittel zum Nachweis der Erzeugung einer Rezeptor-EBNA-Immunreaktion.
In der vorliegenden Untersuchung wurden 2x10&sup4; WI-L2-Zellen, wachsen gelassen wie oben beschrieben, auf einen ebenen Mikroskopobjektträger unter Verwendung einer Cytozentrifuge (CYTOSPIN, Shandon Southern, Astmoor, Runcorn, Cheshire, England) ausgebreitet. Nach 5 min Trocknen an der Luft bei 20ºC wurden die Zellen 2 min in Aceton fixiert, dann 2 min bei 20ºC luftgetrocknet. Die Objektträger wurden bei -20ºC gelagert, bis sie verwendet wurden.
Die fixierten WI-L2-Zellen wurden unter Verwendung von Kaninchen- anti-Polypeptid-Antikörpern (erfindungsgemäßen Rezeptoren) gegen die Polypeptide P27, P60, P62 und P89 getestet. 50 ul jeden Kaninchenserums, 1:10 in VBS-Puffer (120 mM Barbitol, pH 7,3, 144 mM NaCl, 2,5 mM MgCl&sub2; und 0,75 mM CaCl&sub2;) verdünnt, wurden bei 20ºC auf einem Objektträger für einen vorbestimmten Zeitraum (z.B. 30 min), der für die Antikörper und EBNA ausreichend war, eine Immunreaktion einzugehen, inkubiert (mit den fixierten Zellen in Kontakt gebracht und in Kontakt gehalten). Ein negativer Kontrollobjektträger wurde auf identische Weise mit normalem Kaninchenserum behandelt.
Während der oben beschriebenen Inkubation ging ein Teil der anti- Polypeptid-Antikörper mit in den fixierten WI-L2-Zellen vorhandenem EBNA eine Immunreaktion ein. Ungebundene Antikörper wurden durch Waschen mit VBS entfernt, wobei nur das EBNA-Rezeptor-Immunreaktionsprodukt auf dem markierten Träger zurückblieb.
An EBNA gebundene anti-Polypeptid-Antikörper wurden nachgewiesen, indem zuerst 50 ul Meerschweinchenkomplement (Tago, Burlingame, CA), 1:10 in VBS verdünnt, auf jedem Objektträger für einen Zeitraum (30 min), der für das Komplement ausreichend war, an die Rezeptoren zu binden, inkubiert wurden. Die Objektträger wurden dann mit VBS gewaschen, um alles nicht an das Kaninchen-anti-Polypeptid-IgG gebundene Komplement zu entfernen.
Fluoreszein-markiertes Ziege-anti-Meerschweinchen-C&sub3; (markierte antikomplementAntikörper, Cappel Laboratories, Cochranville, PA) wurde zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Komplementkomplexe verwendet. 50 ul des anzeigenden Antiserums, 1:20 in VBS verdünnt, wurden wie oben erwähnt auf jedem Objektträger 30 min bei 20ºC inkubiert. Ungebundenes Ziege-anti-Meerschweinchen-C&sub3; wurde mit VBS vom Objektträger gewaschen. Die Immunreaktionsprodukte wurden dann durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert.

J. Circulardichroismussspektroskopie

Die Konformationseigenschaften der Polypeptide wurden untersucht, um jede Sekundärstruktur, die für die Polypeptidimmunreaktion mit humanen anti-EBNA-Antikörpern notwendig sein könnte, aufzuklären. Die Polypeptide wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst. Die Spektren wurden unter Verwendung von 1 ml Proben in einem Cary 61 Spektropolarimeter (Cary Instruments, Applied Physics Corp., Monrovia, CA) aufgenommen, das auf einen Digital Equipment Corporation 11/02-Computer (Digital Equipment Corporation, Maynard, MA) abgestimmt und automatisiert war. Der Durchschnitt von 10 aufeinanderfolgenden Aufnahmen für jedes Polypeptid wurde wie in Fig. 1 gezeigt aufgetragen.
Das Voranstehende soll die vorliegende Erfindung veranschaulichen, nicht beschränken. Unzählige Variationen und Modifikationen können vorgenommen werden, ohne den Schutzumfang der Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, zu verlassen.

Claims

1. Synthetisches Polypeptid, das bis zu 20 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus genommen, durch die Formel dargestellt wird, die ausgewählt ist aus

(i) -Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys-Arg- Pro-Met-;

(ii) -Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly-Leu- Gly-Glu-;

(iii) -Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-;

(iv) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Gly-Arg-;

(v) -Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;

(vi) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-;

(vii) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Ala-Gly-;

(viii) -Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-;

(ix) -Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-;

(x) -Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala- Gly-Gly-Ala-Gly-;

(xi) -Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala- Gly-;

(xii) -Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-;

(xiii) -Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Gly-Ala-Gly-;

pharmazeutisch verträgliche Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon.

