DE69413024T2

DE69413024T2 - Verfahren zur herstellung von immunogenen oder diagnostischen reagentien und ebensolche

Info

Publication number: DE69413024T2
Application number: DE69413024T
Authority: DE
Inventors: Riccardo I-00144 Roma Cortese; Franco I-00173 Roma Felici; Alessandra I-00144 Roma Luzzago; Paolo I-00181 Roma Monaci; Alfredo I-00144 Roma Nicosia
Original assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Current assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Priority date: 1993-05-11
Filing date: 1994-05-05
Publication date: 1999-02-04
Anticipated expiration: 2014-05-06
Also published as: ITRM930301A1; WO1994026886A2; JPH08506493A; JP2813468B2; CN1122613A; AU685121B2; ATE170558T1; BR9406595A; RU2136697C1; US5994083A; ITRM930301A0; EP0698091B1; CA2160486A1; DE69413024D1; HK1011710A1; IT1270939B; CA2160486C; EP0698091A1; WO1994026886A3; CN1093881C

Description

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Immunogenen oder diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, selbst wenn er nicht charakterisiert oder sogar unbekannt ist (dadurch einschließend Autoimmunkrankheiten, deren Ätiologie und/oder Pathogenese bekannt oder unbekannt ist). Dieses Verfahren basiert auf der Existenz und Verfügbarkeit von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder einem Serum, enthaltend Antikörper, die spezifisch mit dem Organismus, der die Infektion verursacht, reagieren.
Antikörper, geeignet zur Verwendung in diesem Verfahren, können spezifisch sein für irgendein Antigen von Interesse, für das ein Immunogen oder diagnostisches Reagenz, das das Antigen nachahmt, gesucht wird. Das Antigen kann sein ein Protein oder Peptid, entweder synthetisch, abgeleitet von einer natürlichen Quelle oder rekombinant produziert, ein Kohlenhydrat, ein Polysaccharid, ein Glycoprotein, ein Hormon, ein Rezeptor, ein Antikörper, ein Virus, ein Substrat, ein Metabolit, ein Analogon eines Übergangszustands, ein Cofaktor, ein Arzneistoff, ein Farbstoff, ein Nährstoff, ein Wachstumsfaktor, eine zelluläre Komponente, ein onkogenes Produkt, Bakterien und ihre extrazellulären Produkte, Säugerzellen und Extrakte hiervon, einschließlich Tumorzellen, Virus-infizierte Zellen und normale Zellen, Parasiten, Protozon, Malaria-Antigene, ein Helminth, ein Pilz, Rickettsia oder ein Allergen einschließlich aber nicht limitiert auf Pollen, Staub, Danders oder Extrakten desselben oder ein Schlangengift, Gift, Toxin oder toxischer Stoff, Nucleinsäuren, einschließlich DNA oder irgendein anderes Gen ohne Beschränkung. Antigene von Viren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Antigene ein von den Viren, einschließlich, aber nicht einschränkend aufzufassen, von Polyovirus, Influenzavirus, HIV, HTLV, Papillo mavirus, Adenovirus, Parainfluenzavirus, Masernvirus, Mumpsvirus, respiratorischer Syncytialvirus, Schiffsfiebervirus, West- und Ost-Encephalomyelitisvirus, Japanischer B-Encephalomyelitisvirus, Russischer Frühling-Sommer-Encephalomyelitisvirus, Schwein-Choleravirus, Hepatitisvirus, Pockenvirus, Tollwutvirus, Staupevirus, Herpesvirus, Cytomegalovirus, Maul- und Klauenseuchevirus, Rhinovirus, Newcastle-Krankheitsvirus, Vaccinavirus und Pseudo- Tollwutvirus. Der Imitator kann ein Immunogen, ein Vaccin, ein Inhibitor oder ein Aktivator, etc., ohne Einschränkung sein.
Wie bekannt, werden alle Vaccine und diagnostischen Reagenzien, die gegenwärtig verkauft werden oder klinischen Tests unterzogen werden, gewöhnlich erhalten durch Verfahren, basierend auf der Manipulation, Modifikation und/oder Adaption von pathogenen Organismen oder Komponenten hiervon. Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist die Lehre von Perham et al. (WO 92/07077), die Gestaltung von filamentösen Bakteriophagen, um auf ihrer Capsidoberfläche Peptidepitope, abgeleitet von pathogenen Organismen, zu exprimieren, um Vaccine und diagnostische Reagenzien zu gewinnen. Diese Verfahren ergaben gute Ergebnisse, aber waren nicht ohne Probleme. Die größte Einschränkung bei diesen Verfahren ergibt sich aus der Tatsache, daß sie abhängig sind von der Verfügbarkeit von Informationen und/oder Material, direkt abgeleitet von pathogenen Organismen oder Komponenten hiervon.
Die Fähigkeit, eine große Sammlung von willkürlichen Peptiden, exprimiert als ein Teil der Bakteriophagen-Hüllproteine herzustellen und die Entwicklung von Verfahren für ihr Screening mit homogenen Rezeptoren, hat mehrere Experten auf diesem Gebiet dazu veranlaßt, zu spekulieren, daß schützende Antikörper, die, wie man weiß, vorhanden sind in menschlichen Seren, verwendet werden können, um Peptide zu selektieren, die Epitope von Pathogenen nachahmen (WO 91/19818).
Bisherige Versuche, die vorstehend beschriebenen Beschränkungen zu überwinden, sind bisher gescheitert aufgrund des Mangels eines effizienten und reproduzierbaren experimentellen Protokolls, insbesondere stellten diese Versuche keine ausreichenden Informationen bereit, um immunogene Imitatoren zu identifizieren und charakterisieren, um für die Diagnostik und Vaccintherapie verwendet zu werden. Es muß herausgestellt werden, daß die vorliegende Erfindung sich auf die Entwicklung einer neuen Technologie bezieht, die darauf gerichtet ist, gedankliche und technische Unzulänglichkeiten von zuvor vorgeschlagenen Protokollen zu überwinden.
Ein Hauptgesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist eine neue Strategie zur Selektion von antigenischen und immunogenischen Imitatoren, basierend auf der Verwendung von Serumproben von Patienten als Reagenzien und einen Gegenselektionsschritt, verwendend die Serumproben von gesunden Individuen.
Die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt diese Beschränkung zu überwinden. Darüber hinaus werden weitere Vorteile erzielt, die durch die nachfolgende Beschreibung deutlich gemacht werden.
Ein Verfahren zur Herstellung von immunogenen oder diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, unter Verwendung eines Verfahrens, das ausgeführt werden kann ohne jede Information über die Natur und/oder die Identifizierung des (der) Antigens (Antigene) des pathogenen Organismus, spezifisch für die Krankheit, und ohne jede Information über die Natur und/oder Struktur und/oder Eigenschaften der spezifischen Antikörper, umfaßt die folgenden Schritte:
- Identifizierung von mindestens zwei Seren, die nicht charakterisierte Antikörper enthalten, reaktiv mit einem Antigen oder einem pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, selbst wenn ein solches Antigen und/oder pathogener Organismus nicht charakterisiert oder unbekannt ist;
- Konstruktion einer Phagen-Genbank, die Oligopeptide auf der Oberfläche des Capsids zeigt, exprimiert von willkürlichen Sequenzoligonucleotid-Inserts, eingeführt in ein Gen, das für ein Phagen-Capsid-Protein kodiert unter Verwendung genetischer Techniken;
- Selektion der Phagen, die antigene Oligopeptide auf den Oberflächen des Capsids zeigen mit einem pathologischen Serum, nachfolgendem Screening mit zusätzlichen pathologischen Seren, verschieden von dem vorhergehenden, von Individuen, die gegen die gleiche Krankheit immunisiert worden sind, um einen Phagen zu identifizieren, der Oligopeptide zeigt, die mit allen oder fast allen der getesteten Seren reaktiv ist und Counterscreening mit einem Panel von Seren von einem anderen Satz von gesun den Individuen oder jedenfalls nicht mit der gleichen Krankheit infizierten, als Kontrolle, um Oligopeptide zu identifizieren, die nicht mit allen oder fast allen Seren von Kontroll-Individuen reagieren.
Die Herstellung von Phagen-Genbanken gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise ausgeführt werden unter Verwendung von filamentösen Phagen M13, F1 und Fd oder Derivaten hiervon. Die Gründe dafür sind die folgenden:
- Filamentöse Phagen werden gewöhnlich verwendet als molekulare Vektoren im Bereich der Molekularbiologie und Gentechnologie. Zum Beispiel sind sie besonders verwendet worden in DNA-Sequenzierungsexperimenten, bei Experimenten zur ortsspezifischen Mutagenese und für die Expression von Protein und Peptiden unter Ausnutzung ihres Merkmals, ein Genom mit einer einzelnen DNA-Helix zu enthalten.
- Die Information, die erforderlich und ausreichend zur Verpackung eines einzelkettigen DNA-Genoms ist, ist gut charakterisiert worden und kann auf andere molekulare Vektoren transferiert werden.
- Es ist gleichermaßen gezeigt worden, daß mindestens zwei Proteine des Capsids von filamentösen Phagen modifiziert werden können durch Mittel des Hinzufügens oder der Insertion von zusätzlichen Aminosäuresequenzen. Die resultierenden Phagen werden verpackt, behalten ihre Fähigkeit, zu replizieren, und in den meisten Fällen, bakterielle Zellen zu infizieren. Die fremden Aminosäuresequenzen werden auf der Oberfläche des Phagen präsentiert und können erkannt werden durch Interaktion mit Antikörpern oder mit anderen spezifischen Molekülen gemäß dem entsprechenden Fall.
Die Antikörper, die in dem Verfahren zur Herstellung von Immunogenen und diagnostischen Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Antikörper, enthalten in Seren. Die letztere Ausführungsform ist von besonderem Interesse, da sie das erste Mal eine reproduzierbare experimentelle Strategie bereitstellt, um neue antigenische und immunogene Imitatoren zu identifizieren in Abwesenheit jeglicher Information über die Struktur und die Eigenschaften des natürlichen und pathologischen Antigens.
Das Gen, das das Phagen-Capsid kodiert mit Inserts willkürlicher Oligonucleotide, kann das Gen sein, das das Protein VIII des Phagen-Capsids kodiert oder das Gen, das das Protein III des Capsids kodiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ohne Einschränkung auf jeden Antikörper oder Organismus, verantwortlich für eine Krankheit, angewendet werden. Gute Ergebnisse sind erhalten worden unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder Seren, spezifisch für das Oberflächen-Antigen des menschlichen Hepatitis B-Virus (HBsAg).
Die antigenen Oligopeptide, die durch die Antikörper erkannt werden, die verwendet werden, können erhalten werden durch Expression von Inserts von willkürlichen Oligonucleotiden unter Verwendung eines Vektors, z. B. des Plasmids pC89.
In dem Verfahren zur Herstellung von immunogenen und diagnostischen Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Phagen zu selektieren, enthaltend in ihrem Capsid zwischen der Restriktionserkennungsstelle EcoRI (GAATTC) bis zur Restriktionserkennungsstelle BamHI (GGATCC) eine der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:9 bis 47.
Das Plasmid pC89 enthält ganz oder teilweise eine Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Sequenzen SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:8.
Oligopeptide, erhalten durch das vorstehende Verfahren, die mit pathologischen Seren reagieren von Individuen, betroffen durch die gleiche Krankheit wie die Patienten, von denen die Seren für die Selektion und Screening des Phagen, der diese Oligopeptide zeigt, verwendet wurden und die nicht mit Seren von Individuen, nicht betroffen durch die gleiche Krankheit, reagieren, sind fähig z. B. zur Auslösung einer Immunantwort in einem lebenden Organismus gegen natürliche Antigene oder Antikörper gegen HCV oder Antikörper gegen HBV.
Die vorstehenden Oligopeptide können verwendet werden als Immunogene, um eine Antikörperantwort gegen spezifische pathologische Antigene auszulösen, wie infektiöse Pathogene. In dem Fall, daß die hervorgerufenen Antikörper ebenfalls schützend oder neutralisierend sind, können die Oligopeptide zur Formulierung eines Vaccins gegen die spezifischen pathogenen Mittel verwendet werden.
Die Immunogene, erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren, sind nützlich als Vaccine oder immunisierende Agenzien genauso wie als diagnostische Reagenzien. Die Vaccine oder immunisierenden Agenzien werden einem Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, gemäß den bekannten Standardverfahren verabreicht. Die Vaccine oder immunisierenden Agenzien können verabreicht werden und verwendet werden entweder einzeln oder in Kombination. Die Vaccine und Immunogene der vorliegenden Erfindung können den Phagen oder Proteine und Peptide, isoliert hiervon, umfassen.
Kits, enthaltend die Immunogene, erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren, können hergestellt werden. Diese Kits werden verwendet, um das Vorhandensein eines Antigens in einer Probe nachzuweisen. Diese Charakterisierung ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich aber der forensischen Analyse und epidemischen Studien, ohne auf diese beschränkt zu sein. Ein derartiger Kit würde umfassen einen aufgeteilten Träger, geeignet, um einen geschlossenen Raum mit mindestens einem Behälter zu tragen. Der Träger würde ferner umfassen, Reagenzien, wie die Immunogene und Antikörper, geeignet zum Nachweis der Antigene. Der Träger kann ebenfalls Mittel zum Nachweis wie markierte Antigen- oder Enzymsubstrate oder dergleichen enthalten.
Pharmazeutische nützliche Zusammensetzungen, umfassend die Immunogene und Vaccine, erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren, können formuliert werden entsprechend den bekannten Verfahren, wie durch die Zumischung eines pharmazeutisch verträglichen Trägers.
Beispiele für derartige Träger und Verfahren der Formulierung finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences. Zur Bildung einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung, geeignet zur effektiven Verabreichung, werden diese Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Vaccins oder Immunogens der vorliegenden Erfindung enthalten.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden an ein Individuum verabreicht in Mengen, die ausreichend zur Behandlung oder Diagnose der entspre chenden Störungen sind. Die entsprechende Menge kann entsprechend einer Vielzahl von Faktoren variieren, wie die individuelle Verfassung, das Gewicht, Geschlecht und Alter. Andere Faktoren schließen die Art der Verabreichung ein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, wie subkutan, topisch, oral und intramuskulär.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls die Aufgabe, geeignete topische, oral-systemische und parenterale pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in den neuen Verfahren der Behandlung der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Die Zusammensetzungen, enthaltend Vaccine oder Immunogene, identifiziert gemäß dieser Erfindung als aktive Bestandteile, können verabreicht werden in verschiedenen therapeutischen Dosierungsformen mit konventionellen Trägern zur Verabreichung. Zum Beispiel können die Vaccine und Immunogene verabreicht werden in solchen oralen Dosierungsformen als Tabletten, Kapseln (jede einschließend zeitliche Freisetzungs- und Langzeit-wirkende Formulierungen), Pillen, Pulver, Granulate, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Emulsionen oder durch Injektion. Gleichermaßen können sie verabreicht werden in intravenöser (sowohl Bolus und Infusion), intraperetonealer, subkutaner, topischer mit oder ohne Okklusion oder intramuskulärer Form, wobei Formen verwendet werden, die dem Fachmann im pharmazeutischen Bereich bekannt sind. Eine effektive, aber nicht-toxische Menge der Vaccine und Immunogene kann verwendet werden.
