DE69533979T2

DE69533979T2 - Toleranzinduktion mit tolerogenischen Fusionsproteinen

Info

Publication number: DE69533979T2
Application number: DE69533979T
Authority: DE
Inventors: W. David SCOTT; T. Elias ZAMBIDIS
Original assignee: American National Red Cross
Current assignee: American National Red Cross
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 2006-04-27
Also published as: US6838281B2; PT741788E; JP2008001709A; ATE288494T1; WO1995021926A1; JP4214173B2; EP0741788B1; US5817308A; DE69533979D1; DE69533979T8; US20020048562A1; CA2182977A1; ES2233940T3; DK0741788T3; EP0741788A1; JPH09509316A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Selbst/Nicht-Selbst-Unterscheidung stellt einen der Eckpfeiler der Immunologie dar. Normalerweise entwickeln Individuen während des frühen Entwicklungsstadiums des Immunsystems eine Toleranz gegen Selbst-Konstituenten. Allerdings erfordert die Beibehaltung dieses unempfänglichen Zustands das Fortbestehen eines Antigens, eine Tatsache, die impliziert, dass die Toleranzinduktion ein lebenslanger Prozess ist. Smith, Advances in Immunology, 1: 67 (1961). In der Tat stellt der Abbau der Toleranz bei älteren Individuen die Erklärung für das erhöhte Auftreten von Autoimmunität in älter werdenden Populationen dar.
Homologe oder heterologe Gammaglobuline sind als tolerogene Trägermoleküle (hauptsächlich IgG's) verwendet worden. Scott, Immunol. Rev., 43: 241 (1979). Obschon verschiedene Quellen der IgG's in ihrem Fortbestehen und/oder Mechanismus der Toleranzinduktion variieren können, haben sich IgG-Träger bei weitem als die wirkungsvollsten bei Toleranzinduktionen in Erwachsenen gegen Haptene, Nukleoside und Peptide erwiesen. Borel, Immunological Reviews, 50: 71 (1980); und Scott, Cell Immunol., 22: 311 (1976). Diese Träger verdanken ihre überlegende Tolerogenität ihrem Fortbestehen in vivo und der Fähigkeit von chemisch an IgG's gebundenen Epitopen, mIgM mit B-Zell-Fc-Rezeptoren zu vernetzen. Die chemische Vernetzung von Epitopen mit IgG-Trägern ist jedoch durch die Verfügbarkeit von freien Aminogruppen und das unkontrollierte Anzielen der zusätzlichen Determinante auf verschiedene Abschnitte des IgG begrenzt.
Eine rekombinante DNA-Technologie kann zur gentechnischen Herstellung von Molekülen mit heterologen Epitopen angewendet werden. Zum Beispiel wurden heterologe Oligopeptid-Epitope von biologischem Interesse in bakteriellem Flagellin exprimiert (Jennings et al., Protein Eng., 2: 365 (1989)); Hepatitis-B-Oberflächenantigen (Rutgers et al., Biotechnology, 6: 1065 (1988)); und in den Komlementaritäts-bestimmenden Regionen von Immunglobulinen (Zanetti et al., Nature, 355: 476 (1992)). Einige Versuche wurden unternommen, um die Fähigkeit rekominanter Proteine zu testen, als Antigene zur Immunisierung von Tieren und Generierung von Immunreaktionen auf die heterologen Oligopeptide zu dienen. Allerdings wurde die Induktion und Beibehaltung einer Toleranz gegen dem Immunsystem präsentierte Oligopeptide nicht nachgewiesen. Die Fähigkeit, eine Toleranz gegen ein Antigen oder Epitop beizubehalten, erfordert das Fortbestehen des Epitops in vivo.
Daher besteht Bedarf hinsichtlich der Entwicklung einer Methode zum Induzieren einer stabilen und lang anhaltenden Toleranz gegen ein Epitop. Es besteht Bedarf hinsichtlich der Entwicklung eines Vektors, der das Fortbestehen des Epitops in vivo gewährleisten kann, so dass die Toleranz beibehalten bleibt. Es besteht Bedarf hinsichtlich der Entwicklung eines rekombinanten Vektors, welcher für ein rekombinantes Polypeptid codiert, das ein heterologes Epitop aufweist, und der zur Induzierung und Beibehaltung der Toleranz in Individuen eingesetzt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Induzierung einer Toleranz gegen ein tolerogenes Epitop oder ein Antigen, welches das tolerogene Epitop enthält, in einem Individuum bereitgestellt, wobei das tolerogene Epitop ein Epitop ist, dem gegenüber eine immunologische Unempfänglichkeit erwünscht ist, welche Zusammensetzung umfasst:

(a) eine hämopoetische oder lymphoide Zelle, die einen Expressionsvektor umfasst, der zum dauerhaften Beibehalten der Expression des tolerogenen Epitops in dem Individuum fähig ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, das operabel an Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen geknüpft ist, die in der hämopoetischen oder lymphoiden Zellen funktionsfähig sind, wobei das Fusionsimmunglobulin mindestens ein heterologes Epitop aufweist, das in der N-terminalen variablen Region des Immunglobulins inseriert ist, wobei das heterologe Epitop das tolerogene Epitop ist, und wobei der Expressionsvektor stabil in der hämopoetischen oder lymphoiden Zelle erhalten bleibt; und
(b) einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger.

Die Erfindung stellt Zusammensetzungen zum Induzieren und Beibehalten der Toleranz gegenüber Epitopen und Antigenen, die diese Epitope enthalten, bereit. Auch Methoden werden beschrieben. Die Methoden und Zusammensetzungen sind zum Identifizieren neuer tolerogener Epitope oder Antigene, die solche Epitope enthalten, nützlich. Die Methoden und Zusammensetzungen sind außerdem nützlich zum Induzieren und Beibehalten einer Toleranz gegenüber Epitopen oder Antigenen, die die Epitope enthalten, die mit autoimmunen oder allergischen Immunreaktionen in Verbindung stehen.
Die Zusammensetzungen enthalten eine Expressionskassette und einen Vektor. Die Expressionskassette und der Vektor können zur Bildung von transformierten Zellen eingesetzt werden. Die Expressionskassette umfasst eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, das operabel an Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen geknüpft ist, die in einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle funktionsfähig sind. Das Fusionsimmunglobulin weist mindestens ein heterologes tolerogenes Epitop an der N-terminalen variablen Region des Immunglobulin-Moleküls auf. Ein Vektor enthält die Expressionskassette und ist ein solcher Vektor, der eine stabile Beibehaltung erzeugen kann, d.h. für die Genexpression der Expressionskassette in der hämopoetischen oder lymphoiden Zelle während der gesamten Lebensdauer der Zelle sorgen kann. Hämopoetische oder lymphoide Zellen werden mit einem Vektor stabil transformiert, um transformierte Zellen zu schaffen, die das Fusionsimmunglobulin exprimieren.
Wir beschreiben nachstehend auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine ausreichende Menge eines Fusionsimmunglobulins, um eine Toleranz zu induzieren und/oder beizubehalten, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger. Das Fusionsimmunglobulin enthält mindestens ein heterologes tolerogenes Epitop an der N-terminalen variablen Region des Immunglobulins.
Wir beschreiben außerdem Methoden zum Identifizieren von Epitopen oder Epitope enthaltenden Antigenen, die als neuartige Tolerogene dienen können. Die Methoden beinhalten das stabile Transformieren von Zellen mit einer Expressionskassette, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, um eine Population von transformierten Zellen zu erhalten, die das Fusionsimmunglobulin produzieren oder exprimieren. Das Fusionsimmunglobulin mit einem oder mehr als einem Epitop von einem Antigen, das vermutlich zum Induzieren der Toleranz fähig ist, kann auf seine Fähigkeit zur Induzierung der Toleranz gegen das Epitop in vielfältiger Weise gescreent werden. Eine Methode, um zu bestimmen, ob das Fusionsimmunglobulin eine Toleranz induzieren kann, besteht in der Verabreichung einer tolerogenen Menge des Fusionsimmunglobulins an ein Tier. Bei einer anderen Methode können die transformierten Zellen, die das Fusionsimmunglobulin exprimieren, einem Tier verabreicht werden, um zu bestimmen, ob die Toleranz gegen das Epitop induziert und/oder beibehalten werden kann. Bei einer dritten Methode können Epitope oder Antigene, die das Epitop enthalten, durch ihre Reaktivität mit allergischem oder autoimmunem Immunserum oder Lymphozyten identifiziert werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung dienen zur Anwendung bei Methoden zum Induzieren und Beibehalten der Toleranz gegen ein Epitop bei einem Tier. Bei dieser Methode werden transformierte Zellen, die ein Fusionsimmunglobulin exprimieren, einem Tier zum Induzieren und Beibehalten einer Toleranz verabreicht. Wir beschreiben ebenfalls eine Methode, die die Verabreichung einer ausreichenden tolerogenen Menge eines Fusionsimmunglobulins zum Induzieren und/oder Beibehalten der Toleranz gegen ein heterologes Epitop an dem Fusionsimmunglobulin einbezieht. Bei einer anderen Methode wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Fusionsimmunglobulin enthält, zum Induzieren einer Toleranz gegen das heterologe Epitop verabreicht, woraufhin transformierte Zellen, die das Fusionsimmunglobulin exprimieren, dann zur Beibehaltung der Toleranz gegen das heterologe Epitop verabreicht werden.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Strategie zur Herstellung eines murinen DNA-Konstrukts, das für ein Fusionsimmunglobulin einschließlich des 12-26-Epitops des λ-Cl-Repressorproteins am N-Terminus von IgG1 codiert: (A) Karte des Plasmids pSNR, welches die genomische Sequenz für eine γl-H-Kette enthält, modifiziert wie in Beispiel 1 beschrieben. (B) Restriktionskarte und Sequenz, die die für das 12-26-Epitop codierende DNA-Sequenz zeigt, in Kombination mit der DNA-Sequenz, die für die variable Region der Schwerkette codiert.
2: Nachweis eines heterologen Epitops auf dem 12-26-IgG-Fusionsprotein. Das 12-26-IgG1-Konstrukt (Q3), als auch das Kontroll-pSNR-Konstrukt (P6), wurden in J558L-Myelomzellen elektroporiert, die lediglich λ-Leichtketten synthetisieren. Rekombinante IgGs wurden aus Massenüberständen von transformierten Zellen mit Anti-Maus-IgG-Sepharose- oder Protein-A-Sepharose-Säulen aufgereinigt. Western-Blotting: die Proben wurden auf 10% SDS-PAGE elektrophoretisch behandelt. Die Gele wurden auf Nitrocellulose übertragen und mit Anti-Maus-IgG (linke Spuren) oder mit Anti-12-26-monoklonalem Antikörper B3.11 (rechte Spuren) plus alkalische Phosphatase-konjugierten Antikörpern als sekundären Reagenzien geprüft.
3: ELISA-Inhibitionskurven. Vortitrierter monoklonaler Antikörper B3.11 wurde mit ansteigenden Mengen von 12-26-Peptid, 12-26-Peptid, in chemischer Kopplung an Kaninchen-Gammaglobulin (RGG/12-26) oder Q3 (rekombinantes Fusionsprotein 12-26-IgG1) gemischt.
4: Toleranzinduktion durch 12-26-IgG-Fusionsprotein, wie in vitro bestimmt. Milzzellen wurden für 18 Stunden mit ansteigenden Mengen an 12-26-Peptid oder 12-26-IgG-Fusionsprotein (Q3.13) oder einem 12-26-Kaninchen-Gammaglobulin-(RGG)-Konjugat gezüchtet. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit einem Antigen provoziert, das 12-26-Epitop (12-26-Flagellin) enthielt, und ELISA-Assays wurden an Überständen des Tags 4 vorgenommen.
5: In vivo-Toleranzinduktion mit 12-26-IgG. Balb/c-Mäuse wurden mit einer toleranzbildenden Dosis von Kontroll-IgG (P6) bei 1 mg/Maus [dunkle Balken], von 12–26-Peptid bei 100 μg/Maus [leere Balken], von dem chemischen Konjugat von 12–26 an Kaninchen-Gammaglobulin (12-26-RGG) bei 1 mg/Maus [schraffierte Balken) und von dem Fusionsimmunglobulin (Q3.13) bei 1 mg/Maus [gestrichelt-gepunktete Balken] injiziert. Nach 7 Tagen wurden die Milzzellen auf ihre Ansprechempfänglichkeit gegenüber einer in vitro-Provokation mit einem Antigen ausgewertet, das das 12-26-Epitop enthielt, wie in 4 beschrieben
6A: Western-Blot, der die Expression des 12-26-Peptids in Überständen von A20.2J-Zellen, infiziert mit MBAE-12-26-Vektor, zeigt. Die Überstände wurden auf Nitrocellulose slot-geblottet und mit Anti-12-26-monoklonalem Antikörper B3.11 geprüft.
