DE69228701T2

DE69228701T2 - Fragmente von Prion Proteinen.

Info

Publication number: DE69228701T2
Application number: DE69228701T
Authority: DE
Inventors: Robert Vincent Bradley Smithy Cottage Cheshire Sk11 0Hd Fishleigh; Roger Paul Manchester M20 9Dz Mee; Barry The Old Bakery 22A Town Stree Cheshire Sk6 5Aa Robson
Original assignee: Proteus Molecular Design Ltd
Current assignee: Protherics Medicines Development Ltd
Priority date: 1991-12-03
Filing date: 1992-12-03
Publication date: 1999-07-29
Anticipated expiration: 2012-12-04
Also published as: ATE177754T1; WO1993011155A1; JP4233604B2; EP0616613B1; US20030199013A1; AU675053B2; EP0616613A1; JPH07501798A; GR3029740T3; DE69228701D1; CA2124953C; AU3089292A; US6379905B1; NZ246059A; DK0616613T3; US5773572A; US7777011B2; CA2124953A1; ES2128362T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Polypeptide. Sie betrifft insbesondere synthetische Polypeptide, die die dreidimensionalen Strukturen und/oder elektrostatischen Oberflächen und/oder andere physikalische, chemische und strukturelle Eigenschaften bestimmter Abschnitte von Proteinen nachahmen, von denen angenommen wird, daß sie an der molekularen Pathologie von spongiformen Enzephalopathien beteiligt sind. Sie ist von besonderem Interesse für den Aufbau von Immundiagnostika, Impfstoffen und anderen medizinischen, veterinärmedizinischen oder wissenschaftlichen Mitteln, die in Beziehung zu spongiformen Enzephalopathien von Mensch, Rind und Schaf stehen.
Spongiforme Enzephalopathien sind eine Gruppe von degenerativen neurologischen Erkrankungen. Beispiele dafür sind bei einer Reihe von Spezies gefunden worden, einschließlich Schafen (wo sie als Scrapie bekannt sind), Kühen (BSE) und Menschen (Creutzfeld-Jakob-Erkrankung (CJD) und Kuru) (Übersichtsartikel, Taylor, D. M., Veterinary Record 125, 413-415 (1989)). Ähnliche Leiden hat man bei Wildnerzpopulationen und bei Stallkudus (eine Antilopenart) und bei Tigern gefunden. Es ist verschiedentlich berichtet worden, daß BSE unter Laborbedingungen an Mäuse und Schweine übertragen werden kann. Diese Überschreitung der Artgrenzen durch das infektiöse Agens hat die verstärkte Besorgnis aufgeworfen, daß auch eine Übertragung auf den Menschen möglich ist.
Diese Erkrankungen sind durch eine langsame Inkubationszeit von vier bis fünf Jahren charakterisiert, wonach die klinischen Symptome einer fortschreitenden Degeneration des Geisteszustandes, einschließlich Aggressivität und fehlende Koordination auftreten. Die Obduktionen ergeben ein charakteristisches Vakuolenbildungsmuster im Gehirngewebe aufgrund der Zerstörung von Nervenzellen, und die Ablagerung ungewöhnlicher Proteinfasern.
Obwohl die bei Schafen auftretende Krankheitsform (Scrapie) seit vielen Jahren bekannt ist, sind die spongiformen Enzephalopathien im letzten Jahrzehnt nach dem Auftreten von BSE auf Rinderfarmen bekannt geworden. Die Häufigkeit von BSE ist während dieses Zeitraum in Großbritannien drastisch angestiegen, und öffentliche Spekulationen über eine mögliche Übertragung auf den Menschen haben zu einem Zusammenbruch auf dem Fleischmarkt geführt. Sowohl aus veterinärmedizinischen als auch aus ökonomischen Gründen besteht ein dringender Bedarf an Diagnosemitteln zum Nachweis der Infektion und an Impfstoffen zur Verhinderung der Infektion.
Das verursachende Agens von Scrapie und seinen Gegenstücken bei anderen Tieren ist ein sogenanntes "Prion", d. h. ein infektiöses Partikel, das nur Protein und keine Nukleinsäure umfaßt, wobei die Gegenwart des letzteren im Fall eines herkömmlichen Virus erforderlich ist. Bei Scrapie hat man ein bestimmtes Protein gefunden (das als Prionprotein, PrPSC, bezeichnet wird), das mit der Infektiosität cogereinigt wird, und unter Laborbedingungen scrapieähnliche Leiden bei Gehirnzell kulturen aus anderen Tieren, wie Hamster, hervorruft. PrPsC ist die einzige bekannte Komponente der charakteristischen Proteinfasern, die im Gehirngewebe von scrapieinfizierten Schafen abgelagert werden. Der Ausdruck "PrPSC", wie er hier verwendet wird, sollte so verstanden werden, daß er sich nicht nur auf das spezifische Prionprotein bezieht, das im Schaf identifiziert wird, sondern auch auf solche homologen Proteine, die man in vielen anderen Spezies findet und die eine strukturelle Modifikation, wie nachstehend beschrieben, zu durchlaufen scheinen. Der Ausdruck "PrPC" wird für das normale zelluläre Gegenstück von PrPSC verwendet.
Das Hauptproblem bei der Suche nach einem spezifischen Diagnosemittel oder synthetischen Impfstoff gegen das Scrapieagens PrPSC ist, daß es nahezu identisch zur natürlichen Form des Proteins PrPC ist. Die natürliche Funktion dieses Proteins ist noch nicht verstanden, aber die bemerkenswert starke Konservierung der Primärstruktur zwischen homologen Proteinen unterschiedlicher Spezies legt nahe, daß es eine wesentliche strukturelle oder funktionelle Rolle im Organismus spielt.
Trotz der nahezu identischen Form dieser Prionen zu den natürlichen Proteinen haben wir synthetische Peptidstrukturen abgeleitet, die mindestens eine antigene Eigenschaft umfassen, wie eine Epitopstelle, und diese synthetischen Peptide können zur Herstellung von diagnostischen Mitteln und Impfstoffen verwendet werden.
Die Antworten der B- und T-Zellen des Immunsystems sind nicht durch eine globale Erkennung eines vollständigen Proteins, sondern eher durch Erkennung eines als Epitopstelle bekannten kleinen Abschnittes der Proteinoberfläche gekennzeichnet. Diese Stellen können durch einen kontinuierlichen Abschnitt einer Peptidkette gebildet werden, oder sie können diskontinuierlich sein, wobei gesonderte Abschnitte der Peptidkette aufgrund der Faltung der Kette an der Proteinoberfläche zusammengebracht werden. Ein Ziel bei der Herstellung eines synthetischen Peptidimpfstoffes ist es, die Struktur eines bestimmten Epitops nachzuahmen und dadurch eine primäre Immunreaktion herbeizuführen, die die Produktion von Gedächtnis-B-Zellen bewirkt, welche Antikörper auf eine anschließende Aussetzen des Parentalproteins hin sezernieren, so daß eine stark verstärkte Antwort auf eine Sekundär-Infektion erzeugt wird. Ein ähnlicher Mechanismus über die Aktivierung der cytotoxischen T-Zellen zur stärkeren Reaktion auf ein bestimmtes Antigen erfolgt ebenfalls.
Bei der Anwendung herkömmlicher Impfstoff-Herstellungsverfahren für diese Erkrankung treten jedoch Probleme auf, da vermutlich eher die Molekülstruktur des Prionproteins als die Nukleinsäuresequenz für die Infektiosität im Prion verantwortlich ist. Das übliche Verfahren zur Herstellung von viralem Impfstoff beinhaltet die Inaktivierung des Virus auf irgendeine Weise, so daß die Infektiosität zerstört wird und gleichzeitig die Epitopstellen bewahrt bleiben. Es werden Techniken wie Hitzebehandlung oder serielles Durchschleusen des Virus durch eine Kultur eingesetzt, jedoch bewirken diese Ansätze keinen Infektiositätsverlust eines Prions, wenn nicht solche Bedingungen eingesetzt werden, die die Denaturierung des Proteins bewirken. Wenn die Bedingungen zur Inaktivierung des Prionproteins stringent genug sind, dann wird das Protein denaturiert und sämtliche Epitopstellen gehen verloren. Es ergibt sich somit ein Hauptproblem, wenn man versucht, antigene aber nicht infektiöse Prionproteine auf herkömmlichen Wegen zu gewinnen. Das Scrapieagens beim Schaf bspw. ist bekanntlich gegenüber chemischer oder physikalischer Inaktivierung resistent(Hodgson, J. Bio/Technology 8,990 (1990)).
Unsere Erfindung betrifft bestimmte synthetische Polypeptide mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins. Das Prionprotein hat vorzugsweise die Form, die nur im Nervengewebe eines Säugetiers vorkommt, das an spongiformer Enzephalopathie leidet.
Wir haben entdeckt, daß Prionproteine des vorstehend erwähnten Typs sechs interessante Bereiche umfassen, die als A bis F bezeichnet werden, sowie zwei verwandte Leserasterverschiebungspeptidsequenzen, d. h. 1) ein repetitiver Bereich in Abschnitt E, der auf Nukleinsäureebene eine Leserasterverschiebung der codierenden Sequenz von +1 (FSa) durchlaufen hat und 2) der repetitive Bereich in Abschnitt E, der auf Nukleinsäureebene eine Leserasterverschiebung der codierenden Sequenz von -1 (FSb) durchlaufen hat.
Bezüglich Bereich A, stellt unsere Erfindung eine synthetische Peptidsequenz gemäß der allgemeinen Formel (I) bereit:
X-(R&sub1;-Lys-His-R&sub2;)-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-R&sub3;-Gly-Ala-Val- Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala-Met- Ser-(Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;)-Y (I)
wobei R&sub1; ein aus Met, Leu und Phe ausgewählter Aminosäurerest ist;
R&sub2; entweder Met oder Val ist;
R&sub3; Ala ist oder fehlt;
R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ein aus Leu, Ile und Met ausgewählter Aminosäurerest sind; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Pepid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere weitere Aminosäurereste sein können.
Es ist bspw. ersichtlich, daß die Reste am N-Terminus der Sequenz als "R&sub2;-" oder "His-R&sub2;-" oder "Lys-His-R&sub2;-" oder "R&sub1;-Lys-His-R&sub2;-" zugegen sein können. Entsprechend können die bevorzugten Reste am C-Terminus als "-Arg" oder "-Arg-Pro" oder "-Arg-Pro-R&sub4;" oder "-Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;" zugegen sein.
Vorzugsweise ist der Rest R&sub1; - wenn zugegen - Met, R&sub3; Ala und R&sub5; - wenn zugegen - Ile. Ist R&sub2; Met, dann ist R&sub4; - wenn zugegen - ebenfalls Ile. Nachstehend sind bevorzugte Sequenzen (SEQ.-ID.-Nr. 1 und SEQ.-ID.-Nr. 2) der Formel I aufgeführt, die Prionproteine aus Rind, Schaf bzw. Mensch betreffen:

Seq.-ID.-Nr. 1

X-(Met-Lys-His-Val)-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala- Met-Ser-(Arg-Pro-Leu-Ile)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 2

X-(Met-Lys-His-Met)-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala- Met-Ser-(Arg-Pro-Ile-Ile)-Y.
Eine besonders bevorzugte Sequenz nach Formel I ist Seq.-ID.-Nr. 51:
Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala- Met-Ser-Arg-Gly-Cys.
Natürlich umfaßt unsere Erfindung signifikante Subfragmente der Sequenz nach Formel I oben, und bevorzugte Subfragmente sind:
i) X-(His-R&sub2;-Ala-Gly)-Ala-Ala-Ala-R&sub3;-Gly-Ala-Val- Val-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Y; und
ii) X-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser- Ala-Met-Ser-(Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;)-Y,
wobei R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, X und Y wie für Formel I definiert sind, und ein oder mehrere Reste in Klammern wie in Formel I fehlen oder vorhanden sein können.
Dem Vorhergehenden zufolge sind bevorzugte Subfragmente bezüglich Rindern und Schafen:

Seq.-ID.-Nr. 3

i) X-(His-Val-Ala-Gly)-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-(Gly-Leu-Gly-Gly)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 4

ii) X-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser- Ala-Met-Ser-(Arg-Pro-Leu-Ile)-Y.
Entsprechend sind bevorzugte Subfragmente für Menschen:

