DE69105627T2

DE69105627T2 - Immunreagenzien reaktiv mit einem konservierten Epitope des humanen Immundefizienzviruses I (HIV-I) GP120 und Verfahren zu deren Verwendung.

Info

Publication number: DE69105627T2
Application number: DE69105627T
Authority: DE
Inventors: David Da-I Ho; James Edmun Robinson
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center; Louisiana State University
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center; Louisiana State University
Priority date: 1990-05-29
Filing date: 1991-05-29
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2011-05-30
Also published as: EP0614985A1; AP9100280A0; AP237A; US6054284A; EP0459779A1; GR3015269T3; DK0459779T3; ES2067866T3; AU643285B2; AU5510794A; US6190871B1; OA09499A; ATE115189T1; AU660574B2; AU7803591A; EP0459779B1; JPH05500818A; JP2792733B2; DE69105627D1; WO1991018928A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immuntherapy. Spezifischerweise betrifft die Erfindung die Entwicklung von Antikörpern und Derivaten davon, Zellinien, die die Antikörper sekretiren, und Verfahren zu ihrer Verwendung zur Vorbeugung, Bestimmung, Verbesserung oder Behandlung von HIV-Erkrankungen, insbesondere von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) und ARC (AIDS Related Complex).
Jüngste wissenschaftliche Forschungen haben sich auf ein extrazelluläres Glycoprotein des Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1), nämlich gp120 konzentriert. Es wird angenommen, daß dieses Glycoprotein eine entscheidende Rolle bei der Bindung von HIV-1 an eine Wirtszelle spielt, in dem es spezifisch an den zellulären Receptor CD4 der Wirtszelle bindet und deshalb für die Entwicklung eines AIDS-Impfstoffes von Bedeutung ist. Das gp120 kodierende Gen ist jedoch unter verschiedenen HIV-Stämmen hoch variabel, einschließlich sequentieller Isolate des gleichen Patienten (1-4). Die größte Variabilität wurde in verschiedenen hypervariablen Regionen festgestellt, die durch mehrere konservierte Regionen (3,4) flankiert sind.
Als Antwort auf das AIDS-Virus produziert das Immunsystem des Wirtes Antikörper die gegen verschiedene Antigene oder Determinanten von gp120 gerichtet sind. Einige dieser Antikörper haben einen neutralisierenden Effekt und inhibieren die HIV-Infektiosität. Es wird angenommen, daß der neutralisierende Effekt der Fähigkeit der Antikörper zuzuschreiben ist, mit den zellulären Bindungen von HIV zu interferieren. Es wird außerdem angenommen, daß dieser Effekt teilweise die ziemlich lange Latenzzeit zwischen der anfänglichen Serokonversion und dem Ausbruch der klinischen Symptome erklären könnte.
Unsere größte bisherige Kenntnis darüber, welche Domänen von gp120 immunogen sind, stammt aus Studien von in Versuchstieren gezüchteten Antikörpern. Es wurde zuerst beobachtet, daß eine Vielzahl von mit gereinigtem oder rekombinantem gp120 oder gp 160 immunisierten Tieren stammspezifische neutralisierende Antikörper (5 bis 7) entwickelten. In der Folge wurde gefunden, daß polyklonale tierische Antiseren gegen rekombinante oder synthetische Peptide, die die dritte hypervariable Domäne (V3) von gp120 (umfassend die Aminosäurereste 307-330) repräsentieren, eine ähnliche stammspezifische neutralisierende Aktivität zeigen. Diese Beobachtung identifizierte die V3-Domäne als Hauptziel der Neutralisation, zumindestens bei Versuchstieren (8,9). Die V3- hypervariable Region wird durch konservierte Cysteinreste flankiert, die eine Disulphidbindung bilden können und eine "Loop-"-Region definieren, die die überwiegend konservierte Sequenz Gly-Pro-Gly in ihrem Zentrum enthält. Es wurde gefunden, daß sythetischen Loop-Region-Peptide die Produktion von Antikörpern, die nur Viren neutralisieren, die aus Isolaten erhalten wurde, aus denen das synthetische Peptid abgeleitet wurde, hervorrufen. Die V3-Loop induziert deshalb Typen-spezifische neutralisierende Antikörper; aber diese Antikörper sind nicht für die breite Virus-neutralisierende Aktivität, die im Serum der meisten infizierten Personen festgestellt wird, verantwortlich.
Es wurden verschiedene typenspezifische neutralisierende Maus- monoklonale Antikörper hergestellt, die an Epitope innerhalb der V3-Domäne (10-12) binden, was eine präzise Khartierung dieser Epitope erlaubt. Maus-monoklonale Antikörper wurden auch an Epitopen erzeugt, die mit der CD4-Bindungsregion nahe dem COOH-Terminus von gp120 (14-15) associert sind; aber das Ausmaß, in dem diese Region auch in der Neutralisation involviert ist, wurde noch nicht abschließend festgestellt. Obwohl die Peptidsequenz in dieser Region relativ gut konserviert ist, bestimmte Lasky et al (14) geringe Sequenzdifferenzen in verschiedenen Virusstämmen. Dieser Befund hat die Möglichkeit aufgeworfen, daß eine gewissene antigene Variation auch innerhalb der CD4-Bindungsdomäne auftreten könnte.
Unser gegenwärtiger Wissensstand darüber, welche Epitope von gp120 humorale Antworten in chronisch infizierten Menschen stimulieren, ist noch viel eingeschränkter. Im Gegensatz zu der typenspezifischen neutralisierenden Wirkung von Tierantiseren enthalten Seren von HIV-infizierten Patienten im allgemeinen breit-reaktive, gruppenspezifische neutralisierende Antikörper (15-17). Solche breit neutralisierenden Antikörper können gegen eine konservierte Stelle an gp41 gerichtet sein, gegen Antikörper die spezifisch für gag-Proteine sind (31-35), oder möglicherweise gegen Konformations-Epitope an gp120 (42). Trotzdem haben einige Gruppen von Forschern auch beobachtet, daß einige Patientenseren bestimmte Muster von Stamm-restriktierter neutralisierender Aktivität zeigen, wenn sie gegen eine Vielzahl von Stämmen getestet werden (5,6,18,19). Darüberhinaus wurde gezeigt, daß Patientenantikörper, die einer Affinitätsreinigung an gp120 einiger Virusstämme unterworfen wurden, typenspezifische neutralisierende Wirkung gegen diesen Stamm zeigen (6). Diese Beobachtungen lassen vermuten, daß die Mehrzahl von Antikörpern, die im allgemeinen in HIV-1 positiven Patientenseren gegenüber variablen Epitopen festgestellt werden, wichtige spätere Antikörperantworten gegenüber einer breiten Epitopenneutralisation maskieren könnten, von denen angenommen wird, daß sie sich ca. 6 bis 12 Monate nach der anfänglichen HIV-Serokonversion entwickeln. Deshalb besteht die Notwendigkeit für die Entwicklung solcher Mittel mit breiten Bindungs- und Neutralisationsfähigkeiten für die Vorbeugung, Diagnose und Behandlung von mit HIV und AIDS in Beziehung stehenden Infektionen. Die vorliegende Erfindung wird dieser Notwendigkeit gerecht und stellt damit im Zusammenhang stehende Fortschritte dar.
Es wurden humane monoklonale Antikörper gefunden, die eine Bindungsaffinität für eine spezifische konservierte antigene Determinante von gp120 zeigen. Tests zeigen, daß diese Bindung von der tertiären oder nicht linearen Struktur des Glycoproteins abhängig ist, und wichtig ist für die HIV- Neutralisation und die CD4-Bindung. Zusätzlich und zum Teil aufgrund der unerwarteten und überraschenden Wirkung, mit der HIV-Infektion durch diese monoklonalen Antikörper neutralisiert wird, wird angenommen, daß die HIV-Determinante in der CD4-Bindungsregion von gp120 lokalisiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt deshalb einen Antikörper oder ein Antikörperfragment bereit, der (das) durch eine spezifische Reaktivität mit einer konservierten nativen konformationsabhängigen antigenen Determinante charakterisiert ist, die in der CD4-Bindungsregion von HIV-1 gp120 vorhanden ist, und die durch einen Antikörper erkannt wird, der durch die Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70-2.1H (CRL 10758) sekretiert wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls bereit:
- eine kontinuierliche Zellinie, Z.B. eine vom Menschen abgeleitete Zellinie, die einen Antikörper oder ein Antikörperfragement gemäß der Erfindung produziert;
- ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Antikörperfragments, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper oder das Antikörperfragment aus einer kontinuierlichen Zellinie gemäß der Erfindung erhält; und
- einen Anti-idiotypischen Antikörper, der eine konservierte native konformationsabhängige antigene Determinante nachbildet, die in der CD4-Bindungsreaktion von HIV-1 gp120 vorhanden ist, und die durch einen Antikörper erkannt wird, der durch die Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70-2.1H (CRL 10758) sekretiert wird.
Die Antikörper, Antikörperfragmente und Anti-idiotypischen Antikörper können humane, Hybride, Chimäre oder recombinante, gereinigte oder durch irgendein Verfahren hergestellte Antikörper sein. Sie können an Toxine konjugiert sein, um die Immuntoxizität zu erhöhen oder an andere Moleküle, um die Immunogenizität zu erhöhen. Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann deshalb an ein Molekül konjugiert sein, um die biologische Aktivität des Antikörpers oder des Antikörperfragments zu erhöhen, oder an einen Marker. Es kann an ein Immunotoxin oder an ein Immunogen konjugiert sein.
Ein Chimären-Antikörper kann ein Hybrid eines Maus-Antikörpers und eines menschlichen Antikörpers sein. Die Antikörper sind typischerweise monoklonale Antikörper. Antikörperfragmente sind typischerweise F(ab)2 Fragmente. Die Antikörper und Antikörperfragmente können in equivalenter Weise an gp120 binden und/oder eine ähnliche Neutralisationsaktivität besitzen. Die Antikörper, Antikörperfragmente und Anti- Idiotypen können zur Vorbeugung, Diagnose, Behandlung oder Verbesserung mit HIV in Beziehung stehenden Erkrankungen verwendet werden.

