DE3854267T2

DE3854267T2 - HIV-spezifische monoklonale Antikörper und Hybridome zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE3854267T2
Application number: DE3854267T
Authority: DE
Inventors: Evan Hersh; Douglas Arizona Health Sc Lake; Yasuhiko Masuho; Yoh-Ichi Matsumoto; Eskild Petersen; Toru Sugano
Original assignee: Teijin Ltd; University of Arizona
Current assignee: Teijin Ltd; University of Arizona
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1988-12-01
Publication date: 1996-01-04
Anticipated expiration: 2008-12-02
Also published as: JPH02219592A; EP0339163A2; AU2456888A; DE3854267D1; CA1339858C; KR0149848B1; JPH0753755B2; US5298419A; ATE125870T1; EP0339163A3; KR890014730A; JPH07292000A; EP0339163B1; AU627698B2

Description

Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft menschliche monoklonale Antikörper (im folgenden abgekürzt als MCAs), welche spezifisch für den menschlichen Immundefizienz-Virus (hierin abgekürzt als HIV) sind, sowie Hybridome, welche diese MCAs produzieren. Die menschlichen MCAs dieser Erfindung sind spezifisch für HIV und werden bei der Diagnose, Verhinderung und Therapie einer HIV-Infektion nützlich sein.

Beschreibung des Standes der Technik:

HIV ist ein Virus, welcher zuerst T-Helferlymphozyten infiziert und diese schließlich zerstört, was zu einer extremen immunologischen Störung führt, die als AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) bekannt ist. In den frühen Stadien einer HIV-Infektion entwickeln einige Patienten Symptome, die denen einer infektiösen Mononukleose ähneln, d.h. Fieber, Müdigkeit, Kopfschmerzen, usw. Obwohl der Patient frei von erkennbaren Krankheitsanzeichen wird, wird er/sie nachfolgend ein Träger von anti-HIV-Antikörpern im Blut. Dann, nach einer Latenzperiode, welche bis zu einigen Jahren dauern kann, entwickelt der Patient den AIDS-verwandten Komplex (ARC). ARC-Patienten zeigen verschiedene Symptome, wie z.B. ein systemisches Anschwellen der Lymphknoten, Fieber, allgemeine Müdigkeit, Gewichtsverlust, verminderte Blutplättchen- und Lymphozytenniveaus, usw. Wenn die Krankheit fortschreitet, wird der Patient anfällig für und entwickelt oft ein Kaposi-Sarkom und verschiedene opportunistische Infektionen, wie z.B. Pneumocystis carinii-Pneumonie, Pilzinfektionen, Zytomegalievireninfektion usw., welche mit dem Tod enden. Die überraschendsten Charakteristika von AIDS sind die Abnahme der T-Helferlymphozyten (TR) und eine stetige Abnahme bei dem Verhältnis von T4 zu T-Suppressorlymphozyten (T8), d.h. T4/T8, wenn die Krankheit fortschreitet.
Von AIDS ist zuerst in den Vereinigten Staaten von Amerika in 1981 berichtet worden und es ist geschätzt worden, daß es heute mehr als 20.000 AIDS-Patienten allein in den USA gibt. Wenigstens ca. 50.000 Menschen sind bis März 1988 an der Krankheit gestorben. Es wurde geschätzt, daß sich die Anzahl der Träger des Virus in den USA auf eine Million Personen beläuft. Zusätzlich zu den USA gibt es ebenfalls viele AIDS-Opfer in Afrika und Europa, und es wird heute eine große Menge an Forschung durchgeführt, um Verfahren für die Diagnose, Verhinderung und Behandlung von AIDS zu entwickeln.
HIV, das AIDS-verursachende Mittel, ist ein Retrovirus. Es wurde gezeigt, daß dieser Virus aus RNA, die aus ca. 9.700 Basenpaaren besteht, drei gag-Proteinen (mit Molekulargewichten von 55.000, 24.000 und 17.000 Dalton), einer reversen Transkriptase (Molekulargewichte von 66.000 und 51.000 Dalton wurden nachgewiesen), drei Glykoproteinen (zwei Molekülen mit Molekulargewichten von 120.000 und 41.000 Dalton und ihrem Vorläufer, einem Molekül mit einem Molekulargewicht von 160.000 Dalton; diese Glykoproteine werden im folgenden als gp120, gp41 und gp160 abgekürzt), welche die virale Hülle umfassen, und anderen Bestandteilen zusammengesetzt ist. Besonders aus den Gesichtspunkten einer viralen Infektion und ihrer Verhinderung, hat die Hülle, welche an der Oberfläche von HIV exponiert ist, eine besondere Wichtigkeit. Als ein Ergebnis einer Proteolyse wird gp160 in gp120 und gp41 gespalten. Wie in Figur 1 gezeigt, ist gp41 ein Transmembranprotein, welches in die Lipiddoppelschicht der viralen Hülle eingegliedert ist, während gp120 auf der Außenseite der Hülle exponiert ist, und etwas davon aus dem Virus freigesetzt wird. Sowohl gp41 als auch gp120 besitzen viele Zuckerbindungsstellen und ungefähr die Hälfte der gp120-Moleküle ist aus Zuckern zusammengesetzt.
Das gp120-Molekül bindet an den CD4-Antigenen, welche auf der Zelloberfläche von T-Helferzellen usw. existieren, oder benachbart dazu, und darüber hinaus, daß es eine Infektion der Zellen durch den Virus mit sich bringt, besitzt gp120 eine Aktivität, welche in den Zellen zu einer Synzytiumbildung führt. gp120 wird genauer in dem U.S.-Patent 4,725,669 beschrieben.
Im Lichte der obigen Hintergrundinformation bezüglich HIV und AIDS ist es klar, daß Antikörper, welche spezifisch für die Hülle des Virus sind, die eine so wichtige Rolle bei der Etablierung der viralen Infektion spielt, eine große Bedeutung bei der Verhinderung der Infektion haben.
M. Robert-Guroff et al. (J. Immunol. 138: 3731, 1987) berichteten, daß das Fortschreiten der Krankheit bei Patienten, deren Blut virenneutralisierende Antikörper enthielt im Vergleich zu Patienten, die keine solche Antikörper hatten, langsamer war. Zusätzlich wurde berichtet, daß die neutralisierenden Antikörper in dem Blut von AIDS-Patienten an gp120 binden (L.A. Lasky et al.: Science 233: 209, 186; und T.J. Mathew et al.: Pro. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9709, 1986). Im Lichte dieser Funde ist es klar, daß Antikörper, die spezifisch für gp120 sind, eine wichtige Rolle bei der Verhinderung einer Infektion durch HIV spielen müssen.
Eine Anzahl von Forschungsgruppen hat bereits die erfolgreiche Entwicklung eines Maus-MCA berichtet, welcher spezifisch für gp120 ist. Beispielsweise berichteten T.C. Chanh et al. (Eur. J. Immunol. 16: 1465, 1986), daß sie chemisch einen Teil der Peptidkette von gp120 synthetisierten und dann einen MCA herstellten, welcher spezifisch für das synthetische Peptid war. Sie wendeten diesen MCA bei der indirekten Fluoreszenzantikörper-Technik an und berichteten, daß sie in der Lage waren, eine HIV-Infektion mit größerer Empfindlichkeit nachzuweisen, als es mit der Bestimmungstechnik von reverser Transkriptase möglich war. Zusätzlich berichteten Gosting et al. (J. Clin. Microbiol.: 25, 845, 1987), daß sie virale HIV-Antigene solubilisierten, sie auf einer Säule aus Linsen-Lektin-Sepharose 4B adsorbierten, die Glykoproteinfraktion daraus sammelten und diese verwendeten, um Mäuse zu immunisieren, und es ihnen gelang, einen anti-gp120 Maus-MCA und einen anti-gp41 Maus-MCA herzustellen. Matsushita et al. (Medical Immunol. 14: 307, 1987) berichteten ebenfalls, daß sie eine virale Neutralisierung mit einem anti-gp120 Maus-MCA erreichten. Diese MCAs sind nützlich bei der Diagnose einer HIV-Infektion. Unglücklicherweise sind sie jedoch für die Aufgaben der Verhinderung einer HIV-Infektion und einer Behandlung der eingetretenen Krankheit (ARC und AIDS) ungeeignet, da diese MCAs Maus- Proteine sind und sie daher durch das menschliche Immun- System als fremd erkannt werden, wenn sie dem menschlichen Körper verabreicht werden. Als ein Ergebnis würde nicht nur die MCA-Aktivität durch die anti-Maus MCA-Antikörper, die durch das menschliche Immunsystem produziert würden, inhibiert werden, sondern es würden ebenfalls anaphylaktische Nebenwirkungen auftreten. Daher ist es klar, daß es für die Verhinderung und Behandlung einer HIV-Infektion beim Menschen nötig ist, einen MCA menschlichen Ursprungs anstelle eines aus Mäusen abgeleiteten MCAs zu entwickeln.
Im allgemeinen können anti-HIV-MCAs menschlichen Ursprungs hergestellt werden durch (1) Hybridome, welche durch Fusion von menschlichen B-Lymphozyten mit der Fähigkeit Antikörper herzustellen, die spezifisch für HIV sind, und Zellen von etablierten lymphoiden Zellinien, wie z.B. Myelomzellen, erhalten werden, und (2) lymphoblastoide Zellen, welche durch eine von Epstein-Barr(EB)-Virus induzierte Transformation von menschlichen B-Lymphozyten mit der Fähigkeit Antikörper herzustellen, die spezifisch für HIV sind, erhalten werden. Von ca. 1980 bis zur heutigen Zeit wurde viel Forschung über die Herstellung von menschlichen MCAs betrieben, aber keine dieser Anstrengungen führte zu einem etablierten Verfahren, wie z.B. in dem Fall von Maus-MCAs, da jeder der oben beschriebenen Ansätze seine eigenen speziellen Probleme aufwies.
In 1987 gab es zwei Berichte, welche menschliche MCAs betrafen, die spezifisch für HIV waren. Einer war von L. Evans et al. (Proceedings of the Third Congress on AIDS, TP130, 1987). Evans et al. verwendeten EB-Virus, um Lymphozyten aus HIV-infizierten Patienten zu transformieren und erhielten einen menschlichen MCA, welcher mit gag-Proteinen reagierte, die Molekulargewichte von 55, 41 und 25 Kilodalton aufwiesen. Dieser menschliche MCA gehörte zu der IgG4- Unterklasse und neutralisierte HIV nicht. Der zweite Bericht war von B. Banapour et al. (ibid, TPII4). Banapour et al. verwendeten ebenfalls EB-Virus, um Lymphozyten aus anti-HIV-Antikörper-positiven Subjekten zu transformieren, sie fusionierten die transformierten Zellen mit Heteromyelomzellen und erhielten einen menschlichen MCA, welcher mit gp41 reagierte. Dieser MCA war ein IgG, aber die Unterklasse wurde nicht berichtet. Dieser MCA zeigte ebenfalls keine HIV-neutralisierende Aktivität. Somit wurde in beiden jener Berichte eine Transformation durch EB-Virus angewendet. Diese Technik ist, da sie sehr wirksam beim Erreichen einer Immortalisierung von menschlichen B-Lymphozyten ist, dem Zellfusionsverfahren weit überlegen. Nichtsdestotrotz produzieren die erhaltenen lymphoblastoiden Zellen EB- Virus, oder selbst wenn sie die Viruspartikel nicht produzieren, enthalten sie die virale EB-DNA, welche das Potential für eine Produktion des Virus trägt. EB-Virus hat die Fähigkeit Lymphozyten zu transformieren, was bedeutet, das dieser Virus eine tumorerzeugende Wirkung hat. Daher bestehen Bedenken hinsichtlich der Sicherheit, diese EB-Virus- Transformationstechnik zu verwenden, um ein Arzneimittelprodukt für die Verabreichung an Menschen herzustellen.
