DE69632815T2

DE69632815T2 - gC1q-REZEPTOR, DARAN BINDENDE HIV-1 gp120-REGION, VERWANDTE PEPTIDE UND ANTIKÖRPER

Info

Publication number: DE69632815T2
Application number: DE69632815T
Authority: DE
Inventors: S. Michael FUNG; N. Bill SUN; R. Cecily SUN; Woo Young KIM; Liming Yu
Original assignee: Tanox Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2016-03-23
Also published as: JPH11502414A; CN1179163A; US5652333A; EP0815125B1; US5728814A; US5739306A; CN1508151A; KR19980703260A; US5731428A; CN1150207C; KR100415423B1; EP0815125A1; EP0815125A4; WO1996030400A1; DE69632815D1; AU5320196A; US5691447A; ATE270303T1; CN1221566C

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft (1) Peptide, die an HIV-1-gp120 binden und die auf dem gC1q-Rezeptor (gC1q-R) basieren, sowie Antikörper gegen solche Peptide; (2) mit HIV-1-gp120 verwandte Peptide, die an den gC1q-R binden, sowie Antikörper gegen solche Peptide.
Hintergrund der Erfindung
C1q ist ein Bestandteil des C1-Komplexes des klassischen Komplementweges (R. B. Sim und K. B. M. Reid, Immunology Today 1991; 12: 307–311). Die biologischen Funktionen von C1q sind mannigfaltig und umfassen den Start der Komplementkaskade für die Opsonierung und die Cytolyse, sowie die Vermittlung mehrerer unterschiedlicher Funktionen in Abhängigkeit von den Zellarten, die den C1q-Rezeptor exprimieren. C1q verstärkt die durch FcR und CR1 vermittelte Phagocytose in Monocyten/Makrophagen (D. A. Bobak et al., Eur. J. Immunol. 1988; 18: 2001–2007; D. A. Bobak et al., J. Immunol. 1987; 138: 1150–1156), stimuliert die Immunglobulin-Produktion durch B-Zellen (K. R. Young et al., J. Immunol. 1991; 146: 3356–3364), aktiviert Blutplättchen αIIb/β₃-Integrine, P-Selektin und Prokoagulanz-Aktivität zu exprimieren (E. I. B. Peerschke et al., J. Exp. Med. 1993; 178: 579–587; E. I. B. Peerschke et al., J. Immunol. 1994; 152: 5896–5901), aktiviert die Tumor-Cytotoxizität von Makrophagen (R. W. Leu et al., J. Immunol. 1990; 144: 2281–2286) und übt antiproliferative Wirkungen auf das Wachstum von T-Zellen aus (A. Chen et al., J. Immunol. 1994; 153: 1430–1440).
Ein Rezeptor von 33 Kilodalton (kD), der als gC1q-R bezeichnet wurde, und der an den globulären Kopf von C1q-Molekülen bindet, wurde vor Kurzem identifiziert, cloniert und sequenziert (B. Ghebrehiwet et al., J. Exp. Med. 1994; 179: 1809–1821; E. I. B. Peerschke et al., J. Immunol. 1994; 152: 5896–5901; A. Chen et al., J. Immunol. 1994; 153: 1430–1440). Ein weiterer Rezeptor von 60 kD, der als cC1q-R bezeichnet wurde, bindet an den aminoterminalen Kollagen-ähnlichen Bereich von C1q (B. Ghebrehiwet, Behring Inst. Mitt. 1989; 84: 204–215; A. Chen et al., J. Immunol. 1994; 153: 1430–1440). Aufgrund des Nachweises der gC1q-R-mRNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation und des Nachweises der Expression des gC1q-R-Proteins durch immunchemische Verfahren wurde gefunden, dass sich dieser Rezeptor auf einer großen Zahl unterschiedlicher Zellarten befindet, wie z. B. auf B-Zellen, T-Zellen, Monocyten/Makrophagen, Neutrophilen, Eosinophilen, Fibrobasten, Blutplättchen, Endothelzellen, Leberzellen, Neuralzellen und glatten Muskelzellen. Es war jedoch nicht bekannt, dass der gC1q-R an HIV-1-gp120 bindet und die Infektiosität von HIV-1 neutralisiert.
Es ist wohlbekannt, dass das CD4-Antigen, das vorwiegend auf der Oberfläche von Helfer/Induktor-T-Zellen exprimiert wird, den primären Rezeptor für HIV-1-gp120 darstellt (P. J. Maddon et al., Cell 1986; 47: 333–385; J. S. McDougal et al., Science 1986; 231: 382–385). Neben den CD4⁺-T-Zellen kann HIV-1 an eine Anzahl anderer Zellarten binden und sie infizieren, wie z. B. an Monocyten/Makrophagen, B-Zellen, Colon-Epithelzellen und Zellen der Neuroglia, die entweder nicht nachweisbare oder bestenfalls niedrige Spiegel von CD4 an der Zelloberfläche exprimieren. Es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene andere Rezeptoren mit der HIV-1-Infektion von Zielzellen verbunden sind, wie z. B. Galactosylceramid (Gal-Cer) auf der Oberfläche von menschlichen Colon-Epithelzellen, Schwann-Zellen und Oligodendrocyten (N. Yahl et al., Virology 1994; 204: 550–557; J. M. Harouse et al., Science 1991; 253: 320–323), menschliche Immunglobulin-V_H3-Genprodukte des IgM-Isotyps (Mol. Gew.: 950 kD) auf B-Zellen (L. Berberian et al., Science 1993; 261: 1588–1591), CD26 (Mol. Gew.: 110 kD) auf aktivierten T- und B-Zellen (C. Callebaut et al., Science 1993; 262: 2045–2050) und ein Membran assoziiertes C-Typ-Lektin (Mol. Gew.: 46 kD), das sich vorwiegend auf Makrophagen befindet (B. M. Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 8356–8360).
Die Erfindung wurde im Verlauf von Forschungen gemacht, die dazu dienten, zelluläre bindende Proteine oder Rezeptoren für HIV-1-gp120 auf Zellen zu finden, die CD4 nicht exprimieren. Zu diesem Zweck wurden Lysate von CEM-SS-Zellen (bei denen es sich um T-Zellen handelt, welche einen hohen Spiegel an CD4 auf der Zelloberfläche exprimieren), die von P. J. Nara (AIDS Res. Hum. Retroviruses 1987; 3: 283–302) erhalten wurden, und DAKIKI-Zellen (bei denen es sich um CD4-negative B-Zellen handelt), die von der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) erhalten wurden, über Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt, und die aufgetrennten Proteine wurden auf Nitrocellulose-Membranen zur Western-Immunblot-Analyse übertragen. Es wurde gefunden, dass aus rekombinanten oder aus mit HIV-1 infizierten Zellen stammendes gp120 mit einer Proteinbande von 32–33 kD sowohl bei CEM-SS- als auch bei DAKIKI-Zell-Lysaten reagierte, die sich deutlich von der 55 kD-Proteinbande unterschied, die mit monoclonalen anti-Mensch-CD4-Antikörpern reagiert.
Um dieses neue gp120 bindende Protein zur Identifizierung über N-terminale Aminosäure-Sequenzierung zu reinigen, wurde eine große Menge an DAKIKI-Zelllysat hergestellt. Das gp120 bindende Protein wurde über präparative Elektrophorese unter Verwendung des Prep Cell-Modells 491 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Kalifornien) teilweise gereinigt. Dann wurde die Probe über eine zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran für die Western-Immunblot-Analyse und die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung übertragen, um den mit gp120 reagierenden Proteinfleck zu identifizieren. Es wurde bestimmt, dass die Sequenz der ersten 15 Aminosäuren am N-Terminus des mit gp120 reagierenden Proteins mit dem eines Proteins identisch war, das vorher als p32 (Mol. Gew.: 32 kD) identifiziert worden war und das zusammen mit einem menschlichen prä-mRNA-Spleißfaktor durch A. R. Krainer et al. (Cell 1991; 66: 383–394) und B. Honoré et al. (Gene 1993; 134: 282–287) gereinigt worden war. Weitere Experimente enthüllten, dass DAKIKI-Zellen mit anti-p32-Immunglobulinen aus Kaninchen angefärbt werden können, die unter Verwendung von in E. coli exprimiertem und gereinigtem p32 als Immunogen hergestellt worden waren, was zeigt, dass p32 auf der Oberfläche von DAKIKI-Zellen vorliegt. Es wurde auch gezeigt, dass DAKIKI-Zellen rekombinantes HIV-1-gp120 binden, obwohl die Zellen kein nachweisbares CD4 auf der Zelloberfläche exprimieren, wie durch Immunfluoreszenz-Verfahren gezeigt wurde. Zusammengefaßt zeigen diese Befunde, dass p32 ein alternatives Bindeprotein für HIV-1-gp120 auf der Zelloberfläche darstellt. Anschließend wurde bestimmt, dass p32 die gleiche Sequenz wie der gC1q-R (SEQ ID Nr. 1) aufweist (B. B. Ghebrehiwet et al., J. Exp. Med. 1994; 179: 1809–1821).
Die Vorstufe oder das Präproprotein des gC1q-R besitzt 282 Aminosäuren (AS) und das funktionelle, reife Protein besitzt 209 AS. Das reife Protein enthält den Peptidanteil zwischen den Aminosäurereste-Nrn. 74 (Leucin) und 282 (Glutamin) der SEQ ID Nr. 1. Das reife gC1q-R-Protein ist stark geladen und sauer. Es besitzt drei potentielle N-Glycosylierungsstellen an den Aminosäure-Positionen: 114, 136 und 223. Als Folge davon beträgt das scheinbare Molekulargewicht des gC1q-R bei der SDS-PAGE 32 kD statt 24,3 kD, wie sich aufgrund der Aminosäure-Zusammensetzung berechnen läßt. Da das reife Protein nur einen Cysteinrest an Position 186 besitzt, gibt es keine Disulfid-Bindung innerhalb der Proteinkette. Der gC1q-R findet sich in einer großen Vielzahl von Zellarten wie z. B. in B-Zellen, T-Zellen, Monocyten/Makrophagen, Eosinophilen, Neutrophilen, Blutplättchen, Endothelzellen, Fibroblasten und Leberzellen.
Insoweit wie der gC1q-R mit vielfältigen immunologischen und physiologischen Funktionen verbunden ist, kann die Wechselwirkung zwischen dem gC1q-R und HIV-gp120 für einige der immunologischen und physiologischen Dysfunktionen verantwortlich gemacht werden, die sich in mit HIV-1 infizierten Individuen manifestieren. Sie kann auch zu der bekannten Fähigkeit von HIV-1 führen, eine große Vielzahl von menschlichen Zellen in unterschiedlichen Geweben und Organen zu infizieren, die CD4 nicht exprimieren. Ein Eingriff in die Wechselwirkung zwischen dem gC1q-R und HIV-gp120 stellt eine neue Strategie zur Bekämpfung der HIV-1-Erkrankung dar. Einige Erfindungen, die auf dieser Eingriffsstrategie basieren, werden nachstehend diskutiert.
Krainer et al. (Cell, Bd. 66 (1991), Seiten 383–394), Honore et al. (Gene, Bd. 134 (1993), Seiten 283–287) und Ghebrehiwet et al. (Journal of Experimental Medicine, Bd. 179 (1994), Seiten 1809–1821) offenbaren Aminosäuresequenzen, welche die Sequenz der SEQ ID Nr. 2 umfaßt.