(a) Definitionen

Die hier verwendeten Begriffe "gp120 Antigen", "gp120 antigene Determinante" und "Epitop von HIV-1 gp120" beziehen sich auf den Teil des HIV-1 Virus, der dazu fähig ist, mit den erfindungsgemäßen Antikörpern und Antikörperfragementen und mit den T-Zellreceptoren zu kombinieren, und der dazu fähig ist, eine Immuantwort zu induzieren.
Die hier verwendeten Begriffen "reaktiv" oder "Reaktivität" beziehen sich auf die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Antikörpers, Antikörperfragments oder anti-idiotypischen Antikörpers ein Antigen, eine antigene Determinante oder ein Epitop zu erkennen, an es zu binden und/oder es nachzubilden.

(b) Verfahren zur Herstellung

Weil Epitope die von immunisierten Tieren erkannt werden, von solchen verschieden sein können, die eine Antikörperantwort in natürlich infizierten Menschen stimulieren, wurden menschliche monoklonale Antikörper (HMabs) hergestellt, die immunogene Antworten chronisch infizierter Patienten auf gp120 Antigene darstellen. Diese Herstellung hat übrigens eine präzisere Identifizierung und Charakterisierung der konservierten und der varianten gp120 Determinanten, die vom menschlichen Immunsystem erkannt werden, erlaubt. Diese IgG HMabs werden durch B-Zellinien erzeugt, abgeleitet durch EBV-Transformation peripherer Blut B-Lymphocyten, erhalten aus 3 asymptomatischen HIV-1 infizierten Patienten.
Erfindungsgemäße Antikörper und Antikörperfragmente können deshalb aus einer Zellinie erhalten werden, die durch Epstein- Barr-Virustransformation von B-Lymphocyten aus einem HIV-1 infizierten Patienten hergestellt wurden. Die Antikörper und Antikörperfragemente können jedoch auch in Tieren oder mit Hilfe von Hybridoma-Verfahren (monoklonale Antikörper in Mäusen oder monoklonale Antikörper in Menschen) hergestellt werden, oder in Hefe, Bakterien oder Säugetierzellen durch rekombinante Verfahren. Die Säugerzellen können die Zellen einer menschlichen Zellinie sein.
Insbesondere N70-1.5e, N70-1.7B, N70-2.1H und Y76-4.8D binden an ein bis jetzt nicht beschriebenes und nicht erkanntes konformationabhängiges Epitop an gp120, und zeigen eine überraschend große Wirkung bei der HIV-Neutralisation. Dieses Epitop erscheint auch für die Induzierung der breiten HIV neutralisierenden und zellbindenden inhibitorischen Aktivität verantwortlich sein, die in HIV-infizierten menschlichen Seren beobachtet wurde.
Antikörper oder Antikörperfragment, die an diese Stell binden, können verwendet werden, um Anti-idiotopische Antikörper zu erzeugen. Diese Anti-Idiotopen teilen gewisse dreidimensionale Merkmale mit dem ursprünglichen Antigen, an welches unsere Antikörper binden. Darüberhinaus bilden die Anti-Idiotopen die HIV Antigene nach, wenn sie aus den erfindungsgemäßen Antikörpern und Antikörperfragmenten gebildet werden.
Darüberhinaus sind die Anti-Idiotopen gegenüber Menschen relativ nichttoxisch, und rufen eine Immunantwort auf gleiche Weise wie die korrespondierenden Epitope der ursprünglichen Antigene hervor, jedoch ohne begleitende virale Bedrohung des Patienten. Durch Herausforderung eines Immunsystems des Patienten mit einer vernünftigen Mischung von Anti-Idiotopen kann eine breite Immunantwort gegenüber vielen Varianten des HIV-Virus induziert werden. Dies ist auf dem Gebiet der Immuntherapie als aktive Immunisierung bekannt, und ist ein Gebiet, auf dem diese Bindung wertvoll eingesetzt werden könnte. Der Anti-idiotypische Antikörper könnte kovalent an eine Festphasenmatrix zur Affinitätsreinigung gebunden werden, und das gereinigte Produkt, in Mischung mit einem annehmbaren pharmazeutichen Träger, als AIDS-Impfstoff verwendet werden.
Hier werden spezifisch der menschliche monoklonale Antikörper N70-1.5e (I5e) als prototyper Antikörper beschrieben, und die zur Zeit beste erfindungsgemäße Ausführungsform. Es ist jedoch klar, daß zukünftige Ausführungsformen mit besseren oder breiteren N70-1.5e-ähnlichen Charakteristika aufgefunden oder erzeugt werden können, oder andere Ausführungsformen verwendet werden können, ohne sich aus dem erfindungsgemäßen Rahmen zu entfernen. In dieser Hinsicht werden spezifischerweise auch die menschlichen monoklonalen Antikörper N70-1.7B, N70-2.1H und Y76-4.8D beschrieben, die nach dem Auffinden von N70-1.5e gebildet wurden, und die in vorläufigen Versuchen ebenfalls N70-1.5e-ähnliche Bindungs- und Neutralisationsaktivität zu besitzen scheinen.