Seq.-ID.-Nr. 5

i) X-(His-Met-Ala-Gly)-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-(Gly-Leu-Gly-Gly)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 6

ii) X-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser- Ala-Met-Ser-(Arg-Pro-Ile-Ile)-Y.
Bezüglich des Bereiches B stellt unsere Erfindung eine synthetische Peptidsequenz gemäß der allgemeinen Formel II bereit:
X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;-His-Phe-Gly-R&sub6;- Asp-R&sub7;-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-R&sub8;-Arg- (Tyr-Pro-Asn-Gln)-Y (II),
wobei R&sub4; und R&sub5; die gleiche Bedeutung haben wie in Formel I;
R&sub6; entweder Asn oder Ser ist;
R&sub7; entweder Tyr oder Trp ist;
R&sub8; ein Aminosäurerest ist, ausgewählt aus His, Tyr und Asn;
wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und
X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können.
In einer Sequenz gemäß Formel II ist vorzugsweise R&sub5; Ile, R&sub7; Tyr und R&sub8; His oder Tyr. Nachstehend sind einige bevorzugte Sequenzen der Formel II aufgeführt, die zu Prionproteinen aus Rind, Schaf bzw. Mensch gehören:

Seq.-ID.-Nr. 7

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-His-Arg- (Tyr-Pro-Asn-Gln)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 8

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Asn- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-Tyr-Arg- (Tyr-Pro-Asn-Gln)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 9

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Ile-Ile-His-Phe-Gly-Ser- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-His-Arg- (Tyr-Pro-Asn-Gln)-Y.
Besonders bevorzugte Sequenzen sind ausgewählt aus:

Seq.-ID.-Nr. 42

Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly- Asn-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Cys; und

Seq.-ID.-Nr. 43

Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly- Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Cys.
Es ist wiederum offensichtlich, daß unsere Erfindung signifikante Subfragmente der Sequenz gemäß Formel II umfaßt, und ein bevorzugtes allgemeines Subfragment hat die Sequenz:
X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;-His-Phe-Gly-R&sub6;- Asp-R&sub7;-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-(Arg-Glu-Asn-Met)-Y,
wobei R&sub4; bis R&sub7;, X und Y wie für Formel II definiert sind, und ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können. Vorzugsweise ist R&sub5; Ile und R&sub7; Tyr. Es ist offensichtlich, daß bevorzugte Subfragmente, die zu Rindern, Schafen und Menschen gehören, jeweils sind:

Seq.-ID.-Nr. 10

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-(Arg-Glu-Asn-Met)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 11

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Asn- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-(Arg-Glu-Asn-Met)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 12

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Ile-Ile-His-Phe-Gly-Ser- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-(Arg-Glu-Asn-Met)-Y.
Bezüglich des Bereiches C stellt unsere Erfindung eine synthetische Peptidsequenz gemäß der allgemeinen Formel III bereit:
X-(Asn-Met-R&sub8;-Arg)-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-R&sub9;-Asp-R&sub1;&sub0;-Tyr-R&sub1;&sub1;-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y (III),
wobei R&sub8; ein aus His, Tyr und Asn ausgewählter Aminosäurerest ist,
R&sub9; Val oder Met ist;
R&sub1;&sub0; ein aus Gln, Glu und Arg ausgewählter Aminosäurerest ist;
R&sub1;&sub1; Ser oder Asn ist; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können.
In einer Sequenz gemäß Formel III ist vorzugsweise R&sub8; His oder Tyr und R&sub1;&sub1; Ser. Nachstehend sind bevorzugte Sequenzen der Formel III aufgeführt, die zu Prionproteinen aus Rind, Schaf bzw. Mensch gehören:

Seq.-ID.-Nr. 13

X-(Asn-Met-His-Arg)-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-Val-Asp-Gln-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 14

X-(Asn-Met-Tyr-Arg)-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-Val-Asp-Arg-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 15

X-(Asn-Met-His-Arg)-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-Met-Asp-Glu-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y.
Besonders bevorzugte Sequenzen sind ausgewählt aus:

Seq.-ID.-Nr. 44

Asn-Met-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Val- Asp-Arg-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-Gly-Cys; und

Seq.-ID.-Nr. 45

Asn-Met-His-Arg-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Val- Asp-Gln-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-Gly-Cys.
Signifikante Subfragmente der Sequenz gemäß Formel III bilden einen Teil dieser Erfindung, und ein bevorzugtes Subfragment hat die Sequenz:
X-(Arg-Tyr-Pro-Asn)-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-R&sub9;-Asp- R&sub1;&sub0;-Tyr-R&sub1;&sub1;-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y.
Bevorzugte Subfragmente, die zu Rindern, Schafen und Menschen gehören, sind jeweils:

Seq.-ID.-Nr. 16

X-(Arg-Tyr-Pro-Asn)-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Val-Asp- Gln-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 17

X-(Arg-Tyr-Pro-Asn)-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Val-Asp- Arg-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 18

X-(Arg-Tyr-Pro-Asn)-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Met-Asp- Glu-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y.
Hinsichtlich des Bereiches D stellt unsere Erfindung eine synthetische Peptidsequenz gemäß der allgemeinen Formel IV bereit:
X-(Tyr-Tyr-R&sub1;&sub2;-R&sub1;&sub3;-Arg)-R&sub1;&sub4;-R&sub1;&sub5;-Ser-R&sub1;&sub6;-R&sub1;&sub7;-R&sub1;&sub8;-Leu-Phe-Ser- Ser-Pro-Pro-Val-Ile-Leu-Leu-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile-Phe- Leu-R&sub1;&sub9;-Val-Gly-Y (IV),
wobei R&sub1;&sub2; Asp oder Gln ist;
R&sub1;&sub3; Gly ist oder fehlt;
R&sub1;&sub4; Gly oder Arg ist;
R&sub1;&sub5; Ala oder Ser ist;
R&sub1;&sub6; Ser ist oder fehlt;
R&sub1;&sub7; ein aus Ala, Thr, Met und Val ausgewählter Aminosäurerest ist;
R&sub1;&sub8; Val oder Ile ist;
R&sub1;&sub9; Ile oder Met ist; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können.
In einer Sequenz gemäß Formel IV ist vorzugsweise R&sub1;&sub2; Gln, R&sub1;&sub3; nicht vorhanden, R&sub1;&sub4; Gly, R&sub1;&sub6; nicht vorhanden, R&sub1;&sub7; Val oder Met und R&sub1;&sub9; Ile.
Nachstehend sind bevorzugte Sequenzen der Formel IV aufgeführt, die zu Prionproteinen von Rind, Schaf bzw. Mensch gehören:

Seq.-ID.-Nr. 19

X-(Tyr-Tyr-Gln-Arg)-Gly-Ala-Ser-Val-Ile-Leu-Phe-Ser- Ser-Pro-Pro-Val-Ile-Leu-Leu-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile-Phe- Leu-Ile-Val-Gly-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 20

X-(Tyr-Tyr-Gln-Arg)-Gly-Ser-Ser-Met-Val-Leu-Phe-Ser-Ser- Pro-Pro-Val-Ile-Leu-Leu-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile- Phe-Leu-Ile-Val-Gly-Y.
Man erkennt deutlich, daß signifikante Subfragmente der Sequenz gemäß Formel N innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen, und ein bevorzugtes allgemeines Subfragment hat die Sequenz:
X-(R&sub1;&sub4;-R&sub1;&sub5;-Ser-R&sub1;&sub6;-R&sub1;&sub7;)-R&sub1;&sub5;-Leu-Phe-Ser-Ser-Pro-Pro-Val- Ile-(Leu-Leu-Ile-Ser)-Y,
wobei R&sub1;&sub4; bis R&sub1;&sub8;, X und Y wie für Formel IV definiert sind, und ein oder mehrere Reste in Klammern wie in Formel IV vorhanden sein oder fehlen können.
Es ist bevorzugt, daß in einem Subfragment, wie vorstehend angegeben, R&sub1;&sub4; Gly ist, R&sub1;&sub6; fehlt, und R&sub1;&sub7; Val oder Met ist. Nachstehend sind bevorzugte Subfragmente aufgeführt, die zu Rindern, Schafen bzw. Menschen gehören:

Seq.-ID.-Nr. 21

X-(Gly-Ala-Ser-Val)-Ile-Leu-Phe-Ser-Ser-Pro-Pro-Val- Ile-(Leu-Leu-Ile-Ser)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 22

X-(Gly-Ser-Ser-Met)-Val-Leu-Phe-Ser-Ser-Pro-Pro-Val- Ile-(Leu-Leu-Ile-Ser)-Y.
Bezüglich des Bereiches E stellt unsere Erfindung drei synthetische Polypeptidsequenzen gemäß den allgemeinen Formeln Va, Vb und Vc bereit:
X-(Pro-Gly-Gly-R&sub2;&sub0;)-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr- Pro-Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro-Pro- Gln-Gly-(Gly-Rzl-Rzz-Trp)-Y (Va);
X-(Gly-Gly-R&sub2;&sub1;-R&sub2;&sub2;-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly- R&sub2;&sub3;-Trp-(Gly-Gln-Pro-His)-Y (Vb); und
X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-R&sub2;&sub4;-R&sub2;&sub5;-His-R&sub2;&sub6;- Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-R&sub2;&sub7;-Lys-Pro-Lys-Thr-R&sub2;&sub8;-R&sub2;&sub9;-Lys (-His-R&sub3;&sub0;-Ala-Gly)-Y (Vc),
wobei R&sub2;&sub0;, R&sub2;&sub1;, R&sub2;&sub3; und R&sub2;&sub4; jeweils unabhängig voneinander entweder Gly sind oder fehlen; R&sub2;&sub2; entweder Gly oder Thr ist;
R&sub2;&sub5; entweder Thr oder Ser ist;
R&sub2;&sub6; ein aus Gly, Ser und Asn ausgewählter Aminosäurerest ist;
R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; jeweils unabhängig voneinander entweder Asn oder Ser sind;
R&sub2;&sub9; ein aus Met, Leu und Phe ausgewählter Aminosäurerest ist;
R&sub3;&sub0; entweder Val oder Met ist; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Pepid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere weitere Aminosäurereste sein können.
Hinsichtlich der Formeln Va bis Vc oben, ist bevorzugt, daß R&sub2;&sub2; Gly ist, R&sub2;&sub3; fehlt, R&sub2;&sub6; Gly oder Ser ist, R&sub2;&sub7; Ser ist, R&sub2;&sub5; Asn ist und R&sub2;&sub9; Met ist.
Bevorzugte Sequenzen für Prionproteine beim Rind gemäß den Formeln Va bis Vc sind nachstehend angegeben:

Seq.-ID.-Nr. 23

X-(Pro-Gly-Gly-Gly)-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr- Pro-Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro-Pro- Gln-Gly-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 24

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp- (Gly-Gln-Pro-His)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 25

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-Thr-His-Gly-Gln- Trp-Asn-Lys,-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys (-His-Val-Ala-Gly)-Y.
Bevorzugte Sequenzen der Formeln Va bis Vc bezüglich Prionproteinen aus Schaf sind die folgenden:

Seq.-ID.-Nr. 26

X-(Pro-Gly-Gly-Gly)-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr- Pro-Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro- Pro-Gln-Gly-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 27

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly- Gly-Trp-(Gly-Gln-Pro-His)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 28

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-Ser-His- Ser-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr- Asn-Met-Lys-(His-Val-Ala-Gly)-Y.
Bevorzugte Sequenzen der Formeln Va bis Vc bezüglich Prionproteinen aus Mensch sind die folgenden:

Seq.-ID.-Nr. 29

X-(Pro-Gly-Gly-Gly)-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr-Pro- Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro-Pro- Gln-Gly-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 30

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly- Trp-(Gly-Gln-Pro-His)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 31

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-Gly-Thr-His-Ser- Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys- (His-Met-Ala-Gly)-Y.
Besonders bevorzugte Sequenzen der Formeln Va bis Vc bestehen aus:

Seq.-ID.-Nr. 49

Gly-Gly-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr-Pro-Gly-Gln- Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro- Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Cys;

Seq.-ID.-Nr. 46

Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly- Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Cys; und

