DE69835031T2

DE69835031T2 - Neue anti-hiv immunogene (toxoide), herstellungsverfahren und verwendung zur behandlung und vorbeugung von aids

Info

Publication number: DE69835031T2
Application number: DE69835031T
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Zagury; Jay Balacynwyd RAPPAPORT; Miguel Carcagno
Original assignee: Neovacs SA
Current assignee: Neovacs SA
Priority date: 1997-12-26
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: WO1999033346A1; FR2773156A1; BR9814473A; JP2006257102A; ES2267199T3; EP1042363A1; AU1939799A; EP1041888A4; DE69840152D1; US6420141B1; JP2001527029A; EP1042363B1; AU1568499A; CY1106152T1; PT1042363E; MXPA00006263A; CA2316811A1; ATE330970T1; EP1041888B1; DE69835031D1

Description

AIDS wird durch Infektion mit dem Virus HIV-1 induziert. Dieses Virus besteht aus mehreren Proteinen. Unter diesen Proteinen wird Tat zusammen mit dem Protein Nef am frühesten im viralen Zyklus produziert.
Um die Wirkungen des Tat-Proteins zu bekämpfen, wurden mehrere Ansätze vorgeschlagen, wie genetische Ansätze, um die Transcriptionswirkung von Tat zu blockieren. So wurden klinische Versuche mit Antisensemolekülen (Firma Hybridon) durchgeführt, in-vitro-Experimente haben die Möglichkeit von Ribozymen oder auch von Ködern unter Verwendung der RNA des TAR-Bereichs (Stelle der Bindung von Tat an die mRNA) gezeigt.
Pharmakologische Moleküle, die die Transcriptionswirkung von Tat hemmen, wurden ebenfalls beschrieben.
Alle diese Verfahren zielen darauf ab, die Replikation des Virus zu blockieren, indem sie die Transcriptionswirkung von Tat blockieren.
Immunologische Verfahren wurden ebenfalls schon vor langer Zeit vorgeschlagen.
Für eine spezifische Immunisierung gegen das native Tat-Protein beschreibt WO-A-91/18454 die Verwendung von Polypeptiden von retroviralen Proteinen einschließlich des nativen Tat-Proteins, die durch proteolytische Spaltung, chemische Synthese oder genetische Rekombination erhalten wurden, als Immunogene zur Verhinderung der retroviralen Replikation und der cytotoxischen Aktivität insbesondere gegen Lymphocyten und Nervenzellen, die durch die retroviralen Proteine und darunter insbesondere Tat ausgeübt werden. Die Toxizität der nativen Proteine oder ihrer Fragmente steht jedoch ihrer Verwendung für eine Immunisierung entgegen.
WO-A-95/31999 beschreibt die Verwendung des nativen Tat-Proteins von HIV-1, von Fragmenten des Proteins oder von Polypeptiden mit Deletionen/Substitutionen als Immunogene zur Blockierung der Replikation von HIV-1, indem sie den Einfang des extrazellulären Tat-Proteins durch die nichtinfizierten Zellen blockieren. Trotz der beschriebenen Immunogenität gibt es aufgrund der toxischen Wirkungen insbesondere des nativen Tat-Proteins, der Immunstörungen, die es induziert, und des Fehlens von neutralisierenden Antikörpern durch Immunisierung mit den in diesem Patent beschriebenen Immunogenen effektiv ein Bedürfnis, neue inaktivierte Tat-Immunogene (die alle schädlichen Wirkungen des nativen Tat-Proteins verloren haben) zu entwickeln, die eine humorale und zelluläre Immunantwort induzieren können.
WO-A-96/27389 beschreibt die Verwendung von neuen Produkten, der Tat-Toxoide und von retroviralen Regulatorproteinen, als Immunogene, die eine Immunantwort gegen das native Tat-Protein induzieren und seine immunsupprimierenden Wirkungen verhindern oder rückgängig machen können. Diese Toxoide, die inaktive, aber immunogene Produkte sind, wurden durch chemische Behandlung des nativen Proteins oder von Segmenten, die von diesem Protein stammen, mit Formaldehyd hergestellt. Aber die Inaktivierung mit Hilfe eines Aldehyds ist heikel. Für eine industrielle Produktion braucht man jedoch regelmäßige Ergebnisse, insbesondere für die Inaktivierung. Die Gesundheitsbehörden bevorzugen außerdem Produkte mit konstanter und wohldefinierter Struktur, um die Vermarktung zu genehmigen. Ein ideales Produkt müsste außerdem eine gute Lagerstabilität haben.
Daher betrifft die vorliegende Anmeldung neue Toxoide und ein neues einfaches und wirkungsvolles Verfahren zur Herstellung dieser Toxoide, insbesondere ausgehend von Regulatorproteinen von HIV-1, die zur immunsupprimierenden Wirkung von HIV-1 beitragen.
Die Strategie der Toxoide hat große Vorteile gegenüber den Substitutionen/Deletionen von Aminosäuren: die Bereiche des nativen Tat-Proteins, die für die pleiomorphen Wirkungen von Tat verantwortlich sind, sind nicht gut identifiziert, und es ist schwierig, die Substitutionen/Deletionen vorherzusagen, die eine völlige Unschädlichkeit des Präparats gewährleisten. Zum Beispiel hebt die Mutation des Restes C25 zu G die Transaktivatorwirkung von Tat auf, ohne seine immunsupprimierende Wirkung zu unterdrücken. Andererseits können die Substitutionen/Deletionen die Struktur des modifizierten Moleküls gegenüber dem nativen Molekül stark verändern (lineare und konformatorische Antigene) und so die Entwicklung einer wirksamen Immunreaktion gegen das native Molekül verhindern. Dieser letzte Punkt ist für die Produktion von neutralisierenden Antikörpern gegen das native Protein besonders wichtig.
Die vorliegende Anmeldung betrifft also ein virales Regulatorprotein oder ein Fragment von 8 bis 110 Aminosäuren eines viralen Regulatorproteins, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Reaktion mit Iodessigsäure oder durch Reaktion mit Iodacetamid carboxymethyliert sind.
Unter den bevorzugten Bedingungen der Ausführung der Erfindung stammt das obige Protein oder Fragment vom Virus HIV-1, HIV-2, HTLV-1 oder HTLV-2 und insbesondere vom Virus HIV-1 oder HIV-2.
Unter anderen bevorzugten Bedingungen der Ausführung der Erfindung ist das obige Protein oder Fragment ein virales Regulatorprotein oder ein Fragment eines viralen Regulatorproteins.
Unter noch anderen bevorzugten Bedingungen der Ausführung der Erfindung stammt das obige Protein oder Fragment von TAT, insbesondere von HIV-1.
Die vorliegende Anmeldung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Fragments, wie es oben definiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass man das virale Regulatorprotein oder das Fragment einer Carboxymethylie rung unterzieht, so dass man die erwartete Verbindung erhält, die man dann isoliert.