MBpepA, MBpepB, MBpepC und MBpepD stehen für einzeln infizierte A20.2J-Klone, die das 12-26-Peptid produzieren, das für den MBAR-12-26-Vektor codiert.
6B zeigt die Vermehrung eines T-Zell-Anti-12-26-IgG-TH1-Klons als Reaktion auf die Inkubation mit Überständen von A20-Zellen, infiziert mit MBAE-12-26-Vektor oder Kontrollüberständen.
7 zeigt die Konstruktion eines retroviralen MBAE-Vektors, der die DNA-Sequenz enthält, die für das 12-26-Epitop codiert.
8 zeigt einen Southern-Blot von cDNA, wie aus revers transkribierten Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Produkten von MBAE-12-26-infizierten Knochenmarkszellen nach Reifung in bestrahlten Empfängern hergestellt. Periphere Blutzellen wurden von Mäusen 2 Wochen nach Erhalt der infizierten Knochenmarkszellen erhalten. Die RNA wurde revers transkribiert und eine PCR mit V_H- und 12-26-Primern vorgenommen. Die Gele wurden mit eine Oligonukleotid-Sonde, die komplementär zur DNA-Sequenz war, die für das 12-26-Epitop codierte, geprüft. Das Experiment weist die Expression von mRNA, die für das 12-26-Epitop codiert, basierend auf der RT-PCR von RNA aus peripheren Blutzellen 2 Wochen nach Knochenmarkstransplantation nach.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Methoden zum Induzieren und Beibehalten einer Toleranz gegen Antigenen bereit. Die Zusammensetzungen enthalten eine Expressionskassette und einen Vektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, die operabel an Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen geknüpft ist, die in einer hämopoetischen Zelle oder lymphoiden Zelle funktionsfähig sind. Das Fusionsimmunglobulin weist mindestens ein heterologes Epitop auf, das am N-Terminus der variablen Region der Immunglobulinkette lokalisiert ist. Die Vektoren sind vorzugsweise solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in eine hämopoetische Zelle bereitstellen können. Gemäß der Erfindung werden die Zellen mit den Vektoren transformiert. Wir beschreiben außerdem Fusionsimmunglobuline mit einem heterologen Epitop am N-Terminus, die in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden können, die die Induktion einer Toleranz gegen das Epitop und/oder seinem Antigen bereitstellt. Wir beschreiben auch Methoden zum Identifizieren neuer tolerogener Antigene und Epitope, ebenso wie Methoden zum Induzieren und Beibehalten der Toleranz gegen ein Antigen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Antigen" auf ein Agens, das zum Auslösen einer Immunreaktion in einem Tier fähig ist.
Ein "Epitop" stellt einen Abschnitt des Antigens dar, der zur Auslösung einer Immunreaktion fähig ist und das sich mit einem für jenen Abschnitt des Antigens spezifischen Antikörper kombiniert.
Ein "heterologes Epitop" stellt ein Epitop dar, das normalerweise nicht mit dem Immunglobulin-Trägermolekül assoziiert ist. Es wird erhalten oder stammt von einem Antigen, das nicht dasselbe wie das Immunglobulin-Trägermolekül ist.
Eine "hämopoetische Zelle" ist eine Zelle, die Blutzellen einschließlich Lymphozyten und Makrophagen aus Geweben wie Knochenmarkszellen und anderen extramedullären Geweben bilden kann.
Eine "Expressionskassette oder Vektor" ist in einem hämopoetischen oder anderen Zelltyp stabil beibehalten, wenn sie in das Chromosom entweder integriert ist, so dass die Expressionskassette oder der Vektor repliziert wird oder auf Zellnachkommen übertragen wird oder in der Zelle ohne Verlust der funktionsfähigen Aktivität, d.h. Genepxression, über die Lebensdauer der Zelle hinweg beibehalten wird.
Ein "tolerogenes Epitop" ist ein Epitop, das eine immunologische Unempfänglichkeit gegenüber dem Epitop und/oder einem Antigen, das ein Epitop enthält, induziert. Ein tolerogenes Epitop wird aufgrund des Wunsches ausgewählt, eine immunologische Unempfänglichkeit gegenüber dem Epitop und/oder einem Antigen, das das Epitop enthält, zu induzieren. Ein tolerogenes Epitop kann als ein Epitop identifiziert werden, das bei geeigneter Präsentation dem Immunsystem eine Immunreaktion stimulieren kann, oder es kann ein Auto- oder Selbst-Antigen sein, das normalerweise keine Immunreaktion hervorrufen könnte. Ein tolerogenes Epitop kann mit T-Zellen oder B-Zellen oder beidem Wechselwirken. Geeignete tolerogene Epitope, die dafür ausgewählt werden können, sind vorzugsweise solche Epitope und/oder Antigene, die mit Autoimmunkrankheiten oder allergischen Reaktionen assoziiert sind.
A. Expressionskassetten und Vektoren
Eine Expressionskassette zur Verwendung in der Erfindung enthält eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, das operabel an Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen geknüpft ist, die in einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle funktionsfähig sind. Das Fusionsimmunglobulin enthält mindestens ein heterologes tolerogenes Epitop am N-Terminus der variablen Region. Die Expressionskassette wird vorzugsweise in einen Vektor eingebaut, der für eine stabile Beibehaltung und Expression der Expressionskassette in der Wirtszelle sorgt. Ist die Wirtszelle eine hämopoetische Zelle, so ist der Vektor vorzugsweise ein Vektor, der für die Integration des Vektors in das Chromosom der hämopoetischen Zelle sorgt. Ist die Wirtszelle eine lymphoide Zelllinie, so kann der Vektor ein nicht-integrierter Vektor sein, wie etwa ein Plasmid, solange er für die stabile Beibehaltung und Expression der Expressionskassette über die Lebensdauer der Zelle hinweg sorgt. Die Expressionskassetten und Vektoren der Erfindung sind zur Bereitstellung von Fusionsimmunglobulinen zur Verwendung als tolerogene Agenzien und/oder zur Schaffung der Beibehaltung der Toleranz gegen ein Antigen und/oder Epitop nützlich.
Eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, kann mittels standardmäßiger Methoden erhalten und konstruiert werden, wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 3, J. Wiley/Greene Press (1992). Die für Immunglobuline codierenden DNA-Sequenzen können unter Anwendung bekannter Methoden erhalten werden, wie zum Beispiel beschrieben von Hebell et al., Science 254: 102 (1991) und Huse et al., Science, 246: 1275 (1989). Kurz dargestellt können Schwer- und Leichtkettensequenzen durch reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) von Messenger-RNA (mRNA), isoliert aus Milzzellen oder vorzugsweise Hybridomen, die einen Antikörper von bekannter Spezifität erzeugen, erhalten werden. Die Primer können zum Amplifizieren der variablen Leicht- und Schwerkettensequenzen einschließlich des Fd-Fragments (V_H-CH1) gestaltet werden. Beispiele solcher Primer sind beschrieben in Huse et al., zitiert supra, und Ballard et al., PNAS, 83: 9626 (1986). Typischerweise sind solche Primer daraufhin gestaltet, Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen an beiden Enden der zu amplifizierenden Sequenz zu enthalten. Die Restriktionsenodnuklease-Erkennungssequenzen sind den Fachleuten des Gebiets bekannt und können daraufhin ausgewählt werden, um eine einfache Klonierung in einen Vektor an einer spezifischen Lokalisation zu ermöglichen.
Die DNA-Sequenzen, die für die Leicht- und Schwerketten des Immunglobulins codieren, sind vorzugsweise cDNA-Sequenzen, wobei jegliche dazwischenliegende Sequenz-DNA entfernt wurde und ein vollständig funktionsfähiges Immunglobulin durch die DNA-Sequenz codiert ist. Die DNA-Sequenz, die das Immunglobulin-Molekül codiert, kann ein komplettes Immunglobulin sowohl mit Schwer- als auch Leichtketten mit dem Fc-Fragment codieren oder kann Abschnitte des Immunglobulins wie das Fab-Fragment, F(ab)₂-Fragment oder lediglich die Schwerkette codieren. Modifikationen an der DNA-Sequenz, die für die Schwerkette codiert, können vorgenommen werden und führen nach wie vor zu einem Fusionsimmunglobulin-Molekül, wenn die DNA-Sequenz, die für die Schwerkette codiert, in einer Zelle von B-Zell-Abstammung exprimiert wird, welche Leichtketten zum Erhalt des Immunglobulins liefern kann. Die DNA-Sequenz kann für eine sekretierte oder Membranform des Immunglobulin-Moleküls codieren.
Geeignete Beispiele einer DNA-Sequenz, die für die Schwerkette eines für Nitrophenyl spezifischen Antikörpers codiert, sind beschrieben bei Hebell et al., zitiert supra. IgG1 oder IgG2 (Maus) sind als Trägermoleküle zur Induzierung der Toleranz bevorzugt. Die DNA-Sequenz codiert vorzugsweise für die Schwerkette von IgG1- oder IgG2-Typen des Immunglobulins.
Eine DNA-Sequenz, die für mindestens ein tolerogenes Epitop eines Antigens codiert, kann erhalten und mittels standardmäßiger Methoden präpariert werden. Ist das Epitop ein kleines Peptid von 15–20 Aminosäuren, so kann die Nukleotidsequenz, die das Epitop codiert, unter Anwendung einer automatisierten DNA-Synthese synthetisiert werden. Codiert die DNA-Sequenz für das gesamte oder einen Abschnitt eines Antigens (d.h. codiert für multiple Epitope), so kann die DNA-Sequenz, die für jenes Antigen codiert, isoliert und unter Anwendung veröffentlichter Methoden subkloniert werden. Die DNA-Sequenzen, die für das gesamte oder einen Abschnitt einiger Antigene codieren, können ebenfalls durch Suche in einer Datenbank wie GenBank identifiziert werden. Ist die Sequenz einmal in solch einer Datenbank oder durch Bezugnahme auf Veröffentlichungen identifiziert, so kann die DNA-Sequenz, die für das gesamte oder einen Abschnitt eines Antigens codiert, durch automatisierte Synthese oder mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten werden. Zum Beispiel wurde die DNA-Sequenz, die für Antigen E von Traubenkraut-(Ragweed)-Pollen codiert, beschrieben von Rafner et al., J. Biol. Chem., 266: 1229 (1991); und Kuo et al., Molecular Immunol., 30: 1077 (1993). Epitope des Antigens E wurden ebenfalls identifiziert, wie beschrieben bei Olson, J. Immunol., 136: 2109 (1986); und Bond et al., J. Immunol., 146: 3380 (1991). Eine DNA-Sequenz, die für ein oder mehrere der Epitope von Antigen E codiert, kann mittels standardmäßiger Methoden erhalten werden, wie beschrieben bei Kuo et al., zitiert supra.
Geeignete Antigenen sind solche, von denen die Induktion und Beibehaltung der immunologischen Unempfänglichkeit des Epitops und/oder Antigens, das das Epitop enthält, wünschenswert wäre. Zu solchen Antigenen zählen Pollen, Ragweed, Staubmilben und andere bekannte Allergene. Zu geeigneten Antigenen zählen auch Autoantigene wie Gerinnungsfaktor VIII, Acetylcholin-Rezeptoren, Collagen, Myelin-Grundprotein, Thyroglobulin und Histokompatibiltiäts-Antigene. Ein geeignetes Antigen enthält auch die Epitope vom λ-Cl-Repressorprotein. Die Aminosäure-Sequenzen vieler dieser Antigene als auch die Epitope dieser Antigene sind den Fachleuten de Gebiets bekannt. Zu bevorzugten Antigenen zählen Antigen E von Ragweed und Gerinnungsfaktor VIII. Die DNA-Sequenzen, die geeignete Antigene codieren, können erhalten und präpariert werden, wie hierin und gemäß veröffentlichter Methoden beschrieben.
Bevor eine DNA-Sequenz, die für mindestens ein tolerogenes Epitop eines Antigens codiert, erhalten und präpariert wird, wird das Epitop und/oder Antigen ausgewählt. Das Epitop und/oder Antigen kann ein einzelnes Epitop sein oder kann das gesamte oder ein Abschnitt eines Antigens sein, das viele Epitope enthält. Das Epitop kann ein solches sein, das mit T-Zellen wechselwirkt, oder eines, das mit B-Zellen wechselwirkt, oder eines, das sowohl mit T- und/oder B-Zellen wechselwirkt.
