JP3147916B2 - 体外免疫方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リンパ球を抗原で特異
的に効率よく免疫する体外免疫方法に関する。
的に効率よく免疫する体外免疫方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９７５年にKohler及びMilsteinはマウ
スを用い、モノクローナル抗体産生株化細胞が得られる
ことを明らかにした（Nature (1975) 256; 495-497参
照）。その後、多くの抗原に対してマウスのモノクロー
ナル抗体が作成されてきた。また、今日多数のマウスの
モノクローナル抗体が診断（体外診断、血清診断等）を
目的とし、実用化されてきている。
スを用い、モノクローナル抗体産生株化細胞が得られる
ことを明らかにした（Nature (1975) 256; 495-497参
照）。その後、多くの抗原に対してマウスのモノクロー
ナル抗体が作成されてきた。また、今日多数のマウスの
モノクローナル抗体が診断（体外診断、血清診断等）を
目的とし、実用化されてきている。
【０００３】一方、これらの抗体を治療の目的で使用す
る方法が予想されているにも関わらず、実際には治療を
目的としたモノクローナル抗体は実用化されていない。
この理由としては、人の体内に投与するにはヒト型のモ
ノクローナル抗体が望ましいが、ヒト型のモノクローナ
ル抗体を得ることが非常に困難であること、また、ヒト
型モノクローナル抗体を得る際に必要な、免疫されたヒ
トリンパ球を得ることが非常に困難であることによる。
特に倫理上の問題から、目的とする抗原によって免疫さ
れたリンパ球を得るために、その抗原を患者もしくはボ
ランティアなどに投与することができないからである。
る方法が予想されているにも関わらず、実際には治療を
目的としたモノクローナル抗体は実用化されていない。
この理由としては、人の体内に投与するにはヒト型のモ
ノクローナル抗体が望ましいが、ヒト型のモノクローナ
ル抗体を得ることが非常に困難であること、また、ヒト
型モノクローナル抗体を得る際に必要な、免疫されたヒ
トリンパ球を得ることが非常に困難であることによる。
特に倫理上の問題から、目的とする抗原によって免疫さ
れたリンパ球を得るために、その抗原を患者もしくはボ
ランティアなどに投与することができないからである。
【０００４】このため、リンパ球を体外に取り出した後
に免疫を行う体外免疫法が研究されるようになってき
た。この体外免疫法に関しても、いくつかの報告がなさ
れているが（J.Immunol.(1985)135; 3831-3838、 Human
Hybridoma and Monoclonal Antibody; Plenum Press(19
85), pp.71-91)、必ずしも成功を納めているものではな
い。
に免疫を行う体外免疫法が研究されるようになってき
た。この体外免疫法に関しても、いくつかの報告がなさ
れているが（J.Immunol.(1985)135; 3831-3838、 Human
Hybridoma and Monoclonal Antibody; Plenum Press(19
85), pp.71-91)、必ずしも成功を納めているものではな
い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術に鑑み、リンパ球を抗原で特異的に効率よく免疫する
体外免疫方法を確立すること、更にこのリンパ球を用い
て抗原特異的モノクローナル抗体を得ることを目的とし
てなされたものである。
術に鑑み、リンパ球を抗原で特異的に効率よく免疫する
体外免疫方法を確立すること、更にこのリンパ球を用い
て抗原特異的モノクローナル抗体を得ることを目的とし
てなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意研究した結果、アジュバンド物質及
びリンホカインを含み、ポリクローナル活性化物質を含
まない培養液中で、リンパ球を抗原で特異的に効率よく
免疫できることを見出し、本発明を完成するに至った。
を達成するため鋭意研究した結果、アジュバンド物質及
びリンホカインを含み、ポリクローナル活性化物質を含
まない培養液中で、リンパ球を抗原で特異的に効率よく
免疫できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明の体外免疫方法の１つ
は、アジュバンド物質としてＯＫ−４３２、リンホカイ
ンとしてインターロイキン２及びインターロイキン６を
含み、ポリクローナル活性化物質を含まない培養液中に
て、リンパ球を抗原で特異的に免疫することを特徴とす
る。
は、アジュバンド物質としてＯＫ−４３２、リンホカイ
ンとしてインターロイキン２及びインターロイキン６を
含み、ポリクローナル活性化物質を含まない培養液中に
て、リンパ球を抗原で特異的に免疫することを特徴とす
る。
【０００８】また、本発明の体外免疫方法のもう１つ
は、アジュバンド物質としてＯＫ−４３２、リンホカイ
ンとしてインターロイキン２及びインターロイキン６を
含み、ポリクローナル活性化物質を含まない培養液中に
て、リンパ球を抗原で特異的に免疫し、かつ、不滅化さ
せることを特徴とする。
は、アジュバンド物質としてＯＫ−４３２、リンホカイ
