DE69420042T2

DE69420042T2 - Vielfältig verzweigte peptidkonstruktion zur bekämpfung von hiv

Info

Publication number: DE69420042T2
Application number: DE69420042T
Authority: DE
Inventors: Abdelaziz Benjouad; Emmanuel Fenouillet; Jean-Claude Gluckman; Kamel Mabrouk; Herve Rochat; Jean Marc Sabatier; Jurphaas Van Rietschoten; Nouara Yahi
Original assignee: Armel SA
Current assignee: Cellpep Sa Paris Fr
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 2000-04-13
Anticipated expiration: 2014-09-14
Also published as: ATE183201T1; OA10271A; EP0719281A1; AP502A; CN1130911A; GR3031367T3; PL313520A1; EP0719281B1; IL110929A0; BR9407530A; AP9400680A0; HUT75092A; AU7619694A; DE69420042D1; DK0719281T3; HU9600594D0; WO1995007929A1; ES2137378T3

Description

Das menschliche Immunschwächevirus ("human immunodeficiency virus", HIV) ist vermutlich das ätiologische Agens des erworbenen Immunschwächesyndroms ("aquired immunodeficiency syndrome", AIDS). Das HIV bewirkt in unterschiedlichen Zelltypen eine persistierende Infektion; viele der Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche ein Antigen, den CD4-Rezeptor, als eine Bindungsstelle. In solchen Zellen besteht der erste Schritt der Zellinfektion aus einem Festmachen des Virus, wobei das äußere Hüllglykoprotein von HIV an das CD4- Oberflächenantigen der Zelle bindet. Auf diese Bindung folgt eine Reihe von Ereignissen, die die Verschmelzung der Virushülle mit der Membran der Zielzelle sowie die Internalisierung umfassen, wodurch die Zelle infiziert wird. HIV-infizierte Zellen können sodann andere Zellen infizieren, wobei Synzytien (vielkernige Riesenzellen) gebildet werden. Die Synzytienbildung zwischen HIV-infizierten Zellen und nichtinfizierten CD4&spplus;-Zellen (Zellen, die den CD4-Rezeptor aufweisen) umfaßt eine Wechselwirkung zwischen dem CD4-Rezeptor und dem HIV-Oberflächenhüllglykoprotein. Dieser Prozess wird durch lösliches CD4, Anti-CD4- und Anti-V3-Antikörper blockiert.
Die Zellverschmelzungsprozesse, die für die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle in vivo verantwortlich sind, führen dazu, daß die neutralisierenden Antikörper des Plasmas nicht greifen und das Virus dem Immunsystem entkommen kann, das bereits durch einen Lymphocytenmangel geschädigt ist. Die durch HIV aktivierten B-Lymphocyten erzeugen unterschiedliche Antikörperpopulationen. Einige Antikörper beeinträchtigen die Wechselwirkung von gp120 und CD4 nicht, blockieren jedoch die Membranverschmelzung, den für die Infektion der Zellen verantwortlichen Prozess. Diese Antikörper sind hauptsächlich gegen die V3-Schleife ("V3-Loop") des Hüllglykoproteins gerichtet.
Aufgrund der hohen Variabilität des V3-Loops in unterschiedlichen HIV-1- Isolaten neutralisieren Anti-V3-Antikörper im allgemeinen lediglich das Isolat, gegen welches die Antikörper produziert wurden. Aus diesem Grund ist die Neutralisierung auf das Isolat begrenzt und wird Isolat-spezifisch genannt. Diese Anti körper wirken durch eine Hemmung der Zellverschmelzung, ohne daß sie auf die Zelle-Virus-Bindung eine Wirkung haben.
Mehrere Ansätze wurden unternommen, die HIV-Infektion durch V3-Loop- verwandte Peptide zu hemmen, wobei die Wirksamkeit solcher Peptide in Frage gestellt wurde. Z. B. fanden De Rossi et al. [Virology 184 (1991), 187-196], daß einige der V3-Peptide die virale Infektiosität steigerten. Andere synthetische Peptide aus dem V3-Loop, cyclische oder nicht-cyclische, waren bei dem kritischen Schritt der Zellverschmelzung unwirksam. G. P. Allaway et al. [AIDS Research and Human Retroviruses, Bd. 9, Nr. 7, (1993)] zeigten, daß bestimmte CD4-basierende Moleküle (welche das Festmachen des HIV hemmen) zusammen mit bestimmten HIV-1-neutralisierenden Antikörpern, die gegen den V3-Loop von gp120 oder gegen gp41 gerichtet sind (welche die HIV-Verschmelzung hemmen), bei der Hemmung der HIV-1-Hülle-vermittelten Zellverschmelzung synergistisch wirken, dies legt nahe, daß CD4-basierende Moleküle bei Patienten mit natürlich vorkommendem Anti-V3-Loop- oder Anti-gp41-Antikörpern wirksamer sein könnten.
Kürzlich wurde in mehreren Studien gezeigt, daß es sowohl für HIV-1 als auch für HIV-2 einen CD4-unabhängigen Weg der Zellinfektion gibt, dies weist auf das Vorliegen von mindestens einem anderen viralen Rezeptor hin. Einer dieser mutmaßlichen Nicht-CD4-HIV-Rezeptoren wurde vor kurzem auf CD4-Zellen, die vom Gehirn stammten, und Colonepithelzellen identifiziert. Dieser Rezeptor ist ein neutrales Glykolipid, genannt Galactosylceramid (GalCer). Die HIV-Infektion von CD4&supmin;/GalCer&spplus;-Zellen im Gehirn und im Intestinum ist möglicherweise für einige mit HIV zusammenhängende Störungen in diesen Organen verantwortlich. Darüber hinaus könnte das Vorliegen von GalCer auf der apikalen Seite von einigen Schleimhautepithelzellen den Eintritt des Virus während des Geschlechtsverkehrs erleichtern. Bisher wurde für kein von dem V3-Loop stammendes Peptid gezeigt, daß es den GalCer-Rezeptor blockieren kann.
Als Reaktion auf einige dieser Probleme setzte J. P. Tam radial verzweigte Systeme mit Lysin-Skeletten in Polymeren ein [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5409-5413], wodurch Antigene ohne die Verwendung von Trägern entwickelt wurden. Solche Antigene wurden so gestaltet, daß sich damit Impfstoffe gegen eine Vielzahl von Krankheiten erzeugen lassen. Insbesondere werden von Tam in der PCT-Anmeldung Nr. WO93/03766 Antigene zur Herstellung von Impfstoffen gegen die HIV-Infektion beschrieben, die im wesentlichen die Sequenz IGPGR umfassen (Ein-Buchstaben-Nomenklatur für Aminosäuren nach den IUPAC-Regeln) und aus einer Länge von elf Aminosäuren bestehen, so daß sie bei der Induktion geeigneter Immunantworten wirksam sind. Vgl. auf S. 13, Zeilen 29-31. Solche Antigene sind jedoch nicht als potentielle direkte therapeutische Ansätze gegen eine beliebige Erkrankung gedacht, vielmehr sollen sie eine immunogene Antwort im Körper hervorrufen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Peptidkonstrukt für die therapeutische Behandlung von Patienten mit HIV-Infektionen und ein Medikament, das dieses Peptidkonstrukt enthält. Gemäß der Erfindung weist das mehrfach verzweigte Peptidkonstrukt für die therapeutische Verabreichung die in Patentanspruch 1 dargestellten Eigenschaften auf.

Abbildungen

Fig. 1 zeigt einen vorgeschlagenen Mechanismus der Bindung von HIV an CD4&spplus;- oder CD4&supmin;-Zellen.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse beim Testen der Wirkung von mehrfach verzweigten Peptidkonstrukten ("multiple branch peptide constructions", MBPCs) auf die Infektion von menschlichen peripheren Blutlymphocyten (PBLs) mit drei verschiedenen Stämmen von HIV, wobei die Menge von p24 (pg/ml) oder die Aktivität der Reversen Transkriptase (RT) gegen drei verschiedene MBPCs aufgetragen wurde; 1- keines; 2-[GPGRAF]&sub8;-Mehrfach-Lysin-Kern ("multiple lysine core", MLC); 3-[RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC; 4-[PPYVEPTTTQC]&sub4;-MLC.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse beim Testen der Wirkung der MBPCs auf die Infektion menschlicher Makrophagen, wobei die MBPCs gegen die Menge von p24 (ng/ml) aufgetragen wurden. Fünf verschiedene MBPCs wurden verwendet: 1-keines; 2-[GPGRAF]&sub8;-MLC; 3-[GPGRAF]&sub8;-MLCD; 4-[GPG(R)DAF]&sub8;-MLC; 5- [RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC und 6-[PPYVEPTTTQC]&sub4;-MLC.
In Fig. 4A ist die Synzytienbildung in infizierten Kulturen ohne MBPCs dargestellt.
In Fig. 4B ist das Fehlen einer Synzytienbildung in Makrophagen dargestellt, die mit [GPGRAF]&sub8;-MLC behandelt wurden.
Fig. 5A zeigt die Wirkung von MBPCs auf die Infektion menschlicher Epithelzellen über den GalCer-Rezeptor.
Fig. 5B zeigt die Fähigkeit von MBPCs, die Bindung von gp120 an den GalCer-Rezeptor zu blockieren.
Die Fig. 6A, 6B, 7A, 7B und 7C zeigen alle die relative Nicht-Reaktivität von Kaninchenseren, immunisiert mit einem kurzen MBPC, im Vergleich zu Kaninchenseren, immunisiert mit einem längeren MBPC.