Die Auswahl des Epitops und/oder Epitope kann basierend auf den folgenden Kriterien vorgenommen werden. Die Epitope werden zunächst auf ihre Fähigkeit zum Induzieren der Toleranz gegen das Peptid oder ein Antigen, das das Epitop enthält, vorzugsweise ein Antigen, das mit einer allergenen Reaktion oder Autoimmunreaktion in Verbindung steht, ausgewählt. Zweitens kann, wenn eine Toleranz gegen ein großes und komplexes Antigen gewünscht ist, mehr als ein Epitop zur Kombination in einem Fusionsimmunglobulin ausgewählt werden. Vorzugsweise kann das gesamte Antigen in das Fusionsimmunglobulin aufgenommen werden. Drittens können Epitope gewählt werden, wenn eine B- und/oder T-Zell-Toleranz erwünscht ist. Bestimmte Epitopen werden, wie den Fachleuten des Gebiets bekannt, von T-Zellen und nicht von B-Zellen, und umgekehrt, erkannt. Viertens können Epitope ausgehend von ihrer Reaktivität mit Immunserum oder Lymphozyten von Individuen mit allergischer oder autoimmuner Reaktion auf ein Antigen ausgewählt werden. Zum Beispiel kann ein Epitop, das als immundominant oder eine starke Autoantikörperreaktion stimulierend bekannt ist, gewählt werden, so dass der im Fusionsimmunglobulin enthaltene Abschnitt des Antigens jenes Epitop enthält. Fünftens kann es, wenn wenig oder keine Information über die Epitope auf dem Antigen vorliegt, wünschenswert sein, das gesamte Antigen in das Fusionsimmunglobulin aufzunehmen.
Die DNA-Sequenz, die für ein Epitop codiert, kann ein Epitop von etwa 5–6 Aminosäuren oder ein Antigen mit einem Molekulargewicht von bis zu etwa 100.000 Dalton enthalten. Der bevorzugte Größenbereich beträgt etwa 9 Aminosäuren bis etwa 50.000 Dalton. Zum Beispiel weisen Epitope, die durch T-Zellen erkannt werden, eine Konsensussequenz auf, die etwa 9 Aminosäuren enthält. Es wird davon ausgegangen, dass die minimale Größe eines Epitops etwa 5–6 Aminosäuren beträgt. Die maximale Größe des Antigens, das in einem Fusionsprotein präsentiert werden kann, ist jene Größe, die die Faltung sowohl des Antigens als auch des Immunglobulin-Trägermoleküls erlaubt. Ein bevorzugtes Antigen ist das A2-Fragment des Gerinnungsfaktors VIII, das ein Molekulargewicht von etwa 40.000 Dalton aufweist.
Ist das Epitop einmal auswählt und die DNA-Sequenz, die jenes Epitop codiert, erhalten, so wird die für das Epitop codierende DNA-Sequenz mit einer für das Immunglobulin codierenden DNA-Sequenz kombiniert, um eine für ein Fusionsimmunglobulin codierende DNA-Sequenz zu gewinnen. Die für das Epitop codierende DNA-Sequenz wird vorzugsweise mit einer DNA-Sequenz für das Immunglobulin an der N-terminalen variablen Region der Schwerkette im Leseraster und in geeigneter Orientierung kombiniert. Die Lokalisation der Kombination der für das Epitop codierenden DNA-Sequenz kann in Abhängigkeit von der gewünschten Lokalisation des Epitops im Fusionsimmunglobulin variieren. Ist das Epitop das gesamte Antigen oder ein großer Abschnitt des Antigens (d.h. mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000 bis etwa 100.000 Dalton), so ist die Lokalisation des Epitops auf dem Fusionsimmunglobulin eine solche, dass sie eine Faltung sowohl des Immunglobulin-Trägermoleküls als auch des Antigens oder des Abschnitts des Antigens erlauben würde. Ist das Antigen und/oder der Abschnitt des Antigens ein Epitop, so wird dieses vorzugsweise mit dem Immunglobulin am Amino-Terminus der Schwerkette an den Aminosäuren der ersten N-terminalen Framework-Region fusioniert. Kleinere Epitope (d.h. solche, die etwa 5–50 Aminosäuren enthalten) können an der ersten N-terminalen Framework-Region oder innerhalb anderer Regionen auf dem variablen Abschnitt der Immunglobulinkette lokalisiert sein, solange das Epitop an der äußeren Oberfläche des Immunglobulin-Moleküls exponiert bleibt. Vorzugsweise können kleine Epitope auch mit dem Immunglobulin an den Aminosäuren der ersten N-terminalen Framework-Region der Schwerkette kombiniert werden.
Wahlweise kann die DNA-Sequenz, die für mindestens ein heterologes tolerogenes Epitop codiert, flankierende DNA-Sequenzen an einem oder beiden Enden der DNA-Sequenz enthalten. Diese flankierenden DNA-Sequenzen können Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen enthalten und/oder können eine DNA-Sequenz enthalten, die einen Abschnitt der Immunglobulin-Sequenz an der Lokalisation codiert, an der die beiden DNA-Sequenzen kombiniert werden sollen. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz, die für ein Epitop codiert, das an der ersten N-terminalen Framework-Region einer Schwerkette eines Immunglobulin-Moleküls kombiniert ist, eine flankierende DNA-Sequenz enthalten, die die ersten fünf Aminosäuren der ersten Framework-Region an einem oder beiden Enden der DNA-Sequenz, die für das Epitop codiert, enthalten. Die flankierende DNA-Sequenz kann außerdem eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym enthalten. Die flankierende DNA-Sequenz ist vorzugsweise etwa 3 bis 21 Nukleotide lang. Wenn die flankierende DNA-Sequenz einen Abschnitt der Immunglobulin-Aminosäuresequenz codiert, so wird diese Sequenz an der Lokalisation des Kombinationspunkts der epitopalen DNA-Sequenz mit der Immunglobulinsequenz ausgewählt. Die flankierende DNA-Sequenz, die für einen Abschnitt der Immunglobulin-Aminosäuren codiert, kann Aminosäuren im Fusionsimmunglobulin bereitstellen, die die korrekte Faltung sowohl des Epitops und/oder Antigens als auch des Immunglobulins am Fusionspunkt unterstützt. Die flankierende DNA-Sequenz kann auch sicherstellen, dass die DNA-Sequenz, die für das Epitop codiert, mit der DNA-Sequenz, die für das Immunglobulin codiert, im Leseraster und der korrekten Orientierung kombiniert wird.
Die DNA-Sequenzen, die für das Immunglobulin und das Epitop codieren, werden unter Anwendung standardmäßiger Subklonierungsmethoden kombiniert. Die Kombination der beiden DNA-Sequenzen kann durch Bilden der DNA-Sequenz, die das Epitop codiert, mit flankierenden DNA-Sequenzen mit bestimmten Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen unterstützt werden. Diese flankierenden Sequenzen verschaffen einem Fachmann des Gebiets die Möglichkeit, die Lokalisation auszuwählen, an der die DNA-Sequenz, die für das Epitop codiert, mit der DNA-Sequenz, die für das Fusionsimmunglobulin codiert, kombiniert werden wird, und sicherzustellen, dass die Sequenzen im Leseraster und in geeigneter Orientierung kombiniert werden. Sind die DNA-Sequenzen, die für das Immunglobulin und das Epitop codieren, kombiniert, so bilden sie eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsimmunglobulin oder eine Fusionsschwerkette eines Immunglobulin-Moleküls codiert.
Es sollte klar sein, dass aufgrund der Degeneration des genetischen Codes es eine Anzahl von DNA-Sequenzen gibt, die für ein Immunglobulin und ein Epitop, das dieselbe Aminosäuresequenz aufweist, codieren können. Dieser Satz von Sequenzen ist ein begrenzter Satz und kann auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des Epitops und des Immunglobulins bestimmt werden. Alternative DNA-Sequenzen, die für ein Immunglobulin-Molekül und ein Epitop mit derselben Aminosäuresequenz codieren, werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen und sind von ihrem Rahmen umfasst.
Die für ein Fusionsimmunglobulin codierende DNA-Sequenz kann dann mit Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen, die in einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle funktionsfähig sind, kombiniert werden. Eine Kontrollregion, die für die Expression der für ein Fusionsimmunglobulin codierenden DNA-Sequenz wichtig ist, enthält einen Promotor. Ein geeigneter Promotor ist ein solcher, der in einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle funktionsfähig ist. Der Promotor ermöglicht vorzugsweise eine konstitutive Expression der DNA-Sequenzen, die für das Fusionsimmunglobulin codieren. Der Promotor sorgt außerdem vorzugsweise für eine Menge an Fusionsimmunglobulin, um eine Toleranz zu induzieren und/oder beizubehalten. Geeignete Beispiele von Promotoren umfassen den β-Actin-Promotor, den SV40-Promotor und den LTR-Rous sarcoma-Virus-Promotor.
Zu weiteren Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen zählen Enhancer-Sequenzen und Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen. Enhancer-Sequenzen können kombiniert werden mit und werden gewöhnlich vorgefunden innerhalb von oder angrenzend an Promotorsequenzen. Bestimmte Enhancer-Sequenzen, wie etwa die von SV40, sind in vielen Säugerzellen aktiv und sorgen für eine Stimulation der Transkription bis zum 1000-fachen der homologen oder heterologen Promotoren. Polyadenylierungssequenzen sind stromabwärts der Codierungssequenz zu finden und sorgen für die geeignete Bildung von mRNA. Polyadenylierungssequenzen können von SV40 erhalten werden. Transkriptionsterminations-Sequenzen sind stromabwärts der Polyadenylierungssequenzen innerhalb einiger weniger hundert Nukleotide zu finden.
Diese Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen stehen in handelsüblichen Vektoren zur Verfügung. Eine für ein Fusionsimmunglobulin oder eine Fusionsschwerkette codierende DNA-Sequenz kann mit Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen im Leseraster und in korrekter Orientierung kombiniert werden, indem sie in einen Vektor mit diesen Kontrollregionen subkloniert werden, um eine Expressionskassette zu erhalten.
Vektoren können im Hinblick auf ihre Fähigkeit ausgewählt werden, eine stabile Beibehaltung und/oder Genexpression in einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle zu schaffen. Ein Vektor ist stabil in einer Zelle beibehalten, wenn er für die Expression eines Fusionsimmunglobulins für die Lebensdauer der Zelle sorgen kann. Eine geeignete Beibehaltung kann die Beibehaltung und Expression eines Plasmids in einer eukaryontischen Zelle, vorzugsweise einer Zelle wie einer lymphoiden Zelle, beinhalten. In diesem Fall wird das Plasmid, das eine Expressionskassette enthält, nicht autonom repliziert oder wird nicht in das Chromosom integriert. Die Lebensdauer einer Zelle, z.B. einer lymphoiden Zelle, beträgt etwa 14 bis 60 Tage in der Maus oder kann mehrere Jahre beim Menschen betragen. Ein Plasmid-Vektor, der eine Expressionskassette enthält, kann ebenfalls in einer lymphoiden Zelllinie wie J558L-Zellen beibehalten sein, ohne repliziert zu werden.
Ein Vektor kann auch daraufhin ausgewählt werden, für die Integration der Expressionskassette in das Chromosom der Wirtszelle, wie etwa einer hämopoetischen Zelle, zu sorgen. In einer hämopoetischen Zelle aus dem Knochenmark eines Tiers wird der Vektor in eine gemischte Zellpopulation eingeführt, von denen einige sich teilende Zellen sind und von denen andere noch nicht mit der Teilung begonnen haben. Der Vektor kann sich in das Chromosom integrieren und dann zusammen mit dem Chromosom repliziert und in Zellnachkommen übertragen werden. Der Vektor ist stabil integriert, wenn die Genexpression in der Zellpopulation nach etwa 1 bis 12 Wochen nach Einführung der infizierten Zellen in ein Tier oder der in vitro-Anzucht nachgewiesen werden kann.
Zu geeigneten Vektoren zählen die Plasmide, wie etwa pSNR1, pEMBL, pBR322, pRSA101, pUC118, pUC119, pBluescript und pCom (Barbas et al., PNAS, 88: 7978 (1991)). Zu geeigneten Vektoren zählen außerdem virale Vektoren, wie etwa Baculovirus, und retrovirale Vektoren, wie der MBAE-Vektor (Chambers et al., PNAS, 89: 1026 (1992)). Der bevorzugte Vektor für hämopoetische Zellen ist der MBAE-Vektor.