ンとしてインターロイキン２及びインターロイキン６を
含み、ポリクローナル活性化物質を含まない培養液中に
て、リンパ球を抗原で特異的に免疫し、かつ、不滅化さ
せることを特徴とする。
【０００９】以下、本発明について具体例を挙げて更に
詳細に説明する。本発明において、抗原としては、株化
された癌細胞又は不溶化された可溶性抗原が好ましく使
用される。例えば予め２４ウェルプレート上で培養して
おいた癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原が用いられる。
詳細に説明する。本発明において、抗原としては、株化
された癌細胞又は不溶化された可溶性抗原が好ましく使
用される。例えば予め２４ウェルプレート上で培養して
おいた癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原が用いられる。
【００１０】アジュバンド物質としては、ＯＫ−４３２
が用いられる。ＯＫ−４３２は、「ピシバニール」（登
録商標、中外製薬株式会社製）として市販されている。
ＯＫ−４３２を用いる場合、培養液中の最終濃度は25〜
25000 ng/ml とすることが好ましく、50〜10000ng/mlと
することが更に好ましい。
が用いられる。ＯＫ−４３２は、「ピシバニール」（登
録商標、中外製薬株式会社製）として市販されている。
ＯＫ−４３２を用いる場合、培養液中の最終濃度は25〜
25000 ng/ml とすることが好ましく、50〜10000ng/mlと
することが更に好ましい。
【００１１】リンホカインとしては、インターロイキン
２、インターロイキン６よりなる群から選ばれた少なく
とも一種が好ましく用いられる。インターロイキン２
は、好ましくは１〜1000Ｕ/ml、更に好ましくは２〜500
Ｕ/mlで用いる。インターロイキン６は、好ましくは１
〜1000Ｕ/ml、更に好ましくは２〜500Ｕ/mlで用いる。
なお、インターロイキン２とインターロイキン６とを併
用することにより、免疫効率を更に高めることができ
る。
２、インターロイキン６よりなる群から選ばれた少なく
とも一種が好ましく用いられる。インターロイキン２
は、好ましくは１〜1000Ｕ/ml、更に好ましくは２〜500
Ｕ/mlで用いる。インターロイキン６は、好ましくは１
〜1000Ｕ/ml、更に好ましくは２〜500Ｕ/mlで用いる。
なお、インターロイキン２とインターロイキン６とを併
用することにより、免疫効率を更に高めることができ
る。
【００１２】培養液としては、例えばダルベッコＭＥＭ
（ＤＭＥＭ）培地、ハム−Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６
４０培地、ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ
及びハム−Ｆ１２培地を２：１：１で混合した培地）、
ＥＲＤＦ培地（ＲＤＦ培地のアミノ酸及びビタミンを強
化した培地）等が用いられるが、好ましくはＲＤＦある
いはＥＲＤＦ培地が用いられる。
（ＤＭＥＭ）培地、ハム−Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６
４０培地、ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ
及びハム−Ｆ１２培地を２：１：１で混合した培地）、
ＥＲＤＦ培地（ＲＤＦ培地のアミノ酸及びビタミンを強
化した培地）等が用いられるが、好ましくはＲＤＦある
いはＥＲＤＦ培地が用いられる。
【００１３】リンパ球としては、例えば末梢血、手術の
際に得られるリンパ節もしくは脾臓から得られるものを
用いることができる。本発明の方法では、どの組織由来
のリンパ球を用いても体外免疫を行なうことができる。
際に得られるリンパ節もしくは脾臓から得られるものを
用いることができる。本発明の方法では、どの組織由来
のリンパ球を用いても体外免疫を行なうことができる。
【００１４】また、従来の体外免疫方法で通常用いられ
ているポリクローナル活性化物質、例えば内毒素（エン
ドトキシン）、レクチン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、Ｃｏｎ
Ａ）、デキストラン硫酸等を含んだ培地中でリンパ球を
培養した場合には、体外免疫の効率が低下することがわ
かった。したがって、本発明の体外免疫方法では、ポリ
クローナル活性化物質を含まない培地を用いることが必
要である。
ているポリクローナル活性化物質、例えば内毒素（エン
ドトキシン）、レクチン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、Ｃｏｎ
Ａ）、デキストラン硫酸等を含んだ培地中でリンパ球を
培養した場合には、体外免疫の効率が低下することがわ
かった。したがって、本発明の体外免疫方法では、ポリ
クローナル活性化物質を含まない培地を用いることが必
要である。
【００１５】培養方法は、予め培養しておいた免疫原と
しての癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原を用意し、これにアジ
ュバンド物質及びリンホカインを含む培養液中に懸濁し
たリンパ球を添加し、４〜１０日間程度培養すればよ