Die Patentanmeldungen WO 9104273, WO 9422477, EP 0354109 , WO 9428929, Leonard et al. (Journal of Biological Chemistry, Bd. 265, Nr. 18 (1990), Seiten 10373–10382) und Korber et al. (Journal of Virology, Bd. 68, Nr. 11 (1994), Seiten 7467–7481) betreffen die Diagnose und die Behandlung von HIV-Infektionen. Diese Dokumente offenbaren Aminosäuresequenzen, welche die Sequenz der SEQ ID Nr. 3 umfaßt. Insbesondere offenbart D5 ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüll-Glycoprotein codiert, sowie Impfstoffe, die das mutierte HIV-1-Hüll-Glycoprotein umfassen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfaßt Immunogene und Peptide, die auf der Bindestelle des gC1q-R für HIV-1-gp120 basieren, und Immunogene und Peptide, die auf der Bindestelle von HIV-1-gp120 für den gC1q-R basieren. Die Sequenz der gC1q-R-Bindestelle für gp120 wird in der SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Die Sequenz der HIV-1-gp120-Bindestelle für den gC1q-R wird in der SEQ ID Nr. 3 gezeigt. Die Erfindung umfaßt ebenfalls Antikörper und bindende Moleküle für alle diese Immunogene und Peptide sowie die Induktion der endogenen Produktion solcher Antikörper. Andere Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nachstehend weiter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restriktionskarte des Vektors pT7-7, der dazu verwendet wurde, die reife Volllängen-Form des gC1q-R (1–209 AS) und seine drei verkürzten Formen in E. coli zu exprimieren. gC1q-R(δ1–57) stellt den gC1q-R (58–209 AS) dar, gC1q-R(C) stellt den gC1q-R (95–209 AS) dar und gC1q-R(N) stellt den gC1q-R (1–94 AS) dar.
2 zeigt die Bindung von HIV-1-gp120 an den gC1q-R, wie sie durch ELISA gemessen wurde. Die Y-Achse stellt die Reaktivität von HIV-1-gp120 mit dem gC1q-R, ausgedrückt als OD bei 450 nm, dar, und die X-Achse ist die Konzentration an HIV-1-gp120 in der Lösung.
3A zeigt die Neutralisierung der Infektiosität von HIV-1-IIIB durch den gC1q-R in CEM-SS-Zellen, wobei Vn die mittlere Anzahl von Syncytien in duplizierten Test-Vertiefungen darstellt und Vo die mittlere Anzahl von Snycytien in duplizierten Kontroll-Vertiefungen ist.
3B zeigt die Neutralisierung der Infektiosität von HIV-1-MN durch den gC1q-R in CEM-SS-Zellen, wobei Vn die mittlere Anzahl von Syncytien in duplizierten Test-Vertiefungen darstellt und Vo die mittlere Anzahl von Snycytien in duplizierten Kontroll-Vertiefungen ist.
3C zeigt die Neutralisierung der Infektiosität von HIV-1-RF durch den gC1q-R in CEM-SS-Zellen, wobei Vn die mittlere Anzahl von Syncytien in duplizierten Test-Vertiefungen darstellt und Vo die mittlere Anzahl von Snycytien in duplizierten Kontroll-Vertiefungen ist.
4 zeigt die Hemmung der Fusion zwischen mit HIV-1-IIIB infizierten H9-Zellen und CD4⁺-HeLa-Zellen durch den gC1q-R.
5 zeigt die Bindung von in E. coli exprimiertem und gereinigtem gC1q-R an mit HIV-1-IIIB infizierte H9-Zellen, wie sie durch Durchfluß-Cytometrie bestimmt wurde.
6 zeigt die Wirkung von C1q auf die Bindung von HIV-1-gp120 an den gC1q-R in einem ELISA. Die Kurve, die mit gefüllten Kreisen markiert ist, stellt C1q dar, und die Kurve, die mit ausgefüllten Quadraten markiert ist, stellt den gC1q-R dar. Die Y-Achse stellt die Reaktivität von gp120 mit dem gC1q-R dar, ausgedrückt als OD bei 450 nm, und die X-Achse ist die Konzentration an C1q und an gC1q-R in der Lösung.
7 zeigt die Reaktivität von HIV-1-gp120 mit unterschiedlichen Formen von in E. coli exprimiertem gC1q-R als Antigen in der Festphase beim ELISA. Die Kurve, die mit ausgefüllten Quadraten markiert ist, stellt die reife Volllängen-Form des gC1q-R (1–209 AS) dar. Die Kurve, die mit ausgefüllten Kreisen markiert ist, zeigt den verkürzten gC1q-R (58–209 AS), der den gC1q-R mit der Deletion der N-terminalen 57 Aminosäuren darstellt. Die Kurve, die mit ausgefüllten Dreiecken markiert ist, stellt das N-terminale Konstrukt gC1q-R (1–94 AS) dar. Die Kurve, die mit umgekehrtenm ausgefüllten Dreiecken markiert ist, stellt das C-terminale Konstrukt gC1q-R (95–209 AS) dar. Die Y-Achse stellt die Reaktivität von HIV-1-gp120 mit den unterschiedlichen Formen des gC1q-R dar, die als OD bei 450 nm ausgedrückt wird, und die X-Achse ist die Konzentration an gp120 in der Lösung.
8 zeigt die Bindung des Antikörpers 99-12-1 an das gC1q-R-Peptid LM12DN. Die mit ausgefüllten Quadraten markierte Kurve stellt das Peptid LM12DN dar, und die mit ausgefüllten Kreisen markierte Kurve stellt das Peptid TD18EE dar. Die Y-Achse stellt die Reaktivität von 99-12-1 mit dem Peptiden dar, ausgedrückt als OD bei 450 nm, und die X-Achse ist die Konzentration an 99-12-1 in der Lösung.
9 zeigt die Konkurrenz um die Bindung des gC1q-R an HIV-1-gp120 durch den monoclonalen anti-gC1q-R-Antikörper 99-12-1.
10 zeigt die Kompetition um die Bindung von HIV-1-gp120 an den gC1q-R durch die anti-HIV-1-gp120-Antikörper G3-299 und 6205. Die mit ausgefüllten Kreisen markierte Kurve stellt den anti-HIV-1-gp120-C4-Region-Antikörper G3-299 dar, die mit ausgefüllten Quadraten markierte Kurve stellt den polyclonalen Antikörper 6205 aus Schaf dar, der gegen das HIV-1-gp120-C5-Region-Peptid (Aminosäurereste-Nrn. von HXB2R: 497–511, SEQ ID Nr. 10) spezifisch ist, und die mit ausgefüllten Dreiecken markierte Kurve stellt das rekombinante lösliche CD4 (rsCD4) dar.
11 zeigt die Reaktivität des gC1q-R mit den HIV-1-gp120-C4-Region-Peptiden RC12LT, TG12NN und RC16GG. Die mit ausgefüllten Dreiecken markierte Kurve stellt RC16GG dar, die mit ausgefüllten Kreisen markierte Kurve stellt TG12NN dar, und die mit ausgefüllten Quadraten markierte Kurve stellt RC12LT dar. Die Y-Achse stellt die Reaktivität des gC1q-R mit den Peptiden dar, ausgedrückt als OD bei 450 nm, und die X-Achse ist die Konzentration an gC1q-R in Lösung.
Herstellung und Anwendung der Erfindung
A. gC1q-R-Peptide
Die vollständige Nucleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des gC1q-R werden in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Der rekombinante gC1q-R, der in E. coli exprimiert wurde und bei den Immunisierungen sowie in anderen nachstehend beschriebenen Beispielen verwendet wurde, besteht aus dem vollständigen C-terminalen Segment, das an dem Leucin mit der Aminosäurereste-Nummer 74 in SEQ ID Nr. 1 beginnt. Dieses Segment stellt das lösliche, reife Protein des gC1q-R dar, das charakterisiert wurde. Das N-terminale Segment könnte einen hydrophoben Membrananker im Präproprotein darstellen.
Das Peptid-Segment, das die Aminosäurereste-Nummern 239 bis 250 der SEQ ID Nr. 1 umfaßt, wurde aufgrund der vollständigen Hemmung der Bindung von gp120 an den gC1q-R durch den monoclonalen anti-gC1q-R-Antikörper 99-12-1 (der an das Peptid der SEQ ID Nr. 2 bindet) als die aktive Bindestelle für gp120 identifiziert, wie nachstehend in Beispiel 10 diskutiert wird.
Die aktive Bindestelle des gC1q-R für gp120 kann als ein eigenständiges Peptid (hierin nachstehend als "die gp120-Bindestelle" bezeichnet) oder irgendein längeres Peptid exprimiert werden, welches die gp120-Bindestelle umfaßt (wie zum Beispiel als das Peptid, das die vollständige gC1q-R-Sequenz darstellt) (vgl. Beispiel 1 nachstehend), oder die gp120-Bindestelle oder solche längeren Peptide können mit einem anderen Protein verbunden werden, wie z. B. mit KHL ("Keyholelimpethemocyanin") oder mit einem anderen Trägermolekül, das seine Immunogenität verstärkt, oder die gp120-Bindestelle kann an ein Peptid oder an ein Molekül gebunden werden, das eine immunogene Konfiguration hervorbringt, um seine Immunogenität zu steigern, oder es kann ein Peptid, das strukturell oder immunologisch zu der gp120-Bindestelle gleichwertig ist, für den gleichen Zweck verwendet werden (alle solche Peptide werden hierin nachstehend als "gp120-Bindestelle-Peptide" bezeichnet).
Die gp120-Bindestelle-Peptide sind bei einem diagnostischen Testansatz zum Nachweis oder zur Quantifizierung von HIV-1-g120, HIV-1-Virionen oder HIV-1 infizierten Zellen nützlich. Ein solcher diagnostischer Testansatz kann ein Standard-Testansatzformat verwenden, wie z. B. ein enzymverbundener Immunadsorptions-Testansatz (ELISA). Bei einem ELISA können die gp120-Bindestelle-Peptide auf inerten, festen Matrices oder an magnetischen Kügelchen immobilisiert werden, entweder direkt oder indirekt über ein quervernetzendes Mittel oder ein spezifisches bindendes Agens. Die Untersuchungsproben mit der biologischen Flüssigkeit werden anschließend mit den beschichteten Matrices inkubiert. Freie HIV-1-gp120-Moleküle oder gp120-Moleküle tragende HIV-1-Virionen, welche mit den gp120-Bindestelle-Peptiden reagieren, werden an die Matrices binden. Die gebundenen HIV-1-gp120-Moleküle oder die HIV-1-Virionen können dann entweder mit monoclonalen oder mit polyclonalen anti-HIV-1-Antikörpern nachgewiesen werden, die anschließend mit Enzym gebundenen sekundären Nachweis-Antikörpern zur Quantifizierung basierend auf einer Farbreaktion umgesetzt werden können. Alternativ können die eingefangenen gp120-Moleküle oder Virionen durch andere Mittel nachgewiesen werden, wie z. B. durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Zählung der Radioaktivität oder über PCR.
Die gp120-Bindestelle-Peptide können auch dazu verwendet werden, mit HIV infizierte Zellen in Blutproben oder in anderen Proben eines Patienten zu quantifizieren, entweder durch direkte oder indirekte immunchemische Verfahren. Zum Beispiel werden bei einem solchen Testansatz die infizierten Zellen mit den gp120-Bindestelle-Peptiden in Verbindung gebracht und dann mit den an sie bindenden Antikörpern markiert. Diese Nachweis-Antikörper können direkt oder indirekt mit einer fluoreszierenden Sonde konjugiert sein. Die Immunfluoreszenz wird anschließend durch Beobachtung der Zellen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop oder durch Durchfluß-Cytometrie-Verfahren nachgewiesen. Alternativ können die gp120-Bindestelle-Peptide direkt mit Enzymen, Radionukliden, Floreszenz-Sonden oder mit Biotin markiert werden. Die markierten Peptide, die an die Zellen gebunden haben, können dann entsprechend gut etablierter Verfahren nachgewiesen werden.