Ein Bakterienstamm, der einen Plasmid-Vektor mit einer DNA-Sequenz enthält, die für eine Fusionsschwerkette codiert, wurde als E. coli DH5α (pQ3.EZ) bezeichnet. Der Bakterienstamm trägt das Plasmid pQ3.EZ, welches für die Fusionsschwerkette codiert, die ein Epitop von 12–26 Aminosäuren vom λ-C1-Repressorprotein trägt, kombiniert an der ersten N-terminalen Framework-Region der Schwerkette eines für Nitrophenyl spezifischen Antikörpers. Der Bakterienstamm wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, MD, am 7. Februar 1994 hinterlegt und ihm die Zugriffsnummer 69555 zugeordnet.
In einer bevorzugten Version wird eine DNA-Sequenz, die für ein Epitop wie das 12-26-Epitop vom λ-C1-Repressorprotein codiert, mit der DNA-Sequenz kombiniert, die für eine variable Region eines Immunglobulins an der ersten N-terminalen Framework- Region der Schwerkette codiert, um eine für eine Fusionsschwerkette codierende DNA-Sequenz zu bilden. Die für eine Fusionsschwerkette codierende DNA-Sequenz wird mit einem β-Actin-Promotor in einem MBAE-retroviralen Vektor kombiniert. Der Vektor wird vorzugsweise zur Transformation von Knochenmarkszellen oder anderen Zellen von B-Zell-Abstammung, die Leichtketten erzeugen können, verwendet. Die Leichtketten kombinieren sich mit der Fusionsschwerkette zum Erhalt eines Fusionsimmunglobulins. Alternativ könnte eine DNA-Sequenz, die für eine Leichtkette codiert, in denselben Vektor wie dem aufgenommen werden, der für die Fusionsschwerkette codiert, um für die Expression eines Fusionsimmunglobulins zu sorgen.
B. Transformierte Zellen
Vektoren, die für ein Fusionsimmunglobulin codierende Expressionskassetten enthalten, werden um Transformieren von Zellen verwendet. Die transformierten Zellen werden bei Methoden zum Identifizieren neuer tolerogener Epitope und zum Erzeugen eines Fusionsimmunglobulins verwendet. Transformierte Zellen können auch in Tiere zum Induzieren und Beibehalten einer Toleranz gegen das heterologe Epitop eingeführt werden, das durch die transformierten Zellen exprimiert wird, oder gegen ein Antigen, das das heterologe Epitop enthält.
Zu geeigneten Zellen für die Transformation zählen hämopoetische Zellen, lymphoide Zellen und lymphoide Zelllinien. Zu den Zellen zählen Knochenmarkszellen, lymphoide Zellen und die lymphoiden J558L-Zellen. Die Wirtszellen sind vorzugsweise solche, die zum Bilden und Sekretieren von Immunglobulin-Molekülen fähig sind. Die transformierte Zellpopulation enthält vorzugsweise Zellen der B-Zell-Abstammung, wobei dies solche sind, die Leichtketten endogen synthetisieren. Transformierte Zellen, die Tieren verabreicht werden, sind vorzugsweise syngen oder teilen identische Histokompatibilitäts-Antigene, um eine Abstoßung de injizierten Zellen zu vermeiden. Für Screening-Assays sind bakterielle Wirtszellen, wie z.B. E. coli und ähnliche, geeignet.
Der Vektor kann in die Zellen unter Verwendung einer Vielfalt von den Fachleuten des Gebiets bekannten Methoden wie der Calciumphosphat-vermittelten Transfektion, Polybren-vermittelten Transfektion, Protoplast-Fusion, Elektroporation und liposomal vermittelten Transfektion eingeführt werden.
Ist die Expressionskassette einmal in die Zellen eingeführt, so können die transfizierten Zellen durch Nachweis des Vorhandenseins eines selektierbaren Markergens, das auf dem Vektor vorhanden ist, zu Beginn ausgewählt werden. Sind die transfizierten Zellen Knochenmarkszellen oder lymphoide Zellen, so braucht keine Selektion angewendet zu werden. Die transfizierten Zellen können dann auf das Vorhandensein und/oder die Expression der Expressionskassette, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, gescreent werden. In transfizierten Zellen können auf das Vorhandensein einer Expressionskassette unter Anwendung einer oder mehrerer Techniken wie Southernblot, Northernblot, reverse Transkriptase-PC, Westernblot, ELISA und Immunfluoreszenz, gescreent werden. Nachweisbare markierte DNA-Sonden können im Southern- und/oder Northernblot verwendet werden. Die Sonden sind ausreichend komplementär zu Nukleotid-Sequenzen, die für das Epitop oder einen Abschnitt eines Antigens codieren, so dass eine Sonde von etwa 50 bis 100 Nukleotiden unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert. Primer für reverse Transkriptase-PCR können wie zuvor beschrieben entworfen werden, um cDNA-Sequenzen zu amplifizieren, die für die variablen schweren und leichten Ketten des Immunglobulin-Moleküls codieren.
Transfizierte Zellen, in denen das Fusionsimmunglobulin exprimiert werden soll, können ebenfalls unter Anwendung eines Western Blot, ELISA oder von Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Die Mengen der zu exprimierenden Fusionsimmunglobuline können unter Anwendung eines quantitativen Western Blot nachgewiesen werden.
Die Menge an Fusionsimmunglobulin, das in einem bestimmten Wirtszell-Typ und mit einer bestimmten Promotor/Enhancer-Sequenz erzeugt wird, kann unter Anwendung eines quantitativen Westernblot ausgewertet werden. Die Promotor/Enhancer-Sequenzen, die die größte Menge einer konstitutiven Expression des Fusionsimmunglobulins schaffen, können durch Vergleichen der Menge des Fusionsimmunglobulins, die im selben Typ von Wirtszelle über dasselbe Zeitmaß erzeugt wird, bestimmt werden. Ein Promotor/Enhancer kann ausgewählt werden, der eine ausreichende Menge an Fusionsimmunglobulin zum Induzieren und/oder Beibehalten der Toleranz sorgen würde. Die Menge eines Fusionsimmunglobulins, die eine Toleranz induzieren wird, kann gemäß den hierin beschriebenen Faktoren variieren und unter Anwendung standardmäßiger Methoden bestimmt werden.
C. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Wir beschreiben auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine tolerogene Menge eines Fusionsimmunglobulins in einem pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträger enthalten. Das Fusionsimmunglobulin weist mindestens ein heterologes tolerogenes Epitop an der N-terminalen variablen Region des Immunglobulins auf. Vorzugsweise wird das heterologe tolerogene Epitop mit dem Immunglobulin, das an die erste N-terminale Framework-Region der Schwerkette angrenzt, kombiniert. Das Fusionsimmunglobulin wird mit einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger in wirksamen Mengen kombiniert, um eine Toleranz gegen das tolerogene Epitop oder gegen ein das Epitop enthaltendes Antigen in einem Tier zu induzieren. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einem Tier zum Induzieren und/oder Beibehalten einer Toleranz gegen das tolerogene Epitop verabreicht werden. Die Induktion der Toleranz gegen das Epitop oder Epitope kann allergische Reaktionen des Tiers oder die Symptome einer Autoimmunerkrankung minimieren.
Fusionsimmunglobuline können aus transformierten Zellen unter Anwendung standardmäßiger Methoden isoliert werden. Fusionsimmunglobuline können aus Zellüberständen durch Passage durch Protein A- oder andere Affinitätssäulen gemäß standardmäßiger Methoden isoliert werden.
Geeignete tolerogene Epitope sind solche Epitope, die mit allergischen oder Autoimmunreaktionen assoziiert sind. Ein tolerogenes Epitop ist ein solches, das in einer Weise verabreicht werden kann, die zur immunologischen Unempfänglichkeit gegenüber dem Epitop und/oder einem das Epitop enthaltenden Antigen führt. Ist das Epitop ein solches, das eine immundominante Reaktion stimulieren kann, so kann eine Toleranz gegen jenes Epitop ebenfalls zur Toleranz gegen ein das Epitop enthaltendes Antigen führen. Zu spezifischen Beispielen zählen Antigen E oder Antigen K von Traubenkraut-(Ragweed)-Pollen, Staubmilben-Antigene, heterologe Histokompatibilitäts-Antigene, Gerinnungsfaktor VIII, Acetylcholin-Rezeptoren, Myelin-Grundprotein und Thyroglobulin. Das Fusionsimmunglobulin kann ein einzelnes tolerogenes Epitop oder vielfach to lerogene Epitope enthalten. Vorzugsweise ist das tolerogene Epitop ein Epitop, das in der allergischen oder Autoimmunreaktion immundominant ist.
Die Menge des Fusionsimmunglobulins, die zum Induzieren einer Toleranz in einem Tier wirksam ist, hängt von Faktoren ab, doch lässt sich ohne weiteres von einem Fachmann des Gebiets unter Anwendung standardmäßiger Dosis-Wirkungs-Methoden bestimmen. Zu den Faktoren zählen die Größe des zu behandelnden Tiers, Anzahl und Typ der Epitope, Art der Toleranz, Alter des Tiers, Weg und Anzahl der Verabreichungen und Dauer der gewünschten Toleranz.
Das Alter des Tiers kann ein wichtiger Faktor in der Bestimmung der wirksamen tolerogenen Menge eines Epitops sein. Ein neugeborenes oder Jungtier kann etwa 100- bis 1000-mal weniger einer Einzeldosis eines Fusionsimmunglobulins bei intravenöser Verabreichung benötigen als für ein ausgewachsenes Tier erforderlich, um eine Toleranz gegenüber dem Epitop zu induzieren.
Eine tolerogene Menge eines Fusionsimmunglobulins hängt auch von der Größe des Tiers ab und ist typischerweise etwa 10- bis 100-fach höher (für B-Zell-Toleranz) als die Menge an Antigen und/oder Epitop, die dem Tier zur Auslösung einer schützenden Immunreaktion verabreicht wird, außer in dem Fall einer Toleranz bei niedriger Dosis. Eine tolerogene Menge eines Antigens pro Einheit Masse beträgt typischerweise etwa 1 bis 40 mg/kg Körpergewicht, um eine Hochdosis-Toleranz für ein Epitop oder Antigen zu induzieren, das als eine Einzeldosis einem Tier intravenös verabreicht wird. Eine Niederdosis-Toleranz wird in einigen Fällen ebenfalls beobachtet und kann nach mehrfachen (> 4) Dosen von Submikrogramm-Mengen in Salzlösung bei wöchentlichen Intervallen intraperitoneal oder intravenös erhalten werden.
Ein anderer Faktor, der die tolerogene Menge eines Fusionsimmunglobulins variieren kann, ist der, ob das Fusionsimmunglobulin mehr als ein Epitop enthält und ob diese Epitope immundominant sind. Weist das Fusionsimmunglobulin mehrfache Epitope auf, von denen einigen immundominant sind, so kann eine 10-fach geringere Dosis des Fusionsimmunglobulins bei Verabreichung als einer intravenösen Einzeldosis eine Toleranz bei einem Tier induzieren.
Die tolerogene Menge eines Fusionsimmunglobulins kann außerdem in Abhängigkeit davon variieren, ob eine T-Zell- oder B-Zell-Toleranz erwünscht ist. Typischerweise erfordert eine T-Zell-Toleranz eine etwa 10- bis 100-fach geringere Dosis des Antigens oder Epitops als die B-Zell-Toleranz gegen dasselbe Epitop oder Antigen.
Ein weiterer Faktor ist das Fortbestehen des Fusionsimmunglobulins im Kreislaufsystem des Tiers. Ein langsamer metabolisiertes Antigen schafft eine Beibehaltung der Toleranz über längere Zeiträume, nämlich typischerweise vom etwa 2- bis 10-fachen der Zeit der Beibehaltung der Toleranz. Die katabolische Rate der Epitope oder Antigene hängt von der Halbwertszeit des homologen oder des heterologen Trägerimmunglobulins ebenso wie der Natur des Epitops oder der Epitope ab. Die Halbwertszeit des homologen oder heterologen Immunglobulins beträgt etwa 7 bis 21 Tage (Maus). Epitope mit modifizierten oder ungewöhnlichen Aminosäuren, wie etwa D-Aminosäuren, ebenso wie komplexe Antigene oder Epitope, werden möglicherweise nicht ebenso schnell wie andere Arten von Epitopen abgebaut.