い。
しての癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原を用意し、これにアジ
ュバンド物質及びリンホカインを含む培養液中に懸濁し
たリンパ球を添加し、４〜１０日間程度培養すればよ
い。
【００１６】こうしてリンパ球を培養した後、リンパ球
を回収し、必要ならばリンパ系株化細胞と融合するか、
もしくはエプスタイン−バーウィルス感染させることに
よって不滅化することができる。この操作によって、抗
原特異的モノクローナル抗体を生産する細胞株を得るこ
とができ、モノクローナル抗体の持続的な生産が可能と
なる。
を回収し、必要ならばリンパ系株化細胞と融合するか、
もしくはエプスタイン−バーウィルス感染させることに
よって不滅化することができる。この操作によって、抗
原特異的モノクローナル抗体を生産する細胞株を得るこ
とができ、モノクローナル抗体の持続的な生産が可能と
なる。
【００１７】ヒト型リンパ球を用いた場合、ヒト型モノ
クローナル抗体を生産する細胞株、或はヒト型モノクロ
ーナル抗体が得られるが、他の動物のリンパ球を用いる
と、使用した動物の型のモノクローナル抗体生産細胞
株、或はその動物の型のモノクローナル抗体が得られ
る。
クローナル抗体を生産する細胞株、或はヒト型モノクロ
ーナル抗体が得られるが、他の動物のリンパ球を用いる
と、使用した動物の型のモノクローナル抗体生産細胞
株、或はその動物の型のモノクローナル抗体が得られ
る。
【００１８】
【作用】本発明の体外免疫方法では、アジュバンド物質
としてＯＫ−４３２、リンホカインとしてインターロイ
キン２及びインターロイキン６を含み、ポリクローナル
活性化物質を含まない培養液中で、リンパ球を抗原と作
用させることにより、リンパ球を特異的に効率よく免疫
できる。アジュバンド物質とリンホカインを共に添加し
た場合に、免疫効率は最も高くなり、ポリクローナル活
性化物質を添加すると、免疫効率は低下する。
としてＯＫ−４３２、リンホカインとしてインターロイ
キン２及びインターロイキン６を含み、ポリクローナル
活性化物質を含まない培養液中で、リンパ球を抗原と作
用させることにより、リンパ球を特異的に効率よく免疫
できる。アジュバンド物質とリンホカインを共に添加し
た場合に、免疫効率は最も高くなり、ポリクローナル活
性化物質を添加すると、免疫効率は低下する。
【００１９】また、免疫された抗原特異的リンパ球を、
リンパ系株化細胞と融合させるか、又はエプスタイン−
バーウィルス感染させることにより不滅化すれば、抗原
特異的モノクローナル抗体を効率よく生産することがで
きる。
リンパ系株化細胞と融合させるか、又はエプスタイン−
バーウィルス感染させることにより不滅化すれば、抗原
特異的モノクローナル抗体を効率よく生産することがで
きる。
【００２０】
【実施例】実施例１ (1)特定抗原に対するリンパ球の体外免疫 Ａ５４９細胞（ヒト肺線癌細胞株、ATCC CCL-185）を、
１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含有するＥＲＤＦ培地
に、１×１０4cells/mlの細胞密度に懸濁し、２４ウェ
ルプレートに1mlずつ分注して、３６時間、３７℃で培
養した。
１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含有するＥＲＤＦ培地
に、１×１０4cells/mlの細胞密度に懸濁し、２４ウェ
ルプレートに1mlずつ分注して、３６時間、３７℃で培
養した。
【００２１】一方、健康な人の末梢血からフィコール
（ファルマシア社製）によりリンパ球を分離し、ＥＲＤ
Ｆ培地で４回洗浄した。その後、リンパ球密度を２×１
０6cells/mlに調製し、予めＡ５４９細胞の培養を行っ
ていた上記２４ウェルプレートに0.5ml/well添加した。
（ファルマシア社製）によりリンパ球を分離し、ＥＲＤ
Ｆ培地で４回洗浄した。その後、リンパ球密度を２×１
０6cells/mlに調製し、予めＡ５４９細胞の培養を行っ
ていた上記２４ウェルプレートに0.5ml/well添加した。
【００２２】このとき、ＯＫ−４３２（登録商標「ピシ
バニール」、中外製薬株式会社製）、ムラミルジペプチ
ド（以下、ＭＤＰとする）、インターロイキン２（ゼン
ザイム社製）（以下、ＩＬ−２とする）、インターロイ
キン６（ゼンザイム社製）（以下、ＩＬ−６とする）
を、培養液中の最終濃度がそれぞれ250ng/ml、10μg/m
l、100U/ml、10U/mlになるように、かつ、いろいろな組
合せで添加した。こうして、リンパ球及び各因子を添加
した後、４日間培養を行い、以下に述べる方法で免疫活
性を測定した。
バニール」、中外製薬株式会社製）、ムラミルジペプチ
ド（以下、ＭＤＰとする）、インターロイキン２（ゼン
ザイム社製）（以下、ＩＬ−２とする）、インターロイ
キン６（ゼンザイム社製）（以下、ＩＬ−６とする）
を、培養液中の最終濃度がそれぞれ250ng/ml、10μg/m
l、100U/ml、10U/mlになるように、かつ、いろいろな組
合せで添加した。こうして、リンパ球及び各因子を添加
した後、４日間培養を行い、以下に述べる方法で免疫活
性を測定した。
【００２３】(2)免疫活性の測定 上記培養後、リンパ球及び培養上清を除去し、プレート