Genaue Beschreibung der Erfindung

I. Struktur

Die vorliegende Erfindung betrifft mehrfach verzweigte Peptidkonstrukte (MBPCs), die die HIV-Infektion und die Verbreitung und Ausbreitung einer HIV- Infektion hemmen können. Die MBPCs besitzen eine Kernmatrix, an die Peptide kovalent gebunden sind. Die Kernmatrix ist ein dendritisches Polymer, das eine verzweigte Form aufweist, wobei seine Äste vorzugsweise jeweils identisch sind. Die Kernmatrix basiert auf einem Kernmolekül, das mindestens zwei funktionelle Gruppen besitzt, an die molekulare Äste mit terminalen funktionellen Gruppen kovalent gebunden sind. Geeignete Kernmoleküle umfassen Ammoniak oder Ethylendiamin. Geeignete molekulare Äste umfassen Acrylestermonomere, die an das Kernmolekül polymerisiert sind. Solche Moleküle können so konstruiert werden, daß sie eine unterschiedliche Anzahl von Ästen besitzen, abhängig von der Zahl der Monomeren, die vom Kernmolekül abgezweigt sind. Für die Verwendung hier sind MBPCs mit 4 bis 16 Ästen vorgesehen.
Für die Bildung der Kernmatrix kann z. B. Lysin verwendet werden. Ein zentraler Lysinrest wird mit zwei Lysinresten verbunden, wobei die Bindung jeweils über deren Carboxylgruppe an eine der Aminogruppen des zentralen Lysinrestes erfolgt. Auf diese Weise wird ein Molekül mit vier Aminogruppen bereitgestellt, welches die Kernmatrix für ein MBPC mit vier Peptiden darstellen kann. In einer anderen Ausführungsform kann man ein Molekül mit acht Ästen bereitstellen, indem vier Lysinreste über ihre Carboxylgruppen an eine der Aminogruppen der Lysinreste gebunden werden, die an das zentrale Lysin gekoppelt sind. Dieses Molekül kann als Kernmatrix für ein MBPC mit acht Peptiden dienen, oder es kann andererseits acht Lysinreste aufnehmen, wodurch eine Kernmatrix für ein MBPC mit 16 Peptiden gebildet wird.
Die C-Enden der Peptide werden an jeden der Äste der Kernmatrix kovalent gebunden, wodurch das MBPC gebildet wird. Die Peptide können die gleichen sein, was bevorzugt ist, oder sie können voneinander verschieden sein. Das resultierende Molekül besitzt auf der Oberfläche eine Ansammlung ("cluster") von Peptiden sowie eine innere Kernmatrix, die nicht präsentiert wird und daher nicht als Antigen wirkt. Beispiele ähnlicher Strukturen, die andere Peptide als die hier beschriebenen aufweisen, finden sich in J. P. Tam [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5409-5413] und im US-Patent Nr. 5229490 an Tam und den darin zitierten Referenzen.
Gegebenenfalls können Zwischenstücke zwischen den Peptiden und der Kernmatrix eingefügt sein. Die Carboxylgruppe des ersten Lysinrestes kann frei gelassen sein, sie kann amidiert oder an β-Alanin oder eine andere blockierende Verbindung gebunden sein.
Peptide können D- oder L-Aminosäurereste umfassen. D-Aminosäuren bleiben in vivo länger bestehen, da sie für die Peptidase schwieriger zu spalten sind, während jedoch die L-Aminosäuren eine bessere Wirksamkeit aufweisen, wie nachstehend diskutiert.
Außerdem können anstelle von Peptiden auch Peptidanaloga eingesetzt werden, d. h. synthetische Konstrukte, bei denen das Kohlenstoffskelett der Peptide vorliegt, jedoch die -CONH-Peptidbindungen fehlen. Es sollte also so verstanden werden, daß bei Bezugnahme auf Peptide hier auch Peptidanaloga gemeint sind. Es wird angenommen, daß Peptidanaloga widerstandsfähiger gegenüber Peptidase sind und in vivo länger erhalten bleiben.
Die MBPCs der vorliegenden Erfindung umfassen Peptide, die von dem V3-Loop des Oberflächenhüllglykoproteins gp120 des HIV-1-Virus abgeleitet sind, und sie enthalten davon die Konsensus-Aminosäuresequenz GPGR (IUPAC-Ein- Buchstaben-Nomenklatur für Aminosäuren, d. h. Gly-Pro-Gly-Arg). Die MBPCs hemmen wirksam HIV-Infektionen in menschlichen Zellkulturen verschiedener Zelltypen. Die Hemmung scheint vom Virusstamm unabhängig zu sein, und sie scheint sogar gegen HIV-2-Stämme wirksam zu sein. Sie besitzen somit ganz erstaunliche therapeutische Eigenschaften.
Es sollte beachtet werden, daß die entsprechenden Peptidmonomeren keinerlei therapeutische Wirkung zeigen. Der Unterschied liegt vermutlich darin, daß die Kernmatrix eine Konformationsänderung des Peptids bewirkt. Insbesondere und unerwarteterweise wurde gefunden, daß die zwei Aminosäuren, die im Peptid auf GPGR folgen, sich verbiegen, wenn das GPGR-Monomer an die Kernmatrix angehängt wird. Somit ist es bevorzugt, daß in den Peptiden, die an die Kernmatrix gekoppelt werden, mindestens zwei Aminosäurereste auf GPGR folgen. Da jedoch das MBPC als Antigen wirkt, wenn das Peptid zu fange ist, ist es nicht erwünscht, daß mehr als vier Aminosäurereste auf die GPGR-Sequenz folgen und mehr als vier Aminosäurereste dieser Sequenz vorausgehen. Somit wird das Peptid 12 oder weniger Aminosäuren aufweisen.
Spezifische MBPCs, die eine Wirkung auf die Hemmung der Infektion durch HIV-1- und HIV-2-Retroviren zeigen, umfassen die folgenden, die anhand der IUPAC-Nomenklatur für Aminosäuren angegeben sind:

Tabelle 1 - Beispiele von MBPCs

MBPC.1: (GPGRAFY)&sub8;-(K)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-OH oder
(GPGRAFY)&sub8;-(K)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-NH&sub2;
MBPC.3: (GPGRAF)&sub8;-(K)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-OH oder
(GPGRAF)&sub8;-(K)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-NH&sub2;
MBPC.12: (GPGRAF)&sub1;&sub6;-(K)&sub8;-(K)&sub4;-(K)&sub2;-K-A-OH oder
(GPGRAF)&sub1;&sub6;-(K)&sub8;-(K)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-NH&sub2;
Der vorstehend angegebene OH-Terminus am β-Alanin stellt seine Carboxylgruppe dar, wobei die Aminogruppe mit der Carboxylgruppe des Lysinrestes verknüpft ist. Der NH&sub2;-Teminus stellt eine Modifikation der Carboxylgruppe von β- Alanin dar, wodurch ein Carboxamid-Terminus gebildet wird; das β-Alanin ist immer noch über seine Aminogruppe mit der Carboxylgruppe des Lysinrestes verknüpft. In den nachstehend beschriebenen Beispielen werden die OH-Formen eingesetzt.
Trotz des Ergebnisses, daß die Peptide die Konsensus-Sequenz GPGR enthalten sollten, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu besitzen, wurde gefunden, daß der Einbau eines Isoleucins in die Struktursequenz vor dem GPGR, wie bei IGPGR oder IXXGPGR (wobei X einen beliebigen Aminosäurerest darstellt), auch aus dem V3-Loop, dazu führt, daß das MBPC in der therapeutischen Behandlung schwach wirksam oder unwirksam wird, wenn die Peptide, welche die IGPGR-Sequenz enthalten, aus 12 oder weniger Aminosäureresten bestehen, weshalb sie für die Verwendung hier nicht bevorzugt sind. Die Sequenz mit einem Isoleucin (I), das innerhalb von drei Aminosäuren vor dem GPGR liegt, ist eine relativ konservierte Sequenz, die in etwa 98% der HIV- Genome gefunden wird, jedoch wurde erstaunlicherweise entdeckt, daß sie unerwünscht ist.
Obwohl die MBPCs, welche die Sequenz IGPGR oder IXXGPGR enthalten, nicht bevorzugt sind, wurde gefunden, daß MBPCs mit dieser Peptidsequenz die Synzytienbildung blockieren, wenn ... ein Beispiel eines solchen größeren MBPC, welches die Synzytientbildung blockiert, ist ein Konstrukt, in welchem das Peptid, das an jeden Ast eines vierfach verzweigten MBPC gebunden ist, RKSIHIGPGRAFYT ist. Jedoch sind solche großen MBPCs unerwünscht, weil gezeigt wurde, daß solche großen Moleküle sogar in niedrigen Konzentrationen (10&supmin;&sup4; M) Antikörper induzieren, und weil sie von den Antikörpern von HIV-infizierten Patienten erkannt und gehemmt werden, diese beiden Tatsachen sprechen dagegen, daß sie in HIV-infizierten Patienten langfristig eingesetzt werden können. Diese MBPCs zeigen außerdem auf Zellkulturen in Konzentrationen in der Nähe ihrer wirksamen Konzentrationen eine Toxizität. Außerdem hat die Größe dieser MBPCs zur Folge, daß ihre Herstellung schwierig und teuer ist und daß sie empfindlicher gegenüber der Spaltung durch Protease sind.
Die Erfindung stellt daher ein mehrfach verzweigtes Peptidkonstrukt bereit, das eine Kernmatrix umfaßt, an die 4 bis 16 Peptide gebunden sind, wobei jedes dieser Peptide die Aminosäuresequenz GPGR enthält, der 0 bis 4 Aminosäurereste vorausgehen und auf die 2 bis 4 Aminosäurereste folgen, aber im wesentlichen frei ist von der Aminosäuresequenz IGPGR oder IXXGPGR, bei der X einen Aminosäurerest darstellt, wobei das mehrfach verzweigte Peptidkonstrukt bei Serumkonzentrationen von weniger als 10&supmin;&sup4; molar nicht immunogen ist. Vorzugsweise sind die Peptide, die an eine 8- bis 16-fach verzweigte Kernmatrix gebunden sind, GPGRAF. Jedoch wird angenommen, daß Substitutionen im AF möglich sind, wobei die substituierten Aminosäuren die gleichen Eigenschaften aufweisen, und daß sie erwünscht sein können, weil AF gegenüber Peptidase empfindlich zu sein scheint und daher in vivo möglicherweise nicht stabil ist.

II. Herstellung von MBPCs

Die Herstellung der MBPC-Struktur, die aus einem verzweigten Kern mit daran gebundenen Peptiden besteht war dem Fachmann bereits bekannt, sie wurde jedoch früher mehrfach-antigene Peptide (MAPs) genannt. Vgl. z. B. Tam et al., J. Immun. 148 (1992), 914-920; und Wang et al., Science 254 (1991), 285-288. Vorzugsweise wird für die Herstellung der MBPCs in kleinen Mengen (unter 1 kg) ein Festphasenverfahren verwendet. Der schrittweise Zusammenbau der Peptidketten kann automatisch an 4-(Oxymethyl)phenylacetatamidomethyl-Copoly- (Styrol-1% Divinylbenzol) erfolgen. Die Boc/Benzyl-Strategie kann eingesetzt werden, die ein systematisches Doppelkopplungsschema mit aktiven Hydroxybenzotriazol-Estern (Boc-Aminosäure-OBt) umfaßt. Die letzte Abspaltung vom Harz erfolgt mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (eine Stunde bei 0ºC). Anschließend wird das MBPC mit Diethylether gewaschen und in Wasser gelöst. Nach der Gefriertrocknung kann das MBPC auf einer P2- oder G15-Molekularfiltrations-Säule vorgereinigt werden, die mit 0,1 N Essigsäure äquilibriert wurde. Die Eluatfraktion kann sodann gewonnen werden. Der Reinigungsschritt erfolgt unter Einsatz von C&sub8;- oder C&sub1;&sub8;-Reverse Phase-HPLC. Das MBPC kann durch seinen Aminosäuregehalt nach Säurehydrolyse (6 N HCl, 115ºC, 24 Stunden) und Elektrospray-Massenspektrometrie charakterisiert werden.

III. Therapeutische Wirkung und Verwendung

Für die Behandlung von HIV-Infektionen kann an einen Patienten ein mehrfach verzweigtes Peptidkonstrukt verabreicht werden, das eine Kernmatrix umfaßt, an die 4 bis 16 Peptide gebunden sind, wobei jedes dieser Peptide die Aminosäuresequenz GPGR enthält, der 0 bis 4 Aminosäurereste vorausgehen und auf die 2 bis 4 Aminosäurereste folgen, aber im wesentlichen frei ist von der Aminosäuresequenz IGPGR oder IXXGPGR, bei der X einen Aminosäurerest darstellt, wobei das mehrfach verzweigte Peptidkonstrukt bei Serumkonzentrationen von weniger als 10&supmin;&sup4; molar nicht immunogen ist. Die MBPCs sollten in Serumspiegeln zwischen 10&supmin;³ M und 10&supmin;&sup7; M, jedoch vorzugsweise bei etwa 10&supmin;&sup6; M verabreicht werden.
Die MBPCs gemäß der vorliegenden Erfindung hemmen sowohl die HIV- Infektion als auch HIV induzierte cytopathische Effekte in vitro und können somit die Virusmultiplikation und die Ausbreitung des Virus im Wirtsorganismus hemmen.
Die MBPCs gemäß der vorliegenden Erfindung neutralisieren den Schritt der Verschmelzung von Virushülle und Zellmembran und außerdem den Schritt der Verschmelzung der Membranen einer infizierten Zelle und einer nichtinfizierten Zelle, der für die Synzytienbildung essentiell ist, wobei diese beiden Schritte vermutlich unerläßlich sind für die Infektion der Zellen, die Virusvermehrung und die Ausbreitung des Virus im Wirtsorganismus. Die MBPCs sind fähig, den CD4-Rezeptor zu blockieren, der in Zellen, wie Lymphocyten und Makrophagen, vorliegt, die den HIV-Stamm 89.6 enthalten, indem sie offensichtlich an die CDR3-Domäne des CD4-Rezeptors binden. Somit blockieren die MBPCs der vorliegenden Erfindung die durch HIV-1 und HIV-2 induzierte Bildung von Synzytien und hemmen die Infektion von menschlichen peripheren Blutlymphocyten (PBLs) und Makrophagen. Eine solche Blockierung hat nicht zur Folge, daß die Zelle ihre Fähigkeit verliert, von anderen Antigenen oder Mitogenen aktiviert zu werden, d. h. die Funktionalität des Lymphocyten bleibt bei den MBPCs erhalten.
Da die Funktionalität der Lymphocyten erhalten bleibt, wird mit der vorliegenden Erfindung das mögliche Problem eines künstlichen AIDS vermieden. Aus diesem Grund ist die Tatsache, daß die erfindungsgemäßen MBPCs an den Verschmelzungs-Rezeptor und nicht an den Rezeptor zur Aktivierung der T-Zellen binden, ein wichtiger Fortschritt gegenüber früheren Therapien gegen HIV.
Zusätzlich zur Verhinderung einer HIV-Infektion wurde gezeigt, daß die erfindungsgemäßen MBPCs die Produktion von HIV in Zellen, die vor der Behandlung infiziert worden waren, unterdrücken.
Eine gänzlich unerwartete Eigenschaft der erfindungsgemäßen MBPCs und insbesondere der bevorzugten 8 · GPGRAF- und 16 · GPGRAF-MBPCs besteht darin, daß sie die, Fähigkeit gezeigt haben, an den GalCer-Rezeptor zu binden, der ein Rezeptor für HIV ist. Es wurde gezeigt, daß dieser Rezeptor in Colonepithelzellen und in CD4-Zellen des Zentralnervensystems vorliegen. Diese Bindung führt dazu, daß die MBPCs die Infektion von menschlichen Intestinumzellen durch entfernt verwandte Isolate von sowohl HIV-1 als auch HIV-2 hemmen.
Ein weiterer Vorteil der MBPCs der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie sich in Nagern, Kaninchen und Affen in hohen Dosen als nicht-toxisch erwiesen haben und daß sie somit bei der therapeutischen Anwendung im Gegensatz zu vielen herkömmlichen AIDS-Therapien für den Patienten nicht schädlich sein werden.
Ein weiterer Vorteil der MBPCs der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie in Konzentrationen von 10&supmin;&sup4; M oder weniger nicht immunogen sind und daß sie somit, anders als alle bisherigen Ansätze nach dem Stand der Technik, bei denen von dem V3-Loop abgeleitete Peptide oder Konstrukte davon verwendet wurden, keine Impfstoffe sind. Das Fehlen einer Immunogenität der MBPCs ist ein Vorteil, da eine Immunreaktion zu einer Antikörperproduktion führen würde, wodurch es zur Hemmung oder Zerstörung der MBPCs kommen würde. Solche immunogenen MBPCs, wie z. B. das vorher erwähnte RKSIHIGPGRAFYT, könnten in einem bestimmten Individuum lediglich einige wenige Male eingesetzt werden, danach würden sie unwirksam werden.