Die Verabreichungsform kann ebenfalls die tolerogene Menge des erforderlichen Fusionsimmunglobulins beeinflussen. Im üblichen Falle stellt die intravenöse Verabreichung den bevorzugten Weg zur Induzierung der Toleranz dar. Die Anzahl der Verabreichungen des Antigens kann ebenfalls die Menge des pro Verabreichung erforderlichen Fusionsimmunglobulins beeinflussen.
Eine wirksame tolerogene Menge für ein bestimmtes heterologes tolerogenes Epitop auf einem Fusionsimmunglobulin kann mittels Durchführung von in vivo- oder in vitro-Dosis-Wirkungs-Assays bestimmt werden. Die in vitro-Dosis-Wirkungs-Assays können zum Beispiel unter Anwendung eines standardmäßigen Lymphozyten-Prolifertions-Assays vorgenommen werden. Zum Beispiel können Lymphozyten von einem allergischen oder autoimmunen Tier mit unterschiedlichen Dosen des Fusionsimmunglobulins kombiniert und die Vermehrung gemessen werden.
Die in vivo-Dosisreaktion kann durch Verabreichung unterschiedlicher Dosen des Fusionsimmunglobulins in einem Arzneimittelträger an ein Tier bestimmt werden. Das Feh len einer Immunreaktivität auf das heterologe tolerogene Epitop kann durch Messen der spezifischen Antikörperreaktion auf das heterologe tolerogene Epitop oder der Lymphozytenvermehrung auf eine Provokationsdosis des Fusionsimmunglobulins bestimmt werden.
Die Induktion der Toleranz wird durch Messen einer Abnahme der immunologischen Unempfänglichkeit ausgewertet. Methoden zur Messung der immunologischen Reaktivität können unter in vivo- oder in vitro-Antigen-Präsentation und -Provokation vorgenommen werden und sind den Fachleuten des Gebiets bekannt. Zum Beispiel kann die Menge an für das Epitop und/oder Antigen spezifischem Antikörper, ebenso wie die Lymphozytenvermehrung als Reaktion auf eine Provokation mit dem Epitop oder Fusionsimmunglobulin, gemessen werden. Die Abnahme der immunologischen Reaktion, was anzeigt, dass eine Toleranz induziert wurde, kann eine etwa 2-fache bis 100-fache, vorzugsweise etwa 20-fache bis 100-fache Verminderung der Antikörper- oder Lymphozyten-Reaktivität sein. Der Bereich der Abnahme kann in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit des zur Messung der immunologischen Reaktivität angewendeten Assays variieren. Zum Beispiel ist bekannt, dass eine Abnahme der Zahl der Antikörpererzeugenden Zellen empfindlicher ist als die Abnahme der Menge an Antikörper. Der Bereich der Abnahme kann außerdem variieren, wenn das Epitop ein immundominantes Epitop ist. Eine zweifache Veränderung der Reaktivität auf ein immundominantes Epitop kann zu signifikanten Toleranzhöhen gegen das Epitop und/oder ein Antigen, das das Epitop enthält, führen.
Eine Einzeldosis eines Fusionsimmunglobulins kann eine Toleranz induzieren. In einigen Fällen kann die in der Maus durch eine Einzeldosis induzierte Toleranz etwa 2 Monate bis etwa 6 Monate anhalten. Um allerdings eine Toleranz in einem Tier beizubehalten, sind typischerweise vielfache Dosen erforderlich. Die Beibehaltung der Toleranz kann über zumindest jenen Zeitraum hinweg erwünscht sein, der durch eine Einzeldosis des Fusionsimmunglobulins induziert wird, oder für die gesamte Lebensspanne des Tiers.
Eine tolerogene Menge des Fusionsimmunglobulins wird mit einem physiologischen Arzneimittelträger wie Salzlösung, gepufferte Salzlösung und inkomplettes Freund- Adjuvans kombiniert. Das Fusionsimmunglobulin kann auf zahlreichen Wegen verabreicht werden, wie etwa auf dem intraperitonealen, oralen und intravenösen, wird aber vorzugsweise auf dem intravenösen Weg verabreicht. Die zur Induzierung einer Toleranz gegen Allergene oder Autoantigene behandelbaren Tiere sind Mäuse, Menschen, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen.
D. Methoden zum Identifizieren von Epitopen, die als Tolerogene dienen können
Wir beschreiben ebenfalls Methoden zum Identifizieren von Epitopen, die als toleranzbildende Epitope dienen können. Die Identifikation neuer tolerogener Epitope könnte für die Diagnose und Behandlung von autoimmunen und allergischen Immunreaktionen nützlich sein. Eine Methode beinhaltet die Schritte der Bereitstellung eines Vektors, einschließlich einer DNA-Sequenz, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, das operabel an Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen geknüpft ist, die in einer Wirtszelle funktionsfähig sind. Das Fusionsimmunglobulin weist mindestens ein heterologes Epitop an der N-terminalen variablen Region auf. Das Epitop kann ein solches sein, bei dem die Fähigkeit zum Induzieren einer Toleranz vermutet wird. Die Zellen werden mit dem Vektor stabil transformiert, wie zuvor beschrieben. Transformierte Zellen, die das Fusionsimmunglobulin oder das isolierte Fusionsimmunglobulin exprimieren, werden auf ihr Immunreaktionsvermögen mit Immunserum oder Lymphozyten von allergischen oder autoimmunen Tieren analysiert. Die Toleranzinduktion gegen ein Fusionsimmunglobulin, wie durch Reaktivität mit Immunserum oder Lymphozyten bei autoimmunen oder allergischen Tieren identifiziert, kann mittels den Fachleuten des Gebiets bekannten in vitro- oder in vivo-Methoden ausgewertet werden. Zum Beispiel können Fusionsimmunglobuline, die mit Immunserum reagieren und/oder eine Lymphozytenvermehrung stimulieren, einem Tier verabreicht werden, und die Induktion und Beibehaltung der Toleranz kann wie hierin beschrieben beurteilt werden.
Bei einer anderen Methode können die transformierten hämopoetischen oder lymphoiden Zellen in ein Tier eingeführt werden, und kann die Induktion und Beibehaltung der Toleranz gegen das heterologe Epitop unter Anwendung von Assays zur Auswertung der spezifischen immunologischen Reaktivität gegen das Epitop bestimmt werden, wie zuvor beschrieben.
Einige Epitope und Antigene sind dafür bekannt, dass sie Immunreaktionen auslösen. Einige Epitope und Antigene sind dafür bekannt, dass sie immundominante Immunreaktionen auslösen, die mit allergischen oder autoimmunen Immunreaktionen in Verbindung stehen. Solche Epitope, die Immunreaktionen auslösen, können eine Toleranz induzieren oder auch nicht, wenn sie in einem Fusionsimmunglobulin präsentiert werden. Die Epitope einiger Antigene, die dafür bekannt sind, dass sie mit allergischen oder autoimmunen Immunreaktionen in Verbindung stehen, sind bisher nicht identifiziert worden. Die Methoden der Erfindung können angewendet werden, um zu bestimmen, ob ein Epitop, das für seine Auslösung einer Immunreaktion bekannt ist, eine Toleranz induzieren kann, wenn es in einem Fusionsimmunglobulin präsentiert wird, oder um neue tolerogene Epitope von Antigenen zu identifizieren.
Bei einer Methode wird ein Vektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein Fusionsimmungloublin codiert, welches operabel an Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen geknüpft ist, die in der hämopoetischen oder lymphoiden Zelle funktionsfähig sind, zu einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle transformiert. Das Fusionsimmunglobulin kann ein Epitop, das für seine Auslösung einer Immunreaktion bekannt ist, oder ein neues tolerogenes Epitop enthalten. Die Promotor/Enhancer-Sequenzen sorgen vorzugsweise für die Expression des Fusionsimmunglobulins in einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle bei einer ausreichenden Höhe, um eine Toleranz gegen das Epitop in vivo oder in vitro zu induzieren. Solch ein Promotor kann in einem in vitro-Assay identifiziert oder gescreent werden, wie hierin beschrieben. Die Menge an Fusionsimmunglobulin, die eine Toleranz in Tieren induzieren kann, lässt sich unter Anwendung einer standardmäßigen Dosis-Wirkungs-Methodik bestimmen.
Die transformierten Zellen werden in ein Tier eingeführt. Wenn transformierte hämopoetische Zellen in ein Tier eingeführt werden, so wurde das Tier vorzugsweise vor Einführung der transformierten Zellen bestrahlt, um endogene hämopoetische Zellen zu zerstören. Die transformierten Zellen werden einem Tier durch intraperitoneale oder intravenöse Injektion verabreicht. Die Tiere werden dann zur Induktion einer Toleranz gegen das Epitop nach etwa 2 bis 20 Tagen analysiert. Die Toleranz kann durch Messen der spezifischen Antikörperreaktion oder Lymphozyten-Vermehrungsreaktion auf das heterologe tolerogene Epitop nachgewiesen werden. Eine Abnahme der spezifi schen Antikörper- oder Lymphozyten-Vermehrungsreaktion auf das Epitop vom etwa 2- bis 100-fachen, vorzugsweise 10- bis 100-fachen, zeigt eine Toleranz gegenüber dem Epitop an.
Vorzugsweise werden die Screening-Assays zum Identifizieren von tolerogenen Epitopen in Mäusen vorgenommen. Die transformierten Zellen können syngene Mauszellen sein, die von einer anderen genetisch identischen Maus stammen, oder können humane hämopoetische oder lymphoide Zellen sein. Zum Beispiel können Screnning-Assays unter Verwendung von humanem Knochenmarksgewebe vorgenommen werden, das mit einem Vektor transformiert wurde. Das humane Knochenmarksgewebe wird dann immundefizienten Mäusen, wie z.B. den SCID-SCID-Mäusen, gemäß der von Chambers et al., zitiert supra, beschriebenen Methode verabreicht. Die Toleranz kann in den SCID-SCID-Mäusen durch Untersuchen entweder der spezifischen Antikörperreaktion auf das Epitop oder der Lymphozyten-Vermehrungsreaktion ausgewertet werden.
Wir beschreiben außerdem das Screening auf neue Tolerogene, vorzugsweise solche, die mit autoimmunen oder allergischen Immunreaktionen assoziiert sind. Bei dieser Methode werden Epitope von Antigenen, die mit allergischen oder autoimmunen Reaktionen verbunden sind, auf ihr Immunreaktionsvermögen mit Immunserum oder zum Stimulieren der Lymphozytenvermehrung von Tieren mit einer allergischen oder autoimmunen Reaktion gescreent. Zum Beispiel können verschiedene cDNA-Sequenzen, die für Abschnitte eines komplexen Antigens codieren, wie etwa Gerinnungsfaktor VIII, mit einer DNA-Sequenz kombiniert werden, die für die N-terminale variable Region eines Antikörpers codiert, zum Erhalt einer Bank von cDNA-Sequenzen, die für Fusionsimmunglobuline mit verschiedenen, von Gerinnungsfaktor VIII abgeleiteten Epitopen codieren. Die für die Epitope codierenden DNA-Sequenzen können willkürlich erzeugt werden, oder können zur Codierung einer überlappenden linearen Aminosäuresequenz ausgewählt werden, oder können auf der Grundlage der Wahrscheinlichkeit ausgewählt werden, dass die durch die DNA-Sequenz codierten Aminosäuren auf der Oberfläche des Gerinnungsfaktor VIII-Moleküls exponiert sind (basierend auf der Tertiärstruktur). Die für verschiedene Abschnitte des Antigens codierenden cDNA-Sequenzen können mit cDNA-Sequenzen für die N-terminate variable Region eines Immunglobulins, vor zugsweise an der ersten N-terminalen Framework-Region der Schwerkette kombiniert werden, wie zuvor beschrieben.
Ein Phagemid-Vektorsystem, wie etwa pComb, kann zur Generierung einer cDNA-Bank von Schwer- und Leichtketten von Antikörpern mit cDNA-Sequenzen, die für verschiedene Abschnitte eines Antigens codieren, verwendet werden, wie oben beschrieben. Der Phagemid-Vektor kann zum Tragen dieser cDNA-Sequenzen unter Anwendung eines standardmäßigen Restriktionsenzym-Verdaus und von Ligationsmethoden konstruiert werden, wie beschrieben bei Barbas et al., PNAS, 88: 7978 (1991). Die Phagemid-Bank kann auf die Immunreaktivität mit Immunserum von allergischen oder autoimmunen Tieren in einem Panning- und/oder Filter-Westernblot-Assay ähnlich dem von Barbas et al., zitiert supra, beschriebenen gescreent werden.