2. Synthetisches Polypeptid, ausgewählt aus

(i) H-Arg-Ala-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Glu-Lys- Arg-Pro-Met-OH;

(ii) H-Ile-Met-Ser-Asp-Glu-Gly-Pro-Gly-Thr-Gly-Asn-Gly- Leu-Gly-Glu-OH;

(iii) H-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Pro-OH;

(iv) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Gly-Arg-OH;

(v) H-Lys-Gly-Thr-His-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH;

(vi) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH;

(vii) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-OH;

(viii) H-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly- Gly-Ala-Gly-Gly-OH;

(ix) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-OH;

(x) H-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly- Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH;

(xi) H-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly- Ala-Gly-OH;

(xii) H-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala- Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-OH;

(xiii) H-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly- Gly-Gly-Ala-Gly-OH;

3. Synthetisches Multimer, enthaltend eine Vielzahl verbundener synthetischer Polypeptide gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 als sich wiederholende Einheiten.

4. Multimer nach Anspruch 3, worin die sich wiederholenden Polypeptideinheiten miteinander durch eine Amid- oder Disulfidbindung verbunden sind.

5. Synthetisches Polypeptid-Inokulum, das für die Induktion von Antikörpern geeignet ist, die mit EBNA immunreagieren, welches ein synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, gelöst oder dispergiert in einer wirksamen Menge eines pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittels, umfaßt, wobei das Inokulum, wenn es in einer wirksamen Menge in einen Säugerwirt eingeführt wird, zur Induktion der Erzeugung von Antikörpern, die mit EBNA immunreagieren, fähig ist.

6. Synthetisches Polypeptid-Inokulum nach Anspruch 5, worin das Polypeptid an einen Träger gebunden ist.

7. Synthetisches Polypeptid-Inokulum nach Anspruch 5 in Dosiseinheitsform, worin das Polypeptid in einer Menge von ungefähr 10 ug bis ungefähr 500 mg pro Dosis vorhanden ist.

8. Rezeptormolekül, enthaltend eine gegen ein synthetisches Immunogen erzeugte Antikörper-Bindungsstelle, wobei das synthetische Immunogen ein synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt.

9. Diagnostisches System in Kit-Form zum Testen der Gegenwart von EBNA, umfassend:

a) Rezeptormoleküle, die gegen ein synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 erzeugt sind; und

b) ein anzeigendes Mittel zum Signalisieren der Immunreaktion des Rezeptors mit EBNA.

10. Verfahren zum Testen auf Anti-EBNA-Antikörper in einer Körperprobe, umfassend die Schritte:

a) das Bereitstellen einer zu untersuchenden Körperprobe;

b) das Mischen der Körperprobe mit einem synthetischen Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2;

c) das Aufbewahren der Mischung für einen vorbestimmten Zeitraum, der für die in der Probe vorhandenen EBNA- Antikörper ausreichend ist, mit dem Polypeptid eine Immunreaktion einzugehen; und

d) das Bestimmen der Gegenwart der Immunreaktion.

11. Verfahren nach Anspruch 10, das den weiteren Schritt des Befestigens des Polypeptids an einem festen Träger vor dem Mischen umfaßt.

12. Diagnostisches System in Kit-Form zum Testen der Gegenwart von Antikörpern gegen EBNA in einem Körperbestandteil, umfassend in getrennten Packungen

a) ein synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2; und

b) ein Anzeigemittel zum Signalisieren der Immunreaktion des Polypeptides mit Antikörpern gegen EBNA.

13. Diagnostisches System nach Anspruch 12, worin das synthetische Polypeptid an einer festen Matrix befestigt ist, um einen festen Träger zu bilden.

14. Diagnostisches System nach Anspruch 13, worin das Anzeigemittel ein markierter Antikörper ist, der mit humanen Anti-EBNA-Antikörpern immunreagieren kann.

15. Zubereitung zur passiven Immunisierung gegen B-Lymphozyten, die EBNA auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, umfassend eine wirksame Menge von gegen ein synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 erzeugten Antikörper.

16. Verfahren zum Testen auf die Gegenwart von EBNA in einer Körperprobe, umfassend die Schritte:

a) das Bereitstellen einer zu untersuchenden Körperprobe

b) das Mischen der Rezeptormoleküle, die eine gegen ein synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 erzeugte Antikörper-Bindungsstelle enthalten;

c) das Aufbewahren der Mischung für einen vorbestimmten Zeitraum, der für die Rezeptormoleküle ausreichend ist, mit dem in der Körperprobe vorhandenen EBNA eine Immunreaktion einzugehen; und

d) das Messen des Ausmaßes der Immunreaktion.

17. Immunreaktionsprodukt, umfassend einen humanen Anti- EBNA-Antikörper, der immunologisch an ein synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 gebunden ist.