JPH09508390A

JPH09508390A - 免疫刺激性モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH09508390A
Application number: JP7520210A
Authority: JP
Inventors: ブリツタハーデイ，; アブラハムノボグロドスキ，
Original assignee: モア・リサーチ・アプリケーシヨンズ・リミテツド
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 1997-08-26
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: EP0742795A1; CA2182289C; ATE171461T1; CN1052733C; JP3478398B2; CN1145077A; MX9603080A; MD1374F2; US5897862A; ES2124533T3; NO963168D0; IL108501A0; DE69504955D1; WO1995020605A1; IL108501A; NO317020B1; NO963168L; AU1868695A; FI963004A0; DK0742795T3

Abstract

(57)【要約】免疫刺激性効果を有するモノクローナル抗体は、Ｂリンパ芽球様細胞に特異的に結合し、かつ末梢血リンパ球の増殖および活性化を誘導し、かつ腫瘍保持動物内に注入された際には抗腫瘍効果を誘導する。

Description

【発明の詳細な説明】免疫刺激性モノクローナル抗体発明の分野本発明は一般的には免疫療法の分野に含まれ、そしてより具体的には様々な適用のためのそのような治療（例えば、癌の治療におけるもの）の枠組み内に含まれる有用なモノクローナル抗体に関する。従来の技術以下の記載事項は今後の記述に関するものとして考慮される従来の技術のリストである：先の引用文献のいずれかの本明細書内での認容は、読者が従来の技術を理解することを可能にさせることである。しかしながらその認容は、それらの引用文献が、添付される請求の範囲において特定される本発明の特許性の問題にいずれかの意味において関与することを意味するものとして考慮されるべきではない。先の引用文献の認容は、先のリストからの番号を示すことにより行われるであろう。発明の背景形態を異にする癌が、ヒトの死の主原因となっている。米国内の全個体の1/3 が癌を発症しており、２０％が癌で死亡している（１９８８年では４９４，０００人）。癌の最も広範に用いられている治療法は、外科手術、放射線および化学療法である。最近では生物学的応答改変物質（ＢＲＭ）の使用に基づく他の治療法も提唱されている。用いられているＢＲＭには、主にサイトカイン（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−α（ＩＦＮ−α））、活性化単核細胞（例えば、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＫＡ））、および抗体が含まれる。ＢＲＭは腫瘍に直接的に作用すること、そして非特異的もしくは特異的免疫性メカニズムおよび細胞障害性メカニズムを亢進することにより間接的に作用することの両方を行う。今日まで、ＢＲＭを用いる実質的な臨床的成功例は未だに得られておらず、それは主にそれらの毒性および副作用に起因している。腫瘍性癌に対する活性免疫化も提唱されているが、無効果であるという所見が得られている。それに加えて数々のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が癌の診断および治療について評価されているが、癌患者における標準的治療方法内で効果的であることが立証されたｍＡｂは未だ存在しない。Ｔ細胞の表面上の決定基に結合することが可能な様々なｍＡｂが、それらの細胞の増殖、活性化、もしくは分化を誘導することが見いだされている⁽¹⁾。Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲ複合体に対するｍＡｂの結合^(2-4)、Ｔ細胞上のＣＤ２レセプター抗原に対するｍＡｂの結合、ならびにＴ細胞に対する上記両方の種類の抗体の結合が、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２レセプター発現、およびＴ細胞内でのＩＬ −２産生を生じ、そのことによりこれらの細胞における細胞溶解過程の亢進がもたらされることが証明されている。抗ＣＤ３ｍＡｂは動物モデルではインビボで抗腫瘍活性を誘発させることが示されている^(6-7)。Ｔ−リンパ球抗原に対する様々な他のｍＡｂもやはり、その細胞に結合した後にはそれらの活性化を生じることが報告されており、これらの抗体は例えば、ＣＤ５に対するｍＡｂ⁽⁸⁾、ＣＤ６９に対するｍＡｂ⁽⁹⁾、およびＣＤ２８に対するｍＡｂ⁽¹⁰、¹¹⁾である。抗−ＣＤ２８ｍＡｂはマウス黒色腫の成長速度を減少させることが報告されているものの、それらのｍＡｂはマウス内でその腫瘍を完全に除去することに関しては成功を修めてはいない⁽¹²⁾。「ダウディー（Ｄａｕｄｉ）」と称されるヒトＢリンパ芽球様細胞株に対するｍＡｂはマウスリンパ球およびヒト末梢血Ｔ細胞を刺激することが示されている⁽¹³⁾ 。発明の一般的説明本発明はその第一態様により、Ｂリンパ芽球様細胞に結合し、かつ末梢血リンパ球の増殖および活性化を誘導するモノクローナル免疫刺激性抗体を提供し、そのモノクローナル抗体は、腫瘍保持動物内に注入された際には抗腫瘍効果を誘導することを特徴とする。抗腫瘍効果は、腫瘍サイズの減少、転移数の減少、平均余命の増加、もしくは癌の容体に関連する様々な生理学的症状の回復により示され得る生物学的効果である。抗腫瘍効果はまた、第一発症部位での腫瘍の発症の予防におけるｍＡｂの能力によっても示され得る。その特徴を前提とすると、本発明のｍＡｂは急性癌の治療および癌予防の両方に用いることが可能である。本発明のモノクローナル抗体は、最初に動物を免疫原で免疫するが、その免疫原は、Ｂリンパ芽球様細胞、溶解されたＢリンパ芽球様細胞、もしくはそれらの膜調製物である。免疫化および免疫化動物内での免疫反応の進展の後に、Ｂリンパ球をその動物から取り出し、細胞株を増殖させ、そしてその免疫原に結合する抗体を産生する能力を有する細胞株についての選択を行う。その後には、選択されたｍＡｂを、末梢血リンパ球の増殖および活性化を誘導することが可能なものについてのさらなる選択に供する。本発明のｍＡｂを取得する目的では、先の要領で選択された抗体をその後に、抗腫瘍効果を誘導することが可能であるものについてのさらなる選択に供する。そのような抗体を選択する目的では、典型的には癌の動物モデルを用いることが可能である。時としてはその効果を様々なインビトロモデルで検査することもできる。このようなモデルは例えば、予め癌を誘導させてあるいずれかの実験動物であってもよい。具体的には、ヒトにおける治療的使用のためのマウスを選択するためには特に、ヒト指向性腫瘍を発症することが可能なモデルが適切である。後者の種類の動物モデルの例は免疫無防備状態のマウス（例えば、ＳＣＩＤマウスもしくはヌードマウス）であり、これらにはヒトの癌患者から取得された腫瘍細胞もしくは組織を予め注入もしくは移植してある。このような選択の際には、腫瘍サイズを減少させ、生存時間を延長させるなどのｍＡｂの能力は、対照（ｍＡｂでの処置を施していないか、もしくは無関係のｍＡｂでの処置を施した類似の腫瘍保持動物）と比較して決定される。選択には更に、癌の発症を予防するｍＡｂの能力の、適切なモデルでの検査も含まれることがある。例えば、癌を発症することについての遺伝的素因を有する動物にそのｍＡｂを注入してもよく、そしてその後にそのｍＡｂでの処置を施した群における腫瘍発症率および生存率を対照群（ｍＡｂ処置以外は同一様式で処置および維持されている）と比較することが可能である。遺伝的素因を有する動物を用いるよりはむしろ、そのｍＡｂが癌を予防する能力を、動物内への悪性細胞の実験的投与以前にｍＡｂでの処置を施した様々な他の動物において検査することが可能である。そのような抗腫瘍効果を達成する目的では、被験体に本発明のｍＡｂの有効量での投与を施す必要がある。用語「有効量」は、治療効果を達成するのに必要なｍＡｂの量を意味するとして理解されるべきである。