Seq.-ID.-Nr. 47

Gly-Gln-Gly-Gly-Ser-His-Ser-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro- Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Val-Gly-Cys.
Wir haben festgestellt, daß in der Nukleinsäuresequenz, die dem Bereich E entspricht, die repetitive Sequenz der Formel Vb eine Leserasterverschiebung von entweder +1 oder -1 erfahren haben kann. Diese Leserasterverschiebungen erzeugen veränderte Sequenzen im Bereich E des Prionproteins, und unsere Erfindung stellt ein synthetisches Polypeptid mit einer Sequenz bereit, wobei eine repetitive Sequenz in Bereich E eine -1-Rasterverschiebung erfahren hat, wie in Formel VI gezeigt:
X-(R&sub3;&sub1;-R&sub3;&sub2;-Trp-R&sub3;&sub3;)-Trp-Leu-Gly-R&sub3;&sub4;-R&sub3;&sub5;-R&sub3;&sub6;-Trp-R&sub3;&sub7;- (Trp-Leu-Gly-R&sub3;&sub8;)-Y (VI),
wobei R&sub3;&sub1; und R&sub3;&sub5; jeweils unabhängig voneinander entweder Ala oder Thr sind; R&sub3;&sub2; und R&sub3;&sub6; jeweils unabhängig voneinander ein aus Ser, Pro und Thr ausgewählter Aminosäurerest sind;
R&sub3;&sub3; und R&sub3;&sub7; jeweils unabhängig voneinander entweder Trp oder Arg sind;
R&sub3;&sub4; und R&sub3;&sub8; jeweils unabhängig voneinander ein aus Ala, Ser, Pro und Thr ausgewählter Aminosäurerest sind; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können.
Hinsichtlich der -1-Rasterverschiebungen des Bereiches E bei Rindern ist es bevorzugt, daß R&sub3;&sub1; Ala ist, R&sub3;&sub2;, R&sub3;&sub4;, R&sub3;&sub6; und R&sub3;&sub5; Jeweils unabhängig voneinander entweder Ser oder Pro sind, R&sub3;&sub3; und R&sub3;&sub7; Arg sind, und R&sub3;&sub5; Ala ist.
Man beachte, daß sich bevorzugte Sequenzen für die -1-Rasterverschiebungen im Bereich E bei Schafen in einigen Punkten von den für Rinder angegebenen unterscheiden, und bei einer bevorzugten Schafssequenz entsprechen R&sub3;&sub1;, R&sub3;&sub2;, R&sub3;&sub3;, R&sub3;&sub5;, R&sub3;&sub6; und R&sub3;&sub7; den vorstehend für Formel VI gegebenen Definitionen; und R&sub3;&sub4; und R&sub3;&sub5; sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus Ser, Pro und Thr.
Bei einer bevorzugten Mensch-Sequenz gemäß Formel VI sind R&sub3;&sub1;, R&sub3;&sub4;, R&sub3;&sub5; und R&sub3;&sub8; jeweils Ala, R&sub3;&sub2; und R&sub3;&sub6; sind jeweils unabhängig voneinander entweder Ser oder Pro, und R&sub3;&sub3; und R&sub3;&sub7; sind jeweils Trp.
Die Rasterverschiebung kann wie vorstehend erwähnt im repetitiven Abschnitt des Bereiches E +1 sein, was unterschiedliche Aminosäuresequenzen zur Folge hat. Unsere Erfindung stellt daher ein synthetisches Polypeptid gemäß der nachstehenden Formel VII bereit, die eine +1-Rasterverschiebung im repetitiven Abschnitt des Bereichs E betrifft:
X-(R&sub3;&sub9;-R&sub4;&sub0;-Met-R&sub4;&sub1;)-Val-Ala-Gly-R&sub4;&sub2;-R&sub4;&sub3;-R&sub4;&sub4;-Met-R&sub4;&sub5;- (Val-Ala-Gly-R&sub4;&sub6;)-Y (VII),
wobei R&sub3;&sub9; und R&sub4;&sub3; jeweils unabhängig voneinander entweder Ser oder Asn sind; R&sub4;&sub0; und R&sub4;&sub4; jeweils unabhängig voneinander ein aus Pro, Leu, und His ausgewählter Aminosäurerest sind, R&sub4;&sub1; und R&sub4;&sub5; jeweils unabhängig voneinander Val oder Glu sind; R&sub4;&sub2; und R&sub4;&sub6; jeweils unabhängig voneinander aus Val, Ala, Asp und Gly ausgewählt sind; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können.
Eine bevorzugte Rinder-Sequenz gemäß der Formel VII umfaßt R&sub3;&sub9; und R&sub4;&sub3;, die jeweils Ser sind, R&sub4;&sub2; und R&sub4;&sub6;, die jeweils unabhängig voneinander Val oder Ala sind und Res, das entweder Pro oder Leu ist, wobei die anderen R-Gruppen wie für Formel VII definiert sind.
Eine bevorzugte, bei Schafen vorkommende Sequenz gemäß Formel VII ist die gleiche wie sie in der allgemeinen Formel VII angegeben wird, ausgenommen, daß R&sub4;&sub2; und R&sub4;&sub6; jeweils unabhängig voneinander aus Val, Ala und Asp ausgewählt sind.
Bei einer bevorzugten Mensch-Sequenz gemäß Formel VII sind R&sub3;&sub9; und R&sub4;&sub3; Ser, R&sub4;&sub0; und R&sub4;&sub4; sind jeweils unabhängig voneinander Pro oder Leu, R&sub4;&sub1; und R&sub4;&sub5; sind Val, und R&sub4;&sub2; und R&sub4;&sub6; sind jeweils unabhängig voneinander entweder Asp oder Gly.
Unsere Erfindung stellt ebenfalls eine synthetische Peptidsequenz bereit, die den Bereich F betrifft und entweder die allgemeine Formel VIIIa oder VIIIb hat:
X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-R&sub4;&sub7;-Lys- R&sub4;&sub8;-His-Thr-Val-R&sub4;&sub9;-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-R&sub5;&sub0;-Lys)-Y (VIIIa),
X-(Met-Cys-R&sub5;&sub1;Thr)-Gln-Tyr-R&sub5;&sub2;-R&sub5;&sub3;-Glu-Ser-Gln-Ala- TYr-Tyr-R&sub5;&sub4;-R&sub5;&sub5;-Arg-(R&sub5;&sub6;-R&sub5;&sub7;-Ser-R&sub5;&sub8;-R&sub5;&sub9;)-Y (VIIIb),
wobei R&sub4;&sub7; entweder Ile oder Val ist;
R&sub4;&sub8; und R&sub5;&sub2; jeweils unabhängig voneinander entweder Gln oder Glu sind;
R&sub4;&sub9; entweder Val oder Thr ist;
R&sub5;&sub0; entweder Val oder Ile ist;
R&sub5;&sub1; ein aus Ile, Thr und Val ausgewählter Aminosäurerest ist;
R&sub5;&sub2; Gln oder Glu ist;
R&sub5;&sub3; entweder Arg oder Lys ist;
R&sub5;&sub4; entweder Asp oder Gln ist;
R&sub5;&sub5; Gly ist oder fehlt;
R&sub5;&sub6; entweder Gly oder Arg ist;
R&sub5;&sub7; entweder Ala oder Ser ist;
R&sub5;&sub8; Ser ist oder fehlt;
R&sub5;&sub9; ein aus Ala, Thr, Met und Val ausgewählter Aminosäurerest ist;
wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere, z. B. 3, zusätzliche Aminosäurereste sein können.
In der Formel VIIIa ist bevorzugt, daß R&sub4;&sub9; Thr ist, und daß in Formel VIIIb R&sub5;&sub1; Ile ist, R&sub5;&sub3; Arg ist, R&sub5;&sub4; Gln ist, R&sub5;&sub5; fehlt, R&sub5;&sub6; Gly ist, R&sub5;&sub7; Ala ist und R&sub5;&sub8; fehlt.
Die am stärksten bevorzugten Sequenzen aus Rind, Schaf und Mensch gemäß den Formeln VIIIa und VIIIb sind nacheinander nachstehend angegeben:

Seq.-ID.-Nr. 32

X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-Val-Lys- Glu-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-Ile-Lys)-Y Rind (VIIIa), und

Seq.-ID.-Nr. 33

X-(Met-Cys-Ile-Thr)-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala- Tyr-Tyr-Gln-Arg-(Gly-Ala-Ser-Val)-Y Rind (VIIIb);

Seq.-ID.-Nr. 34

X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-Val-Lys- Gln-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-Ile-Lys)-Y Schaf (VIIIa), und

Seq.-ID.-Nr. 35

X-(Met-Cys-Ile-Thr)-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala- Tyr-Tyr-Gln-Arg-(Gly-Ala-Ser-Val)-Y Schaf (VIIIb);

Seq.-ID.-Nr. 36

X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-Ile-Lys- Gln-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-Val-Lys)-Y; Mensch (VIIIa), und

Seq.-ID.-Nr. 37

X-(Met-Cys-Ile-Thr)-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala- Tyr-Tyr-Gln-Arg-(Gly-Ser-Ser-Met)-Y Mensch (VIIIb).
Besonders bevorzugte Sequenzen gemäß den Formeln VIIIa und VIIIb sind ausgewählt aus:

Seq.-ID.-Nr. 50

Val-Asn-Ile-Thr-Val-Lys-Gln-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr- Lys-Gly-Glu-Asn-Phe-Thr-Glu-Gly-Cys; und

