DE60221805T2

DE60221805T2 - Peptide mit affinität zu gp120, und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE60221805T2
Application number: DE60221805T
Authority: DE
Inventors: Claudio Vita; Loic Martin; Christian Roumestand; Francisco Veas
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2001-01-23
Filing date: 2002-01-21
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2022-01-22
Also published as: ES2291439T3; JP4307838B2; JP2004535366A; CN1304421C; IL156799A; DK1368372T3; WO2002059146A3; EP1368372A2; KR20040011454A; MXPA03006263A; US7374875B2; ZA200305576B; US20060121538A1; AU2002233424B2; DE60221805D1; FR2819809A1; CN1487951A; WO2002059146A2; ATE370160T1; EP1368372B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Familie von Peptiden; die eine hohe Affinität und Spezifität für das Virusprotein gp120 zeigen, auf Verfahren zum Herstellen dieser Peptide und auf die Verwendung dieser Peptide.
Das Virusprotein gp120 ist ein Glykoprotein der Hülle des Immunschwächevirus. Es ist am ersten Schritt des Replikatonszyklus des Virus, das heißt an dem Schritt der Erkennung des CD4-Proteins der Lymphozytenmembran durch die Virushülle und der Fusion der Membranen unter Internalisieren des Nukleokapsids besteht. Es ist vielmehr das äußerste Protein der Stelle zur Erkennung des CD4-Proteins durch die Virushülle.
Es gibt zahlreiche Immunschwächeviren, die ein dem Virusprotein gp120 ähnliches Hüllprotein umfassen. Darunter können das humane Immunschwächevirus (HIV), das simiane Immunschwächevirus (SIV), das ovine Immunschwächevirus (VISNA), das bovine Immunschwächevirus (BIV) und das feline Immunschwächevirus (FIV) angeführt werden.
Einige Peptide der vorliegenden Erfindung können an das Virusprotein gp120 der Virushülle binden und die Bindung des Virusproteins gp120 an den CD4-Rezeptor mit IC₅₀-Werten zwischen 0,1 und 400 nM in Abhängigkeit von ihrer Sequenz hemmen. Einige dieser Moleküle können eine T-Lymphozyteninfektion mit dem HIV-Virus mit zum Beispiel einer ED₅₀ (wirksame Dosis 50%) von 100 bis 900 nM hemmen. Außerdem schließt die Bindung dieser Moleküle an rekombinantes Virusprotein gp120 eine konformative Änderung daran ein, die neue Epitope mit derselben Wirksamkeit wie das lösliche CD4-Molekül aufdeckt.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in der Therapie und bei Vakzinen Anwendung finden. Sie ermöglichen auch das Design neuer Moleküle, die zum Beispiel beim Nachweis, aber auch bei der Reinigung des HIV-Hüllproteins und beim Auffinden neuer Anti-AIDS-Wirkstoffe von Nutzen sind.
Stand der Technik
Zahlreiche Untersuchungen wurden zum Auffinden wirksamer Behandlungen einer Infektion mit einem Immunschwächevirus und insbesondere dem humanen Immunschwächevirus (HIV) und Mittel zu deren Prophylaxe durchgeführt. Die Hauptschwierigkeiten be treffen die Entwicklung wirksamer Vakzine und immuntherapeutischer Behandlungen. Dies ist insbesondere auf die Veränderbarkeit des Virus, auf die Schwierigkeit beim Verstehen des Mechanismus seines Eindringens in Zielzellen und der zum Schutz gegen eine Infektion durch das Virus erforderlichen Immunantwort zurückzuführen.
In der folgenden Beschreibung beziehen sich die Zitate in eckigen Klammern auf die Dokumente in der angefügten Zitatenliste.
Wie durch die Analyse der dreidimensionalen Struktur des CD4-gp120-Komplexes [1] (siehe angefügte Zitate) gezeigt wurde, schließen die wesentlichen Strukturelemente von CD4 zu seinem Binden an das Virusglykoprotein gp120 die Aminosäuren Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Phe43 und Thr45, die in der Region 36-47 enthalten sind, und Arginin-59 von CD4 ein. Die Region 36-47 von CD4 wurde mit der CDR2-Region von Immunglobulinen verglichen und zeigt eine geordnete Haarnadelstruktur. Diese Struktur besteht aus einem β-Strang (C'), der der Sequenz 36-40 entspricht, gefolgt von einer Wendung, die der Sequenz 40-43 entspricht, die einem zweiten, der Sequenz 43-47 entsprechenden β-Strang (C'') das Bilden einer antiparallelen β-Struktur mit der ersten gestattet. Diese Struktur wird durch Wasserstoffbindungen zwischen dem Amidstickstoff der Reste Gly38, Gln40, Phe43, Thr45 und Gly47 des ersten β-Strangs beziehungsweise dem Carbonylsauerstoff der Reste Thr45, Phe43, Gln40, Gly38 und Ile36 des zweiten β-Stranges stabilisiert. Diese Haarnadelstruktur weist bei der Wechselwirkung von CD4 mit dem Virusprotein gp120 eine zentrale Rolle auf und übt eine Doppelfunktion aus. Sie erlaubt erstens den Aminosäuren Gly38, Gln40, Gly41, Ser42, Phe43 und Thr45 das Bilden einer zu der Oberfläche der Wechselwirkung des Virusproteins gp120 komplementären Oberfläche und ermöglicht insbesondere das Einfügen der Seitenkette von Phe43 in den Eingang eines hydrophoben Hohlraums in der Moleküloberfläche des Virusproteins gp120; sie erlaubt zweitens eine Wechselwirkung des β-Blattyps zwischen den Polypeptidrückgraten des β-Strangs C'' von CD4 und dem β15-Strang (Reste 365-368) des Virusproteins gp120. Das Arginin 59 (Arg59) weist ebenfalls eine wesentliche Rolle bei der CD4-gp120-Wechselwirkung auf, da die Guanidiumgruppe seiner Seitenkette eine doppelte Wasserstoffbrücke mit der Seitenkette des Rests Asp368 des Virusproteins gp120 bildet und dadurch die Stabilisierung der Wechselwirkung des β-Strukturtyps zwischen dem C''-Strang von CD4 und dem β15-Strang des Virusproteins gp120 erlaubt. Versuche zur ortsgerichteten Mutagenese haben gezeigt, daß alle diese Reste von CD4 eine wesentliche Rolle bei der Wechselwirkung mit dem Virusprotein gp120 spielen [2], [3].
Die Reproduktion dieser geordneten Haarnadelstruktur und der Konformation der Seitenketten ihrer Reste ist bei einem Molekül wesentlich, das an das Virusprotein gp120 an der Stelle der CD4-Wechselwirkung binden muß. Die Tatsache, daß einfache Peptidkonstrukte wie etwa ein der Sequenz 37-53 entsprechendes lineares Peptid und ein der Sequenz 37-46 von CD4 entsprechendes cyclisches Peptid keine meßbare Affinität zum Virusprotein gp120 besitzt, ist ein Beweis dafür [4].
Die CD4-Zellinfektion mit HIV wird durch eine hohe Affinitätswechselwirkung zwischen der Virushülle und CD4 vermittelt. Mutagenese- und Konkurrenzversuche mit Antikörpern ermöglichten das Lokalisieren der Kontaktoberfläche mit dem gp120-Protein der Virushülle in der Domäne D1 von CD4. Die dreidimensionale Struktur einer rekombinanten, funktionsfähigen Form des gp120-Glykoproteins, bei dem aber die Schleifen V1-V2-V3 und die N- und C-terminalen Regionen deletiert wurden, in einem Komplex mit den Domänen D1D2 von CD4 und mit dem Fab-Fragment eines monoklonalen Antikörpers wurde kürzlich durch Kristallographie [1] aufgeklärt. In dieser Struktur wechselwirkt CD4 mit einer großen Vertiefung an der Moleküloberfläche (800 Å²) des Virusproteins gp120 unter Einnehmen einer großen Moleküloberfläche (742 Å²), die um die Region zentriert ist, die mit der CDR2-Region von Immunglobulinen verglichen wurde. Ein enger und tiefer Hohlraum öffnet sich im Zentrum der Molekülvertiefung des Virusproteins gp120, der „Phe43-Hohlraum", in dem die Seitenkette von Phe43 auf der Spitze der CDR2-Region von CD4 den Eingang besetzt. Die Aufklärung dieser Struktur bestätigt die vorangehenden Daten zur Mutagenese, was zeigt, daß der Rest Phe43 und die gesamte CDR2-Schleife funktionell sehr bedeutend sind und die letzte als ein mögliches Ziel zum Hemmen der Bindung von HIV-1-Virionen an Zellen nahelegt. Die gp120-CD4-Wechselwirkung erlaubt dem Virus das Binden an die Membran der Zielzellen und stellt die erste Protein-Protein-Wechselwirkung im Infektionsmechanismus dar. Zu einem wirkungsvollen Eindringen von HIV in Zellen sind jedoch andere Corezeptoren erforderlich. Diese sind CXCR-4 [5], [6], das am Eindringen lymphotropher Virusstämme (X4) beteiligt ist, und CCR-5 [7], [8], das am Eindringen M-tropher Stämme (R5) und der meisten primären Isolate beteiligt ist. Mehrere Beweisstücke zeigen, daß das Binden des Virusproteins gp120 an CD4 konformative Änderungen bei dem Hüllglykoprotein hervorruft, das durch spezielle, CD4i genannte Antikörper nachweisbare Stellen freilegt und die Affinität der Hülle zu den Chemokinrezeptoren [9], [10], den Corezeptoren für das Eindringen erhöht. Nach dem Binden von CD4 und des Corezeptors durch das Virusprotein gp120 führen andere konformative Änderungen zu einer strukturellen Umordnung von gp41, was zum Freisetzen seines fusogenen Peptids, dann zur Fusion der Virus- und Zellmembranen und schließlich zum Eindringen der Viruslast in die Zelle führt.
Die kristallographische Struktur des mit CD4 komplexierten Virusproteins gp120 ermöglichte das Aufklären eines der durch HIV verwendeten Mechanismen, um sich der Immunantwort zu entziehen. Es war bereits bekannt, daß das gp120-Hüllprotein hypervariable und stark glykosylierte Regionen aufweist. Die kristallographische Struktur beweist in der Tat, daß die hypervariablen Regionen und die stark glykosylierten Regionen die freiliegende Moleküloberfläche des Virusprotein gp120 bilden, die auch der Virionen zugänglichen Oberfläche entspricht. Nur einige Regionen der Moleküloberfläche des Virusproteins gp120 bleiben erhalten und können das Ziel für Antikörper sein. Diese Regionen sind normalerweise nicht zugänglich und werden wahrscheinlich durch die hypervariablen Schleifen (V1-V2-V3) geschützt, die in dem kristallinen Protein fehlen und daher unsichtbar sind. Eine dieser Regionen ist eine der Stelle der Wechselwirkung für Chemokinrezeptoren nahe und den CD4i-Antikörpern nach dem Binden der Hülle an CD4 zugängliche Oberfläche. Die CD4-Bindungsstelle ist eine weitere freiliegende und konservierte Oberfläche: diese Oberfläche befindet sich jedoch in einem Hohlraum des Virusproteins gp120 und ist daher Antikörpern nicht zugänglich, kann aber das CD4 aufnehmen, das anders als Antikörper, die zur Molekülerkennung zwei Domänen verwenden, eine einzige Immunglobulindomäne aufweist.
Die heute zum Erkennen des Hüllproteins (gp120) verfügbaren Werkzeuge sind beschränkt. Diese sind die CD4i-Antikörper [11], [12], [13], die ein breites Spektrum primärer Hüllen binden können. Ihre Affinität zu der Virushülle ist jedoch schwach und erhöht sich nur in Gegenwart von CD4, was ihre Verwendung nicht leicht und bequem macht. Von anderen Antikörpern wie etwa IgG1b12, F105 oder 15e wird nicht angenommen, daß sie alle primären Isolate erkennen können. Ein mit Biotin markiertes CD4-Molekül kann ebenfalls eine Lösung darstellen. Dieses Molekül ist im Handel erhältlich (Intracel). Unglücklicherweise ist es teuer und seine funktionellen Eigenschaften des Bindens des Virusproteins gp120 wurden durch die Biotinylierungsreaktion stark verringert (100fach), was seine Verwendung stark einschränkt.
Die Hemmung der Wechselwirkung des Virusproteins gp120 mit dem Hauptrezeptor für das Eindringen, CD4, durch ein rekombinantes, lösliches CD4 und/oder durch CD4-Domänen enthaltende Immunglobulinchimären war einer der ersten zum Hemmen einer Infektion mit HIV-1 vorgeschlagenen und experimentell untersuchten therapeutischen Wege. Diese Moleküle sind in vitro bei der Hemmung einer Virusinfektion nur im Fall an das Labor angepaßter Stämme wirksam, sind aber im Fall zahlreicher primärer Isolate unwirksam. Der rasche Abbau in vivo dieser von CD4 abgeleiteten Konstrukte und ihre niedrigere Affinität zur Virushülle primärer Isolate ist als Hauptursache ihrer Wirkungslosigkeit vorgeschlagen worden. Untersuchungen haben jedoch gezeigt, daß sich die Affinität rekombinanter monomerer gp120 aus bestimmten primären Isolaten zu CD4 nicht signifikant von der von aus Laborstämmen stammendem gp120 unterscheidet. Die oligomere Natur des Virusproteins gp120 an der Virusoberfläche, die Dichte und die Struktur von CD4 an der Oberfläche der permissiven Zellen und möglicherweise die Anwesenheit anderer molekularer Wechselwirkungen, die noch nicht eindeutig aufgeklärt sind, oder anderer zusätzlicher Moleküle zum Eindringen können eine wichtige Rolle bei dem Mechanismus des Eindringens spielen und andere Ursachen der Unwirksamkeit der löslichen CD4-Proteine als Antagonisten des Eindringens darstellen. Die Entwicklung antiviraler Mittel, die auf das Virusprotein gp120 gerichtet sind, stellt aufgrund der großen genetischen Veränderbarkeit des Hüllproteins, was die Unwirksamkeit vieler Inhibitoren des Virusproteins gp120 erklären kann, eine große Herausforderung dar. Die Tatsache, daß die Reste, die zum Bilden des Kerns der Bindungsstelle des Virusproteins gp120 für CD4 aus sehr konservierten Resten besteht, legt jedoch nahe, daß Inhibitoren des Virusproteins gp120 gegen ein breites Spektrum von HIV-1-Isolaten wirksam sein können.
Von CD4 abgeleitete Peptidkonstrukte sind als Hemmer der Virusinfektion vorgeschlagen worden: sie sind ein die Struktur nachahmendes Peptid der CDR2-Schleife von CD4, in das eine Phenylgruppe eingebaut ist, die das Phe43 [14] nachahmt, und ein der CDR-Schleife von CD4 entsprechendes cyclisches Peptid, in das weitere aromatische Reste eingebaut sind [15]. Diese Konstrukte zeigen jedoch eine niedrige antivirale Aktivität, die auf ein Laborisolat beschränkt ist, und selbst obwohl sie anfänglich als Strukturmimetika von CD4 geplant waren, sind sie im Eindringschritt nicht aktiv [16].