(c) Anwendung

Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich bereit:
- eine für Injektionszwecke geeignete Zusammensetzung, die ein Medium umfaßt, das einen erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragment oder Anti-idiotypischen Antikörper in Mischung mit einem pharmazeutischen annehmbaren Träger umfaßt;
- ein Immunoassay-Verfahren zur Bestimmung von mit AIDS-Virus in Beziehung stehender Infektion beim Menschen, das umfaßt:
in Kontakt bringen einer Testprobe eines Menschen mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragment oder Anti- idiotypischen Antikörper, und
Bestimmen der Gegenwart der konservierten nativen konformationsabhängigen antigenen Determinante in der Probe, die in der CD4-Bindungsregion von HIV-1 gp120 vorhanden ist, und die durch die durch die Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70-2.1H (CRL 10758) sekretierten Antikörper erkannt wird; und
- einen diagnostischen Kit umfassend:
einen erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragment oder Anti-idiotypischen Antikörper, und
ein Signalreagens.
Die folgenden vorgeschlagenen Verwendungen der vorliegenden Erfindung beabsichtigten nicht, den Rahmen der Erfindung darauf zu beschränken, sondern sollen vielmehr nur als kleiner Ausschnitt die breiten Applikationsmöglichkeiten und das enorme Potential verständlich machen und veranschaulichen.
Die erfindungsgeinäßen Antikörper, Antikörperfragmente und Anti-idiotypischen Antikörper können therapeutisch in verschiedenen Situationen verwendet werden:
1. zur Vorbeugung von HIV-1 Infektion bei Personen, die akut HIV ausgesetzt werden (z.B. durch Nadelstiche);
2. zur Vorbeugung der Übertragung von HIV infizierten Müttern auf Kinder;
3. zur passiven Immuntherapie von Patienten mit HIV-Infektion;
4. zur aktiven Immuntherapie von Patienten unter Verwendung einer Mischung von Anti-idiotypischen Antikörpern oder equivalenten Immunreagentien.
Die Antikörper, Antikörperfragmente und/oder Anti- idiotypischen Antikörper können deshalb in Mischung mit einem annehmbaren pharmazeutischen Träger zur Entwicklung eines Impfstoffes gegen AIDS verwendet werden, sowie zur Beobachtung der Retention des Konformationsepitops in HIV-1 Impfstoffen, die das gesamte oder einen Teil von gp120 enthalten.
Zusätzlich können die Antikörper, Antikörperfragmente und/oder Anti-idiotypischen Antikörper in einem Immunoassay zur Diagnose von AIDS in einer menschlichen Testprobe verwendet werdend und zur Verfolgung von Antikörper-Antworten in AIDS- Impfstoff-Empfängern. Die Testprobe zur Verwendung in einem Immunoassay kann irgendeine aus Gesamtblut, Lymphflüssigkeit, Serum, Plasma, Samen, Speichel und cerebraler Rückenmarksflüssigkeit sein; und die Gegenwart der AIDS-Virus- Infektion kann durch die Gegenwart von gp120 Antigen/Antikörper-Komplexen in der Testprobe angezeigt werden. Vorzugsweise wird die Gegenwart der konservierten nativen konformationsabhänigen HIV-1 gp 120 antigenen Determinante in der Probe bestimmt, indem man die Testprobe auf die Gegenwart von Komplexen, die die Determinante und den Antikörper, das Antikörperfragment oder den Anti-idiotypischen Antkörper umfassen, prüft, wobei die Gegenwart dieser Komplexe die Gegenwart einer AIDS-Virusinfektion anzeigt.
Für alle solche diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Verwendungen können die monoklonalen Antikörper und/oder deren Derivate sowie andere notwendige Agentien und geeignete Vorrichtungen und Zubehör in Form eines Kits bereitgestellt werden. Der Kit kann als einzelner Container, individuelle Flaschen, Beutel, Ampüllen oder andere Container hergestellt werden, von denen jeder eine wirksame Menge an Antikörper, Antikörperfragment oder Anti- idiotypischem Antikörper für die therapeutische oder diagnostische Verwendung enthält. Dieser Kit kann z.B. umfassen den Antikörper, das Antikörperfragment oder den Anti- idiotypischen Antikörper in einem einzelnen Container, gegebenenfalls als lyophilisierter Pfropfen, und einen Container für Lösungen zur Rekonstituierung. Der Antikörper oder das Antikörperfragment können unmarkiert sein.
Die Antikörper, Antikörperfragmente und Anti-idiotypischen Antikörper können auch verwendet werden, um die Struktur und Funktion verschiedener anderer gp120 Determinanten aufzuklären. Unter anderem werden deshalb auch beschrieben und beansprucht menschliche monoklonale Antikörper N70-1.5e und N70-2.1H und deren Derivate, und die Zellinien die die Antikörper produzieren, die auf equivalente Weise an gp120 binden, und die eine ähnliche Neutralisationsaktivität haben, und ihre Verwendung zur Vorbeugung, Diagnose, Behandlung oder Verbesserung von mit HIV in Beziehung stehenden Erkrankungen.
Die vorliegende Erfindung wird im Zusammenhang mit den beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen bedeuten:
Figur 1 ist ein Western-Blot der HMab-Reaktivität mit 2 HIV-1 viralen Stämmen, IIIB und J62. Die Reaktivität von 4 HMabs mit Streifen in beiden Feldern ist die folgende: Spur 1, K24-3b, Spur 2, N70-2.3a, Spur 3 N70-1.5e, Spur 4, N70-1.9b. Spur 5 zeigt die Reaktivität von Schaf-Anti-HTLV-IIIB gp120.
Figur 2 ist ein Punkt-Blot, der die Reaktivität von 4HMabs mit gereinigtem gp120 vom Stamm J62, nicht reduziertem rekombinantem LAV gp 120, reduziertem rekombinantem LAV gp120 und nicht reduziertem erhitztem LAV gp120 zeigt.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung der ELISA-Reaktivität von K24-3b und N70-2.3a HMabs mit Con-A immobilisiertem gp120 aus 9 Stämmen von HIV-1. Die Ergebnisse sind als mittlere optische Dichte (O.D.) aus 3 Bestimmungen angegeben. Die Standardabweichungen sind angegeben. H72 ist die Codebezeichnung für ein HIV-1-Antikörper-positives Kontrollserum.
Die Figur 4 ist eine graphische Darstellung der ELISA- Reaktivität von N70-2.3a, N70-1.5e und N70-1.9b HMabs mit Con- A immobilisiertem gp 120 aus 8 Stämmen von HIV-1. Die Ergebnisse sind als Einzelbestimmungen angegeben.
Die Figur 5 zeigt die Reaktivität von K24-3b und N70-2.3a HMabs mit Western-Blots, hergestellt aus 8 unabhängigen HIV-1 Stämmen. Das Feld A stellt die Reaktivität von K24-3b dar; und das Feld B stellt die Reaktivität von N70-2.3a dar. Die verschiedenen Stämme werden durch Codenummern am oberen Ende jeder Blot-Spur angegeben; IIIB bezieht sich auf HTLV-IIIB.
Die Figur 6 stellt serologische Untersuchungen dar, die mit HMab I5e gegenüber verschiedenen HIV Varianten allein, oder in Kombination mit löslichem CD4 (sCD4), Dithiotreitol (DTT) und Tunicamycin durchgeführt wurden. Im einzelnen bedeuten:
Feld A stellt die I5e Reaktivität mit verschiedenen HIV-1 Isolaten dar: IIIB, RF, AL, MN und Z84; worin PC das positive Kontrollserum, das mit IIIB Proteinen reagiert, ist.
Das Feld B stellt den Wettstreit zwischen I5e und sCD4 um die Bindung an gp120/160 von HIV-1 dar.
Das Feld C stellt dar, daß die gp120 Reduktion durch DDT die I5e Reaktivität eliminiert.
Das Feld D stellt dar, daß die I5e-Reaktivität mit dem Hüllenprotein von HIV-1 verloren geht, wenn die Glycosylierung durch Tunicamycin inhibiert wird.
Die Figur 7 veranschaulicht die I5e Neutralisation verschiedener HIV-1-Isolate: -O-, IIIB; -Δ-, RF; , Z84; , AL; ., MN; , SA3.
Die Figur 8 zeigt die I5e Neutralisation von 9 von 10 primären HIV-Isolaten. Bemerkenswert ist die variable Wirkung. ., AC, ., JRCSF; Δ, JRFL; , LS; , CC; , JM; , RP; , TB; , EP; , LL.
Die Figur 9 veranschaulicht, daß I5e die CD4-gp120-Bindung wirksamer blockiert als HMab gegen das Epitop, wie von Lasky et al beschrieben.
Die Figur 10 stellt einen weiteren Beweis dafür dar, daß die I5e Bindungsstelle neu ist. Insbesondere zeigt die Figur 10 den Wettstreit für die I5e-Bindung an gp120 durch [A] andere anti-gp120 MAb's: 9784 ( ; gegen den V3-Loop von gp120 gerichtet); G3-536 (.), G3-537 ( ), und G3-136 (Δ); und durch [B] normales menschliches Serum (.) und HIV-1-positives menschliches Serum (Δ, ., , ).
In Figur 10A wird kein Wettstreit zwischen I5e und auf die vorstehend beschriebenen Epitope gerichteten Antikörpern beobachtet (d.h. "loop", NH3-Terminus, und die Lasky-Stelle).
Die Figur 10B zeigt die konkurrierende Inhibierung der I5e- Bindung durch von 6 AIDS-Patienten erhaltene Seren. Die konkurrierende Inhibierung von I5e trat bei rekonvalescenten- Seren auf, aber nicht mit Seren von akuten Serokonvertern. Es wird angenommen, daß I5e inhibierende Antikörper sich ca. 6 bis 12 Monate nach der anfänglichen HIV-Serokonversion entwickeln.
Die Figur 11 ist eine graphische Darstellung der ELISA- Reaktivität von N70-1.7B und N70-2.1H HMabs mit Con-A immobilisiertem gp120 aus 11 HIV-1-Stämmen. Die Ergebnisse sind als mittlere O.D. aus dreifachen Bestimmungen angegeben. Die Standardabweichungen sind angegeben.