In 1988 gab es einen weiteren Bericht hinsichtlich menschlicher MCAs, welche spezifisch für HIV waren, von Grunow et al. (Journal of Immunological Methods, 106, 1988, S. 257 - 265). Grunow et al. verwendeten ebenfalls EB-Virus, um lymphoblastoide Zellen zu transformieren.
Es ist bekannt, daß lymphoblastoide Zellen, die aus einer transformation von Lymphozyten durch EB-Virus resultieren, weiter durch HIV infiziert werden können, und somit besteht eine Befürchtung, daß eine Zellinie, die einen menschlichen MCA produziert, sowohl von EB-Virus als auch von HIV infiziert werden kann. Zusätzlich hat die Antikörperproduktion durch lymphoblastoide Zellen einige Nachteile im Hinblick auf die Tatsachen, daß sie gewöhnlich niedriger und ebenfalls weniger stabil ist, als das Produktionsniveau durch Hybridome. Der Grund, daß Banapour et al. eine zusätzliche Zellfusion von lymphoblastoiden Zellinien durch führten war, zu versuchen, die Antikörper-Produktionsfähigkeit jener Zellinien zu verbessern.
Wie oben gesehen wurde, wäre demgemäß, wenn die Immortalisierung von menschlichen B-Lymphozyten mit größerer Wirksamkeit durch Zellfusion erreicht werden könnte und wenn ein Hybridom mit der Fähigkeit menschliche MCAs zu produzieren, die spezifisch für HIV wären, erhalten werden könnte, dann das resultierende Hybridom sehr wünschenswert auf der Grundlage, daß es eine hohe Produktivität an MCAs hätte, die darüber hinaus sicher für eine Verwendung als ein Arzneimittel wären.
Jedoch sind beide der zwei oben erwähnten menschlichen MCAs, die von Evans et al. und Banapour et al. erhalten wurden, spezifisch für gag-Proteine und gp41. Die gag-Proteine sind innerhalb der viralen Partikel lokalisiert und sind nicht auf der viralen Oberfläche exponiert. Im Fall von HIV-infizierten Zellen, sind jene Proteine ebenfalls innerhalb der Zelle und nicht auf der Oberfläche lokalisiert. Demgemäß sind MCAs, die spezifisch für gag-Proteine sind, in der Lage, an gag-Proteine zu binden, welche durch virale Partikel abgestoßen wurden oder aus aufgebrochenen viralen Partikeln freigesetzt wurden, aber sie werden nicht in der Lage sein, an intakte virale Partikel oder infizierte Zellen zu binden. Aus diesem Grund wird es nicht erwartet, daß solche MCAs irgendeine schützende Wirkung gegenüber einer Infektion durch den Virus zur Verfügung stellen werden. In ähnlicher Weise ist gp41 relativ nahe an der Oberfläche von viralen Partikeln und infizierten Zellen lokalisiert, aber es ist ein Transmembranprotein, welches in die Oberflächenmembran eingebettet ist, und es ist daher für MCAs schwierig, an gp41 zu binden.
Für den Zweck, eine Infektion von Zellen durch HIV zu verhindern, ist es daher klar, daß der am meisten geeignete Typ von menschlichen MCAs ein solcher wäre, der spezifisch für gp120 ist, ein Glykoprotein, das auf der Oberflächenmembran der viralen Partikel exponiert ist, eine Aktivität beim Binden an die Wirtszellen aufweist und auf der Oberfläche von infizierten Zellen exprimiert wird.
Zusätzlich ist es hinsichtlich der Unterklasse, welche für menschliche MCAs die wünschenswerteste wäre, evident, daß es für den Antikörper vorteilhaft wäre, einer Unterklasse anzugehören, welche die Fähigkeit, Komplement zu aktivieren und die Fähigkeit, an die Fc-Rezeptoren auf Makrophagen und Lymphozyten zu binden, besitzt. Es wurde gezeigt, daß eine Aktivierung von Komplement durch den klassischen Weg durch die IgG1- und IgG3-Unterklassen erreicht werden kann, wogegen IgG2 und IgG4 diese Aktivierung nicht erreichen können (J.L. Winkelhake: Immunochem. 15: 695, 1978). Weiterhin wurde ebenfalls gezeigt, daß die IgG1- und IgG3-Unterklassen eine starke Affinität für die Fc-Rezeptoren von Monozyten aufweisen (Cosio et al.: Immunol. 44: 773, 1981). Um eine Infektion von Zellen zu verhindern ist es daher klar, daß die IgG1- und IgG3-Unterklassen wünschenswert sind.
Jedoch ist eine andere Erwägung die der Reinigung des menschlichen MCA. Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A ist für die Reinigung von MCAs als wirkungsvoll bekannt, und da IgG1 an Protein A bindet, während IgG3 dieses nicht tut, ist es klar, daß die IgG1-Unterklasse von menschlichen MCAs die wünschenswerteste Unterklasse aus dem Gesichtspunkt der Leichtigkeit einer Reinigung ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen menschlichen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, welcher eine Unterklasse von IgG1 aufweist und welcher sowohl Glykoprotein gp120 als auch gp41, welche strukturelle Bestandteile der Hülle von HIV sind, erkennt und an diese bindet.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung dieser menschlichen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, das keine Transformation durch den Epstein-Barr-Virus einschließt.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, welche im folgenden leichter ersichtlich werden, sind durch Fusionieren von Maus-Myelomzellen und Lymphozyten aus den Lymphknoten von HIV-seropositiven Spendern unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen gelöst worden, um menschliche monoklonale Antikörper herzustellen, welche der Unterklasse IgG1 angehören und welche in der Lage sind, HIV zu neutralisieren.
Bis heute hat niemand erkannt, daß man menschliche monoklonale IgG1-Antikörper erzeugen kann, welche in der Lage sind, HIV zu neutralisieren. Im Hinblick auf den Fund dieser Möglichkeit in der vorliegenden Erfindung und den hierin beschriebenen Techniken folgend, kann man menschliche monoklonale IgG1-Antikörper mit einer HIV-neutralisierenden Aktivität erhalten, und daher liegen im allgemeinen diese monoklonalen Antikörper zusammen mit den Hybridomen, welche diese produzieren, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt eine schematische Querschnittsansicht eines viralen HIV-Partikels.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse von zwei der MCAs der vorliegenden Erfindung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Als ein Ergebnis der Durchführung einer energischen Forschung, die darauf zielte, einen menschlichen anti-HIV-MCA zu erhalten und die ein Verfahren anwendete, das eine Fusion von Maus-Myelomzellen und Lymphozyten aus den Lymphknoten von HIV-seropositiven Spendern einschloß, gelang es den gegenwärtigen Erfindern ein Hybridom zu erhalten, das einen menschlichen MCA produziert (IgG1-Unterklasse), welcher sowohl mit gp120 als auch mit gp41 reagierte. Es gelang ihnen ebenfalls, die Hybridome und/oder Zellinien, welche aus den Hybridomen hervorgingen, zu kultivieren, und sie waren in der Lage, die menschlichen anti-HIV-MCAs aus den Überständen der Zellkulturen zu sammeln.
Das heißt, die vorliegende Erfindung ist auf menschliche monoklonale Antikörper gerichtet, welche spezifisch für HIV sind und zu der IgG1-Unterklasse gehören, insbesondere auf einen IgG1-Antikörper, welcher sowohl an gp120 als auch an gp41 aus HIV bindet. Zusätzlich ist diese Erfindung auf Hybridome gerichtet, welche solche menschlichen monoklonalen Antikörper produzieren, die durch Fusion zwischen menschlichen Lymphozyten und Maus-Myelomzellen gebildet werden. Ein solches Hybridom wurde bei der ATCC am 25. März 1988 hinterlegt und ihm wurde die Zugriffsnummer H89669 zugeordnet.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist das Verfahren durch welches es den Erfindern gelang, die oben beschriebenen Hybridome effizient zu bilden. In diesem Verfahren wurden menschliche Lymphozyten zuerst mit Komplement und einem anti-menschliche T-Lymphozyten Maus-MCA behandelt und dann wurden die behandelten menschlichen Lymphozyten einer Fusion mit Maus-Myelomzellen unterworfen. Andere Details dieses Verfahrens werden nachfolgend diskutiert.