Derzeit wird eine gewisse Anzahl Inhibitoren der gp120-CD4-Wechselwirkung vorgeschlagen und weist eine klinische Anwendung auf. Diese sind zum Beispiel ein großes rekombinantes Protein, das durch genetische Fusion der DID2-Domänen von CD4 mit den konstanten Domänen eines IgG2-Immunglobulins [17] gebildet wurde. Dieses Konstrukt PRO542 ist in der klinischen Phase I/II. Dieses große rekombinante Protein scheint durch den menschlichen Körper gut toleriert zu werden, seine Wirksamkeit hängt jedoch von einer hohen im Kreislauf befindlichen Dosis ab, die schwer zu erreichen ist. Kleinere Moleküle sind als Inhibitoren der CD4-gp120-Wechselwirkung vorgeschlagen worden und befinden sich in der klinischen Testphase. Diese sind: ein auf kombinatorische Weise identifizierter Bisazofarbstoff FP21399 [18], das Phosphorothioatoligonukleotid Zintevir (AR177) [19], ein Polymer auf Naphthalinsulfonatgrundlage, PRO2000 [20], und ein Stärkederivat, Dextrin-2-sulfat (D2S) [21], das chemische HIV-1-Isolate in Zellkulturen hemmt, aber hohe Konzentrationen erfordert. Unter diesen Eindringinhibitoren befindet sich auch SPC3 [22], ein mehrfach verzweigtes, synthetisches Peptidkonstrukt, das anfänglich als Inhibitor der CD4-gp120-Wechselwirkung vorgeschlagen wurde, sich anschließend als bei dem auf die Virionenbindung an die Zellen folgenden Schritt als aktiv erwies. Andere kleine Moleküle wurden als Eindringinhibitoren vorgeschlagen: das Bicyclam AMD3100 [23], NSC651016 [24], das Peptid T22 [25] und seine neuere Version T134 oder T140 [26] und TAK779 [27]. Diese Moleküle sind Inhibitoren des Eindringens des Virus und sind auf den Corezeptoren für das Eindringen CXCR4 und CCR5 aktiv, weisen aber keine Aktivität bei der CD4-gp120-Wechselwirkung auf. Von der Sequenz der C-terminalen Region des gp41-Glykoproteins abgeleitete Peptide, das Peptid T20 (oder DP178) [28] und seine neuere, verbesserte Version DT1249 [29] und andere Inhibitoren der Infektion, die auf eine Übergangsphase des Eindringens nach dem Binden der Virushülle an CD4 und vor der Viruszellmembranfusion gerichtet sind: diese Peptide sind bei der gp120-CD4-Wechselwirkung inaktiv. Die meisten dieser Produkte befinden sich derzeit in der klinischen Testphase I/II, aber ihre therapeutische Wirksamkeit muß noch bestätigt werden.
Das derzeit klinisch angewendete therapeutische Schema gegen AIDS, die Tritherapie, umfaßt eine Kombination dreier Inhibitoren, die auf zwei Virusenzyme, die reverse Transkriptase und die Protease gerichtet sind. Obschon die Tritherapie beim Verringem der Viruslast vieler Erkrankter erfolgreich war, kann sie selbst in den günstigsten Fällen, die Krankheit nicht beseitigen, da noch immer schlafende Infektionsbestände fortbestehen [30]. Der teilweise Erfolg der Tritherapie einerseits und die Unmöglichkeit des Aufhaitens der AIDS-Infektion mit den derzeitigen Therapieschemata andererseits, hat den Bedarf nach neuen Wirkstoffen erhöht, die bei anderen Virenzielen aktiv sein können und das Repertoire und die Wirksamkeit der derzeitigen klinischen Wirkstoffe erhöhen können.
Versuche im Labor von J. H. Nunberg, Montana Biotechnology Center, The University of Montana, Missoula, USA, haben gezeigt, daß das chemische Überbrücken bei dem Schritt vor der Virus-Zellfusion vorhandener Proteinformen neue Immunogene darstellt, die die Bildung das Virus neutralisierender Antikörper auslösen können [31]. Der Kom plex der Virushülle mit den Eindringrezeptoren vor der Fusion stellt daher eine Struktur von derzeit großem Interesse dar, da diese Struktur die wichtigste Komponente einer Proteinbildung bei der Herstellung eines Vakzins gegen AIDS darstellen könnte. Versuche im Labor von A. DeVico, Institute of Human Virology, University of Maryland, Baltimore, USA, zeigten, daß der durch chemisches Verbrücken oder als ein rekombinantes Fusionsprotein stabilisierte gp120-CD4-Komplex eine makromolekulare Form darstellt, die verborgene antigene Stellen des Virusproteins gp120 freilegt und die neutralisierende Antikörper induzieren kann [32], [33]. Das Erhalten dieses antigenen Komplexes durch chemisches Verbrücken ist nicht zufriedenstellend, dar er nicht homogen und schwierig zu reproduzieren ist. Sein Erhalten als rekombinantes Protein führt nicht zu einer strukturell stabilen und wirksamen Form. Insbesondere die Anwesenheit von CD4 in diesen Präparaten kann jedoch die Gefahr des Auslösens einer Antiimmunantwort in einem Organismus darstellen, der bereits immunsupprimiert ist.
Weiterhin ist die Herstellung der Virushülle in ihrer rekombinanten monomeren Form (gp120) oder in der nativeren trimeren Form (gp140 oder Analoga) von sehr großem Interesse bei der Suche nach und der Herstellung rekombinanter Formen in großem Maßstab, die zur Impfung verwendet werden können. Die Reinigung dieser rekombinanten Formen ist nicht einfach und umfaßt die Verwendung mit Liganden, insbesondere Lectinen funktionalisierter chromatographischer Träger, die auf das Hüllprotein nicht sehr spezifisch sind. Die Verwendung eines das rekombinante CD4 kovalent gebunden enthaltenden chromatographischen Trägers würde einen Schritt einführen, der zum Reinigen des Virusproteins gp120 spezifischer und wirksamer wäre, aber ein derartiger Träger wäre sehr teuer und dieses Protein wäre nicht unter allen Verwendungsbedingungen ausreichend stabil.
Das Dokument MARTIN et al., „Engineering Novel Bioactive Mini-Proteins an Natural Scaffolds", TETRAHEDRON, Bd. 56, 24. November 2000, Seite 9451-9460, beschreibt CD4-Peptide, aber diese umfassen keine Thiopropionsäure (TPA) am C-terminalen Ende wie die Peptide der vorliegenden Erfindung. Sie zeigen viel höhere Hemmkonzentrationen (IC_50%) als die der vorliegenden Erfindung.
Das Dokument US-A-4 721 704 (CHANG JAW-KANG) beschreibt atriale Proteine, die eine natriuretische, diuretische und blutdrucksenkende Aktivität aufweisen. Diese Peptide weisen 21 oder 22 Aminosäuren auf und sind von der Sequenz
worin Mpr ein β-Mercaptopropansäurederivat ist, das ein Cys ersetzt (wobei R₁ und R₂ Gly oder DAla sind und R₃ OH, NH₂, Tyr-OH oder Tyr-NH₂ ist). Außer der Tatsache, daß die beschriebenen Peptide in keinem Bezug zu denen der vorliegenden Erfindung stehen, beschreibt dieses Dokument keine mit der β-Mercaptopropansäure verbundene biologische Aktivität.
Das Dokument US-A-4 684 622 (HUFFMAN WILLIAM F et al.) beschreibt Peptide, die Vasopressinderivate sind und die Sequenz
aufweisen.
Eine Mercaptopropionsäure kann in Position 1 vorhanden sein. Außer der Tatsache, daß die beschriebenen Peptide in keinem Bezug zu denen der vorliegenden Erfindung stehen, beschreibt dieses Dokument keine mit der Mercaptopropionsäure verbundene biologische Aktivität.
Die Dokumente H. OZAKI et al., „Molecular Structure of the Toxic Domain of Heat-Stable Enterotoxin Produced by a Pathogenic strain of Escherichia coli", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Bd. 266, 25. März 1991, Seite 5934-5941, und EP-0 989 136 beschreiben keine CD4-Peptide. Sie beschreiben ein durch E. coli produziertes Enterotoxin beziehungsweise ein cyclisches Peptid mit einer Wirkung auf die Wiederherstellung von Mutanten des Proteins P53. Nichts in diesen Dokumenten läßt einen annehmen, daß TPA in Position 1 die biologische Aktivität der beschriebenen Peptide verändern kann.
Erläuterung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Familie von Peptiden bereit, die CD4 nachahmen und die vorstehend angeführten Nachteile des Standes der Technik überwinden. Insbesondere stellt sie ein stabiles Peptid bereit, das eine sehr hohe Affinität zur Hülle des AIDS-Virus, insbesondere zu dem gp120-Protein aufweist.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Sequenz (I) umfaßt:
worin TPA Thiopropionsäure darstellt, Xaa^a, Xaa^b, Xaa^c, Xaa^d, Xaa^e, Xaa^f, Xaa^g, Xaa^h und Xaaⁱ natürliche oder nicht natürliche, gleiche oder verschiedene Aminosäure sind, Xaa^j β-Naphthylamin oder Phenylalanin oder Diphenylalanin darstellt und Xaa^k Gly oder Val oder Ile darstellt.
Der Rest (D)Asp stellt das optische D-Isomer von Asparaginsäure dar, Nal stellt β-Naphthylalanin dar und Bip stellt Biphenylalanin dar.
Die Erfinder zeigten, daß das durch Sequenz (I) definierte Peptid der vorliegenden Erfindung, das eine Thiopropionsäure in Position 1 der Sequenz, einen Phe-, Nal- oder Bip-Rest in Position 23 der Sequenz (Xaa^j) und einen Gly-, Val- oder Ile-Rest in Position 27 der Sequenz (Xaa^k) aufweist, eine hohe Affinität und große Bindungsspezifität für das gp120-Protein der Virushülle des Immunschwächevirus zeigt.
Dieses Peptid umfaßt nur 27 oder 28 Reste und weist eine Haarnadelstruktur auf, die aus zwei antiparallelen β-Strängen besteht, die durch eine β-Wendung von vier Resten verknüpft sind. Da sich die beiden antiparallelen Stränge in einer Entfernung von einander befinden, die intramolekulare Wasserstoffbrückenwechselwirkungen ergeben kann, stabilisieren sie die Struktur. Insbesondere ist der Abstand zwischen dem Amidstickstoff- und Carbonylsauerstoffatom der Peptidbindung 2,5 bis 3,6 Å. Diese gut definierte und stabile Struktur reproduziert wesentliche Strukturelemente von CD4, die für sein Binden an das gp120-Glykoprotein wesentlich sind.
Die dreidimensionale Struktur des Peptids der vorliegenden Erfindung ist durch Kemmagnetresonanz (NMR) experimentell aufgeklärt worden. Diese Analyse zeigt, daß die dreidimensionale Ordnung dieses Peptids das Peptidrückgrat der Haarnadelstruktur von CD4 darstellt und die Region 37-46 dieses Peptids kann mit einer rms-Abweichung von nur 1,05 Å über die Region 36-37 von CD4 gelegt werden. Außerdem weisen die Seitenketten der Reste Ala oder Gln 20, Ser 22, Xaa^J 23 (Nal, Phe oder Bip) und Thr oder Ala 25 eine der der entsprechenden Reste von CD4, nämlich Gln 40, Ser 42, Phe 43 und Thr 45 entsprechende Orientierung auf. Insbesondere ragt die Seitenkette von Xaa^J 23 aus dem Haarnadelmotiv in einer der des Phe 43 von CD4 ähnlichen Konformation heraus, um sich auf diese Weise in den Eingang eines hydrophoben Hohlraums des Virusproteins gp120 einzufügen und auf diese Weise die Verknüpfung mit gp120 zu verstärken. Arg und Lys in Position 9 und 18 sind den Resten Arg59 und Lys35 des CD4-Proteins topologisch äquivalent.
TPA und das 5-Cys des Peptids bilden Disulfidbrücken, die ein Paaren des 1-3-, 2-4-und 3-6-Typs zeigen und die Haarnadelstruktur stabilisieren.
Das Motiv der Haarnadelstruktur weist eine für das Lösungsmittel und/oder ein größeres Molekül zugängliche Oberfläche wie etwa ein Protein auf, das seine Wechselwirkung mit dem Virushüllprotein fördern kann.
Die Seitenketten der Aminosäuren der dem Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche dieses Motivs sind räumlich nah und bilden eine durchgängige Moleküloberfläche, die die Struktur mehrerer Reste nachbildet, die für die CD4-gp120-Bindung wichtig sind.
Die strukturelle Plattform, die das Strukturmotiv der Haarnadel enthält, enthält ferner andere Strukturregionen, die weitere chemische Funktionen in einer räumlichen Lage annehmen können, die bezüglich des Strukturmotivs der Haarnadel gut definiert ist, und kann auf diese Weise ihre biologische Funktion des Bindens und/oder Bereitstellens von Markierungsgruppen verstärken. Zum Beispiel wurde eine Biotingruppe oder eine Fluoresceingruppe in die Seitenkette von Lysin 11 eingebaut, ohne irgendeinen Verlust an biologischer Aktivität des Derivats zu verursachen. Das Einarbeiten dieser Gruppen hat das Verwenden dieser Derivate bei den nachstehend beschriebenen Tests auf die Wechselwirkung mit dem Hüllprotein ermöglicht.
Gemäß der Erfindung kann Sequenz (I) auch einen mit dem Rest Xaa^k verknüpften Prolinrest umfassen. Ein an Position 28 angefügter Prolinrest stabilisiert das C-terminale Ende und macht den C-terminalen β-Strang des Haarnadel-Strukturmotivs weniger flexibel.
Gemäß der Erfindung kann in Sequenz (I) Xaaⁱ Gly sein.
Zum Beispiel kann das Peptid der vorliegenden Erfindung eine aus den Sequenzen ID Nr. 4, ID Nr. 5, ID Nr. 6, ID Nr. 7, ID Nr. 8, ID Nr. 9, ID Nr. 10, ID Nr. 11, ID Nr. 12, ID Nr. 13, ID Nr. 14, ID Nr. 15 und ID Nr. 16 der angefügten Sequenzliste ausgewählte Sequenz umfassen.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann durch chemische Festphasensynthese oder durch genetische Rekombination erhalten werden. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Herstellen des vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Proteins, wobei das Verfahren die chemische Festphasensynthese des Peptids umfaßt. Die chemische Synthese kann zum Beispiel mit einem Peptidsyntheseautomaten von Applied Biosystems, Typ mod. 433A, durchgeführt werden. Sie kann zum Beispiel durch die Fmoc-Chemie durchgeführt werden, bei der die Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe zum vorübergehenden Schutz der α-Aminofunktion der Aminosäuren verwendet wird.
Das Peptid der Erfindung kann auch mittels eines die folgenden Schritte umfassenden Verfahrens hergestellt werden:

a) Einbauen einer Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor, wobei die Nukleinsäuresequenz das Peptid der vorliegenden Erfindung kodiert,
b) Einführen des die Nukleinsäuresequenz umfassenden Expressionsvektors in eine Wirtszelle,
c) Kultivieren der die Nukleinsäure umfassenden Wirtszelle unter Kulturbedingungen, die die Synthese des Peptids erlauben,
d) Isolieren des synthetisierten Peptids und
e) Pfropfen von TPA an der C-terminalen Position.

Die technischen Elemente zum Durchführen dieses Verfahrens der Peptidsynthese sind dem Fachmann bekannt. Sie werden zum Beispiel in der Arbeit von Sombrook, Fritsch und Maniatis, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe, beschrieben. Das Pfropfen einer TPA an der N-terminalen Position des Peptids kann mittels eines auf ein Peptid anwendbaren herkömmlichen Verfahrens der organischen Chemie durchgeführt werden.
Die Erfinder haben eine Familie von Peptiden synthetisiert, die einen Teil der Struktur der Region von CD4 nachbilden, die der CDR2-Region von Immunglobulinen ähnelt und sich wie durch die Ergebnisse der Mutagenese und kristallographischen Analyse gezeigt unter den für das Binden von CD4 an das Virusprotein gp120 wesentlichen Regionen befindet. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können an die Region des gp120-Glykoproteins binden, die mit CD4, dem Hauptrezeptor für das Eindringen von HIV-1 in CD4-Zielzellen, wechselwirkt.
Sie bilden eine Familie von Inhibitoren, deren Affinität zu dem rekombinanten, monomeren Virusglykoprotein gp120 zwischen von 0,1 nM bis 400 nM reichenden IC₅₀-Werten schwankt. Sie stellen spezifische und starke Inhibitoren der CD4-gp120-Wechselwirkung dar, die auf der Struktur von CD4 beruhen. Das Binden mit dem rekombinanten Virusprotein gp120 erfolgt im Wettbewerb mit löslichem CD4 und ist für die Form mit der richtigen Struktur spezifisch.
Aufgrund der strukturellen und funktionellen Nachahmung von CD4 können diese Peptide auf den verschiedenen, nachstehend beschriebenen Gebieten verwendet werden.
Wie durch die ELISA-Tests gezeigt können die Peptide der vorliegenden Erfindung die HIV-1-Hülle in ihrer rekombinanten Form binden. Diese Peptide ermöglichen nach dem Markieren mit einer geeigneten fluoreszierenden oder radioaktiven Sonde das Nachweisen der Anwesenheit der HIV-1-Hülle in Lösung oder auf der Oberfläche einer Zelle und daher das Nachweisen der Anwesenheit einer infizierten Zelle und damit einer HIV-1-Infektion.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung hemmen die Wechselwirkung zwischen den rekombinanten CD4-gp120-Proteinen in vitro und sie können auf diesem Umweg auch das Eindringen des HIV-1_LAI-(primäres Isolat) und HIV-1_LEN-Virus (klinisches Isolat) in zirkulierende Lymphozyten aufhalten. Die wirksamsten Peptide der vorliegenden Erfindung können in der Tat eine Lymphozyteninfektion mit einer ED₅₀ zwischen 100 und 900 nM hemmen. Diese Moleküle stellen daher antivirale Mittel dar, die klinische Anwendung finden. Aufgrund ihrer Peptidnatur können sie durch Injektion oder Infusion oder äußerlich örtlich angewendet werden.
Die Fähigkeit der Peptide der vorliegenden Erfindung, das Binden des Virusproteins gp120 an CD4 zu hemmen, ist ein Beweis der Fähigkeit dieser Peptide, die Virusinfektion zu hemmen, da sie einen der ersten Schritte des Eindringens des Virus hemmen. Diese Inhibitoren des Eindringens sind daher Komponenten mit einer Antiviruswirkung. Die Peptide der vorliegenden Erfindung stellen daher Moleküle dar, die in der Anti-HIV-Therapie verwendet werden können.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können Änderungen bei der Konformation des rekombinanten Virusproteins gp120 und der Hülle auslösen, was das Erkennen durch CD4i genannte, spezifische monoklonale Antikörper wie etwa CG10, 17b und 48D ermöglicht. Diese Konformationsänderungen sind daher offensichtlich denen ähnlich, die durch das Binden von CD4 ausgelöst werden. Das Binden der Peptide der Erfindung an das rekombinante Virusprotein gp120 und an die Virushülle deckt daher Hüllepitope auf, die normalerweise nicht ohne CD4 zugänglich sind. Diese Epitope stellen neue antigene Stellen dar, die möglicherweise für das Entwickeln HIV-1-neutralisierender Antikörper sehr wichtig sind. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können daher auch in einer Vakzinzubereitung, insbesondere in einer Formulierung, die deren Komplex mit einem Protein der Virushülle umfaßt, verwendet werden.
Einige Peptide der vorliegenden Erfindung zeigen eine niedrigere Affinität für das rekombinante Virusprotein gp120 als andere. Diese Peptide sind auch bei der Reinigung funktioneller Formen der Virushülle von sehr großem praktischem Nutzen. Speziell das Binden des Virusproteins an diese Peptide ist leichter umkehrbar. Um dies zu zeigen, banden die Erfinder eines dieser Peptide unter Verwenden eines an die Seite gegenüber der aktiven Oberfläche des Moleküls gebundenen flexiblen Arms kovalent an einen bei der Flüssigkeitschromatographie verwendeten hydrophilen polymeren Träger (Sepharose 4B). Dieses so gebundene Molekül kann noch immer mit dem rekombinanten Virusprotein gp120 Wechselwirken und kann dieses Virusprotein auf der polymeren Matrix festhalten. Es kann anschließend durch Ansäuern des Mediums abgelöst werden. Ein derart funktionalisierter Träger ermöglicht daher das Reinigen des rekombinanten Virusproteins gp120 und gegebenenfalls anderer Formen der Virushülle und sogar des gesamten Virus in Zubereitungen im großen Maßstab.
Außerdem können die Peptide der vorliegenden Erfindung zum Beispiel mit Fluorescein und Biotin markiert oder radiomarkiert werden, ohne daß sich die Fähigkeit zum Binden des Virushüllproteins gp120 ändert. Diese markierten Peptide können als Tracer bei Versuchen verwendet werden, die den Wettbewerb um das Binden an gp120 zum Beispiel zum Durchführen einer Moleküldurchmusterung umfassen. Die Verfahren, die angewendet werden können, sind die, die dem Fachmann in der Literatur zugänglich sind, die sich auf Untersuchungen molekularer Wechselwirkungen bezieht (siehe zum Beispiel [37, 38, 39 und 40]). Bei einem Durchmusterungsverfahren kann jedes Molekül, das die Wechselwirkung zwischen einem Peptid der vorliegenden Erfindung und einem Virusprotein gp120 hemmen kann, einen Inhibitor der CD4-gp120-Wechselwirkung und daher einen Inhibitor der Virusinfektion darstellen. Es ist daher möglich, vermittels der Peptide der vorliegenden Erfindung auf ein Molekül, das mit dem gp120-Protein oder einem zu gp120 analogen Protein Wechselwirken kann, insbesondere Moleküle mit Antivirusaktivität oder Moleküle, die zum Herstellen eines Arzneimittels von Nutzen sind, zu durchmustern.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Peptids zum Herstellen eines Arzneimittels.
Sie bezieht sich auch auf die Verwendung des vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Peptids zum Herstellen eines antiviralen Mittels.
Sie bezieht sich auch auf die Verwendung des vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Peptids zum Herstellen eines zur Behandlung von AIDS bestimmten Arzneimittels.
Sie bezieht sich auf ein Vakzin, das einen Komplex aus einem erfindungsgemäßen Peptid und einem Hüllprotein eines Virus umfaßt. Das Virus kann ein AIDS-Virus wie etwa die vorstehend angeführten sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Peptids zum Herstellen eines diagnostischen Produkts, zum Beispiel von AIDS.
Sie bezieht sich auch auf die Verwendung eines vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Peptids zum Nachweisen von Molekülen der Virushülle des HIV.
Sie bezieht sich auch auf die Verwendung des vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Peptids zum Durchmustern auf Moleküle, die die Wechselwirkung von gp120 oder seinen Analoga mit dem CD4-Molekül hemmen, zum Durchmustern auf Moleküle mit antiviraler Aktivität und zum Durchmustern auf Moleküle, die zum Herstellen eines Arzneimittels von Nutzen sind.
Sie bezieht sich auch auf die Verwendung des vorstehend definierten, erfindungsgemäßen Peptids als immobilisierter Ligand zum Funktionalisieren einer chromatographischen Matrix.
Noch mehr Vorteile werden beim Lesen der folgenden Beispiele unter Bezug auf die Sequenzliste und auf die angefügten Figuren deutlich.
Kurze Beschreibung der Sequenzliste
Die angefügte Sequenzliste stellt die folgenden Peptidsequenzen bereit:

Sequenz ID Nr. 1: sCD4-Sequenz
Sequenz ID Nr. 2: Sequenz von Scyllatoxin (ScTx)
Sequenz ID Nr. 3: CD4M9-Sequenz: von Scyllatoxin abgeleitetes Peptid, das in Position 1 der Sequenz kein TPA aufweist.
Sequenz ID Nr. 4-16: CD4M9T, CD4M26, CD4M27, CD4M27A, CD4M27B, CD4M27C, CD4M30, CD4M31, CD4M32, CD4M33, CD4M35, K15 beziehungsweise K16 genannte Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Sequenz ID Nr. 17: CD4M3 genannte Sequenz, die von Scyllatoxin abgeleitet ist und in Position 1 der Sequenz kein TPA aufweist.
Sequenz ID Nr. 18: von Charybdotoxin abgeleitete, CD4MO genannte Sequenz.

Kurze Beschreibung der Figuren
1: Kurven der Hemmung des Bindens von CD4 an das Virusprotein gp120 durch Peptide der vorliegenden Erfindung, die durch einen kompetitiven ELISA erhalten wurden. Die getesteten Peptide sind: CD4M9, CD4M9T, CD4M27, CD4M32, CD4M33 und CD4M35. Die experimentellen Daten sind als prozentuales Binden (% F) als Funktion der Peptidkonzentration angegeben.
2: Kurven der Hemmung des Bindens von CD4 an das Virusprotein gp120 durch das markierte Peptid CD4M33-Fluorescein, CD4M33-F, die durch einen kompetitiven ELISA erhalten wurden. Die Kurven für die Peptide CD4M9 (Sequenz ID Nr. 3), CD4M33 (Sequenz ID Nr. 13) und CD4M35 (Sequenz ID Nr. 14) sind zum Vergleich ebenfalls dargestellt. Die experimentellen Daten sind als prozentuales Binden (% F) als Funktion der Peptidkonzentration dargestellt.
3: Kurven der Wechselwirkung des rekombinanten Virusproteins gp120-HXB2 mit dem an die Oberfläche eines Chips eines Oberflächenplasmonresonanzgeräts gebundenen Peptid CD4M33 (Sequenz ID Nr. 13), Die Assoziations- (0-300 sec) und Dissoziationskurven (300-800 sec) wurden nach der Injektion des Virusproteins gp120 in einer Konzentration von 13,2 (1), 19,8 (2), 29,6 (3), 44,4 (4), 66,6 (5) und 100 (6) nM aufgezeichnet. Die Daten sind als Resonanzeinheiten (RU) als Funktion der Zeit (t) in Sekunden dargestellt.
4(a) und (b): Die Kurve der Wechselwirkung von mit AT-2 [34] inaktiviertem HIV-1 mit dem Antikörper 48d [11] (a) und CG10 [35] (b), die an die Oberfläche eines Chips eines Oberflächenplasmonresonanzgeräts gebunden sind, in Gegenwart des Peptids CD4M33 (10 μg/ml), eines inaktiven Peptids (Ala23) CD4M9 (in der Peptidsequenz von CD4M9 durch Ala ersetztes Phe23) (10 μg/ml) und in Abwesenheit des Peptids. Die Assoziations- (0-180 sec) und Dissoziationskurven (180-600 sec) wurden nach der Injektion von HIV-1, das 1 h bei 20°C mit den Peptiden vorinkubiert worden war, aufgezeichnet. Die Daten sind als Resonanzeinheiten (RU) als Funktion der Zeit (t) in Sekunden dargestellt.
5(A)–(C): Wirkungen der Peptide CD4M30 (Sequenz ID Nr. 10) (4A), CD4M33 (Sequenz ID Nr. 13) (4B), CD4M35 (Sequenz ID Nr. 14) (4C) auf die Replikation des HIV-1_LAI-Stamms in mit PHA-P aktivierten PBMC. Die Daten sind als prozentuale Hemmung (% I) der Aktivität der reversen Transkriptase (RT) in den Kulturüberstunden als Funktion der Peptidkonzentration in nM dargestellt.
6(A) und (B): Wirkung der Anwesenheit von löslichem CD4 und der Peptide der vorliegenden Erfindung auf die Wechselwirkung des rekombinanten Virusproteins gp120_HXB2 mit den an die Oberfläche eines Chips eines Oberflächenplasmonresonanzgeräts gebundenen Antikörpern CG10 (A) und 48d (B). Die Assoziations- (0-180 sec) und Dissoziationskurven (180-400, 180-450 sec) sind für das Virusprotein gp120 allein und das Virusprotein gp120 in Gegenwart von CD4M27 (1,5 Äquivalent, Sequenz ID Nr. 6), von CD4M9 (1,5 Äquivalent), der inaktiven Mutante (Ala23)CD4M9 (1,5 Äquivalent) und löslichem CD4 (1,5 Äquivalent) angegeben. Die Daten sind als Resonanzeinheiten (RU) als Funktion der Zeit (t) in Sekunden angegeben.
7: Beispiele der Peptidsequenzen der durch den Ein-Buchstaben-Code für Aminosäurereste dargestellten Peptidsequenzen der vorliegenden Erfindung. TPA und B stellen Thiopropionsäure beziehungsweise Biphenylalanin dar und „d" stellt die optische D-Form von Asparaginsäure dar.
8: Chromatographisches Profil der Reinigung des rekombinanten Proteins gp120_HXB2 auf einer Sephadex-4B-Säule (1,2 × 4 cm), die mit dem Peptid CD4M9 (Sequenz ID Nr. 3) der vorliegenden Erfindung funktionalisiert ist. Die Daten sind als Absorption bei 280 nm als Funktion der Zeit (min) nach der Zugabe von 0,5 M Essigsäure angegeben.
Beispiele
Beispiel 1: Synthese der Peptide der vorliegenden Erfindung
Die Peptide der vorliegenden Erfindung wurden in diesem Beispiel durch chemische Festphasensynthese mit einem Applied Biosystem Peptidsyntheseautomaten mod. 433A und durch Fmoc-Chemie hergestellt, bei der die Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (Fmoc) zum vorübergehenden Schutz der α-Aminofunktion der Aminosäuren verwendet wird. Die bei dieser Fmoc-Strategie zum Verhindern der Nebenreaktionen der Seitenketten der Aminosäuren verwendeten Schutzgruppen waren tert-Butylether (tBu) für die Ser-, Thr- und Tyr-Reste, tert-Butylester (OtBu) für Asp, Glu, Trityl (Trt) für Gln, Asn, Cys, His, tert-Butyloxycarbonyl (Boc) für Lys und 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) für Arg.
Die Kupplungsreaktion findet bei einem Überschuß von 10 Äquivalent Aminosäure (1 mMol) bezogen auf das Harz (0,1 mMol) statt. Die geschützte Aminosäure wird in 1 ml N-Methylpyrrolidon (NMP) gelöst und 1 ml einer Lösung von 1M 1-N-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) in dem Lösungsmittel NMP gelöst. 1 ml einer Lösung von 1M N,N'-Dicyclohexylcarbonodiimid (DCC) wird anschließend zugesetzt. Nach 40 bis 50 Minuten Aktivierung wird der gebildete aktive Ester in das Reaktionsgefäß überführt, das das Harz enthält. Vor diesem Schritt der Überführung und der anschließenden Kupplung wird das Harz mit einer Lösung von 20% Piperidin in NMP von seiner Fmoc-Gruppe entschützt. Das überschüssige Piperidin wird durch Waschen mit NMP nach ungefähr 5 bis 10 Minuten entfernt.
Während des Entschützens ermöglicht der Nachweis der Dibenzofulven-Piperidin-Addukte bei 305 nm das Verfolgen eines guten Synthesefortschritts. Insbesondere die mengenmäßige Bestimmung des Addukts ermöglicht das Abschätzen des Wirkungsgrads des Entschützens der Fmoc-Gruppe und folglich des Kuppelns der schlußendlich eingebauten Aminosäure.
In die Peptide der vorliegenden Erfindung eingearbeitete chemische Modifikationen
Eine fluoreszierende Sonde und ferner eine Biotingruppe wurden an zwei in der vorliegenden Erfindung untersuchte Peptide, CD4M9T (Sequenz ID Nr. 4) und CD4M33 (Sequenz ID Nr. 13), gekuppelt. Der Einbau dieser beiden Verbindungen erfolgte an dem Lysinrest 11 auf einer der Stelle zum Binden des Virusproteins gp120 gegenüberliegenden Seite. Diese Wahl eines Lysins war durch seine Möglichkeiten zum Schützen seiner Seitenkette mit einer als orthogonal bezeichneten Schutzgruppe wie etwa der 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)ethylgruppe bedingt. Eine derartige Gruppe ist tatsächlich bezüglich der Behandlung mit zum Entschützen der Fmoc-Gruppe verwendetem 20%igem Piperidin stabil, wird aber durch Behandlung mit einer 2%igen Hydrazinlösung spezifisch gespalten. Sobald die Dde-Gruppe entfernt worden war, war es möglich, das Fluorescein sowie das Biotin zu kuppeln.
Einführung von Fluorescein.
Die fluoreszierende Gruppe wurde in die Seitenkette von Lysin 11 des Peptids CD4M33 der vorliegenden Erfindung beziehungsweise von Lysin 15 oder 16 des Peptids K15 (Sequenz ID Nr. 15) oder K16 (Sequenz ID Nr. 16) der vorliegenden Erfindung eingeführt. Die Dde-Gruppe wurde daher zum Schützen der Seitenkette des Lysins während der Peptidsynthese verwendet und wurde anschließend durch zwei Behandlungen über 5 min mit 2% Hydrazin in Dimethylformamid (DMF) freigesetzt. Das Fluoresceinmolekül wurde direkt oder über einen Arm, der zum Fernhalten des Fluoresceins dient, das ein sperriges Molekül ist, das die Bindungsaktivität behindern könnte, an das synthetisierte Peptid gebunden. Im letzten Fall ist das Molekül, das das Einführen eines Arms ermöglicht, Fmoc-8-Amino-3,6-dioxaoctansäure. 17 Äquivalent Fmoc-8-Amino-3,6-dioxaoctansäure, 60 Äquivalent Diisopropylethylamin (DIEA) und 17 Äquivalent 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) werden so einem Äquivalent Harz zugesetzt. Nach 1 Stunde Kuppeln bei Raumtemperatur wird die Fmoc-Gruppe mit 20%igem Piperidin entschützt. Das Kuppeln der Sonde wurde anschließend mit Hilfe des N-Hydroxysuccinimidylfluorescein-5(6)-carboxylatesters durchgeführt. Dazu werden 4 Äquivalent aktivierter Fluoresceinester einem Äquivalent Harz in Gegenwart von 14 Äquivalent Diisopropylethylamin (DIEA) zugesetzt. Die Reaktion findet in dem Lösungsmittel NMP über Nacht statt. Schließlich wird das endgültige Entschützen durchgeführt.
Einführung von Biotin.
Ein 8-Amino-3,6-dioxaoctan-Abstandsarm wurde in einem ersten Schritt an zuvor von der Dde-Gruppe entschütztes Lysin 11 angehängt. Die Reaktion ist der im vorangehenden Abschnitt beschriebenen ähnlich. Das Biotin wird anschließend in Form eines N-Hydroxysuccinimidylbiotinamidocaproatesters eingebaut: 4 Äquivalent aktivierter Biotinester werden so einem Äquivalent Harz in Gegenwart von 14 Äquivalent Diisopropylethylamin (DIEA) zugesetzt. Die Reaktion erfolgt über Nacht bei Raumtemperatur. Das Harz wird anschließend gewaschen, bevor es mit der endgültigen Entschützungslösung behandelt wird.
Einführung einer Thiolgruppe.
Das Peptid CD4M9 wird gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit dem Lysin in Position 11 mit einer Dde-Gruppe als Schutzgruppe für die Seitenkette synthetisiert. Nach der Synthese des Peptids wird das Peptidharz 5 Mal mit einer Lösung von 2% Hydrazin in DMF behandelt. Das Kuppeln eines Abstandarms wird eine Stunde bei Raumtemperatur in DMF mit 10 Äquivalenten Fmoc-8-Amino-3,6-dioxaoctansäure unter Verwenden des Reagenzes HBTU in Gegenwart von Diisopropylethylamin durchgeführt. Die Fmoc-Gruppe wird anschließend mit 20% Piperidin in DMF entschützt. Das Peptidharz wird nachfolgend mit 10 Äquivalenten Traut-Reagenz (2-Iminothiolan-hydrochlorid (Sigma)) in Gegenwart von DIEA behandelt. Das Peptid wird schließlich wie nachstehend beschrieben freigesetzt und entschützt.
Endgültiges Entschützen des Harzes
Das Abspalten des Harzes und der in den Seitenketten vorhandenen Schutzgruppen wurde gleichzeitig durch Behandlung des mit dem Harz verknüpften Peptids mit Trifluoressigsäure (TFA) durchgeführt. Vor dem Ausführen der Abspaltung wurde das Harz mehrmals mit Dichlormethan (DCM) gewaschen und schließlich getrocknet. Das beim Abspalten verwendete Reagenz ist ein 81,5% TFA und die Fänger Phenol (5%), Thioanisol (5%), Wasser (5%), Ethandithiol (2,5%) und Triisopropylsilan (1%) enthaltendes Gemisch. Das Harz wurde mit diesem Gemisch drei Stunden unter Rühren und bei Raumtemperatur in einem Verhältnis von 100 ml Lösung je Gramm Harz behandelt. Das freie Peptid in der Lösung wurde durch Filtration isoliert. Das Peptid wurde anschließend gefällt und unter kalten Bedingungen in Diisopropylether gewaschen und anschließend in 20%iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert.