A. Blockierung des CD4-Rezeptors

Experimentelle Ergebnisse zeigen eine spezifische Hemmwirkung der MBPCs der vorliegenden Erfindung, insbesondere von MBPC.3 und MBPC.12, auf den Prozess der HIV-Infektion von CD4&spplus;-Zellen und eine vollständige Blockierung einer HIV-1- und HIV-2-induzierten Synzytienbildung. Die MBPC-Konzentrationen, bei denen in vitro eine Hemmwirkung beobachtet wurde, liegen für MBPC.3 und MBPC.12 bei etwa 10&supmin;&sup6; M und für andere MBPCs bei höheren Konzentrationen. Die Neutralisierung wurde bei allen getesteten HIV-Stämmen beobachtet, d. h. MN, LAI, NDK und 89.6 für HIV-1, und ROD für HIV-2. Im Gegensatz dazu sind die einzelnen Peptidfragmente, die in den MBPCs eingesetzt werden, bei der Hemmung der Synzytienbildung inaktiv, sogar in sehr hohen Konzentrationen, z. B. 5 · 10&supmin;&sup4; M.
Die MBPCs könnten somit mit einem zellulären Molekül interagieren, das an einem nach der Bindung ablaufenden Vorgang, d. h. im Stadium der Fusion beteiligt ist, für die Infektion der Zelle erforderlich ist und bei entfernt verwandten HIV-1- und HIV-2-Isolaten, die unterschiedliche V3-Loops präsentieren, auftritt. Ein guter Kandidat für diese postulierte V3-Bindungsstelle ist die CDR3-Domäne der V1-Region von CD4, denn: i) blockieren Anti-CD4-Antikörper, die für diese Region spezifisch sind (z. B. 13B8-2), den Fusionsprozess während der HIV-1- Infektion, ii) zeigen die von CDR-3 abgeleiteten synthetischen Peptide in Fusionstests eine gewisse Hemmwirkung, und iii) erkennen die MBPCs ein synthetisches Peptid, das der CDR3-Domäne von C174 entspricht.
Die MBPCs der vorliegenden Erfindung binden an Lymphocyten, ohne die Bindung der Virushülle (über die CDR2-Domäne) zu verändern, während der Vorgang der HIV-Infektion verhindert wird. Die MBPCs binden auch an lösliches CD4. Aus diesem Grund wird die MBPC-Bindung in Gegenwart von löslichem CD4 gehemmt.
Die Wirkung der MBPCs der vorliegenden Erfindung auf die Wechselwirkung zwischen Region-spezifischen Anti-CD4-Antikörpern und dem CD4-Rezeptor wurde in seiner natürlichen Umgebung untersucht. Die In situ-Bindung des gegen CDR3 gerichteten monoclonalen Antikörpers (MAb) 13B8-2 an das auf Makrophagen exprimierte CD4 war in Gegenwart der erfindungsgemäßen MBPCs dramatisch und spezifisch herabgesetzt. Die Bindung von anderen Anti-CD4- MAbs, einschließlich solchen, die die gp120-Bindungsstelle erkennen (die MAbs Leu3a und OKT4a), war in Abwesenheit und in Gegenwart von MBPCs identisch. Diese Ergebnisse zeigen, daß die MBPCs an die CDR3-Region von CD4 binden und somit mindestens zum Teil wirken, indem sie die Wechselwirkung zwischen der V3-Loop von gp120 und dieser Domäne von CD4 blockieren.
Obwohl die V3-Loop von HIV-1 im Verschmelzungsprozess zwischen HIV-1 und seinen Zielzellen als eine wichtige Determinante angesehen wird, war es bisher vor der vorliegenden Erfindung noch nicht möglich, diese Eigenschaft therapeutisch zu nutzen. Der Hauptgrund hierfür liegt darin, daß V3 eine hypervariable Region ist, die bei den HIV-1-Isolaten ein hohes Maß an Vielfalt zeigt. Neutralisierende Anti-V3-Antikörper sind im allgemeinen Typ-spezifisch und können im besten Fall lediglich nahe verwandte Isolate neutralisieren. Da die MBPCs der vorliegenden Erfindung auf zelluläre und nicht auf virale Determinanten gerichtet sind, umgehen sie die Probleme, die mit der Variabilität der Hülle zusammenhängen. Somit können die in der Erfindung eingesetzten MBPCs, obwohl sie von der Konsensus-Sequenz des HIV-1-V3-Loops hergeleitet sind, verschiedene HIV-1-Stämme, einschließlich des hoch-divergenten HIV-1 (NDK), und außerdem den nicht verwandten HIV-2-Stamm ROD neutralisieren. Erstaunlicherweise wurde außerdem gefunden, daß die MBPCs der vorliegenden Erfindung die Infektion mit primären HIV-1-Isolaten hemmen, d. h. Isolaten, die direkt von Patienten gewonnen wurden, einschließlich Stämme, die gegen AZT, J-1, resistent sind.
Die folgenden Beispiele, die die vorstehende Beschreibung in keiner Weise einschränken sollen, erläutern die Wirksamkeit, den Nutzen und die Bandbreite der Verwendung der erfindungsgemäßen MBPCs in Bezug auf eine HIV-Infektion, sowie ihre Bindung und Verschmelzung mit CD4&spplus;-Lymphocyten und Makrophagen.

Beispiel 1 - Blockierung der Synzytientbildung

Die Zellen wurden in RPMI 1640, das mit 5% fetalem Kälberserum, 1% Glutamin, 1% Streptomycin-Penicillin angereichert war (Gibco of Irvine, Schottland), in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; gezüchtet. CEM- oder C8166-Zellen wurden chronisch infiziert mit HIV-1-LAI oder HIV-2-ROD bzw. mit HIV-1-MN. Die infizierten Zellen (1 · 10&sup4;) wurden zwei Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von MBPCs in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Anschließend wurden nicht-infizierte Molt-4-Zellen (4 · 10&sup4;) in 100 ul Kulturmedium zugegeben. Die Synzytien wurden nach 18 Stunden bei 37ºC gezählt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 2 - Synzytienbildung
MBPC.4 ist (IGPGRAF)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-OH. Mono.3 ist das Hexapeptid GPGRAF und MBPC.5 ist das Tetradecapeptid-MBPC (RKSIHIGPGRAFYT)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-OH. MBPC.3 ist wie vorstehend definiert.
Das Vorliegen von Synzytien ist mit +-Zeichen dargestellt, die das ungefähre Mengenverhältnis der gezählten Mengen wiedergeben.
MBPC.3 zeigte bei einer Konzentration von etwa 10&supmin;&sup6; M eine in vitro- Hemmwirkung auf die durch HIV induzierte Synzytienbildung, und MBPC.5 zeigte bei einer etwas höheren Konzentration eine Hemmwirkung. Mit MBPC.12 wurden ähnliche Ergebnisse erhalten wie mit MBPC.3 (Ergebnisse nicht dargestellt). Im Gegensatz dazu ist die monomere Version Mono.3 vollständig inaktiv; dies wurde auch für Mono.3 in der höheren Konzentration von 10&supmin;&sup4; M bestätigt.