Die gp120-Bindestelle-Peptide oder irgendwelche Derviat-Produkte wie z. B. Konjugate mit einem Toxin (z. B. Ricin A, Diphtherie-Toxin, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A, antivirales Protein der amerikanischen Kermesbeere, einem stark strahlenden Radionuklid (z. B. Iod-131, Indium-111 und Yttrium-90), einem cytotoxischen Arzneistoff (z. B. Doxorubicin), einem Zellmembran-aktiven Molekül (z. B. Phospholipase, Komplement und Saponin) oder in Form von Mikroträgern (wie z. B. Liposomen) können ebenfalls bei der Behandlung der HIV-1-Erkrankung oder zur Vorbeugung einer HIV-1-Infektion verwendet werden. Von dem Peptid, das der vollständigen Sequenz des reifen Proteins des gC1q-R entspricht, wurde gezeigt, dass es die in vitro-Infektiosität verschiedener divergenter HIV-1-Stämme neutralisiert und dass es die Bildung von Syncytien zwischen CD4-postiven Zellen und Zellen, die mit HIV-1-IIIB infiziert sind, hemmt. Vergleiche mit den nachstehenden Beispielen 5 und 6. Es wird auch erwartet, dass die Verabreichung der gp120-Bindestelle-Peptide zur Bindung an gp120 und Neutralisation von HIV-1 führt und ebenfalls verhindert, dass HIV-1 andere Zellen über Zell-Zell-Fusion (Syncytien-Bildung) infiziert. Eine solche Verabreichung angewendet werden, entweder vor oder sofort nach dem Kontakt mit HIV-1, um die Infektion mit HIV-1 zu verhindern oder sie zu hemmen. Bei einer vorbeugenden Verwendung könnte sie als vorbeugende Maßnahme bei Gruppen mit hohem Risiko angewendet werden, wie z. B. bei Benutzern von intravenösen Drogen und an Angestellte im Gesundheitsdienst. Alternativ könnte sie nach einer Stichverletzung mit einer Nadel angewendet werden, um die Infektion zu verhindern, oder direkt vor oder sofort nach der Geburt, um eine Mutter-zu-Kind-Übertragung von HIV-1 zu verhindern.
Die gp120-Bindestelle-Peptide können an feste Matrices konjugiert werden. Diese modifizierten Matrices können außerhalb des Körpers dazu verwendet werden, freie HIV-1-Virionen oder mit HIV-1 infizierte Zellen aus HIV-1-infizierten Individuen zu entfernen, um die Belastung mit Viren zu vermindern.
B. Antikörper gegen qC1q-R-Peptide
Monoclonale oder polyclonale Antikörper gegen den gC1q-R können mit wohlbekannten Verfahren rasch hergestellt werden, wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben wird. Solche monoclonalen Antikörper können unter Verwendung des monovalenten oder des polyvalenten gC1q-R oder der gp120-Bindestelle-Peptide als Immunogen erzeugt werden. Das gC1q-R-Peptid (oder die gp120-Bindestelle-Peptide) können ebenfalls dazu verwendet werden, nach Immunisierung und Fusion auf Hybridome zu durchmustern. Eine andere Alternative besteht darin, Immunogene unter Verwendung irgendeines der gp120-Bindestelle-Peptide oder gleichwertiger Peptide herzustellen, die die Fähigkeit haben, den relevanten Teil der C4-Region von gp120 in Kombination mit einem oder mehreren Trägerproteinen zu binden. Bevorzugte Trägerproteine sind KLH, das Tetanus-Toxoid oder Bacillus Calmette- Guerin (BCG). Rekombinante Proteinantigene wie z. B. solche des Vaccinia-Virus, des Hepatitis B-Virus, des Adenovirus oder des Influenza-Virus können ebenfalls verwendet werden. Diese Träger können chemisch mit den gp120-Bindestelle-Peptiden konjugiert werden, oder das vollständige Träger-Peptid kann durch eine rekombinante Wirtszelle exprimiert werden. Polyclonale Antikörper können unter Verwendung der gp120-Bindestelle-Peptide oder gleichwertiger Peptide als Immunogene in Tieren erzeugt werden (z. B. in Nagetieren, Schafen, Ziegen, Meerschweinchen, Kaninchen und nicht-menschlichen Primaten) (vergleiche mit dem nachstehenden Beispiel 3).
Monoclonale oder polyclonale Antikörper, die für die gp120-Bindestelle des gC1q-R spezifisch sind, können ebenfalls durch die Immunisierung von Tieren mit Deoxyoligonucleotiden erzeugt werden, die die gp120-Bindestelle-Peptide als DNA-Immunogene codieren (J. J. Donnelly et al., J. Immunol. Meth. 1994; 176: 145–152). Die spezifischen Oligonucleotide, die den gC1q-R codieren, können zusammen mit anderen Expressionsvektoren (z. B. Vaccinia-Virus, Hepatitis B-Virus, Cytomegalievirus, Retroviren oder Adenoviren) zur Verstärkung der Expression und zur gezielten Steuerung der Gene konstruiert werden. Alternativ können die direkte intramuskuläre Injektion, mechanische Verfahren wie z. B. Hochgeschwindigkeit-Gold-Mikroprojektile, die mit DNA beschichtet sind, zur Transfektion der Epidermis oder ex-vivo-Transfektionen durch chemische (z. B. Calciumphosphat) oder elektrische Mittel dazu verwendet werden, die Oligonucleotide in die Wirtszellen zur Expression von Antigenen einzuschleußen, um eine spezifische Antikörper-Antwort zu induzieren.
Solche monoclonalen oder polyclonalen Antikörper können vielseitig verwendet werden. Sie können verwendet werden, um Zellen nachzuweisen, die den gC1q-Rezeptor exprimieren, wie z. B. B-Zellen, T-Zellen, Monocyten/Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Fibroblasten, Blutplättchen und Endothel- und glatte Muskelzellen; dies erfolgt unter Verwendung eines Immunfluoreszenz-Testansatzformats oder anderer Verfahren, wie vorstehend beschrieben. Von dem monoclonalen Antikörper 99-12-1, der mit dem gC1q-R reagiert, wurde gezeigt, dass er mit gp120 um die Bindung an den gC1q-R kompetitiert (vergleiche die Experimente, die nachstehend in Beispiel 11 beschrieben werden). Somit können sie auch zur Behandlung der HIV-1-Erkankung, oder, wenn sie vorbeugend verabreicht werden, entweder vor oder sofort nach dem Kontakt mit HIV-1 verwendet werden, um einer Infektion mit HIV-1 vorzubeugen oder um sie zu verhindern.
Wenn sie zur Behandlung der HIV-1-Erkrankung oder zur Vorbeugung einer Infektion in Menschen verwendet werden, werden sie bevorzugt entweder in Form von chimären, humanisierten oder menschlichen Antikörpern verwendet. Chimäre Antikörper werden über rekombinante Verfahren erzeugt, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, und besitzen eine variable Region aus einem Tier und eine konstante Region aus dem Menschen. Humanisierte Antikörper besitzen einen höheren Anteil an menschlichen Peptidsequenzen als chimäre Antikörper. In einem humanisierten Antikörper stammen nur die die Komplementaritäts bestimmenden Regionen (CDRs), die für die Bindung des Antikörpers und seine Spezifität verantwortlich sind, von einem Tier und besitzen eine Aminosäuresequenz, die dem des tierischen Antikörpers entspricht, und im Wesentlichen alle der verbleibenden Teile des Moleküls stammen aus dem Menschen und entsprechen in ihrer Aminosäuresequenz einem menschlichen Antikörper. Vergleiche mit L. Riechmann et al., Nature 1988; 332: 323–327; G. Winter, Patent Nr. 5,225,539 Vereinigten Staaten; C. Queen et al., Internationales Patent Nr. WO 90/07861.
Menschliche Antikörper können über mehrere unterschiedliche Wege hergestellt werden, einschließlich der Verwendung von menschlichen Immunglobulin-Expressions-Genbanken (Stratagene Corp., La Jolla, Kalifornien), um Fragmente menschlicher Antikörper herzustellen (V_H, V_L, F_V, Fd, Fab oder F(ab')₂), und der Verwendung dieser Fragmente, um vollständige menschliche Antikörper unter Verwendung von Verfahren herzustellen, die ähnlich denjenigen sind, die zur Herstellung chimärer Antikörper dienen. Menschliche Antikörper können auch in transgenen Mäusen mit einem menschlichen Immunglobulin-Genom hergestellt werden, welche durch GenPharm International (Mountain View, Kalifornien) erzeugt werden. Diese Tiere werden mit den gp120-Bindestelle-Peptiden immunisiert. In den geimpften Tieren, die die Immunogene erhalten haben, können menschliche Antikörper gegen die gp120-Bindestelle-Peptide gefunden werden. Aus den B-Zellen der Spender können Hybridome oder mit EBV transformierte B-Zelllinien entwickelt werden. Menschliche Antikörper können ebenfalls durch kombinatorische Genbank- Verfahren (T. A. Collet et al., Prac. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 10026–10030) unter Verwendung der mRNAs erzeugt werden, die für die schwere und die leichte Kette der anti-gp120-Bindestelle-Antikörper codieren. Diese mRNAs können aus den B-Zellen der immunisierten Tiere, wie vorstehend beschrieben, erhalten werden.
Alternativ kann man bindende Einzelketten-Peptid-Moleküle erzeugen, bei denen die Fv-Regionen der schweren und der leichten Kette miteinander verbunden sind (J. S. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983; 85: 5879–5883). Alle der vollständig und der teilweise menschlichen Antikörper sind weniger immunogen als monoclonale Antikörper, die vollständig murin sind, und die Fragmente und die einzelkettigen Antikörper sind ebenfalls weniger immunogen. Von allen diesen Arten an Antikörpern ist es daher weniger wahrscheinlich, dass sie eine Immunantwort oder eine allergische Reaktion hervorrufen. Folglich sind sie beim Menschen besser zur Verabreichung in vivo geeignet als vollständig tierische Antikörper, insbesondere, wenn eine wiederholte oder eine Langzeit-Verabreichung notwendig ist.
Antikörper gegen die gp120-Bindestelle-Peptide können Tieren (z. B. Mäusen) injiziert werden, um anti-idiotypische monoclonale Antikörper zu erzeugen. Diese anti-Idiotypen können das ursprüngliche Antigen nachbilden und können daher als Immunogene, um Antikörper gegen die gp120-Bindestelle zu erzeugen, oder als gC1q-R verwendet werden, um die HIV-1-Infektion zu blockieren.
C. HIV-1-gp120-Peptide, die an den gC1q-R binden
Von einem rekombinanten Peptid, das die Sequenz der Aminosäurereste-Nrn. 444 bis 459 von HIV-1-gp120 des Stammes HXB2R besitzt und das in der SEQ ID Nr. 3 gezeigt wird, wurde durch das nachstehend in Beispiel 13 beschriebene Verfahren bestimmt, dass es an den gC1q-R bindet. Dieses Peptid-Segment befindet sich in der Region von gp120, die als C4 bezeichnet wird (C. K. Leonard et al., J. Biol. Chem. 1990; 265: 10373–10382). Dieses Peptid wird hierin nachstehend als "das gC1q-R-Bindestelle-Peptid" bezeichnet. Ein solches Peptid oder längere, dieses Peptid enthaltende Peptide oder gleichwertige Peptide, mit der Fähigkeit, an den gC1q-R zu binden, könnten als Immunogene verwendet werden, um monoclonale oder polyclonale Antikörper zu erzeugen, die gegen eine solche gp120-Region gerichtet sind.