Kurz dargestellt werden die Phagemid-Vektoren, die die Fab-Fragmente mit mindestens einem heterologen Epitop tragen, das von einem Antigen stammt, in einen E. coli-Stamm transformiert. Der E. coli-Stamm wird in Gegenwart von Antikörpern zur Auswahl jener Stämme gezüchtet, die den Phagemid-Vektor tragen. Der Phage kann isoliert und dann auf die Bindung an Zellen gescreent werden, die mit Immunserum von einem allergischen oder autoimmunen Tier überzogen sind, wie beschrieben von Barbas et al., zitiert supra. Adhärente Phagen werden unter Verwendung von Elutionspuffer eluiert. Der eluierte Phage kann in E. coli-Zellen übertragen und die Kolonien auf das Vorhandensein eines Phagemids, der ein Fab-Fragment mit einem heterologen Epitop trägt, unter Verwendung eines Filter-Westernblot-artigen Assays mit Immunserum von einem allergischen oder autoimmunen Tier untersucht werden.
Die Phagemid-DNA von positiven Klonen kann isoliert werden und die für das Fusions-Fab codierende DNA-Sequenz in einen Vektor subkloniert werden, der zum Transformieren von hämopoetischen oder lymphoiden Zellen verwendet werden kann. Der Vektor kann zusätzliche DNA-Sequenzen enthalten, so dass ein Fusionsimmunglobulin und nicht das Fab-Fragment durch die transformierten Zellen produziert wird. Das Fusionsimmunglobulin mit einem heterologen Epitop, das mit Immunserum von allergischen oder autoimmunen Tieren reagiert, von einem wie beschrieben identifizierten positiven Klon kann isoliert und auf sein Induktionsvermögen der Toleranz in vitro oder in vivo getestet werden. Alternativ können transformierte Zellen, die solch einen Vektor tragen, in ein Tier eingeführt werden, und kann die Induktion der Toleranz in vivo wie hierin beschrieben bestimmt werden.
Sind einmal neue Epitope und/oder Fusionsimmunglobuline, die eine Toleranz induzieren können, identifiziert, so können diese in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Methoden zur Toleranzbildung in Tieren gegen die Epitope verwendet werden. Alternativ könnte die Identifikation neuer tolerogener Epitope, die mit autoimmunen oder allergischen Immunreaktionen assoziiert sind, in standardmäßigen diagnostischen Assays zur Bewertung des Vorhandenseins von autoimmunen oder allergischen Immunreaktionen oder zur Überwachung der Wirksamkeit der Behandlung verwendet werden.
E. Methoden zur Toleranzbildung in Tieren gegen ein Epitop
Mit der Erfindung werden auch Methoden zum Induzieren und Beibehalten der Toleranz gegen ein Epitop in einem Tier beschrieben. Gemäß der Erfindung kann die Toleranz in einem Tier durch Einführung von transformierten hämopoetischen oder lymphoiden Zellen, die das Fusionsimmunglobulin produzieren, in das Tier induziert und beibehalten werden. Wir beschreiben außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung einschließlich eines Fusionsimmunglobulins, welches einem Tier wie zuvor beschrieben verabreicht wird. Ohne die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die fortdauernde Produktion von Fusionsimmunglobulin, das das heterologe Epitop trägt, durch die transformierten Zellen in vivo die Beibehaltung der Toleranz ebenso gut oder besser als unter Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung des Fusionsimmunglobulins ermöglichen kann.
Bei einer Methode wird ein Vektor, der für ein Fusionsimmunglobulin codiert, das stabil in einer hämopoetischen oder lymphoiden Zelle beibehalten werden kann, bereitgestellt. Das Fusionsimmunglobulin weist mindestens ein heterologes tolerogenes Epitop auf. Hämopoetische oder lymphoide Zellen, wie etwa periphere Blutzellen, werden mit einem Vektor, wie etwa MBAE unter Verwendung von Polybren, transformiert. Transformierte Zellen werden typischerweise nicht ausgewählt, sondern die gesamte Population an hämopoetischen oder lymphoiden Zellen dem Tier verabreicht. Transformierte Zellen können dann auf die Produktion eines Fusionsimmunglobulins in vivo oder in vitro durch Nachweisen des Vorhandenseins eines Fusionsimmunglobulins unter Verwendung von Antikörpern oder durch Nachweisen der Expression der Fusionsimmunglobulin-mRNA unter Verwendung von RT-PCR oder Northernblots ausgewertet werden. Vorzugsweise wird die transformierte Zellpopulation in vitro auf die Produktion von Fusionsimmunglobulin bei einer Menge analysiert, die ausreicht, um eine Toleranz gegen das heterologe Epitop in einem Tier zu induzieren und beizubehalten.
So präparierte transformierte Zellpopulationen, das das Fusionsimmunglobulin in ausreichender Menge produziert wird, um eine Toleranz zu induzieren und/oder beizubehalten, werden in ein Tier eingeführt. Die Menge an in das Tier eingeführten Zellen entspricht jener Menge, die für die Produktion eines Fusionsimmunglobulins in einer ausreichenden Höhe sorgt, um eine Toleranz zu induzieren und vorzugsweise die Toleranz beizubehalten. Das Tier wird auf die Induktion und das Fortbestehen der Toleranz gegen das heterologe Epitop unter Verwendung von zuvor beschriebenen Assays überwacht. In einigen Fällen werden die Tiere in ausreichendem Umfang bestrahlt, um endogene hämopoetische oder lymphoide Zellen vor Einführung der transformierten Zellpopulationen zu zerstören. Ein Tier wird als tolerant gegen das Epitop erachtet, wenn eine etwa 2- bis 100-fache Abnahme der immunologischen Reaktivität, wie z.B. der Lymphozytenvermehrung oder Antikörperreaktion, erkennbar ist. Die Toleranz wird als beibehalten erachtet, wenn der tolerante Zustand mindestens so lange beibehalten bleibt, wie der mit einer einzelnen intravenösen Injektion einer tolerogenen pharmazeutischen Zusammensetzung induzierte tolerante Zustand währt. Bei Mäusen kann eine Einzelinjektion einer tolerogenen Menge eines Fusionsimmunglobulins zu einer Toleranz von etwa 2 bis 20 Tagen und bis hin zu etwa 2 Monaten bis 6 Monaten führen. Die Toleranz könnte für die gesamte Lebensdauer des Tiers beibehalten bleiben.
Zu geeigneten transformierten Zellen zählen Knochenmarkszellen und lymphoide Zellen von Mäusen oder Menschen. Zu geeigneten Tieren zählen Inzucht-Stämme von Mäusen, einschließlich immundefizienter Mäuse wie den SCID-SCID-Mäusen. Die Induktion und Beibehaltung einer Toleranz gegen Epitope unter Verwendung von humanen transformierten Zellen kann durch die Entwicklung einer Toleranz gegen Epitope in humanen transformierten Zellpopulationen, die SCID-SCID-Mäusen verabreicht wurden, ausgewertet werden. Andere transformierte Tierzellen, wie etwa transformierte Rinderzellen, können ebenfalls auf die Induktion einer Toleranz in SCID-SCID-Mäusen ausgewertet werden.
Bei einer anderen Methode kann eine tolerogene Menge eines Fusionsimmunglobulins zum Induzieren einer Toleranz verwendet und die Toleranz durch Verabreichung von transformierten hämopoetischen oder lymphoiden Zellen, die dasselbe Fusionsimmunglobulin exprimieren, beibehalten werden. Bei der Methode kann eine tolerogene Menge eines Fusionsimmunglobulins als eine Einzeldosis verabreicht werden, wie hierin beschrieben. Nach Erreichung eines Zustandes von immunologischer Unempfänglichkeit können transformierte hämopoetische oder lymphoide Zellen, die das Fusionsimmunglobulin exprimieren, dem Tier verabreicht werden. Obschon keine Einschränkung der Erfindung beabsichtigt ist, wird davon ausgegangen, dass die transformierten hämopoetischen oder lymphoiden Zellen zur Beibehaltung der Toleranz gegen das Epitop führt. Die Menge an Fusionsimmunglobulin, die exprimiert werden muss, wenn transformierte Zellen zur Beibehaltung und nicht zur Induzierung einer Toleranz verwendet werden, kann geringer sein als bei Zellen erforderlich, die eine Toleranz sowohl induzieren als auch beibehalten. Typischerweise ist die Verabreichung einer etwa 10- bis 100-fach geringeren Menge an Fusionsimmunglobulin oder Antigen zur Beibehaltung der Toleranz erforderlich als bei der Induktion.
BEISPIEL 1
Präparierung von Fusionsimmunglobulin-p12-26-rekombinanten Konstrukten
Die Toleranz gegen das Epitop, welches die Reste 12-26 des Bakteriophagen-λ cl-Proteins umfasste, wurde untersucht, da dieses Epitop sowohl von T- als auch B-Zellen erkannt werden kann und es das immundominante Haupt-Epitop dieses Proteins in H-2^d-Mäusen ist. Dieses Epitop wurde in einem Fusionsprotein von Maus-IgG mit dem Epitop am N-Terminus exprimiert. Homologes IgG1 wurde für das Fusionsprotein ausgewählt, da es als ein tolerogener Träger bekannt ist. Homologe Immunglobuline (insbesondere IgGs) stellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur Vernetzung mit B-Zell-Fc-Rezeptoren und zum Fortbestehen im Kreislaufsystem, als auch dem Fehlen von "intrinsischer Immunogenität", d.h. dem Fehlen des Potenzials, eine Immunreaktion in einer löslichen Form hervorzurufen, mit einiger Wahrscheinlichkeit effiziente tolerogene Träger dar. DNA-Konstrukte, die für ein Fusionspolypeptid des Immunglobulins IgG, das das 12-26-Epitop von λ cl-Repressorprotein enthält, codieren, wurden durch Modifizieren von Plasmid-pSNR-1 erhalten. (Siehe 1.)
Das immundominante Haupt-Peptid des λ cl-Repressorproteins (Reste 1-102) wird an Resten 1-26 gefunden, wie beschrieben in Nature, 343: 381 (1990). Die für dieses Peptid-Fragment codierende DNA-Sequenz wurde mittels standardmäßiger automatisierter Methoden synthetisiert. Das synthetische Oligonukleotid-Fragment, das für das 12-26-Epitop codiert, weist die folgende Sequenz auf (SEQ ID NR: 1):
Die durch dieses Fragment codierte entsprechende Aminosäuresequenz ist:
Plasmid pSNR-1 ist ein Plasmid, das eine DNA-Sequenz enthält, die für die variable Schwerketten-Domäne (VH) und Schwerketten-konstante Regionen 1-3 (CH1-3) von einem für 4-Hydroxy-3-nitrophenyl spezifischen murinen Immunglobulin codiert. Plasmid pSNR-1 wurde konstruiert, wie beschrieben von Ballard et al., PNAS, 83: 9626 (1986). Das pSNR-1-Plasmid wurde erhalten von Douglas Fearon (John Hopkins, Baltimore, MD). Um die für das 12-26-Epitop codierende DNA-Sequenz in den N-Terminus der variablen Schwerkette einzuführen, wurde das Plasmid pSNR wie nachstehend beschrieben manipuliert. Eine 1,3 kbp-Region des pSNR-1-Plasmids, umfassend die Codierungssequenz für VH, 118 bp der DNA-Sequenz 5'-stromaufwärts der VH-Codierungssequenz, die für ein Promotorelement codiert, und 3'-stromabwärts gelegene Intron und IgH-Enhancer-Sequenzen, wurde unter Anwendung standardmäßiger Methoden subkloniert. Diese Sequenz ist zwischen Restriktionsenzymstellen BamHI und EcoRI definiert und wurde in das Plasmid pBS (Stratagene) unter Verwendung von BamHI- und EcoRI-Restriktionsendonukleasen subkloniert. Das pBS/VH wurde mit PstI unter Bedingungen verdaut, um ein einmal geschnittenes PstI-teilverdautes Fragment zu isolieren, wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, zitiert supra.
Das 12-26-Epitop wurde modifiziert und dann in die VH-Region des Immunglobulins an einer Lokalisation eingeführt, die für eine korrekte Faltung jener Region sorgte. Die für das 12-26-Epitop codierende DNA-Sequenz wurde durch Hinzufügen der Codierungssequenz für die ersten 5 Aminosäuren der Framework-Region (FRI) der VH-Codierungssequenz am 3'-Ende der synthetischen DNA-Sequenz, die für das 12-26-Epitop codierte, modifiziert. Diese Modifikation ermöglichte die korrekte Faltung und wurde ausgewählt, um zu einer minimalen Zerstörung der Tertiärstruktur des Immunglobulin-Moleküls zu führen. Die Regionen des Ig-Moleküls, die wahrscheinlich die Stellen sind, an denen die Insertion eines Epitops das Molekül wahrscheinlich nicht zerstören, können durch Analyse der Aminosäuresequenz des Ig-Moleküls als auch der Tertiärstruktur bestimmt werden. Die N-terminalen und CDR-Regionen an der Ig-Kette sind vorzugsweise Regionen, in die die Epitope bei einer minimalen Zerstörung der Tertiärstruktur inseriert werden können. Die Insertion an der N-terminalen Region ermöglicht die Insertion eines größeren Polypeptids ≥ 10 kDa.