Faltung der Peptide der vorliegenden Erfindung durch Bildung von Disulfidbrükken
Das nach der Lyophilisierung isolierte Peptid, das Syntheserohprodukt, liegt in reduzierter Form vor, das heißt die Disulfidbrücken in der Kette sind nicht ausgebildet. Die Bildung dieser kovalenten Bindungen wurde unter Verwenden des Redoxpaars Cystamin/Cysteamin durchgeführt. Das Syntheserohprodukt wurde zu 2,0 mg/ml^–1 in Wasser aufgenommen, dem 0,1% (Vol./Vol.) TFA und 6M Guanidiumchlorid zugesetzt worden waren, um dessen Lösen zu erleichtern. Diese auf 0,2 mg/ml^–1 verdünnte Lösung wurde anschließend tropfenweise dem 100 mM Tris/HCl, pH 7,8, und 5 mM Cysteamin umfassenden Reduktionspuffer zugesetzt. Das Cystamin (Oxidationsmittel) in einer Endkonzentration von 0,5 mM wurde nach 45 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Medium wird nach 30 Minuten auf pH 3,0 gebracht.
Das Cysteamin ermöglicht das Reduzieren der in dem Peptid vorhandenen Thiolgruppen. An offener Luft oxidiert es und erlaubt die Oxidation von Cysteinen und daher das Falten des Peptids durch Bilden von Disulfidbrücken in der Kette. Das am Ende der Behandlung zugesetzte Cystamin ermöglicht das Abschließen des Faltens. Der gute Fortschritt der Oxidation wird durch analytische Chromatographie unter Vergleichen der Retentionszeit des rohen und oxidierten Produkts bestätigt, wobei die des ersten länger ist.
Die Oxidation des Peptids CD4M9, das eine Thiolgruppe in Position 11 aufweist, unterscheidet sich etwas von der im vorstehenden Abschnitt beschrieben. Das Medium für die Faltungsreaktion, das 20 mM auf pH 7,8 eingestellten und 200 nM NaCl enthaltenden Phosphatpuffer umfaßt, wird lang mit Argon entgast und anschließend werden 5 mM Cysteamin und 5 mM Cystamin zugesetzt. Das sieben freie SH-Funktionen umfassende Peptid wird anschließend zugesetzt und die Oxidationsreaktion wird durch Zusetzen von Essigsäure nach nur 10 Minuten, einem zum Falten und zur Bildung der drei natürlichen Disulfidbrücken ausreichend langen Zeitraum und zum Begrenzen der Bildung höheren Oxidationszuständen entsprechender Nebenprodukte ausreichend kurzen Zeitraum abgebrochen.
Reinigung der Peptide der vorliegenden Erfindung
Die Peptide der vorliegenden Erfindung wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer präparativen Säule Vydac C18 (1,0 × 25,0 cm) gereinigt. Es wurde ein linearer Acetonitrilgradient von 0-60% in 0,1%iger wäßriger Trifluoressigsäurelösung während 90 Minuten angewendet. Die Fraktionen des Hauptpeaks wurden durch analytische HPLC analysiert. Die nur einen Peak zeigenden Fraktionen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert. Das so erhaltene Produkt wurde durch Massenspektrometrie analysiert.
Beispiel 2: Kompetitive Tests durch indirekten ELISA
Das Hemmen der rgp120-CD4-Wechselwirkung wurde durch indirekten ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay [enzymverknüpfter Immunsorbenstest]) gemessen. 50 ng Anti-gp120-Antikörper, D7324, je Näpfchen wurden über Nacht bei 4°C auf einer 96-Näpfchen-Platte (Maxisorb, Nunc) immobilisiert. Nach der Passivierung mit Rinderserumalbumin und drei Wäschen mit dem Waschpuffer (10 mM Tris, pH 7,8, 0,05% Tween 20) wurden 15 ng rgp120_HXB2 je Näpfchen zugesetzt. Verschiedene Konzentrationen der Kompetitoren wurden anschließend nach drei Wäschen und ferner 0,4 ng lösliches CD4 je Näpfchen zugesetzt. Nur lösliches CD4 enthaltende 100% Kontrollen wurden hergestellt. Nach einer Nacht bei 4°C und drei Wäschen wurden 5 ng Maus-anti-CD4-Antikörper L120.3 je Näpfchen zugesetzt, gefolgt von einem an Peroxidase gekuppelten Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (GAMPO). Der Nachweis erfolgte durch Zusetzen von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, einem fluoreszierenden Substrat für Peroxidase. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten durch Zufügen von 2M Schwefelsäure abgebrochen. Das Hemmen der rgp120-CD4-Wechselwirkung wurde durch Ablesen der Absorption A bei 450 nm berechnet. Kontrollen ohne Kompetitor ermöglichten das Bestimmen der Absorption A_100% (Absorption in Abwesenheit eines Kompetitors). Die prozentuale Hemmung bei jeder Konzentration eines Peptids der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwenden der Formel Prozent Hemmung = 100 × (A100% – A)/A100% berechnet.
Die Tests wurden im Doppel ausgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittel von Versuchsdoppeln ausgedrückt.
Auf die biologischen Aktivitäten des von Charybdotoxin abgeleiteten Peptids CD4MO (Sequenz ID Nr. 18) und des von Scyllatoxin abgeleiteten Peptids CD4M3 (Sequenz ID Nr. 17) wurden in einem indirekten ELISA-Test getestet. Diese Peptide zeigen eine Fähigkeit zum Hemmen der Wechselwirkung rgp120_LAI-lösliches CD4 mit einer 50% Hemmkonzentration (oder IC₅₀) von 4,0 × 10^–5 M beziehungsweise 2,0 × 10^–5 M (Tabelle I) [4]. Diese Werte sind 10000 Mal höher als die von löslichem CD4 (IC₅₀ = 4,0 × 10^–9 M) [4].
Die angefügte 1 faßt die in diesem Beispiel erhaltenen Ergebnisse mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung zusammen.
Sie sind Darstellungen des prozentualen Bindens (% F) des Virusproteins gp120_HXB2-CD4 als Funktion der molaren Konzentration (C(M)) des Kompetitors, das heißt des Peptids der vorliegenden Erfindung. Diese Figur zeigt das Hemmen der CD4-gp120_HXB2-Wechselwirkung.
CD4M9 (Sequenz ID Nr. 3) wurde durch einen kompetitiven ELISA bestimmt. Es zeigt die Fähigkeit, die Wechselwirkung rgp120_LAI-lösliches CD4 mit einer 50% Hemmkonzentration (oder IC₅₀) von 4,0 × 10 M (Tabelle I) zu hemmen, was eine 50fache Zunahme des Hemmvermögens bezogen auf das Peptid CD4M3 (Sequenz ID Nr. 17) der vorliegenden Erfindung ist. Das Peptid CD4M9 der vorliegenden Erfindung kann bei einem kompetitiven ELISA-Test auch die Wechselwirkung von CD4 mit anderen, aus den T- und M-trophen Viren HIV-1_IIIB, HIV-1_MN, HIV-1_Ba-L, HIV-1_JR-FL und HIV-1_W61D stammenden rekombinanten gp120-Proteinen mit einer 50% Hemmaktivität (IC₅₀) zwischen 0,1 und 1,0 × 10^–6 M [4] hemmen.
Dieses Peptid hemmt die Wechselwirkung gp120_HXB2-lösliches CD4 mit einer IC₅₀ von 9 × 10^–8 M (1, Tabelle I).
Eine den Ersatz der C-terminalen Sequenz Gly-Pro von CD4M9 durch Val umfassende Mutante CD4MV zeigt eine IC₅₀ von 3,0 × 10^–7 M bei der Hemmung der gp120_LAI-CD4-Wechselwirkung (Tabelle 1), was eine leichte Zunahme des Hemmvermögens darstellt. Die Mutante CD4M9Bip umfaßt verglichen mit CD4M9 den Ersatz Phe23Bip. Dieses Peptid zeigt eine IC₅₀ von 1,0 × 10^–7 M bei der Hemmung der gp120_LAI-CD4-Wechselwirkung (Tabelle 1), was eine weitere Zunahme des Hemmvermögens darstellt. Die Mutante CD4M9T (Sequenz ID Nr. 4), die eine Thiopropionsäure als Ersatz für die N-terminale Aminosäure Cys umfaßt, zeigt eine IC₅₀ von 3,0 × 10^–8 M bei der Hemmung der gp120_LAI-CD4-Wechselwirkung (1; die IC₅₀ bei der gp120_HXB2-Wechselwirkung ist 1,1 × 10^–8 M, Tabelle 1), was eine nahezu 10fache Zunahme des Hemmvermögensbezogen auf CD4M9 darstellt.
Die folgenden Mutanten weisen alle einen Thiopropionsäure- (TPA) und Valinrest (Val oder Ile) in der N- beziehungsweise C-terminalen Position auf und wurden alle mit von den T-trophen Viren HIV-1_HXB2 und HIV-1_LAI stammendem gp120 getestet.
Das Peptid CD4M27 (Sequenz ID Nr. 6) der vorliegenden Erfindung umfaßt die Mutationen Arg5Phe (zum Entfernen eines nicht essentiellen Arginins und zum Schützen der Disulfidbrücke 6-24), Gly27Val und eine Deletion des C-terminalen Prolinrests (um die β-Struktur besser zu stabilisieren). Es zeigt eine Zunahme der Fähigkeit zum Hemmen der CD4-gp120_HXB2-Bindung, eine IC₅₀ von 7 × 10^–9 (1, Tabelle I). Die Peptide CD4M27 A, B beziehungsweise C werden durch eine Mutation Gly21Ser(a), Ser22His(b) und Ser22Asn(c) ausgehend von dem Peptid CD4M27 erhalten. Sie zeigen ein mit der des Peptids CD4M27 vergleichbares Hemmvermögen.
Das Peptid CD4M32 (Sequenz ID Nr. 12) der vorliegenden Erfindung umfaßt verglichen mit CD4M9T eine Deletion des C-terminalen Prolinrests, die Mutation Gly27Val und die Mutation von Phe23 zu Biphenylalanin (Bip): die Mutation Phe23Bip hängt eine hydrophobe Verlängerung an die Seitenkette des Phe23 an, um so die Wechselwirkung mit dem hydrophoben Hohlraum des Virusproteins gp120 zu erhöhen. CD4M32 zeigt eine Zunahme bei der Hemmung der CD4-gp120_HXB2-Bindung (IC₅₀ von 8 × 10^–10 M, 1). Die Mutante CD4M30 (Sequenz ID Nr. 10) umfaßt verglichen mit CD4M32 die Mutation Arg5Phe (bereits in CD4M27 eingeführt) und Ala4Gln, um die Löslichkeit des Moleküls zu erhöhen. Dieses Peptid der vorliegenden Erfindung zeigt eine IC₅₀ von 3,0 nM in den Tests zur Hemmung der CD4-gp120_LAI-Wechselwirkung. Die Mutante CD4M33 (Sequenz ID Nr. 13) schließt die in den beiden vorangehenden Peptiden vorhandenen Mutationen, insbesondere Cys1TPA, Arg5Phe, Phe23Bip, Gly27Val, die Deletion eines Rests in der C-terminalen Position und außerdem die Mutation Ala4His (zum Erhöhen der Löslichkeit des Moleküls) ein. Diese Mutationen weisen eine additive Wirkung auf und ermöglichen dem Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung das Hemmen der CD4-gp120_HXB2- und CD4-gp120_LAI-Wechselwirkung mit einer IC₅₀ von 1,2 × 10^–10 M und von 2,5 × 10^–10 M (1 und Tabelle 1), das heiß eine Zunahme der Fähigkeit zum Hemmen der CD(-gp120-Bindung um den Faktor 1000 verglichen mit CD4M9. Ein weiteres Peptid, CD4M35 (Sequenz ID Nr. 14), wurde verglichen mit dem Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung mit den Mutationen Val27Ile und Gly21(D)Asp synthetisiert. Diese Mu tationen ermöglichen dem Peptid der vorliegenden Erfindung die CD4-gp120_HXB2-Wechselwirkung mit einer IC₅₀ von 7,0 × 10^–11 M (1, Tabelle 1) zu hemmen.
Zwei andere Peptide, K15 (Sequenz ID Nr. 15) und K16 (Sequenz ID Nr. 16) wurden synthetisiert: sie umfassen verglichen mit dem Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung den Ersatz Gln7Val, Leu8Gln und Lys11 His und einen Lys-Rest in Position 15 beziehungsweise 16. Eine fluoreszierende Fluoresceingruppe wurde anschließend gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift kovalent an die Seitenkette des Lysinrests gebunden. Die fluoreszierenden Peptide K15 und K16 zeigen eine IC₅₀ von 5,0 × 10^–8 M und 6,0 × 10^–9 M bei der Hemmung der gp120_LAI-CD4-Wechselwirkung, wobei die Affinität zu dem Virusprotein gp120 durch Markieren nicht verändert wird.
Schlußendlich stellt die vorliegende Erfindung eine Familie von Peptiden bereit, die starke Inhibitoren der CD4-gp120-Wechselwirkung sind.
Tabelle 1

