DE3856199T2

DE3856199T2 - Impfstoff gegen cholera

Info

Publication number: DE3856199T2
Application number: DE3856199T
Authority: DE
Inventors: John J. Cambridge Ma 02138 Mekalanos; Ronald K. Memphis Tn 38163 Taylor
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1987-04-29
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1999-02-04
Anticipated expiration: 2008-04-30
Also published as: EP0358692B1; AU1725788A; WO1988008431A1; FI895108A0; JP2777894B2; JPH02503914A; HU205372B; DE3856199D1; AU629793B2; HUT53915A; EP0358692A1; EP0358692A4; ATE166880T1

Description

Hintergrund zu der Erfindung

Die vorliegende Anmeldung ist eine Continuation-in- part der Anmeldung von Mekalanos, mit dem Titel "Cholera- Impfstoffe" und der US-Anmeldenummer 053 907, die demselben Inhaber gehört wie die vorliegende Anmeldung und deren gesamte Figurenbeschreibung und Figuren durch Bezugnahme inkorporiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft den immunologischen Schutz gegen Vibrio cholerae.
V. cholerae ist eine Bakterienspezies, die beim Menschen durch Besiedlung des Dünndarms und Sezernierung eines Proteintoxins eines Durchfallerkrankung verursachen kann. Die Wirkung des Choleratoxins ist sehr genau charakterisiert. Das Toxin weist zwei Untereinheiten, die A- und die B-Untereinheit auf; die B-Untereinheit hat keine bekannte toxische Aktivität, sondern schafft bis zu einem gewissen Grad einen immunologischen Schutz, wenn sie als Komponente bei einem Impfstoff verwendet wird. Black et al. 1986 In Advances in Research on Cholera and Related Diarrheas 3 : 271. eds. Kuwahara et al.
Abgesehen von den Impfstoffen mit der B-Untereinheit enthalten Impfstoffe gegen Cholera auch denaturiertes Gesamtcholeratoxin, abgetötete Vollzellen von V. cholerae, die üblicherweise auf einem festen Medium bei einem pH- Wert zwischen 7,5-8,0 gezüchtet wurden, oder Mischungen von abgetöteten Zellen und inaktivierten Toxinmolekülen. Andere Impfstoffe enthalten lebende abgeschwächte V. cholerae-Stämme, die die A-Untereinheit des Choleratoxins nicht produzieren, sowie abgeschwächte Stämme von heterologen, Nicht-Vibrio cholerae-Trägern, d. h. nicht-V. cholerae-Stämme, beispielsweise Salmonella typhi Ty21A mit klonierten Genen, die für das gegen Cholera schützende Antigen O1 codieren (J. Infectious Desease 131 : 553--558, 1975).
Ehara et al. (Trop. Med. 28 : 21, 1986; und Vaccine, 1988) beschreiben die Reinigung von der Pili von V. cholerae mit einem strukturellen Untereinheitprotein von etwa 16 kD. Dieses Protein wird nicht durch Coomassie Blue gefärbt und seine Haemagglutinationstiter (HA) ist nicht mannoseempfindlich. AL-Kaissi et al. (J. App. Bact.. 58: 221, 1985) beschreiben auch Pili, die einen mannoseempfindlichen HA-Titer haben.
Kanoh (Nippon Saikingaku Zasshi, 36 : 465, 1981), Melnikova et al. (Mol. Biol. Genet. Russian 2 : 18, 1982) und Kanoh (Jpn. J Bacteriol. 36 : 465, 1981) beschreiben Sexpili von V. Cholerae, die durch Plasmidgene codiert werden. Holmgren et al. (Infect. Immun. 33 : 136, 1981) beschreiben verschiedene E. coli-Pili.
Taylor et al. berichten in Bacterial Vaccine and Local Immunity (Ann Sclavo 1986 n. 1-2, 51-61), dass bei einer Reihe von V. cholerae mutanten Stämmen mit einem Kolonisierungsfehler gefunden wurde, dass ihnen ein 20,5 kD-Protein fehlt, das als Pilusprotein identifiziert wurde und bei dem erkannt wurde, dass es mit dem Choleratoxin koreguliert wurde.
Shaw et al. berichtet in American Society for Microbiology, Abstracts of the Annual Meeting held Atlanta, USA 1-6 March 1987, dass die Analysen von klonierten TcpA- Genen von V. cholerae gezeigt haben, dass das Pilusprotein Ähnlichkeit mit anderen Pilusproteinen hat, zu denen eine modifizierte N-terminale Aminosäure, eine hydrophobe Domäne und eine potenzielle Cysteinschleife gehören.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde herausgefunden, dass eine Proteinstruktur an der Oberfläche von V. cholerae, die als Pilus bezeichnet wird, speziell ein toxin-koregulierter Pilus ("TcpA-Pilus") als Mittel zum Anhaften von V. cholerae in dem Darm oder zur Besiedlung des Darms dienen. Die Produktion dieses Pilus wird unter bestimmten Laborkulturbedingungen deutlich verstärkt. Die B-Untereinheit des Choleratoxins ist mit der Produktion des TcpA-Pilus koreguliert und auch als Impfstoffkomponente brauchbar. Zusätzlich haben wir die Strukturgene für die TcpA-Pilusuntereinheit kloniert und die hergeleitete Aminosäuresequenz des TcpA-Proteins bestimmt. Die Verwendung dieser Materialien und dieser Informationen ermöglicht die Produktion mehrerer unterschiedlicher Typen von Choleraimpfstoffen, die in der Lage sind, die Produktion von schützenden Antikörpern zu stimulieren, die den TcpA-Pilus erkennen und somit das Anhaften in dem menschlichen Darm durch V. cholerae und dessen Besiedelung zu unterdrücken.
Gemäß einem ersten Aspekt schafft die Erfindung demgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Cholera-Impfstoffes, zu dem es gehört, eine Kultur von V. cholerae Zellen mit einem mutierten htx-Gen in einem Wachstumsmedium zu züchten, wobei der toxinkoregulierte Pilus in einer Konzentration von 1% oder mehr, bezogen auf das gesamte Zellprotein, vorhanden ist und ein Tier mit den Zellen oder Zellkomponenten aus der Kultur zu impfen.
Der zweite Aspekt der Erfindung zielt auf ein Verfahren zum Herstellen eines Cholera-Impfstoffes, wobei es zu dem Verfahren gehört, eine Kultur von V. cholerae-Zellen auf einem Wachstumsmedium bei einem pH-Wert von etwa 6,5 oder weniger wachsen zu lassen, wobei der toxin-koregulierte Pilus in einer Konzentration vorhanden ist entsprechend 1% oder mehr des gesamten Zellproteins und ein Tier mit den Zellen oder Zellkomponenten aus dieser Kultur geimpft wird.
Vorzugsweise ist der Impfstoff ein Vollzellenimpfstoff, und zu dem Verfahren gehört es ferner, dass die Zellen abgetötet werden; oder der Impfstoff enthält einen TcpA-Pilus und das Verfahren beinhaltet es, dass die V. Cholerae geerntet und der TcpA-Pilus von den Zellen isoliert wird; oder der Impfstoff enthält die B-Untereinheit des Choleratoxins und das Verfahren sieht ferner vor, dass die Vibrio cholerae-Zellen geerntet werden und die B-Untereinheit des Choleratoxins aus den Zellen isoliert wird.
Die Erfindung zielt außerdem auf Bakterienzellen mit wenigstens 1% des Gesamtproteins als TcpA. Vorzugsweise fehlen den Zellen die toxischen Werte des Choleratoxins; und höchst vorzugsweise sind die Zellen Vibrio colerae- Zellen mit einem mutierten htx-Gen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Struktur