Die tägliche Dosierung der Vaccine und Immunogene kann über einen weiten großen Bereich variieren, von 0,0 bis 1000 mg pro Erwachsenenpro Tag. Für die orale Verabreichung werden die Vaccine und Immunogene bevorzugt bereitgestellt in Form von eingekerbten oder nichteingekerbten Tabletten, enthaltend 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 und 50,0 mg des aktiven Wirkstoffs zur symptomatischen Anpassung der Dosierung an den zu behandelnden Patienten. Eine wirksame Menge der Vaccine und Immunogene wird normalerweise bereitgestellt mit einer Dosierungsmenge von etwa 0,0001 mg/kg bis etwa 100 mg/kg des Körpergewichts pro Tag. Mehr bevorzugt ist der Bereich von etwa 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg des Körpergewichts pro Tag. Die Dosierungen der Vaccine und Immunogene wird angepaßt, wenn sie kombiniert werden, um gewünschte Effekte zu erreichen. Auf der anderen Seite kann die Dosierung von diesen verschiedenen Mitteln unabhängig optimiert werden und kombiniert werden, um einen synergistischen Effekt zu erzielen, wobei die Krankheit stärker reduziert ist, als wenn jedes Mittel allein verwendet würde. Vorteilhafterweise kann das Vaccin oder die Immunogene der vorliegenden Erfindung verabreicht werden in einer Einzeldosis, oder einer einzelnen täglichen Dosis oder die gesamte tägliche Dosis kann in zwei, drei oder vier täglich Dosierungen aufgeteilt werden. Darüber hinaus können das Vaccin oder die Immunogene der vorliegenden Erfindung verabreicht werden in intranasaler Form über lokale Verwendung von geeigneten intranasalen Trägern oder über transdermale Wege, unter Verwendung solcher Formen von transdermalen Hautpflastern, die dem Fachmann bekannt sind. Bei der Verabreichung in Form von transdermalen Freisetzungssystemen wird die Verabreichung eher kontinuierlich als periodisch durch ein Dosierungsschema erfolgen.
Bei Kombinationsbehandlung mit mehr als einem aktiven Mittel, wobei die aktiven Mittel in getrennten Dosierungsformulierungen vorliegen, kann die Verabreichung der aktiven Mittel zusammen oder zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgen.
Das Dosierungsschema, bei dem die Vaccine oder Immunogene der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird ausgewählt gemäß einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, der Schwere der zu behandelnden Krankheit, dem Weg der Verabreichung, der Nieren- und Leberfunktion des Patienten und des ausgewählten Vaccins oder Immunogens, das eingesetzt wird. Der durchschnittliche Arzt oder Veterinär kann leicht die wirksame Menge eines Vaccins oder Immunogens der vorliegenden Erfindung bestimmen und verschreiben, erforderlich zur Verhinderung, zur Abwehr oder zum Aufhalten des Fortschreitens der Krankheit. Die optimale Präzision bei dem Erreichen von Konzentrationen des Vaccins oder Immunogens der vorliegenden Erfindung innerhalb des Bereichs, der wirksam ist ohne Toxizität, erfordert ein Dosierungsschema, basierend auf den Kinetiken der Vaccine oder Immunogene der vorliegenden Erfindung, verfügbar an den Zielstellen. Dies schließt eine Betrachtung der Verteilung, des Equilibriums und der Eliminierung des Vaccins oder der Immunogene der vorliegenden Erfindung ein.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die hier im Detail beschriebenen Vaccine oder Immunogene den aktiven Inhaltsstoff bilden und werden typischerweise verabreicht mit einer Zumischung von geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Zusatzstoffen oder Trägern (kollektiv bezeichnet als "Träger"-Materialien), ausgewählt hinsichtlich der beabsichtigten Form der Verabreichung, d. h. orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dergleichen und in Übereinstimmung mit gewöhnlichen pharmazeutischen Techniken.
Zum Beispiel kann bei der oralen Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel das aktive Vaccin oder die immunogene Komponente kombiniert werden mit einem oral-nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen inerten Träger wie Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen. Darüber hinaus, wenn gewünscht oder notwendig, können geeignete Bindemittel, Schmiermittel, Zerfallmittel und Farbstoffe in das Gemisch eingegliedert werden. Geeignete Bindemittel schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie Glucose oder beta-Lactose, Korn-Süßstoffe, natürliche und synthetische Gummi, wie Akazie, Tragant oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglykol, Wachse und dergleichen. Schmiermittel, die in diesen Dosierungsformen verwendet werden, schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dergleichen. Zerfallmittel schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, Stärke, Methylcellulose, Agarbentonit, Xanthan Gum und dergleichen.
Für flüssige Formen des aktiven Vaccins oder der immunogenen Komponente können mit geeigneten aromatisierten Suspensions- oder Dispersionsmitteln kombiniert werden, wie synthetische und natürliche Gummi, z. B. Tragant, Akazie, Methylcellulose und dergleichen. Andere Dispersionsmittel, die eingesetzt werden können, schließen Glycerin und dergleichen ein. Für die parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen wünschenswert. Isotonische Präparationen, die im allgemeinen geeignete Konservierungsstoffe enthalten, werden eingesetzt, wenn die intravenöse Verabreichung beabsichtigt ist.
Topische Präparationen, enthaltend das aktive Vaccin oder die immunogene Komponente, können einer Vielzahl von Trägermaterialien, die bekannt sind, beigemischt werden, wie z. B. Alkoholen, Aloe vera-Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A und E-Ölen, Mineralöl, PPG2- Myristylpropionat und dergleichen, um z. B. alkoholische Lösungen, topische Reinigungsmittel, Reinigungscremes, Gesichtsgele, Gesichtslotionen und Shampoos in Creme- oder Gel- Formulierungen gemischt werden.
Das Vaccin oder die Immunogene der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Form von Liposomen-Freisetzungssystemen verabreicht werden, wie kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln. Liposomen können gebildet werden von einer Vielzahl von Phospholipiden, wie Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholin.
Das Vaccin oder die Immunogene der vorliegenden Erfindung können ebenfalls freigesetzt werden bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern als individuelle Träger, an die das Vaccin oder die immunogenen Moleküle gebunden sind. Das Vaccin oder die Immunogene der vorliegenden Erfindung können ebenfalls mit löslichen Polymeren als zielfähige Vaccine oder immunogene Träger gekoppelt werden. Derartige Polymere schließen ein Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoylresten. Darüber hinaus kann das Vaccin oder die Immungene der vorliegenden Erfindung gekoppelt werden an eine Klasse von bioabbaubaren Polymeren, nützlich für das Erreichen einer kontrollierten Freisetzung eines Vaccins oder Immungens, z. B. Polyacticsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydroxypyrane, Polycyanoacrylate und quervernetzte oder amphipathische Block-Copolymere oder Hydrogele.
Bis zu diesem Punkt ist eine allgemeine Beschreibung der Gegenstände der vorliegenden Erfindung gegeben worden. Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird eine detailliertere Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung gegeben zum besseren Verständnis der Gegenstände, Eigenschaften, Vorteile und Verfahren der Erfindung. Die folgenden Beispiele beziehen sich auf Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung von Immunogenen und diagnostischen Reagenzien gegen ein spezifisches pathogenes Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung, um die Wirksamkeit der Klone, selektiert zur Herstellung von Immunogenen, basierend auf den Effekten, produziert durch Proben des Serums von Testtieren, immunisiert unter Verwendung der Single-Klone, zu zeigen, und um die Wirksamkeit von Klonen, ausgewählt zur Herstellung von diagnostischen Reagenzien, basierend auf ihrer spezifischen Reaktion mit dem Serum von Individuen, immunisiert mit HBsAg, zu zeigen.
Die beigefügte Figur zeigt einen Teil der genetischen Karte des Plasmids pC89, hergestellt für die Zwecke der Erfindung. Die Nucleotidsequenz der Restriktionsstellen und die korrespondierenden Aminosäuresequenzen sind unter dem vorstehend genannten Teil der genetischen Karte dargestellt. Die willkürliche Aminosäuresequenz des Amino-terminalen Endes des reifen pVIII ist modifiziert worden, um einzelne EcoRI- und BamHI-Stellen einzuführen.