Gemäß der Erfindung werden die Proteine oder Fragmente, die sich gegenüber dem Immunsystem wie Toxine verhalten, zum Beispiel Tat oder Nef, durch die Carboxymethylierung modifiziert. Diese chemische Modifizierung führt zu neuen Proteinen oder Fragmenten, die biologisch inaktiv sind, aber ihre Immunogenität beibehalten. Mit anderen Worten, diese Proteine oder Fragmente, die sich gegenüber dem Immunsystem wie Toxine verhalten, werden von Antikörpern erkannt, die gegen die carboxymethylierten Proteine oder Fragmente gemäß der Erfindung produziert wurden. Diese carboxymethylierten Proteine oder Fragmente behalten ausreichende immunogene Eigenschaften bei, um Antikörper zu produzieren, die das native Protein neutralisieren oder blockieren, und haben gleichzeitig wenigstens 90%, vorzugsweise wenigstens 95%, insbesondere wenigstens 99%, der toxischen biologischen Eigenschaften des nativen Proteins, d.h. seiner wohlbekannten üblichen biologischen Eigenschaften, verloren.
Die carboxymethylierte immunogene Verbindung gemäß der Erfindung kann aus dem ganzen oder aus einem Fragment von 8 bis 110 Aminosäuren des Proteins, insbesondere Regulatorproteins, bestehen und kann, wie dem Fachmann wohlbekannt ist, eine oder mehrere Modifikationen in den Aminosäuren dieses Proteins oder Fragments, wie Deletionen, Substitutionen, Additionen oder Funktionalisierungen, wie Acylierung von Aminosäuren, umfassen, solange diese Modifikationen im oben präzisierten Rahmen bleiben (keine Toxizität, immunologische Eigenschaften). Zum Beispiel modifiziert der Ersatz eines Leucinrests durch einen Isoleucinrest solche Eigenschaften im Allgemeinen nicht. Die Modifikationen dürfen im Allgemeinen weniger als 30% der Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 20% und besonders bevorzugt weniger als 10% betreffen.
Ein Fragment kann zum Beispiel 8 bis 110 Aminosäuren umfassen, vorzugsweise 12 bis 60 Aminosäuren und insbesondere 12 bis 40 Aminosäuren. Ein solches Fragment kann auch C- oder N-Termini mit 1 bis 5 zusätzlichen Aminosäuren, d.h. verschiedenen vor ursprünglichen Segment, umfassen. Ein Fragment muss außerdem wenigstens einen Cysteinrest umfassen, um carboxymethyliert werden zu können.
Im Allgemeinen kann man sich bezüglich der Modifikationen, der Homologie oder Ähnlichkeit zwischen dem modifizierten Immunogen und dem nativen Protein oder Proteinteil sowie der Abmessungen der immunogenen Verbindung sowie der Modalitäten der Verwendung oder der Kupplung der immunogenen Verbindung gemäß der Erfindung mit einem immunogenen Protein, wie dem Tetanustoxoid, insbesondere auf die äquivalenten Patentschriften WO-A-86/06414 oder EP-A-0 220 273 oder auch PCT/US 86/00831 beziehen, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die immunogenen Verbindungen gemäß der Erfindung, die von Regulatorproteinen abstammen, werden im Folgenden im experimentellen Teil zuweilen als "virale Toxoide" bezeichnet.
Genau wie die klassischen bakteriellen Toxoide fehlt ihnen tatsächlich die eigentliche Toxizität, sie sind aber dennoch in der Lage, durch Verabreichung an einen Probanden eine Immunisierung hervorzurufen.
Um zu überprüfen, ob das native Regulatorprotein von Antikörpern gegen das modifizierte Regulatorprotein gut erkannt wird, kann man zum Beispiel immunologisch durch ELISA in Gegenwart von spezifischen Antikörpern die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen überprüfen, wie im Folgenden im experimentellen Teil gezeigt wird.
Um zu bestimmen, ob die immunogenen Eigenschaften des Regulatorproteins ausreichend beibehalten wurden, um Antikörper zu produzieren, die das native Protein neutralisieren, kann man zum Beispiel Säuger (Kaninchen, Ratten, Mäuse) mit Hilfe einer immunogenen Verbindung gemäß der Erfindung immunisieren und überprüfen, ob die produzierten Antikörper die toxischen Aktivitäten von Tat neutralisieren.
Um zu bestimmen, ob das modifizierte Regulatorprotein wenigstens 90% seiner toxischen biologischen Eigenschaften verloren hat, kann man zum Beispiel, was Tat betrifft, die Wirkung des inaktivierten Tat auf die Immunsuppression von T-Zellen oder auf die Neoangiogenese untersuchen.
Die Inaktivierung des Tat-Regulatorproteins wird zum Beispiel durch den "Tat-Rescue-Assay" überprüft, bei dem eine nichtinfektiöse Tat-defiziente Mutante von HIV verwendet wird, die auf der Zelllinie HL-1 kultiviert wird, deren Replikation von einer exogenen Zufuhr von nativem Tat abhängt.
Die immunogene Verbindung gemäß der Erfindung kann insbesondere von einem der Regulatorproteine der Viren HIV-1, HIV-2, HTLV-1 oder HTLV-2 und insbesondere Nef, Rev und vorzugsweise Tat der Viren Virus HIV-1 und HIV-2, stammen.
Genannt sei auch das Protein Tax von HTLV-1 oder HTLV-2.
Die vorliegende Anmeldung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Fragments, wie es oben definiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass man das virale Regulatorprotein oder das Fragment einer Carboxymethylierung durch Reaktion mit Iodessigsäure oder durch Reaktion mit Iodacetamid unterzieht, so dass man die erwartete Verbindung erhält, die man dann gegebenenfalls isoliert.
Die Carboxymethylierungsreaktion ermöglicht es, die Thiolgruppen (Sulfhydrylgruppen), die sich an den Cysteinresten der Aminosäurekette befinden, zu modifizieren. Diese Gruppen reagieren mit Iodessigsäure oder Iodacetamid über eine S-Carboxymethylierungs- bzw. S-Carboxyamidomethylierungsreaktion.
Zum Beispiel besitzt das Tat-Protein 7 Cysteinreste. Diese Cysteinreste sind an der Bildung von Dilsulfidbrücken zwischen und innerhalb der Ketten beteiligt und tragen zur Bildung von Oligomeren bei.
Das Produkt der Reaktion ist in jedem Fall ein S-Carboxymethylcysteinyl- oder S-Carboxymethylamidocysteinylrest.
Die Carboxymethylierungsreaktion kann auch mit anderen chemischen Agentien, wie Perameisensäure, 3-Brompropionsäure, Ethylenimin, (2-Bromethyl)trimethylammoniumbromid, 2-Bromethansulfonat, 1,3-Propansulfon usw., durchgeführt werden.
Unter den bevorzugten Bedingungen der Ausführung des oben beschriebenen Verfahrens der Erfindung liegt das Ausgangsprotein oder -fragment in einer Form, in der es mit einem Marker (FP) fusioniert ist, vor, wenn es der Carboxymethylierung unterzogen wird.
Die Ausgangsproteine oder -fragmente des Verfahrens sind bekannte Produkte, die in der Literatur beschrieben sind, zum Beispiel für Tat von HIV-1 von Frankel A.D. et al. (Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus, Cell, 1988, 55: 1189–93) oder für Nef von HIV-1 von Azad A.A. et al. (Large-scale production and characterization of recombinant human immunodeficiency virus type 1 Nef, J. Gen. Virol. 1994, 75: 651–55), oder sie können in herkömmlicher Weise hergestellt werden.
Die obigen Ausgangsproteine oder -fragmente kann man insbesondere herstellen durch:

1) Synthese durch Gentechnik oder biochemische Synthese;
2) Reinigung

Durch Gentechnik kann man die durch Affinitätschromatographie präparierten Proteine reinigen, indem man zum Beispiel Antikörper gegen das Protein oder eines seiner Fragmente verwendet; man kann auch das mit einem Marker (FP) fusionierte Protein synthetisieren, das zur Verankerung an einer Affinitätssäule dient.
Unter anderen bevorzugten Bedingungen der Ausführung des oben beschriebenen Verfahrens wird das Protein oder Fragment, wenn es mit einem Marker (FP) fusioniert ist, Folgenden unterzogen:

– einer Konzentration, zum Beispiel durch Ultrafiltration;
– einer Entsalzung, zum Beispiel durch Gelfiltration;
– einer Behandlung mit Bromcyan oder Enterokinase, um das Fusionsprotein zu spalten und so das Protein oder Fragment freizusetzen;
– einer Konzentration und Diafiltration;
– einer Kationenaustauschchromatographie;
– einer Konzentration durch Ultrafiltration, gefolgt von einer Filtration auf Ausschlussgel.

Die obige Reaktion mit Bromcyan ermöglicht die Spaltung von Thioethern. Die Wirkung des Bromcyans auf Polypeptidmoleküle ist selektiv und bewirkt eine Spaltung an den vorhandenen Methioninresten. Diese Reaktion führt zur Bildung von 2 Polypeptidfragmenten pro Methioninrest. Diese Reaktion kann vorteilhafterweise mit der oben beschriebenen Carboxymethylierungsreaktion gekoppelt werden, aber sie ist für die Inaktivierung nicht notwendig.
Unter anderen bevorzugten Bedingungen der Ausführung des oben beschriebenen Verfahrens wird das erwartete Protein oder Fragment so hergestellt, dass es an eine Verbindung gekoppelt ist, die seine Reinigung erlaubt, zum Beispiel an ein Peptidfragment, das mehrere Histidinreste enthält, vorzugsweise in einer kontinuierlichen Sequenz von 4, 5 und insbesondere 6 Histidinresten oder mehr, die die Fixierung an eine Nickelsäule ermöglichen. Solange die Anwesenheit dieser Verbindung keine Toxizität induziert und die Immunogenität des Proteins oder Fragments nicht ungünstig modifiziert, ist es nicht notwendig, es nach der Reinigung wieder abzuspalten. Unter bevorzugten Ausführungsbedingungen spaltet man diese Verbindung jedoch ab, um sie zu entfernen.
Die Verbindungen, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, besitzen sehr interessante pharmakologische Eigenschaften. Sie sind biologisch inaktiv gegenüber Funktionen, die sie üblicherweise ausüben, wie immunsupprimierende Wirkungen, Transaktivatorwirkungen auf den Promotor von HIV-1 oder oxidative Wirkungen bei Tat.
Sie sind bei der Maus, aber auch beim Menschen immunogen. Sie erlauben insbesondere die Induktion einer humoralen Immunantwort mit neutralisierenden Antikörpern und einer zellulären Immunantwort.
Diese Eigenschaften werden im Folgenden im experimentellen Teil veranschaulicht. Sie rechtfertigen die Verwendung der oben beschriebenen Proteine oder Fragmente sowie ihrer Additionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren als Medikament.
Deshalb betrifft die Erfindung auch ein carboxymethyliertes Protein oder Fragment wie oben zur Verwendung in einem Verfahren der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, d.h. als Medikament.
Die Medikamente gemäß der vorliegenden Erfindung finden zum Beispiel Verwendung bei der Behandlung, sowohl therapeutisch als auch präventiv, der schädlichen Wirkungen, die von einer Überproduktion eines Regulatorproteins eines Virus, insbesondere eines der Retroviren HIV-1, HIV-2, HTLV-1 oder HTLV-2, hervorgerufen werden.
Die Proteine Tat und Nef haben relativ gut konservierte Bereiche. Dennoch könnte man gegebenenfalls dasselbe Individuum mit Toxoiden immunisieren, die ausgehend von variablen Stämmen hergestellt wurden, insbesondere um sie an geographische Varianten der Epidemie anzupassen.
Die immunogenen Verbindungen gemäß der Erfindung können wie folgt verwendet werden:
Man verabreicht einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, eine immunogene Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel subkutan oder intramuskulär, in ausreichender Menge, um therapeutisch wirksam zu sein. Die verabreichte Dosis kann zum Beispiel 50 bis 1000 μg intramuskulär in Form einer w/o-Emulsion einmal pro Monat während drei Monaten, dann regelmäßig in Abhängigkeit von der induzierten Serumantikörperspiegeln, zum Beispiel alle 2–6 Monate, betragen.
Als Medikamente können die obigen carboxymethylierten Proteine oder Fragmente also in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebaut werden, die für die orale und insbesondere parenterale Verabreichung bestimmt sind.
Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann auf einem beliebigen herkömmlichen Weg verabreicht werden, der auf dem Gebiet der Impfstoffe verwendet wird, insbesondere subkutan, intramuskulär, intravenös oder oral. Die Verabreichung kann in einer einzigen Dosis erfolgen oder nach einer bestimmten Zeitspanne ein- oder mehrmals wiederholt werden.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die wenigstens eine der oben genannten Verbindungen als Wirkstoff umfassen.
In diesen Zusammensetzungen ist der Wirkstoff vorteilhafterweise in physiologisch wirksamen Dosen vorhanden; die oben genannten Zusammensetzungen umfassen insbesondere eine wirksame immunogene Dosis wenigstens eines der obigen Wirkstoffe. Die immunogene Verbindung kann allein oder gemischt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff, wie einem Adjuvans, konditioniert werden.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können insbesondere flüssig sein und in pharmazeutischen Formen vorliegen, die zur Zeit in der Humanmedizin für Impfstoffe verwendet werden, wie zum Beispiel die injizierbaren Präparate, insbesondere in Emulsionsform; sie werden gemäß den üblichen Verfahren hergestellt. Der oder die Wirkstoffe können zusammen mit Arzneimittelhilfsstoffen eingebaut werden, die in diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise eingesetzt werden, wie wässrige Träger, Calciumphosphat, Alaun.
Die Erfindung betrifft als pharmazeutische Zusammensetzungen insbesondere:

a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als präventiven oder therapeutischen Wirkstoff ein virales Toxoid oder ein Fragment oder Analogon eines Regulatorproteins, insbesondere Tat, gemäß der Erfindung umfasst.
b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als präventiven oder therapeutischen Wirkstoff Anti-Tat-Antikörper gemäß der Erfindung umfasst, die ausgehend von Organismen produziert wurden, die gegen das Protein oder seine Fragmente F(ab')₂ oder Fab immunisiert wurden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer oben beschriebenen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass man den oder die Wirkstoffe nach an sich bekannten Verfahren mit annehmbaren, insbesondere pharmazeutisch annehmbaren, Arzneimittelhilfsstoffen mischt.
Außerdem betrifft die Erfindung einen Kit, der eine pharmazeutische Impfzusammensetzung umfasst, die außer dem Wirkstoff (zum Beispiel Tat-Toxoid oder dessen Derivate oder Anti-Tat-Antikörper) ein Adjuvans und/oder ein anderes Immunogen mit antiretroviralen Eigenschaften umfassen kann.
Als weiteres Immunogen seien zum Beispiel das Hüllprotein GP 160, insbesondere das Transmembran-Glycoprotein GP 10 von HIV-1 oder deren im Stand der Technik bekannte Fragmente, das Gag-Protein des Viruscapsids oder auch das Protein Pol genannt.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung des obigen carboxymethylierten Proteins oder Fragments zur Gewinnung eines Medikaments zur Verwendung als Immunogen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Anmeldung.
1 zeigt die Ergebnisse der Bewertung der Wirkungen des nativen Tat im Vergleich zu denen des Produkts von Beispiel 1 auf die Vermehrung von normalen Lymphocyten, die durch ein Booster-Antigen stimuliert wurden.
Präparat A
Man kultiviert 2 ml des Bakteriums, das am 26. Dezember 1997 unter der Nr. I-1964 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de Paris hinterlegt wurde und bei dem es sich um ein E.-coli-Bakterium handelt, bei dem durch Transfektion ein rekombinantes Plasmid eingesetzt wurde, das ein Gen enthält, welches für ein Polypeptid codiert, das ein aus 6 Histidinresten bestehendes Fragment umfasst, welches mit dem Gen des Tat-Proteins assoziiert ist, in 400 ml eines Grundkulturmediums (Hefeextrakt 5 g/l, Trypton 1 g/l, Natriumchlorid 1 g/l) und 40 ml einer Lösung 1 (CaCl₂·2H₂O: 0,175 g/l; MgSO₄·7H₂O: 5,9 g/l; Glucose: 6 g/l). So wird die Kultur 10 Stunden lang bei 30 °C mit 250 U/min inkubiert.
Nach der obigen Vorfermentation erfolgt eine Fermentation unter analogen Bedingungen, indem man die Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch Steuerung des Rührens auf einem Wert von 70% der Sättigung hält. Wenn die gemessene optische Dichte bei 650 nm den Wert 6 erreicht, gibt man 100 ml einer sterilen Lösung mit 3,75% IPTG (Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid) in entionisiertem Wasser hinzu. Gleichzeitig ergänzt man das Medium mit einer 25%igen sterilen Lösung von Hefeextrakt. Dann gibt man eine Lösung hinzu, die 8,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 300 g/l Glucose, 106 g/l (NH₄)₂SO₄ und Oligoelemente umfasst, wobei man die Glucosekonzentration auf über 2 g/l hält. Dann erntet man die Bakterienmasse 4 Stunden nach der Einführung des IPTG. Danach erfolgt eine Diafiltration gegen einen Puffer aus 0,1 M Tris, 0,1 M NaH₂PO₄, 1 mM Dithiothreit, pH 8,0, durch Gegenstromfiltration (Schwelle 0,3 μm).
Drei Liter des obigen Rohprodukts werden durch 4 Passagen mit einem Überdruck von 500 bar lysiert. Dann wird das Lysat 15 min lang bei 4 °C mit 5000 U/min zentrifugiert. Dann wird dem Überstand eine ausreichende Menge Harnstoff zugefügt, um eine 8 M Lösung zu erhalten, und der pH-Wert wird auf 8 eingestellt.
Danach erfolgt eine Reinigung durch Affinitätschromatographie auf einer Nickel-NTA-Agarose-Säule (Qiagen), die zuvor mit 600 ml Puffer A (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,1 M Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 8,0) äquilibriert wurde. Sobald sie beladen war, wurde die Säule mit 250 ml Puffer A gewaschen. Dann wird das Protein eluiert, indem man einen diskontinuierlichen Gradienten verwendet, um das erwartete fusionierte Protein zu erhalten.
Die so erhaltene Lösung wird auf Amicon-Membran mit einer Trennschwelle von 3000 Dalton konzentriert, so dass man eine Endkonzentration von 10 mg/ml erhält. So erhält man ein Roheluat, das das erwartete rekombinante Fusionsprotein von HIV-1-Tat umfasst.
So wurde ein Fusionsprotein von Tat hergestellt, das genetisch mit einem Peptidfragment fusioniert ist, welches reich an Histidinresten ist, was seine Bindung an Nickel zur Reinigung ermöglicht.
Das so erhaltene Eluat wird der Carboxymethylierungsreaktion unterzogen.
Beispiel 1: Herstellung von Tat-Toxoid
Stadium A: Carboxymethylierung
Eine Lösung des oben in Präparat 1 hergestellten Proteins TAT, das mit einem histidinreichen Peptidfragment fusioniert ist, wird so eingestellt, dass man die folgenden Konzentrationen erhält: 8 M Harnstoff, 0,3 M Tris-HCl, 10 mM Dithiothreit, pH 8,4.
Unter Inertatmosphäre gibt man 2,6 g Iodessigsäure zu 100 ml der obigen Lösung. Diese Lösung wird 90 min lang bei 37 °C unter Lichtausschluss und unter einer inerten Atmosphäre inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml 98%igem β-Mercaptoethanol blockiert, und die Inkubation wird 60 Minuten lang unter denselben Bedingungen wie oben fortgesetzt.
Die aus dem vorigen Schritt resultierende Lösung wird mit Hilfe eines Amicon-Konzentrators (Kat.-Nr. 8400) auf YM3-Membran (Schwelle 3000 Da) bis auf eine Konzentration von 10 mg/ml konzentriert.
Dann wird durch Passage über eine Cellufine-GH25-Säule (Matrex), die mit Hilfe von 300 ml einer 4 M Harnstofflösung, 0,1 M HCl, äquilibriert worden war, entsalzt.
Stadium B: Reinigungen
Dann wird das Eluat ultrafiltriert und mit Bromcyan behandelt, um den aminoterminalen Teil des carboxymethylierten Produkts am Methioninrest zu spalten. Unter inerter Atmosphäre wird Bromcyan im Überschuss in einem Anteil von ungefähr 50 mol Bromcyan pro Mol Methionin zugegeben. Diese Lösung wird 24 h lang bei 37 °C in einem geschlossenen Gefäß aufbewahrt. Das überschüssige Bromcyan wird durch Verdampfen unter reduziertem Druck vertrieben.
Dann wird die erhaltene Lösung konzentriert, gegen 0,05 M Essigsäure-Natriumacetatpuffer, pH 5, diafiltriert, wobei man einen mit einer YM3-Membran (Schwelle 3000 kDa) ausgestatteten Amicon-Diafiltrator verwendete. Die Menge des erhaltenen inaktiven Produkts in Lösung liegt in der Größenordnung von 450 mg.
Diese Lösung wird über eine SP-Sepharose-FF-Ionenaustauschersäule, die zuvor mit 200 ml Puffer A äquilibriert worden war, filtriert, und das Produkt wird mit einem NaCl-Gradienten eluiert.
Das Eluat wird erneut durch Diafiltration in demselben Amicon-System konzentriert, und die erhaltene Fraktion wird durch Gelfiltration über eine Säule mit Sephacryl S(Pharmacia) gereinigt, die mit einem Phosphatpuffer, pH 7,4, äquilibriert worden war. Das Endprodukt wird über eine 0,22-μm-Membran filtriert und bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.
Dieses Produkt wurde den folgenden Analysen unterzogen und war Gegenstand pharmakologischer Tests.
Analysen