Die menschlichen Lymphozyten, die in dem Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden, können aus der Milz, Lymphknoten, peripherem Blut, Knochenmark, Mandeln, Adenoiden usw., von HIV-seropositiven Spendern erhalten werden. Es ist bevorzugt, daß die Lymphozyten aus den Lymphknoten, der Milz oder den Mandeln von HIV-seropositiven Spendern oder Patienten mit Lymphadenopathie erhalten werden.
Es ist vorteilhaft, als die Maus-Myelomzellen eine Zellinie zu verwenden, welche resistent gegenüber 8-Azaguanin ist, und die folgenden sind einige der öffentlich bekannten Zellinien aus BALB/c-Mäusen: P3x65Ag8, P3-NS1/1-Ag4-1, P3x63AgU1, SP2/0Ag14, P3x63Ag8.6.5.3, MPC11-45.6.TG1.7 und SP-1. Eine bevorzugte Maus-Myelomzellinie ist P3x63AgU1. Sie ist in U.S.-Patent 4,363,799 beschrieben, auf welches hier vollinhaltlich Bezug genommen wird.
In dem Verfahren dieser Erfindung ist es bevorzugt, vor der Fusion der menschlichen Lymphozyten und der Maus-Myelomzellen zuerst die menschlichen Lymphozyten mit Komplement und einem anti-menschlichen T-Lymphozyten Maus-MCA (z.B. OKT3, ein Produkt der Ortho Diagnostics Co., Ltd.) zu behandeln, um so die menschlichen T-Lymphozyten zu eliminieren. Bei der tatsächlichen Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung wird beispielsweise ein fixiertes lymphatisches Gewebe operativ aus einem seropositiven menschlichen Spender herausgeschnitten und leicht mit einer Schere und einem Skalpell zerteilt, um eine Flüssigkeit zu erhalten, die suspendierte Zellen enthält. Diese Suspension wird dann auf eine Ficoll-Paque -Lösung geschichtet und die Lymphozyten werden durch Zentrifugation getrennt und geerntet. Dann werden die Lymphozyten mit 0,5 ml frischem Serum als der Quelle von Komplement und 1,0 ml eines anti-menschliche T-Lymphozyten Maus-MCA behandelt, um die T-Lymphozyten zu zerstören. Die Effizienz der Hybridombildung wird durch dieses Verfahren erhöht.
Die so erhaltenen menschlichen Lymphozyten werden dann mit Maus-Myelomzellen fusioniert. Die allgemeinen Bedingungen für eine Zellfusion und Kultivierung von Hybridomen sind schon bekannt, aber die Erfinder führten trotzdem eine energische Forschung durch, um die spezifischen Kombinationen zu bestimmen, welche eine Bildung und Vermehrung von Hybridomen verstärken. Als ein Ergebnis waren die Erfinder in der Lage, die Bildung eines Hybridoms auf jeweils 10- Lymphozyten zu erreichen, die durch das Verfahren dieser Erf indung behandelt wurden.
Es wurde bestimmt, daß die bevorzugten Bedingungen wie folgt waren. Beispielsweise werden Lymphozyten und Maus- Myelomzellen in einem Verhältnis von 10:1 bis 1:100 gemischt, vorzugsweise 1:1 bis 1:10. Eine geeignete Lösung für eine Zellfusion, wie z.B. RPMI 1640, welche ca. 35% (z.B. 25-45%) Polyethylenglykol (Molekulargewicht: ca. 1.000 bis 6.000) und ca. 7,5% (z.B. 5-10%) Dimethylsulfoxid enthält, wird zugegeben. Die resultierende Zellsuspension wird für eine bis mehrere (z.B. 10-30) Minuten bei einer Temperatur in einem Bereich von Raumtemperatur (25ºC) bis 37ºC gerührt, und dann wird die Suspension stufenweise verdünnt und mit RPMI 1640, welche 10% Kalbsfötenserum (FCS) enthält, gewaschen. Schließlich wird die Suspension weiter mit einer selektiven HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin)-Kulturlösung verdünnt, um eine Zelldichte von 1-5 x 10&sup5;/ml zu ergeben. Peritoneale Maus-Exudatzellen werden zu einer Platte mit 96 Vertiefungen als eine Futterschicht zugegeben und die Kulturlösung wird entfernt, direkt bevor die fusionierten Zellen durch Verteilen von 0,2 ml-Aliquots der Suspension in die Vertiefungen der Platte eingeführt werden. Diese werden dann 3-4 Wochen lang bei 35-38ºC in befeuchteter Luft, welche ca. 5% CO&sub2; (z.B. 2-7% CO&sub2;) enthält, kultiviert. In der HAT-Kulturlösung sind nur Hybridomzellen vorhanden, da die 8-Azaguanin-resistenten Myelomzellen und die Zellen, die aus einer Fusion von Myelomzellen entstehen, in der HAT-Lösung nicht überleben können (nicht fusionierte antikörperproduzierende Zellen sterben innerhalb einiger Tage).
Nach Kultivieren der Hybridome in den Platten mit 96 Vertiefungen wird der Antikörpertiter des Kulturfluids jeder Vertiefung, die Zellen enthält, durch die Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA)-Technik bestimmt, und nur Hybridome, welche die gewünschten Antikörper produzieren, werden ausgewählt. Zellen von jedem ausgewählten Hybridom werden gesammelt, Klonieren wird durch das limitierende Verdünnungsverfahren durchgeführt, und Subklone, die dauerhaft einen MCA produzieren, werden etabliert. Dann werden die Hybridome weiter untersucht, indem die Antigene, die durch die MCAs, welche sie produzieren, erkannt werden, durch eine Western Blot-Analysetechnik analysiert werden und indem die Fähigkeit der produzierten MCAs untersucht wird, an der Oberfläche von HIV-infizierten Zellen zu binden. Schließlich werden Hybridome ausgewählt, die einen MCA produzieren, der an gp120 bindet und der an die Oberfläche von infizierten Zellen binden kann.
Die Maus-Mensch-Hybridome, welche durch das Verfahren dieser Erfindung wie oben beschrieben erhalten wurden und welche menschliche anti-HIV-MCAs produzieren, können durch Einfrieren konserviert werden. Wenn diese Hybridom-Zellinien und/oder Zellinien, die aus diesen abgeleitet sind, in einem großen Maßstab durch ein geeignetes Verfahren kultiviert werden, ist es möglich, aus dem Kulturüberstand die menschlichen MCAs der vorliegenden Erfindung zu erhalten. wenn diese Hybridome in Tiere transplantiert werden, um Tumoren zu bilden, können die produzierten menschlichen MCAs zusätzlich aus dem Aszites oder dem Serum der Tiere erhalten werden.
Die menschlichen anti-HIV-MCAs, welche durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden und welche bei der ATCC hinterlegt wurden, haben die folgenden Eigenschaften:
(1) In einem ELISA, bei welchem fixierte virale Antigene, die aus HIV-infizierten Zellen erhalten wurden, verwendet wurden, waren die MCAs beim Binden positiv, aber sie waren negativ beim Binden in einem ELISA, welcher einen Kunststoff verwendete, der mit Substanzen, die aus uninfizierten Zellen durch dasselbe Verfahren erhalten wurden, beschichtet war.
(2) Da HIV aus vielen antigenen Substanzen zusammengesetzt ist, wurde eine Western Blot-Analysetechnik angewendet, um die Natur der strukturellen Bestandteile zu bestimmen, an welche die menschlichen MCAs, die in dieser Erfindung erhalten wurden, binden. Es wurde so gefunden, daß die menschlichen MCAs an Moleküle binden, welche Molekulargewichte von 41 Kilodalton (41 Kd), 120 Kd und 160 Kd (160 Kd ist der Vorläufer der 120 Kd- und 41 Kd-Moleküle) aufweisen.
(3) Die MCAs wurden untersucht, um zu bestimmen, ob sie an die Oberfläche von HIV-infizierten Zellen binden oder nicht. Nachdem der menschliche MCA mit unfixierten HIV- infizierten Zellen umgesetzt wurde, wurde einem mit Fluorescein markierten Antikörper gegen menschliches IgG erlaubt zu reagieren, und eine starke Fluoreszenz wurde auf der Oberfläche der infizierten Zellen beobachtet. Daher wurde bestimmt, daß die menschlichen MCAs dieser Erfindung an die Oberfläche von infizierten Zellen binden.
(4) Es ist bekannt, daß menschliches IgG vier Unterklassen hat, IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4, wobei jede Unterklasse ihre eigenen charakteristischen biologischen Aktivitäten aufweist. Die Unterklasse von jedem der zwei hierin beschriebenen spezifischen menschlichen anti-HIV-MCAs wurde somit untersucht, indem ein spezifisches tierisches Antiserum verwendet wurde, und es wurde gefunden, daß die hierin beschriebenen MCAs zu der IgG1-Unterklasse gehören.
Obwohl nur ein spezifisches Hybridom in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung hinterlegt wurde, versteht es sich, daß durch ein Verfolgen der oben beschriebenen Verfahren, wie es in den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht wird, ein durchschnittlicher Fachmann weitere menschliche monoklonale Antikörper der Unterklasse IgG1 mit einer Fähigkeit HIV zu neutralisieren erhalten könnte. Um in den Umfang der vorliegenden Erfindung zu fallen, haben diese monoklonalen Antikörper einerseits die IgG1-Unterklasse und erkennen andererseits eines oder mehrere der viralen Hüll- Proteine von HIV und binden an diese. Diese Proteine schließen gp120, gp160 und gp41 ein, welche nachfolgend beschrieben werden.