Beispiel 1

Verfahren zur Herstellung von spezifischen diagnostischen Reagenzien und Immunogenen für die Krankheit, verursacht durch das menschliche Hepatitis B-Virus (HBV)

Das folgende Verfahren wurde ausgeführt gemäß der Erfindung:
Eine erste "Genbank" von Epitopen wurde hergestellt, durch Phagen mit Oligopeptiden mit 9 Aminosäuren, die auf der Oberfläche des Capsids gezeigt wurden, exprimiert durch willkürliche Sequenz-Oligonucleotid-Inserts, eingeführt in das Gen, kodierend für das Protein VIII des Phagen-Capsids. Zur Expression der rekombinanten Proteine, enthaltend die Epitope, wurde das Plasmid pC89 verwendet, aufgebaut wie beschrieben bei F. Felici et al. Selection of Antibody Ligands from a Large Library of Oligopeptides Expressed on a Mulitvalent Exposition Vector, J. Mol. Biol., 1991, 222, 301-310, von dem ein Teil der genetischen Karte in der Figur gezeigt ist.
Eine zweite Epitop-"Bibliothek" wurde hergestellt in der gleichen Weise wie die erste, mit dem Unterschied, daß zwei Cysteinreste vorhanden waren an den zwei Enden des Inserts, wie beschrieben in A. Luzzago et al., Mimicking of discontinuous epitopes by phage displayed peptides, I. Epitope mapping of human H Ferritin, using a phage library of constrained peptides, Gene, 1993, 128, 51-57.
Eine Probe von Seren von Individuen, immunisiert unter Verwendung einer rekombinanten Form des HBV-Oberflächen-Antigens (HBsAg) wurde auf das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern gegen HBsAg getestet. Die Seren mit einem hohen Antikörpergehalt gegen HBsAg wurden danach verwendet.
Die Antikörper, enthalten in diesen Seren, wurden immobilisiert auf einer festen Matrix und inkubiert mit der Phagen-Bibliothek. Die Phagen, die spezifisch zurückgehalten wurden durch diese Antikörper, wurden danach eluiert und amplifiziert.
Bakterien, infiziert durch diese Phagen, ausgewählt wie vorstehend, wurden auf ein festes Kulturmedium plattiert und transferiert auf Nitrocellulosefilter. Nachfolgend wurden diese Filter inkubiert mit Seren von Individuen, immunisiert gegen HBsAg, verschieden von dem Serum, verwendet für die erste Anreicherung. Die Phagen, spezifisch erkennend die Antikörper, vorhanden in diesen Seren, wurden identifiziert und isoliert.
Die Phagen, die wie vorstehend identifiziert wurden, wurden gegen-selektiert bezüglich der Reaktivität gegenüber Antikörpern, vorhanden in den Seren von Individuen, die nicht gegen HBsAg immunisiert wurden, unter Verwendung des ELISA-Tests.
Die Phagen, resultierend von dieser Gegenselektion wurden bezüglich der Spezifität der Reaktion gegenüber anti-HBsAg-Antikörpern getestet durch den Vergleich in dem ELISA- Test.
Die Nucleotidsequenz, kodierend für die Epitope, identifiziert in dieser Art und Weise, wurde nachfolgend bestimmt (SEQ ID NO:4,5,6,8).