Hemmkonzentration 50% (IC₅₀) der CD4-mimetischen Peptide bei der Wechselwirkung von löslichem rekombinantem CD4 mit dem Virushüllprotein gp120_LAI und gp120_HXB2. Die Standardabweichung für jeden Wert ist kleiner als 30%.

Name	Sequenz ID Nr.	IC₅₀ (gp120_LAI)	IC₅₀ (gp120_HBX2)
CD4M0	18	40 μM	–
CD4M3	17	20 μM	–
CD4M9	3	400 nM	90 nM
CD4M9V	–	300 nM	–
CD4M9T	4	30 nM	11 nM
CD4M9Bip	–	100 nM	–
CD4M27	6	10 nM	7 nM
CD4M30	10	3,0 nM	–
CD4M32	12	2,0 nM	800 pM
CD4M33	13	250 pM	120 pM
CD4M35	14	–	70 pM
K15FR	15	50 nM	–
K16FR	16	6 nM	–

Beispiel 3: Oberflächenplasmonresonanzversuche
Die Oberflächenplasmonresonanzversuche wurden mit einem System Biacore 2000 (Biacore, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Die zu testenden Peptide wurden (wie zuvor beschrieben) an Biotin gekuppelt und anschließend auf einem Chip immobilisiert, an den zuvor Streptavidin gebunden worden war.
Das Streptavidin wurde auf dem Chip wie folgt immobilisiert: die Chipoberfläche wurde zuerst durch Injektion von 50 l des Kupplungsmittels N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC)/N-Hydroxysuccinimid (NHS), 50/50, das durch den Hersteller geliefert wurde und Amidbindungen bilden kann, aktiviert; anschließend wurden 20 μl Streptavidin, 0,2 mg.ml^–1 in 10 mM Natriumacetat, pH 4,5, mit 5 μl.min^–1 injiziert, gefolgt von der Neutralisierung der aktivierten Carboxygruppen mit 2 × 20 μl 1,0 M Ethanolamin, pH 8,5. Die biotinylierten Moleküle wurden anschließend (10 μl.min^–1 in einem 0,3 M NaCl enthaltenden 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,4) auf drei der vier Bahnen des Chips injiziert. Auf der ersten Bahn wurde CD4M9 (10^–7 M) bis zu einem RU-Wert (Resonanzeinheit) von 100 immobilisiert; die zweite Bahn wurde unberührt gelassen (Vergleich); die dritte Bahn wurde mit löslichem CD4 (10^–7 M) bis zu einem RU-Wert von 450 beschichtet; auf der vierten Bahn wurde CD4M33 (10^–7 M) mit einem RU-Wert von 100 immobilisiert. Zu jeder Analyse wurden mehrere Konzentrationen verschiedener gp120 (Stämme HXB2, BAL und JRFL) mit einer Geschwindigkeit von 50 μl.min^–1 bei 25°C über eine Assoziationszeit von 4 min injiziert. Der Chip wird anschließend mit einem Laufpuffer, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA und 0,05% P20 enthaltendes 10 mM Hepes, pH 7,4, gespült, um die Dissoziationsphase zu analysieren. Nach jedem Versuch wird der Chip mit 25 μl 1,0 M Ameisensäure regeneriert. Die Dissoziationskonstanten werden aus den durch die Software Biaevaluation 3,0 bestimmten kinetischen Konstanten berechnet.
Beispiel 4: Antivirale Aktivität der CD4-Mimetika
Das Handhaben des infektiösen Materials wurde in einem Hochsicherheitslabor des Typs 13 durchgeführt. Um den physiopathologischen Bedingungen so nahe wie möglich zu kommen, wurde die Untersuchung mit Hilfe primärer Kulturen humaner, mononukleärer Blutzellen (PBMC) durchgeführt. Bei all diesen Versuchen wurden die Wirkungen der neuen Moleküle mit denen von AZT verglichen.
Isolierung, Kultur und Aktivierung der Zellen
Kulturmedium
Das Medium A setzt sich aus dem mit 10% 30 min bei +56°C wärmedekomplementiertem, fetalem Kälberserum (SVF, Roche Product), 2 mM L-Glutamin (Roche Product) und 100 μg/ml einer Lösung von drei Antibiotika (Penicillin, Streptomycin, Neomycin; PSN, Life Technologies) ergänzten Zellkulturmedium RPMI 1640 (Life Technologies) zusammen. Das Medium B besteht aus mit 20 IE/ml rekombinantem humanem IL-2 (Roche Product) ergänztem Medium A.
Isolierung und Aktivierung der PBMC
Die PBMC werden von den anderen vorhandenen Blutbestandteilen durch Ficoll-Gradientenzentrifugation (MSL 2000, Eurobio) abgetrennt: um ein Drittel verdünnte 30 ml Blut aus einem gesunden Spender werden auf ein Ficoll-Kissen geschichtet. Nach 20 min Zentrifugieren bei 850 g wird der PBMC-Ring entfernt und anschließend nach 10 min Zentrifugieren bei 750 g und 5 min bei 400 g zweimal mit RPMI 1640 gewaschen. Die PBMC werden anschließend 48 h mit 1 μg/ml Phytohämagglutinin-P (PHA-P; Difco Laborstories) aktiviert. Die PBMC werden bei +37°C in einer feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre unter 5% CO₂ kultiviert. Am Ende der 48 Stunden mitogener Aktivierung werden sie in Medium B kultiviert. Während des Kultivierens werden von den Kulturüberständen Proben genommen und die Kulturmedien werden alle drei oder vier Tage erneuert. Bei jedem Erneuern der Kulturmedien wird die Lebensfähigkeit der Zellen durch mikroskopische Beobachtung ermittelt.
Ermittlung der antiretroviralen Aktivität der Moleküle
Die Verbindungen CD4M30, CD4M33 und CD4M35 der vorliegenden Erfindung wurden in sterilem Wasser für eine injizierbare Zubereitung (Aguettant) gelöst, in aliquote Mengen aufgeteilt und anschließend bei –20°C aufbewahrt. Die Verbindung SAH-CD4 (lösliches CD4, das an durch Aventis (Vitry-sur-Seine) geliefertes Humanserumalbum gekuppelt war, wurde bis zu ihrer Verwendung bei –80°C aufbewahrt. Die Lösungen und die Verdünnungen wurden anschließend ohne Vorbereitung in Medium A hergestellt. Die PBMC wurden 1 Stunde mit den Verbindungen vorbehandelt und anschließend mit dem Lymphozytentropismus aufweisenden Referenzisolat HIV-1_LAI oder mit dem klinischen Isolat HIV-1_LEN infiziert. Die biologischen Eigenschaften dieses Isolats sind: rasch/stark, Synzitium-induzierend (SI), X4: es kann daher vorzugsweise Lymphozyten infizieren. Der Virusvorrat wurde durch Amplifizieren dieses Stamms in vitro unter Verwenden mononukleärer Nabelschnur-Blutzellen (UCBMC) gebildet, die mit 1 μg/ml PHA-P voraktiviert und in Medium B kultiviert wurden. Zum Entfernen der löslichen Faktoren wie etwa Zytokine wurden die Kulturüberstände 5 min bei 360000 g zentrifugiert und die Pellets wurden in RPMI 1640 resuspendiert. Der so gebildete Virusvorrat wurde anschließend unter Verwenden PHA-P-aktivierter PBMC titriert. Die TCID₅₀ (infektiöse Gewebekulturdosis 50%) wurde mittels der Kärber-Formel berechnet. Die PBMC wurden mit verschiedenen Virendosen, 10-100 TCID₅₀, des Stamms HIV-1_LAI um und mit 50 TCID₅₀ des Stamms HIV-¹LEN (Multiplizität der Infektion m.o.i. = 0,001) infiziert.
Bestimmen der Virusreplikation in den Kulturüberständen
Die Virusreplikation wurde an Tag 7 der Kultur durch Bestimmen der reversen Transkriptaseaktivität in den Kulturüberständen unter Verwenden des Testkits RetroSys (eingetragenes Warenzeichen) gemäß den Empfehlungen der Firma Innovagen gemessen.
Analyse der Ergebnisse und Bestimmung der wirksamen Dosen 50%
Die wirksamen Dosen 50% (ED₅₀) werden mittels der durch J. Chou & T. C. Chou entwickelten Software „Dose-effects analysis with microcomputers^„ berechnet.
Beispiel 5: Vorschrift zum Herstellen des rekombinanten Virusproteins gp120
Das das Virusprotein gp120 kodierende Fragment (Aminosäure V12 bis R481) wurde durch PCR in dem Plasmid HIVIIIB/HXB2R mittels zweier Primer amplifiziert, die das Erzeugen eines eine BamHI- (stromaufwärts der KpnI-Stelle des Virusproteins gp120) und PstI-Stelle (stromabwärts des an das Ende der Sequenz des Virusproteins gp120 angefügten Stopkodons) enthaltenden Fragments ermöglichten. Das so erhaltene BamHI/PstI-Fragment wurde in den Bluescript-Vektor (pBS, Stratagene) kloniert, wodurch das Plasmid pBSm1 erzeugt wurde. Die das N-terminale Ende des Virusproteins gp120 (T1 bis G11) kodierende Sequenz und auch die das Signalpeptid der Ecdysteroid-Glycosyltransferase des Autographa californica Baculovirus kodierende wurden zwischen den BamHI- und KpnI-Stellen von pBSm1 inseriert, was zu pBSm2 führte.
Das BamHI-PstI-Fragment von PBSm2 wurde anschließend zwischen den BglII-PstI-Stellen des Transfervektors p119P des Baculovirus P10 inseriert. Sf9-Insektenzellen wurden mit der gereinigten Virus-DNA des modifizierten Baculovirus AcSLP10 und der DNA des rekombinanten Vektors p119P gp120 cotransfiziert. Diese rekombinanten Viren werden durch ein Standardverfahren gereinigt.
Sf9-scla-Zellen (an ein Wachstum ohne Serum angepaßte Linie, bei der Sammlung des Pasteur-Instituts hinterlegt) werden in einem Spinner in serumfreiem Medium gehalten. Diese Zellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) werden anschließend mit den rekombinanten Viren bei einer Multiplizität der Infektion von 1 PFU (plaquebildende Einheit) je Zelle infiziert und bei 28°C inkubiert. Nach sechs Tagen Infektion werden die Zellen zentrifugiert (500 g) und das Wildtyp-Virusprotein gp120 wird durch Affinitätschromatographie auf einer Säule aus bromacetylierter, an den Anti-gp120-Antikörper D7324 gekuppelter Sepharose kon zentriert und direkt aus dem Kulturüberstand gereinigt.