Detaillierte Beschreibung

A. Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern (HMabs)

Die folgenden Beispiele und Verfahren werden angegeben, um die Verfahren zur Herstellung der Antikörper, deren Derivate und ihrer Verwendung zu veranschaulichen. Sie beschränken jedoch in keiner Weise die Erfindung, die den gesamten Umfang der anliegenden Ansprüche umfaßt.

i. Epstein-Barr-Virustransformation

Periphere Blut-monoklonale Zellen (PBMC) aus 3 erwachsenen HIV-1 seropositiven Männern wurden an Ficoll-Hypaque- Gradienten isoliert. PBMC wurde von CD3 positiven T-Zellen abgereichert unter Verwendung einer indirekten Panning-Technik (20), in der Zellen, die mit dem OKT3 monoklonalen Antikörper reagieren, an Petrischalen, die mit F(ab)2 Antikörpern gegen Maus IgG beschichtet waren, absorbiert wurden. Nicht- anhaftende Zellen, angereichert an B-Zellen, wurden mit dem B95-8 Stamm von EBV (21) inokuliert und mit 10³ oder 10&sup4;- Zellen pro Vertiefung in Mikrotiterplatten für Zellkulturen mit 96 Vertiefungen gegeben zusammen mit bestrahlten menschlichen Nabelschnur-Blutlymphocyten (HUCL, 10&sup5; Zellen pro Vertiefung) als Feeder-Zellen. Die Kulturen wurden in RPMI 1640, das 5 % fetales Kälberserum (FCS) und 1 % Nutridoma-HU (Boehringer-Mannheim) enthielt, belassen, einem Serumsubstitut mit niedrigem Proteingehalt.

ii. ELISA

Zur Immobilisierung von HIV-1-Antigenen in den Vertiefungen von ELISA-Platten zum Antikörper-Screening wurden 2 Verfahren verwendet. In einem System wurden HIV-1 infizierte H9-Zellen in Concanavalin-A (Con-A) beschichteten Vertiefungen immobilisiert und dann mit 1:1 Aceton-Methanol fixiert. Die Vertiefungen wurden mit RPMI-10 % FCS eine Stunde lang blockiert. Die Flüssigkeiten aus Kulturen (96 Vertiefungen) wurden in Vertiefungen in den Assayplatten transferiert.
Nach einer Stunde wurden die Vertiefungen mit Phosphat gebufferter Salzlösung (PBS), die 0,1 % Triton-X 100 (PBS-Tx) enthielt, gewaschen und dann mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper gegen menschliches IgG (Protos Labs) umgesetzt. Die Farbe wurde mit 100 ul Tetramethylbenzidine (TMB)-H202 als Substrat entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H2SO4 beendet und die Farbe wurde als optische Dichte (O.D.) bei 450 nm mit einem Titertek Multiskan ELISA-Lesegerät abgelesen.
Das andere ELISA-Verfahren war ein neuer Immunoassay, der auf der Beobachtung basierte, daß HIV-Hüllenglycoproteine über ihre Kohlenhydrateinheiten an Con-A (22) binden. In diesem System wurden Vertiefungen von Immulon-2-Assayplatten (Dynatech) mit 200 ul/ml Con-A in PBS beschichtet. Die Vertiefungen wurden dann mit 100 ul von mit Detergens zerstörter Überstandsflüssigkeit aus HIV-produzierenden Zellinien, die 2 bis 3 Tage in serumfreiem RPMI, das mit 1 % Nutridoma-Hu ergänzt war, inkubiert. In Abwesenheit von Serumkomponten binden die zerstörten viralen Glycoproteine, die in solchen Kulturflüssigkeiten sind, an Con-A in ausreichenden Mengen um als Festphasen-Antigene in einem hochsensitiven ELISA zu fungieren. Unumgesetzte Con-A- Bindungsstellen wurden mit RPMI-10 % FCS eine Stunde lang blockiert. Aus Kulturflüssigkeiten von uninfizierten MT4 Zellen wurden Kontrollantigene auf ähnliche Weise hergestellt. Transformierte B-Zellkulturflüssigkeiten wurden sowohl in Antigen beschichtete als auch in Kontrollvertiefungen von Assayplatten transferiert, die eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Im ersten Assay wurde die Bindung der Antikörper gemessen. Dieser ELISA wurde auch in späteren Versuchen zum Test auf Reaktivität von HMabs mit Glycoproteinen aus verschiedenen Virusstämmen verwendet.

iii. HTV-Stämme

11 HIV-1 Stämme wurden in diesen Untersuchungen verwendet. Die Stämme C39, J62, SA90, SA96 und L86 wurden in unserem Laboratorium aus Mitogen-aktivierten T-Zellen von 5 asymptomatischen HIV-1 infizierten Personen durch Co- Kultivierung mit aktivierten normalen T-Zellen in einem mit Interleukin-2 (IL-2) ergänzten Medium isoliert. Stamm SA3 wurde auf ähnliche Weise in unserem Laboratorium von einem Patienten mit AIDS isoliert. Der Stamm HiTi (23) wurde von Robert Garry, Tulane Medical School, erhalten; Stamm K3 wurde von S.R.S. Rangan vom Tulane Delta Primate Center erhalten; HTLV-IIIB (24), der Prototyp HIV-1-Stamm, wurde von der American Type Culture Collection erhalten; HTLV-IIIMN (25-26), sowie glycosyliertes rekombinamtes gp120 von HIV-ISF2 (27) wurden vom AIDS Research and Reference Reagent Program erhalten. Die Stämme C39, J62, SA96, und SA90 wurden in MT4- Zellen gezüchtet (28); HTLV-IIIB, HTLC-IIIMN, SA3, HiTi, und K3 wurden in H9-Zellen gezüchtet. Stamm L86, isoliert aus dem B-Zellen-Donor eines monoklonalen Antikörpers (K24-3B) zeigte keine Replikation in kontinuierlichen T-Zellinien und wurde in Mitogen-aktivierten Nabelschnurblut-T-Zellen in einem Medium, das 100 Einheiten pro ml rekombinantes IL-2 enthielt, erzeugt. Um Antigene für Con-A-Immobilisierung herzustellen, wurden mit jedem Virusstamm infizierte Zellen 2 bis 3 Tage in serumfreiem Medium RPMI, ergänzt mit 1 % Nutridoma-HU, gezüchtet. Die geklärten Flüssigkeiten wurden mit 1 % Triton-X behandelt und in aliquoten Teilen bei -20 ºC bis zur Verwendung gelagert.

iv. Western-Blot und Punkt-Blot (Dot Blot) Assays

Extrakte von 1-2 x 107 HIV-1 infizierten Zellen wurden hergestellt durch Solubilisierung von Zellen während 30 Minuten in 1 % Triton-X, gefolgt von einer Entfernung von unlöslichem Material durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge. Die Proben wurden 1:1 mit Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probepuffer ohne Reduktionsmittel gemischt und 5 Minuten bei 90 ºC erhitzt. Die Zellysate von uninfizierten H9 und MT4-Zellen wurden auf ähnliche Weise hergestellt. Die Proben wurden durch Elektrophorese in 7.5 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen in einer BioRad Minigel-Apparatur fraktioniert. Die Proteinen wurden dann elektrophoretisch auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen. Western-Blot-Streifen wurden mit Blockierungspuffern (1 % Rinderserumalbumin, 0.5 % Tween 20, in 0.5 M NaCl, 10 mM Tris, pH = 8) inkubiert, zuerst mit jeder Antikörperpräparation umgesetzt, und dann mit alkalischen Phosphatase-konjugierten Antikörpern gegen menschliches oder Schaf-IgG, wie gewünscht. Gefärbte Banden wurden unter Verwendung von Nitroblau Tetrazol und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBT-BCIP) als Substrat entwickelt. Ein Schafantiserum gegen gp120 von HTLV-IIIB, erhalten vom AIDS Research and Reference Reagent Program wurde als positive Kontrolle zur Bestimmung von gp120/160 verwendet.
Für die Dot-Blot-Assays wurde Streifen von Nitrocellulose mit 1 ul Baculovirus-produziertem, rekombinantem LAV gp120 bei 100 ul/ml und J62 Hüllenglycoproteinen dotiert, die aus mit Detergens behandeltem serumfreiem Kulturmedium durch Linsenlectinaffinitätschromatographie gereinigt wurden (22) und auf 10 ul/ml konzentriert wurde. Rekombinantes gp120 wurde ebenfalls angetüpfelt, nachdem es 5 Minuten lang bei 95 ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol erhitzt wurde. Die Antikörperassays an den Dot-Blot-Streifen wurden wie für die Western-Blots durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Ziegenantiserum gegenüber gp160 von HTLV-IIIB (29) als positive Kontrolle verwendet wurde.