Beispiel 2 - Verhinderung der Infektion von PBLs

50 · 10³ 8E5-Zellen, die mit einem RT-defizienten HIV-I(IIIB)-Isolat chronisch infiziert waren, wurden zusammen mit 150 · 10³ Phytohämagglutinin (PHA)-stimulierten menschlichen peripheren Blutlymphocyten (PBLs) in Gegenwart des angegebenen Peptids in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet. Die eingesetzten MBPCs sind durch die Peptide und deren Anzahl gekennzeichnet, die an eine mit MLC bezeichnete Lysin-Kernmatrix gebunden sind. Alle in diesem Experiment verwendeten Aminosäuren lagen in der Dextro-Form vor.
Die chemische Synthese von MBPCs erfolgte durch die Festphasentechnik, wie vorstehend beschrieben. Die Peptidketten wurden auf 4-(Oxymethyl)- PAM-Harz schrittweise verlängert, wobei eine optimierte t-Butyloxycarbonyl/Benzyl-Chemie eingesetzt wurde. Die Aminosäureanalysen der gereinigten MBPCs stimmen mit den hergeleiteten Aminsäureverhältnissen überein.
[GPGRAF]&sub8;-MLC wurde durch Elektrospray-Massenspektrometrie weiter charakterisiert (experimentelles Mτ = 5672 Da).
Die Anzahl der Synzytien wurde nach 24 Stunden Inkubation mit kontinuierlichem Vorliegen der Peptide bestimmt, und die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 dargestellt. +++ gibt an, daß die Anzahl der in der Vertiefung vorliegenden Synzytien ähnlich war wie in den unbehandelten Kontrollvertiefungen; - zeigt die vollständige Abwesenheit von Synzytien in der Vertiefung an; ± bezeichnet das gelegentliche Vorliegen von wenigen Synzytien in der Vertiefung. Die Synzytienbildung wurde in diesem Test durch die Anti-CD4-Antikörper OKT4A (Anti-CDR2) und 13B8-2 (Anti-CDR3) blockiert, was mit früheren Berichten übereinstimmt. Die Kern-Lysin-Strukturen (mit "MLCs" bezeichnet) selbst induzierten in diesem Test keine Synzytienbildung. Die Toxizität wurde entweder durch den MTT-Test (nachstehend beschrieben) oder durch die Trypanblau-Ausschluß-Technik ermittelt. Tabelle 3 - Hemmung der HIV-1-induzierten Zellverschmelzung durch MBPCs
Unter diesen Versuchsbedingungen induzierte [GPGRAF]&sub8;-MLC bei der niedrigen Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup7; M eine deutliche Hemmung der Synzytienbildung, während das entsprechende monomere Peptid GPGRAF im eingesetzten Konzentrationsbereich (bis zu 5 · 10&supmin;&sup5; M) nicht aktiv war. Die N-terminale Acetylierung ([Ac-GPGRAF]&sub8;-MLC), das Anfügen eines Isoleucinrestes (I) ([IGPGRAF]&sub8;-MLC) und der Einbau von D-Aminosäuren in die GPGRAF-Sequenz führte zu einem signifikanten Aktivitätsverlust. MBPCs mit weniger als sechs Resten (d. h. [GPGRA]&sub8;-MLC oder [GPGR]&sub8;-MLC) und außerdem MBPCs mit einer nicht-relevanten Sequenz hemmten die Zellverschmelzung nicht, dies zeigt, daß die Kernmatrix nicht an der biologischen Wirkung beteiligt war.
[RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC war fähig, die Synzytienbildung bei einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup6; M zu hemmen. Da der Isoleucinrest, welcher der GPGRAF-Einheit vorausgeht, bei den HIV-1-Isolaten hoch-konserviert ist, wurden zwei verwandte Konstrukte mit einem Lysin- oder einem Threoninrest anstelle des Isoleucinrestes synthetisiert. Bei diesen drei Konstrukten wurden keine signifikanten Unterschiede in der Anti-Fusions-Aktivität festgestellt. Jedoch sollte beachtet werden, daß [RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC und seine Derivate in 8E5-Zellen eine gewisse Toxizität induzierten, wenn sie in einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup5; eingesetzt wurden, und sie deshalb für die Verwendung in der Therapie am Menschen unerwünscht sind.
Aufgrund dieser Ergebnisse schien [GPGRAF]&sub8;-MLG das wirksamere Anti- HIV-MBPC zu sein. In anderen Tests war dieses Molekül auch fähig, die Verschmelzung von mit HIV-1(LAI), HIV-1(NDK) oder HIV-2(ROD) chronisch infizierten T-Lymphoblastoid-CEM-Zellen und HTLV-1-transformierten MT-2-Zellen zu blockieren.

Beispiel 3 - Wirkung von MBPCs auf die Funktionalität der Lymphocyten

a) Wirkung von MBPCs auf die Antigen- und Mitogen-induzierte Zellproliferation

Periphere Blutlymphocyten (PBLs) von drei gesunden HIV-seronegativen Spendern wurden aus heparinisiertem Blut durch die Ficoll-Hypaque-Technik isoliert. Das Kulturmedium war RPMI 1640, das mit 1% Glutamin, 1% Antibiotika und 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum angereichert war. Die Zellen (10&sup5;) wurden in Gegenwart von MBPCs (5 · 10&supmin;&sup6; M) mit oder ohne Antigen (Candidin, PPC) oder Mitogen (PHA) inkubiert. Die mit Antigen oder Mitogen behandelten Zeilen wurden acht Stunden mit 1 mCi [³H]-Thymidin gepulst. Anschließend wurden die Zellen geerntet und der Einbau von [³H]-Thymidin in die DNA gezählt.

b) Gemischte Lymphocyten-Antwort (MLR)

In diesem Test wurden periphere Blutlymphocyten von den drei gesunden Spendern (10&sup5;) zusammen mit 10&sup5; Zellen aus einem Gemisch von zehn seronegativen Spendern in 200 ul Endvolumen in Gegenwart oder in Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von MBPCs in Vertiefungen von Mikrotiterplatten inkubiert. Die Lymphocytengemische wurden am Tag 6 acht Stunden mit 1 uCi [³H]-Thymidin gepulst. Die Zellen wurden geerntet und der Einbau von [³H]- Thymidin in die DNA in einem Betazähler gezählt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 dargestellt, wobei MBPC.5 wie im ersten angegeben ist. Tabelle 4 - Antigen- und Mitogen-induzierte PBL-Proliferation
Der Thymidin-Einbau in die Zellen ist bei den behandelten Platten und bei den Kontrollplatten ähnlich. Wenn die Funktionalität der PBLs negativ beeinflußt worden wäre, wäre der Einbau von Thymidin, einem Marker für die Zeilvermehrung, in den MBPC-behandelten Platten deutlich gesteigert. Somit zeigen diese Ergebnisse, daß hier keine Proliferation von PBLs vorliegt, wie das der Fall ist, wenn sie ihre Fähigkeit verloren haben, auf Antigene oder Mitogene zu reagieren.

Beispiel 4 - Wirkung von MBPCs auf die Infektion von menschlichen PBLs

Periphere Blutlymphocyten (PBLs) wurden von gesunden Spendern erhalten, mit Phytohämagglutinin stimuliert und in RPMI 1640 gezüchtet, das 10% fetales Kälberserum und Interleukin-2 enthielt (Komplettmedium). Proben mit 6 · 10&sup6; Zellen/ml wurden entweder mit dem angegebenen MBPC in einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M behandelt oder nicht behandelt und eine Stunde bei 37ºC mit HIV-1 oder HIV-2 (100 TCID&sub5;&sub0;) in Kontakt gebracht, währenddessen waren die MBPCs weiterhin anwesend. Nach gründlichem Waschen wurden die PBLs in Komplettmedium mit 10&supmin;&sup5; M des entsprechenden MBPC gezüchtet. Der Infektionszustand wurde durch Bestimmung der RT-Aktivität (sowohl für HIV-1- als auch für HIV-2-Isolate) und durch Messungen von HIV-1-p24gag (Coulter-Kit, Ausschluß 10 pg/ml) im Fall von HIV-1-Isolaten zehn Tage nach der Infektion festgestellt. Die MBPC-Behandlung sah folgendermaßen aus: 1- keine; 2-[GPGRAF]&sub8;-MLC; 3- [RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC; 4-[PPPYVEPTTTQC]&sub4;-MLC (ein nicht-HIV-verwandtes MBPC) (MLC bezeichnet eine Kern-Lyinstruktur). Die in Fig. 2 gezeigten Ergebnisse wurden aus drei getrennten Experimenten erhalten. Um welche Virusisolate es sich bei den verwendeten handelte, wurde durch PCR (HIV-1- gegen HIV-2-Isolate) und durch RIPA zur Unterscheidung zwischen HIV- 1(LAI) und HIV-1(NDK) überprüft.
Die Behandlung mit [GPGRAF]&sub8;-MLC und [RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC bewirkte durchweg eine Verzögerung in der Produktion von Virusnachkommenschaft, dies wurde durch die Messung der Aktivität der Reversen Transkriptase (RT) in den Kulturüberständen festgestellt: an den Tagen 10 und 13 nach der Infektion war die RT-Aktivität in den MBPC-behandelten Proben mehr als 90% niedriger als in den Kontrollproben. Da die Peptide den RT-Test nicht stören, entspricht das einer MBPC-induzierten Hemmung der Virusproduktion. Ähnliche Ergebnisse wurden (bei HIV-1-Isolaten) erhalten, wenn die Virusproduktion durch Bestimmung der p24gag-Konzentration im Kulturüberstand verfolgt wurde. [RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC war bei der Hemmung der HIV-2-Infektion weniger wirksam als [GPGRAF]&sub8;-MLC. MBPCs, die keine Konsensus-Sequenz aus dem V3-Loop enthielten, hemmten die Infektion von PBLs nicht.