Seq.-ID.-Nr. 48

Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu- Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg.
Synthetische Polypeptide gemäß einer der Formeln I bis VIIIb oben ohne vorhandenes X und Y eignen sich natürlich bspw. bei der Herstellung von Antikörpern. Sind jedoch X und Y zugegen, können sie beliebig lang sein, haben jedoch vorzugsweise weniger als 20, stärker bevorzugt weniger als 10, bspw. 3 bis 6 Aminosäuren. Man geht natürlich davon aus, daß eine Sequenz gemäß einer der Formeln I bis VIIIb ein Protein ausmachen kann, wobei X und Y Hauptanteile des Proteins ausmachen und wobei die antigene Sequenz bspw. Teil einer nach außen gerichteten Schleife auf einem kugelförmigen Protein ist.
Es ist bevorzugt, daß X und Y - wenn sie vorhanden sind - relativ kurze Sequenzen sind, üblicherweise 1 bis 3 Reste lang. In den meisten Fällen ist X vorzugsweise nicht vorhanden und Y ist 1 oder 2 Reste lang, z. B. -Cys oder -Gly-Cys.
Sämtliche Sequenzen sind hier mittels Standard-Dreibuchstaben-Abkürzungen der IUPAC für Aminosäurereste aufgeführt, und zwar wie folgt definiert: Gly-Glycin, Ala-Alanin, Val-Valin, Leu-Leucin, Ile-Isoleucin, Ser-Serin, Thr-Threonin, Asp-Asparaginsäure, Glu-Glutaminsäure, Asn- Asparagin, Gln-Glutamin, Lys-Lysin, His-Histidin, Arg-Arginin, Phe-Phenylalanin, Tyr-Tyrosin, Trp-Tryptophan, Cys-Cystein, Met-Methionin und Pro-Prolin.
Erfindungsgemäße Polypeptide können zum Züchten von Antikörpern verwendet werden, die mit Prionproteinen kreuzreagieren, die in einer Vielzahl von Organismen gebildet werden. Unsere Analysen haben gezeigt, daß - da die Konformations-, topographischen und elektrostatischen Eigenschaften von erfindungsgemäßen Polypeptiden derart sind, daß sie sehr wahrscheinlich die Produktion von Antikörpern, die mit Prionproteinen aus mehreren oder vielen Organismen kreuzreagieren, anregen - sich weitere Vorteile aus der Kombination mehrere Polypetidvarianten in einem größeren Polypeptid ergeben können. Ein solches Polypeptid kann die allgemeine Formel (IX) haben:
[La-F]m-[Lb-G]n-Lc (IX),
wobei F und G jeweils unabhängig voneinander ein Polypeptid oder ein Subfragment nach einer der Formeln I bis VIIIb sein können, L eine Verbindungssequenz ist, a, b und c jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, und m und n jeweils positive Zahlen, bspw. zwischen 1 und einschließlich 10, sind. L ist vorzugsweise ein kurzer Abschnitt der Polypeptidkette mit beweglicher Konformation, bspw. und ohne Einschränkung (SEQ.-ID.-Nr. 38) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, (SEQ.-ID.- Nr. 39) Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro oder (SEQ.-ID.-Nr. 40) Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala. Es sollte klar sein, daß jeder repetitive Bereich gegebenenfalls eine andere Variante eines erfindungsgemäßen Polypeptids besitzen kann.
Man beachte, daß bestimmte C-Termini mit den N-Termini übereinstimmen, insbesondere Formel Va mit Formel Vb, Formel Vc mit Formel I, Formel I mit Formel II, Formel II mit Formel III, Formel III mit Formel VIIIa und Formel VIIIb mit Formel IV. Aus dieser Übereinstimmung läßt sich bei der Herstellung großer Polypeptide gemäß Formel IX ein Vorteil ziehen.
Die Verbindungssequenzen zusammen mit den jeweiligen X- und Y-Einheiten können weggelassen werden, und die Reste in Klammern können so ausgewählt sein, daß entweder die übereinstimmenden Bereiche dupliziert sind, oder einige oder alle duplizierten Reste entfallen. Im letzteren Fall ist es ersichtlich, daß der C-Terminus eines Polypeptides mit dem N-Terminus des anderen Polypeptides fusioniert.
Analoga polyvalenter Determinanten können entweder wie durch Formel IX definiert sozusagen pseudohomopolyvalent sein, wobei Varianten eines im wesentlichen gleichen Determinanten- Analogons in einer einzigen Polypeptidkette wiederholt werden, und/oder heteropolyvalent, wobei bestimmte Deteminanten in einer einzigen Polypeptidkette enthalten sind. Man erwartet ferner, daß einfache homopolyvalente Polypeptid-Immunogene, die Mehrfachkopien der gleichen Variante eines Determinanten-Analogons gemäß einer der Formeln I bis VIIIb enthalten, ebenfalls wirksam sind, und sie sind daher ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthalten.
Selbstverständlich sind alle antigen signifikanten Subfragmente und/oder antigen signifikanten Varianten der vorstehend identifizierten Polypeptidsequenzen, die die allgemeine Form und Funktion des parentalen Polypetids beibehalten, im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen. Der Austausch eines spezifischen Restes durch Reste mit vergleichbaren Konformations- und/oder physikalischen Eigenschaften, einschließlich dem Austausch durch seltene (aber natürlich vorkommende, z. B. D-Stereoisomere) oder synthetische Aminosäure-Analoga, ist insbesondere mit erfaßt. Der Austausch eines Restes durch einen anderen im gleichen Satz, wie nachstehend definiert, ist zum Beispiel im Umfang der Erfindung enthalten; Satz 1 - Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp und Met; Satz 2 - Ser, Thr, Asn und Gln; Satz 3 - Asp und Glu; Satz 4 - Lys, His und Arg; Satz 5 - Asn und Asp; Satz 6 - Glu und Gln; Satz 7 - Gly, Ala, Pro, Ser und Thr. Die D-Stereoisomere sämtlicher Aminosäuretypen können ausgetauscht werden, bspw. D-Phe, D-Tyr und D-Trp.
Di Martino et al. (J. Molecular Recognition 4, 85-91 (1991)) beschreiben die Herstellung polyklonaler Antikörper von zwei synthetischen Polypeptiden von Maus-PrP. Bolton et al. (J. Virology 65. 3667-3675 (1991)) beschreiben die Epitopkartierung mit Hilfe synthetischer Polypeptide von monoklonalen Antikörpern, die gegen Hamster-Scrapie-Agens gezüchtet wurden.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können X und Y - wenn zugegen - unabhängig voneinander einen oder mehrere Segmente einer Proteinsequenz beinhalten, die als T- Zellepitop wirken können. Bspw. scheinen Segmente einer Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel 1-2-3-4, wobei 1 Gly oder eine geladene Aminosäure (z. B. Lys, His, Arg, Asp oder Glu) ist, 2 eine hydrophobe Aminosäure (z. B. Ile, Leu, Val, Met, Tyr, Phe, Trp, Ala) ist, 3 entweder eine hydrophobe Aminosäure (wie vorstehend definiert) oder eine ungeladene polare Aminosäure (z. B. Asn, Ser, Thr, Pro, Gln, Gly) ist, und 4 eine polare Aminosäure (z. B. Lys, Arg, His, Glu, Asp, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro) ist, in zumindest einigen Fällen als T-Zell-Epitope zu wirken (Rothbard, J. B. & Taylor, W. R. (1988). A sequence pattern in common to T-cell epitopes. The EMBO Journal 7(1): 93-100). Ähnliche Segmente können die Sequenz 1'-2'-3'-4'-5' haben, wobei 1' dem vorstehend definierten 1,2'2,3' und 4' 3 und 5' 4 entsprechen (ebenda). Beide Formen sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten und besitzen ein oder mehrere T-Zell-Epitope (vorzugsweise weniger als fünf), die vom vorstehend definierten Typ sind oder eine andere Struktur haben können und die durch Abstandssegmente beliebiger Länge oder Zusammensetzung voneinander getrennt sein können, die vorzugsweise weniger als fünf Aminosäurereste lang sind und bspw. aus Gly, Ala, Pro, Asn Thr, Ser oder polyfunktionalen Linkem, wie Nicht-α-Aminosäuren ausgewählte Reste umfassen. Ein C- oder N-terminaler Linker kann ein vollständiges Protein darstellen, so daß die Bindung an ein Trägerprotein nicht mehr nötig ist.
Ebenfalls im Umfang dieser Erfindung enthalten sind Derivate der Polypeptide gemäß einer der Formeln I bis VIIIb, bei denen X oder Y eine "retro-inverso"-Aminosäure sind oder enthalten, d. h. ein bifunktionales Amin mit einer funktionellen Gruppe, die einer Aminosäure entspricht. Ein erfindungsgemäßes Analogon, das eine retro-inverso-Aminosäure enthält, kann die Formel haben:
wobei R eine funktionelle Gruppe ist, z. B. eine Glycin-Seitenkette, und A1 und A2 vorzugsweise jeweils eine Kopie eines der hier definierten Analoga sind (jedoch nicht unbedingt die gleichen), die durch ihren N- oder C-Terminus gebunden sind. Gegebenenfalls können T-Zell- Epitope, wie vorher erörtert, enthalten sein.
Die retro-inverso-Modifikation von Peptiden beinhaltet die Umkehrung von einer oder mehreren Peptidbindungen, so daß Analoga erzeugt werden, die gegen enzymatischen Abbau resistenter als das ursprüngliche Molekül sind, und bietet einen geeigneten Weg, um verzweigte Immunogene zu erzeugen, die eine hohe Epitopkonzentration für ein mittleres bis großes Immunogen enthalten.
Die Verwendung dieser Verbindungen bei der Lösungssynthese im Großmaßstab von retro-inverso- Analoga kurzkettiger biologisch aktiver Peptide hat großes Potential.
Erfindungsgemäße Peptide können durch Standard-Peptidsynthesetechniken synthetisiert werden, bspw. indem entweder die Standard-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(F-Moc)-Chemie (s. bspw. Atherton, E. und Sheppard, R. C. (1985), J. Chem. Soc. Chem. Com. 165) oder die Standard- Butyloxycarbonat-(T-Boc)-Chemie eingesetzt wird, obwohl man vermerkt, daß das neuere, von Sheppard et al. entwickelte Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)/tert.-Butyl-System immer stärkere Anwendung findet (Sheppard, R. C. 1986, Science Tools, The LKB Journal 33,9). Die Richtigkeit der Struktur und das Ausmaß der Reinheit, die gewöhnlich über 85% liegt, sollten sorgfältig überprüft werden, und besondere Aufmerksamkeit sollte der Richtigkeit der Anordnung innerer Disulfidbrücken - wenn zugegen - gewidmet werden. Verschiedene Chromatographieanalysen, einschließlich Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, und spektrographische Analysen, einschließlich Raman-Spektroskopie, können bspw. zu diesem Zweck eingesetzt werden.
Es ist selbstverständlich, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide durch ein herkömmliches Verfahren, entweder direkt mittels manueller oder automatischer Peptidynthese-Techniken wie vorstehend erwähnt, oder indirekt durch RNA- oder DNA-Synthese und herkömmliche Techniken der Molekularbiologie und Gentechnik synthetisiert werden können. Diese Techniken können zur Herstellung von Hybridproteinen verwendet werden, die ein oder mehrere, in eine andere Polypetidsequenz inserierte Polypetide enthalten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt somit ein DNA-Molekül bereit, das mindestens ein erfindungsgemäßes synthetisches Polypeptid codiert, das vorzugsweise in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut ist, der in Mikroorganismen oder in Säugetierzellen replizierbar ist. Die DNA kann auch Teil der DNA-Sequenz für ein längeres Produkt sein, z. B. können die Polypeptide als Teile anderer Proteine exprimiert werden, in die sie durch Gentechnik eingebracht worden sind. Ein praktisches Handbuch für solche Techniken ist "Molecular cloning: a laboratory manual" von Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (2. Ausgabe 1989).
Man beachte, daß Analoga, die retro-inverso-Aminosäure-Derivate beinhalten, nicht direkt mit Hilfe eines rekombinanten DNA-Systems hergestellt werden können. Die grundlegenden Analoga können jedoch sehr wohl so hergestellt werden, und sie können dann mit Hilfe von Standard-Peptid-/organischer Chemie gereinigt und an die retro-inverso-Aminosäuren chemisch gebunden werden. Ein praktisches und leichtes neuartiges Verfahren für die Festphasen-Synthese von retro-inverso-Peptiden auf Harz vom Polyamid-Typ ist vor kurzem beschrieben worden. [Gazerro, H., Pinori, M. & Verdini, A. S. (1990). A new general procedure for the solid-phase synthesis of retro-inverso peptides. In "Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis" Hrsg. Roger Epton. SPCC (GB) Ltd., Birmingham, GB].
Die Polypetide werden gegebenenfalls entweder über chemische Gruppen in den Polypetiden selbst oder über zusätzliche Aminosäuren, die entweder an den C- oder N-Terminus gefügt werden und von den Polypeptiden selbst getrennt sein können oder von einer oder mehreren zusätzlichen Aminosäuren umgeben sind, an ein Trägermolekül gebunden, so daß sie für ihre immunologische Funktion optimiert werden. Viele Bindungen sind geeignet und beinhalten bspw. die Verwendung von Seitenketten von Tyr-, Cys- und Lys-Resten. Geeignete Träger beinhalten bspw. gereinigtes Proteinderivat von Tuberculin (PPD), Tetanus-Toxoid (TT), Cholera-Toxin und seine B- Untereinheiten, Ovalbumin, Rinderserumalbumin (BSA), Sojabohnen-Trypsininhibitor (STI), Muramyldipeptid (MDP) und Analoga davon, Diphterie-Toxoid (DPT), Schlüsselloch-Napfschnecken- Hämocyanin (KLH) und Brauns Lipoprotein, obwohl andere geeignete Träger dem Fachmann leicht zugänglich sind. Bspw. lassen sich Mehrfach-Antigen-Peptide verwenden, wie solche, die einen Polylysyl-Kern umfassen, z. B. Heptalysyl, und reaktive Amin-Termini tragen. Erfindungsgemäße Polypetid-Antigene können mit den Aminotermini umgesetzt werden oder daran synthetisiert werden, und verschiedene Polypetid-Antigene können mit dem gleichen Kern oder Träger umgesetzt werden. Bei der Verwendung von PPD als Träger für die erfindungsgemäßen Polypeptide, wird ein höherer Antikörpertiter erzielt, wenn der Empfänger des Polypetid-PPD-Konjugates bereits Tuberculin-sensitiv ist, z. B. aufgrund einer vorhergegangenen BCG-Impfung. Im Fall eines menschlichen Impfstoffes ist es bemerkenswert, daß die Bevölkerung in Großbritannien und in vielen anderen Ländern routinemäßig mit BCG geimpft wird und daher überwiegend PPD-sensitiv ist. Es wird daher erwartet, daß PPD ein bevorzugter Träger für die Verwendung in solchen Ländern ist.
Die Art, mit der das Polypeptid an den Träger gekuppelt wird, hängt von der Art der zu kuppelnden Materialien ab. Bspw. kann ein Lysinrest im Träger an einen C-Terminus oder anderen Cysteinrest in einem Polypeptid durch Behandlung mit N-γ-Maleimidobutyryloxysuccinimid (Kitagawa, T. & Ackawa, T. (1976) J. Biochem. 79, 233) gekuppelt werden. Alternativ kann ein Lysinrest im Träger an einen Glutaminsäure- oder einen Asparaginsäurerest im Peptid mittels Isobutylchlorformiat (Thorell, J. I. De Larson, S. M. (1978) Radioimmunoassay and related techniques: Methodology and clinical applications, S. 288) konjugiert werden. Andere Kupplungsreaktionen und Reagenzien sind in der Literatur beschrieben.
Die Polypeptide können, entweder allein oder gebunden an ein Trägermolekül, auf jedem Weg (z. B. parenteral, nasal, oral, rektal, intravaginal) mit oder ohne Verwendung herkömmlicher Hilfsstoffe (wie Aluminiumhydroxid oder komplettes oder inkomplettes Freund'sches Adjuvans) und/oder anderen Immunpotenzierungsmitteln verabreicht werden. Die Erfindung beinhaltet auch die Formulierung von erfindungsgemäßen Polypeptiden in Formen für die verzögerte Freisetzung, wie ein Subdermal-Implantat oder Depot, umfassend bspw. Liposomen (Allison, A. C. & Gregoriadis, G. (1974) Nature (London) 252, 252), oder biologisch abbaubare Mikrokapseln, die aus Copo lymeren der Milchsäure und Glykolsäuren hergestellt werden (Gresser, J. D. und Sanderson, J. E. (1984) in "Biopolymer Controlled Release Systems", S. 127-138, Hrsg. D. L. Wise).
Erfindungsgemäße Polypeptide können entweder allein oder an einen geeigneten Träger gebunden verwendet werden:
(a) als Liganden in Tests für z. B. Serum aus Patienten oder Tieren;
(b) als Peptid-Impfstoffe zur Verwendung bei der Prophylaxe;
(c) als Qualitätskontrollmittel zur Untersuchung von bspw. Bindungsmengen von Antikörpern, die gegen die Polypeptide gezüchtet sind;
(d) als antigene Mittel zur Erzeugung von monoklonalen oder poylklonalen Antikörpern durch Immunisierung eines geeigneten Tiers, wie Antikörper, die geeignet sind:
(i) für wissenschaftliche Untersuchung an Prionproteinen, (ii) als Diagnostika, z. B. als Teil von immunhistochemischen Reagenzien, (üi) für die passive Immunisierung von Tieren oder Patienten, entweder als Behandlung für Enzephalopathien oder in Kombination mit anderen Mitteln, (iv) als Maßnahme zum gezielten Hinführen anderer Mittel in Bereiche, die Prionproteine umfassen, wie Mittel, die entweder kovalent gebunden oder andersartig verknüpft sind, z. B. wie in Liposomen, die solche Mittel und Antikörper enthalten, die gegen eines der antigenen Polypeptide gezüchtet sind, und (v) für die Verwendung als Immunogene zur Züchtung von Anti-Idiotyp-Antikörpern; diese Anti-Idiotyp- Antikörper bilden ebenfalls einen Teil dieser Erfindung. Die Erfindung stellt zudem gentechnisch veränderte Formen oder Sub-Komponenten, insbesondere VH-Bereiche, von Antikörpern bereit, die gegen die Polypeptide gezüchtet sind, sowie von schafsähnlich, rindsähnlich und menschenähnlich gemachten Formen von Antikörpern, die anfänglich gegen die Polypeptide in anderen Tieren gezüchtet wurden, wobei die in der Literatur beschriebenen Techniken verwendet wurden; und
(e) für die Behandlung von Enzephalopathien, entweder durch Verdrängung der Bindung von Prionproteinen an Mensch- oder Tierzellen oder durch Stören der dreidimensionalen Organisation des Proteins in vivo; sowie für die Durchführung wissenschaftlicher Untersuchung von Prionproteinen in vitro.
Für den Nachweis und die Diagnose von Prionproteinen oder Antikörpern gegen Prionproteine, kennt der Fachmann eine Reihe von im Fachgebiet bekannten Immuntest-Techniken, wie u. a. den Sandwich-Test, den kompetitiven und nicht-kompetitiven Test und die Verwendung von direkter und indirekter Markierung.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung stellt ein Kit zum Nachweisen von Prionproteinen oder Antikörpern gegen Prionproteine bereit, umfassend mindestens ein erfindungsgemäßes synthetisches Polypeptid.
Die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, menschenähnlich gemachten Formen dieser Antikörper (s. bspw. Thompson, K. M. et al., (1986) Immunology 58,157-160), Antikörpern mit einer Domäne (s. bspw. Ward, E. S., Gussow, D., Griffiths, A. D., Jones, P. und Winter, G. (1989) Nature 341, 544-54~ und Antikörpern, die die Blut-Hirnschranke passieren können und spezifisch an ein erfindungsgemäßes synthetisches Polypeptid binden, kann mit herkömmlichen Maßnahmen erfolgen, und diese Antikörper werden als Teil dieser Erfindung aufgefaßt. Erfindungsgemäße Antikörper sind u. a. bei einem Verfahren zur Diagnose von Säuger-Enzephalopathien nutzbringend, umfassend das Inkubieren einer Gewebeprobe oder einer Körperflüssigkeit eines Säugetiers mit einer Menge an Antiköper, wie hier beschrieben, und die Bestimmung, ob - und wenn gewünscht - in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Rate die Kreuzreaktion zwischen Probe und Antikörper erfolgt. Diagnose-Kits, die mindestens einen der Antikörper enthalten, bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt synthetische Polypeptide für die Verwendung bei der Therapie oder der Prophylaxe von Säuger-Enzephalopathien und/oder Stimulation des Säuger- Immunsystems und/oder Blockierung der zellulären Bindung oder Aggregation der Prionproteine und für die Herstellung von Medikamenten, die für diese Verwendungen geeignet sind, bereit. Ebenfalls enthalten sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff mindestens ein Polypeptid oder Polypetid-Träger-Konjugat, wie hier beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Trägern und/oder Exzipienten enthalten. Die Zusammensetzungen können für die orale, rektale, nasale oder insbesondere parenterale Verabreichung (einschließlich Intra-ZNS-Verabreichung) formuliert werden.
Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren für die Therapie oder Prophylaxe von Säuger- Enzephalopathien und/oder zur Stimulation des Säuger-Immunsystems und/oder zur Blockierung der zellulären Bindung oder Aggregation der Prionproteine bereit, umfassend das Verabreichen einer Menge eines Polypeptides wie zuvor definiert, entweder allein oder in Kombination mit anderen Mitteln zur Behandlung von Enzephalopathien.
Die Unterscheidung zwischen natürlichem PrPC und PrPSC ist stark gewünscht, da PrPC in normalen Individuen gefunden wird und PrPC als auch PrPSC in erkrankten Individuen vorkommt. Wir haben entdeckt, daß erfindungsgemäße Peptidsequenzen, vorzugsweise solche, die die Bereiche A, B und C betreffen, und signifikante Subfragmente davon zur Unterscheidung zwischen natürlichem PrPC und infektiösem PrPSC verwendet werden können. Zur Unterscheidung zwischen PrPC und PrPSC können ebenfalls Antikörper, die gegen diese Peptidsequenzen und Subfragmente gezüchtet wurden, und die Nukleotid-Sequenzen, die diese Peptidsequenzen und Subfragmente codieren, verwendet werden. Die Erfindung stellt folglich ein Verfahren bereit zur Unterscheidung zwischen PrPC und PrPSC, bei dem eine Probe mit einer Substanz in Kontakt gebracht wird, ausgewählt aus erfindungsgemäßen Peptidsequenzen, vorzugsweise solchen, die die Bereiche A, B und C betreffen, und signifikanten Subfragmenten davon, Antikörpern, die gegen die Sequenzen und Subfragmente gezüchtet worden sind, und die Gegenwart oder das Fehlen von PrPSC bestimmt wird.
In einigen Fällen kann die Unterscheidung durch Vorbehandlung der Probe, bspw. durch Vorspaltung mit Enzymen, z. B. Proteinase K, oder Denaturierung durch eine starke Base, z. B. 6 M Guanidinhydrochlorid oder durch eine Kombination dieser Behandlungen verstärkt werden.
Man verwendet bevorzugt die Peptidsequenzen, Antikörper und Nukleotidsequenzen, die dem jeweils untersuchten Individuum zugehören, z. B. Rindersequenzen und Antikörper für Rind, Schafs- Sequenzen und Antikörper für Schaf.
Es kann vorteilhaft sein, mit einem Cocktail zu immunisieren, der (i) ein vorgegebenes Analogon enthält, das mit mehr als einen Trägermolekültyp konjugiert ist, und/oder (ii) mehr als eine Art von Analoga, die mit dem gleichen Trägermolekül konjugiert ist. Sämtliche Peptidanaloga, ihre Konjugate und Cocktails davon können darüber hinaus in einem geeigneten Hilfsmittel- oder Abgabesystem verabreicht werden, und es können mehr als ein Hilfsstoff oder Abgabesystem zur Bildung eines sogenannten "Super-Cocktails" miteinander kombiniert werden. Bevorzugte Hilfsstoffe und Abgabesysteme sind u. a. Aluminiumhydroxid (Alum), Liposomen, Mizellen, Niosomen, ISCOMS, Brauns Lipoprotein und Gesamtzellen oder Komponenten mikrobieller Tier-Impfstoffe.