Ein rekombinantes Peptid, das die Sequenz besitzt, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt wird, oder längere Peptide einschließlich solcher Peptide oder gleichwertiger Peptide mit der Fähigkeit, an den gC1q-R zu binden, oder andere Immunogene, die auf solchen Peptiden basieren (zum Beispiel solche, die durch Konjugation dieser Peptide mit bevorzugten Trägerproteinen wie z. B. KLH, Tetanus-Toxoid oder BCG hergestellt wurden oder diese als Teil einer immunogenen Struktur enthalten, wie z. B. defekte oder abgeschwächte Formen des Hepatitis B-Virus, des Adenovirus oder des Grippevirus), könnten als Impfstoffe gegen HIV-1, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden. Diese Träger können chemisch mit den gp120-Bindestelle-Peptiden konjugiert werden, oder das vollständige Träger-Peptid kann in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert werden. Wenn sie als Impfstoffe verwendet werden, würden sie endogen Antikörper erzeugen, und die erzeugten Antikörper würden an die gC1q-R-Bindestelle von gp120 binden und HIV-1 neutralisieren, oder sie werden an mit HIV-1 infizierte Zellen binden, um die Übertragung der Viren durch Zell-Zell-Fusion zu hemmen oder um infizierte Zellen durch die Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC) oder die Komplement vermittelte Cytolyse (CMC) abzutöten.
Monoclonale oder polyclonale Antikörper, die gegen die Bindestelle von gp120 für den gC1q-R spezifisch sind, können auch durch die Immunisierung von Tieren mit Desoxynucleotiden, die die gC1q-R-Bindestelle-Peptide codieren, als DNA-Immunogene erzeugt werden (J. J. Donnelly et al., J. Immunol. Meth. 1994; 176: 145–152). Die spezifischen Oligonucleotide, die diesen Teil von gp120 codieren, können zusammen mit anderen Expressionsvektoren (z. B. Vaccinia-Virus, Hepatitis B-Virus, Cytomegalievirus, Retroviren oder Adenoviren) zur Verstärkung der Expression und gezielten Steuerung der Gene konstruiert werden. Alternativ können die direkte intramuskuläre Injektion, mechanische Verfahren, wie z. B. Hochgeschwindigkeits-Gold-Mikroprojektile, die mit DNA beschichtet sind, zur Transfektion der Epidermins oder ex-vivo-Transfektionen durch chemische (z. B. Calciumphosphat) oder elektrische Mittel dazu verwendet werden, die Oligonucleotide in die Wirtszellen zur Expression von Antigenen einzuschleußen, um eine spezifische Antikörper-Antwort zu induzieren.
D. Antikörper gegen HIV-1-gp120-Peptide
Monoclonale Antikörper gegen die SEQ ID Nr. 3, die das gC1q-R-Bindestelle-Peptid darstellt, können mit herkömmlichen Verfahren über die Immunisierung von Tieren (wie z. B. Nagetieren und nicht-menschlichen Primaten) mit gp120 oder mit solchen Peptiden oder mit den vorstehend beschriebenen Immunogenen hergestellt werden. Polyclonale Antikörper können unter Verwendung der wohlbekannten Verfahren, wie vorstehend beschrieben, ebenfalls hergestellt werden.
Monoclonale oder polyclonale Antikörper gegen das gC1q-R-Bindestelle-Peptid (in der C4-Region von gp120) können in Tieren oder in Menschen ebenfalls mit Oligonucleotiden erzeugt werden, die diese Region eine längere Region codieren, wobei diese als DNA-Immunogen oder Impfstoff, wie vorstehend beschrieben, eingesetzt werden.
Diese monoclonalen oder polyclonalen Antikörper können zum Nachweis oder zur Quantifizierung von HIV-1-gp120, HIV-1-Virionen oder HIV-1-infizierten Zellen in einem diagnostischen Testansatz verwendet werden. Bei einem solchen diagnostischen Testansatz kann ein Standard-Testansatzformat, wie z. B. ein ELISA verwendet werden. Der ELISA wird auf ähnliche Weise gestaltet wie der, welcher vorstehend für die gp-120-Bindestelle-Peptide beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass die anti-HIV-1-gp120-Antikörper – anders als diese Peptide – auf inerten, festen Matrices oder magnetischen Kügelchen immobilisiert werden. Anschließend werden die zu untersuchenden Proben mit der biologischen Flüssigkeit mit den beschichteten Matrices inkubiert. HIV-1-gp120 oder HIV-1-Virionen, die gp120-Moleküle tragen, welche mit den Antikörpern reagieren, werden an die Matrices binden. Die gebundenen Virionen oder das gebundene gp120 kann dann mit anderen monoclonalen oder polyclonalen anti-HIV-1-Antikörpern nachgewiesen werden, die anschließend mit enzymgebundenen sekundären Nachweis-Antikörpern zur Quantifizierung über eine Farbreaktion umgesetzt werden. Alternativ können das eingefangene gp120 oder die eingefangenen HIV-1-Virionen durch andere Mittel nachgewiesen werden, wie z. B. durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder PCR.
Diese Antikörper können auch dazu verwendet werden, mit HIV infizierte Zellen in Blutproben eines Patienten nachzuweisen und zu quantifizieren, entweder durch direkte oder durch indirekte Immunfluoreszenz-Verfahren, wie vorstehend für die gp120-Bindestelle-Peptide beschrieben wurde. Die Antikörper können auch direkt mit Enzymen, Radionukliden, Fluoreszenz-Sonden oder mit Biotin markiert werden. Die markierten Antikörper, welche an die Zellen gebunden haben, können dann durch etablierte Verfahren nachgewiesen werden.
Antikörper gegen diese gC1q-R-Bindestelle in der C4-Region der HIV-1-gp120-Region könnten möglicherweise auch bei der Behandlung der HIV-1-Erkrankung oder zur Vorbeugung vor einer Infektion mit HIV-1 verwendet werden. Sie können individuell verwendet werden oder in Kombination mit anderen anti-HIV-1 neutralisierenden Antikörpern, rekombinantem, löslichem CD4, anti-retroviralen Arzneistoffen oder mit Cytokinen. Von solchen Antikörpern wird erwartet, dass sie neutralisierend wirken, da sie, nachdem sie erst einmal an gp120 gebunden haben, es an der Bindung an den gC1q-R hemmen und somit die anschließende Infektion von Zielzellen verhindern. Diese Antikörper liegen vermutlich in chimärer, humanisierter oder in menschlicher Form vor, wenn sie zur Therapie oder zur Vorbeugung einer Infektion mit HIV-1 eingesetzt werden. Die Verfahren zur Erzeugung dieser Formen der Antikörper wurden vorstehend beschrieben. Darüber hinaus können transgene Mäuse mit einem menschlichen Immunglobulin-Genom mit den gC1q-R-Bindestelle-Peptiden immunisiert werden, um menschliche Antikörper herzustellen. Alternativ können menschliche Antikörper gegen die C4-Region von gp120 in mit HIV-1 infizierten Individuen oder in geimpften Personen, welche die Immunogene enthaltenden gC1q-R-Bindestelle-Peptide verabreicht bekamen, gefunden werden. Es können Hybridome oder mit EBV transformierte B-Zelllinien aus den B-Zellen dieser Spender entwickelt werden. Menschliche Antikörper können auch über das kombinatorische Genbank-Verfahren (T. A. Collet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 10026–10030) unter Verwendung von mRNAs erzeugt werden, die die schweren und die leichten Ketten der anti-C4-Antikörper codieren. Diese mRNAs können aus den B-Zellen von mit HIV-1 infizierten Individuen oder den geimpften Personen, wie vorstehend beschrieben, erhalten werden.
Die monoclonalen oder die polyclonalen Antikörper können dazu verwendet werden, cytotoxische Mittel gezielt anzuliefern, um infizierte Zellen abzutöten, entweder in Form von Konjugaten oder Mikroträgern (wie z. B. Liposomen). Bei den konjugierten Mitteln kann es sich zum Beispiel um Toxine, cytotoxische Arzneistoffe, Membran-aktive Enzyme oder um Chemikalien und hochenergetische Radionuklide handeln.
Die Antikörper gegen die gC1q-R-Bindestelle auf gp120 können an feste Matrices konjugiert werden. Diese modifizierten Matrices können dazu verwendet werden, freie HIV-1-Virionen oder mit HIV-1 infizierte Zellen aus HIV-1-infizierten Individuen außerhalb des Körpers zu entfernen, um die Belastung mit Viren zu vermindern.
Die Antikörper gegen die gC1q-R-Bindestelle auf gp120 können durch Kombination mit anderen Antikörpern einer unterschiedlichen Spezifität (z. B. gegen Zelloberflächen-Marker oder gegen HIV-1-Antigene) modifiziert werden. Solche bispezifischen Antikörper können entweder durch chemische Konjugation (S. A. Kostelny et al., J. Immunol. 1992; 148: 1547–1553; A. Mabondzo et al., J. Inf. Dis. 1992; 166: 93–99) oder durch Fusion der beiden Hybridome (S. M. Chamow et al., J. Immunol. 1994; 153: 4268–4280) erzeugt werden.
Die Antikörper gegen die gC1q-R-Bindestelle-Peptide können Tieren (z. B. Mäusen) injiziert werden, um anti-idiotypische monoclonale Antikörper zu erzeugen. Anti-idiotypische monoclonale Antikörper können das ursprüngliche Antigen nachbilden, das zur Erzeugung des gewünschten Antikörpers verwendet wurde, und können somit als Immunogene verwendet werden, um Antikörper gegen die gC1q-R-Bindestelle zu erzeugen.
Nachstehend erscheinen einige Beispiele für die Herstellung und die Verwendung der Erfindung sowie eine Bestätigung ihrer Nützlichkeit.
Beispiel 1: Die Expression des gC1q-R-Proteins in E. coli
A. RNA-Isolierung und Herstellung der cDNA
Die Gesamt-RNA wurde aus 5 × 10⁶ DAKIKI-Zellen über das RNA-ZOL-Extraktionsverfahren unter Befolgung des Verfahrens des Herstellers (Biotex, Houston, Texas) isoliert. Zehn Mikrogramm der RNA wurden als Matrize zur Herstellung des ersten Stranges der cDNA in einem Reaktionsgemisch zur reversen Transkription eingesetzt, dieses enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 8,3) und 20 Einheiten RNASIN (Promega, Madison, Wisconsin), jeweils 0,5 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP, 10 μM Oligo-dT und 2 Einheiten reverse AMV-Transkriptase (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland). Die Reaktion wurde 1 Stunde bei 42°C durchgeführt.
B. PCR zur Amplifikation der gC1q-R-cDNA, die das reife Volllänge-gC1q-R-Protein codiert (ab dem Leucin an Position 74 bis zu dem Glutamin an Position 282 der SEQ ID Nr. 1)
Die Sequenzen der beiden Primer, die bei der PCR verwendet wurden, stammten aus dem gC1q-R-cDNA-Gen (A. R. Krainer et al., Cell 1991; 66: 383–394), wobei dem Primer Nr. 1 eine NdeI- und dem Primer Nr. 2 eine PstI-Restriktionsschnittstelle angefügt wurden. Primer Nr. 1 = SEQ ID Nr. 4: TACATATGCTGCACACCGACGGAGAC; Primer Nr. 2 = SEQ ID Nr. 5: GCCCTGCAGCATCTGTCTGCTCTA). Die PCR-Reaktion wurde in 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, jeweils 0,2 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP, jeweils 0,5 mM der beiden Primer, 2 μl des Reaktionsgemisches der reversen Transkrption und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (United States Biochemicals, Cleveland, Ohio) durchgeführt. Die PCR wurde bei 94°C (1 Minute), 55°C (2 Minuten) und 72°C (2 Minuten) über 40 Zyklen auf dem GeneAmp 9600-PCR-Gerät (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut) durchgeführt.