治療的最終結果を達成するのに必要な有効量は多数の要因に依存することがあり、それらには例えば、腫瘍の種類、および患者の容体の重篤度（すなわち、癌の段階）、ならびにそのｍＡｂがそのｍＡｂと一緒に相加的もしくは相乗的様式で共に作用する他の作用物質と共に同時投与されたかどうか（このような同時投与に関しては、以下を参照されたい）が含まれる。本発明のｍＡｂを分泌する不滅化細胞株の取得は、それ自体既知の多数の手法により実施することが可能であり、それらは例えば、ハイブリーマを産生するための不滅化細胞との融合；ＥＢＶ形質転換；例えばＣＨＯ細胞株のような細胞株を遺伝子工学的に作製することにより実施され、これらはそれ自体既知の様々な手法などにより達成することが可能である。一般的には、不滅化モノクローナル抗体分泌性細胞株を取得する様式は今日では当業者に知られる日常的な方法であるので、それについての記述は本明細書の範囲以外のものとなる。ｍＡｂがヒトにおける治療を意図される際には、典型的に免疫原はヒト起源のものであろう。しかしながら種間交差反応性が存在する場合には、時としては、例えば霊長類由来のもののような非ヒト由来免疫原での免疫後に取得されるｍＡｂをヒトに用いることも場合によっては可能である。本発明の抗体はモノクローナル抗体を包含するものとして理解されるべきであり、これらはＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体であってもよく、そのような抗体のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、および一本鎖抗体などであってもよい。それに加えて非ヒト起源（例えば、マウス）に由来する抗体は、様々な遺伝子工学的手法により「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」されることがある（「ヒト化」抗体は、主要部分にヒト起源の部分での置換を施した抗体である）。本発明に従う抗体は様々な治療的適用に有用であると同時に、本発明の好ましい態様に従い癌の治療に用いられる。本発明に従うモノクローナル抗体が様々な腫瘍の腫瘍形成性を減少させるという活性を示すことを我々は見いだした。本発明に従う代表的なハイブリーマ細胞株は、ｔｈｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｐａｓｔｅｕｒ、２５、ＲｕｅｄｕＤｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ、７５７２４、Ｐａｒｉｓ、Ｃｏｄｅｘ１５、に、受託番号Ｉ−１３９７として１９９４年１月２８日に寄託されている。この株の細胞は本明細書では時としては「ＢＡＴ−１細胞」として称され、そして個々のモノクローナル抗体は本明細書では時としては「ＢＡＴ−１ｍＡｂ」として称される。ＢＡＴ−１ｍＡｂの特徴を有するモノクローナル抗体、具体的にはＢＡＴ− １ｍＡｂそれ自体の使用が本発明の好ましい態様である。このＢＡＴ−１モノクローナル抗体はダウディー（Ｄａｕｄｉ）ヒトＢリンパ芽球様細胞株の細胞に結合することに基づいて選択された。ＢＡＴ−１ｍＡｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した場合に４８〜５０Ｋダルトンの見かけ上の分子量を有する蛋白質性物質（今後「ＢＡＴ−１結合性蛋白質」と称される）に結合することを我々は見いだした。このＢＡＴ−１結合性蛋白質は本発明の他の態様を形成する。ＢＡＴ−１結合性蛋白質は、本発明のｍＡｂを用いることによる、それ自体既知の様々な手法により単離することができる。その後にはそのＢＡＴ−１結合性蛋白質を動物の免疫化に使用することができ、その後にはその動物から本発明のｍＡｂを取得することができる。本発明はまた、活性成分としての本発明のｍＡｂの有効量、ならびに生理学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物も提供する。本発明の更に別の態様は、疾患もしくは障害、特に癌の治療方法であり、これには治療が必要とされる被験体に本発明のｍＡｂの有効量を投与することが含まれる。