Beispiele

Beispiel 1

A. Zellfusion

1. Sammlung von Lymphozyten

Ein Lymphknoten, welcher operativ aus einem ARC-Patienten herausgeschnitten wurde, wurde unter Verwendung von Schere und Skalpell fein zerschnitten. Daraus erhaltene Zellen wurden in Medium A (RPMI 1640, welches 10% Kalbsfötenserum (FCS), 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 20 ug/ml L- Serin, 0,05 u/ml Humaninsulin und 80 ug/ml Gentamicinsulfat enthielt) suspendiert. Diese Zellsuspension wurde auf eine Ficoll-Paque -Lösung geschichtet und 20 Minuten lang bei 1.500 UpM zentrifugiert. Die Zellen, die sich am oberen Ende des Ficoll-Paque ansammelten, wurden geerntet, einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und zweimal mit RPMI 1640 mit einer Zentrifuge gewaschen. Schließlich wurden die Zellen in RPMI 1640 bis zu einer Konzentration von 1 x 10&sup7; Zellen/ml resuspendiert.

2. Behandlung der Lymphozyten

Um das Ausmaß der Zellfusion zu vermindern, die mit T-Lymphozyten stattfinden würde, wurden die T-Lymphozyten in der Lymphozytensuspension eliminiert. Das heißt, OKT3 (Ortho Diagnostics Co., Ltd.) wurde zu der oben erwähnten Zellsuspension zugegeben, um eine 200-fache Endverdünnung zu erreichen. Nachdem diese 60 Minuten lang bei 4ºC umgesertzt wurde, wurden die Zellen durch Zentrifugation (1.500 UpM, 5 Minuten lang) präzipitiert. Als nächstes wurde Komplement aus Kaninchenbabies 3-fach verdünnt (mit RPMI 1640) und zu dem Zellpellet zugegeben, um es zu suspendieren; dieses wurde dann 60 Minuten lang bei 37ºC umgesetzt. Dann wurde diese Zellsuspension zweimal einer Waschung mit einer Zentrifuge unterworfen.