C. Die Konstruktion des gC1q-R-Expressionsvektors und die Expression des reifen rekombinanten Volllängen-Proteins in E. coli
Das gC1q-R-cDNA-Segment wurde in den pT7-7-Vektor (United States Biochemicals) über einen doppelten Restriktionsenzymverdau mit NdeI und PstI cloniert (1). Der E. coli-Wirtszell-Stamm war BL21. Das clonierte Gen befand sich unter der Kontrolle des starken T7-Promotors und wurde nach Induktion durch 1 mM IPTG exprimiert.
D. Die Expression verkürzter rekombinanter gC1q-R-Proteine
Der rekombinante gC1q-R mit einem verkürzten N-terminalen Teil, der als gC1q-R(C) bezeichnet wurde, wurde, wie in 1 gezeigt, hergestellt. Das Gensegment, das den N-terminalen Teil codiert, wurde aus dem pT7-7/gC1q-R- Expressionsvektor durch Restriktionsverdau mit EcoRI und BstXI entfernt. Der gC1q-R(C) enthält das Peptidsegment zwischen Phenylalanin an Position 168 und Glutamin an Position 282 der SEQ ID Nr. 1. Die Enden des Vektors wurden durch T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und mit T4-DNA-Ligase religiert. Das Peptid gC1q-R(C) wurde in BL21-Zellen auf die gleiche Weise wie der Volllänge-gC1q-R exprimiert.
Der rekombinante gC1q-R mit einem verkürzten C-terminalen Teil, der als gC1q-R(N) bezeichnet wurde, wurde, wie in 1 gezeigt, hergestellt. Der gC1q-R(N) enthält das Peptidsegment zwischen Leucin an Position 74 und Asparagin an Position 167 der SEQ ID Nr. 1. Das Gensegment, das den C-terminalen Teil codiert, wurde aus dem pT7-7/gC1q-R-Expressionsvektor durch Restriktionsverdau mit BstXI und PstI entfernt. Die Enden des Vektors wurden durch T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und mit T4-DNA-Ligase religiert. Das Peptid gC1q-R(N) wurde in BL21-Zellen auf die gleiche Weise wie der Volllängen-gC1q-R exprimiert.
Der rekombinante und um seine N-terminalen 57 Aminosäuren verkürzte gC1q-R, der als gC1q-R(δ1–57) bezeichnet wurde, wurde, wie in 1 gezeigt, hergestellt. Der gC1q-R(δ1–57) enthält ein Peptidsegment zwischen Valin an Position 131 und Glutamin an Position 282 der SEQ ID Nr. 1. Zuerst wurde das Gensegment durch PCR synthetisiert. Es wurden die Volllängen-gC1q-R-cDNA als Matrize und zwei Primer, der Primer Nr. 2 (SEQ ID Nr. 5) und der Primer Nr. 3 (SEQ ID Nr. 6), der die Sequenz AAGAATTCCGGTCACTTTCAACATT besitzt, bei der PCR verwendet. Die Reaktionsbedingungen bei der PCR waren die gleichen wie vorstehend, mit der Ausnahme, dass die Anzahl der Amplifikationzyklen auf 25 vermindert wurde. Das durch die PCR amplifizierte DNA-Segment wurde in den pT7-7-Vektor zwischen die EcoRI- und die PstI-Schnittstelle cloniert. Das Peptid gC1q-R(δ1–57) wurde in BL21-Zellen auf die gleiche Weise wie der Volllängen-gC1q-R exprimiert.
E. Die Herstellung und die Reinigung des gC1q-R aus E. coli
E. coli, der den gC1q-R exprimierte, wurde angezogen und durch Behandlung mit Ultraschall in Tris-Puffer geerntet. Das Lysat wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde gegen einen Puffer dialysiert, der 20 mM HEPES, 0,1 M KCl, 0,5% Glycerin, 0,2 mM EDTA und 1 mM Dithiothreit mit einem pH-Wert von 8,0 enthielt. Die dialysierte Probe wurde auf eine vorher äquilibrierte Fast Q-Ionenaustauscher- Säule (Pharmacia Biotechnology, Piscataway, New Jersey) aufgetragen. Die gebundenen Proteine wurden mit einem Puffer eluiert, der 20 mM HEPES und 1 M KCl mit einem pH-Wert von 8,0 enthielt. Es wurden diejenigen Fraktionen gesammelt, die nach SDS-PAGE und einem Western-Immunoblot auf die Reaktivität mit dem rekombinanten gp120 als gC1q-R-positiv gefunden wurden. Die vereinigten Fraktionen wurden über eine Sephacryl 200-Gelfiltrations-Säule (Pharmacia Biotechnology) weiter gereinigt. Die Reinheit des endgültigen Materials wurde über SDS-PAGE und seine Bindungsaktivität an gp120 über einen ELISA bestimmt (vergleiche mit dem nachstehenden Beispiel 4).
Beispiel 2: Die Herstellung monoclonaler Antikörper gegen das gC1q-R-Peptid
Männliche BALB/cJ-Mäuse (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) im Alter von 12 Wochen wurden subcutan 100 μg in E. coli exprimierter und gereinigter gC1q-R in komplettem Freundschem Adjuvanz (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in 200 μl PBS injiziert. Einen Monat später wurden die Mäuse subcutan mit 100 μg gC1q-R in inkomplettem Freundschem Adjuvanz geimpft. Einen Monat später und drei Tage vor der Tötung wurde den Mäuse dann erneut subcutan 100 μg des gleichen Antigens in inkomplettem Freundschen Adjuvanz injiziert. Für jede Fusion wurden Einzelzellsuspensionen aus der Milz einer immunisierten Maus hergestellt und zur Fusion mit Sp2/0-Myelomzellen verwendet. Es wurden 5 × 10⁸ Sp2/0-Zellen und 5 × 10⁸ Milzzellen in einem Medium miteinander fusioniert, das 50% Polyethylenglycol (MG 1450, Kodak, Rochester, New York) und 5% Dimethysulfoxid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) enthielt. Die Zellen wurden anschließend 1,5 × 10⁵ Milzzellen pro 200 μl Suspension in Iscove-Medium (Gibco, Grand Island, New York) eingestellt, das mit 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,1 mM Hypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin und 16 μM Thymidin ergänzt worden war. 200 Mikroliter der Zellsuspension wurden in jede Vertiefung von etwa 20 Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Nach etwa zehn Tagen Anzucht wurden die Kulturüberstände für eine Durchmusterung mit einem ELISA mit Immulon 1-Mikrotestplatten (Dynatech Laboratories, Alexandria, Virginia) entnommen, die mit 50 × 10³ DAKIKI-Zellen pro Vertiefung vorher beschichtet worden waren. Die DAKIKI-Zellen wurden auf eine hohe Expression von gC1q-R auf der Oberfläche hin untersucht. Kurzgefaßt wurden den Vertiefungen der Mikrotestplatten, die mit getrockneten DAKIKI-Zellen beschichtet worden waren, 200 μl 5%-iges BLOTTO (entfettete Trockenmilch) in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zugegeben, um die unspezifischen Stellen abzusättigen. Eine Stunde später wurden die Vertiefungen dann mit dem Puffer PBST (PBS, die 0,05% Tween-20 enthielt) gewaschen. Es wurden 50 Mikroliter des Kulturüberstandes aus jeder Fusions-Vertiefung gesammelt und mit 50 μl BLOTTO gemischt und dann den einzelnen Vertiefungen der Mikrotestplatten zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Vertiefungen mit PBST gewaschen. Die murinen Antikörper, die an die Zellen gebunden hatten, wurden dann durch eine Reaktion mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) nachgewiesen, das an anti-Maus-IgG aus Ziegen (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania) konjugiert und 1 : 1.000 mit BLOTTO verdünnt worden war. Die Peroxidase-Substrat-Lösung, die 0,1% 3',3',5',5'-Tetramethylbenzidin (Sigma) und 0,0003% Wasserstoffperoxid enthielt, wurde den Vertiefungen zur Farbentwicklung zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 2 M H₂SO₄ pro Vertiefung beendet. Die optische Dichte (OD) des Reaktionsgemisches wurde mit einem BioTek-ELISA-Lesegerät (BioTek Instruments, Winooski, Vermont) bei 450 nm abgelesen.
Die Kulturüberstände in diesen positiven Vertiefungen wurden ebenfalls auf ihre Reaktivität mit dem rekombinanten gC1q-R mit einem ELISA untersucht. Kurzgefaßt wurden den Vertiefungen von Immulon 2 (Dynatech Laboratories)-Mikrotestplatten 50 μl an in E. coli exprimiertem gC1q-R in einer Konzentration von 1 μg/ml über Nacht bei Zimmertemperatur zugegeben. Nachdem die Lösung zur Beschichtung durch Ausschütteln der Platte entfernt worden war, wurden 200 μl BLOTTO jeder Vertiefung für eine Stunde zugegeben, um die unspezifischen Bindestellen zu blockieren. Anschließend wurden die Vertiefungen mit PBST gewaschen. Die gebundenen murinen Antikörper wurden, wie vorstehend beschrieben, nachgewiesen. Die Zellen in den positiven Vertiefungen wurden über eine begrenzte Verdünnung cloniert. Die Clone wurden erneut auf ihre Reaktivität mit dem gC1q-R in einem ELISA untersucht. Die ausgewählten Hybridome wurden in Spinner-Flaschen angezogen, und die verbrauchten Kulturüberstände für die Reinigung der Antikörper über Protein A-Affinitätschromatographie gesammelt. Einer der monoclonalen Antikörper, der auf diese Weise gegen den gC1q-R hergestellt worden war, 99-12-1, wurde untersucht, um zu bestimmen, ob er mit HIV1-gp120 um die Bindung an den gC1q-R kompetitiert (vergleiche mit dem nachstehenden Beispiel 11).
Beispiel 3: Die Herstellung polyclonaler Antikörper gegen den gC1-q-R
Zwei männliche weiße Neuseeland-Kaninchen, die etwa 15 Wochen alt waren, wurden mit 100 μg in E. coli exprimiertem und gereinigtem gC1q-R in komplettem Freundschen Adjuvanz (Difco Laboratories) subcutan immunisiert. Zwei Wochen später wurden sie erneut die gleiche Menge Antigen in inkomplettem Freundschem Adjuvanz injiziert. Die gleiche Immunisierung wurde zwei Wochen später wiederholt. Die Seren wurden aus den immunisierten Tieren gesammelt und auf ihre Reaktivität mit gC1q-R in einem ELISA, wie vorstehend beschrieben, untersucht, mit der Ausnahme, dass mit HRP konjugiertes anti-Kaninchen-IgG aus Esel (Jackson ImmunoResearch Laboratories) in einer Verdünnung von 1 : 2.000 in BLOTTO zum Nachweis der gebundenen Antikörper verwendet wurde. Das Tier, das die höhere serologische Antwort aufwies, wurde zur Sammlung des Serums verwendet. Die polyclonalen anti-gC1q-R-Immunglobuline des Kaninchens wurden über eine Affinitäts-Säule unter Verwendung des gC1q-R gereinigt, der an Affigel 102 (BioRad Laboratories) gekoppelt war.