– Gesamtmenge des inaktivierten Produkts, bestimmt durch Bradford-Test: 150 mg.
– Elektrophorese auf Sulfododecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE), Silberfärbung (Phast System, Pharmacia, 20%iges homogenes Gel): einzige Bande mit einem Molekulargewicht, das mit dem erwarteten verträglich ist. Keine anderen nachweisbaren Banden bei höheren oder tieferen Molekulargewichten.
– Isoelektrische Fokussierung (Phast System, Pharmacia, GEL IEF 3–9): eine einzige sichtbare Bande.
– Western Blot (Phast System, Pharmacia, monoklonaler Antikörper des Hybridoms 5G11): eine einzige Bande beobachtet und kein aggregiertes oder abgebautes Material.
– biologische Aktivität (Induktion des CAT-Gens in der Linie HELA-HIV-1-LTR-CAT): keinerlei Aktivität nachweisbar.
– Sequenzierung des N-terminalen Teils unter Verwendung der Edman-Standard-Sequenzierungstechnik mit einem Sequencer von Applied Biosystems (Modell 477A): die ersten 20 erhaltenen Aminosäuren fallen mit der erwarteten Sequenz zusammen: E-P-V-D-P-R-L-E-P-W-K-H-P-G-S-Q-P-K-T-A
– Endotoxine (LAL-Test gemäß der Vorschrift USP XXIII): weniger als 0,5 endotoxische Einheiten pro mg Protein.
– Sterilität (gemäß der Vorschrift USP XXIII): entspricht den Normen.