Beispiel 6: Binden der Virushülle
Zum besseren Charakterisieren seiner biologischen Aktivität wurde das Peptid CD4M33 (Sequenz ID Nr. 13) der vorliegenden Erfindung wie in Beispiel 1 beschrieben mit Biotin und mit der fluoreszierenden Fluoresceinsonde auf dem Lys-11 markiert, das auf der Oberfläche gegenüber der aktiven Oberfläche des Peptids CD4M33 der vorliegenden Erfindung gelegen ist. Seine Aktivität bleibt bei ELISA-Tests unverändert (2).
2 faßt die in diesem Beispiel erhaltenen Ergebnisse zusammen. Es sind Kurven, die die Entwicklung der prozentualen Bindung (% F) von Peptiden der vorliegenden Erfindung mit dem Virusprotein gp120_HXB2 als Funktion der molaren Konzentration dieser Peptide (C(M)) zeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß in das Peptid CD4M33 eine Markierungsgruppe eingebaut werden kann, ohne seine biologische Aktivität zu verändern.
Zum Erhalten einer ersten Bewertung der Affinität des Peptids CD4M33 der vorliegenden Erfindung zu dem Virusprotein gp120 wurde eine Analyse biospezifischer Wechselwirkungen (in Beispiel 3 beschrieben) auf der Grundlage eines Nachweises durch Oberflächenplasmonresonanz verwendet. Bei dieser Technik wurde das biotinylierte Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung (wie in Beispiel 1 hergestellt) spezifisch an die carboxylierte Dextranmatrix eines Chips gebunden, auf den Streptavidin vorgepfropft worden war. Lösungen verschiedener rekombinanter gp120-Proteine (gp120_HXB2, gp120_BAL und gp120_JRFL) wurden anschließend auf diese Matrix injiziert und ein eine spezifische Assoziation hoher Affinität anzeigendes Signal wurde anschließend nachgewiesen. 3 zeigt die Entwicklung des Plasmonresonanzsignals als Funktion der Zeit nach der Wechselwirkung des gp120_HXB2-Proteins (bei verschiedenen Konzentrationen) mit dem Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung.
Nach der nichtlinearen Regression der erhaltenen Assoziations- und Dissoziationskurven wird eine Dissoziationskonstante K_D von 2,4 × 10^–9 M für das Virusprotein gp120_HXB2, von 7,4 × 10⁹ M für das Virusprotein gp120_BAL und von 8,5 × 10^–9 M für das Virusprotein gp120_JRFL erhalten. Diese Werte sind mit dem in der Literatur [34] für die CD4-gp120-Wechselwirkung mitgeteilten Wert von K_D = 1,9 × 10 M vergleichbar. Dieselbe Technik auf der Grundlage des Nachweises durch Oberflächenplasmonresonanz wurde auch zum Überprüfen verwendet, ob das Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung die Virushülle in ihrer nativen Form binden kann. Dazu wurde eine Suspension mit Aldrithiol-2 [35] inaktivierter Virusteilchen auf denselben Chip injiziert, auf den die Antikörper 48d und CG10 gepfropft waren. Ein Signal für die spezifische Wechselwirkung mit hoher Affinität wurde anschließend eindeutig nachgewiesen, als die Suspension mit dem Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung inkubiert wurde, nicht aber als die Virussuspension mit dem Peptid CD4M9, das viel weniger aktiv ist, oder in Abwesenheit eines Peptids inkubiert wurde (4).
4 zeigt, daß die Anwesenheit des Peptids CD4M33 für die Wechselwirkung der Virushülle mit den Virushülle-spezifischen Antikörpern 48d und CG10 wesentlich ist und daß HIV-1 bei seiner Abwesenheit nicht an die Antikörper bindet: dies ist ein indirekter Beweis der Bindung des Peptids CD4M33 an die Virushülle von HIV-1.
Diese Versuche zeigen, daß das markierte oder unmarkierte Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit zum Binden der HIV-Virushülle sowohl in seiner isolierten und gereinigten rekombinanten Form als auch in seiner auf der Virusoberfläche vorliegenden nativen Form aufweist.
Beispiel 7: Hemmung der Infektion mit HIV-1
Zum Bewerten der antiviralen Fähigkeit der Peptide der vorliegenden Erfindung führten die Erfinder Versuche durch, die aus der Infektion mit dem HIV-1_LAI-Virus und mit dem chemischen Isolat HIV-1_LEN aus primären Kulturen humaner, peripherer, mononukleärer Blutzellen (PBMC) bestanden. Bei all diesen Versuchen wurden die Wirkungen der neuen Moleküle mit denen von AZT verglichen. Das HIV-1_LAI-Virus wurde in verschiedenen Virusdosen (10-100 TCID₅₀, Tabelle 2) in Gegenwart wechselnder Konzentrationen von CD4M30, CD4M33, CD4M35 und SAH-CD4 zugesetzt. Das HIV-1_LEN-Virus wurde in der TCID₅₀ (Tabelle 4) in Gegenwart von CD4M33 zugesetzt. Toxizitätstests der CD4-Mimetika wurden ebenfalls an denselben Zellen durchgeführt.
a. Toxizität der CD4-Mimetika.
In den getesteten Dosen verringerte keine der Verbindungen AZT, SAH-CD4 oder Anti-CD4-Mimetika die Lebensfähigkeit der PHA-P-aktivierten PBMC.
b. Anti-HIV-1_LAI-Aktivität der CD4-Mimetika
b.1. Replikation des Stamms HIV-1_LAI in PBMC.
Der Stamm HIV-1_LAI repliziert in PHA-P-aktivierten PBMC auf hoher Stufe. Der Spitzenwert der Virusreplikation ist an Tag 7 der Kultur und die Wirkungen der Peptide CD4M30, CDM33 und CD4M35 wurden zum Zeitpunkt nach der Infektion zahlenmäßig bestimmt.
b.2. Wirkungen von AZT auf die Replikation des Stamms HIV-1_LAI in PBMC.
AZT hemmt die Replikation des Stamms HIV-1_LAI in PHA-P-aktivierten PBMC stark (Tabelle 2). Die ED₅₀ ist gleich 3-14 nM.
b.3. Wirkungen der Verbindung SAH-CD4 auf die Replikation des Stamms HIV-1_LAI in PBMC.
Die antiretrovirale Aktivität der Verbindung SAH-CD4 bezüglich der mit PHA-P aktivierten und mit dem Stamm HIV-1_LAI infizierten PBMC führt zu 85 ± 15% Hemmung der Virusreplikation in einer Konzentration von 2,5 μM.
b.4. Wirkungen der CD4-Mimetika auf die Replikation des Stamms HIV-1LAI in PBMC.
Die Peptide CD4M30, CD4M33 und CD4M35 der vorliegenden Erfindung zeigten eine antiretrovirale Aktivität (Tabelle 3) in den mit PHA-P aktivierten und mit dem Stamm HIV-1_LAI infizierten Kulturen der PBMC. Die Verbindung CD4M33 ist die am stärksten antivirale der drei bei den verschiedenen Dosen getesteten. Ihre Aktivität ist kleiner als die von AZT: ED₅₀ = 100-500 nM ggb. AZT: ED₅₀ = 3 nM (Tabelle 3 nachstehend), ist aber mindestens Logarithmus von 1 zur Basis 10 größer als die des CD4-Rezeptorderivats SAH-CD4.
Die 5A–C fassen die erhaltenen Ergebnisse zusammen: prozentuelle Hemmung (% I) als Funktion der Konzentration des Peptids in nM.
c. Antiretrovirale Aktivität der Verbindung CD4M33 bezüglich des klinischen Isolats HIV-1_LEN
c1. Wirkungen von AZT auf die Replikation des Isolats HIV-1_LEN in PBMC.
AZT hemmt die Replikation des Stamms HIV-1_LEN in den mit PHA-P aktivierten und mit dem Stamm HIV-1_LEN infizierten PBMC stark mit einer ED₅₀ von 2,2 nM (Tabelle 4). Der Hemmungsgrad ist mit dem bezüglich des Referenzstamms mit Lymphozytentrophismus, HIV-1_LAI, identisch.
c2. Wirkungen des Mimetikums CD4M33 auf die Replikation des klinischen Isolats HIV-1_LEN in PBMC
Die retrovirale Aktivität des Mimetikums CD4M33 bezüglich der mit PHA-P aktivierten und mit dem Isolat HIV-1_LEN infizierten PBMC entspricht einer dosisabhängigen Abnahme der Virusreplikation und einer ED₅₀ von 367 nM (Tabelle 4). Das Mimetikum CD4M33 bewahrt daher eine bedeutende Anti-HIV-1-Aktivität, selbst obschon gefunden wurde, daß sie verglichen mit der des Stamms HIV-1_LAI geringfügig niedriger war.
Diese Versuche zeigen, daß diese Peptide der vorliegenden Erfindung die Infektion der Zellen selbst bei hohen Virusdosen mit ED₅₀-Werten von 900-35 nM (Tabelle 3 nachstehend) hemmen können. Das Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung ist das am stärksten antivirale und seine ED₅₀ ist ungefähr 100 nM für die Standardvirusdosen für eine Infektion (4a–c, Tabelle 3 nachstehend).
Außerdem besitzt das Peptid CD4M33 eine antiretrovirale Aktivität, die Logarithmus von 1 zur Basis 10 größer als die bei einem anderen CD4-Rezeptoderivat, SAH-CD4, beobachtete ist und zeigte insbesondere eine bedeutende Anti-HIV-Aktivität bezüglich eines klinischen Isolats (Tabelle 4).
Schlußendlich zeigt das Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung, das an das rekombinante Virusprotein gp120 mit einer Kd von 2,4–8,0 nM (Oberflächenplasmonresonanzversuche) binden und die Wechselwirkung zwischen den rekombinanten CD4-gp120-Proteinen im ELISA mit einer IC₅₀ von 120-250 pM hemmen kann, auch die Fähigkeit, diese Wechselwirkung in primären Kulturen humaner Zellen zu hemmen, den ersten Schritt des Eindringens zu hemmen und daher die Infektion selbst eines klinischen HIV-1-Isolats zu hemmen.
Tabelle 2
Wirkung von AZT auf die Replikation des Stamms HIV-1_LAI in durch PHA-P aktivierten PBMC. Die Ergebnisse sind als Prozent Hemmung ± Standardabweichung ausgedrückt.