v. Isolierung von Antikörper produzierenden B-Zellinien

Im ersten Transformationsexperiment wurden EBV exponiertes, an T-Zellen abgereichertes PBMC aus einem HIV-1 infizierten Spender mit 10³ Zellen pro Vertiefung in Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen) mit bestrahlten HUCL-Feeder-Zellen gegeben. Nur ca. 50 % der Kulturen wurden nach 4 bis 5 Wochen Kultivierung transformiert. Die Kulturflüssigkeiten wurden durch ELISA auf IgG Antikörper durch Umsetzung mit fixierten, immobilisierten HIV infizierten H9-Zellen gescreent. Eine transformierte Kultur, bezeichnet als K24-3b,.war ein stabiler Produzent eines Antikörpers, der bei weiteren Testen durch indirekte Immunfluorescenz sowohl mit fixierten als auch mit unfixierten HIV-1-infizierten Zellen reagierte, aber nicht mit nicht infizierten Zellen. Multiple Subkulturen von K24-3b Zellen wurden mit geringer Zelldichte erstellt und alle zur Herstellung von Antikörpern fortgesetzt. Es war nicht möglich, definitiv K24-3b zu klonen, nach ca. 8 Monate hörten alle Subkulturen auf zu wachsen; aber zu diesem Zeitpunkt waren bereits ca. 1 l eines Antikörper enthaltenden Kulturmediums gesammelt. Weil die ursprünglichen Zellen mit einer relativen niedrigen Zelldichte aufplattiert wurden und das Auftreten von Transformation geringer als 50 % war, ist es wahrscheinlich, daß die K24-3b-Zellinie als ein Klon vorhanden war.
In dem zweiten Experiment wurde EBV exponiertes an T-Zellen abgereichertes PBMC einer anderen HIV positiven Person mit 104 Zellen/Vertiefung mit bestrahltem HUCL in 2 Titerplatten (96 Vertiefungen) eingebracht. Transformation trat in 100 % der Vertiefungen ein. Die Kulturflüssigkeiten wurden mittels ELISA auf IgG Antikörper gescreent, die mit Con-A immobilisierten viralen Glycoproteinen, abgeleitet von J62-Stamm von HIV-1, gezüchtet in MT4-Zellen in serumfreiem Medium, reagierten 10 transformierte Kulturen produzierten IgG-Antikörper, die mit J62 Glycoproteinen reagierten, aber nicht mit Kontrollantigen. 7 Kulturen produzierten Antikörper für weniger als 2 Monate. 3 Zellinien, bezeichnet als N70-2.3a, N70-1.5e bzw. N70-1.9b waren stabile Antikörperproduzenten und wurden zu 10 Zellen pro Vertiefung geklont.
Die IgG-Subklasse und der Light-Chain-Typ von 4 der Antikörper wurden durch Reaktivität mit Maus monoklonalen Antikörpern gegen die 4 Heavy Chain-Subklassen (Behring Diagnostics) oder polyklonale Ziegenantikörper gegenüber lambda und kappa Light Chains in einem Sandwich-ELISA bestimmt. Diese 4 HMabs gehören zur IgGI-Subklasse; K24.3b, N70-1.5e und N70-1.9b enthalten kappa-Light-Chains und N70-2.3a enthält lambda-Light-Chains. Die Isotypisierung der 3 erst vor kürzerster Zeit produzierten HMabs, N70-1.7B, N70-2.1H und Y76-4.8D wurde noch nicht durchgeführt. Es wird jedoch angenommen, daß sie ebenfalls aufgrund ihrer Bindungsaffinität zu gp120 zu IgG-Subklasse gehören.

vi. Charakterisierung von HNab-Spezifizität durch Western-Blot und Dot-Blot-Assays

Die Figur 1 zeigt die Reaktivität von 4 der HMabs an Western Blots von Antigenen von 2 HIV-1-Stämmen, HTLV-IIIB und J62. An den Blots von HTLV-IIIB (Feld A) reagierten 3 HMabs (K24-3B, N70-2.3a und N70-1.5e) stark mit einer markanten Bande von ca. 120 kd und mit einer weniger intensiven Bande von 160 kd. Obgleich N70-1.9b schwach mit gp120 auf diesem Blot (Feld A, Spur 4) zu reagieren schien, reagierte es in anderen Assays mit HTLV-IIIB nicht. An Blots aus Stamm J62 (Feld B) zeigten alle 4 HMabs eine identische Bindung zu einer markanten Bande bei 160 kd, unterhalb der eine diffuse Bande war, die sich bis ca. 120 kd erstreckte. Dieses diffuse Bandenmuster ist charakteristisch für diesen Stamm. Die mit einem polyklonalen Schafantikörper gegen gp120 erhaltenen sich abbildenden Muster an Blots beider Stämme waren identisch mit denen die mit den monoklonalen Antikörpern (Felder A und B, Spur 5) beobachtet wurden. Die HMabs reagierten nicht mit Blots von nicht infizierter MT4 oder H9-Zellen.
Obwohl diese Ergebnisse anzuzeigen scheinen, daß diese 4 HMabs mit gp120 und seinem ungespaltenen zellulären Vorläufer, gp160, reagieren, führte Zolla-Pazner et al (30) neuerdings den Beweis, daß Banden, die als gp160/120 in einigen kommerziell erhältlichen HIV-1 Western Blot-Streifen identifiziert wurden, Multimere von gp41 sind. Um deshalb weiter zu bestätigen, daß die 4 HMabs tatsächlich spezifisch für gp120 sind, wurde ihre Bindung an Dot-Blots rekombinanter LAV gp120 und Linsenlectin-gereinigten J62-Glycoproteinen getestet. Wie die Figur 2 zeigt, reagierten 3 der 4 HMabs (K24-3b, N70-2.3 und N70-1.5e) stark mit rekombinantem gp120. N70-1.9b zeigte keine Bindung an LAV gp120, band aber an J62- Antigen. Die Menge an J62 Antigen-Dots war ca. 10 x geringer als die des rekombinanten Antigens, was die mit diesem Antigen beobachtete schwächere Fleckenbildung erklärt. Diese Ergebnisse zeigen deshalb, daß die in unseren Western-Blots beobachteten Banden von 120 und 160 kd tatsächlich gp120/160 repräsentieren.
In zusätzlichen Western-Blot-Untersuchungen reagierten weder K24-3b noch N70-2.3a mit Blots aus Zell-Lysaten, die in Probepuffer, der 2-Mercaptoethanol enthielt, erhitzt wurden, was darauf hindeutet, daß die identifizierten Epitope gegenüber Reduktion empfindlich sind. Um die Wirkung der Reduktion auf diese Epitope weiter zu untersuchen, wurden Antikörper an Dot-Blots rekombinanter gp120 LAV getestet, das bei 95 ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol erhitzt wurde. Die in Figur 2 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß K24-3b und N70-1.5e nicht an reduziertes Antigen band, daß die Bindung von N70-2.3 an reduziertes Antigen beträchtlich verringert war, und daß das Erhitzen allein nur leicht die antigene Aktivität dieser Antikörper verringerte. Da N70-1.9b nicht an LAV gp120 band, wurde die Wirkung der Reduktion an diesem Epitop in diesem Experiment nicht bestimmt. Wir haben danach N70-1.9b an Dot-Blots reduzierter und nicht reduzierter J62-Glycoproteine getestet und keine Reaktivität mit reduziertem Antigen festgestellt (unveröffentlichte Daten). Somit identifizieren aller 4 HMabs gegenüber Reduktion empfindliche Epitope.