Messung des Substitutionsgrads: unter Verwendung des Ellman-Reagens zur Bestimmung der freien Sulfhydrylgruppen durch Vergleich mit einer Eichkurve, die die Cysteinreste misst. Beim Vergleich des nativen Tat mit dem carboxymethylierten Tat hat sich gezeigt, dass im carboxymethylierten Tat nur 0,03% der Cysteinreste aktiv bleiben, d.h. 1 aktiver Cysteinrest auf 3330 inaktive Cysteinreste. Eine einfache Rechnung zeigt, dass unter diesen Bedingungen mehrere kg Tat-Protein nötig wären, um ein Tat-Molekül mit 7 aktiven Cysteinresten zu erhalten. Die Inaktivierung ist also praktisch vollständig.
Beispiel 2. Herstellung des Nef-Toxoids
Für die Klonierung werden Nef-Primer verwendet, um das Nef-Gen durch RT-PCR ausgehend von RNA von HIV-1-infizierten Zellen zu erhalten. Anschließend wird dasselbe Plasmid mit demselben lysinreichen fusogenen Segment verwendet, das die Verankerung auf der Nickelsäule ermöglicht. Die Vorschrift zur Herstellung und Reinigung ist also dieselbe wie in Beispiel 1, aber die Spaltung erfolgt durch Einwirkung von Enterokinase und nicht von Bromcyan.
Die Analyseergebnisse sind den mit dem Tat-Protein erhaltenen ähnlich.
Beispiel 3. Herstellung des IFNα-Toxoids
Diesmal wird im Plasmid kein Fusionsprotein verwendet. Das Protein wird so, wie es ist, durch Gentechnik ohne fusogenes Segment hergestellt und unter Verwendung einer Chromatographiesäule gereinigt, an die monoklonale Anti-IFNα-Antikörper gebunden sind. Sobald es eluiert ist, wird das Protein sofort nach derselben Vorschrift, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, inaktiviert.
Die Analyseergebnisse sind mit denjenigen identisch, die mit dem Tat-Protein bei einem biologischen Test, der eine nicht vorhandene antivirale (Virus VSV auf MDBK-Zellen) Aktivität zeigt, erhalten wurden: Die biologische Inaktivierung ist vollständig.
Pharmakologische Studie
1) Fehlende immunsupprimierende Wirkung des Tat-Toxoids
Es gibt einen einfachen Test, der die immunsupprimierende Wirkung des nativen Tat-Proteins zeigt. Zellen des peripheren Bluts (PBMCs) werden in Medium ohne Serum mit dem nativen Tat-Protein oder mit Tat-Toxoid in Konzentrationen, die von 0 bis 10 mg/ml variieren, inkubiert. Nach 2 h Kontakt wird Serum bis zu einer Endkonzentration von 10% hinzugefügt, und die Zellen werden in üblicher Weise mit Staphylococcus-Enterotoxin B (SEB) oder mit gereinigtem Proteinderivat (PPD) als Booster-Antigen stimuliert. Die Proliferation wird nach 3 Tagen SDEB oder nach 5 Tagen PPD bewertet.
Man sieht, dass die Proliferation in dosisabhängiger Weise durch das native Tat reduziert wird, während dies bei dem Toxoid nicht der Fall ist.
In 1 entsprechen die 4 linken Balken dem nativen Tat, und die 4 rechten Balken entsprechen der Verbindung von Beispiel 1 (Tat-Toxoid). Die Werte auf der Abszisse sind Konzentrationen des Produkts in μg/ml, 0, 1, 3 bzw. 10 μg/ml. Die Ordinate gibt die Vermehrung der T-Zellen in Prozent an. Die Kontrolle entspricht einer Konzentration des verwendeten Tat von 0. Man sieht, dass das native Tat die Zellproliferation hemmt, während die Verbindung von Beispiel 1 keine Wirkung hat.
2) Immunogenität des Tat-Toxoids bei der Maus, Produktion von neutralisierenden Antikörpern
Gemäß Beispiel 1 hergestelltes Tat-Toxoid wurde verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Die Immunisierungsvorschrift ist die klassischerweise verwende te: Den Mäusen werden am Tag 0 intramuskulär (im) 100 μl Emulsion mit Freunds vollständigem Adjuvans (1:1), die 20 μg Produkt enthält, injiziert, und an den Tagen 21 und 35 erfolgt eine Booster-Injektion von 5 μg mit Freunds unvollständigem Adjuvans. Das Serum der Mäuse wird an den Tagen –2, 28 und 40 entnommen, und die Anti-Tat-Antikörper werden mit ELISA auf Platten gemessen, die mit nativem (nicht chemisch behandeltem) rekombinantem Tat-Protein oder mit der Verbindung von Beispiel 1 sensibilisiert wurden. Die Seren wurden mit einer Verdünnung von 1/1000 getestet. Die erhaltenen Ergebnisse, die als optische Dichte ausgedrückt sind, von 3 immunisierten Mäusen (1 bis 3) und 3 nichtimmunisierten Mäusen (4 bis 6) sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch das Toxoid immunisierten Mäuse Antikörper produzieren, die gleichermaßen das native Protein und das Toxoid erkennen.
Diese Antikörper sind außerdem neutralisierend. Dies wurde mit Hilfe von 2 verschiedenen Tests festgestellt:
Der Tat-Protein-Inaktivierungstest. Zu kultivierten Zellen der Linie HELA-HIV-1-LTR-CAT, die stabil mit einem Plasmid transfiziert sind, das den Long Terminal Repeat (LTR) von HIV-1 als Promotor des Gens Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) enthält, gibt man natives Tat-Protein oder Tat-Toxoid oder natives Tat-Protein, das 1 Stunde lang mit Serum (Verdünnung 1/50) von immunisierten oder nicht immunisierten Mäusen (Tag 0 oder Tag 40) vorinkubiert worden war. Das native Tat-Protein in einer Konzentration von 5 μg/ml dringt in die Zellen ein und spielt seine Transaktivatorrolle bei dem LTR von HIV-1 und induziert die Expression des CAT-Proteins. Nach 48 Stunden werden die Zellen lysiert, und die vorhandene Menge des CAT-Proteins wird durch einen ELISA-Test (Boehringer) gemessen. Die Ergebnisse sind als optische Dichte ausgedrückt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Serum der immunisierten Maus (Maus 2) Antikörper enthält, die das native Tat-Protein neutralisieren, was bei dem Serum einer nicht immunisierten Maus nicht der Fall ist.
Wenn man die Antikörper, die von den Mäusen produziert wurden, die mit dem Toxoid immunisiert wurden, in dem Immunsuppressionstest verwendet, der oben bei der pharmakologischen Studie 1) beschrieben wurde (Verdünnung 1/50), blockiert man ebenso die immunsupprimierende Wirkung des nativen Tat-Proteins.
Alle diese Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung von Beispiel 1 immunogen ist und eine Immunantwort induzieren kann, die das native Protein neutralisiert.
3) Immunogenität des IFNα-Toxoids bei der Maus, Produktion von neutralisierenden Antikörpern
Gemäß Beispiel 3 hergestelltes IFNα-Toxoid wurde verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Die Immunisierungsvorschrift ist die klassischerweise verwendete: Den Mäusen werden am Tag 0 intramuskulär (im) 100 μl Emulsion mit Freunds vollständigem Adjuvans (1:1), die 20 μg Produkt enthält, injiziert, und an den Tagen 21 und 35, 45 erfolgt eine Booster-Injektion von 5 μg mit Freunds unvollständigem Adjuvans. Das Serum der Mäuse wird an den Tagen –2, 28 und 50 entnommen und mit ELISA auf Platten analysiert, die mit dem nativen (nicht chemisch behandelten) rekombinanten IFNα-Protein sensibilisiert wurden. Die Seren wurden mit einer Verdünnung von 1/1000 getestet. Die als optische Dichte erhaltenen Ergebnisse von 3 immunisierten Mäusen (1 bis 3) und 3 nichtimmunisierten Mäusen (4 bis 6) sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch das Toxoid immunisierten Mäuse Antikörper produzieren, die gleichermaßen das native Protein und das Toxoid erkennen. Andererseits bestätigt dies die Unschädlichkeit der Immunisierung mit dem IFNα-Toxoid, da die Mäuse die Immunisierung sehr gut vertragen haben.