TcpA-Pilus

Die Figur zeigt die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz des Gens, das für den TcpA-Pilus bei V. cholerae codiert.
Der TypA-Pilus ist ein Beispiel für eine faserförmige Oberflächenkomponente (Pilus) von V. cholerae-Zellen. Wenn er von den Vollzellen V. cholerae 0395 isoliert wird, hat er ein Molekulargewicht, das in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bei 20,5 KD erscheint. Der TcpA-Pilus ist mit den makromolekularen fadenförmigen Strukturen auf der Oberfläche von V. cholerae assoziiert und kann durch Differenzialzentrifugation teilweise gereinigt werden. Der Pilus wird in signifikanten Mengen nur unter bestimmten Umgebungsbedingungen beim Züchten von V. cholerae-Zellen produziert. Beispielsweise tritt die beste Produktion bei einem niedrigen pH-Wert, vorzugsweise einem pH-Wert von 6,5 oder niedriger auf, und ist bei einem pH-Wert von 7,5 praktisch nicht messbar. Ferner ist seine Produktion am besten bei einem niedrigen Ionenkonzentrationsmaß entsprechend etwa zwischen 50-100 mM NaCl. Zu anderen Faktoren, die die Produktion des TcpA-Pilus kontrollieren, gehören das Vorhandensein von Aminosäuren in dem Wachstumsmedium (beispielsweise LB, siehe unten), die Durchlüftung (beispielsweise 0,5-2 l/min pro 6 Liter Medium), die Art des Mediums (vorzugsweise flüssig) und der Inkubationstemperatur (beispielsweise 25-30ºC). Zusätzlich wird der TcpA- Pilus nur in einer speziellen Wachstumsstufe der V. cholerae-Zellen produziert (beispielsweise der stationären Phase). Diese Wachstumsbedingungen sind im Allgemeinen für das Zellwachstum nicht optimal; statt dessen sind sie für die Produktion des TcpA-Pilus optimal.
Die TcpA-Pili bilden, wenn sie gereinigt sind, Bün del, das Protein wird durch Coomassie Blue gefärbt und ihre Haemagglutinationsaktivität wird durch Mannose nicht beeinträchtigt.
Um den Prozentanteil von TcpA in der Zubereitung zu messen, lässt man einen Teil der Zubereitung in einem Gel laufen, lässt es mit einem Antikörper für TcpA reagieren, um das Proteinband entsprechend dem TcpA zu lokalisieren, schneidet das Band wird aus einem Gel heraus und bestimmt die Menge des TcpA. Das Gesamtprotein wird mit Standardverfahren bestimmt und dazu verwendet, den Prozentsatz an TcpA zu berechnen.
Das Gen, das für den TcpA-Pilus in V. cholerae codiert, wurde, wie unten beschrieben, kloniert; seine DNA- Sequenz ist in Fig. 1 gezeigt. Das TcpA-Gen ist auf einem Chromosom lokalisiert. Unter Verwendung dieser klonierten DNA, verwandter DNA von anderen Stämmen von V. cholerae oder synthetische DNA, die im Wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz codiert, wie sie in der Figur gezeigt ist, kann den TcpA-Pilus in anderen Bakterienstämmen unter Verwendung von Standardverfahren produzieren. Demzufolge beinhaltet der Ausdruck "TcpA-Pilus" auch Proteine mit Aminosäuremodifikationen, die die Antigenfähigkeit des Moleküls nicht wesentlich beeinträchtigen. In ähnlicher Weise bezeichnet Gen, das für den TcpA codiert, auch Gene, die für solche Aminosäuremodifikationen codieren oder für Antigeneabschnitte des TcpA. Beispielsweise kann die DNA in jeden beliebigen Standardvektor eingefügt und in Bakterienstämme transformiert werden, die in der Lage sind, den TcpA-Pilus zu exprimieren; ein Beispiel hierfür ist nachstehend gegeben.