vii. Analyse der Stammspezifität von HMabs durch ELISA

Die 4 vorstehend getesteten HMabs wurden auch durch ELISA auf die Reaktivität mit Con-A immobilisierten viralen Glycoproteinen aus verschiedenen HIV-1-Stämmen getestet. In einem Experiment (Figur 3) wurden Kulturflüssigkeiten von K24- 3b und N70-2.3a und ein HIV-1 positives Kontrollserum (H72) auf einem Feld mit 9 verschiedenen Stämmen getestet, die L86, den aus dem B-Zelldonor von K24-3b isolierten Stamm, enthielten. Antikörper N70-2.3a reagierte mit allen 9 Stämmen. Obgleich einige Unterschiede in der Bindung dieses Antikörpers auf dem Feld beobachtet wurden, wurden im allgemeinen mit dem positiven Kontrollserum parallele Unterschiede beobachtet. Es ist deshalb wahrscheinlich, daß die Bindungsniveaus von N70- 2.3a und dem H72-Serum ein relatives Maß für die Mengen an von jedem Stamm immobilisiertem gp120 darstellen. Wir haben keine Erklärung für die viel schwächere Reaktivität von N70-2.3a mit dem L86-Stamm im Vergleich zu dem positiven Serum. L96 war jedoch der einzige Stamm, der in IL-2 abhängigen primären T- Zellen gezüchtet wurde, die weniger Virus als kontinuierliche Zellinien freisetzen. Möglicherweise wurde mehr gp41 als gp120 in der L26 Viruspräparation immobilisiert und Antikörper gegen gp41 sind für die größere Serumreaktivität verantwortlich.
Durch Vergleich mit N70-2.3 zeigte das monoklonale K24-3b eine bemerkenswerte Variabilität in der Reaktivität mit diesen Viren. Dieser Antikörper reagierte mit 6 der 9 Stämme, band aber nicht an die Stämme SA3 oder K3, und zeigte eine minimale Bindung an Stamm SA 96. Während die Reaktivität von N70-2.3a und K24-3b mit den Stämmen L86 und J62 nahezu die gleiche war, war die Bindung von K24-3b an die Stämme SA90 und C39 viel geringer als von N70-2.3a, wobei der Unterschied mit SA90 am größten war. Diese Beobachtungen waren in Assays, die mit verschiedenen Ansätzen von Antigenen durchgeführt wurden, reproduzierbar. Geringere Unterschiede in der Bindung dieser 2 Antikörper waren ebenfalls mit den Stämmen HiTi und HTLV-III zu sehen. Diese Differenzen standen nicht in Beziehung zu den Antikörperkonzentrationen, da Präparationen von beiden in diesen Assays verwendeten Antikörpern die verfügbaren Antigen stellen an immobilisierten Antigenen abzusättigen schienen; und optische Dichten, die mit Serienverdünnungen bei den Antikörpern bis zu 1:32 erhalten wurden, waren nahezu die gleichen (die Daten sind nicht angegeben) wenn sie gegen das J62 Isolat getestet wurden. Diese Daten scheinen anzuzeigen, daß N70-2.3a ein konserviertes Epitop identifiziert, während K24-3b eine Epitopvariante identifiziert, die in diesem Feld von Virusstämmen heterogen exprimiert ist.
Die Figur 4 veranschaulicht Ergebnisse eines ähnlichen Versuchs, der die Reaktivitäten von N70-1.9b mit Con-A immobilisierten Glycoproteinen, abgeleitet aus 8 Stämmen, vergleicht. In diesem Experiment dient N70-2.3a als positive Kontrolle. Während sowohl N70-1.5e und N70-2.3a mit allen 8 Stämmen stark reagierten, reagierte N70-1.9b nur mit J62, dem Stamm, der beim Screenen der ursprünglichen B-Zellkulturen auf Antikörperproduktion verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß N70-1.5e, wie N70-2.3a, mit einem Epitop, das insoweit allen getesteten Stämmen zukommt, reagierte, während N70-1.9b mit einem auf einen Stamm beschränkten Epitop reagiert. In einem nachfolgenden Experiment wurde jedoch gefunden, daß N70- 1.9b, so wie die anderen HMabs, in ELISA mit Con-A immobilisierten Glycoproteinen von 2 anderen Stämmen, HTLV- IIIMN und HIV-1SF21 stark reagierten. Diese Ergebnisse, die in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben sind, zeigen, daß das N70-1.9b definierte Epitop nicht so stark auf einen Stamm beschränkt ist, wie dies die Ergebnisse in Figur 5 anfänglich vermuten ließ. Tabelle I Reaktivität von 4 HMabs mit Con-A- immobilisiertem gp120 von 3 HIV-1-Stämmen Optische Dichte mit dem angegebenen Stamm
Zusammenfassend ist insofern festzustellen, daß aufgrund unserer Daten darauf zu schließen ist, daß N70-2.3a und N70- 1.5e beide ein konserviertes Epitop identifizieren, während K24-3b und N70-1.9b (in geringerem Ausmaß) eine Epitopvariante zu identifizieren scheinen, die in einem Feld von Virusstämmen heterogen exprimiert ist. Darüberhinaus identifizieren alle 4 HMabs reduktionsempfindliche Epitope.

viii. Stammspezifität von HMabs durch Western-Blot Analyse

Die Stammspezifität von 2 der 4 HMabs, K24-3b und N70-2.3a, wurden ebenfalls an Western Blots, die aus dem vorstehend identifizierten Feld von HIV-1 Stämmen hergestellt wurden, getestet. Die in Figur 5 angegebenen Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit den durch ELISA erhaltenen Ergebnissen. Antikörper N70-2.3a reagierte mit gp120/160 aus allen 8 Stämmen. Antikörper K24-3b reagierte mit gp120/160 aus den gleichen Stämmen, die er im ELISA identifizierte. Auf ähnliche Weise reagierte K24-3b nicht mit SA3 und K3; und seine minimale Reaktivität mit Stamm SA96 war unterhalb der photographischen Empfindlichkeit. Obgleich N70-1.5e und N70- 1.9b durch Western Blots nicht auf gleiche Weise mit allen Viren getestet wurden, wird die stammrestriktierte Reaktivität von N70-1.9b, wie im ELISA beobachtet, durch die Nichtreaktivität mit rekombinantem LAV gp120 in Dot-Blot- Assays bestätigt.