上に残ったＡ５４９細胞を３回ＥＲＤＦで洗浄した後、
0.06％グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５分間
固定を行った。更に、0.05％Tween-PBS 溶液を用いて３
回洗浄し、0.2％ゼラチン−0.5％BSAで３７℃、２時間
ブロッキングを行った。
上に残ったＡ５４９細胞を３回ＥＲＤＦで洗浄した後、
0.06％グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５分間
固定を行った。更に、0.05％Tween-PBS 溶液を用いて３
回洗浄し、0.2％ゼラチン−0.5％BSAで３７℃、２時間
ブロッキングを行った。
【００２４】溶液を捨てた後、ビオチン化抗ヒトIgGと
ビオチン化抗ヒトIgMを混合した溶液を添加し、３７
℃、１時間反応を行った。これを洗浄した後、アビジン
−ペルオキシダーゼ複合体を添加し、３７℃、１時間反
応を行い、更に洗浄後、通常のジアミノベンジジンを含
む反応液により発色を行った。
ビオチン化抗ヒトIgMを混合した溶液を添加し、３７
℃、１時間反応を行った。これを洗浄した後、アビジン
−ペルオキシダーゼ複合体を添加し、３７℃、１時間反
応を行い、更に洗浄後、通常のジアミノベンジジンを含
む反応液により発色を行った。
【００２５】その後、各ウェル中の陽性コロニーの数を
計測することにより、免疫活性を測定した。この陽性コ
ロニーは、抗原特異的免疫グロブリンを生産するリンパ
球数と比例している。このようにしてアジュバンド物質
とリンホカインの影響を調べた結果を表１、表２に示
す。
計測することにより、免疫活性を測定した。この陽性コ
ロニーは、抗原特異的免疫グロブリンを生産するリンパ
球数と比例している。このようにしてアジュバンド物質
とリンホカインの影響を調べた結果を表１、表２に示
す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】表１及び表２に示されるように、アジュバ
ンド物質及びリンホカインを同時に添加した方がＡ５４
９に反応する陽性コロニーの数は多い。特に、ＭＤＰ、
ＩＬ−２及びＩＬ−６の組合せが最も効果的であること
が明らかとなった。このことは、Ａ５４９に反応する抗
体を生産するリンパ球数が多いことを示している。
ンド物質及びリンホカインを同時に添加した方がＡ５４
９に反応する陽性コロニーの数は多い。特に、ＭＤＰ、
ＩＬ−２及びＩＬ−６の組合せが最も効果的であること
が明らかとなった。このことは、Ａ５４９に反応する抗
体を生産するリンパ球数が多いことを示している。
【００２９】実施例２ 二人の癌患者由来のリンパ節リンパ球と、三人の健常人
の末梢血由来のリンパ球を分離し、それぞれのリンパ球
を用いて実施例１と同様に培養及び免疫活性の測定を行
なった。この結果を表３に示す。
の末梢血由来のリンパ球を分離し、それぞれのリンパ球
を用いて実施例１と同様に培養及び免疫活性の測定を行
なった。この結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
【００３１】表２から明らかなように、リンパ球を分離
する組織として、リンパ節を用いた場合と末梢血を用い
た場合とで明らかな差はみられない。すなわち、体外免
疫法を行うために必要なリンパ球は、どのような組織か
ら分離しても可能であることを示している。
する組織として、リンパ節を用いた場合と末梢血を用い
た場合とで明らかな差はみられない。すなわち、体外免
疫法を行うために必要なリンパ球は、どのような組織か
ら分離しても可能であることを示している。
【００３２】実施例３ 体外免疫法に及ぼすポリクローナル活性化物質（例えば
レクチン、リボ多糖類など）の影響について調べた。す
なわち、ＯＫ−４３２、ＭＤＰ、ＩＬ−２、ＩＬ−６の
他に、ポークウィートマイトージェン（ＰＷＭ）及びリ
ボ多糖類（ＬＰＳ）を培地中にそれぞれ１％及び25μg/
ml添加した他は、実施例１と同様にして培養し、免疫活
性を測定した。この結果を表４に示す。
レクチン、リボ多糖類など）の影響について調べた。す
なわち、ＯＫ−４３２、ＭＤＰ、ＩＬ−２、ＩＬ−６の
他に、ポークウィートマイトージェン（ＰＷＭ）及びリ
ボ多糖類（ＬＰＳ）を培地中にそれぞれ１％及び25μg/
ml添加した他は、実施例１と同様にして培養し、免疫活
性を測定した。この結果を表４に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】通常、体外免疫法においては、ポリクロー
ナル活性化物質の存在が必要とされているが、表４の結
果は、これらの物質が阻害的に働くことを示している。
ナル活性化物質の存在が必要とされているが、表４の結
果は、これらの物質が阻害的に働くことを示している。
【００３５】参考例 実施例１と同様にして、ＭＤＰ、IL-2及びIL-6を添加し
た培地中でリンパ球を培養した後、リンパ球を回収し、
リンパ球系株化細胞であるＲＦ−Ｓ１（ヒトミエローマ
細胞株とマウスミエローマ細胞株との融合細胞突然変異
株）（微工研菌寄第１２０９１号）と細胞融合を行っ
た。なお、リンパ球としては健常人の末梢血から分離し
たものを用い、抗原としてはＡ５４９細胞を用いた。
た培地中でリンパ球を培養した後、リンパ球を回収し、
リンパ球系株化細胞であるＲＦ−Ｓ１（ヒトミエローマ