Beispiel 1: Klonieren des TcpA-Gens

TnphoA stellt ein Derivat des Transposons Tn5 dar, das ein breites Wirtsspektrum und seine zufälligen Einfügungseigenschaften erhalten hat, jedoch zusätzlich Fusionen zwischen Zielgenen und phoA, dem Gen für die alkalische Phosphatase von Scherichia coli erzeugen kann (Monoil et al. 82 Proc. Nat 1 Acad. Sci USA 8129, 198F). Solche Genfusionen codieren Hybridproteine, die sich aus einem caboxylterminalen Abschnitt alkalischen Phosphatase (PhoA) zusammensetzt, das innerhalb eines Rahmens mit einem aminoterminalen Abschnitt eines Zielgenproduktes fusioniert. Dieses Hybridprotein zeigt nur wenig oder überhaupt keine PhoA-Aktivität, solange das Zielgen nicht für ein sezerniertes oder membranüberbrückendes Protein codiert. Diese aktiven Fusionen werden leicht als blaue Kolonien identifiziert, indem das chromogene alkalische Phosphatasesubstrat 5-bromo-4-chloro-3-Indolylphosphat (XP) in Agarmedium inkorporiert wird, auf dem die Bakterienzellen platiert wurden, die die TbphoA-Inserts tragen. Da in der Tat alle bakteriellen Proteine, die als Virulenzfaktoren angesehen werden, periplasmatisch, extrazellulär oder zelloberflächenassoziiert sind, liefert dieses Verfahren eine starke Anreicherung für Insertionsmutationen, die die pathogenen Eigenschaften der Bakterien beeinträchtigen können, beispielsweise die Besiedelung oder die Toxinproduktion.
Zufällige Insertionen von TnphoA in dasselbe Chromosom von V. cholerae wurde mittels der Verwendung von pRT291 erreicht, einem Derivat des P-Gruppenplasmids pRK290 mit breitem Wirtsspektrum (Mekalanos, Nature 276: 633, 1978), das eine Kopie von TnphoA trägt (durch spontane Transposition mit TnphoA hergestellt). Kurz gesagt, werden chromosomale Inserts von TnphoA in V. cholerae-Stämmen erhalten, die pRT201 tragen, indem eine Superinfektion mit dem inkompatiblen Plasmid pPh1JI (Id.) durchgeführt und auf Widerstandsfähigkeit gegenüber Kanamycin und Gentamycin selektiert wird. V. cholerae-Kolonien, die Inserts von TnphoA tragen, wurden nach dem PhoA&spplus;- Phenotyp auf LB-Agar gescreent, der 0,2% Glucose und 20 mg/ml XP bei 30ºC enthält.
Ein Pool von mehreren tausend V. cholerae-Kolonien, die Inserts von TnphoA tragen, wurden auf Mutationen hin gescreent, die für PhoA&spplus;-Fusionsproteine codieren. Etwa 1% der Kolonien, die Inserts von TnphoA tragen, waren auf ihrem Medium blau, was anzeigt, dass sie Kopien von TnphoA tragen, die mit Genen fusioniert waren, die für sezernierte oder Membranproteine codieren, die in diesem Medium exprimiert sind.
Vierzig dieser blauen Kolonien wurden gereinigt und für ihr gesamtes Proteinprofil mittels Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) analysiert. Wildtypen und mutante Stämme von V. cholerae wurden in LB-Brei bei einem pH-Wert von 6,5 bei 30ºC 18 Stunden lang mit Belüftung wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in einem Probenpuffer mit einem reduzierenden Wirkstoff lysiert und mittels Elektrophorese durch ein 12,5 %iges Polyacrylamidklatschgel in Anwesenheit von NaDodSO&sub4; analysiert, wie dies zuvor durch Mekalonos et al. beschrieben wurde (16 Infect. Immun. 787, 1977).
Sieben Mutanten hatten erkennbare Unterschiede in ihrem Proteinprofil, was sich in dem Verlust von einem oder mehreren Banden zeigte. Ein Mutantentyp, der durch den Stamm RT110.21 repräsentiert ist, hat ein einziges Protein mit einem Mulekulargewicht von 20.5 KD verloren.
Eine Mutante, bei der das 20,5 KD-Protein fehlt, wurde auf Besiedelungsdefekte mittels eines Konkurrenztestes untersucht, bei dem 3-9 Tage alte CD-1-Mäuse mit der Mutante zusammen mit dem elterlichen Stamm infiziert wurde, im Wesentlichen in der Art, wie dies durch Freter Ea al. 34 Infect. Inmun 234, 1981 beschrieben wurde. Der mutante Stamm RT110.21, der das 20,5 KD-Protein verloren hatte, zeigte eine deutliche Abnahme hinsichtlich seiner Fähigkeit, in vivo mit dem elterlichen Stamm zu konkurrieren, jedoch nicht in vitro. Andere Konkurrenzversuche, die mit anderen unabhängig isolierten Mutanten, denen das 20,5 KD- Protein fehlte, isoliert wurden, bestätigten, dass diese Rasse von Mutanten bei der Besiedelung sowohl in kindlichen Mäusen als auch in erwachsenen Karnickeln gravierende Defekte zeigte.
Die Zellfraktionierung zeigte, das das 20,5 KD-Protein mit makromolekularen Strukturen assoziiert ist, die auf der Oberfläche der Bakterienzelle lokalisiert sind. Eine flagellantenfreie Mutante (mot-39; Mekalanos, 306 Nature 551, 1983), die von dem Stamm 0395-N1 abgeleitet wurde, wurde dazu verwendet, diese Strukturen mittels mehrerer Durchgänge durch eine differenzielle Sedimentation von zerteilten Zellen teilweise zu isolieren. Der Stamm wurde in LB-Brei bei einem pH-Wert von 6,5 wachsen gelassen. Eine Menge von 400 ml Brei pro 2-Literflasche wurde verwendet und die Kultur wurde bei 30ºC 16 Stunden lang mit 150 U/min inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und in einem Puffer erneut suspendiert, der 12,5 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,0, 25 mM NaCl, 4 mM MgCl&sub2; und 4 mM CaCl&sub2; enthielt. Nach dem Zerkleinern der Bakterien mittels einer Passage durch eine 21-iger Nadel wurden die Pili mittels mehrerer Durchgänge von differenzieller Zentrifugierung gereinigt, um die Zellen und die löslichen Proteine zu entfernen. Typischerweise wurden die zerkleinerten Zellen 20 Minuten lang mit 3000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gesmamelt und das Pellet weggeworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde sodann 40 Minuten lang mit 15 000 g zentrifugiert. Der Überstand aus diesem Schritt wurde weggeworfen, das Pellet gesammelt und (in TCP-Puffer) erneut suspendiert. Diese beiden differenziellen Zentrifugierungsschritte wurden zwei Mal wiederholt. Das endgültige Pellet bildet den gereinigten TcpA (d. h. das TcpA-Protein bildet mehr als 50% des gesamten Zellproteins) in einer solchen Zubereitung. Die Reinigung der Pili wurde überwacht, indem die Reinigung der 20,5 KD Pilus-Untereinheit mittels PAGE verfolgt wurde. Die gereinigten Pili wurden nach dem Färben mit 2% Ammoniummolybdat unter dem Elektronenmikroskop beobachtet. Die Untersuchung dieser Zubereitungen unter dem Elektronenmikroskop zeigten lange seitlich aneinanderliegende Fimbrien oder Pili (Durchmesser 7 nm). Einzelne Pilusfilamente konnten auf der Oberfläche der Zellen des Stammes 0395 beobachtet werden, jedoch nicht auf den Zellen mit TnphoA induzierten Mutanten, die das 20,5 KD-Protein verloren hatten.
Das 20,5 KD-Protein wurde durch Elektroeluierung nach dem PAGE weiter gereinigt und einer N-terminalen Aminosäuresequenzanalyse unterzogen. Die Sequenzierungsdaten entsprechenden denen, wie sie in der Figur gezeigt sind. Die Sequenz ist stark hydrophob und kann einen Teil oder die geseamte sekretorische Signalsequenz darstellen. In Übereinstimmung mit dieser Schlussfolgerung hat die Subklonierung der TnphoA-Fusion aus dem RT110.21-Stamm und der DNA- Sequenzierung gezeigt, dass das phoA-Gen mit der 92 Codons langen Sequenz, die für den Pilus codiert, fusioniert hat, die stromab der Sequenz angeordnet ist, die für diese hydrophobe Strecke von Aminosäuren codiert. Zwei andere Mutanten, die das 20,5 KD-Protein verloren hatten, enthalten ebenfalls TnphoA-Inserts, die phoA an denselben offenen Leserahmen fusioniert haben, was bestätigt, dass diese Sequenz tatsächlich das Strukturgen für den V. cholerae- Pilus darstellt.
Wir haben das Gen für das tcpA-Gen in zwei Schritten kloniert. Zunächst wurde die tcpA-TnphoA-Genfusion, die von dem RT110.21 getragen wurde, auf ein Plasmid kloniert, indem nach seinem Kanamycinresistenzphenotyp in E. coli selektiert wurde. Sodann wurde eine Genprobe, die aus den DNA-Sequenzen neben dieser TnphoA-Fusion abgeleitet wurde, dazu verwendet, einen Cosmidklon zu identifizieren, der den Wildtyp des tcpA-Gens des Stammes 0395 (Id.) trägt. Dieses Plasmid, bezeichnet mit pCS12g7, trägt ein aktives tcpA-Gen, wie dies mit den nachfolgenden Experimenten gezeigt wurde:
a. Wenn pCS12G7 in den tcpA-mutanten Stamm RT110.21 eingebracht wird, füllt es den Pilusdefekt aus und der das Plasmid tragende Stamm kann wieder den TcpA-Pilus produzieren.
b. Die DNA-Sequenzierung des gesamten tcpA-Gens bestätigt seine Lokation auf dem pCS12G7. Diese Sequenz ist in der Zeichnung wiedergegeben.
c. Wenn pCS12G7 in V. cholerae-Stämme 0395-N1 oder 569BN1 eingebracht wird, induziert es einen Phenotyp mit Hyperpiliation, wobei diese Stämme zwei bis drei Mal mehr TcpA-Pili produzieren als sie üblicherweise in dem Exprimierungsmedien produziert werden. 560B-N1 stellt einen Inaba-Serotypstamm von V. cholerae dar. Er verfügt über eine Auslassung in dem ctxA-Gen, ist jedoch ctxB+. Der Stamm wurde mittels Transduktion der ctxAB Kmξ-Mutation von 0395-NT in ein spontan hochbewegliches Derivat von 560B konstruiert (der Stamm 569B ist übicherweise unbeweglich). Der Transduktant (Stamm 569B-NT) wurde dann mittels Rekom bination mit pJM290.2 (Id.) in 569B-N1 konvertiert.
d. Wenn pCS12G7 in E. coli oder Salmonella thyphimurium LB5000 eingebracht wird, erzeugt er eine Proteinuntereinheit, die hinsichtlich der Größe und der immunologischen Eigenschaften identisch mit dem TcpA-Protein ist, das mittels Western blot-Analyse gefunden wird.