Beispiel 5 - MBPC-Hemmung der Synzytienbildung in Makrophagen

MBPCs wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, die Infektion von menschlichen primären Makrophagen durch ein hoch-cytopathisches makrophagentropes Isolat, HIV-1 (89.6), zu blockieren. Mononucleäre Zellen wurden aus Leukophorese-Einheiten isoliert, die durch Ficoll-Hypaque-Dichtetrennung auf Monocyten angereichert wurden. Die Makrophagen wurden durch Haften an Kunststoff in RPMI 1640 gereinigt, das mit 10% fetalem Kälberserum und 5% menschlichem AB-Serum angereichert war. Die anhaftenden Zellen wurden fünf Tage in Gegenwart von GM-CSF (1 ng/ml) gezüchtet und waren positiv für den menschlichen Makrophagenmarker (Boehringer Mannheim, Clon 25F9). 5 · 10&sup5; Zellen wurden 45 Minuten mit dem angegebenen MBPC in Konzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup5; M behandelt und anschließend mit 10 000 TCID&sub5;&sub0; des makrophagentropen Isolates HIV-1 (89.6) in Kontakt gebracht. Die folgenden MBPCs wurden eingesetzt: 1- keines; 2-[GPGRAF]&sub8;-MLCD; 4-[GPG(R)DAF]&sub8;-MLC; 5- [RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC; 6-[PPPYVEPTTTQC]&sub4;-MLC, wobei die Aminosäuren in der L-Form vorlagen, wenn nicht angegeben ist, daß sie in der D-Form vorlagen. Nach gründlichem Waschen wurden die Zellen erneut mit Medium versetzt und vier Tage nach der Infektion auf die Produktion von HIV-1-p24gag und auf die Synzytienbildung untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt, wobei die MBPCs gegen die Menge von p24 (ng/ml) aufgetragen sind. Wie außerdem in Fig. 3 angegeben, stimmte die relative Zahl der Synzytien pro Vertiefung (+++, keine Hemmung; ++, 50% Hemmung; ±, > 95% Hemmung) mit der Konzentration von p24gag überein.
Die in Fig. 4A dargestellten Makrophagen sind unbehandelte Kontrollen und zeigen, daß in infizierten Kulturen zahlreiche Synzytien vorliegen. Die Makrophagen, wie sie in Fig. 4B mit 100x dargestellt sind, die mit [GPGRAF]&sub8;-MLC vorbehandelt wurden, zeigten sehr wenige Riesenzellen. [RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC und [GPGRAF]&sub8;-MLC waren fähig, die Infektion zu hemmen, dies wurde festgestellt durch i) die in Gegenwart von MBPCs auftretende starke Abnahme von sichtbaren cytopathischen Effekten in Makrophagenkulturen, die mit 10 000 TCID&sub5;&sub0; von HIV-1 (89,6) in Kontakt gebracht wurden, und ii) die Messung der Konzentration von HIV-1-p24gag und der RT-Aktivität von in den Kulturüberständen. Die Kontroll-MBPCs hatten keinen signifikanten Einfluß auf die Infektionsrate von Makrophagen durch HIV-1(89.6). Interessanterweise waren [GPGRAF]&sub8;-MLCD (d. h. [GPGRAF]&sub8;-MLC mit D-Aminosäureresten) und 4-[GPG(R)DAF]&sub8;-MLC signifikant weniger aktiv auf die Makrophageninfektion als [GPGRAF]&sub8;-MLC.

B. GalCer-Rezeptor

Die MBPCs der vorliegenden Erfindung, insbesondere MBPC.3 und MBPC.12 und ihre Derivate, binden auch an den zweiten Rezeptor, den Galactosylceramid-Rezeptor (vgl. Harouse et al., Science 253 (1991), 320-323) und blockieren vollständig die Infektiosität von HIV bei menschlichen Colonzellen. Die entsprechenden monomeren Peptide sind an diesem Rezeptor inaktiv.
Um eine vollständige Blockierung des GalCer-Infektionswegs in intestinalen Zellen unter Verwendung des GPGRAF-Peptids im MBPC zu erhalten, muß der Polymerisationsgrad des MBPC mindestens 8 sein. Dies legt nahe, daß die Anforderung bezüglich der Konformation des V3-Loops für die GalCer-Erkennung stringenter ist als für die Bindung an die CDR3-Domäne von CD4. CDR3 ist eine saure Region (die einen Glutaminsäurerest in Position 87 umfaßt, der, wie berichtet wurde, für den Fusionsprozess essentiell ist), die möglicherweise mit basischen Aminosäuren des V3-Loops durch elektrostatische Wechselwirkungen interagiert. Im Gegensatz dazu ist die Galactose-Kopfgruppe von GalCer, die be kanntermaßen an der gp120-Bindung beteiligt ist, neutral polar und benötigt für eine optimale Wechselwirkung möglicherweise eine andere räumliche Anordnung von Atomen in der V3-Struktur. Somit ist es erstaunlich, daß eine Therapie zur Blockierung des CD4-Wegs der HIV-Infektion auch über den GalCer-Rezeptor funktionieren könnte.
Die Wirkung der MBPCs auf diesen anderen Infektionsweg wurde folgendermaßen untersucht: HT-29-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen) wurden mit MBPCs (5 · 10&supmin;&sup6; M) 45 Minuten inkubiert und anschließend mit 100 TCID&sub5;&sub0; von HIV-1(LAI), HIV- 1(NDK) oder HIV-2(ROD) eine Stunde bei 37ºC in Kontakt gebracht. Die resultierende Probe wurde durch drei aufeinanderfolgende Trypsinierungen inaktiviert, und die Infektion wurde festgestellt durch: i) die direkte Messung von HIV-1-p24gag (für HIV-1-Isolate) und der RT-Aktivität (für HIV-1- und HIV-2-Isolate) in den Kulturüberständen; und ii) die gemeinsame Kultivierung mit menschlichen PBLs. Die Zellen wurden folgendermaßen mit den MBPCs behandelt: 1- keines; 2- [GPGRAF]&sub8;-MLC; 3-[GPGRAF]&sub8;-MLCD; 4-[GPG(R)DAF]&sub8;-MLC; 5-[GPGRAF]&sub1;&sub6;- MLC; 6-[RKSIHIGPGRAFYT]&sub4;-MLC; und 7-[PPPYVEPTTTQC]&sub4;-MLC, wobei alle Aminosäuren in der L-Form vorlagen, wenn es nicht anders angegeben ist. Die in Fig. 5A dargestellten Ergebnisse; die einer Infektion mit HIV-1 (NDK) entsprechen, wurden aus drei getrennten Experimenten erhalten, wobei das verwendete MBPC jeweils als Nummer auf der X-Achse angegeben ist. Die Konzentration von p24gag (pg/ml) wurde während des Experiments der gemeinsamen Kultivierung mit PBLs gemessen (+++, > 10 ng/ml zehn Tage nach der Infektion; ++, > 1 ng/ml 13 Tage nach der Infektion; + > 1 ng/ml 16 Tage nach der Infektion; -, kein nachweisbares p24gag einen Monat nach der Infektion). Ähnliche Ergebnisse wurden mit HIV-1(LAI) und HIV-2(ROD) erhalten.
In einem anderen Experiment mit den gleichen MBPCs wurde die Wirkung von MBPCs auf die Bindung von gp120 an GalCer untersucht, wobei ein Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie (HPDC)-Bindungstest eingesetzt wurde. Die MBPCs (10&supmin;&sup4; M) wurden mit GalCer eine Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert. Nach gründlichem Waschen wurden die HPDC-Platten mit rekombinatem HIV-1-gp120 (2,5 ug/ml) inkubiert, worauf Kaninchen-Anti-gp120 und ¹²&sup5;I-Ziegen-Anti-Kaninchen-IpG folgten. Die Platten wurden in PBS gewaschen und acht Stunden mit einem Amersham Hyperfilm MP in Kontakt gebracht. Wie in Fig. 5B dargestellt, schützte die Behandlung der HT-29-Zellen mit aktiven MBPCs die Zellen vor einer Infektion durch HIV-1 (NDK-Isolat). Diese antivirale Wirkung entsprach seiner Fähigkeit, die Bindung von gp120 an GalCer zu blockieren.
Weder monomere V3-Peptide noch Kontroll-MBPCs zeigten eine antivirale Wirkung, und sie hemmten nicht die Bindung von gp120 an GalCer.
Die Erfindung stellt deshalb außerdem ein MBPC bereit, das eine Kernmatrix umfaßt, an die 2 bis 64 (vorzugsweise von 4 bis 32) Peptide gebunden sind, die jeweils von dem V3-Loop des Oberflächenhüllglykoproteins gp120 des HIV-1-Virus hergeleitet sind, wobei das MBPC fähig ist, die Infektiosität der HIV- Viren sowohl in CD4&spplus;/GalCer&supmin; als auch in CD4&supmin;/GalCer&spplus;-Zellen zu hemmen.