ix. HMab N70-1.5e(I5e), der Prototyp und die beste Antikörper- Ausführungsform

Wir nehmen an, daß I5e HMab der Prototyp ist, weil er der erste entdeckte Antikörper war, der eine Spezifität für ein konformationsabhängiges Epitop, das in der gp120-CD4-Bindung involviert ist, besitzt. Seither haben wir 3 zusätzlich HMabs, N70-1.7B, N70-2.1H und Y76-4.8D erzeugt, von denen jeder I5e- ähnliche Charakteristika aufweist. Diese 3 neuen HMabs werden noch untersucht; vorläufige Daten im Hinblick auf ihre Neutralisationsbindungskapazität sind jedoch im nachfolgenden Abschnitt X angegeben. In der Zwischenzeit wurde der I5e HMab detailliert untersucht, wobei Routine-Laboratoriumsverfahren verwendet wurden (für Laboratoriumsverfahren siehe: Referenzen 16, 37 und 41). Unsere Ergebnisse in diesen nachfolgenden Testserien sind die folgenden.
In einem Radio-Immunopräzipitationsassay, der die in Figur 6A veranschaulichten Ergebnisse erbrachte, zeigte sich I5e als reaktiv mit gp120 und/oder seinem Vorläufer gp160 von HIV-1 Isolaten IIIB, MN und Z84, aber nicht mit RF und AL.
I5e wurde ebenfalls auf seine Neutralisationsaktivität gegenüber multiplen Laboratorien- und primären HIV-1-Isolaten getestet und es wurde gefunden, daß er eine breite Neutralisationsaktivität besitzt. Wie in den Figuren 7 und 8 veranschaulicht, zeigte HMab I5e in vitro eine Neutralisationsaktivität gegen 4 von 5 Laboratoriumsisolaten von HIV und 9 von 10 primären HIV-Isolaten. Noch bedeutender ist es, daß die Wirksamkeit der I5e-Neutralisation dieser Isolate durch ihre relativen niedrige ID50 und ID90-Werte realisiert werden kann. In Figur 7 sind I5e neutralisierte Laboratoriumsisolate IIIB, Z84, MN und SA3 mit 90 %-iger inhibitorischer Dosis (die Dosis die erforderlich ist, um die Aktivität um 90 % zu inhibieren; LD90) mit 0.4, 0.6, 3.5 bzw. 12.0 ug angegeben. Die Isolate RF und AL waren gegenüber Neutralisation durch I5e wiederstandsfähig, was mit den in Figur 6 angegebenen Ergebnissen. der Immunopräzipitation in Einklang steht. Der Neutralisationsassay wurde wie früher (16, 37, 41) beschrieben durchgeführt, wobei die p24- Antigenkonzentration im Überstand als Indikator für die Virusinfektion diente.
Die Figur 8 zeigt die Neutralisationsfähigkeit von I5e gegenüber 10 primären HIV-1 Isolaten. Wie dargestellt, wurden 6 primäre Stämme wirkungsvoll neutralisiert, mit einer ID90 von weniger als 1.5 ug, während mehr I5e erforderlich war, um 3 andere Stämme zu neutralisieren, und 1 Isolat war vollständig wiederstandsfähig. Diese Ergebnisse bestätigen die große Wirksamkeit und breite Spezifität von I5e bei der Neutralisation von HIV-Isolaten, und sind in tabellarischer Form in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt. Tabelle II I5e-Neutralisation Laboratoriumstämme: Klinische Isolate:
Als nächstes wurde I5e auf seine Fähigkeit untersucht, mit CD4 um die Bindung an gp120/gp160 zu konkurrieren, weil dies ein möglicher Mechanismus für die HIV-1 neutralisierende Aktivität ist. In dem in Figur 6B dargestellten Experiment wurden steigende Dosen von sCD4 einem methabolisch markierten Lysat von HIV-1 vor der Immunpräzipitation zugegeben. Lösliches CD4 konkurrierte mit I5E in einer dosisabhängigen Weise, was darauf hindeutet, daß das Epitop an gp120 für diesen menschlichen monoklonalen Antikörper an der Oberfläche sein dürfte, was einen Kontakt mit CD4 ergibt. Diese Beobachtung wurde durch einen quantitativen Konkurrenz-Enzymimmunoassay bestätigt, wobei rekombinantes gp120 indirekt auf der Festphase und sCD4 eingefangen wurde. Wie in Figur 9 dargestellt blockierte I5e die gp120-sCD4-Bindung in einer dosisabhängigen Weise. Tatsächlich war es in dieser Hinsicht wirksamer als zwei Maus Anti-gp120 monoklonale Antikörper, G3- 536 und G3-537, die früher an der vermutlichen CD4- Bindungsstelle, wie von Lasky et al. (14) beschrieben, kartiert wurden. Die Menge an I5e, G3-536 und G3-537, die zur Reduzierung der gp120-sCD4-Bindung um 50 % erforderlich war, betrug 70, 2500 bzw. 200 ug/ml, Weitere Epitop- Klassifikationsuntersuchungen zeigten, wie in Figur 10A dargestellt, daß das I5e-Epitop nicht irgendein früher beschriebenes Epitop überlappt, einschließlich dem "loop", dem NH3-Terminus und der Lasky-Stelle.
Zusammengenommen lassen diese Ergebnisse darauf schließen, daß das Epitop von I5e vermutlich nicht aus einer linearen Sequenz besteht. Das Epitop ist vielmehr eher konformations- oder Kohlenhydrat-abhängig oder beides. Die Natur der Konformation des I5e-Epitops wurde durch Untersuchungen bestätigt, die in Figur 6C dargestellt sind. Nach Reduktion eines methabolisch markierten Lysats von HIV-1 durch 0.1 M Dithiothreitol ging die gp120/gp160-Reaktivität von I5e verloren. Auf ähnliche Weise wurde die Bedeutung der Glycosylierung für die I5e- gp120-Reaktivität durch die in Figur 6D dargestellten Untersuchungen bestätigt, wo metabolisch markierte HIV-1- Lysate in Abwesenheit und Gegenwart von Tunicamycin hergestellt wurden. Das nicht glycosylierte eingehüllte Vorläufer-Polypeptid von 90 kD wurde durch I5e nicht erkannt, vermutlich aufgrund von Veränderungen in der Tertiärstruktur.
Alternativ ist es möglich, daß eine Oligosaccharideinheit direkt dazu beiträgt, einen Teil des I5e-Epitops zu bilden. In jedem Fall lassen diese Ergebnisse darauf schließen, daß das I5e-Epitop nicht an früher definierte funktionielle Domänen von gp120 lokalisiert ist, und wahrscheinlich eine neue Stelle darstellt, die sowohl für die CD4-Bindung und die Antikörperneutralisation von HIV-1 wichtig ist.
Die Neutralisationsaktivität wurde auch bei verschiedenen Seren primärer HIV-Isolate als breiter als mit Laboratoriumsisolaten beobachtet. Darüberhinaus wurde beobachtet, daß, wie in Figur 10B dargestellt, Seren von HIV- infizierten Patienten konkurrierend die I5e-Bindung inhibierten, während Seren von akuten Serokonvertern dies nicht taten. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß die I5e-Bindungsstelle verantwortlich sein könnte für die Induzierung der breiten Neutralisierung und bindungsinhibierenden Aktivität, die in rekonvaleszenten menschlichen Seren (6 bis 12 Monate nach anfänglicher HIV- Serokonversion) beobachtet wurden. In der nachfolgenden Tabelle III ist die I5e-Reaktivität einer Anzahl von HIV- Isolaten zusammengestellt. Tabelle III Enzym Immunoassay Peptide Antigen HIV-1 Isolat Amino Acid No. Quelle Ergebnisse gereinigt (NIH) recomb., CHO (Chiron) recomb., baculo (Chiron) recomb., E. coli (Chiron) recomb., yeast (Chiron) recomb., E. coli (DuPont) recomb., E. coli (Repligen) synthetisch (Tanox) synthetisch (Tanox)

x. HMabs N70-1.7B, N70-2.1H und Y76-4.8D

Seit der Entdeckung von HMab I5e haben wir 3 neue HMabs hergestellt, die eine I5e-ähnliche Aktivität zeigten. Alle drei wurden durch EBV-Transformation von B-Zellen erzeugt. Während N70-1.7B und N70-2.1H von B-Zellen, die vom gleichen Patient, aus dem I5e abgeleitet wurde, abgeleitet wurden, wurde HMab Y76-4.8D van einem verschiedenen Patient abgeleitet.
Wir begannen unsere Untersuchung dieser HMabs durch Testen der Stammspezifität der HMabs N70-2.1H und N70-1.7B mittels ELISA auf die Reaktivität mit mit Con-A immobilisierten viralen Glycoproteinen aus 11 verschiedenen HIV-1-Stämmen. Unsere Ergebnisse sind in den Figuren 11 und der Tabelle IV veranschaulicht. Wie die Figur 11 zeigt, zeigte HMab N70-2.1H eine besonders starke Reaktivität mit allen 11 Stämmen in dem Feld. HMab N70-1.7B zeigte eine ähnlich starke Aktivität, in dem es mit 10 von 11 Stämmen reagierte; der MN-Stamm war der einzige nicht reaktive Stamm. In Tabelle IV wird gezeigt, daß der dritte HMab, Y76-4.8D ein ähnliches Verhalten wie I5e zeigt; obgleich eine schwächere Reaktivität mit den RF und SF2-Stämmen festgestellt wurde. Diese Ergebnisse stellen jedoch nur vorläufige Daten dar; ob irgendeiner der neu hergestellten Antikörper besser als I5e in Hinblick auf die Neutralisation ist, ist noch durch weitere Untersuchungen festzustellen. Tabelle IV Vergleich der Stammspezifität von HMabs 4.8D und 1.5e OD mit angegebenem HMab Virus Stamm
Als nächstes haben wir die 3 neuen HMabs auf ihre Fähigkeit unterstützt, miteinander um gleiche oder überlappende Epitope an gp120 zu konkurrieren. In diesem Experiment wurde gp120 des HIV-1-Stammes J62 in Vertiefungen einer Immulon II-Assayplatte (Dynatech Laboratories) immobilisiert, die mit HMab N70-1.9b mit 10 ug/ml PBS während einer Stunde beschichtet wurden. Die Vertiefungen wurden mit jedem unmarkierten HMab (konkurrierende Antikörper) umgesetzt, und dann mit entweder biotyniliertem N70-2.3a oder biotyniliertem N70-1.5e. Die relative Menge von gebundenem Biotin - markiertem Antikörper wurde durch Peroxidase-Streptavidin (Boeringher-Mannheim Inkubierung in den Vertiefungen und Entwickeln der Farbe unter Verwendung von TMB-H202 bestimmt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen.
Wie in Tabelle V gezeigt, wurden geringe O.D. Werte für die unmarkierten Antikörper im Vergleich zu dem Kontroll O.D.-Wert für jeden Biotin-HMab gefunden, was zeigt, daß ein unmarkierter HMab für eine antigene Stelle konkurriert, die mit der Stelle, die durch den markierten Antikörper erkannt wird, überlappt. Wie dargestellt, konkurriert N70-2.3a mit Biotin-2.3a, aber nicht mit Biotin-1.5e. Im Gegensatz dazu haben N70-1.5e, N70-1.7B, N70-2.1H und Y76-4.8D alle niedrige O.D.-Werte für Biotin-1.5e, was anzeigt, daß alie mit N70-1.5e konkurrieren. Tabelle V Konkurrenz von HMabs mit biotinylierten HMabs 2.3a und 1.5e OD mit angegebenem markiertem HMab Konkurrierende Antikörper Biotin-2.3 Biotin-1.5e
In den Figuren 6B und 9 wurde festgestellt, daß I5e ein in der gp120-CD4-Bindung involviertes Epitop erkennt. Als Ergebnis waren wir daran interessiert, festzustellen, ob der neue HMab N70-2.1H auch ein Epitop erkennt, das in der gp120-CD4-Bindung involviert ist. In diesem Experiment wurden 3 Konzentrationen von srCD4 (10 ug/ml, 5 ug/ml und 2.5 ug/ml) mit gp120 von HIV- 1J62, immobilisiert in Con-A-beschichteten Vertiefungen, inkubiert. Die HMabs N70-2.3a, N70-1.5e und N70-2.1H wurden in die Vertiefungen gegeben und ihre Bindungsfähigkeit unter Verwendung des Peroxidase-anti-Human IgG-Systems, wie früher beschrieben, bestimmt. Wie in Tabelle VI gezeigt, zeigte srCD4 keine Wirkung auf die Bindung von N70-2.3a. srCD4 verringerte jedoch bei allen getesteten Konzentrationen beträchtlich die Bindung von N70-1.5e und N70-2.1H. Es ist deshalb anzunehmen, daß N70-2.1H, so wie N70-1.5e ebenfalls ein an der gp120-CD4- Bindung beteiligtes Epitop erkennt. Tabelle VI Konkurrenz von HMabs mit löslichem rCD4 Optische Dichte mit angegebener Konzentration an CD4 Keine