B-Untereinheit des Choleratoxins

Die B-Untereinheit liegt in dem Choleratoxin in einem Verhältnis von 5 : 1 zu der A-Untereinheit vor. Sie hat keine bekannte toxische Aktivität und sie ist als Komponente für Impfstoffe gegen Cholera brauchbar. Es sind Stämme von V. cholerae-Mutationen bekannt, die die A-Unterheit inaktivieren. Die Menge sowohl an A- als auch an B- Untereinheiten kann deutlich gesteigert werden, indem man die V. cholerae-Zellen in einem Medium wachsen lässt, das, wie oben beschrieben, zur Produktion des TcpA-Pilus geeignet ist. Durch Verwendung von Mutanten, die eine inaktive A-Untereinheit aufweisen, beispielsweise Stämme mit ctxA-Auslassung (Id.), ist es möglich, Zellen wachsen zu lassen, um gleichzeitig große Mengen sowohl an der Untereinheit B als auch an TcpA-Pili zu produzieren.
Der Grund für die gesteigerte Produktion der B-Untereinheit und des TcpA-Pilus scheint darin zu liegen, dass die Gene, die für diese Proteine codieren, durch dasselbe Gen --toxR--reguliert werden, dessen Regulation oder Aktivität wiederum durch die Wachstumsbedingungen beeinflusst wird.
Durch Verwendung von einer tCpA-spezifischen Hybridisierungsprobe (auf einem DNA-Fragment, das nur Nukleoti de enthält, die bekanntermaßen Aminosäuren des TcpA-Proteins codiert) haben wir ferner gezeigt, dass das tcpA-Gen in allen Stämmen von V. cholerae präsent ist, die aus Patienten mit Cholera isoliert wurden. Im Gegensatz dazu enthalten verschiedene aus der Umwelt stammende Stämme von V. cholerae (d. h. Stämme, die aus Wasserquellen anstelle von Patienten isoliert wurden), das tcDA-Gen nicht. Diese Beobachtungen stützen die Annahme, dass der tcpA für den Besiedlungsfaktor bei allen V. cholerae-Stämmen codiert, die bei der menschlichen Durchfallerkrankung beteiligt sind. Aus der Umwelt stammende Stämme von V cholerae, die das tCpA-Gen nicht enthalten, sind außerdem dafür bekannt, dass sie bei menschlichen Freiwilligen sich nur schlecht ansiedeln und bei diesen Freiwilligen, wenn überhaupt, nur eine geringe Immunität induzieren. Levine et al., In Acute Enteric Infections in Children, Ch 26., 1981 Elsevier. Die Erklärung hierfür ist, dass diese Stämme den TcpA-Pilus nicht bilden können und damit Menschen nicht besiedeln oder schützende Antikörper induzieren können, die mit dem TcpA-Pilus reagieren.