Beispiel 1

Eine bevorzugte Rinderform der Formel II (SEQ.-ID.-Nr. 41) Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile- His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-His-Arg-Gly-Cys (verwandt mit SEQ.-ID.-Nr. 7), bei der die erfindungsgemäße C-terminale Y-Verlängerung Gly-Cys ist, wird mittels Standard-Festphasen-Fmoc-Methodologien synthetisiert. Das Peptid wird in Gegenwart von Trifluoressigsäure vom Harz gespalten, und die anschließende Reinigung erfolgt durch Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, und Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Das Peptid wird durch MBS (m-Maleimido-benzoyl-N-hydroxy-succinimidester), einem bekannten hetero-bifunktionalen Reagenz, an eine Vielzahl von Trägern konjugiert.
Beispiele für Träger sind u. a. KLH, BSA und TT, von denen gezeigt wurde, daß sie B-Zell- Epitopen notwendige Immunpotenzierungseigenschaften verleihen.
Die Peptid-Träger-Konjugate werden in komplettem Freund'schen Adjuvans emulgiert und werden intramuskulär an Mäuse verabreicht. Anschließende Booster-Injektionen werden in inkomplettem Freund'schen Adjuvans gegeben.
Die darauffolgende Serumantikörperreaktion wird während des Immunisierungsplans durch Enzym-Immuntest (ELISA) mit immobilisiertem Antigen (Formel II), das an BSA gekuppelt ist, der zu testenden Serumprobe und einem enzymmarkierten Antimausantikörper überwacht.
Bei diesem Beispiel erfolgt die Verwendung der Träger, Hilfsstoffe und Abgabesysteme sowie die Booster-Injektionen, um ein optimales Protokoll für die Produktion von Anti-Formel-II-Antikörpern zu bestimmen.

Beispiel 2

Die Antikörper gegen Formel II werden als diagnostische Reagenzien zur Untersuchung der Gegenwart von Prionprotein in Serum, in "Zellträgern", in Serum und in Gewebebiopsien geimpfter Tierarten verwendet.
Ein direkter Enzym-Immuntest (ELISA) kann die Gegenwart von isoliertem Prionprotein durch seine Immobilisierung auf ein festes Substrat nachweisen. Die Reaktion von Maus-Antiseren, gezüchtet gegen Formel II, mit nativem Prionprotein wird mit einem enzymmarkierten Anti-Maus- Antiserum nachgewiesen. Die Reaktion wird durch Zugabe eines geeigneten Substrates und Ablesen der optischen Dichte der entstandenen Färbung quantifiziert.
Überdies kann die Immunhistochemische Diagnose von Prionproteinen in Gewebebiopsien durch Umsetzen von Anti-Formel-II-Antikörpern mit Gewebe erfolgen, das in Paraffinwachs eingebettet ist oder eingefroren ist. Die Reaktionen können mittels indirekter Standard-Immunperoxidasetechnik nachgewiesen werden.

Beispiel 3

Materialien und Methoden

Peptidsynthese

Die nachstehenden Peptide wurden mit Standard-Festphasen-Fmoc-Methodologien synthetisiert.

Peptid II: (Seq.-ID.-Nr. 42)

Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly- Asn-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Cys (Ein bevorzugtes Schafs-Subfragment der Formel II).