3. Zellfusion

Die OKT3-behandelten Lymphozyten und die unbehandelten Lymphozyten wurden jeweils mit Maus-Myelom-P3U1-Zellen (beide Zellpopulationen wiesen 3 x 10&sup7; Zellen auf) in RPMI 1640- Medium gemischt. Diese Zellmischungen wurden dann durch Zentrifugation (1.600 UpM, 5 Minuten) präzipitiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde aufgebrochen, indem gegen das Röhrchen geklopft wurde. Dann wurde 1 ml Polyethylenglykol-Lösung (35% v/v Polyethylenglykol Nr. 1000 und 7,5% v/v Dimethylsulfoxid in RPMI 1640) langsam zu dem Röhrchen zugegeben und diesem wurde erlaubt, eine Minute lang bei Raumtemperatur zu stehen. Als nächstes wurden 2 ml RPMI 1640 zugegeben und der Mischung wurde erlaubt, eine Minute lang zu stehen; weitere 2 ml RPMI 1640 wurden zugegeben und der Mischung wurde erlaubt, weitere 2 Minuten zu stehen. Dann wurden 4 ml HAT-Medium (95 uM Hypoxanthin, 0,4 uM Aminopterin und 16 uM Thymidin in Medium A) zugegeben und der Mischung wurde erlaubt, 2 Minuten lang zu stehen; weitere 8 ml HAT-Medium wurden zugegeben und es wurde 2 Minuten lang stehen gelassen; weiter 24 ml HAT- Medium wurden zugegeben und es wurde 30 Minuten lang bei 37ºC stehen gelassen. Schließlich wurde das Gesamtvolumen durch die Zugabe von HAT-Medium auf zwischen 75 und 150 ml gebracht.
Aliquots von ungefähr 200 ul wurden in den Vertiefungen einer flachen Kulturplatte mit 96 Vertiefungen angeimpft. Diese Kulturplatte war vorbehandelt worden, indem peritoneale ICR-Maus (männlich) Exudatzellen mit 2 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung angeimpft wurden; direkt vor dem Animpfen der fusionierten Zellen wurde das Kulturfluid aus den Vertiefungen entfernt. Diese Kulturplatte wurde dann in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC inkubiert. Einmal pro Woche wurde die Hälfte des Kulturmediums in jeder Vertiefung durch HT- Medium (HAT-Medium, bei welchem Aminopterin weggelassen wurde) ersetzt, und die Inkubation wurde fortgesetzt, bis Hybridomkolonien sichtbar wurden.

4. Klonieren

Zu der Zeit, wo Hybridomkolonien sichtbar wurden, wurde jedes Kulturfluid auf die Gegenwart von Antikörperaktivität gegenüber HIV getestet. Die Hybridome von Kolonien, bei welchen gefunden wurde, daß sie HIV-spezifische Antikörper produzieren, wurden dann kloniert. Zuerst wurden die flachen Platten mit 96 Vertiefungen nur mit peritonealen Maus- Exudatzellen mit 2 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung angeimpft. Dann wurde zu unterschiedlichen Zeiten von einer Stunde bis zu einem Tag nach dem Animpfen das Kulturmedium entfernt, und die Hybridome wurden mit jeweils 10 Zellen/Vertiefung in 4B Vertiefungen angeimpft. Für das erste Klonieren wurde HT- Medium verwendet, während für das zweite Klonieren Medium A verwendet wurde. Nach 2-3 Wochen der Kultivierung wurde die Antikörperaktivität bestimmt und positive Klone wurden gesammelt.

B. ELISA (Festphasen-Enzymimmunoassay)

1. Virale Antigene

a. HTLV-III (menschlicher lymphotropher Virus Typ III)- Antigen (Bionetics Laboratory Products Co., Ltd.)

b. CRI0/NIT-Antigene

CR10/NIT ist eine Zellinie, die etabliert wurde, indem eine persistente Infektion von CEM-Zellen mit dem NIT-Stamm von HIV erzeugt wurde. Die viralen Antigene wurden teilweise aus dieser CR10-Zellinie gereinigt. Kurz ausgedrückt, wurden CR10/NIT-Zellen 3 mal mit PBS gewaschen und dann bei -70ºC eingefroren. Zur Zeit der Verwendung wurden die eingefrorenen Zellen aufgetaut, und 10&sup8; Zellen wurden in 9 ml destilliertem Wasser suspendiert; diese Zellsuspension wurde eine Minute lang kräftig geschüttelt, indem ein Vortex-Mischer verwendet wurde. Dieses wurde dann 10 Minuten lang bei 2.800 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt. Ein ml an 10-fach konzentriertem PBS wurde als nächstes zu dem Überstand zugegeben, eine Zentrifugation wurde 30 Minuten lang bei 15.000 x g durchgeführt, und das Pellet wurde gesammelt. Das Pellet wurde in 5 ml PBS resuspendiert, 4 mal für jeweils 15 Sekunden beschallt, während in Eis gekühlt wurde, und es wurde weitere 30 Minuten lang stehen gelassen, während in Eis gekühlt wurde; dann wurde der Überstand gesammelt. Der Überstand wurde eine Stunde lang einer Ultrazentrifugation bei 100.000 x g unterworfen und der Überstand wurde als die virale Antigenpräparation eingesetzt. Als die negative Kontrolle wurde eine Antigenpräparation durch Behandeln von CEM-Zellen (nicht durch HIV infiziert) auf dieselbe Weise erhalten.

2. Antigen-beschichtete Platten

HTLV-III-Antigen (1 ug/ml), CR10/NIT (20-25 ug/ml) und CEM- Antigene (20-25 ug/ml) wurden jeweils in Aliquots von 50 ug auf die Vertiefungen von separaten Mikrotiterplatten (Coster, Nr. 3912) verteilt, und den Platten wurde dann erlaubt, 60 Minuten lang bei 37ºC zu stehen. Die Platten wurden dann zweimal mit HBSS-BSA (Hank's ausgewogene Salzlösung, 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1% NaN&sub3;) gewaschen, PBS (Ca²&spplus;, Mg²&spplus;), welche 3% BSA enthielt, wurde mit 125 20 ul/Vertiefung verteilt, und den Platten wurde erlaubt, 60 Minuten lang bei 37ºC und dann über Nacht bei 4ºC zu stehen, um eine Blockierung durchzuführen.

3. ELISA

Die Antigen-beschichteten Platten wurden zweimal mit HBSS- BSA gewaschen und dann wurden 50 ul von jedem der erwärmten (60 Minuten lang bei 56ºC) Hybridom-Kulturfluids zugegeben. Nachdem diese 60 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen wurden, wurden die Platten wieder zweimal mit HBSS-BSA gewaschen. Dann wurden 50 ul alkalische Phosphatase, welche mit einem Ziegenantikörper gegen menschliches IgG (1000-fach verdünnt; Tago Inc.) konjugiert war, zugegeben und der Reaktion wurde wieder erlaubt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur stattzufinden, bevor die Platten 4 mal mit HBSS-BSA gewaschen wurden. Als nächstes wurden 100 ul 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,5, welcher 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat und 1 mM MgCl&sub2; enthielt, zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 60 Minuten lang oder über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt. Schließlich wurde bei 495 nm unter Verwendung eines ELISA-Auswerters (Titertech Inc.) die optische Dichte gemessen.