Beispiel 2

Demonstration der Wirksamkeit der ausgewählten Phaegen als spezifische Immunogene für die Krankheit, verursacht durch das menschliche Hepatitis-Virus (HBV)

Das folgende Verfahren wurde verwendet:
Die Phagen, ausgewählt wie vorstehend beschrieben, wurden amplifiziert und gereinigt.
Die gereinigten Phagen wurden in Testtiere injiziert (Mäuse, Ratten und Kaninchen), gemäß dem Verfahren beschrieben bei V. F. de la Cruz et al., Immunogenicity and Epitope Mapping of Foreign Sequences via Genetically Engineered Filamentous Phage, J. Biol. Chem., 1988, 263, 9, 4318-4322, und bei J. Greenwood et al., Multiple Display of Foreign Peptides on a Filamentous Bacteriophage, J. Mol. Biol., 1991, 220, 821-827.
Die Seren von Tieren, immunisiert wie vorstehend, wurden auf das Vorhandensein von Antikörpern getestet, fähig zur Interaktion mit HBsAg unter Verwendung des ELISA-Tests. Dieses Verfahren unterstreicht das Vorhandensein einer großen Menge von anti-HBsAg-Antikörpern in dem Serum von Testtieren, immunisiert wie vorstehend.
Das gleiche Immunisierungsverfahren wurde angewendet unter Verwendung synthetischer Oligopeptide als Immunogene, die die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1 bis NO:3 und NO:7) der Epitope, identifiziert gemäß dem vorstehenden Verfahren, wiedergeben. Dieses Verfahren unterstreicht die Bedeutung einer großen Menge von anti-HBsAg-Antikörpern in dem Serum von Testtieren, immunisiert wie vorstehend.
Das gleiche Immunisierungsverfahren wurde übernommen unter Verwendung von rekombinanten Formen der schweren Kette von menschlichem Ferritin, hergestellt in Bakterien, die auf ihrer Oberfläche die synthetischen Oligopeptide zeigen, erzeugt durch die Aminosäuresequenz der Epitope, identifiziert gemäß vorstehend angegebenen Verfahren. Dieses Verfahren unterstreicht das Vorhandensein einer großen Menge von anti-HBsAg-Antikörpern in dem Serum von Testtieren, immunisiert wie angegeben.

Beispiel 3

Demonstration der Wirksamkeit der ausgewählten Phagen als diagnostische Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins von anti-HBsAg-Antikörpern im Serum

Ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte, wurde durchgeführt:
20 menschliche Seren von Individuen, geimpft gegen HBsAg, wurden analysiert in einem ELISA-Test auf ihre Fähigkeit, spezifisch die Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert wie beschrieben in Beispiel 1, die die Peptidsequenzen beschrieben als SEQ ID NO:1 bis NO:3 und NO:7 zeigen. Die Ergebnisse zeigen, daß 80% der Seren mindestens eine der vier Sequenzen spezifisch erkennen.
16 menschliche Seren von Patienten, die unter Hepatitis B leiden, und anti-HBsAg-Antikörper enthalten, wurden in einem ELISA-Test auf ihre Fähigkeit, spezifisch die Phagen-Klone zu identifizieren, identifiziert wie in Beispiel 1 beschrieben, mit den Peptidsequenzen beschrieben als SEQ ID von NO:1 bis NO:3 und NO:7. Das Ergebnis zeigt, daß 44% der Seren spezifisch mindestens eine der vier Sequenzen erkennen.
20 menschliche Seren von Individuen, nicht gegen HBsAg geimpft, wurden in einem ELISA- Test auf ihre Fähigkeit analysiert, spezifisch die Phagen-Klone, identifiziert wie beschrieben in Beispiel 1, zu erkennen, die die Peptidsequenzen beschrieben als SEQ ID von NO:1 bis NO:3 und NO:7 zeigen. Die Ergebnisse zeigen, daß keines der Seren eine der vier Sequenzen spezifisch erkennt.

Beispiel 4

Verfahren zur Herstellung von spezifischen diagnostischen Reagenzien und Immunogenen für die Krankheit, verursacht durch das menschliche Hepatitis C-Virus (HCV)

Das folgende Verfahren wurde gemäß der Erfindung ausgeführt:
Eine erste "Genbank" von Epitopen wurde hergestellt, durch Phagen mit Oligopeptiden mit 9 Aminosäuren, die auf der Oberfläche des Capsids gezeigt wurden, exprimiert durch willkürliche Sequenz-Oligonucleotid-Inserts, eingeführt in das Gen, kodierend für das Protein VIII des Phagen-Capsids. Zur Expression der rekombinanten Proteine, enthaltend die Epitope, wurde das Plasmid pC89 verwendet, aufgebaut wie beschrieben bei F. Felici et al. Selection of Antibody Ligands from a Large Library of Oligopeptides Expressed on a Mulitvalent Exposition Vector, J. Mol. Biol., 1991, 222, 301-310, von dem ein Teil der genetischen Karte in der Figur gezeigt ist.
Eine zweite Epitop-"Bibliothek" wurde hergestellt in der gleichen Weise wie die erste, mit dem Unterschied, daß zwei Cysteinreste vorhanden waren an den zwei Enden des Inserts, wie beschrieben in A. Luzzago et al., Mimicking of discontinuous epitopes by phage displayed peptides, I. Epitope mapping of human H Ferritin, using a phage library of constrained peptides, Gene, 1993, 128, 51-57.
Seren von Patienten wurden verwendet, die klinisch als Hepatitis C-Virus infiziert charakterisiert worden waren.
Die Antikörper, enthalten in diesen Seren, wurden immobilisiert auf einer festen Matrix und inkubiert mit der Phagen-Bibliothek. Die Phagen, die spezifisch zurückgehalten wurden durch diese Antikörper, wurden danach eluiert und amplifiziert.
Bakterien, infiziert durch diese Phagen, ausgewählt wie vorstehend, wurden auf ein festes Kulturmedium plattiert und transferiert auf Nitrocellulosefilter. Nachfolgend wurden diese Filter inkubiert mit Seren von Individuen, infiziert mit HCV, verschieden von dem Serum, verwendet für die erste Anreicherung. Die Phagen, spezifisch erkennend die Antikörper, vorhanden in diesen Seren, wurden identifiziert und isoliert.
Die Phagen, die wie vorstehend identifiziert wurden, wurden gegen-selektiert bezüglich der Reaktivität gegenüber Antikörpern, vorhanden in den Seren von Individuen, die nicht mit HCV infiziert waren, unter Verwendung des ELISA-Tests.
Die Reaktionsspezifität der vorstehenden Phagen mit anti-HCV-Antikörpern ist statistisch wie folgt abgeschätzt worden. Die Frequenz, mit der eine signifikante Anzahl von Seren von mit HCV infizierten Patienten, die Phagen-Klone erkennt, ist in einem ELISA-Test bestimmt worden. Parallel ist wiederum unter Verwendung des ELISA-Tests das Nichterkennen der gleichen Phagen-Klone durch eine signifikante Anzahl von Seren von Individuen, die nicht mit HCV infiziert sind, getestet worden. Für jeden Phagen-Klon ist die Spezifität abgeschätzt worden durch Vergleich der Frequenz der Erkennung durch Seren von Patienten, infiziert mit HCV, mit der von Seren von nicht-infizierten Individuen.
Die Epitop-Peptidsequenz, die in dieser Art und Weise identifiziert wurde, wurde nachfolgend bestimmt (SEQ ID von NO:9 bis NO:30).