C. Antigenität, Toxizität und Immunogenität

Die MBPCs der vorliegenden Erfindung sind in vitro gegenüber menschlichen PBLs oder in vivo gegenüber Mäusen, denen die MBPCs wiederholt entweder intraperitoneal, intravenös oder subkutan in einer Konzentration von 10&supmin;³ M injiziert wurden, nicht toxisch. Mäuse, die wiederholte Dosen von 1 mg MBPCs intraperitoneal und intravenös enthielten, zeigten keine nachteiligen Effekte. Außerdem wiesen Affen (Macaca sylvana), denen einmal intravenös und dann subkutan täglich eine Dosis von 5 mg/kg verabreicht wurde, nach dreißig Tagen keinerlei Anzeichen von toxischen Wirkungen auf Ferner erzeugten Kaninchen und Mäuse, denen [GPGRAF]&sub8;-MLC injiziert wurde, keine signifikanten Titer von Anti-GPGRAF-Antikörpern, was mit dem Konzept übereinstimmt, daß MBPCs mit weniger als zehn Aminosäureresten in jedem Ast des Peptids in Konzentrationen von weniger als 10&supmin;³ M, den für die Verwendung geeigneten Konzentrationen, nicht immunogen sind. Außerdem behalten die PBLs in vitro die Fähigkeit, durch andere Antigene oder ein Mitogen aktiviert zu werden.

1. Antigenität

"Enyme linked immunosorbent assay" (ELISA) der MBPC-Immunogenität

MBPC.1, MBPC.2 und ein monomeres V3-Konsensus-Peptid wurden in einem ELISA auf ihre immunologische Reaktionsfähigkeit gegen HIV-1&spplus;-Seren oder HIV-1&supmin;-Seren getestet. Für diesen Test ist MBPC.2 (RKSIHIGPGRAFYT)&sub4;- (K)&sub2;-K-BA-OH, und MBPC.1 ist (GPGRAF)&sub8;-(K)&sub4;-(K)&sub2;-K-BA-OH. Die positive Reaktion der Seren wurde als erstes durch eine Western-Blot-Analyse bestätigt, wobei ein NEW LAV-BLOT-Kit (Diagnostic Pasteur) für den Nachweis von Anti- HIV-1-Antikörpern in Serum/Plasma eingesetzt wurde. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 500 ng Peptiden pro Vertiefung beschichtet. Nach Sättigung und Waschen wurden 50 ul HIV-1&spplus;-Serum (Verdünnung von 1/100) für zwei Stunden bei 37ºC zugegeben. Die Färbung erfolgte mit Peroxidase-gekoppeltem Schweine-Anti-Kaninchen-IpG. 30 HIV-1-positive Seren und drei HIV- 1-negative Seren wurden in einem ELISA-Test gegen ein V3-Peptid, das von der Nordamerikanischen/Europäischen Konsensus-Sequenz (V3-Cons) stammte, und V3-MBPCs vergleichend analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 dargestellt.
Von den 30 HIV-1-positiven Seren reagierten 26 stark mit V3-Cons und mit MBPC.2, eines reagierte schwach mit den beiden Peptiden, eines reagierte selektiv mit MBPC.2 und zwei Seren reagierten mit keinem der Peptide.
Interessanterweise reagierte MBPC.1 mit keinem der HIV-1-positiven Seren. Beim Vergleich mit MBPC.2 wurde gezeigt, daß MBPC.1 wirksamer eine HIV-1- und HIV-2-Infektion blockiert und weniger toxisch ist. Die Tatsache, daß MBPC.1 nicht von HIV-1-positiven Seren erkannt wird, legt nahe, daß ein solches MBPC die neutralisierende Aktivität von Anti-V3-Antkörpern möglicherweise nicht stört. Deshalb könnte eine synergistische Wirkung zur Neutralisierung der HIV-1- Infektion vorliegen. Tabelle 5

2. Toxizität

Ein MTT-Test, ein kolorimetrischer Test auf Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, wurde verwendet, um die Wirkung von MBPCs auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen. CEM- oder C8166-Zellen (5 · 10&sup4;) wurden kontinuierlich (15 Tage) in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von MBPCs in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem Endvolumen von 200 ul RPMI 1640-Medium, das mit 5% fetalem Kälberserum, 1% Glutamin, 1% Streptomycin-Penicillin angereichert war (erhältlich von Gibco of Irvine, Schottland), in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; gezüchtet. Alle drei bis vier Tage wurde mit 100 ul der Zellsuspension ein MTT-Test durchgeführt, und zu der Zellkultur das MBPC zugegeben und das Volumen auf 200 ul aufgefüllt. [GPGRAF]&sub8;-MLC war in diesem Test in Konzentrationen von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup4; M für die Zellen nicht toxisch. Andere Ergebnisse sind in der vorstehenden Tabelle 3 dargestellt. Wie zu sehen ist, ist das Tetradecapeptid-MLC, das die IGPGR- Sequenz umfaßt, toxisch und deshalb nicht für die hier besprochene therapeutische Verwendung geeignet.