このｍＡｂの投与は典型的には非経口的投与の手法によるものであり、それは例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）投与、腹膜内（ｉ．ｐ．）投与、もしくは筋肉内（ｉ．ｍ．）投与である。投与のための担体はそれ自体既知のものの内のいずれか一つであることがあり、例えば食塩水溶液、もしくは他のいずれかの適切な生理学的溶液である。本発明のｍＡｂは既述のように、様々な腫瘍の腫瘍形成性を減少させるという活性を示すことを我々は見いだした。腫瘍形成性を減少させることにおける本発明のｍＡｂの効果は、リンパ球の細胞障害性活性を誘導する能力と比例する。この活性を増強させる目的では時としては、本発明のｍＡｂは、そのｍＡｂと相加的もしくは相乗的様式で作用することが可能な他の作用物質と共に投与することが有利である。この例には、例えばＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ− ２、ＩＬ−６、およびＩＦＮ−α（インターフェロン−α）のような様々なサイトカインが含まれる。本発明のｍＡｂは癌以外の様々な疾患の治療に有効であることがあり、この場合、免疫系の細胞障害性活性におけるｍＡｂの活性化もしくは他の効果が治療的効果を有することがあり、それは例えばＨＩＶ（後天性免疫不全症−ＡＩＤＳの原因ウイルス）感染の初期段階、様々な自己免疫性疾患、もしくは遺伝子的もしくは後天性の免疫不全症の幾つかの症例におけるものである。癌の治療の際には、この抗体は、その被験体内での原発性もしくは後発性腫瘍の検出後、あるいは癌を発症する高危険率にさらされている被験体（例えば、放射線に露出された個体もしくは遺伝的素因を有する個体など）の予防療法としてのいずれかのために投与することができる。同様にＡＩＤＳ患者では、このｍＡｂがその疾患のいずれかの症状を未だに発症していない感染個体か、もしくはＨＩＶ感染過程の初期段階にある個体に投与してもよい。これ以降では、本発明は、抗癌治療活性を示す実験を記述する様々な実施例により詳細に説明されるであろう。しかしながらこれは説明目的のみが意図されるのであって、制限として見なされるべきではないことが理解されるべきである。図面の簡単な説明図１は、ヒトの精製Ｔ−リンパ球に対するＢＡＴモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合のフローサイトメトリー分析を示す。ＢＡＴ抗体の結合は、蛍光標識を保持する第二抗体であるＦＩＴＣ−ヤギ抗−マウス抗体により評価された。図１ａ−ＢＡＴ抗体なしの場合のバックグランド測定値；図１ｂ−抗−ＣＤ３抗体；図１ｃ−ＢＡＴ−１；図１ｄ−ＢＡＴ−５；図１ｅ−ＢＡＴ−２；図１ｆ−ＢＡＴ−４。図２は、第一抗体（これはＢＡＴｍＡｂもしくは抗ＣＤ３ｍＡｂである）および第二ＦＩＴＣ複合体形成化抗−マウスＩｇＧ抗体で二重ラベル化したヒト末梢血単球（ＰＢＭ）（左側パネル）およびジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞（右側パネル）のフローサイトメトリー分析を示す。図２Ａ−非ゲート化細胞；図２Ａ（ａ）−ＢＡＴｍＡｂで処理したＰＢＭ細胞；図２Ａ（ｂ）−抗−ＣＤ３ｍＡｂで処理したＰＢＭ細胞；図２Ａ（ｃ）−ＢＡＴｍＡｂで処理したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞；図２Ａ（ｄ）−抗−ＣＤ３で処理したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞；図２Ｂ−ゲート化細胞；図２Ｂ（ａ）−小細胞（Ｒ１）および大細胞（Ｒ２）にゲート化したＰＢＭ；図２Ｂ（ｂ）−ＢＡＴｍＡｂで処理した（Ｒ１）細胞；図２Ｂ（ｃ）−抗−ＣＤ３で処理した（Ｒ１）細胞；図２Ｂ（ｄ）−ＢＡＴｍＡｂで処理した（Ｒ２）細胞；図２Ｂ（ｅ）−抗−ＣＤ３で処理した（Ｒ２）細胞。図３は、ＦＩＴＣ−複合体形成化ＢＡＴｍＡｂおよびＰＥ−複合体形成化抗 −ＣＤ３で二重ラベルしたヒトＰＢＭ上のＢＡＴ結合性蛋白質およびＣＤ３の表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。