Beispiel 5

Nachweis der Wirksamkeit ausgewählter Phagen als diagnostische Reagenzien zur Bestimmung der Gegenwart von anti-HCV-Antikörpern im Serum

Ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte, wurde durchgeführt:
40 menschliche Seren von Individuen, nicht infiziert mit HCV, wurden analysiert in einem ELISA-Test auf ihre Fähigkeit, spezifisch Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit der Peptidsequenz beschrieben als SEQ ID NO:9 bis NO:23. Die Ergebnisse zeigen, daß keines der Seren die ausgewählten Sequenzen erkennt.
42 menschliche Seren von Patienten, infiziert mit HCV, wurden in einem ELISA-Test auf ihre Fähigkeit, spezifisch Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert wie beschrieben in Beispiel 4, mit der Peptidsequenz beschrieben als SEQ ID NO:9 bis NO:23. Die Ergebnisse zeigen, daß jeder Phagen-Klon spezifisch durch die ausgewählten Seren erkannt wird mit einer Frequenz, die von 15 bis 65% variiert (vgl. Tabelle I). Die gleichen Ergebnisse zeigen ebenfalls, daß jedes der 42 Seren, die getestet wurden, spezifisch mindestens eine der ausgewählten Sequenzen erkennt.
Die ausgewählten Sequenzen geben einen wirksamen Hinweis auf das Vorhandensein von anti-HCV-Antikörpern im Blut von allen Patienten, die untersucht wurden, und reagieren nicht mit Blut von nicht-infizierten Individuen. Diese Daten zeigen, daß die Gruppe der ausgewählten Phagen-Klone ein zuverlässiges System zur Diagnose von Infektionen durch den Hepatitis C-Virus bildet. TABELLE I

Beispiel 6

Verfahren zur Herstellung von spezifischen diagnostischen Reagenzien und Immunogenen für die Krankheit Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV)

Das folgende Verfahren wurde erfindungsgemäß durchgeführt:
Eine erste "Genbank" von Epitopen wurde hergestellt, durch Phagen mit Oligopeptiden mit 9 Aminosäuren, die auf der Oberfläche des Capsids gezeigt wurden, exprimiert durch willkürliche Sequenz-Oligonucleotid-Inserts, eingeführt in das Gen, kodierend für das Protein VIII des Phagen-Capsids. Zur Expression der rekombinanten Proteine, enthaltend die Epitope, wurde das Plasmid pC89 verwendet, aufgebaut wie beschrieben bei F. Felici et al. Selection of Antibody Ligands from a Large Library of Oligopeptides Expressed on a Mulitvalent Exposition Vector, J. Mol. Biol., 1991, 222, 301-310, von dem ein Teil der genetischen Karte in der Figur gezeigt ist.
Eine zweite Epitop-"Bibliothek" wurde hergestellt in der gleichen Weise wie die erste, mit dem Unterschied, daß zwei Cysteinreste vorhanden waren an den zwei Enden des Inserts, wie beschrieben in A. Luzzago et al., Mimicking of discontinuous epitopes by phage displayed peptides, I. Epitope mapping of human H Ferritin, using a phage library of constrained peptides, Gene, 1993, 128, 51-57.
Proben von Antikörpern von Individuen, die an Typ II Kryoglobulinämie leiden, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV) wurden auf einem festen Träger immobilisiert und inkubiert mit den Phagen-Bibliotheken. Die Phagen, die spezifisch zurückgehalten wurden durch diese Antikörper, wurden dann eluiert und amplifiziert.
Bakterien, infiziert durch vorstehend ausgewählten Phagen, wurden auf ein festes Kulturmedium ausplattiert und auf Nitrozellulosefilter transferiert. Nachfolgend wurden diese Filter mit Seren von Patienten, die an Typ II Kryoglobulinämie leiden, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV) und unterschiedlich von dem Serum, das für die erste Anreicherung verwendet wurde, inkubiert. Die Phagen, die spezifisch die in diesen Seren vorhandenen Antikörper erkennen, wurden identifiziert und isoliert.
Die vorstehend identifizierten Phagen wurden gegen-selektiert auf die Reaktivität gegenüber Antikörpern, vorhanden in Seren von Individuen, nicht infiziert mit Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV), unter Verwendung des ELISA-Tests.
Die Reaktionsspezifität der Phagen, resultierend von dieser Gegenselektion mit Antikörpern, spezifisch für Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV), ist statistisch abgeschätzt worden wie folgt. Die Frequenz, mit der eine signifikante Anzahl von Seren von Patienten, die unter Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV), leiden, die Phagen-Klone erkennen, wird in einem ELISA-Test bestimmt. Parallel wird wiederum unter Verwendung des ELISA-Tests das Nichterkennen der Phagen-Klone durch eine signifikante Anzahl von Seren von Individuen, die nicht an der Krankheit leiden, getestet. Für jeden Phagen-Klon wird die Spezifität abgeschätzt durch Vergleich der Frequenz der Erkennung durch Seren von Patienten, die unter der Krankheit leiden, mit der von Seren von gesunden Individuen.
Die in dieser Art und Weise identifizierte Epitop-Peptidsequenz wurde nachfolgend bestimmt (SEQ ID NO:31 bis NO:42).