Diese Antikörper sind außerdem neutralisierend. Dies wurde mit dem klassischen Test des Virus VSV auf MDBK-Zellen festgestellt. Normalerweise macht man die Zellen durch Zugabe von 1 bis 10 Interferoneinheiten resistent gegen Lyse durch das Virus VSV. Wenn man das native IFNα mit dem auf 1/50 verdünnten Serum der Maus 1 oder 4 (Tag 0, Tag 50) inkubiert, wird die Lyse nur beobachtet, wenn das native IFNα mit dem Serum der Maus 1 vom Tag 50 vorinkubiert wurde.
Dieses Beispiel zeigt, dass die Verbindung von Beispiel 3 immunogen ist, wobei neutralisierende Antikörper gebildet werden.
4) Immunogenität des Nef-Toxoids bei der Maus
Gemäß Beispiel 2 hergestelltes Nef-Toxoid wurde verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Die Immunisierungsvorschrift ist die klassischerweise verwende te: Den Mäusen werden am Tag 0 intramuskulär (im) 100 μl Emulsion mit Freunds vollständigem Adjuvans (1:1), die 20 μg Produkt enthält, injiziert, und an den Tagen 21 und 35 erfolgt eine Booster-Injektion von 5 μg mit Freunds unvollständigem Adjuvans. Das Serum der Mäuse wird an den Tagen –2, 28 und 40 entnommen und mit ELISA auf Platten analysiert, die mit dem nativen (nicht chemisch behandelten) rekombinanten Nef-Protein sensibilisiert wurden. Die Seren wurden mit einer Verdünnung von 1/1000 getestet. Die erhaltenen Ergebnisse, die als optische Dichte ausgedrückt sind, von 3 immunisierten Mäusen (1 bis 3) und 3 nichtimmunisierten Mäusen (4 bis 6) sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch das Toxoid von Beispiel 2 immunisierten Mäuse Antikörper produzieren, die gleichermaßen das native Protein und das Toxoid erkennen. Andererseits bestätigt dies die Unschädlichkeit der Immunisierung mit dem Nef-Toxoid, da die Mäuse die Immunisierung sehr gut vertragen haben.
5) Wirkung der Antikörper von Mäusen, die mit dem Tat- und dem IFNα-Toxoid immunisiert wurden auf die Infektion durch HIV-1 in vitro
Es wurde ein Test für die durch HIV-1-Infektion induzierte Immunsuppression in vitro entwickelt. Dieser Test wird folgendermaßen durchgeführt:
Zellen des peripheren Bluts (PBMCs) eines gesunden Probanden werden mit einem lymphotropen HIV-1-Stamm (HIV-HTLVIIIB) infiziert. Nach der Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) und 6 Tagen Kultur in Gegenwart von Interleukin-2 werden die Zellen bestrahlt. Die bestrahlten Zellen sind supprimierend, da sie die Vermehrung von autologen PBMCs, die durch Antigene wie SEB oder PPD stimuliert wurden, hemmen können. Diese immunsupprimierende Wirkung ist nicht an nach der Bestrahlung verbleibendes Virus gebunden, da die Tests der Bestimmung von Reverser Transcriptase oder p24-Antigen in den Überständen negativ sind. Wenn man ein Präparat von Zellen ohne Virus (Kontrolle) herstellt, die in derselben Weise 6 Tage nach der Stimulation durch PHA bestrahlt werden, und man diese zu autologen Zellen gibt, die durch SEB oder PPD stimuliert wurden, beobachtet man keinerlei Hemmung der Vermehrung. Die hemmende Wirkung ist auf das Virus HIV-1 zurückzuführen.
J.F. Zagury et al. (Cell Pharmacol. AIDS Sciences, 1996, Band 3, S. 97–103, A critical role of the Tat and IFNα in the HIV-1 induced immunosuppression leading to AIDS) beschreiben, dass die Genese dieser supprimierenden Zellen gleichzeitig von IFNα und vom Tat-Protein abhängt, da Antikörper, die diese beiden Proteine neutralisieren, die Bildung von supprimierenden Zellen hemmen. Wenn in einem Experiment dieses Typs die Seren (auf 1/50 verdünnt) der Mäuse, die mit den in Beispiel 1 und 3 beschriebenen Produkten (Tat-Toxoid und IFNα- Toxoid) immunisiert wurden, gleichzeitig hinzugefügt werden, blockieren diese Seren die Bildung von supprimierenden Zellen. Das ist bei den Seren von nicht immunisierten Mäusen (negative Kontrolle) oder bei den Seren, die vor der Immunisierung entnommen wurden, nicht der Fall. Wenn man Serum von Mäusen verwendet, die nur mit dem Tat-Toxoid immunisiert wurden, wird die Immunsuppression nicht mehr blockiert. Wenn man dagegen Serum von Mäusen verwendet, die mit dem IFNα-Toxoid immunisiert wurden, beträgt die Hemmung der Suppression 70%. Wenn man die beiden Seren, das Anti-Tat- und das Anti-IFNα-Serum, miteinander kombiniert, blockiert man die Genese von supprimierenden Zellen vollständig. Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung von verschiedenen Viruschargen, insbesondere Primärisolaten, erhalten. Dies zeigt, dass die Anti-Tat-Antikörper, die mit einem einzigen Toxoid erhalten wurden, dennoch eine Kreuzreaktivität aufweisen können.
Diese Ergebnisse, die von J.F. Zagury et al. (Cell Pharmacol. AIDS Sciences, 1996, Band 3, S. 97–103, A critical role of the Tat and IFNα in the HIV-1 induced immunosuppression leading to AIDS) beschrieben wurden, bestätigen die kombinierte hemmende Wirkung von Tat und IFNα auf den immunsupprimierten Zustand bei Patienten im AIDS-Stadium. Sie bestätigen außerdem die Initiatorrolle von Tat und die determinierende Rolle von IFN-α bei dieser Immunsuppression (siehe Publikation D. Zagury et al.: Beteiligung von IFN und Tat bei der Immunsuppression von uninfizierten T-Zellen und der Reduktion von CC-Chemokin bei AIDS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, im Druck). Die Ergebnisse dieser Arbeiten zeigen die Notwendigkeit einer Bekämpfung des extrazellulären Tat-Proteins durch die Induktion einer neutralisierenden Antikörperantwort, indem man, wenn möglich, die Tat-Produktion durch die Induktion einer zellulären Immunantwort stört.
6. Immunogenität und Unschädlichkeit der kombinierten oder nicht kombinierten Tat- und IFNα-Toxoide beim Menschen. Verträglichkeit mit den Chemotherapien
Die Tabellen 1, 2, 3 beschreiben die Ergebnisse, die bei einem Test der Phase 1 erhalten wurden, wobei man die Toxoide der Beispiele 1 und 3 in 50/50- Emulsion mit ISA 51 (SEPPIC) verwendete: Volumen 1 ml, das 100 μg Wirkstoff gemäß der Erfindung enthält. Die Antworten auf das IFNα-Toxoid (Daten hier nicht gezeigt) sind denjenigen ähnlich, die bereits in den Publikationen von Gringeri et al. in JAIDS 1994, Vol. 7, 978–988, und 1996, Vol. 13, 55–67, bei einem durch Formolierung realisierten Toxoid beschrieben wurden.
Tabelle 1: Beschreibung der Patienten, die in den Test der Phase 1 aufgenommen wurden.
Tabelle 2: biologische Parameter am Anfang und am Ende (im Allgemeinen über 6 Monate).
Tabelle 3: Analyse der spezifischen Anti-Tat-Antwort.
Tabelle 1 Demographie von Patienten, die gegen Tat von HIV-1 immunisiert wurden, Alter zum Zeitpunkt der Serokonversion und antiretrovirale Behandlung
Tabelle 2 Zählung der CD4-Zellen als Absolutwert, HIV-1-Plasmavirämie und Antigenämie bei 14 seropositiven Patienten, die mit den Produkten von Beispiel 1 oder 3 immunisiert wurden
Tabelle 3 Immunogenität der Anti-HIV-1-Tat-Immunisierung bei den HIV-1-seropositiven Patienten