Beispiel 4: Die Bindung von HIV-1-IIIB-gp120 an den in E. coli exprimierten gC1q-R im ELISA
Die Vertiefungen von Immulon 2-Platten wurden mit 100 μl in E. coli exprimiertem gC1q-R (5 μg/ml in 0,1 M Natriumacetat-Puffer mit dem pH-Wert 6) beschichtet und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Nachdem die Vertiefungen mit dem Blockierungspufter PBSTB (PBST, das 2% Rinderserumalbumin enthielt) 1 Stunde bei Zimmertemperatur behandelt und mit PBST gespült worden waren, wurden 100 μl einer seriellen Verdünnung (von 2 μg/ml bis 0,016 μg/ml) an in Baculoviren exprimiertem HIV-1-IIIB-gp120 (American Biotechnologies, Inc., Cambridge, Massachusetts) den entsprechenden Vertiefungen in Doppelproben zur Reaktion über 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Dann wurden die Vertiefungen wie vorstehend gewaschen. Das gebundene gp120 wurde durch den monoclonalen murinen anti-HIV-1-gp120-Antikörper gegen die V3-Domäne, BAT123, der mit HRP konjugiert worden war, in einer Verdünnung von 1 : 2.000 nachgewiesen. Der Antikörper wurde auf seine Reaktion mit dem Peptidsegment des gp120 (Aminosäurereste-Nrn. des HXB2R-Stammes: 308–322), das in SEQ ID Nr. 7 gezeigt wird, hin untersucht, und auch darauf hin, dass er die Bindung zwischen dem gC1q-R und gp120 nicht beeinträchtigt. 100 Mikroliter des verdünnten Konjugats wurden jeder Vertiefung zur Reaktion über 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Dann wurden die Vertiefungen gewaschen, und es wurden 200 μl der Peroxidase-Substratlösung jeder Vertiefung für die Farbreaktion über 30 Minuten zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 2 M H₂SO₄ beendet, und die OD wurde durch das BioTek ELISA-Lesegerät bei 450 nm gemessen. Die spezifische Reaktivität erhält man durch Subtraktion der OD der Testvertiefungen, denen gp120 zugegeben worden war, von der OD der Kontrollvertiefungen ohne gp120.
Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt, wo man erkennen kann, dass bei steigender Konzentration an gp120 die Bindung von gp120 an eine konstante Menge des immobilisierten rekombinanten gC1q-R auf sigmoide Weise zunimmt. Dies zeigt eine Dosis-abhängige Bindung von gp120 an den gC1q-R. Insoweit wie der gegen die gp120-V3-Region gerichtete Antikörper BAT123 noch in der Lage ist, mit gp120 zu reagieren, das an den gC1q-R gebunden ist, wird gezeigt, dass die V3-Region von gp120 an der Bindung des gC1q-R an gp120 nicht beteiligt ist, wie in der SEQ ID Nr. 7 dargestellt.
Beispiel 5: HIV-1-Neutralisierungs-Testansatz
Um die hemmende Aktivität des gC1q-R auf die Infektiosität von HIV-1 zu untersuchen, wurde ein Syncytien-Bildungs-Mikrotestansatz unter Verwendung von CEM-SS-Zellen als Zielzellen, wie durch P. L. Nara et al. beschrieben (AIDS Res. Hum. Retroviruses 1987; 3: 283–302), durchgeführt. Kurzgefaßt wurden 50 μl an verdünntem und in E. coli exprimiertem gC1q-R mit 50 μl viralem Kulturüberstand gemischt, der 200 Syncytien bildende Einheiten (SFUs) von HIV-1-IIIB, HIV-1-MN oder HIV-1-RF enthielt, und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Gemische wurden Mikrokultur-Vertiefungen zugegeben, die 5 × 10⁴ mit DEAE-Dextran behandelte CEM-SS-Zellen enthielten, und die Zellkulturen wurden in 5% CO₂ bei 37°C über drei bis vier Tage gehalten. Die Syncytien wurden unter einem Umkehrmikroskop gezählt. Die neutralisierende Aktivität wurde als IC₅₀-Wert ausgedrückt, der definiert ist als die Konzentration, die erforderlich ist, eine 50%-ige Hemmung der Infektion zu erreichen (d. h. Vn/Vo = 50%), wobei Vn die Anzahl an SFUs in den Testvertiefungen und Vo die Anzahl an SFUs in den Kontrollvertiefungen ohne die Testantikörper darstellt.
Die Ergebnisse werden in den 3A, 3B und 3C gezeigt. Man kann erkennen, dass der gC1q-R HIV-1-IIIB, -MN und -RV mit einem IC₅₀-Wert von 4,3, 13,5 bzw. 1,65 μg/ml neutralisierte. Diese Daten zur Neutralisierung zeigen an, dass der gC1q-R die Infektiosität divergenter HIV-1-Isolate umfassend hemmen kann.
Beispiel 6: Testansatz zur Hemmung der Aktivität der Syncytien-Bildung
Die Wirkungen des gC1q-R auf die Übertragung von HIV-1 über Zell-Zell-Fusion wurde unter Verwendung von HIV-1 infizierten H9-Zellen und CD4 exprimierenden HeLa-Zellen (HeLa-CD4⁺) untersucht, die in Kultur nach Kontakt fusionieren und Syncytien bilden. HeLa ist eine menschliche Karzinom-Zelllinie, und HeLa-CD4⁺ enthält in ihrem Genom CD4-DNA, die durch Transfektion eingeführt wurde, und sie exprimiert das CD4-Antigen auf ihrer Zelloberfläche. Das bei den vorliegenden Untersuchungen verwendete Verfahren ist ähnlich demjenigen, das beschrieben wurde (P. J. Madden et al., Cell 1986; 47: 333–348). Im Wesentlichen wurden HeLa-CD4⁺-Zellen in die Vertiefungen von Mikrokulturplatten mit 24 Vertiefungen zu 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung plattiert. Die Platten wurden 36 Stunden inkubiert, und nach diesem Zeitraum waren die eine einzellige Schicht bildenden Epithelzellen nahezu konfluent. Nachdem 1 × 10⁴ infizierte H9-Zellen den noch nicht vollständig konfluenten HeLa-CD4⁺-Zellen zugegeben worden waren, bildeten die Zellen Kontaktstellen aus und fusionierten, und nach 8 Stunden bildeten sich vielkernige Riesenzellen (Syncytien). Syncytien mit mehr als fünf Kernen konnten leicht identifiziert und nummeriert werden, was ein quantitatives Maß für die Syncytienbildung lieferte. Wenn die Wirkungen des in E. coli exprimierten und gereinigten gC1q-R auf die Syncytienbildung untersucht wurde, wurden unterschiedliche Konzentrationen des gC1q-R mit infizierten H9-Zellen gemischt und den HeLa-CD4⁺-Zellen zugegeben. Das Gesamt-Endvolumen des Anzuchtmediums pro Vertiefung betrug 1 ml. Am Ende einer 8-stündigen Inkubation bei 37°C in 5% CO₂ wurden die Vertiefungen mit RPMI-1640-Anzuchtmedium gewaschen, mit Methanol fixiert, an der Luft getrocknet und mit 0,1% Methylenblau in Methanol gefärbt. Die Zellen wurden bei 100-facher Vergrößerung untersucht, und die Zahl an Syncytien (mit mehr als 5 Kernen) wurde in vier zufällig ausgewählten Feldern bestimmt, und es wurde der Mittelwert gebildet. Der Prozentsatz der Hemmung der Syncytienbildung wurde aus der verminderten Zahl an Syncytien in Vertiefungen, denen gC1q-R zugegeben worden war, im Vergleich zu einer Kontrolle berechnet.
Die Ergebnisse, die in 4 gezeigt werden, zeigen, dass der rekombinante gC1q-R die Fusion zwischen mit HIV-1-IIIB infizierten H9-Zellen und CD4⁺-HeLa-Zellen mit einem IC₅₀-Wert von 21 μg/ml hemmt.
Beispiel 7: Die Bindung des gC1q-R an mit HIV-1-IIIB infizierte H9-Zellen, gemessen durch Durchfluß-Cytometrie
Die Bindung des in E. coli exprimierten und gereinigten gC1q-R an gp120, das auf der Oberfläche der mit HIV-1-IIIB infizierten H9-Zellen exprimiert wird, wurde über indirekte Immunfluoreszenz-Durchfluß-Cytometrie untersucht. 50 Mikroliter infizierte Zellen in einer Konzentration von 10 × 10⁶ Zellen/ml in PBSB (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 1% Rinderserumalbumin und einem pH-Wert von 7,4) wurden mit einer Konzentrationsreihe von in E. coli exprimiertem und gereinigtem gC1q-R 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen einmal im gleichen Puffer durch 5 Minuten Zentrifugation bei 300 × g gewaschen. Das Zellsediment wurde dann in 50 μl des gleichen Puffers resuspendiert, und es wurden 50 μl des affinitätsgereinigten anti-gC1q-R-Antikörpers aus Kaninchen in einer Konzentration von 5 μg/ml zur Reaktion auf Eis über 30 Minuten zugegeben. Anschließend wurden die Zellen wie vorstehend gewaschen, und es wurden 50 μl von mit Fluorescein konjugiertem anti-Kaninchen-IgG aus Esel (Jackson ImmunoResearch Laboratories) in einer Verdünnung von 1 : 40 zugegeben und weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen gewaschen, mit 1% Paraformaldehyd fixiert und anschließend unter Verwendung eines Coulter EPIC-Zellanalysegeräts (Coulter Electronics, Hialeah, Florida) untersucht. Bei den Kontrollen wurde nur der anti-gC1q-R aus Kaninchen und/oder mit Fluorescein konjugiertes anti-Kaninchen-IgG aus Esel verwendet. Die spezifische Färbung der Zellen wurde durch Subtraktion des Prozentsatzes der Zellbindung der Testproben von dem der Kontrolle berechnet, der willkürlich auf 10% festgesetzt wurde. Als negative Kontrolle für die Bindestudien wurden ebenfalls nicht infizierte H9-Zellen untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass der rekombinante gC1q-R an mit HIV-1-IIIB infizierte H9-Zellen in einer dosisabhängigen Weise band (5), aber nicht an nicht infizierte H9-Zellen.
Beispiel 8: Die Wirkungen von C1q auf die Bindung des HIV-1-gp120 an den gC1q-R im ELISA
Um zu untersuchen, ob der natürliche Ligand C1q die gleiche Bindestelle für den gC1q-R wie gp120 besitzt, wurde die Wirkung von C1q auf die Bindung von HIV-1-gp120 an den gC1q-R über ELISA untersucht. Die Vertiefungen von Immulon 2-Mikrotestplatten wurden mit 50 μl in E. coli exprimiertem und gereinigtem gC1q-R in einer Konzentration von 5 μg/ml in 0,1 M Natriumacetat-Puffer beschichtet und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Dann wurden die Vertiefungen mit 200 μl des Blockierungs/Verdünnungs-Puffers PBSTB 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert. Nachdem die Vertiefungen mit PBST gewaschen worden waren, wurden 50 μl des in Baculoviren exprimierten HIV-1-IIIB-gp120 in einer Konzentration von 0,2 μg/ml jeder Vertiefung in An- oder Abwesenheit einer Verdünnungsreihe von in E. coli exprimiertem gC1q-R oder gereinigtem C1q aus menschlichem Serum (Quidel, San Diego, Kalifornien) in Blockierungs/Verdünnungs-Puffer zugegeben, und die Vertiefungen wurden eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend gewaschen. Es wurden 50 Mikroliter des mit HRP konjugierten monoclonalen Antikörpers BAT123 in einer Verdünnung von 1 : 2.000 in Blockierungs/Verdünnungs-Puffer jeder Vertiefung für 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Dann wurde die Platte gewaschen, und die Peroxidase-Substratlösung wurde, wie vorstehend beschrieben, zur Farbentwicklung zugegeben. Die spezifische Reaktivität wurde durch Subtraktion der OD der Testvertiefungen, denen gp120 zugefügt worden war, von der der Kontrollvertiefungen ohne gp120 erhalten.
Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt, wobei die Kurve, die mit ausgefüllten Kreisen markiert ist, C1q darstellt, und die Kurve, die mit ausgefüllten Quadraten markiert ist, den gC1q-R darstellt. C1q kompetitiert nicht mit der Bindung von gp120 an den gC1q-R, wohingegen der gC1q-R dies, wie erwartet, tut. Dieses Ergebnis zeigt, dass gp120 an den gC1q-R an einer Stelle bindet, die sich von der für C1q unterscheidet, und sie beeinflussen sich nicht gegenseitig. Dies ist ein sehr wichtiger Befund, da, wenn der gC1q-R mit HIV-1 infizierten Individuen oder HIV-1-exponierten Personen verabreicht wird, die große Menge an C1q, die im Blut vorliegt, den gC1q-R bei der Bindung an HIV-1-gp120 auf den Virionen oder den infizierten Zellen nicht beeinflusst. Weiterhin ist die Fähigkeit des gC1q-R, sowohl gleichzeitig an C1q als auch an gp120 zu binden, signifikant und nützlich, da der gC1q-R in der Lage sein könnte, die Aktivierung des klassischen Komplementweges zu vermitteln, um HIV-1-Virionen und mit HIV-1 infizierte Zellen zu lysieren.
Beispiel 9: Die Reaktivität von HIV-1-gp120 mit unterschiedlichen rekombinanten Konstrukten des gC1q-R
Um die gC1q-R-Bindestelle für HIV-1-gp120 zu lokalisieren, wurden rekombinante Konstrukte des gC1q-R mit unterschiedlicher Länge für den ELISA hergestellt. Die Vertiefungen von Immulon 2-Mikrotestplatten wurden mit 100 μl in E. coli exprimiertem und gereinigtem Volllängen-gC1q-R (AS 1–209), gC1q-R (AS 58–209), gC1q-R (AS 1–94) oder mit gC1q-R (AS 95–209) in einer Konzentration von 5 μg/ml in 0,1 M Natriumaceteat-Puffer (pH-Wert 6) beschichtet und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Nachdem die Vertiefungen mit dem Blockierungs/Verdünnungs-Puffer PBSTB über 1 Stunde bei Zimmertemperatur behandelt und mit PBST abgespült worden waren, wurden 100 μl einer Verdünnungsreihe (von 2 μg/ml bis 0,016 μg/ml) von in Baculoviren exprimiertem HIV-1-IIIB-gp120 (American Biotechnologies, Inc.) den entsprechenden Vertiefungen in Doppelproben zur Reaktion über 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Dann wurden die Vertiefungen wie vorstehend gewaschen. Das gebundene gp120 wurde durch Zugabe von 100 μl des mit HRP konjugierten monoclonalen Antikörpers BAT123 in einer Verdünnung von 1 : 2.000 über 1 Stunde bei Zimmertemperatur nachgewiesen. Dann wurden die Vertiefungen gewaschen, und es wurden 200 μl der Peroxidase-Substratlösung jeder Vertiefung zur Farbentwicklung über 30 Minuten zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 2 M H₂SO₄ beendet, und die OD wurde mit einem BioTek ELISA-Lesegerät bei 450 nm gemessen. Die spezifische Reaktivität wurde durch Subtraktion der OD der Testvertiefungen, denen gp120 zugefügt worden war, von der der Kontrollvertiefungen ohne gp120 erhalten.
Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt, wobei die Kurve, die mit ausgefüllten Quadraten markiert ist, den Volllängen-gC1q-R (AS 1–209) darstellt, die mit ausgefüllten Kreisen markierte Kurve den gC1q-R (AS 58–209) darstellt, die mit ausgefüllten Dreiecken markierte Kurve den gC1q-R (AS 1–94) darstellt und die mit ausgefüllten und umgedrehten Dreiecken markierte Kurve den gC1q-R (AS 95–209) darstellt. Gp120 bindet an den gC1q-R (AS 1–209), den gC1q-R (AS 58–209) und an den gC1q-R (AS 95–209), aber nicht an den gC1q-R (AS 1–94). Die Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass die Bindestelle auf dem gC1q-R für gp120 sich in seinem C-terminalen Teil befindet. Diese Beobachtung stimmt mit dem in 6 gezeigten Ergebnis überein, das zeigt, dass sich die gp120-Bindestelle von der für C1q unterscheidet, die in dem Peptidsegment am N-Terminus des gC1q-R kartiert wurde, wie in der SEQ ID Nr. 8 gezeigt (B. Ghebrehiwet et al., J. Exp. Med. 1994; 179: 1809–1821). Dieses Peptidsegment entspricht den Aminosäurereste-Nrn. 76–93 der SEQ ID Nr. 1.
Beispiel 10: Die Peptid-Kartierung der Bindedomäne für 99-12-1 auf dem gC1q-R
Um das Epitop für die Bindung von 99-12-1 zu kartieren, wurde das Multipin-Peptidsynthese-Verfahren verwendet (H. M. Geysen et al., Science 1987, 235: 1184–1190). 41 12-mer Peptide, die die vollständige Sequenz des gC1q-R überdeckten (die aufeinanderfolgenden Peptide überlappten jeweils um 7 Aminosäuren) wurden individuell nacheinander auf Plastiknadeln in der Anordnung einer Mikrotestplatte mit 96 Vertiefungen synthetisiert. Die Peptid-Sammlung wurde auf Bestellung durch Chiron Mimotopes PTY, LTD., Clayton, Victoria, Australien synthetisiert.
Das Verfahren zur Epitop-Kartierung unter Verwendung dieses Multipin-Peptid-Systems erfolgte ähnlich der Durchführungsvorschrift des Herstellers. Kurzgefaßt wurden die Nadeln zuerst mit einem Vorbeschichtungspuffer, der 2% Rinderserumalbumin und 0,1% Tween-20 in PBS enthielt, 1 Stunde bei Zimmertemperatur behandelt. Dann wurden die Nadeln in die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotestplatte mit 96 Vertiefungen eingeführt, die den Antikörper 99-12-1 in einer Konzentration von 2 μg/ml in dem Vorbeschichtungspuffer enthielt. Die Inkubation erfolgte über 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Die Nadeln wurden mit PBST gewaschen (3 Spülungen über jeweils 10 Minuten) und dann in den Vertiefungen einer Mikrotestplatte mit 96 Vertiefungen 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert, die 100 μl von mit HRP konjugiertem anti-Maus-IgG (Fc) aus Ziegen (Jackson ImmunoResearch Laboratories) in einer Verdünnung von 1 : 4.000 enthielten. Nachdem die Nadeln wie vorstehend gewaschen worden waren, wurden die Nadeln für 30 Minuten bei Zimmertemperatur zur Farbreaktion in Vertiefungen gestellt, die eine Peroxidase-Substratlösung aus Diammonium-2,2'-azino-bis [3-ethylbenzthiazolin-b-sulfonat] (ABTS) und H₂O₂ (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, Maryland) enthielten. Die Platte wurde bei 405 nm mit einem BioTek ELISA-Platten-Lesegerät gegen die den Hintergrund absorbierenden Wellenlänge von 492 nm abgelesen. Die Vertiefungen, die eine Farbreaktion aufwiesen, zeigten die Reaktivität der aus dem gC1q-R stammenden Peptide in denjenigen Vertiefungen mit 99-12-1 an.
Die Ergebnisse der Epitop-Kartierung zeigen, dass 99-12-1 an das Peptid mit der SEQ ID Nr. 2 bindet.
Um das bindende Epitop von 99-12-1 zu bestätigen, wurde das Peptid LM12DN der SEQ ID Nr. 2 auf die Bindung an 99-12-1 im ELISA untersucht. Das Peptid der SEQ ID Nr. 8 (Peptid TD18EE), das vorher als die Bindestelle für C1q definiert worden war (Ghebrehiwet et al., J. Exp. Med. 179: 1809–1821), wurde als negative Kontrolle verwendet. Die Peptide LM12DN und TD18EE wurden mit einem automatisierten Peptid-Synthesegerät (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) unter Verwendung des 9-Fluorenylmethoxycarboyl-Syntheseprotokolls, wie im Handbuch des Herstellers beschrieben, synthetisiert. Bei dem Peptid-ELISA wurden die Vertiefungen von Immulon 2-Mikrotestplatten mit 50 μl der Peptide LM12DN oder TD18EE in einer Konzentration von 1 μg/ml beschichtet und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Nachdem die Beschichtungslösung durch Ausschütteln der Platte entfernt worden war, wurden 200 μl PBSTB jeder Vertiefung, um die unspezifischen Stellen abzusättigen, 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Anschließend wurden die Vertiefungen mit PBST gewaschen. Den Vertiefungen wurden 50 Mikroliter einer Verdünnungsreihe von 99-12-1 in PBSTB in Doppelproben über 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Die Platte wurde erneut gewaschen. Jeder Vertiefung wurden 50 Mikroliter des mit HRP konjugierten anti-Maus-IgG (Fc) aus Ziegen (Jackson ImmunoResearch Laboratories) in einer Verdünnung von 1 : 2.000 über 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Nachdem die Vertiefungen gewaschen worden waren, wurde das Peroxidase-Substrat für die Farbreaktion, wie vorstehend beschrieben, zugegeben. Die Platte wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts bei 450 nm abgelesen. Die spezifische Reaktivität wurde durch Subtraktion der OD der Testvertiefungen, denen 99-12-1 zugegeben worden war, von der der Kontrollvertiefungen erhalten.
Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt, wobei die mit ausgefüllten Quadraten markierte Kurve das Peptid LM12DN darstellt, und die mit ausgefüllten Kreisen markierte Kurve das Peptid TD18EE darstellt. 99-12-1 bindet an das Peptid LM12DN (SEQ ID Nr. 2) in einer dosisabhängigen Weise, aber nicht an das Peptid TD18EE (SEQ ID Nr. 8).
Beispiel 11: Kompetition um die Bindung von HIV-1-gp120 an den gC1q-R durch den monoclonalen anti-gC1q-R-Antikörper 99-12-1 im ELISA
Die Vertiefungen von Immulon 2-Mikrotestplatten wurden mit 50 μl in E. coli exprimiertem und gereinigtem gC1q-R in einer Konzentration von 5 μg/ml in 0,1 M Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 6) beschichtet und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschießend wurden die Vertiefungen mit 200 μl des Blockierungs/Verdünnungs-Puffers PBSTB für 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert und dann mit PBST gewaschen. Es wurden 50 Mikroliter des in Baculoviren exprimierten HIV-1-IIIB-gp120 in einer Konzentration von 0,2 μg/ml jeder Vertiefung in An- oder Abwesenheit einer Verdünnungsreihe von 99-12-1 in Blockierungs/Verdünungs-Puffer zugegeben, und die Vertiefungen wurden eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend gewaschen. Jeder Vertiefung wurden 50 Mikroliter des mit HRP konjugierten monoclonalen Antikörpers BAT123 in einer Verdünnung von 1 : 2.000 in Blockierungs/Verdünnungs-Puffer zugegeben, danach erfolgte eine Inkubation über 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Dann wurde die Platte gewaschen, und die Peroxidase-Substrat-Lösung, wie vorstehend beschrieben, für die Farbreaktion zugegeben. Die Hemmung der Bindung von gp120 an den gC1q-R durch 99-12-1 wird als Differenz der ODs zwischen Vertiefungen mit oder ohne 99-12-1 berechnet.
9 zeigt, dass 99-12-1 die Bindung von gp120 an den gC1q-R in einer dosisabhängigen Weise hemmt, was vermuten läßt, dass 99-12-1 an eine Stelle in dem gC1q-R bindet, die für die Wechselwirkung mit gp120 essentiell ist. Diese Stelle wurde auf SEQ ID Nr. 2 kartiert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
Beispiel 12: Kompetition um die Bindung des gC1q-R an HIV-1-gp120 durch die Antikörper G3-299 und 6205 im ELISA
Zur Unterstützung der Identifizierung der gC1q-R-Bindestelle auf HIV-1-gp120 wurde ein Kompetitions-ELISA entworfen, um die Wirkungen verschiedener anti-HIV-1-gp120-Antikörper und des rekombinanten löslichen CD4 (rsCD4) auf die Bindung von gp120 an den gC1q-R zu untersuchen.