C. Ergebnisse

1. Lymphknotenzellen aus dem Patienten A wurden mit und ohne OKT3-Behandlung verglichen. Tabelle 1 Erzeugung von Hybridomen, welche IgG-Antikörper gegen HIV produzieren* Anzahl von anti-HIV IUG-positiven Vertiefungen Behandlung hohe O.D.** mittlere O.D. geringe O.D.
*: Zeigt Vertiefungen, die Hybridome enthalten, welche IgG produzieren, das mit CR10/NIT-Antigenen, nicht aber mit der negativen Kontrolle (CEM-Antigenen) reagiert.
**: "Hoch" bedeutet, daß die optische Dichte bei 495 nm größer als 1,0 war, während "mittel" den Bereich von 0,4 - 1,0 anzeigt und "gering" den Bereich von 0,2 - 0,3 darstellt. Daher wurden, in dem Fall der Lymphozyten, welche mit Komplement und anti-Lymphozyten-Antikörper behandelt wurden, mehr Hybridome, die IgG-Antikörper gegen HIV produzierten, erzeugt.
2. Wie oben berichtet, wurden Hybridome durch Fusion von Maus-Myelomzellen mit OKT3-behandelten Lymphozyten aus den Lymphknoten von Patienten mit ARC erhalten, die Hybridome wurden kloniert, und es gelang den Erfindern Hybridom Nr. 86 zu etablieren, welches dauerhaft MCAs produziert. Im 40 ELISA reagierten die MCAs, welche durch das Hybridom Nr. 86 produziert wurden, mit HTLV-III-Antigen und CR10/NIT-Antigenen aber nicht mit CEM-Antigenen. Die MCA-Produktionsraten waren 10 ug/10&sup6; Zellen/Tag in dem Fall von Nr. 86.

Beispiel 2

A. Reinigung von MCAs

Die Kulturfluids (1,5-2 Liter) von Mybridomen Nr. 86 wurden als die Ausgangsmaterialien verwendet. Ammoniumsulfat wurde zu den Kulturfluids bis zu einer 50%igen Sättigung zugegeben, und die resultierenden Niederschläge wurden durch 30 Minuten lange Zentrifugation bei 10.000 UpM gesammelt. Die Niederschläge wurden dann in einem geeigneten Volumen an PBS gelöst, gefolgt von einer Dialyse gegen PBS. Die dialysierte Lösung wurde als nächstes auf ein Protein A-Sepharose-Säulenbett (Bettvolumen: 6 ml; Pharmacia AB) aufgetragen. Die Säule wurde mit Salzlösung gewaschen und dann wurde das IgG mit HC1 in Salzlösung (pH 2,5) eluiert. Es wurde durch Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bestätigt, daß das auf diese Weise eluierte IgG rein war.

B. Identifizierung von IgG-Unterklassen von MCAs

1. Schwere Ketten

Die gereinigten MCA-Lösungen wurden mit Schafantiseren gegen menschliches IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 (Serotec Inc.) umgesetzt. Die Unterklasse jedes MCA wurde auf der Basis identifiziert, welche Antiseren zur Bildung eines Immunopräzipitationsringes führten. Es wurde so gefunden, daß Nr. 86 MCAs nur mit dem anti-IgG1 reagierten und nicht mit den anderen drei Antiseren reagierten. Daher wurden diese anti-HIV-MCAs als IgG1 identifiziert.

2. Leichte Ketten

Eine Mikrotiterplatte wurde mit Ziegenantikörper gegen menschliches IgG (Tago Inc.) beschichtet. Jeder der gereinigten MCAs wurde dann mit dieser mit anti-menschlichem IgG beschichteten Platte umgesetzt. Als nächstes wurden gemäß dem Verfahren für ELISA, welches oben in Abschnitt B von Beispiel 1 beschrieben wurde, mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziegenantikörper gegen die menschliche lambda-Kette und die kappa-Kette (Tago Inc.) verwendet, und der Typ jedes MCAs wurde identifiziert. Als ein Ergebnis wurde gezeigt, daß MCA Nr. 86 eine kappa-Kette aufweist.

C. Virale Antigene, die durch die MCAs erkannt werden

Das Western Blot-Verfahren (Bio Rad Immunoblot Assay; Bio Rad Inc.) wurde verwendet, um festzustellen, welche viralen Antigene durch die MCAs Nr. 86 erkannt wurden. Die Verfahren der Assay-Technik werden im folgenden kurz beschrieben.
Der HTLV-III-Stamm von HIV wurde für eine SDS-PAGE eingesetzt, die getrennten viralen Antigene wurden auf Nitrocellulosestreifen geblottet und jeder der halbgereinigten MCAs wurde darauf umgesetzt. Als nächstes wurde ein mit Peroxidase konjugierter Antikörper gegen menschliches IgG mit den Streifen umgesetzt und schließlich wurde, um eine Farbe zu entwickeln, ein Enzymsubstrat mit den Streifen umgesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt. In der Figur ist A ein Serum von einem AIDS-Patienten, B ist ein Serum von einem normalen Menschen, C ist Subklon 1 von Nr. 86 und D ist Subklon 2 von Nr. 86.
MCA Nr. 86 reagierte stark mit gp41 und reagierte schwach mit gp120. Als der Grund für eine Reaktion mit sowohl gp41 als auch gp120 war es möglich, daß MCA Nr. 86 eine Mischung aus einem MCA, welcher mit gp41 reagierte, und einem anderen MCA war, welcher mit gp120 reagierte. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde das Hybridom, welches MCA Nr. 86 Produzierte, erneut kloniert, was die Subklone 1, 2, 3 und 4 ergab, und die MCAs, die von jedem dieser Subklone produziert wurden, wurden ebenfalls dem Western Blot-Assay unterworfen. Wie man in Figur 2 sehen kann, reagierten die MCAs von jedem der 4 Subklone von Hybridom Nr. 86 wieder sowohl mit 9p41 als auch mit gp120. Dieser Befund legt nahe, daß MCA Nr. 86 entweder ein antigenes Epitop erkennt, welches sowohl auf gp41 als auch auf gp120 vorhanden ist, oder ein Antikörper ist, welcher auf die Spaltstelle von gp41 und gp120 gerichtet ist. MCA Nr. 86 reagierte ebenfalls mit gp160 und der Grund dafür ist, daß dieses Antigen ein Glykoprotein ist, welches aus gp41 und gp120 aufgebaut ist.