細胞株とマウスミエローマ細胞株との融合細胞突然変異
株）（微工研菌寄第１２０９１号）と細胞融合を行っ
た。なお、リンパ球としては健常人の末梢血から分離し
たものを用い、抗原としてはＡ５４９細胞を用いた。
【００３６】細胞融合は、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法により行った。細胞融合後、96ウェルプ
レートに細胞をまき、細胞の生育してきたウェル数を測
定した。更に、その培養上清中に抗原特異的な免疫グロ
ブリンが含まれているかどうかを、次のような方法で測
定した。
いる通常の方法により行った。細胞融合後、96ウェルプ
レートに細胞をまき、細胞の生育してきたウェル数を測
定した。更に、その培養上清中に抗原特異的な免疫グロ
ブリンが含まれているかどうかを、次のような方法で測
定した。
【００３７】まず、Ａ５４９細胞を96ウェルプレート上
でコンフルエントになるまで培養を行ない、培養上清を
除去した後、３回ＥＲＤＦで洗浄した。そして、0.06％
グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５分間固定を
行なった。更に、0.05％Tween-PBS溶液を用いて３回洗
浄し、0.2％ゼラチン−0.5％BSAで３７℃、２時間ブロ
ッキングを行った。
でコンフルエントになるまで培養を行ない、培養上清を
除去した後、３回ＥＲＤＦで洗浄した。そして、0.06％
グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５分間固定を
行なった。更に、0.05％Tween-PBS溶液を用いて３回洗
浄し、0.2％ゼラチン−0.5％BSAで３７℃、２時間ブロ
ッキングを行った。
【００３８】溶液を捨てた後、細胞融合後細胞の生育し
てきたウェルの培養上清を加え、３７℃、１時間反応を
行なった。これを洗浄した後、アビジン−ペルオキシダ
ーゼ複合体を添加し、３７℃、１時間反応を行い、更に
洗浄後、通常のＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３
−エチルベンゾチアリゾン−６−スルホン酸）二アンモ
ニウム塩）を含む反応液により発色を行った。そして、
発色したもの、すなわち抗原特異的に反応する免疫グロ
ブリンが含まれるウェル数を測定した。この結果を表５
に示す。
てきたウェルの培養上清を加え、３７℃、１時間反応を
行なった。これを洗浄した後、アビジン−ペルオキシダ
ーゼ複合体を添加し、３７℃、１時間反応を行い、更に
洗浄後、通常のＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３
−エチルベンゾチアリゾン−６−スルホン酸）二アンモ
ニウム塩）を含む反応液により発色を行った。そして、
発色したもの、すなわち抗原特異的に反応する免疫グロ
ブリンが含まれるウェル数を測定した。この結果を表５
に示す。
【００３９】
【表５】
【００４０】表５の結果から明らかなように、体外免疫
法を用いることにより、抗原特異的なモノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマの出現率が顕著に上昇す
る。
法を用いることにより、抗原特異的なモノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマの出現率が顕著に上昇す
る。
【００４１】
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、ア
ジュバンド物質としてＯＫ−４３２、リンホカインとし
てインターロイキン２及びインターロイキン６を含み、
ポリクローナル活性化物質を含まない培養液を用いるこ
とにより、効率のよいリンパ球の体外免疫が可能とな
る。また、そのリンパ球の由来として特殊な組織由来の
ものを用いることなく、どのようなものを用いても体外
免疫が可能である。更に、このようにして免疫されたリ
ンパ球を用いて、目的とする抗原に対するモノクローナ
ル抗体を得ることが可能となる。特に、ヒト型のモノク
ローナル抗体は、その作製の難しさ、目的とする抗原に
対して反応するものを得ることが非常に困難であること
が、その普及を妨げてきたが、本発明によって、目的と
する抗原特異的ヒト型モノクローナル抗体が効率よく得
られるようになり、予防、診断、治療への道が開かれ
る。
ジュバンド物質としてＯＫ−４３２、リンホカインとし
てインターロイキン２及びインターロイキン６を含み、
ポリクローナル活性化物質を含まない培養液を用いるこ
とにより、効率のよいリンパ球の体外免疫が可能とな
る。また、そのリンパ球の由来として特殊な組織由来の
ものを用いることなく、どのようなものを用いても体外
免疫が可能である。更に、このようにして免疫されたリ
ンパ球を用いて、目的とする抗原に対するモノクローナ
ル抗体を得ることが可能となる。特に、ヒト型のモノク
ローナル抗体は、その作製の難しさ、目的とする抗原に
対して反応するものを得ることが非常に困難であること
が、その普及を妨げてきたが、本発明によって、目的と
する抗原特異的ヒト型モノクローナル抗体が効率よく得