HSR: retardierte Hypersensibilität
CMI: Immunität mit zellulärer Vermittlung

Claims

Protein oder Proteinfragment von 8 bis 110 Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Reaktion mit Iodessigsäure carboxymethyliert sind und dass es sich um ein virales Regulatorprotein oder ein Fragment eines viralen Regulatorproteins handelt.
Protein oder Fragment gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Virus um HIV-1 oder HIV-2 handelt.
Protein oder Fragment gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein virales Regulatorprotein oder ein Fragment eines viralen Regulatorproteins handelt.
Protein oder Fragment gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es von Tat stammt.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Fragments, wie es in Anspruch 1 definiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass man das Protein oder Fragment einer Carboxymethylierung durch Reaktion mit Iodessigsäure unterzieht, so dass man die erwartete Verbindung erhält, die man dann isoliert.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Fragment während der Carboxymethylierung in einer Form vorliegt, in der es mit einem Marker fusioniert ist (FP).
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker nach der Reinigung abgespalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker eine Peptidverbindung umfasst, die mehrere Histidinreste umfasst.
Protein oder Fragment gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Protein oder Fragment von 8 bis 110 Aminosäuren des Tat-Proteins von HIV-1, carboxymethyliert durch Reaktion mit Iodessigsäure zur Verwendung in einem Verfahren der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff wenigstens eines der carboxymethylierten Proteine oder Fragmente, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff wenigstens eines der Proteine oder Fragmente, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 4 definiert sind, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff umfasst.
Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er als Wirkstoff wenigstens eines der Proteine oder Fragmente umfasst, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert sind.
Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Carboxyamidomethylierung durch Reaktion mit Iodacetamid erhalten wird und dass es sich um ein virales Regulatorprotein handelt.
Protein gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Virus um HIV-1 oder HIV-2 handelt.
Protein gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Tat-Protein handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man das Protein einer Carboxyamidomethylierung durch Reaktion mit Iodacetamid unterzieht, so dass man die erwartete Verbindung erhält, die man dann isoliert.
Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein während der Carboxyamidomethylierung in einer Form vorliegt, in der es mit einem Marker fusioniert ist (FP).
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker nach der Reinigung abgespalten wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker eine Peptidverbindung umfasst, die mehrere Histidinreste umfasst.
Proteinfragment von 8 bis 110 Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Carboxyamidomethylierung durch Reaktion mit Iodacetamid erhalten wird und dass es sich um ein Fragment eines viralen Regulatorproteins handelt, wobei das Fragment während der Carboxyamidomethylierung in einer Form vorliegt, in der es mit einem Marker fusioniert ist (FP).
Fragment gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker eine Peptidverbindung umfasst, die mehrere Histidinreste umfasst.
Protein oder Fragment gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 und 21 bis 22 zur Verwendung in einem Verfahren der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff wenigstens ein Protein oder Proteinfragment, wie sie in einem der Ansprüche 14 bis 16 und 21 bis 22 definiert sind, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff umfasst.
Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er als Wirkstoff wenigstens ein Protein oder Proteinfragment umfasst, wie sie in einem der Ansprüche 14 bis 16 und 21 bis 22 definiert sind.
Impfstoff gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass er einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff umfasst.
Impfstoff gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff um ein Adjuvans handelt.