Cholera-Impfstoffe

Die Fähigkeit sowohl den TcpA-Pilus als auch große Mengen der B-Untereinheit zu produzieren, machen die Konstruktion einer Vielfalt von Cholera-Impfstoffen möglich.

a. Abgetötete Vollzellenimpfstoffe

Für diesen Impfstoff lässt man V. cholerae-Zellen unter Bedingungen wachsen, die eine starke Exprimierung des TcpA-Pilus und/oder der B-Untereinheit des Choleratoxins gestatten. Wir haben solche Bedingungen für die Stäm me 0395-NI, 569B-NI und ihre Derivate (siehe Beispiel 2 unten) geschaffen und haben auch gezeigt, dass diese Bedingungen in ähnlicher Weise für theoretisch jeden Stamm von V. cholerae eingerichtet werden können, vorausgesetzt, dass die Produktion des TcpA und der B-Untereinheit des Choleratoxms als Wachstumsoptimierungsparameter verwendet wird. In ähnlicher Weise können mutante Stämme von V. cholerae isoliert werden, die in TcpA und die B-Untereinheit Wachstumsbedingungen produzieren, die sich von den hier dargestellten unterscheiden (siehe Stamm 569B htx-5 in Beispiel 2 unten). Der wesentliche Aspekt unserer Erfindung besteht darin, dass die Kultivierung von V. cholerae unter bestimmten Wachstumsbedingungen Zellen erzeugen kann, die die TcpA-Pili auf ihrer Oberfläche in einem hohen Maße exprimieren (d. h. mehr als 1% des gesamten Zellproteins) und somit einen geeigneten Cholera-Impfstoff darstellen. Sobald geeignete Stämme unter geeigneten Bedingungen gezüchtet sind, werden diese Zellen mittels Standardverfahren abgetötet, beispielsweise durch Behandlung mit Glutaraldehyd oder Formalin. Die Behandlung muss so sein, dass sie die antigenen Eigenschaften des TcpA- Pilus und der B-Untereinheit nicht beschädigen.
Dieser Impfstoff kann mit gereinigter B-Untereinheit ergänzt werden, die durch Standardverfahren erzeugt wurde oder indem Zellen unter Bedingungen wachsen gelassen werden, die seine Produktion steigern, um sodann diese Proteine mittels Standardverfahren zu reinigen.

Beispiel 2:

Dieses Beispiel demonstriert die Produktion der B- Untereinheit von Cholera und Pili tragender V. cholerae- Zellen zur Verwendung in Impfstoffen mit abgetöteten Voll zellen und zur Zubereitung des gereinigten TcpA-Pilus.
Wenigstens drei unterschiedliche Stämme von V. cholerae können zur Erzeugung von Pili tragenden Zellen und der B-Untereinheit des Choleratoxins verwendet werden. Die Stämme 0395-N1 und seine hyperpilierten Derivate 0395-N1 (pCS12G7) sind vom Ogawa Serotyp, während die Stämme 569B- N1 und ihre hyperpilierten hypertoxigenen Derivate 569B-N1 htx-5 vom Inaba Serotyp sind. Der Stamm 569B-N1 htx-5 stellt ein Derivat des Stammes 569B-N1 dar, der eine htx- Mutation trägt, die mittels Standardverfahren isoliert wurde (Mekalanos et. al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 941 1978). Wir haben herausgefunden, dass die htx-Mutation zusätzlich zu dem Hervorrufen einer Hyperproduktion an Choleratoxin auch die Hyperproduktion des TcpA-Pilus verursacht, und zwar sowohl unter den Wachstumsbedingungen, wie sie unten herausgestellt sind, als auch unter anderen Wachstumsbedingungen, die für gewöhnlich für die TcpA-Produktion nicht zulässig sind (d. h. hoher pH-Werte, beispielsweise 7,5). Ein Cholera-Impfstoff aus getöteten Vollzellen sollte vorzugsweise sowohl Zellen des Ogawa- als auch des Inaba-Serotyps enthalten und deswegen werden üblicherweise getrennte Kulturen eines Ogawa und eines Inaba Serotyps produziert. Die hyperpilierten Derivate erzeugen zwei bis drei Mal mehr TcpA-Pili als ihre elterlichen Derivate, da sie entweder eine hohe Kopienanzahl des Plasmids pCS12G7, der das tcDA-Gen des Stammes 0395 (d. h. 0395-Nl pC512G7) enthält, oder die htx-Mutation tragen (d. h. 569B-N1 htx-5). All diese Stämme werden wie unten beschrieben kultiviert, mit der Ausnahme, dass zu dem Medium Ampicillin hinzugegeben wird mit einer endgültigen Konzentration von 50 ug pro Milliliter bei dem Stamm 0395- N1 (pCS12G7).
Starterkulturen des ausgewählten V. cholerae-Stammes werden in Teströhrchen zubereitet, die 2 ml an LB-6,5 Medium enthalten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid, pH-Wert auf 6,5 vor der Behandlung im Autoclaven eingestellt) und bei 30ºC in einem Rollinkubator mit einer Drehzahl von 30 U/min 18 Stunden lang inkubiert. Die anfängliche Zelldichte der Starterkultur ist niedrig (etwa 107/ml, eingeimpft aus einer frischen Kultur auf einer Agarplatte) und nach dem Wachstum ist leicht mit dem unbewaffneten Auge das Autoagglutinieren der Bakterienzellen in Gestalt von Materialklumpen zu sehen. Die Bakterienzellen, die miteinander verklumpt sind, lässt man sich in einem aufrecht stehenden ruhenden Röhrchen absetzen und sie werden sodann mit einer Pipette von dem Boden abgesammelt. Die verklumpten Zellen werden dazu verwendet, 6 Liter von LB-6,5 zu impfen, das in einem Fermentationsgefäß enthalten ist, das in dem Sinne geeignet geformt ist, dass Luft durch das Medium hindurchgepumpt und als feine Bläschen dispergiert wird. Die Kultur wird bei moderater Durchlüftung (0,5-1 l/min) bei 25ºC 24 Stunden lang inkubiert, wobei während dieser Zeit die Kultur die stationäre Phase erreicht und nahezu vollständig autoagglutiniert. Die verklumpten Bakterienzellen, die die TcpA-Pili auf ihrer Oberfläche tragen, werden durch Zentrifugieren gesammelt und in 600 ml von 0,85% Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 erneut suspendiert.
Diese pilierten V. cholerae-Zellen werden sodann zur Herstellung von gereinigtem TcpA-Pili oder abgetöteten Vollzellen verwendet, während der zellfreie Kulturüberstand dazu verwendet wird, die B-Untereinheit des Choleratoxins mittels Standardverfahren zu reinigen (Mekanalos et al., Infection and Immunity 16 : 789, 1977 und 20 : 552, 1978).
Es wird vorausgesetzt, dass das Verfahren, das zum Abtöten dieser Fimbrien tragenden Zellen und zum Konservieren zur Verwendung in einem Impfstoff aus Vollzellen, die Immunogenität der TcpA-Pili nicht zerstört. In diesem Sinne tötet die 24-48 Stunden andauernde Behandlung der Fimbrien tragenden Zellen mit 1% Glutaraldehyd oder 1% Formalin die Organismen effektiv, während die Immunogenität der TcpA-Pili erhalten bleibt. Die Formulierung einer oralen oder parenteralen Dosis dieses Impfstoffs aus abgetöteten Vollzellen sollte vorzugsweise wenigstens 10¹&sup0; abgetötete Fimbrien tragende V. cholerae-Zellen des Ogawa Serotyps (0395-N1 oder 0395-N1 (pCS12G7)) und wenigstens 10¹&sup0; abgetötete Fimbrien tragende V. cholerae-Zellen des Inaba Serotyps (569B-N1 oder 569B-N1 htx-5) enthalten.
Die Schutzwirksamkeit eines solchen Impfstoffes kann weiter verbessert werden, indem 200-500 Mikrogramm der gereinigten B-Untereinheit des Choleratoxins beigegeben werden, die aus denselben Kulturen gewonnen wird, die zur Herstellung der Fimbrien tragenden V. Cholerae-Zellen verwendet wurde. Es ist zu beachten, dass alle vier Produktionsstämme von der A-Untereinheit des Toxins befreit sind und dass die obigen Kulturbedingungen optimal für das Exprimieren sowohl des TcpA-Pilus als auch der B-Untereinheit sind - diese sind die bevorzugten Typen für die Produktionsstämme und Bedingungen.
Alternativ können die Fimbrien tragenden Zellen zerteilt und der TcpA-Pilus durch Differenzialsedimentation oder andere Verfahren gereinigt werden, um sodann anschließend entweder alleine oder in Verbindung mit der gereinigten Cholera-B-Untereinheit als Impfstoff verwendet zu werden.

b. TcpA-Pilus-Impfstoff

Dieser Impfstoff besteht aus wenigstens einem immunogenen Fragment des TcpA-Pilus (beispielsweise einem Fragment, das wenigstens eine TcpA-Pilus-Determinante und vorzugsweise zwei oder drei solcher Determinanten trägt). Der Pilus kann entweder synthetisch oder aus Vollzellen hergestellt werden, die unter geeigneten Bedingungen gewachsen sind und sodann durch Standardverfahren gereinigt wurden, oder er kann unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Verfahrens zubereitet werden. Beispielsweise kann ein synthetisches Polypeptid entsprechend einem Fragment der TcpA-Pilus-Aminosäuresequenz durch Standardverfahren zubereitet werden oder eine Nukleinsäuresequenz, die für ein solches Fragment codiert, kann in einem Exprimierungssystem exprimiert werden, wobei das erhaltene Polypeptid gereinigt wird. Standardverfahren können dazu verwendet werden, solche Fragmente zu identifizieren, beispielsweise können partielle Auslassungen des tcpA-Gens konstruiert werden, das, wie oben exprimiert wird und sodann wird die Wirksamkeit des partiellen TcpA-Produkts untersucht. Jene Fragmente, die eine Immunogenität ähnlich der des nativen TcpA-Pilus zeigen, sind für einen solchen Impfstoff brauchbar. In ähnlicher Weise sind Polypeptide, die mit dem TcpA-Pilus crossreaktiv sind, für die Erfindung geeignet (unter crossreaktiv werden jene Polypeptide verstanden, die mit Antikörpern immunoprezipitierten, die gegen den TcpA-Pilus produziert sind). Siehe ganz allgemein J. Mol. Immumol. 19 : 1541-1549, 1982; und J. Mol. Immunol. 21 : 785-793, 1984.
Dieser Impfstoff kann mit abgetöteten Vollzellen von V. cholerae oder der B-Untereinheit ergänzt werden oder er kann dazu verwendet werden, um bestehende Impfstoffe zu ergänzen.
Synthetische Peptide bieten außerdem eine billige Möglichkeit, ein reines Immunogen zur Verwendung in Impfstoffen zu produzieren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der TcpA-Pili (abgeleitet aus seiner DNA-Sequenz) liefert die wesentliche Information, die benötigt wird, um ein synthetisches Peptid zu konstruieren, das als Immunogen zum Züchten von Antikörpern dienen kann, die mit dem TcpA- Pilus reagieren und seine Funktion (Zellbindung) blockieren. Solche immunogenen Peptide können durch einen systematischen Lösungsansatz identifiziert werden, bei dem nicht überlappende oder teilweise überlappende Peptide synthetisiert werden und sodann Antikörper gegen jedes gezüchtet werden. Sodann werden die Peptide identifiziert, die Antikörper induzieren, die entweder mit den TcpA-Pili reagieren und die Bindung der TcpA-Pili an Wirtszellen verhindern, oder die in der Tat Tiere gegen virulente V. cholerae schützen. Diese Peptide tragen die schützenden Epitode des TcpA-Pilus und können deswegen als Cholera- Impfstoff verwendet werden, vorzugsweise nachdem sie an ein geeignetes immunologisches Trägerprotein chemisch angebunden sind. Das Trägerprotein steigert die Immunogenität der Peptide, indem es eine "T-Zellhelferfunktionen" schafft. Viele unterschiedliche Proteine wurden als Peptidcarrier verwendet, jedoch ist eines der besten die Cholera-B-Untereinheit oder die B-Unterheit des hitzeempfindlichen Enterotoxins von E. coli (Infection & Immunity 44 : 268-273, 1984).