D. Binden an die Oberfläche von HIV-infizierten Zellen

Die Fähigkeit von MCAs Nr. 86, an die Oberfläche von HIV- infizierten Zellen zu binden, wurde durch die indirekte Fluoreszenzantikörpertechnik untersucht.
C-3-Zellen (eine HTLV-III-transformierte Zellinie), 5 x 106 Zellen, wurden mit 2,5 x 10&sup6; TCID&sub5;&sub0; von HTLV-IIIb gemischt und diese Mischung wurde 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, um einer Infektion zu erlauben, fortzuschreiten. Diese Zellen wurden dann 3 Tage lang in RPMI 1640 Medium, das 20% FCS enthielt, kultiviert, worauf folgend die Zellen 3 mal bei 4ºC mit PBS, welche 0,1% NaN&sub3; enthielt, gewaschen wurden. Als die negative Kontrolle wurden C-3-Zellen, welche nicht mit HIV infiziert waren, verwendet.
Diese unf ixierten Zellen wurden in konische Röhrchen verteilt, um 2 x 10&sup6; Zellen/Röhrchen zu ergeben, und es wurde 5 Minuten lang eine Zentrifugation bei 1.500 UpM durchgeführt. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 50 ul 0,1% NaN&sub3;-HBSS suspendiert. Diese Suspension wurde 60 Minuten lang bei 4ºC umgesetzt, und dann wurden die Zellen 3 mal mit 0,1% NaN&sub3;-1 mM EDTA-PBS gewaschen. Jedes Zellpellet wurde in 100 ul mit Fluoresceinisothiocyanat markiertem Antikörper gegen menschliches IgG (50- fache Verdünnung; Tago Inc.) suspendiert, gefolgt von einer 5 Reaktion für 60 Minuten bei 4ºC.
Die Zellen, welche wie oben behandelt wurden, wurden als nächstes durch Flußzytometrie (FAC Scan; Becton Dickinson Co.) analysiert. Das Binden wurde für die folgenden Kombinationen untersucht: HTLV-IIIb-infizierte C-3-Zellen und Serum (100-fach verdünnt) von einem AIDS-Patienten, uninfizierte C-3-Zellen und Serum (100-fach verdünnt) von einem AIDS-Patienten, HTLV-IIIb-infizierte C-3-Zellen und Serum (100-fach verdünnt) von einem normalen Erwachsenen, uninfizierte C-3-Zellen und Serum (100-fach verdünnt) von einem normalen Erwachsenen, HTLV-IIIb-infizierte C-3-Zellen und MCA Nr. 86, uninfizierte C-3-Zellen und MCA Nr. 86, HTLV- IIIb-infizierte C-3-Zellen und MCA V1 und uninfizierte C-3- Zellen und MCA V1. V1 war ein menschlicher IgG-MCA, welcher für ein belangloses Antigen spezifisch war.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten. MCA Nr. 86 band an die Oberfläche von HIV-infizierten Zellen, band aber nicht an die von uninfizierten Zellen. MCA V1, welcher nicht spezifisch für HIV war, reagierte nicht mit den HIV- infizierten Zellen.
Mit einem MCA, der mit der Oberfläche von HIV-infizierten Zellen reagiert, könnte es möglich sein, HIV-infizierte Zellen in der Gegenwart von Komplement oder in der Gegenwart von Lymphozyten oder Makrophagen zu zerstören, wodurch die Produktion von neuem Virus gestoppt wird und eine Unterdrückung der Ausbreitung der Infektion ermöglicht wird.
Die Ergebnisse der verschiedenen oben beschriebenen Experimente sind in der folgenden Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 2 Eigenschaft MCA Nr. 86 (HB 9669) Isotyp Binden an HIV im ELISA Erkannte virale Antigene Binden an HIV-infizierte Zellen MCA-Produktionsrate Stabilität der MCA-Produktion IgG1; kappa-Kette HTLV-IIIb CR10/NIT schwach positiv Zellen pro Tag Monate
Da die Erfindung nun vollständig beschrieben ist, wird es einem durchschnittlichen Fachmann klar sein, daß darin viele Änderungen und Modifikationen gemacht werden können,
ohne vom Sinn und Umfang der Erfindung abzuweichen, wie sie hierin bekanntgegeben wird.

Claims

1. Menschlicher monoklonaler IgG1-Antikörper, der sowohl an das Glycoprotein gp120 als auch an das Glycoprotein gp41 bindet, welche Strukturbestandteile der Hülle von HIV sind.

2. Hybridom mit der ATCC-Hinterlegungsnummer H89669 oder eine davon abgeleitete Zellinie.

3. Antikörper nach Anspruch 1, produziert durch die ATCC-Hinterlegungsnummer H89669.

4. Hybridom oder davon abgeleitete Zellinie, welche(s) den menschlichen monoklonalen IgG1-Antikörper nach Anspruch 1 produziert, gebildet durch Fusion von menschlichen Lymphocyten und Maus-Myelomzellen P3X63AgU1.

5. Verfahren zum Herstellen des Hybridoms nach Anspruch 4, welches das Behandeln von menschlichen Lymphocyten, die von einem HIV-seropositiven patienten erhalten wurden, mit Komplement und einem monoklonalen Maus-Antikörper, der für menschliche T-Lymphocyten spezifisch ist, und dann das Fusionieren dieser Lymphocyten mit Maus-Myelomzellen umfaßt.

6. Verfahren zum Herstellen des menschlichen monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1, umfassend:

Vermischen von menschlichen Lymphocyten, die von einem HIV-seropositiven patienten erhalten wurden, und von Maus-Myelomzellen P3X63AgU1 in einem Verhältnis von 1:10 bis 1:100, um ein Gemisch zu bilden;

Zugeben einer Zellfusionslösung zu dem Gemisch, so daß sich eine Zellsuspension ergibt;

Rühren der Zellsuspension während etwa 1 bis mehreren Minuten bei einer Temperatur von etwa 25ºC bis 37ºC;

Verdünnen und Waschen der Zellsuspension mit der Zellfusions lösung;

Zugeben einer HAT-Selektionskulturlösung zu der Zellsuspension, so daß sich eine Zelldichte von 1-5 x 10&sup5;/ml ergibt;

Zugeben von Aliquots der Zellkulturlösung zu einer Näpfe enthaltenden Platte;

Kultivieren der Zellsuspension in der Platte während 3 bis 4 Wochen bei 35ºC bis 38ºC in angefeuchteter Luft, die etwa 5% CO&sub2; enthält;

Selektieren von Näpfen, die Zellen enthalten, welche gegen HIV gerichtete Antikörper produzieren, die der IgG1-Subklasse angehören; und

Klonieren der Zellen, die gegen HIV gerichtete Antikörper produzieren, durch das Verfahren mit begrenzter Verdunnung (limiting dilution method), um stabile Subklone zu erhalten, die einen menschlichen monoklonalen Antikörper produzieren, der an die Oberfläche eines HIV-Teilchens binden kann.