られるようになり、予防、診断、治療への道が開かれ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−86690（ＪＰ，Ａ) Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙ ｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ. １（1990）ｐ．34−41 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｖｏｌ．９，Ｎ ｏ．１（1990）ｐ．81−89 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．144, Ｎｏ．２（1990）ｐ．562−569 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 5/10 C12N 15/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 アジュバンド物質としてＯＫ−４３２、
リンホカインとしてインターロイキン２及びインターロ
イキン６を含み、ポリクローナル活性化物質を含まない
培養液中にて、リンパ球を抗原で特異的に免疫すること
を特徴とする体外免疫方法。 - 【請求項２】 アジュバンド物質としてＯＫ−４３２、
リンホカインとしてインターロイキン２及びインターロ
イキン６を含み、ポリクローナル活性化物質を含まない
培養液中にて、リンパ球を抗原で特異的に免疫し、か
つ、不滅化させることを特徴とする体外免疫方法。 - 【請求項３】 免疫された抗原特異性リンパ球を、リン
パ系株化細胞と融合するか、又はエプスタイン−バーウ
ィルス感染させることによって不滅化する請求項２記載
の体外免疫方法。 - 【請求項４】 前記抗原が、株化された癌細胞又は不溶
化された可溶性抗原である請求項１〜３のいずれか１つ
に記載の体外免疫方法。 - 【請求項５】 前記リンパ球が、末梢血由来、リンパ節
由来又は脾臓由来のものである請求項１〜４のいずれか
１つに記載の体外免疫方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06927391A JP3147916B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 体外免疫方法 |
| US07/842,262 US5290681A (en) | 1991-03-08 | 1992-02-27 | Method of assaying immunization stimulating activity |
| DE4207365A DE4207365C2 (de) | 1991-03-08 | 1992-03-05 | Verfahren zur in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten sowie zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität |
| FR9202747A FR2673641A1 (fr) | 1991-03-08 | 1992-03-06 | Procede d'immunisation in vitro et procede d'essai de l'activite de stimulation de l'immunisation. |
| GB9204928A GB2254326B (en) | 1991-03-08 | 1992-03-06 | Monoclonal antibodies produced by in vitro immunization of lymphocytes |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06927391A JP3147916B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 体外免疫方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04281799A JPH04281799A (ja) | 1992-10-07 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06927391A Expired - Fee Related JP3147916B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 体外免疫方法 |
Country Status (5)
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|---|---|
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| JP (1) | JP3147916B2 (ja) |
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| FR (1) | FR2673641A1 (ja) |