Die modifizierte 12-26-Sequenz einschließlich der Sequenz für die ersten fünf Aminosäuren der ersten Framework-Region der VH wurde mittels Polymerasekettenreaktion erhalten. Ein Plasmid, das die Nukleotidsequenz von 45 Basenpaaren, die für das 12-26-Epitop codiert, enthielt, wurde durch Klonieren der synthetischen 45 Basenpaar-DNA-Sequenz in die BamHI/ClaI-Stelle eines Plasmids pPX1647 konstruiert, das das H-Id-Flagellin-Gen enthielt (zur Verfügung gestellt von Dr. P. Brey, Praxis-Lederle Corp.), ein Derivat-Plasmid von pUC119. Die modifizierte 12-26-Sequenz wurde unter Anwendung von PCR-Techniken und zweier Primer amplifiziert.
Die Primer wurden als OS-1 und OS-2 bezeichnet. Der Primer OS-1 enthält die Codierungssequenz für die PstI-Stelle und die Codierungssequenz für die ersten 5 Aminosäuren der 12-26-Sequenz. Die Sequenz von OS1 (SEQ ID NR: 3) ist:
Der Primer OS-2 war zur Codierungssequenz für die PstI-Stelle und zur Codierungssequenz für die ersten 5 Aminosäuren der ersten Framework-Region der VH und den letzten 6 Aminosäuren der 12-26-Sequenz komplementär. Die Sequenz für OS-2 (SEQ ID NR: 4) ist:
Das 82-bp-Produkt der PCR-Methode, d.h. die modifizierte 12-26-Sequenz, wurde mittels Feinsieb-Agarose unter Anwendung standardmäßiger Methoden isoliert.
Das 82 Basenpaar-PCR-Fragment wurde mit PstI verdaut, um ein 65 bp-Fragment zu erzeugen, das für das modifizierte 12-26-Epitop einschließlich der ersten 5 Aminosäuren von FR1 codierte. Das 65 bp-Fragment wurde in das Plasmid pVS an einer pST1-Stelle subkloniert. Die Subklonierung erfolgte durch Verdau der modifizierten 12-26-Sequenz mit PstI. Die ausgewählten Plasmide, die das PstI-Fragment der modifizierten 12-26-Sequenz enthielten, wurden sequenziert, um das Vorhandensein jenes Fragments in korrigierter Orientierung zu bestätigen. Plasmide, die die modifizierte 12-26-Sequenz enthielten, werden als pBS/12-26 bezeichnet und wurden zur Bestätigung der Struktur sequenziert.
Das modifizierte 12-26-Fragment von pBS/12-26 wurde in pBS/VH subkloniert. Die Subklonierung wurde durch anfängliche Vornahme eines PstI-Teilverdaus des pBS/VH vorgenommen, um die VH-Region an einer PstI-Stelle zu schneiden, welche an der Codierungssequenz für die ersten Framework-Aminosäuren 4 und 5 von VH lokalisiert ist. Das pBS/12-26 wurde mit PstI vollständig verdaut. Nach der Ligation wurden die Plasmide, die die modifizierte 12-26-Sequenz eingeführt nach der Codierungssequenz für die ersten 5 Aminosäuren der ersten Framework-Region der VH enthielten, durch Filterhybridisation der Bakterienkolonien unter Verwendung eines P³²-markierten 12-26-Oligonukleotids als Sonde ausgewählt. Die resultierende VH-Fusionssequenz ist wie folgt: L-FRI-12-26-FRI (L = Leadersequenz; FRI = die ersten 5 Aminosäuren der ersten Framework-Region der VH). Eine doppelsrängige Sequenzierung wurde zur Bestätigung der Insertion an der korrekten Stelle ebenso wie der Orientierung vorgenommen. Diese Plasmide sind als pBS/VH/12-26 bezeichnet.
Das Vorhandensein der VH/12-26-rekombinanten Sequenz im Plasmid wurde mittels DNA-Sequenziermethodiken verifiziert. Die VH-DNA-Sequenz, die das modifizierte 12-25-Insert umgibt und enthält (SEQ ID NR: 5), ist wie folgt:
Die modifizierte 12-26/VH-Rekombinante von pBS/VH/12-26 wurde in ein Plasmid pSV2-neo an den BamHI/EcoRI-Stellen subkloniert. Das pSV-2-neo-Plasmid ist von pSNR hergeleitet (Dr. Al Bothwell, Yale University, New Haven, CT) und enthält das V_H (NP-bindend), eingefügt in eine IgG₁-Schwerkette. Das 8,5 kbp-EcoRI-Fragment von pSNR-1, welches die konstanten Regionen 1-3 (CH1-3) der α₁-Kette enthält, wurde ebenfalls in pSV2-neo subkloniert. Die Deletion einer 8,5 kbp-Region zwischen den EcoRI-Stellen von Plasmid pSNR-1, welche die CH1-3-Codierungssequenz enthält, wurde unter Anwendung standardmäßiger Techniken ausgeführt, wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1: Ergänzung 3.1.3., John Wiley & Sons (1989). Das komplette Plasmid enthält die Sequenz, die für die variable Schwerkette codiert, mit der 65 Basenpaar-Sequenz, die für das 12-26-Epitop codiert, eingeführt an der ersten N-terminalen Framework-Region der variablen Schwerkette, und die Sequenz, die für die (CH1-3)-konstanten Regionen 1-3 codiert. Die Orientierung der modifizierten variablen Regionsequenz und der konstanten Regionen wurde mittels Southern-Restriktionsanalyse verifiziert, wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, zitiert supra. Erfolgreiche Rekombinante wurden mittels Ampicillin ausgewählt, und Plasmid-Präparate wurden unter Anwendung standardmäßiger Methoden in großem Maßstab gezüchtet.
BEISPIEL II
Expression von Fusionsimmunglobulin-p12-26-rekombinanten Konstrukten
Die rekombinanten Plasmide, die die Codierungssequenz sowohl für die VH/12-26-Fusion als auch die CH1-3 von IgG1 enthielten, wurden in Wirtszellen eingeführt, und die Expression des Fusionsproteins wurde nachgewiesen. Die Transformation und Detektion der Expression wurde unter Anwendung standardmäßiger Methoden durchgeführt, wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, zitiert supra.
Das 12-26-IgG1-DNA-Konstrukt (Q3), als auch das Kontroll-pSNR-Konstrukt (P6), wurden in J558L-Myelomzellen elektroporiert, die lediglich λ-Leichtketten synthetisieren. Stabile Integranten wurden zur Zucht in Gegenwart des Antibiotikums G418 ausge wählt. Transfektome, die das 12-26-IgG1-Fusionsprotein exprimieren, wurden durch Analyse der Zellkulturüberstände mittels Westernblot und ELISA identifziert.
Die Transfektome wurden zu hoher Dichte in serumfreiem Medium (RPMI-1640 mit 5 FCS) in Rollflaschen und in Massenkultur gezüchtet. Die Ausreinigung aus den serumfreien Transfektom-Überständen wurde über die Bindung mit Protein-A-Sepharose bei pH 8 mit Elution bei pH 4 als auch mit Anti-Maus-IgG-Affinitätssäulen erfolgreich vorgenommen.
Gereinigte Überstände von ausgewählten Klonen wurden zur Expression von 12–26-Epitopen durch Western Blotting und ELISA mittels standardmäßiger Methoden analysiert. (Siehe 2 und 3.) Für das Western Blotting wurden die Proben auf 10% SDS-PAGE elektrophoretisch behandelt. Die Gele wurden auf Nitrocellulose übertragen und mit Anti-Maus-IgG (linke Spuren) oder Anti-12-26-monoklonalem Antikörper B3.11 (rechte Spuren) plus alkalische Phosphatase-konjugierten Antikörpern als sekundäre Reagenzien geprüft. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Lediglich jene Zellkultur-Überstände von Transfektomen, die das 12-26-IgG1-Konstrukt (Q3) enthielten, reagierten mit für Maus-IgG spezifischen Antikörpern (linke Spuren) und für das 12-26-Epitop spezifischen Antikörpern (rechte Spuren).
Für ELISA-kompetitive Inhibitionsassays wurde vortitrierter monoklonaler Antikörper B3.11 mit zunehmenden Mengen des 12-26-Peptids oder des 12-26-Peptids in chemischer Kopplung an Kaninchen-Gammaglobulin (RGG/12-26) oder 12-26-IgG1 (Q3) gemischt. Das Bindungsvermögen der Gemische an immobilisiertes 12-26-Peptid wurde mittels standardmäßiger Methoden bestimmt. Die in 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass das 12-26-IgG-Fusionsprotein zur wirksamen Hemmung der Bindung des monoklonalen Antikörpers an das 12-26-Epitop im Vergleich zum 12-26-Peptid in Lösung fähig war.
Die kompetitiven ELISA-Inhibitionsstudien zeigen, dass diese Fusionsimmunglobuline wirksam mit freiem synthetischem Peptid oder 12-26 in chemischer Konjugation an Kaninchen-IgG um die Bindung an monoklonalen Antikörper Anti-12-26-B3.11 konkurrieren können. Darüber hinaus ist das 12-26-IgG für das 12-26-Epitop immunogen, wenn in CFA emulgiert (Daten nicht gezeigt). Dies legt nahe, dass das inserierte Peptid in einer physiologisch relevanten Weise selbst in Zusammenhang mit einem Selbst-IgG-Molekül prozessiert und präsentiert werden kann. Experimente zeigen auch, dass die 12-26-Fusionsimmunglobuline die IL-2-Produktion in einem H-2^d restringierten 12-26-spezifischen T-Zell-Hybridom (9C127) (Daten nicht gezeigt) stimulieren können (gemessen mittels CTLL-Assay).
BEISPIEL III
Toleranzinduktion in Mäusen mit dem 12-26-IgG1-Fusionsprotein
Eine Hochdosis-Vorbehandlung von Tieren mit dem 12-26-Peptid, injiziert intravenös oder intraperitoneal in Salzlösung oder emulgiert in inkomplettem Freund-Adjuvans (IFA), kann die T-Helferzell-Toleranz auf die anschließende Immunisierung mit Peptid in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) induzieren. Scherer et al., Symp. on Quant. Biol., Cold Spring Harbor, NY, 54: 497 (1989). Die Toleranzinduktion gegen das 12-26-Epitop wurde in T-Zellproliferations-Assays bestätigt. Allerdings sind mit dem Peptid behandelte Tiere auf dem B-Zell-Niveau nicht tolerant. Das heißt, dass bei Provokation mit 12-26-Flagellin (das "Trägerepitope" bereitstellt) die Reaktion nicht vermindert war (siehe unten). Dies zeigt, dass die Reduktionen bei Peptid-Provokation auf die T-Zell, doch nicht die B-Zell-Toleranz zurückzuführen waren.
Um zu bestimmen, ob das 12-26-IgG1-Fusionsprotein eine B-Zell-Toleranz induzieren kann, wurde das folgende Experiment vorgenommen. Mäusemilzzellen wurden in vitro in RPMI-1640 + 5% FCS für 18 Stunden gezüchtet. Die Mäusemilzzellen wurden dann mit zunehmenden Konzentrationen entweder an freiem 12-26-Peptid, einem chemischen Konjugat von Kaninchen-Gammaglobulin mit 12-26 (RGG-12-26) oder mit 12-26-IgG1 (Q3) inkubiert. Nach 18 Stunden wurden diese Milzzellen gewaschen und dann entweder mit Lipopolysaccharid (einem mitogenen Stimulus, nicht gezeigt) oder dem A29-Fusionsprotein von Salmonella flagellin provoziert, das das 12-26-Peptid enthält. Das Salmonella flagellin-Fusionsprotein, das das 12-26-Epitop enthält, wurde bereits zuvor als sowohl in vivo als auch in vitro immunogen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Als eine Kontrolle für die Induktion der Toleranz wurden die Milzzellen mit einem Kaninchen-Anti-Immunglobulin behandelt, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es eine Unempfänglichkeit in vitro induziert. G. Warner et al., J. Immunol., 146: 2185 (1991).