Peptid BII: (Seq.-ID.-Nr. 43)

Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly- Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Cys (Ein bevorzugtes Rinder-Subfragment der Formel II).

Peptid III: (Seq.-ID.-Nr. 44)

Asn-Met-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Val- Asp-Arg-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-Gly-Cys (Eine bevorzugte Schafs-Sequenz der Formel III (S. 8, Z. 30-32).

Peptid BIII: (Seq.-ID.-Nr. 45)

Asn-Met-His-Arg-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Val- Asp-Gln-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-Gly-Cys (Eine bevorzugte Rinder-Sequenz der Formel III (S. 8, Z. 26-28).

Peptid Vb: (Seq.-ID.-Nr. 46)

Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly- Gly-Trp-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Cys (Eine bevorzugte Schafs-/Rinder-Sequenz der Formel Vb).

Peptid Vc: (Seq.-ID.-Nr. 47)

Gly-Gln-Gly-Gly-Ser-His-Ser-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro- Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Val-Gly-Cys (Eine bevorzugte Schafs-Sequenz der Formel Vc).

Peptid VIIIb: (Seq.-ID.-Nr. 48)

Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu- Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg (Eine bevorzugte Schafs-/Rinder-Sequenz der Formel VIIIb).

Peptid Va: (Seq.-ID.-Nr. 49)

Gly-Gly-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr- Pro-Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro- Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Cys

Peptid VIIIa: (Seq.-ID.-Nr. 50)

Val-Asn-Ile-Thr-Val-Lys-Gln-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr- Lys-Gly-Glu-Asn-Phe-Thr-Glu-Gly-Cys (Eine bevorzugte Schafs-Sequenz der Formel VIIIa).

Peptid I: (Seq.-ID.-Nr. 51)

Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala- Met-Ser-Arg-Gly-Cys.
Die Peptide I, II, BII, III, BIII, Va, Vb, Vc und VIIIa wurden mit der erfindungsgemäßen C- terminalen Verlängerung synthetisiert. Die Peptide wurden in Gegenwart von Trifluoressigsäure aus dem Harz gespalten, und die anschließende Reinigung erfolgte über Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie. Sämtliche Peptide hatten eine Reinheit von 85% oder mehr.

Konjugation von Peptiden an Ovalbumin

Die Peptide wurden über ihre Cterminalen (Peptide II, BII, III, BIII, Vb und Vc) oder N- terminalen (Peptid VIIIb) Cys-Reste konjugiert. Die Peptide wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Das voraktivierte Ovalbumin (Pierce, Imject Kit) wurde in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert, und gleiche Volumina voraktiviertes Ovalbumin und Peptid wurden gemischt, und die Lösung wurde 3 Std. bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Konjugat wurde über Nacht zur Entfernung von DMSO und nicht-konjugiertem Peptid gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert.
Das Ausmaß der Konjugation wurde durch Messen des Gehaltes an freiem Thiol mit dem Ellman's Test und durch Überwachen des Anstiegs der Molekülmasse des Konjugates durch SDS- PAGE (Natriumdodecylsulphat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) bestimmt.

Herstellung der Kaninchen-Antiseren.

Antiserum wurde gegen jedes der Peptid-Konjugate in zwei weiblichen weißen Neuseeland- Kaninchen gezüchtet. Jedes Kaninchen erhielt eine Konjugatmenge, die sowohl für die primäre Impfung als auch für die Booster 40 ug Peptid entsprach. Die Kaninchen wurden folgendermaßen geimpft:
Tag 0: Konjugat in komplettem Freund'schen Adjuvans (1 : 1 Vol./Vol.) intramuskulär.
Tag 21: Konjugat in inkomplettem Freund'schen Adjuvans (1 : 1 Vol.Vol.) intramuskulär.
Tag 31: Nur Konjugat intraperitoneal.
Die Tiere wurden am Tag 41 geblutet, und die Seren wurden über ELISA auf Anti-Peptid- Antikörper untersucht (wobei freies Peptid als Beschichtungs-Antigen verwendet wurde). Die Seren wurden ebenfalls bei Immunoblot- und Dot-Blot-Untersuchungen verwendet, um herauszufinden, ob sie die Proteine aus Gehirn-Homogenaten erkennen können.

Herstellung von Gehirn-Homogenaten

Scrapie-freies Gehirn-Material wurde aus einer Neuseeland-Schafherde in Quarantäne erhalten.
Scrapie-infiziertes Gehirn-Material, das histopathologisch als Scrapie-infiziert diagnostiziert worden war, wurde von einer Landwirtschaftsbehörde erhalten.
BSE-infiziertes Gehirn-Material, das histopathologisch als BSE-infiziert eingestuft worden war, wurde über eine staatliche Landwirtschaftsbehörde erhalten.
BSE-freies Material wurde von einer privaten Quelle erhalten.
Ha 27-30 ist ein von einem Inzucht-Hamster-Scrapie-Modell erhaltenes Gehirn-Material, von dem gezeigt worden war, daß es eine hohe Menge an infektiösem Scrapie-Agens enthielt. Es wurde als positive Kontrolle verwendet.
Es wurden kleine Proben von infiziertem und nicht-infiziertem Gehirn gewogen, und 10%ige (Gew./Vol.) Homogenate in einer 10%igen (Vol./Vol.) Lösung von Sarkosyl in 25 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,4 (Homogenisationspuffer) erzeugt. Das Homogenat wurde 30 min bei 4ºC inkubiert und dann 30 min bei 6000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, und der Proteingehalt wurde mit dem BCA-Protein-Test-Kit (Pierce) bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde mit Homogenisationspuffer auf 3 mg/ml eingestellt.

ELISA (Enzymverknüpfter Immunosorbent-Test)

Eine 8 um Lösung des freien Peptids in PBS wurde als Beschichtungsantigen verwendet. Die Mikrotiterplatten wurden beschichtet, indem 50 ul der Antigenkonzentration zu jedem Loch zugegeben wurden und 1 Std. bei 37ºC inkubiert wurden, so daß die Bindung erfolgte. Jedes Loch wurde 5mal je 2 Minuten mit 300 ul PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Platten durch 1stündige Inkubation bei 37ºC mit PBS, das 0,3% Tween 20 und 3% fettarme Milch enthielt, blockiert. Ein Aliquot von 50 ul in PBS verdünntem primärem Antikörper (d. h. Antiseren), wurden zu den entsprechenden Löchern gegeben und die Platten 1 Std. bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen, und anschließend mit Meerrettich-Peroxidasekonjugiertem Schwein-Anti-Kaninchen-Immunglobulin (anti-Ig/HRP) bei einer Verdünnung von 1 : 1000 in PBS 1 Std. bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 50 ul OPD (O- Phenylendiamin-dihydrochlorid-Substrat (10 mg/ml) in Citratpuffer) wurde zu jedem Loch gegeben, und die Umsetzung wurde 10 min bei Raumtemperatur fortgesetzt, bevor sie durch Zugabe von Schwefelsäure beendet wurde. Die Extinktion jedes Loches wurde mit einem ELISA- Plattenlesegerät bei 492 nm gemessen. Die Titer wurden als diejenigen Verdünnungen notiert, die eine positive optische Dichte (OD) ergaben, die mindestens dreimal höher als der Hintergrund war. Der Hintergrund wurde von OD-Messungen aus nicht mit Antigen beschichteten Löchern abgelesen.

Dot-Blot-Nachweis von PrP in Gehirn-Homogenaten

Die wie vorher beschrieben hergestellten Gehirn-Homogenate wurden 10fach in PBS verdünnt, und 100 ul der Homogenate (mit 30 ug Gesamt-Protein) wurden mit einem BRL-96-Loch-Vakuum- Verteiler auf Nitrocellulose-Filter aufgetragen. Die Filter wurden 1 Std. bei Raumtemperatur getrocknet. Die Filter wurden dann entweder mit IBST (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) befeuchtet, und PrP wie bei den Immunoblots beschrieben nachgewiesen, oder die Proteinprobe wurde weiter behandelt. Diese weitere Behandlung der Probe umfaßte die Spaltung des Proteins auf dem Filter mit 100 ug/ml Proteinase K in IBST für 90 min bei Raumtemperatur.
Die Proteinase K wurde durch Zugabe von PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) auf eine Konzentration von 5 mM in IBST inaktiviert. Nach der Proteinspaltung wurden einige Proben ebenfalls durch Inkubation der Filter in 6 M Guanidin-HCl, das 5 mM PMSF enthielt, 10 min denaturiert. Das Guanidin wurde durch 3 Waschschritte mit TBST vor der Inkubation mit dem primären Antikörper entfernt.

Immunoblots. (Western-Blots)

SDS-PAGE wurde mittels Standard-Techniken an Gehirn-Homogenaten durchgeführt, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden waren. Die Proben im Gel wurden in einer Biorad- Transblot-Vorrichtung unter Verwendung von Towbin-Puffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin und 0,1% SDS) bei 70 mA über Nacht auf Nitrocellulose überführt. Die Nitrocellulosefilter wurden mit 5% fettarmer Milch 30 min bei Raumtemperatur blockiert. Der primäre Antikörper (d. h. die Antiseren), der in IBST verdünnt worden war, wurde 3 Std. bei Raumtemperatur angewendet, die Filter wurden 3 Mal für 10 min in IBST gewaschen, und die Filter wurden 2 Std. bei Raumtemperatur mit alkalische- Phosphatase-konjugiertem Schwein-Anti-Kaninchen-Immunglobulin, das 1 : 2000 verdünnt worden var, inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Proteinbanden mit dem NBT/BCIP (Nitro-Blau- Tetrazolium; 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat)-Substrat (Boehringer Mannheim) nachgewiesen.

Ergebnisse

1) Antikörper-Titer: Gute Antikörper-Titer gegen die Peptide wurden in allen Fällen erhalten, obwohl die Mengen erheblich variierten. Das Peptid, das den höchsten Titer ergab, ergab auch die besten Ergebnisse bei den Dot-Blots.
2) Dot-Blot-Daten: Man erwartet, daß nicht-infiziertes Gewebe nur normales Prion-Protein (PrPC) enthält. Man erwartet, daß infiziertes Gewebe sowohl die normale als auch die erkrankte Form (PrPSC) von PrP enthält.
Das Molekulargewicht von PrPC beträgt etwa 33-35 kD.
PrPSC hat ein Molekulargewicht von etwa 27-30 kD und hat kein N-terminales Segment, das in der PrPC-Form vorhanden ist. Die Aminosäuresequenz von PrpSC ist anonsten genau die gleiche wie bei PrPC. Die wahrscheinlich bedeutendste Eigenschaft von PrPSC ist die Beständigkeit gegenüber enzymatischem Abbau mit Proteinase K, einem nicht-spezifischen proteinspaltenden Enzym.
Wenn eine Proteinprobe mit Proteinase K behandelt wird, sollte jegliches PrPC vollständig gespalten werden. Bei einer Probe, die nur PrPC enthält, verbleibt daher kein PrP in irgendeiner Form nach der Proteinase-K-Behandlung. Bei einer Probe, die PrPC und PrPSC enthält (d. h. bei einer erkrankten Probe), verbleibt PrPSC nach der Behandlung.
Z. Zt. sind Antikörper verfügbar, die PrPSC erkennen, jedoch erkennen sie nur das denaturierte Protein. Nach der Proteinase-K-Behändlung werden daher die Proben im Dot-Blot-Test mit Guanidin-HCl, einem Denaturierungsmittel behandelt, so daß diese Antikörper zum Nachweisen von PrPSC verwendet werden können.
Die Daten sind in den Tabellen I-V angegeben.

Peptid II:

Gute Titer. Dot-Blots scheinen anzuzeigen, daß eine gewisse Unterscheidung erfolgt. Negative Ergebnisse wurden aus den Western-Blots erhalten.

Peptid III:

Befriedigende Titer. Es besteht möglicherweise eine Erkennung einer unspezifischen (möglicherweise Nicht-Protein-) Komponente in den mit Proteinase K und Guanidin behandelten Proben. Negative Ergebnisse wurden aus den Western-Blots erhalten.