Beispiel 3: TcpA-verwandte chimerische Proteinimpfstoffe

Auf derselben Art wie ein chemisch quervernetztes Konjugat aus einem TcpA-verwandten Peptid und einem Carrierprotein als Immunogen verwendet werden kann, können genetisch abgeleitete Fusionsproteine ebenso als Immunogen in einem Cholera-Impfstoff dienen. Diese Genfusionen werden aus dem Strukturgen für den TcpA-Pilus oder einem synthetischen DNA-Oligonukleotid hergestellt, der für die Peptidsequenzen, die zu dem TcpA-Protein gehören, codiert sowie das Gen für das Carrierprotein. Wir haben eine derartige Genfusion zwischen dem tcpA-Gen und dem Gen für alkalische Phosphatase (phoA) von E. coli hergestellt und, wie oben beschrieben, die Herstellung eines Fusionsproteins sowohl in V. cholerae als auch in E. coli demonstriert. Diese Fusionsproteine reagieren mit Antikörpern, die gegen die TcpA-Pili gezüchtet sind und würden somit wahrscheinlich Antikörper gegen die TcpA-Pili stimulieren, wenn Fusionsproteine als Immunogene verwendet werden. Dieser genetische Lösungsansatz kann auch verwendet werden, um andere Fusionsproteine zwischen zu tcpA gehörigen DNA- Sequenzen und Genen für Carrierproteine verwendet werden, wie die LT-B-Untereinheit der Choleratoxin-B-Untereinheit, des Diphtherietoxins und des Tetanustoxins (FEBS Letters 208 : 194-198 (1986)).

c. Heterologe Lebendimpfstoffe

Lebende Zellen von Salmonella, E. coli oder der Kuhpockenvirus, die modifiziert wurden, um verhältnismäßg wenig patogen zu sein, werden transformiert oder anders unter Verwendung des Verfahrens mit rekombinanter DNA modifiziert, um für das TcpA-Pilusprotein und vorzugsweise auch für die B-Untereinheit des Choleratoxins zu codieren. Diese Zellen oder Partikel werden dazu verwendet, gegen Cholera zu impfen, wenn sie die Antikörperproduktion gegen den TcpA-Pilus und vorzugsweise auch die B-Untereinheit stimulieren können. Es muss nur ein immunologisch aktives Fragment jedes Proteins durch diese Organismen codiert werden und der Impfstoff kann in Verbindung mit den obigen Impfstoffen oder alt bekannten Impfstoffen verwendet werden.

Beispiel 4:

Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines heterologen Lebenträgerimpfstoffes, der die TcpA-Pilus- Unterteinheit exprimiert. Verschiedene Organismen einschließlich S. typhi Ty21A (J. Infect. Dis. 131 : 553, 1975; Inf. & Immunity 46 : 564-569, 1984), andere Salmonella Spezien (Nature 291 : 238-239, 1981), E. coli-Shigella Hybriden (Inf. & Immunity 46 : 465-469, 1984) und der Kuhpockenvirus (Nature 311 : 67, 1984; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 7155, 1983), sind potenzielle Lebendträgerimpfstoffe, die nicht nur gegen homologe Krankheiten (Typhusfieber, Schigellose, Kuhpocken, usw.) immunisieren, sondern auch gegen andere Krankheiten, die von dem Lebendträgerstamm getragen und durch Gene für die geeigneten Schutzimmunogene exprimiert werden. Sowohl E. coli als auch S. typhimurium-Stämme, die das Plasmid pCS12G7 oder verwandte Plasmide, wie das pCS12G10, tragen, produzieren ein Protein, das mit dem TcpA-Pilin immunologisch identisch ist. Somit liefern dieses Plasmid oder Derivate von diesem Plasmid die notwendige genetische Information für die Lebend-Trägerimpfstoffstämme, um die TcpA-bezogenen Immunogene zu exprimieren.
Das Verfahren zum Herstellen dieses Impfstoffes hängt von dem Organismus ab, der als Stamm für den Lebendträgerimpfstoff verwendet wird. Bei bakteriellen Trägern werden die Plasmide, die dass TcpA-Pilin exprimieren, durch Transformation oder Konjugation unter Verwendung von Standardverfahren eingebracht. Solche Plasmide können in das Chromosom des Trägerstammes integriert werden, um eine stabilere genetische Vererbung des TcpA-Pilingens zu er halten. Bei viralen Trägern wird die tCpA-Gensequenz genetisch eingebaut, damit die (tierische oder menschliche) Wirtszelle exprimiert, die mit rekombinanten Virus infiziert wurde.
Die Wirksamkeit eines heterologen Lebendträgerimpfstoffes, der das TcpA-Pilin exprimiert, wird gesteigert, wenn er außerdem die B-Untereinheit des Choleratoxins exprimiert. Das Einbauen des ctxB-Gens ebenso wie des tcpA- Gens in denselben Stamm für den Trägerorganismus wird deswegen bevorzugt.
Ein heterologer Lebendimpfstoffstamm wird, sobald er konstruiert ist, durch Standardverfahren in einen Impfstoff eingebunden und oral oder parenteral in einer Dosis verabreicht, die groß genug ist, dass sich die Organismen vervielfachen können, jedoch keine offene Krankheit in dem geimpften Wirt verursachen können (beispielsweise etwa 10&sup6;- 10¹&sup0;-Zellen oder Viruspartikel pro Dosis).