Die Wirkung des Anti-Ig ist als leere Kreise auf der rechten Seite jedes Schaubilds gezeigt. Die Empfänglichkeit der Zellen wurde mittels ELISA gemessen. Die Ergebnisse sind als 4 gezeigt (A29-Fusionsprotein mit 12-26-Peptid-Provokation).
Die Ergebnisse zeigen, dass dann, wenn Milzzellen mit dem A29-Fusionsprotein provoziert werden, das 12-26-IgG1-Fusionsprotein (Q3.13) oder das chemische Konjugat (RGG-12-26) beide bei Mikrogramm-Mengen tolerogen waren. Im Gegensatz dazu hemmt das freie Peptid die B-Zell-Empfänglichkeit bei keinerlei Dosis. Folglich zeigen diese Ergebnisse, dass die 12-26-IgG-Fusionsproteine eine Toleranz in B-Zellen in vitro induzieren können. Ähnliche Ergebnisse wurden in vivo erhalten wie folgt.
Die 12-26-IgG-Fusionsproteine wurden auf die Induktion einer Toleranz in vivo getestet. CAF₁-Mäuse wurden mit 1 mg des 12-26-IgG-Fusionsproteins, 12-26-IgG oder freies Peptid in Salzlösung injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten PBS in Salzlösung. Die Milzzellen aus diesen Mäusen wurden 10 Tage später mit dem 12-26-Flagellin-Fusionsprotein in vitro provoziert. Die Empfänglichkeit gegenüber dem 12-26 wurde mittels ELISA-Assays 4 Tage nach der Provokation wie für 4 beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die 12-26-IgG-Fusionsproteine als auch das chemische Konjugat (RGG-12-26) eine Toleranz in vivo und in vitro induzieren kann. Siehe 4 und 5.
BEISPIEL IV
Konstruktion eines retroviralen Vektors, enthaltend eine für das 12-26-IgG1-Fusionsprotein codierende DNA-Sequenz
Mehrere retrovirale Konstrukte wurden hergestellt, die auf dem Moloney-Maus-Leukämie-Retrovirusvektor MBAE basieren, wie beschrieben von Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9803 (1990).
Der retrovirale Vektor MBAE kann erhalten werden von Dr. Hozumi oder hergestellt werden wie beschrieben bei Kang et al., zitiert supra. Kurz dargestellt wurde der retrovirale Vektor, der die Long-Terminal-Repeats von Moloney-Maus-Leukämie-Virus und das für die G418-Resistenz codierende Neo-Gen enthielt, durch Insertion des β-Actin-Promotors und der Enhancer-Sequenzen modifiziert. Die β-Actin-Promotor- und Enhancersequenzen wurden stromabwärts vom Neo-Gen kloniert. Heterologe Gene können dann stromabwärts vom β-Actin-Promotor durch Subklonieren mit HindIII und SalI inseriert werden.
In MBAE subklonierte DNA-Sequenzen stammten von PCR-amplifizierter revers transkribierter RNA vom Transfektom Q3, welches die 12-26-IgG-H-Kette enthält. Das Q3-Transfektom wurde präpariert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die RNA vom Q3-Transfektom wurde geerntet und mit reverser Transkriptase in einer standardmäßigen PCR-Reaktion inkubiert, wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, zitiert supra, um cDNA-Moleküle zu bilden. Die cDNA-Moleküle wurden unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
V_H 5' Primer (SEQ ID NR: 6):
pep 3' Primer (SEQ ID NR: 7):
Eine solche cDNA enthält eine DNA-Sequenz, die für die Leadersequenz codiert, und das 12-26-Epitop vom variablen Schwerketten-Gen, gefolgt von einem Stoppcodon. Das Stoppcodon wurde in den PCR-Primer am Ende der DNA-Sequenz, die für die letzte Aminosäure von 12–26 (im Primer) codiert, zur Konstruktion eines Peptid-Minigens konstruiert.
Eine DNA-Sequenz, die für die Leadersequenz und die für das 12-26-Epitop codierende Sequenz codierte, gefolgt von einem Stoppcodon, wurde in pBluescript subkloniert und sequenziert und dann in den MBAE-Vektor subkloniert. Die Subklonierung wurde unter Verwendung von SalI und HindIII zum Einbau des Peptid-Minigens stromabwärts vom β-Actin-Promotor und den Enhancer-Sequenzen vorgenommen, wie in 7 gezeigt.
Die rekombinanten MBAE-Vektoren wurden durch Lipofektion in die Ψ-2-Zelllinie transfiziert, wie bezogen von Nr. N. Hozumi (Toronto, Kanada). Die transfizierten Zelllinien wurden in RPMI 5% FCS in Gegenwart von 0,8 mg/ml rohem G418 gezüchtet. Die G418-resistenten Klone wurde mittels „Limiting Dilution" isoliert, und der virale Titer wurde aus NIH 3T3-Zellen in Gegenwart von 0,8 mg/ml G418 (Rohgewicht) bestimmt. Für das Peptid-Minigen-Konstrukt wurde ein tansfizierter Ψ-2-Klon (MBAE pEP19) mit einem Titer von 10⁵–10⁶ CFU/ml für nachfolgende Gentransfer-Experimente ausgewählt. Das Vorhandensein von Helfer-Virus wurde mittels standardmäßiger Methoden ("horizontale Infektionsausbreitungs"-Methode) untersucht, wie beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, zitiert supra, und wurde nicht nachgewiesen. Die Virus-produzierenden Linien wurden für jedes einzelne Experiment frisch abgetaut.
Eine A20.2J-B-Zell-Lymphomzelle, beziehbar von ATCC, infiziert mit dem viralen Vektor, exprimierte und sekretierte das Peptid, wie mittels Westernblot nachgewiesen. Siehe 6A. Nach der Infektion von A20.2J-B-Zell-Lymphomzellen wurden die Zellen in G418 gezüchtet, und 200 μl der Überstände wurden mittels Western Blotting analysiert. Die Überstände von vier Ψ-2-/A20.2J-Klonen, die mit retroviralem 12-26-Minigen infiziert waren, wurden slot-geblottet und mit monoklonalem Antikörper B3.11, wie für das 12-26-Epitop spezifisch, umgesetzt. Wie in 6A erkennbar, wurde das Peptid in der infizierten Lymphomzelle exprimiert.
Die A20.2J-infizierten Zellen erzeugen nicht nur das Peptid, sondern präsentieren es auch einem 12-26-reaktiven T-Zell-Hybridom. Kurz dargestellt wurden titrierte Volumina der Überstände von infizierten A20.2J-Zellen mit 12-26-reaktiven T-Zellklonen (T32) für 24–48 Stunden inkubiert. Die 12-26-reaktiven T-Zellklone wurden erhalten von Dr. Tom Briner und Dr. M. Gefter (Massachusetts Insitute of Technology, Cambridge, MA). Die Empfänglichkeit der T-Zellklone wurde mittels ³H-Thymidin-Einbau und standardmäßigem IL-2-Assay gemessen. Die Ergebnisse sind in 6B gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass A20-Zellen dieses Peptid prozessieren, so dass es einem 12-26-reaktiven T-Zellklon präsentiert werden kann. Die IL-2-Produktion durch diese Klone wurde ebenfalls gemessen, wobei die Ergebnisse zeigen, dass das 12-26-Peptid durch die infizierten Zellen produziert und sekretiert wird.
BEISPIEL V
Präparierung von Mäusen, die transfizierte Knochenmarkszellen tragen
Mäuse, die Knochenmarkszellen tragen, die mit dem für 12-26-Epitop codierenden viralen Vektor MBAE 12-26 transfiziert waren (7), wurden präpariert. Knochenmarks-Vorläufer aus Balb/c-Mäusen wurden mit dem MBAE-12-26-Vektor infiziert, wie beschrieben von Chambers et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 1026 (1992). Die Markspender-Balb/c-Mäuse wurden intravenös mit 150 mg/kg an 5-Fluoruracil für 3–4 Tage vor der Markernte vorbehandelt. Die fraktionierten Markzellen wurden auf Eis gehalten und dann in kompletten RPMI mit 15% FC5 und 10 Einheiten/ml IL-3 gewaschen. Die Knochenmarkszellen wurden dann mit einer zu etwa 80% zusammenfließenden Schicht an bestrahlten (2000 Rad) Ψ-2-Verpackungslinien cokultiviert. Die Cokultur mit der adhärenten Ψ-2-Virus-erzeugenden Linie wurde bei 37°C für 48 Stunden wie folgt vorgenommen:
5 × 10⁶ Knochenmarkszellen pro 6 Wells in 10 ml Medium, enthaltend:

– 15% FCS
– 6 μg/ml Polybren
– 100 Einheiten/ml IL-6
– 200 Einheiten/ml IL-3.

Nicht-adhärente Knochenmarkszellen wurden nach 48 Stunden geerntet, gewaschen und in HEPES-gepuffertem Eagles-Medium resuspendiert. Syngene Empfänger-Balb/c-Mäuse wurden mit 900 Rad lethal bestrahlt, und 4 × 10⁶ Zellen in einem Volumen von 400 μl wurden in die bestrahlten Mäuse intravenös injiziert. Die Empfängermäuse wurden 1 bis 2 Wochen vor Transplantation auf angesäuertem Wasser erstbehandelt, um gram-negative Infektionen zu verhüten, und in autoklavierten Mikroisolator-Käfigen mit autoklavierter Nahrung, Nestwolle und mit Antibiotika ergänztem angesäuertem Wasser gehalten.
Nach zwei Wochen wurden die lymphoiden Zellen den Empfängermäusen durch Schwanzschnittblutungen abgenommen und auf das Vorhandensein der 12-26-Sequenz mittels RT-PCR untersucht. Die Fragmente von etwa 100 Basenpaaren wurden sowohl in infizierten lymphoiden Zellen als auch der Ψ-2-MBAE-12-26 enthaltenden Zelllinie nachgewiesen. Siehe 8.
Kurz dargestellt wurde die RNA aus peripheren Blutzellen, die den Tieren nach 2 Wochen, oder aus infizierten [Ψ?]-2-Verpackungslinien, entnommen wurde, revers transkribiert. Die für das 12-26-Epitop codierenden DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung von V_H-(SEQ ID NR: 6)- und pep-(SEQ ID NR: 7)-Primern amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese getrennt, und die Produkte, die eine für das 12-26-Epitop codierende DNA-Sequenz enthielten, wurden mittels Southernblot nachgewiesen. Die zum Nachweis der 12-26-Codierungssequenzen verwendete Sonde ist die folgende (SEQ ID NR: 8):
Die Hybridisation wurde unter standardmäßigen Bedingungen, wie beschrieben in Current Protocols, zitiert supra, vorgenommen. Ein in peripheren Blutzellen mittels Hybridisation an die 12-26-Sonde nachgewiesenes Fragment ergab, dass die Expression des 12-26-Epitops in den Zellen 2 Wochen nach Verabreichung erfolgte.
SEQUENZLISTE
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13bis)

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zum Induzieren einer Toleranz gegenüber einem tolerogenen Epitop oder einem Antigen, das das tolerogene Epitop enthält, in einem Individuum, wobei das tolerogene Epitop ein Epitop ist, dem gegenüber eine immunologische Unempfänglichkeit erwünscht ist, welche Zusammensetzung umfasst: a) eine hämopoetische oder lymphoide Zelle, die einen Expressionsvektor umfasst, der zum dauerhaften Beibehalten der Expression des tolerogenen Epitops in dem Individuum fähig ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsimmunglobulin codiert, das operabel an Transkriptions- und Translations-Kontrollregionen geknüpft ist, die in der hämopoetischen oder lymphoiden Zelle funktionsfähig sind, wobei das Fusionsimmunglobulin mindestens ein heterologes Epitop aufweist, das in der variablen Region des N-Terminus des Immunglobulins inseriert ist, wobei das heterologe Epitop das tolerogene Epitop ist, und wobei der Expressionsvektor stabil in der hämopoetischen oder lymphoiden Zelle erhalten bleibt; und b) einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zelle eine Knochenmarkszelle oder eine Lympoidzelle ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Fusionsimmunglobulin ein IgG ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Individuum ein Mensch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die hämopoetische oder lymphoide Zelle von dem Individuum stammt, bei dem die Toleranz induziert werden soll.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Zelle eine Knochenmarkszelle ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Antigen ein mit einer Autoimmunerkrankung oder allergischen Reaktion im Individuum assoziiertes Antigen ist.