AZT (nM) % Hemmung

1 39 + 10%

10 59 + 28%

100 87 ± 18%

100 100 ± 0%

10 000 100 ± 0%
Tabelle 3
Wirksame Dosen 50% (ED₅₀) der Peptide der vorliegenden Erfindung und von AZT in Kulturen humaner, peripherer, mononukleärer Blutzellen (PBMC), die mit Phytohämagglutinin-P (PHA-P) aktiviert und mit dem Stamm HIV-1_LAI bei verschiedenen infektiösen Dosen (TCID₅₀: infektiöse Gewebekulturdosis 50%) infiziert wurden:

ED₅₀(nM)

Sequenzen 100 TCID₅₀ 50 TCID₅₀ 10 TCID₅₀

CD4M30 894 235 253

CD4M33 534 133 118

CD4M35 154 428 266

AZT 14 3 5
Tabelle 4
Wirkung von AZT und des Mimetikums CD4M33 auf die Replikation des klinischen Isolats HIV-1_LEN in Kulturen humaner, peripherer, mononukleärer Blutzellen (PBMC), die mit Phytohämagglutinin-P (PHA-P). Die Zellen wurden mit 50 TCID₅₀ des Virus infiziert:

HIV-1_LEM AZT CD4M33

ED₅₀ (nM) 2,2 367

ED₇₀(nM) 4,8 542

D₉₀ (nM) 16,5 1006
Beispiel 8: Freilegen antigener Stellen der Hülle
Zum Ermitteln der Fähigkeit des Peptids CD4M33 der vorliegenden Erfindung zum Auslösen konformativer Änderungen bei dem gp120-Protein, das durch das Freilegen gegenüber neutralisierenden Antikörpern sensibler Epitope gekennzeichnet ist, nahm man sich der Wechselwirkung derartiger humaner Antikörper, 48d und CG10, mit der HIV-Hülle in Gegenwart von CD4M33 und zum Vergleich von rekombinantem CD4 mittels der Oberflächenplasmonresonanztechnik an. Die Antikörper 48d und CG10 wurden kovalent an die Oberfläche der Chips (Biochip) gebunden und die Lösungen von gp120 wurden anschließend in Abwesenheit von CD4 und in Gegenwart eines Überschusses von CD4 und CD4M33 injiziert. Wenn CD4M33 dem Virusprotein gp120_HXB2 in 1,5fachem und 20fachem molaren Überschuß zugesetzt wird, zeigt das Virusprotein eine starke Wechselwirkung mit den Antikörpern (6a–b). Andererseits wechselwirkt das Hüllprotein in seiner Abwesenheit (und in Abwesenheit von löslichem CD4) sehr schwach mit den Antikörpern (6a–b). Außerdem ist die Wirkung des Zusetzens von CD4M33 auf die Zunahme der Affinität der Wechselwirkung des Virusproteins gp120 mit den Antikörpern mit der vergleichbar, die durch Zusetzen äquivalenter Mengen von löslichem CD4 erhalten wird.
Die Erfinder führten ebenfalls ähnliche Plasmonresonanzversuche direkt durch Verwenden von HIV-1, Stamm HXB2 durch. 4 zeigt die bei diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse und zeigt die Entwicklung des Plasmonresonanzsignals als Funktion der Zeit nach der Wechselwirkung einer Suspension von HIV-1_HXB2-Virusteilchen mit einem Chip, der die immobilisierten Antikörper 48d und CG10 aufweist: HIV-1 wechselwirkt mit den Antikörpern erst nach der Inkubation mit dem Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung und andererseits ist die Wechselwirkung in seiner Abwesenheit oder in Gegenwart des inaktiven Peptids [Ala23]CD4M9 praktisch null.
Die Oberflächenplasmonresonanztechnik ermöglicht daher zu zeigen, daß das Binden von CD4M33 an das Hüllprotein gp120 eine Modifikation des Virusproteins auslösen kann, das nachfolgend den aus mit HIV-1 infizierten Personen isolierten neutralisierenden Antikörpern (17b, CG10) bevorzugt bestimmte Moleküloberflächen darbietet [11], [12], [13].
Das durch das Peptid CD4M33 der vorliegenden Erfindung ausgelöste Freilegen dieser verborgenen Epitope ist sowohl bei dem Protein der Hülle in rekombinanter Form als auch in der Hülle der Virionen wirksam. Außerdem stellt im Hinblick auf die kürzlichen Versuche, die zeigen, daß das mit CD4 komplexierte gp120-Protein eine Molekülform sein kann, die die Bildung neutralisierender Antikörper auslösen kann [31, 32, 33], der CD4M33-gp120-Komplex daher einen sehr vorteilhaften Kandidaten als Immunogen zum Induzieren neutralisierender Antikörper insbesondere bei einer Vakzinanwendung dar.
CD4M33 besitzt wie lösliches CD4 die Eigenschaft des Aufdeckens von Epitopen des Virusproteins gp120 mit dem Vorteil, daß es keine Immunantwort gegen CD4 auslösen kann und daß es außerdem aufgrund seiner kleinen Größe einen sogar noch leichteren Zugang zu den unaufgedeckten Epitopen des Virusproteins gp120 ermöglicht.
Beispiel 9: Synthese eines chromatographischen Trägers zum Reinigen der HIV-Virushülle
Zum Ermitteln der Möglichkeit des Verwendens des CD4-mimetischen Peptids der vorliegenden Erfindung als immobilisierter Ligand zum Funktionalisieren einer chromatographischen Matrix zum Reinigen des Virusproteins gp120 wurde ein hydrophiler poly merer Träger, Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Schweden), mit einem unserer vier CD4-Mimetika funktionalisiert und anschließend zum Binden des Virusproteins gp120 direkt aus dem Virusprotein-Kulturmedium verwendet. Zum Vermeiden des Anwendens von Bedingungen, die während der Elution des gp120-Proteins von dem Träger zu drastisch sind und um daher die Möglichkeiten einer Denaturierung einzuschränken, wurde ein Ligand mit einer niedrigeren Affinität für das Virusprotein gp120 gewählt. Es ist CD4M9, das nach dem ELISA eine Affinität (IC₅₀) für das Virusprotein gp120 zwischen 0,1 μM und 1,0 μM in Abhängigkeit von dem HIV-1-Isolat zeigt. CD4M9 wurde in der Position Lys11, das bereits bei den vorangehenden Markierungen verwendet wurde, modifiziert, um so eine weitere Thiolgruppe einzuschließen (in Beispiel 1 beschrieben), die anschließend wie nachstehend beschrieben zu ihrer kovalenten Immobilisierung auf dem Träger Sepharose 4B verwendet wurde.
Das Harz EAH Sepharose (Warenzeichen) (durch Pharmacia Biotech vertrieben), das 7 bis 12 μMol primäre Aminfunktionen je ml trockenes Harz umfaßt, wird mit einer Maleimidgruppe funktionalisiert. Dazu wurden 12 ml in 24 ml Wasser voräquilibriertes Harz 12 h mit 1,05 mg des Reagenzes Sulpho-SMCC (3-Sulfo-N-hydroxysuccinimidester der 4-(N-Maleimidoethyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Sigma)) behandelt, wobei der pH bei ungefähr 4,5 gehalten wurde. Der erwartete Substitutionsgrad ist 200 nMol Maleimidfunktionen je ml trockenes Harz. Das überschüssige Reagenz wird anschließend durch aufeinanderfolgende Wäschen mit 100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH, 8,0, und anschließend mit einem 500 nM NaCl enthaltenden 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,0, entfernt. Die restlichen freien Aminfunktionen werden dann durch zwei Behandlungen mit 1%iger Acetanhydridlösung acetyliert. 3,8 mg thioliertes Peptid CD4M9 werden dem mit Maleimid funktionalisierten Harz zugesetzt. Die Reaktion wird 12 Stunden bei 4°C gerührt. Das Harz wird anschließend mit dem Puffer 20 mM Natriumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,4, gewaschen und äquilibriert. Eine Chromatographiesäule von 6,0 ml wurde mit dieser Matrix hergestellt, die ungefähr 0,1 mg/ml immobilisiertes Peptid CD4M9 gemäß der vorliegenden Erfindung enthielt. Diese Säule wurde anschließend mit dem gp120-Kulturmedium beladen und das auf der Säule zurückgehaltene Virusprotein wurde anschließend durch Behandlung mit 0,5 M Essigsäure aus der Säure eluiert. Die mit der Essigsäure eluierten Fraktionen wurden anschließend durch SDS-PAGE analysiert und dann lyophilisiert. Die Analyse dieser Fraktionen zeigte, daß sie das Virusprotein gp120 enthielten.
8 ist eine Graphik, die das in diesem Beispiel erhaltene chromatographische Profil darstellt: Absorption bei 280 nm (A280) als Funktion der Zeit in Minuten (t(min)).
Das chromatographische Profil in 8 zeigt mehrere Hüllprotein-Elutionspeaks. Die Erfinder nehmen an, daß die verschiedenen Peaks das Virusprotein gp120 bei verschiedenen Graden einer durch die bei der Elution von der Säule verwendete Essigsäure hervorgerufenen Denaturierung darstellen.
Beispiel 10: Durchmusterung
Moleküle der vorliegenden Erfindung wurden mit Fluorescein oder Biotin markiert, ohne die Affinität zum Binden an das Virusprotein gp120 zu verändern.
Bei diesem Beispiel wird das Markieren mit fluoreszierenden Lanthanidmetallen oder radioaktiven Isotopen durchgeführt, ohne die Bindungsaktivität der Peptide der vorliegenden Erfindung bezüglich des Viruspeptids gp120 zu ändern. Diese markierten Peptide werden als Tracer bei Versuchen zum kompetitiven Durchmustern der Wechselwirkung dieser Peptide mit dem Virusprotein gp120 verwendet.
Bei einem ersten Versuch wird das Virusprotein gp120 in 96-Näpfchen-Mikrotiterplatten immobilisiert und das mit dem Lanthanid Europium(III) markierte Peptid CD4M33 wird mit diesem Protein unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Wechselwirkung zwischen dem Peptid CD4M33 und dem gp120-Protein erlauben. Signalmessungen (zum Beispiel nach der Zeit aufgelöste Fluoreszenzmessungen) ermöglichen das zahlenmäßige Bestimmen der Fähigkeit der durchmusterten Moleküle zum Ersetzen der markierten Peptide.
Bei einem zweiten Versuch wird das Peptid CD4M33 mit Fluorescein markiert und an das Virusprotein gp120 gebunden und wird durch Messungen der Fluoreszenzpolarisation in Lösung in miniaturisierten Systemen nachgewiesen.
Diese beiden Systeme, die zum Durchmustern auf Moleküle verwendet werden, die die CD4-gp120-Wechselwirkung hemmen können, sind nicht begrenzt. Die durch dieses Durchmustern nachgewiesenen Moleküle stellen Inhibitoren der CD4-gp120-Wechselwirkung und daher mögliche Inhibitoren der Virusinfektion dar.
Die in diesem Beispiel verwendeten Techniken zur Durchführung werden in der Literatur, insbesondere in den Dokumenten [37, 38, 39 und 40] beschrieben.
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SEQUENZLISTE

Claims

Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Sequenz (I) umfaßt: TPA-Xaa^a-Xaa^b-Ala oder Gln oder His-Arg oder Phe- Cys-Xaa^c-Xaa^d-Arg-Cys-Lys-Xaa^e-Xaa^f- Xaa^g-Xaa^h-Leu oder Lys-Xaaⁱ-Lys-Cys-Ala oder Gln-Gly oder (D)Asp oder Ser-Ser oder His oder Asn- Xaa^j-Cys-Thr oder Ala-Cys-Xaa^k-NH₂, worin TPA Thiopropionsäure darstellt, Xaa^a, Xaa^b, Xaa^c, Xaa^d, Xaa^e, Xaa^f, Xaa^g, Xaa^h und Xaaⁱ natürliche oder nicht-natürliche, gleiche oder verschiedene Aminosäuren sind, Xaa^jβ-Naphthylalanin oder Phenylalanin oder Diphenylalanin darstellt und Xaa^k Gly oder Val oder Ile darstellt.
Peptid gemäß Anspruch 1, wobei Sequenz (I) weiter einen mit dem Rest Xaa^k verbundenen Prolinrest umfassen kann.
Peptid gemäß Anspruch 1, worin Xaaⁱ Gly ist.
Peptid umfassend eine Sequenz, die aus den Sequenzen ID Nr. 4, ID Nr. 5, ID Nr. 6, ID Nr. 7, ID Nr. 8, ID Nr. 9, ID Nr. 10, ID Nr. 11, ID Nr. 12, ID Nr. 13, ID Nr. 14, ID Nr. 15 und ID Nr. 16 der beigefügten Sequenzliste ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren eine chemische Festphasensynthese des Peptids umfaßt.
Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Herstellen eines Arzneimittels.
Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Herstellen eines antiviralen Mittels.
Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Herstellen eines zur Behandlung von AIDS bestimmten Mittels.
Vakzin umfassend einen Komplex aus einem Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und einem Hüllprotein eines Virus.
Vakzin gemäß Anspruch 9, wobei das Virus ein AIDS-Virus ist.
Verwendung in vitro eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Nachweis von Molekülen der Virushülle des HIV.
Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Herstellen eines diagnostischen Produkts.
Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 als immobilisierter Ligand zum Funktionalisieren einer chromatographischen Matrix.
Verwendung in vitro eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 bei einem Durchmusterungsverfahren.