3. Antigenität - Immunogenität-Studien mit MBPCs

Vier schwarze C57/BL6-Mäuse erhielten täglich 36 Tage lang Injektionen mit 250 ul MBPC.3 bei 4 mg/ml (1 mg). Die Injektionen erfolgten intraperitoneal. Die Blutproben wurden durch suborbitale Augenpunktion gewonnen. Die Blutproben wurden eine Stunde bei 37ºC und dann über Nacht bei 4ºC stehengelassen und die auf diese Weise erhaltenen Überstände (Serumproben) von den Niederschlägen abgetrennt. Die Seren wurden durch ELISA getestet, wobei nach spezifischen Anti-MBPC.3-Antikörpern gesucht wurde.
Außerdem wurden zwei "New Zealand"-Kaninchen mit [GPGRAF]&sub8;-MLC immunisiert: 400 ug von [GPGRAF]&sub8;-MLC in 1 ml PBS, pH 7,4, wurden mit einem gleichen Volumen von komplettem Freundschem Adjuvans gemischt und jedem Kaninchen am Tag 0 intradermal injiziert. Diese Prozedur wurde als subkutane Injektion mit inkomplettem Freundschem Adjuvans an den Tagen 30, 60, 90 und 120 wiederholt. Die Seren wurden durch ELISA getestet, wobei nach spezifischen Anti-MBPC.3-Antikörpern gesucht wurde. Die hier dargestellten Ergebnisse stammen von den letzten Serumproben (120 + 7 Tage).
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nung, Rotskild, Dänemark) wurden zwei Stunden bei 37ºC mit verschiedenen Konzentrationen von [GPGRAF]&sub8;-MLC (500 bis 25 ng [GPGRAF]&sub8;-MLC in 50 ul PBS), pH 7,4, pro Vertiefung beschichtet. Nach der Sättigung mit 400 ul Casein (5 g/100 ml) wurden verschiedene Serumverdünnungen für zwei Stunden bei 37ºC zugegeben. Die Kontrollen waren Seren von nicht-immunisierten Kaninchen und Mäusen. Nach Spülen (5 x) wurden 50 ul von 1 : 5000 Peroxidase-markiertem Schweine-Anti-Kaninchen-IgG oder Anti- Maus-IgG (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark) für eine Stunde bei 37ºC zuge fügt. Nach weiterem Spülen (5 x) wurden 100 ul ortho-Phenylendiamin für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 50 ul 4 N Schwefelsäure beendet und die optischen Dichte (OD)-Verhältnisse bei 492/620 nm bestimmt.
Die nachstehenden Tabellen 6 bis 10 zeigen die Ergebnisse, wobei in Tabelle 6 eine Zusammenfassung der Ergebnisse dargestellt ist, die mit den Kaninchen unter Verwendung der optischen Dichte-Verhältnisse (x 103) erhalten wurden. Mo bedeutet das GPGRAF-Monomer bei 10 ug/ml. Tabelle 6
- , opt. Dichte (OD) < 0,2; +, OD = 0,2 bis 0,4; ++, OD = 0,4 bis 0,8; +++ OD > 0,8 Tabelle 7 - Mikrotiterplatte Nr. 1
Legende: S10 = 10 ug MBPC.3/ml; S5 = 5 ug MBPC.3/ml; S1 = 1 ug MBPC.3/ml; S.5 = 0,5 ug MBPC.3/ml; Mo = GRGRAF-Monomer, 10 ug/ml; M 10-2 = [10&supmin;²] Maus; R 10-2 = [10&supmin;²] Kaninchen; M ctrl = [10&supmin; ²] nicht-immun. Maus; R ctrl = [10&supmin;¹] nicht-immun. Kaninchen Tabelle 8 - Mikrotiterplatte Nr. 2
Legende: S10 = 10 ug MBPC.3/ml; S5 = 5 ug MBPC.3/ml; S1 = 1 ug MBPC.3/ml; S.5 = 0,5 ug MBPC.3/ml; Mo = GRGRAF-Monomer, 10 ug/ml; M 10-2 = [10&supmin;²] Maus; R 10-2 = [10&supmin;²] Kaninchen; M ctrl = [10&supmin; ²] nicht-immun. Maus; R ctrl = [101] nicht-immun. Kaninchen Tabelle 9 - Mikrotiterplatte Nr. 3
Legende: S10 = 10 ug MBPC.3/ml; S5 = 5 ug MBPC.3/ml; S1 = 1 ug MBPC.3/ml; S.5 = 0,5 ug MBPC.3/ml; Mo = GRGRAF-Monomer, 10 ug/ml; M 10-2 = [10&supmin;²] Maus; R 10-2 = [10&supmin;²] Kaninchen; M ctrl = [10&supmin; ²] nicht-immun. Maus; R ctrl = [10&supmin;¹] nicht-immun. Kaninchen Tabelle 10 - Mikrotiterplatte Nr. 4
Legende: S10 = 10 ug MBPC.3/ml; S5 = 5 ug MBPC.3/ml; S1 = 1 ug MBPC.3/ml; S.5 = 0,5 ug MBPC.3/ml; Mo = GRGRAF-Monomer, 10 ug/ml; M 10-2 = [10&supmin;²] Maus; R 10-2 = [10&supmin;²] Kaninchen; M ctrl = [10&supmin; ²] nicht-immun. Maus; R ctrl = [10&supmin;¹] nicht-immun. Kaninchen; R ABU = [10&supmin;²] Kaninchen mit Peptid Abu (nicht-verwandte Aminosäure)
Aufgrund des hohen Wertes der Hintergrundaktivität, die in einigen der Ergebnissen festgestellt wurde, folgte ein weiteres Testen, um die Nicht- Reaktivität von MBPC.1-immunisierten Seren zu bestätigen.
Die Seren aus Kaninchen, die entweder mit MBPC.1 oder mit MBPC.2 immunisiert worden waren, wurden in einem ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, an MBPC.1, MBPC.2, Mono.1 (die monomere Form von MBPC.1) und an die Nordamerikanische/Europäische Konsensus-V3-Sequenz (V3-Cons oder Cs) zu binden.
Fig. 6A zeigt, daß Seren von Kaninchen, die mit MBPC.2 immunisiert worden waren, MBPC.2 und V3-Cons signifikant erkannten, während keine Reaktivität gegenüber MBPC.1 oder den entsprechenden monomeren Peptiden festgestellt wurde. Fig. 6B macht deutlich, daß Seren von Kaninchen, die mit MBPC.1 immunisiert worden waren, nicht mit MBPC.1 (mit Ausnahme einer schwachen Reaktivität des Serums von Kaninchen A), MBPC.2, V3-Cons oder Mono.1 reagierten. Genauso zeigten die als negative Kontrolle verwendeten Vor- Immun-Seren keine Reaktion gegenüber den beiden MBPCs, V3-Cons oder Mono.1.
In einer anderen Versuchsreihe wurden Seren von Kaninchen, die entweder mit MBPC.1 oder mit MBPC.2 immunisiert worden waren, (bei Verdünnungen von 1/100 und 1/1000) gegen verschiedene Konzentrationen von MBPC.1, MBPC.2 und V3-Cons getestet. Aus den Fig. 7A, 7B und 7C ist eindeutig ersichtlich, daß die Seren von Kaninchen, die mit MBPC.2 immunisiert worden waren, mit MBPC.2 und V3-Cons dosisabhängig reagierten. Keine Reaktivität gegenüber MBPC.1 wurde nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigten Seren von Kaninchen, die mit MBPC.1 immunisiert worden waren, keine Reaktion gegenüber MBPC.2, während sie mit MBPC.1 schwach reagierten (zu beachten ist die schwache Reaktivität des Serums von Kaninchen A gegenüber MBPC.1, wobei das Serum von Kaninchen B keine Reaktivität zeigte). Interessanterweise reagierten diese letzteren Seren nicht mit dem monomeren V3-Cons, einem linearen 34-Aminosäuren-Epitop, das die auf gp120 vorliegende Konsensus- Sequenz nachahmt.
Diese Ergebnisse machen deutlich, daß MBPC.1, ein kurzes V3-MBPC, in Kaninchen keine signifikante Antikörperantwort induzierte, während MBPC.2, das längste V3-Peptidkonstrukt, eine solche Antwort hervorrief Diese Beobachtungen stimmen mit den Ergebnissen der Immunreaktivität von MBPC.1 mit den Seren von HIV-1-infizierten Patienten überein.
In Mäusen, die wiederholt Injektionen mit 10&supmin;³ M erhalten hatten, konnten gelegentlich sehr schwache Antikörpertiter in Seren bei einer Verdünnung von 1 : 100 und im wesentlichen keine Antikörper bei niedrigeren Serumverdünnungen nachgewiesen werden. In Kaninchen waren Antikörper bei einem Tier in einer Serumverdünnung von 1 : 100 nachweisbar. Bei allen anderen Serumverdünnungen sind die Antikörpertiter mit den in den Kontrolltieren erhaltenen Titern vergleichbar. Eine solche schwache Antigenität macht deutlich, daß die MBPCs der vorliegenden Erfindung nicht das Potential besitzen, daß sie als ein Antigen eingesetzt werden können, das eine wirksame Antikörperantwort hervorruft, worin die Verwendung der bisher bekannten Peptidkonstrukte besteht. Tatsächlich liegen die geplanten therapeutischen Konzentrationen der MBPCs der vorliegenden Erfindung etwa bei 10&supmin;&sup6; M, wobei bei solchen Konzentrationen keine Antikörperantwort zu erwarten ist. Jedoch können die MBPCs aufgrund des Fehlens einer Antigenität mit bis zu 10&supmin;³ M verabreicht werden.

Claims

1. Mehrfach, verzweigtes Peptidkonstrukt, umfassend eine Kernmatrix, an - die 4 bis 16 Peptide gebunden sind, wobei jedes dieser Peptide die Aminosäuresequenz GPGR umfaßt, der 0 bis 4 Aminosäurereste vorausgehen und auf die 2 bis 4 Aminosäurereste folgen, aber im wesentlichen frei von der Aminosäuresequenz IGPGR oder IXXGPGR, wobei X ein Aminosäurerest ist, wobei das mehrfach verzweigte Peptidkonstrukt bei Serumkonzentrationen von 10&supmin;&sup4; molar nicht immunogen ist.

2. Peptidkonstrukt nach Anspruch 1, in dem jedes Peptid das gleiche ist.

3. Peptidkonstrukt nach Anspruch 1, in dem jedes Peptid GPGRAF ist.

4. Peptidkonstrukt nach Anspruch 3, in dem 8 oder 16 Peptide GPGRAF vorliegen.

5. Peptidkonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Kernmatrix aus Lysinresten besteht.

6. Peptidkonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich zwischen der Kernmatrix und den Peptiden Zwischenstücke befinden.

7. Peptidkonstrukt nach Anspruch 1, in dem die Peptide oder einige der Peptide eine oder mehrere D- Aminosäurereste umfassen.

8. Peptidkonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei jedes der Peptide vom V3-Loop des Oberflächenhüllglycoproteins gp120 des HIV-Virus abgeleitet ist.

9. Peptidkonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche, das die Infektiosität des HIV-Virus sowohl in CD4&spplus;/GalCer&supmin; als auch in CD4&supmin;/GalCer&spplus;-Zellen hemmen kann.

10. Medikament, umfassend ein mehrfach verzweigtes Peptidkonstrukt nach einem der vorangehenden Ansprüche im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Träger.