Peptid Vb:

Gute Titer. Obwohl scheinbar eine gewisse Unterscheidung erfolgt, tritt das Vb-Peptid tatsächlich im Nterminalen Bereich auf, der bei PrPSC fehlt. Man erwartet daher nicht, daß irgendeine Erkennung im infizierten Material auftritt, das mit Proteinase K und Guanidin behandelt worden ist. Eine mögliche Erklärung ist aber, daß das im infizierten Material vorhandene PrPC durch die Proteinase K nicht vollständig gespalten worden ist. Negative Ergebnisse wurden aus den Western-Blots erhalten.

Peptid Vc:

Ausgezeichnete Titer. Diese Ergebnisse sind genau wie erwartet. Wie vorher erwähnt, erkennen Antikörper, die PrPSC erkennen, gewöhnlich nur das Protein in seinem denaturierten Zustand. Infizierte und nicht-infizierte Proben, sowie solche, die PrPSC und/oder PrPC im "nativen" Zustand enthalten, enthalten auch beide PrP-Formen in verschiedenen Stadien der Denaturierung aufgrund des natürlichen Proteinumsatzes in den Zellen. Man erwartet aus diesem Grund, daß die Antikörper alle drei unbehandelten Proben erkennen. Die Proteinase-K-Behandlung spaltet jedoch PrPC und jegliches partiell denaturierte PrPSC, was einen Verlust der Antikörpererkennung in allen Proben bewirkt (unter der Annahme, daß der Antikörper nur denaturiertes PrP erkennt). Die Zugabe von Guanidin sollte die Antikörpererkennung in Material, das ursprünglich PrPSC enthielt, wiederherstellen. Western-Blots zeigten die erwarteten Proteinbanden bei den richtigen Molekulargewichten.

Peptid VIIIb:

Befriedigender Titer. Es kann eine unspezifische Komponente erkannt werden. Negative Ergebnisse wurden aus den Western-Blots erhalten.

Peptide BII & BIII:

Die Titer sind befriedigend, und es gibt zwingende positive Ergebnisse aus unbehandeltem, normalem und infiziertem Rinder-Gehirnmaterial.
In allen Fällen werden zusammegefaßt gute Antipeptidtiter erhalten, die Western-Blots funktionierten nur im Falle des Proteins Vc gut, das auch de höchsten Titer hatte, und die Dot-Blots zeigen, daß mit dem Peptid Vc eine gewisse Unterscheidung zwischen PrPC und PrpSC erfolgt. Die Daten von Peptid II legen ebenfalls nahe, daß eine Unterscheidung erfolgt. Tabelle I: Ergebnisse von Schafs-Peptid-Sequenzen. Tabelle II: Ergebnisse von Schafs-Peptid-Sequenzen. Tabelle III: Ergebnisse von Schafs-/Rinder-Peptid-Sequenzen Tabelle IV: Ergebnisse von Schafs-/Rinder-Peptid-Sequenzen. Tabelle V: Ergebnisse von Rinder-Peptid-Sequenzen.

SEQUENZPROTOKOLL

Anzahl der Sequenzen: 51

(1) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 1

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 1

(2) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 2

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 2

(3) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 3

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 3

(4) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 4

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 4

(5) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 5

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 5

(6) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 6

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 6

(7) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 7

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 7

(8) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 8

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 8

(9) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 9

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 9

(10) Angaben zu Seq.-SD.-Nr. 10

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 23 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 10

(11) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 11

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 23 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 11

(12) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 12

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 23 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 12

(13) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 13

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 13

(14) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 14

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 14

(15) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 15

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 15

(16) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 16

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 26 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 16

(17) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 17

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 26 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 17

(18) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 18

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 26 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 18

(19) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 19

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 19

(20) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 20

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 20

(21) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 21

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 21

(22) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 22

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 22

(23) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 23

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 23

(24) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 24

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 24

(25) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 25

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 28 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 25

(26) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 26

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 26

(27) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 27

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(H) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq·.-ID.-Nr. 27

(28) Angaben zu.Seq.-ID.-Nr. 28

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 28 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 28

(29) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 29

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 29

(30) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 30

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 30

(31) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 31

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 31

(32) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 32

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 32

(33) Anqaben zu Seq.-ID.-Nr. 33

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 33

(34) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 34

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(H) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 34

(35) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 35

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 35

(36) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 36

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 36

(37) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 37

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 37

(38) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 38

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 5 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 38

(39) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 39

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 39

(40) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 40

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 40

(41) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 41

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 26 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 41

(42) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 42

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 21 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 42

(43) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 43

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 21 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 43

(44) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 44

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 27 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 44

(45) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 45

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 27 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 45

(46) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 46

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 26 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 46

(47) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 47

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 24 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Molekizls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 47

(48) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 48

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 15 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 48

(49) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 49

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 28 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 49

(50) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 50

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 23 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 50

(51) Angaben zu Seq.-ID.-Nr. 51

(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 29 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid.
(xi) Sequenzbeschreibung: Seq.-ID.-Nr. 51

Claims

1. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß den allgemeinen Formeln Va, Vb und Vc:

X-(Pro-Gly-Gly-R&sub2;&sub0;)-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr- Pro-Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro-Pro- Gln-Gly-(Gly-R&sub2;&sub1;-R&sub2;&sub2;-Trp)-Y (Va);

X-(Gly-Gly-R&sub2;&sub1;- R&sub2;&sub2;-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly- R&sub2;&sub3;-Trp-(Gly-Gln-Pro-His)-Y (Vb); und

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-R&sub2;&sub4;-Rzs-His-R&sub2;&sub6;- Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-R&sub2;&sub7;-Lys-Pro-Lys-Thr-R&sub2;&sub8;-R&sub2;&sub9;-Lys (-His-R&sub3;&sub0;-Ala-Gly)-Y (Vc),

wobei R&sub2;&sub0;, R&sub2;&sub1;, R&sub2;&sub3; und R&sub2;&sub4; jeweils unabhängig voneinander entweder Gly sind oder fehlen;

R&sub2;&sub2; entweder Gly oder Thr ist;

R&sub2;&sub5; entweder Thr oder Ser ist;

R&sub2;&sub6; ein aus Gly, Ser und Asn ausgewählter Aminosäurerest ist;

R&sub2;&sub7; und R&sub2;&sub8; jeweils unabhängig voneinander entweder Asn oder Ser sind;

R&sub2;&sub9; ein aus Met, Leu und Phe ausgewählter Aminosäurerest ist;

R&sub3;&sub0; entweder Val oder Met ist; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Pepid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere weitere Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe, daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der in dem entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

2. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus:

Seq.-ID.-Nr. 23

Seq.-ID.-Nr. 24

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp- (Gly-Gln-Pro-His)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 25

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-Thr-His-Gly-Gln- Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys (-His-Val-Ala-Gly)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 26

Seq.-ID.-Nr. 27

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly- Gly-Trp-(Gly-Gln-Pro-His)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 28

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-Ser-His- Ser-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr- Asn-Met-Lys-(His-Val-Ala-Gly)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 29

X-(Pro-Gly-Gly-Gly)-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr-Pro- Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro-Fro- Gln-Gly-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 30

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Pro-His-Gly-Gly-Gly- Trp-(Gly-Gln-Pro-His)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 31

X-(Gly-Gly-Gly-Trp)-Gly-Gln-Gly-Gly-Gly-Thr-His-Ser- Gln-Trp-Asn-Lys-Fro-Ser-Lys-Pro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys- (His-Met-Ala-Gly)-Y.

3. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 49

Gly-Gly-Trp-Asn-Thr-Gly-Gly-Ser-Arg-Tyr- Pro-Gly-Gln-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Asn-Arg-Tyr-Pro- Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Cys;

Seq.-ID.-Nr. 46

Seq.-ID.-Nr. 47

Gly-Gln-Gly-Gly-Ser-His-Ser-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro- Ser-Lys-Fro-Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Val-Gly-Cys.

4. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß der allgemeinen Formel (I):

X-(R&sub1;-Lys-His-R&sub2;)-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-R&sub3;-Gly-Ala-Val- Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala-Met- Ser-(Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;)-Y (I),

wobei R&sub1; ein aus Met, Leu und Phe ausgewählter Aminosäurerest ist;

R&sub2; entweder Met oder Val ist;

R&sub3; Ala ist oder fehlt;

R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander ein aus Leu, Ile und Met ausgewählter Aminosäurerest sind; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Pepid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere weitere Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe, daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der in dem entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

5. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 4, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 1

Seq.-ID.-Nr. 2

X-(Met-Lys-His-Met)-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala- Met-Ser-(Arg-Pro-Ile-Ile)-Y.

6. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 4, bestehend aus der Sequenz

Seq.-ID.-Nr. 51

Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser-Ala- Met-Ser-Arg-Gly-Cys.

7. Signifikantes Subfragment einer Sequenz nach Anspruch 4, das vorzugsweise ausgewählt ist aus:

i) X-(His-R&sub2;-Ala-Gly)-Ala-Ala-Ala-R&sub3;-Gly-Ala-Val- Val-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Y; und

ii) X-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser- Ala-Met-Ser-(Arg-Fro-R&sub4;-R&sub5;)-Y,

wobei R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, X und Y wie für Formel I definiert sind, und ein oder mehrere Reste in Klammern wie in Formel I fehlen oder vorhanden sein können.

8. Subfragment nach Anspruch 7, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 3

i) X-(His-Val-A1a-Gly)-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-(Gly-Leu-Gly-Gly)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 4

ii) X-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser- Ala-Met-Ser-(Arg-Pro-Leu-Ile)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 5

Seq.-ID.-Nr. 6

ii) X-(Gly-Gly-Leu-Gly)-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser- Ala-Met-Ser-(Arg-Pro-Ile-Ile)-Y.

9. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß der allgemeinen Formel II:

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;-His-Phe-Gly-R&sub6;- Asp-R&sub7;-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-R&sub8;-Arg- (Tyr-Pro-Asn-Gln)-Y (II),

wobei R&sub4; und R&sub5; die gleiche Bedeutung haben wie in Formel I;

R&sub6; entweder Asn oder Ser ist;

R&sub7; entweder Tyr oder Trp ist;

R&sub8; ein Aminosäurerest ist, ausgewählt aus His, Tyr und Asn;

wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und

X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe, daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der in dem entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

10. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 9, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 7

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-His-Arg-(Tyr- Pro-Asn-Gln)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 8

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Asn- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-Tyr-Arg-(Tyr- Pro-Asn-Gln)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 9

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Ile-Ile-His-Phe-Gly-Ser- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Met-His-Arg-(Tyr- Pro-Asn-Gln)-Y.

11. Signifikantes Subfragment einer Sequenz nach Anspruch 9, das vorzugsweise die Sequenz umfaßt:-

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-R&sub4;-R&sub5;-His-Phe-Gly-R&sub6;- Asp-R&sub7;-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-(Arg-Glu-Asn-Met)-Y,

wobei R&sub4; bis R&sub7;, X und Y wie für Formel II definiert sind, und ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können.

12. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 11, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 42

Seq.-ID.-Nr. 43

Ser-Ala-Met-Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly- Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Cys.

13. Subfragment nach Anspruch 11, ausgewählt aus:

Seq.-ID.-Nr. 10

Seq.-ID.-Nr. 11

Seq.-ID.-Nr. 12

X-(Ser-Ala-Met-Ser)-Arg-Pro-Ile-Ile-His-Phe-Gly-Ser- Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg-Tyr-Tyr-(Arg-Glu-Asn-Met)-Y.

14. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß der allgemeinen Formel III:

X-(Asn-Met-R&sub8;-Arg)-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-R&sub9;-Asp-R&sub1;&sub0;-Tyr-R&sub1;&sub1;]-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y (III),

wobei R&sub8; ein aus His, Tyr und Asn ausgewählter Aminosäurerest ist,

R&sub9; Val oder Met ist;

R&sub1;&sub0; ein aus Gln, Glu und Arg ausgewählter Aminosäurerest ist;

R&sub1;&sub1; Ser oder Asn ist; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe, daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der in dem entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

15. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 14, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 13

X-(Asn-Met-His-Arg)-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-Val-Asp-Gln-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-(Asp- Cys-Val-Asn)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 14

X-(Asn-Met-Tyr-Arg)-Tyr-Fro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-Val-Asp-Arg-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-(Asp- Cys-Val-Asn)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 15

X-(Asn-Met-His-Arg)-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg- Pro-Met-Asp-Glu-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-(Asp- Cys-Val-Asn)-Y.

16. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 15, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 44

Seq.-ID.-Nr. 45

Asn-Met-His-Arg-Tyr-Pro-Asn-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Val- Asp-Gln-Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His-Gly-Cys.