Beispiel 7

Nachweis der Wirksamkeit von ausgewählten Phagen als diagnostische Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins von Antikörpern im Serum, spezifisch für die Krankheit T nv = II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV)

Ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte, wurde durchgeführt:
16 menschliche Seren von Individuen, die nicht an der Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV), leiden, wurden in einem ELISA-Test analysiert auf ihre Fähigkeit, spezifisch die Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert wie beschrieben in Beispiel 6 mit der Peptidsequenz beschrieben als SEQ ID NO:31 bis NO:42. Die Ergebnisse zeigen, daß keines der Seren die ausgewählten Sequenzen erkennt.
80 menschliche Seren von Patienten, die an der Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV), leiden, wurden in einem ELISA-Test analysiert auf ihre Fähigkeit, spezifisch die Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert wie beschrieben in Beispiel 6, mit der Peptidsequenz beschrieben als SEQ ID NO:31 bis NO:42. Die Ergebnisse zeigen, daß jeder Phagen-Klon spezifisch erkannt wird durch die ausgewählten Seren mit einer Frequenz, die von 15 bis 60% variiert.
Die ausgewählten Sequenzen geben einen Hinweis auf das Vorhandensein von Antikörpern, spezifisch für Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV), im Blut von allen untersuchten Patienten und reagieren nicht mit Blut von Individuen, die nicht an dieser Krankheit leiden. Diese Daten zeigen, daß die Gruppe der ausgewählten Phagen-Klone ein zuverlässiges System zur Diagnose der Krankheit, Typ II Kryoglobulinämie, verursacht durch und/oder assoziiert mit dem menschlichen Hepatitis C-Virus (HCV), bildet.
Die ausgewählten Sequenzen zeigen eine signifikante Homologie mit der menschlichen LAG- 3-Gensequenz, die spezifisch in T-Lymphozyten und "natürlichen Killer"-Zellen exprimiert wird. Die gleichen Antikörper, die verwendet wurden, um die Phagen-Klone zu selektieren, reagieren mit dem Teil des LAG-3-Proteins, der homolog zur Sequenz der ausgewählten Phagen-Klone ist. Dieses Erkennen kann verhindert werden durch Verdrängung durch die ausgewählten Phagen-Klone. Diese Ergebnisse zeigen, daß die ausgewählten Phagen-Klone verwendet werden können, um die Auto-Antikörperbindung des Proteins LAG-3 zu blockieren.

Beispiel 8

Verfahren zur Herstellung von diagnostischen Reagenzien für die Diabetes Autoimmunkrankheit Typ I und Nachweis der Wirksamkeit von ausgewählten Phagen als diagnostische Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins von Autoimmunkrankheiten charakterisierenden Auto-Antikörpern in Blut

Das folgende Verfahren wurde gemäß der Erfindung durchgeführt:
Eine erste "Genbank" von Epitopen wurde hergestellt, durch Phagen mit Oligopeptiden mit 9 Aminosäuren, die auf der Oberfläche des Capsids gezeigt wurden, exprimiert durch willkürliche Sequenz-Oligonucleotid-Inserts, eingeführt in das Gen, kodierend für das Protein VIII des Phagen-Capsids. Zur Expression der rekombinanten Proteine, enthaltend die Epitope, wurde das Plasmid pC89 verwendet, aufgebaut wie beschrieben bei F. Felici et al. Selection of Antibody Ligands from a Large Library of Oligopeptides Expressed on a Mulitvalent Exposition Vector, J. Mol. Biol., 1991, 222, 301-310, von dem ein Teil der genetischen Karte in der Figur gezeigt ist.
Eine zweite Epitop-"Bibliothek" wurde hergestellt in der gleichen Weise wie die erste, mit dem Unterschied, daß zwei Cysteinreste vorhanden waren an den zwei Enden des Inserts, wie beschrieben in A. Luzzago et al., Mimicking of discontinuous epitopes by phage displayed peptides, I. Epitope mapping of human H Ferritin, using a phage library of constrained peptides, Gene, 1993, 128, 51-57.
Eine Probe von Seren von Diabetikern am Beginn ihrer klinischen Geschichte der Typ I Diabetes wurden auf das Vorhandensein von Antikörpern, spezifisch für gewisse bekannte Marker, charakteristisch für die Krankheit, die anti-Insulin- und ICA-Antikörper oder Antikörper gegen pankreatische Inselzellen, getestet. Ein Serum mit einem hohen Antikörpergehalt wurde danach zur Selektion verwendet.
Die in diesem Serum enthaltenen Antikörper wurden immobilisiert auf eine feste Matrix und inkubiert mit den Phagen-Bibliotheken. Die Phagen, die spezifisch durch diese Antikörper zurückgehalten wurden, wurden danach eluiert und amplifiziert.
Bakterien, infiziert durch vorstehend ausgewählten Phagen, wurden auf ein festes Kulturmedium ausplattiert und auf Nitrozellulosefilter transferiert. Nachfolgend wurden diese Filter mit Seren von Diabetikern, verschieden von den Seren, verwendet für die erste Anreicherung, inkubiert. Die Phagen, die spezifisch durch die in diesen Seren vorhandenen Antikörpern erkannt wurden, wurden identifiziert und isoliert.
Die vorstehend identifizierten Phagen wurden gegen-selektiert auf ihre Reaktivität gegenüber Antikörpern, vorhanden in den Seren von Individuen, die nicht an Typ I Diabetes leiden, unter Verwendung des ELISA-Tests.
Die Phagen, resultierend von dieser Gegenselektion, wurden auf ihre Reaktionsspezifität getestet durch ein Screening in großem Maßstab unter Verwendung von Seren von Diabetikern in verschiedenen Stadien der Krankheit. Die Nucleotidsequenz, kodierend für die in dieser Art und Weise identifizierten Epitope, wurde danach bestimmt.
Die Phagen-Klone wurden analysiert unter Verwendung des folgenden Verfahrens:
25 menschliche Seren von Individuen, zum Zeitpunkt des ersten klinischen Hinweises auf Typ I Diabetes, wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests auf ihre Fähigkeit, spezifisch die Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert wie beschrieben und mit der Peptidsequenz beschrieben als SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 und SEQ ID NO:47, getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß 36% der Seren spezifisch mindestens eine der fünf ausgewählten Sequenzen erkennt.
16 menschliche Seren von Individuen mit Autoimmunkrankheiten, anders als Diabetes, wurden analysiert unter Verwendung eines ELISA-Tests auf ihre Fähigkeit, spezifisch die Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert wie in Beispiel 8 beschrieben, mit der Peptidsequenz beschrieben als SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 und SEQ ID NO:47. Die Ergebnisse zeigen, daß 18% der Seren spezifisch mindestens eine der fünf ausgewählten Sequenzen erkennen.
50 menschliche Seren von Individuen, die nicht an Diabetes leiden oder an anderen Autoimmunkrankheiten, wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests analysiert auf ihre Fähigkeit, spezifisch die Phagen-Klone zu erkennen, identifiziert wie beschrieben in Beispiel 8 und mit der Peptidsequenz beschrieben als SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 und SEQ ID NO:47. Die Ergebnisse zeigen, daß keines der Seren spezifisch eine der fünf ausgewählten Sequenzen erkennt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S. p. A.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:Verfahren zur Herstellung von Immunogenen und diagnostischen Reagenzien, die hierdurch erhältlich sind
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN:47
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT:Società Italiana Brevetti
(B) STRASSE:Piazza di Pietra, 39
(C) STADT:Rom
(E) LAND:Italien
(F) POSTLEITZAHL:I-00186
(viii) VERTRETER:
(A) NAME:Di Cerbo, Mario (Dr.)
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER:RM/X88179/DC
(C) REFERENZNUMMER:612287 ROPAT
(ix) TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFONNUMMER:06/6785941
(B) TELEFAXNUMMER:06/6794692
(C) TELEX:612287 ROPAT
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:1
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:2
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:47 Basenpaare
(B) ART:Nucleinsäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:DNA
(iii) HYPOTHETISCH:nein
(iv) ANTISENSE:nein
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polynucleotid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:4:
GAATTCTGCC GAACCTGCGC CCATCCAGGT GAGCATGCGG GGGATCC 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:47 Basenpaare
(B) ART:Nucleinsäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:DNA
(iii) HYPOTHETISCH:nein
(iv) ANTISENSE:nein
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polynucleotid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID N0:5:
GAATTCTGCG GGCCTTTTTA TCTCTCTGCA CCTCAGTGCG GGGATCC 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:47 Basenpaare
(B) ART:Nucleinsäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:DNA
(iii) HYPOTHETISCH:nein
(iv) ANTISENSE:nein
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polynucleotid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:6:
GAATTCTGCG GTCCCTTCTT TCTCGCGGCT TCCGTATGCG GGGATCC 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:47 Basenpaare
(B) ART:Nucleinsäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:DNA
(iii) HYPOTHETISCH:nein
(iv) ANTISENSE:nein
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polynucleotid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:8:
GAATTCTGCG GTCCGTTTTT TCTCTCCCCG ACGTCATGCG GGGATCC 47
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MEHL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäwen
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:25:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:26:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:27:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:12 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:30:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:14 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:32:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:33:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:34:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:35:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:37:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:38:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:39:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP; intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:44:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:45:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE:15 Aminosäuren
(B) ART:Aminosäure
(C) STRANGFORM:Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLTYP:rekombinantes Protein
(iii) HYPOTHETISCH:ja
(v) FRAGMENTTYP:intern
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK:von rekombinanten Phagenpeptiden
(B) KLON:Phage
(ix) MERKMAL
(A) NAME:Polypeptid
(B) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN:Selektion mit spezifischen Antikörpern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:SEQ ID NO:47:

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung von immunogenen oder diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, unter Verwendung eines Verfahrens, das ausgeführt werden kann ohne jede Information über die Natur und/oder die Identifizierung des (der) Antigens (Antigene) des pathogenen Organismus, spezifisch für die Krankheit, und ohne jede Information über die Natur und/oder Struktur und/oder Eigenschaften der spezifischen Antikörper, umfassend die folgenden Schritte:

- Identifizierung von mindestens zwei Seren, die nicht charakterisierte Antikörper enthalten, reaktiv mit einem Antigen oder einem pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, selbst wenn ein solches Antigen und/oder pathogener Organismus nicht charakterisiert oder unbekannt ist;

- Konstruktion einer Phagen-Genbank, die Oligopeptide auf der Oberfläche des Capsids zeigt, exprimiert von willkürlichen Sequenzoligonucleotid-Inserts, eingeführt in ein Gen, das für ein Phagen-Capsid-Protein kodiert unter Verwendung genetischer Techniken;

- Selektion der Phagen, die antigene Oligopeptide auf den Oberflächen des Capsids zeigen mit einem pathologischen Serum, nachfolgendem Screening mit zusätzlichen pathologischen Seren, verschieden von dem vorhergehenden, von Individuen, die gegen die gleiche Krankheit immunisiert worden sind, um einen Phagen zu identifizieren, der Oligopeptide zeigt, die mit allen oder fast allen der getesteten Seren reaktiv ist und Counterscreening mit einem Panel von Seren von einem anderen Satz von gesunden Individuen oder jedenfalls nicht mit der gleichen Krankheit infizierten, als Kon trolle, um Oligopeptide zu identifizieren, die nicht mit allen oder fast allen Seren von Kontroll-Individuen reagieren.

2. Verfahren zur Herstellung von immunogenen oder diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, gemäß Anspruch 1, wobei die Konstruktion der Phagen-Genbanken ausgeführt wird mit filamentösen Phagen, ausgewählt aus der Gruppe umfassend M13, F1, Fd und Derivate hiervon.

3. Verfahren zur Herstellung von immunogenen und diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gen, das das Phagen-Capsid mit willkürlichen Sequenzoligonucleotid-Inserts kodiert, das Gen ist, das das Protein VIII des Phagen-Capsids kodiert.

4. Verfahren zur Herstellung von immunogenen und diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, gemäß Anspruch 1 bis 2, wobei das Gen, das das Phagen-Capsid mit willkürlichen Sequenzoligonucleotid-Inserts kodiert, das Gen ist, das für das Protein III in dem Phagen-Capsid kodiert.

5. Verfahren zur Herstellung von immunogenen und diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das pathogene Agens ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend das Oberflächen-Antigen des menschlichen Hepatitis B-Virus (HBsAg), der menschliche Hepatitis C-Virus und Antigene, pathogen verknüpft mit Autoimmunkrankheiten wie Diabetes.

6. Verfahren zur Herstellung von immunogenen und diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, gemäß Anspruch 5, wobei der Antikörper mit neutralisierender oder schützender Aktivität gegenüber dem pathogenen Reagenz enthalten ist in dem Serum der Individuen, immunisiert unter Verwendung des Oberflächen-Antigens des Virus von menschlichem Hepatitis B-Virus (HBsAg) oder in dem Serum von Individuen, infiziert mit dem menschlichen Hepatitis C- Virus.

7. Verfahren zur Herstellung von immunogenen und diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogenen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die antigenen Oligopeptide, die durch den verwendeten Antikörper erkannt werden, erhalten werden durch die Expression von willkürlichen Sequenzoligonucleotid-Inserts unter Verwendung des Plasmids pC89 als ein Vektor.

8. Verfahren zur Herstellung von immunogenen und diagnostischen Reagenzien, die ein Antigen oder einen pathogerlen Organismus, spezifisch für eine Krankheit, nachahmen, gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die filamentösen Phagen in ihrem Capsid, in dem Protein VIII oder in dem Protein III eine Aminosäuresequenz zwischen der Restriktionserkennungsstelle EcoRI (GAATTC) bis zur Restriktionserkennungsstelle BamHI (GGATCC) enthalten, ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Sequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:9 bis 47.