Die Vertiefungen von Immulon 2-Mikrotestplatten wurden mit 50 μl in E. coli exprimiertem und gereinigtem gC1q-R in einer Konzentration von 5 μg/ml in 0,1 M Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 6) beschichtet und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschießend wurden die Vertiefungen mit 200 μl des Blockierungs/Verdünnungs-Puffes PBSTB für 1 Stunde bei Zimmertemperatur abgesättigt. Es wurden 50 Mikroliter des in Baculoviren exprimierten HIV-1-IIIB-gp120 in einer Konzentration von 0,2 μg/ml jeder Vertiefung in An- oder Abwesenheit einer Verdünnungsreihe der anti-HIV-1-gp120-Antikörper oder des rsCD4 (Biogen, Boston, Massachusetts) in Blockierungs/Verdünnungs-Puffer zugegeben, und die Vertiefungen wurden eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die ausgetesteten anti-HIV-1-gp120-Antikörper umfassen: den monoclonalen murinen Antikörper G3-299 (gegen die C4-Region (Aminosäurereste-Nrn. des HXB2R-Stammes: 423–437), wie in der SEQ ID Nr. 9 gezeigt), den anti-HIV-1-gp120-C5-Region-Antikörper aus Schaf, 6205 (gegen die Sequenz der Aminosäurereste-Nrn. des HXB2R-Stammes: 497–511, wie in der SEQ ID Nr. 10 gezeigt) und BAT085 (gegen die V2-Region mit den Aminosäurereste-Nrn. des HXB2R-Stammes: 169–183, wie in der SEQ ID Nr. 11 gezeigt). Die Eigenschaften von G3-299 und BAT085 wurden bereits vorher beschrieben (N. C. Sun et al., J. Virol. 1989; 63: 3579–3585; M. S. C. Fung et al., J. Virol. 1992; 66: 848–856). Der Antikörper 6205 wurde von International Enzymes, Fallbrook, Kalifornien bezogen. Nachdem die Platte gewaschen worden war, wurden 50 μl des mit HRP konjugierten monoclonalen Antikörpers BAT123 in einer Verdünnung von 1 : 2.000 in Blockierungs/Verdünnungs-Puffer jeder Vertiefung zugegeben, danach erfolgte eine Inkubation über 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Dann wurde die Platte gewaschen, und die Peroxidase-Substrat-Lösung, wie vorstehend beschrieben für die Farbreaktion zugegeben. Der Prozentsatz der Hemmung der Bindung von gp120 an den gC1q-R durch die anti-HIV-1-gp120-Antikörper oder durch rsCD4 wird als die Differenz der ODs zwischen Vertiefungen mit oder ohne die kompetitierenden Agenzien berechnet.
Die Ergebnisse werden in 10 gezeigt, wobei die Kurve, die mit ausgefüllten Kreisen markiert ist, den anti-gp120-C4-Region-Antikörper G3-299 darstellt, die mit ausgefüllten Quadraten markierte Kurve den polyclonalen anti-gp120-C5-Region-Antikörper 6205 aus Schaf darstellt und die mit ausgefüllten Dreiecken markierte Kurve rsCD4 darstellt. Man kann erkennen, dass G3-299 die Bindung von gp120 an den gC1q-R sehr effektiv kompetitiert, 6205 dies moderat tut und rsCD4 dies nicht tut. Der Antikörper BAT085 gegen die V2-Region hemmt die Bindung ebenfalls nicht. Zusammengefaßt deuten die Ergebnisse der Beispiele 4 und 12 darauf hin, dass sich die gC1q-R-Bindestelle in der Nähe der C4- und der C5-Regionen befindet. Sie unterscheidet sich von der CD4-Bindestelle. Dieser wichtige Befund läßt vermuten, dass sowohl der gC1q-R als auch rsCD4 in Kombination zur Behandlung einer Infektion mit HIV-1 angewendet werden können. Dies könnte die Wirksamkeit der Verhinderung einer Infektion sowohl von CD4-positiven als auch von CD4-negativen Zielzellen erweitern.
Beispiel 13: Pegtid-Kartierung der Bindedomäne für den gC1q-R auf HIV-1-gp120
Um das Peptid-Epitop der gC1q-R-Bindedomäne auf HIV-1-gp120 zu bestimmen, wurde das Multipin-Peptidsynthese-Verfahren erneut, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Es wurden 94 12-mer-Peptide, die die gesamte Sequenz des HIV-1-MN-gp120 überspannten (die aufeinanderfolgenden Peptide überlappen jeweils um sieben Aminosäuren) auf Plastiknadeln in einer Anordnung für eine Mikrotestplatte mit 96 Vertiefungen durch Chiron Mimotopes Peptide Systems synthetisiert. Die Aminosäuresequenz des HIV-1-MN-gp120 basierte auf der Datenbank der Los Alamos National Laboratories (G. Myers et al., Human Retroviruses and AIDS, 1992). Das Verfahren zur Epitop-Kartierung ist ähnlich demjenigen, das vorstehend in Beispiel 10 beschrieben wurde.
Es wurde in E. coli exprimierter und gereinigter gC1q-R in einer Konzentration von 5 μg/ml zur Reaktion mit den Peptiden auf den Plastiknadeln verwendet. Nachdem die Nadeln gewaschen worden waren, wurde der gebundene gC1q-R durch Reaktion mit dem affinitätsgereinigten Kaninchen-anti-gC1q-R-Immunglobulin über 1 Stunde bei Zimmertemperatur nachgewiesen. Die Nadeln wurden wie vorher abgespült und mit anti-Kaninchen-IgG aus Esel zur Reaktion gebracht, das mit HRP konjugiert war (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Das Verfahren zur Farbentwicklung war das Gleiche wie vorstehend.
Die Bestätigung des bindenden Epitops des gC1q-R auf HIV-1-gp120 wurde durch die Verwendung überlappender synthetischer Peptide, die die bindende Region überdeckten, als Antigene zur Beschichtung in einem ELISA durchgeführt. Die HIV-1-gp120 überlappenden Peptide RC16GG (Aminosäurereste-Nrn. 444–459, wie in SEQ ID Nr. 3 gezeigt), RC12LT (Aminosäurereste-Nrn. 444–455, wie in SEQ ID Nr. 12 gezeigt) und TG12NN (Aminosäurereste-Nrn. 450–461, wie in SEQ ID Nr. 13 gezeigt) des HXB2R-Stammes wurden von American Biotechnologies, Inc. bezogen. Die Vertiefungen von Immulon 2-Mikrotestplatten wurden mit 100 μl der entsprechenden Peptide in einer Konzentration von 2 μg/ml über Nacht bei Zimmertemperatur beschichtet. Die Vertiefungen wurden dann mit 200 μl des Blockierungs/Verdünnungs-Puffers PBST13 über 1 Stunde bei Zimmertemperatur behandelt. Dann wurden die Vertiefungen mit PBST gewaschen. Unterschiedliche Konzentrationen des in E. coli exprimierten und gereinigten gC1q-R wurden als Doppelproben den Vertiefungen zur Reaktion über 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Dann wurden die Platten wie zuvor gewaschen. Jeder Vertiefung wurden 100 μl des affinitätsgereinigten Kaninchen-anti-gC1q-R-Immunglobulins in einer Konzentration von 2 μg/ml über 1 Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben. Anschließend wurde die Platte gewaschen. Dann wurden 100 μl des verdünnten mit HRP konjugierten anti-Kaninchen-IgG aus Esel für eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur zugegeben, und anschließend wurde die Platte gewaschen. Die Peroxidase-Substrat-Lösung wurde wie zuvor zur Farbentwicklung zugegeben.
Die Ergebnisse werden in 11 gezeigt, wobei die Kurve, die mit ausgefüllten Quadraten markiert ist, RC12LT darstellt, die mit ausgefüllten Kreisen markierte Kurve TG12NN darstellt, und die mit ausgefüllten Dreiecken markierte Kurve RC16GG darstellt. Man kann erkennen, dass nur RC16GG mit dem gC1q-R reagierte. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass die gC1q-R-Bindestelle auf gp120 sich in dem in der SEQ ID Nr. 3 gezeigten Peptidsegment befindet, das in der C4-Region von gp120 lokalisiert ist. Der Antikörper G3-299 kann die Bindung von gp120 an den gC1q-R wirksam kompetitieren, wie in Beispiel 12 gezeigt, wahrscheinlich aufgrund der engen Nachbarschaft zwischen der Bindestelle von G3-299 (SEQ ID Nr. 9) und der des gC1q-R (SEQ ID Nr. 3).
Es wird vorausgesetzt, dass die Begriffe, Ausdrücke und Beispiele, die hierin angeführt sind, nur zum Beispiel dienen und nicht begrenzend wirken, und dass der Rahmen der Erfindung nur durch die nachfolgenden Ansprüche definiert ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, das in der Lage ist, HIV-1-gp120 oder ein Fragment davon zu binden, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz Leu-Met-Asp-Phe-Leu-Ala-Asp-Arg-Gly-Val-Asp-Asn (SEQ ID Nr. 2) besteht oder strukturell äquivalent dazu ist und an die Aminosäuresequenz Arg-Cys-Ser-Ser-Asn-Ile-Thr-Gly-Leu-Leu-Leu-Thr-Arg-Asp-Gly-Gly (SEQ ID Nr. 3) bindet.
Peptid nach Anspruch 1, das vom gC1q-Rezeptor gC1q-R abgeleitet ist.
Peptid, das in der Lage ist, an gC1q-R zu binden, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz Arg-Cys-Ser-Ser-Asn-Ile-Thr-Gly-Leu-Leu-Leu-Thr-Arg-Asp-Gly-Gly (SEQ ID Nr. 3) besteht oder strukturell äquivalent dazu ist und an die Aminosäuresequenz Leu-Met-Asp-Phe-Leu-Ala-Asp-Arg-Gly-Val-Asp-Asn (SEQ ID Nr. 2) bindet.
Peptid nach Anspruch 3, das von HIV-1-gp120 abgeleitet ist.
Oligonucleotid, das ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Oligonucleotid nach Anspruch 5, das ein Desoxyribonucleotid ist.
Expressionsvektor, umfassend das Oligonucleotid nach Anspruch 5 oder 6.
Wirtszelle, in die der Vektor nach Anspruch 7 eingeführt wurde.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Peptids, das durch das Oligonucleotid nach Anspruch 5 oder 6 codiert wird, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 8 und Gewinnen des Peptids aus der Kultur.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das mit einem Träger, der dessen Immunogenität erhöht, vorzugsweise mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), konjugiert ist.
Antikörper oder ein Fragment davon, der/das spezifisch an ein Peptid nach Anspruch 1 oder 2 bindet.
Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 11, der monoclonal ist.
Antikörper oder ein Fragment davon, der/das spezifisch an das Peptid nach Anspruch 3 oder 4 bindet.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 13, der monoclonal ist.
Zelllinie oder Wirt, die/der den Antikörper oder das Fragment davon nach einem der Ansprüche 11 bis 14 produziert, wobei die Zelllinie ein Hybridom ist oder wobei der Wirt ein Nagetier, ein Schaf, eine Ziege, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen oder ein nicht-menschlicher Primat ist.
Impfstoff, umfassend das Peptid nach Anspruch 1 oder 2.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 und/oder des Antikörpers oder des Fragments davon nach Anspruch 13 oder 14, zum Nachweis oder zur Quantifizierung in vitro von HIV-1-gp120, HIV-1-Virionen oder HIV-1-infizierten Zellen.
Verwendung des Antikörpers oder des Fragments davon nach Anspruch 11 oder 12, zum in vitro-Nachweis von Zellen, die gC1q-R exprimieren.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 2, und/oder des Antikörpers oder Fragments davon nach Anspruch 11 oder 12, und/oder des Antikörpers oder Fragments davon nach Anspruch 13 oder 14 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer HIV-1-Erkrankung oder zur Prävention einer HIV-1-Infektion.