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| JP2002112069A (ja) * | 2000-07-25 | 2002-04-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 画像歪補正装置および画像歪補正方法 |
| US7006255B2 (en) * | 2001-03-29 | 2006-02-28 | Sharp Laboratories Of America | Adaptive image filtering based on a distance transform |
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| GB0724051D0 (en) * | 2007-12-08 | 2008-01-16 | Medical Res Council | Mutant proteins and methods for producing them |
| GB0724860D0 (en) | 2007-12-20 | 2008-01-30 | Heptares Therapeutics Ltd | Screening |
| GB0802474D0 (en) * | 2008-02-11 | 2008-03-19 | Heptares Therapeutics Ltd | Mutant proteins and methods for selecting them |
| DE08718604T1 (de) * | 2008-03-05 | 2009-12-24 | Medical Research Council | Kristallstruktur |
| GB0910725D0 (en) | 2009-06-22 | 2009-08-05 | Heptares Therapeutics Ltd | Mutant proteins and methods for producing them |
| GB201002082D0 (en) | 2010-02-09 | 2010-03-24 | Univ Leiden Medical Ct | Biological material |
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|---|---|---|---|---|
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| US5229275A (en) * | 1990-04-26 | 1993-07-20 | Akzo N.V. | In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies |
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- 1991-03-08 JP JP06927391A patent/JP3147916B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-02-27 US US07/842,262 patent/US5290681A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 DE DE4207365A patent/DE4207365C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-06 FR FR9202747A patent/FR2673641A1/fr active Granted
- 1992-03-06 GB GB9204928A patent/GB2254326B/en not_active Expired - Fee Related
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|---|
| Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１（１９９０）ｐ．３４−４１ |
| Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１（１９９０）ｐ．８１−８９ |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４４，Ｎｏ．２（１９９０）ｐ．５６２−５６９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04281799A (ja) | 1992-10-07 |
| GB9204928D0 (en) | 1992-04-22 |
| GB2254326A (en) | 1992-10-07 |
| GB2254326B (en) | 1995-08-23 |
| US5290681A (en) | 1994-03-01 |
| DE4207365A1 (de) | 1992-09-10 |
| FR2673641B1 (ja) | 1995-02-17 |
| FR2673641A1 (fr) | 1992-09-11 |
| DE4207365C2 (de) | 1999-07-22 |
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