B. Diskussion der Ausführungsbeispiele der bevorzugten Ausführungsform

Es wurde die Herstellung von 6 IgG HMabs mit einer Spezifität für gp120/160 gegenüber HIV-1 durch B-Zellinien, abgeleitet durch EBV-Transformation peripherer Blut-B-Zellen, erhalten von 3 asymptomatischen HIV-1 infizierten Patienten, beschrieben. 5 HMabs (N70-2.3a, N70-1.5e, N70-1.7B, N70-2.1H und Y76-4.8D) binden an Epitope, die der Mehrzahl der bis jetzt getesteten Stämme gemeinsam sind, und deshalb versuchsweise gut konservierte Epitope identifizieren könnten. Der sechste Antikörper (K24-3b) bindet an Epitopenvarianten, und identifiziert ein Epitop, daß in 2 Virusstämmen abwesend ist und in 9 anderen Stämmen heterogen exprimiert ist. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse die Brauchbarkeit, die HMab-Produktion durch EBV-transformierte Zellen dazu zu verwenden, um menschliche Antikörper-Antworten gegenüber sowohl Varianten als auch konservierten Epitopen von gp120, die in chronisch infizierten Wirten immunogen sind, zu untersuchen.
Im Hinblick auf die biologischen Wirksamkeiten der HMabs haben vorläufige Untersuchungen gezeigt, daß N70-1.5e eine überraschend wirksame neutralisierende Aktivität gegenüber HTLV-IIIB besitzt, sogar bei Antikörperkonzentrationen, die so niedrig wie 1 ug/ml sind (für Neutralisationsverfahren siehe die Referenz 37). Ob jeder der neu hergestellten Antikörper eine breitere oder eine wirksamere Neutralisationsfähigkeit als I5e besitzt, muß jedoch noch bestimmt werden. Von Interesse ist die Tatsache, daß I5e nicht an gp120 der RF und AL-Stämme bindet. Wie dies die Figur 11 veranschaulicht, scheint N70-2.1H an alle getesteten Stämme zu binden, einschließlich RF; und könnte deshalb eine breitere Aktivität haben, wenn sich in weiteren Experimenten erweist, daß es so gut wie I5e neutralisiert. Auf ähnliche Weise erscheint N70- 1.7B an RF zu binden, band aber nicht an den MN-Stamm; es könnte ebenfalls eine möglicherweise breitere Aktivität besitzen, wenn es so gut wie I5e neutralisiert. Die Experimente haben auch gezeigt, daß diese Antikörper eine Antikörper-abhängige Zell-vermittelte Cytotoxicität (ADCC) gegenüber Zieizelien, die gp120/160 exprimieren, ausbilden.

C. Die Hinterlegung

Eine Probe der N70-1.5e-Zellinie wurde unter dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 25. Mai 1990 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer CRL10464. Eine Probe der N70-2.1H-Zellinie wurde ebenfalls bei ATCC am 23. Mai 1991 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer CRL 10758.

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Claims

1. Antikörper oder Antikörperfragment, charakterisiert durch eine spezifische Reaktivität mit einer konservierten aktiven konformationsabhängigen Antigenendeterminante die in der CD4-Bindungsregion von HIV-1 gp120 vorhanden ist, und die durch einen Antikörper erkannt wird, der durch die Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70- 2.1H (CRL 10758) sekretiert wird.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Antikörperfragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein F(ab)2 Fragment ist.

4. Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein menschlicher Antikörper oder menschliches Antikörperfragment ist.

5. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er durch die Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70-2.1H (CRL 10758) sekretiert wird.

6. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Chimären-Antikörper ist.

7. Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Hybrid eines Maus-Antikörpers und eines menschlichen Antikörpers ist.

8. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein rekombinanter Antikörper ist.

9. Antikörper nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er ein rekombinantes Hybrid ist, abgeleitet von einer Bakterien-, Hefe- oder menschlichen Zellinie.

10. Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er an ein Molekül konjugiert ist, um die biologische Aktivität des Antikörpers oder Antikörperfragments zu erhöhen, oder an einen Marker.

11. Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es an ein Immunotoxin oder ein Immunogen konjugiert ist.

12. Kontinuierliche Zellinie, die einen Antikörper oder ein Antikörperfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche produziert.

13. Zellinie nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine vom Menschen abgeleitete Zellinie ist.

14. Zellinie nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70-2.1H (CRL 10758) ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines wie im Anspruch 1 definierten Antikörpers oder Antikörperfragments, dadurch gekennzeichnet, daß man den Antikörper oder das Antikörperfragment aus einer Zellinie, wie in einem der Ansprüche 12 bis 14 definiert, erhält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellinie durch Epstein-Barr Virustransformation von B-Lymphocyten aus einem HIV-1 infizierten Patienten hergestellt wurde.

17. Anti-idiotypischer Antikörper, der eine konservierte native konformationsabhängige antigene Determinante nachbildet, die in der CD4-Bindungsregion von HIV-1 gp120 vorhanden ist und durch einen durch die Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70-2.1H (CRL 10758) sekretierten Antikörper erkannt wird.

18. Für Injektionszwecke geeignete Zusammensetzung umfassend ein Medium, das einen Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder einen Anti-idiotypischen Antikörper gemäß Anspruch 17 in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

19. Immunoassayverfahren zur Bestimmung einer mit einem AIDS-Virus in Beziehung stehenden Infektion beim Menschen, das umfaßt:

In Kontakt bringen einer Testprobe eines Menschen mit einem Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder einem Anti-idiotypischen Antikörper gemäß Anspruch 17; und

Bestimmen der Anwesenheit der konservierten nativen konformationsabhängigen antigenen Determinante in der Probe, die in der CD4-Bindungsregion von HIV-1 gp120 vorhanden ist und die durch einen von der Zellinie N70-1.5e (CRL 10464) oder N70-2.1H (CRL 10758) sekretierten Antikörper erkannt wird.

20. Immunoassayverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Gegenwart der konservierten nativen konformationsabhängigen HIV-1 gp120 antigenen Determinante in der Probe bestimmt wird durch Prüfung der Testprobe auf die Gegenwart von Komplexen, die die Determinante und den Antikörper, das Antikörperfragment oder den Anti-idiotypischen Antikörper umfassen, wobei die Gegenwart dieser Komplexe die Anwesenheit einer AIDS-Virus-Infektion anzeigt.

21. Immunoassayverfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Testprobe Gesamtblut, Lymphflüssigkeit, Serum, Plasma, Samen, Speichel oder zerebrale Rückenmarksflüssigkeit ist.

22. Diagnostischer Kit umfassend:

einen Antikörper oder ein Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder einen Anti-idiotypischen Antikörper gemäß Anspruch 17; und

ein Signalreagens.

23. Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Antikörperfragment unmarkiert ist.