17. Signifikantes Subfragment einer Sequenz nach Anspruch 14, das vorzugsweise die Sequenz umfaßt:

X-(Arg-Tyr-Pro-Asn)-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-R&sub9;-Asp- R&sub1;&sub0;-Tyr-R&sub1;&sub1;-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y,

wobei R&sub9;, R&sub1;&sub0;, R&sub1;&sub1;, X und Y wie für Formel (III) definiert sind.

18. Subfragment nach Anspruch 17, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 16

Seq.-ID.-Nr. 17

Seq.-ID.-Nr. 18

X-(Arg-Tyr-Pro-Asn)-Gln-Val-Tyr-Tyr-Arg-Pro-Met-Asp-Glu- Tyr-Ser-Asn-Gln-Asn-Asn-Phe-Val-His- (Asp-Cys-Val-Asn)-Y.

19. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß der allgemeinen Formel IV:

X-(Tyr-Tyr-R&sub1;&sub2;-R&sub1;&sub3;-Arg)-R&sub1;&sub4;-R&sub1;&sub5;-Ser-R&sub1;&sub6;-R&sub1;&sub7;-R&sub1;&sub8;-Leu-Phe-Ser- Ser-Pro-Pro-Val-Ile-Leu-Leu-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile-Phe- Leu-R&sub1;&sub9;-Val-Gly-Y (IV)

wobei R&sub1;&sub2; Asp oder Gln ist;

R&sub1;&sub3; Gly ist oder fehlt;

R&sub1;&sub4; Gly oder Arg ist;

R&sub1;&sub5; Ala oder Ser ist;

R&sub1;&sub6; Ser ist oder fehlt;

R&sub1;&sub7; ein aus Ala, Ihr, Met und Val ausgewählter Aminosäurerest ist;

R&sub1;&sub8; Val oder Ile ist;

R&sub1;&sub9; Ile oder Met ist; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe, daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der im entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

20. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 19, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 19

Seq.-ID.-Nr. 20

X-(Tyr-Tyr-Gln-Arg)-Gly-Ser-Ser-Met-Val-Leu-Phe-Ser-Ser- Pro-Pro-Val-Ile-Leu-Leu-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile- Phe-Leu-Ile-Val-Gly-Y.

21. Signifikantes Subfragment einer Sequenz nach Anspruch 19, das vorzugsweise die Sequenz umfaßt:

X-(R&sub1;&sub4;-R&sub1;&sub5;-Ser-R&sub1;&sub6;-R&sub1;&sub7;)-R&sub1;&sub8;-Leu-Phe-Ser-Ser-Pro-Pro-Val- Ile-(Leu-Leu-Ile-Ser)-Y,

wobei R&sub1;&sub4; bis R&sub1;&sub8;, X und Y wie für Formel IV definiert sind, und ein oder mehrere Reste in Klammern wie in Formel IV vorhanden sein oder fehlen können.

22. Subfragment nach Anspruch 21, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 21

Seq.-ID.-Nr. 22

X-(Gly-Ser-Ser-Met)-Val-Leu-Phe-Ser-Ser-Pro-Pro-Val- Ile-(Leu-Leu-Ile-Ser)-Y.

23. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß der Formel VI:

X-(R&sub3;&sub1;-R&sub3;&sub2;-Trp-R&sub3;&sub3;)-Trp-Leu-Gly-R&sub3;&sub4;-R&sub3;&sub5;-R&sub3;&sub6;-Trp-R&sub3;&sub7;- (Trp-Leu-Gly-R&sub3;&sub8;)-Y (VI),

wobei R&sub3;&sub1; und R&sub3;&sub5; jeweils unabhängig voneinander entweder Ala oder Thr sind; R&sub3;&sub2; und R&sub3;&sub6; jeweils unabhängig voneinander ein aus Ser, Pro und Ihr ausgewählter Aminosäurerest sind; R&sub3;&sub3; und R&sub3;&sub7; jeweils unabhängig voneinander entweder Trp oder Arg sind;

R&sub3;&sub4; und R&sub3;&sub8; jeweils unabhängig voneinander ein aus Ala, Ser, Pro, und Thr ausgewählter Aminosäurerest sind; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe; daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der im entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

24. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß der Formel VII.

X-(R&sub3;&sub9;-R&sub4;&sub0;-Met-R&sub4;&sub1;)-Val-Ala-Gly-R&sub4;&sub2;-R&sub4;&sub3;-R&sub4;&sub4;-Met-R&sub4;&sub5;- (Val-Ala-Gly-R&sub4;&sub6;)-Y (VII),

wobei R&sub3;&sub9; und R&sub4;&sub3; jeweils unabhängig voneinander entweder Ser oder Asn sind; R&sub4;&sub0; und R&sub4;&sub4; jeweils unabhängig voneinander ein aus Pro, Leu, und His ausgewählter Aminosäurerest sind, R&sub4;&sub1; und R&sub4;&sub5; jeweils unabhängig voneinander Val oder Glu sind; R&sub4;&sub2; und R&sub4;&sub6; jeweils unabhängig voneinander aus Val, Ala, Asp und Gly ausgewählt sind; wobei ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe, daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der in dem entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

25. Synthetisches Polypeptid mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, umfassend eine Sequenz gemäß der Formel VIIIa oder VIIIb:

X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-R&sub4;&sub7;-Lys- R&sub4;&sub8;-His-Thr-Val-R&sub4;&sub9;-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-R&sub5;&sub0;-Lys)-Y (VIIIa),

X-(Met-Cys-R&sub5;&sub1;-Thr)-Gln-Tyr-R&sub5;&sub2;-R&sub5;&sub3;-Glu-Ser-Gln-Ala- Tyr-Tyr-R&sub5;&sub4;-R&sub5;&sub5;-Arg-(R&sub5;&sub6;-R&sub5;&sub7;-Ser-R&sub5;&sub8;-R&sub5;&sub9;)-Y (VIIIb),

wobei R&sub4;&sub7; entweder Ile oder Val ist;

R&sub4;&sub8; und R&sub5;&sub2; jeweils unabhängig voneinander entweder Gln oder Glu sind;

R&sub4;&sub9; entweder Val oder Ihr ist;

R&sub5;&sub0; entweder Val oder Ile ist;

R&sub5;&sub1; ein aus Ile, Thr und Val ausgewählter Aminosäurerest ist;

R&sub5;&sub2; Gln oder Glu ist;

R&sub5;&sub3; entweder Arg oder Lys ist;

R&sub5;&sub4; entweder Asp oder Gln ist;

R&sub5;&sub5; Gly ist oder fehlt;

R&sub5;&sub6; entweder Gly oder Arg ist;

R&sub5;&sub7; entweder Ala oder Ser ist;

R&sub5;&sub8; Ser ist oder fehlt;

R&sub5;&sub9; ein aus Ala, Ihr, Met und Val ausgewählter Aminosäurerest ist;

ein oder mehrere Reste in Klammern vorhanden sein oder fehlen können, mit der Maßgabe, daß sie - wenn sie vorhanden sind - der Reihe nach an das restliche Peptid gebunden sind, und X und Y jeweils unabhängig voneinander fehlen können oder unabhängig voneinander ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste sein können, mit der Maßgabe, daß - wenn vorhanden - weder X noch Y einen Teil einer Antigeneigenschaft des Prionproteins bereitstellen oder bilden, der im entsprechenden Sequenzabschnitt eines natürlichen Prionproteins an die Sequenz grenzt, an die X und Y gebunden sind.

26. Synthetisches Polypetid nach Anspruch 25, umfassend eine Sequenz, ausgewählt aus:

Seq.-ID.-Nr. 32

X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-Val-Lys- Glu-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-Ile-Lys)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 33

X-(Met-Cys-Ile-Thr)-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala- Tyr-Tyr-Gln-Arg-(Gly-Ala-Ser-Val)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 34

X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-Val-Lys- Gln-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-Ile-Lys)-Y;

Seq.-ID.-Nr. 35

Seq.-ID.-Nr. 36

X-(Asn-Phe-Val-His)-Asp-Cys-Val-Asn-Ile-Thr-Ile-Lys- Gln-His-Thr-Val-Thr-Thr-Thr-Thr-Lys-Gly-Glu-Asn- Phe-Thr-Glu-(Thr-Asp-Val-Lys)-Y; und

Seq.-ID.-Nr. 37

X-(Met-Cys-Ile-Thr)-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala- Tyr-Tyr-Gln-Arg-(Gly-Ser-Ser-Met)-Y.

27. Subfragment eines synthetischen Polypeptides nach Anspruch 25, ausgewählt aus

Seq.-ID.-Nr. 50

Seq.-ID.-Nr. 48

Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg.

28. Synthetisches Polypeptid der allgemeinen Formel (IX);

[La-F]m-[Lb-G]n-Lc (IX),

wobei F und G jeweils unabhängig voneinander ein Polypeptid oder ein Subfragment nach einer der Formeln I bis VIIIb sein können, L eine Verbindungssequenz ist, a, b und c jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 sind, und m und n jeweils positive Zahlen sind.

29. Synthetisches Polypeptid, umfassend ein antigen signifikantes Subfragment und/oder eine antigen signifikante Variante der vorstehend identifizierten Polypeptidsequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 27.

30. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das zusätzlich ein T- Zellepitop umfaßt.

31. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das eine retro-inverso- Aminosäure enthält.

32. Synthetisches Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das an einen Träger gebunden ist.

33. DNA-Molekül, das mindestens ein synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 30 codiert.

34. Impfstoff, umfassend mindestens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 31, das die Prophylaxe gegen Enzephalopathien wirksam fördert.

35. Kit zum Nachweisen von Prionproteinen oder Antikörpern gegen Prionproteine, das mindestens ein synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 31 umfaßt.

36. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein Polypeptid oder Polypeptid-Träger-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 32 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Trägern und/oder Exzipienten enthält.

37. Verwendung eines synthetischen Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 32 für die Herstellung eines Medikamentes für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung von Säugerenzephalopathien und/oder die Blockierung der zellulären Bindung oder Aggregation der Prionproteine.

38. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 32, entweder allein oder in Kombination mit anderen Mitteln, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Therapie oder Prophylaxe von Säugerenzephalopathien und/oder Stimulierung des Säuger-Immunsystems und/oder Blockierung der zellulären Bindung oder Aggregation der Prionproteine.

39. Verfahren zum Nachweis von Prionprotein oder Antikörpern gegen Prionprotein oder antigenbindenen Fragmenten davon, umfassend das Inkubieren einer Probe mit mindestens einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 32.

40. Verfahren zur Unterscheidung zwischen PrPC und PrPSC, wobei eine Probe mit einer Substanz in Kontakt gebracht wird, die aus Peptidsequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 32, vorzugsweise aus solchen, die die Bereiche A, B und C betreffen, und signifikanten Subfiragmenten davon, Antikörpern, die gegen diese Sequenzen und Subfragmente gezüchtet wurden, ausgewählt ist, und das Vorhandensein oder das Fehlen von PrPSC ermittelt wird.

41. Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon, der/das spezifisch an ein synthetisches Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 31 bindet.

42. Kit zum Nachweisen von Prionproteinen oder Antikörpern gegen Prionproteine, das einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon nach Anspruch 41 enthält.

43. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment nach Anspruch 41 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Exzipienten umfaßt.

44. Verwendung eines Antikörpers oder eines antigenbindenden Fragmentes nach Anspruch 41 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Therapie oder Prophylaxe von Säugerenzephalopathien.

45. Verfahren zum Nachweisen von Prionproteinen oder Antikörpern gegen Prionproteine, umfassend das Inkubieren einer Probe mit einem Antikörper oder einem antigenbindenden Fragment nach Anspruch 41.

46. Antiidiotypischer Antikörper, der gegen einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment nach Anspruch 41 gezüchtet ist.

47. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Polypeptides mit mindestens einer antigenen Stelle eines Prionproteins, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Kuppeln der Reste mit an sich bekannten chemischen, biologischen oder rekombinanten Techniken und Isolieren des Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 31.

48. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch an ein synthetisches Polypeptid bindet, das mindestens eine antigene Stelle eines Prionproteins aufweist, wobei das Verfahren das Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugers mit dem Polypeptid und das Isolieren des Antikörpers nach Anspruch 41 umfaßt.