Verwendung

Die Verwendung der obigen Impfstoffe sieht ihr Einimpfen beim Menschen oder anderen Tieren vor, um Cholera und verwandte Infektionen zu verhindern. Diese Impfstoffe können zur Verwendung von Standardverfahren verabreicht werden, vorzugsweise über den oralen Weg, jedoch auch durch Injektion. Die Dosierungen variieren zwischen 10&sup9;- 10¹&sup0; lebende Bakterien oder 10¹&sup0; abgetötete Bakterien sowie zwischen 10-1000 mg TcpA-Pilus oder B-Untereinheit pro Kilogramm Körpergewicht des Tiers.

Hinterlegungen

Die nachfolgenden Hinterlegungen wurden am 29. April 1987 bei der American Type Culture Collection (ATCC) vorgenommen, bei der die Hinterlegungen die folgenden Hinterlegungsnummern erhielten:
Der Rechtsnachfolger der Anmelder, President and Fellows of Harvard College, gehen davon aus, dass die ATTC eine Hinterlegungsstelle ist, die die Dauerhaftigkeit der Hinterlegung und die leichte Zugänglichkeit zu der Hinterlegung durch die Öffentlichkeit gewährleistet, wenn ein Patent gewährt ist. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Zugänglichkeit der Öffentlichkeit zu dem hinterlegten Material wird bei der Erteilung eines Patentes unwiderruflich zurückgenommen. Das Material bleibt während der Anhängigkeit der Patentanmeldung für jemanden zugänglich, der durch den Commissioner gemäß 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 ermächtigt ist. Das hinterlegte Material wird mit aller Sorgfalt behandelt, die notwendig ist, um es am Leben zu erhalten und für einen Zeitraum von wenigstens fünf Jahren nach der letzten Anfrage zur Bereitstellung einer Probe der hinterlegten Mikroorganismen unkontaminiert zu halten, und in jedem Falle für eine Zeitspanne von wenigstens dreißig (30) Jahren nach dem Hinterlegungsdatum oder der durchsetzbaren Lebensdauer eines Patentes, und zwar je nachdem, welche Zeitspanne die längere ist. Der Rechtsnachfolger der Anmelder anerkennt seine Verpflichtung, die Hinterlegung zu ersetzen, falls die Hinterlegungsstelle, zufolge des Zustands der Hinterlegung, nicht mehr in der Lage ist, eine Probe auf Anforderung bereitzustellen.
Andere Ausführungsbeispiele liegen innerhalb der nachfolgenden Ansprüche.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines Choleravaccins, wobei es zu dem Verfahren gehört, dass man eine Kultur von V. Cholerazellen mit einem mutierten htx-Gen in einem Kulturmedium wachsen lässt, in dem die Toxin-koregulierten Pili in einer Konzentration entsprechend 1% oder mehr bezogen auf das gesamte Zellprotein vorhanden sind, und dass ein Tier mit den Zellen oder Zellkomponenten aus dieser Kultur geimpft wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen in einem Kulturmedium wachsen gelassen werden, das einen pH- Wert von etwa 6, 5 oder niedriger aufweist.

3. Verfahren zum Herstellen eines Choleravaccins, wobei es zu dem Verfahren gehört, dass man eine Kultur von V. Cholerazellen bei einem pH-Wert von etwa 6, 5 oder niedriger in einem Kulturmedium wachsen lässt, in dem die Toxin-koregulierten Pili in einer Konzentration entsprechend 1% oder mehr bezogen auf das gesamte Zellprotein vorhanden sind und dass ein Tier mit den Zellen oder Zellkomponenten aus der Kultur geimpft wird.

4. Verfahren zum Herstellen eines Choleravaccins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, zu dem es ferner gehört, dass man die Kultur der V. Cholerazellen bis zur stationären Phase in dem Kulturmedium wachsen lässt, das eine oder mehrere der Aminosäuren, wie Asparagin, Arginin, Serin, Glutaminsäure oder Glutamin enthält, wobei das Medium eine Ionenstärke entsprechend 50-100 mM NaCl aufweist und auf einer Temperatur zwischen 22-30ºC gehalten sowie Sauerstoff ausgesetzt ist.

5. Verfahren zum Herstellen eines Choleravaccins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es zu dem Verfahren ferner gehört, dass die Zellen abgetötet und die abgetöteten Zellen in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel bereitgestellt werden.

6. Verfahren zum Herstellen eines Choleravaccins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Vaccin Toxin-koregulierte Pili enthält und es ferner zu dem Verfahren gehört, dass die V. Cholerazellen geerntet und die Toxinkoregulierten Pili von den Zellen gereinigt werden.

7. Verfahren zum Herstellen eines Choleravaccins nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Vaccin die B-Untereinheiten des Choleratoxins enthält und es zu dem Verfahren ferner gehört, dass die V. Cholerazellen geerntet werden und die B-Untereinheiten von den Zellen gereinigt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Zellen nicht-toxische Werte des Choleratoxins enthalten.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 8, bei dem die Kultur den Stamm enthält, der bei der ATCC hinterlegt ist und die Nummer 53613 trägt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, bei dem die Kultur den Stamm enthält, der bei der ATCC hinterlegt ist und die Nummer 67396 trägt.

11. Lösung, die gereinigte bakterielle Vollzellen mit wenigstens 1% Toxin-koregulierten Pili pro Zelle als Gesamtprotein enthält.

12. Bakterienzelle, bei der wenigstens 1% des gesamten Proteins als Toxin-koregulierter Pili vorliegt und der Zelle toxische Werte von Choleratoxin fehlen.

13. Zelle nach Anspruch 12, bei der die Zelle eine Vibriocholerazelle ist.

14. Zelle nach Anspruch 12 oder 13, bei der die Zelle ein mutiertes htx-Gen enthält.