図３Ａ−非ゲート化細胞；図３Ａ（ａ）−陰性対照として用いられるＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のサイマルテスト（ｓｉｍｕｌｔｅｓｔ）対照；図３Ａ（ｂ）−ＰＥ−抗−ＣＤ３単独；図３Ａ（ｃ）−ＦＩＴＣ−ＢＡＴｍＡｂ単独；図３Ａ（ｄ）−ＦＩＴＣ−ＢＡＴｍＡｂおよびＰＥ−抗−ＣＤ３抗体の両方での二重ラベル化；図３Ｂ−ゲート化細胞；図３Ｂ（ａ）−小細胞（Ｒ１）および大細胞（Ｒ２）にゲート化したＰＢＭ；図３Ｂ（ｂ）−ＦＩＴＣ−ＢＡＴｍＡｂおよびＰＥ−抗ＣＤ３で二重ラベル化した（Ｒ１）細胞；図３Ｂ（ｃ）−ＦＩＴＣ−ＢＡＴｍＡｂおよびＰＥ−抗ＣＤ３で二重ラベル化した（Ｒ２）細胞；図４は、ダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞の様々な溶解物に対するＢＡＴ−１抗体の結合のウエスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）分析を示す。図４（１）−ダウディー(Ｄａｕｄｉ)細胞（未処理）からの溶解物；図４（２）−ノイラミニダーゼ(０．２ｕ／ｍｌ)で処理した溶解物；図４（３）−ノイラミニダーゼ（０．４ｕ／ｍｌ）で処理した溶解物；図４（４）−ＥｎｄｏＨｆ（１００ｕ／μｇ）で処理した溶解物。図５は、一連のＢＡＴｍＡｂの増加濃度の存在下で６日間培養した細胞内での［³Ｈ］チミジン取り込みの結果のグラフ表示である：ＢＡＴ−１（−▲−）、ＢＡＴ−２（−×−）、ＢＡＴ−３（−●−）、ＢＡＴ−５（−★−）、ＢＡＴ−６（−◆−）、ＢＡＴ−７（−■−）。図６は、細胞障害性活性の誘導を２．５μｇ／ｍｌのＢＡＴｍＡｂを用いて、様々な時間間隔で培養したＰＢＭ中で検査した実験のグラフ表示である。ＨＴ−２９（左側）細胞もしくはＲＣ２９（右側）細胞を標的細胞として用いた。標的に対するエフェクターの比率は２０：１であった。対照（−○−）、ＢＡＴ−１（−●−）、ＢＡＴ−２（−×−）、ＢＡＴ−３（−▲−）。図７は、Ｂ−１６黒色腫細胞を接種したＣ５７ＢＬマウスからの肺を示す：上段は細胞単独で接種したマウスの肺を示す（接種後２４日目）；下段は先の要領でＢ−１６細胞を接種し、その後１４日後に１０μｇのＢＡＴ−１ｍＡｂの静脈内（Ｉ．Ｖ．）注入を施したマウスの肺を示す（接種後２４日目）。図８は、図７に示される種類の実験のまとめのグラフ表示であり、Ｂ−１６黒色腫細胞、３ＬＬルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌細胞、もしくはＭＣＡ１０５線維肉腫細胞のいずれかである腫瘍細胞を接種したマウスの肺における転移数を示す（接種後１カ月目）。この結果は、各種腫瘍を用いて実施された３〜４回の実験のまとめである。未処理マウス（−）、もしくは腫瘍投与後２週間目にＢＡＴ −１（１０μｇ／マウス）で処理したマウス（＋）。転移あり（●）；転移なし（○）。図９は、３ＬＬルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌細胞を接種したマウスからの肺を示す。図７におけるものと同様に、上段は腫瘍細胞単独を接種した肺を示し、そして下段は１４日後に１０μｇのＢＡＴ−１ｍＡｂの静脈内（Ｉ．Ｖ．）注入を施した腫瘍接種マウスの肺を示す。図１０は、腫瘍細胞がＭＣＡ１０５線維肉腫細胞である図９に示されるものに類似する実験を示す。材料および方法モノクローナル抗体の産生ＢＡＬＢ／ｃマウスをダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞の膜調製物で免疫化した。ダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞からの膜調製物は、グリセロール重層式−低張ショック法（Ｊｅｔｔ，Ｍ．、Ｓｅｅｄ，Ｔ．Ｍ．、およびＪａｍｉｅｓｏｎ，Ｇ．Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２：２１３４、（１９７７））により調製された。ＰＢＳ中に懸濁されかつ３７℃でインキュベートされた５０〜８０×１０⁶細胞を徐々に３０％グリセロールと同時に重層していった。氷上での５分のインキュベーションの後にそれらの細胞を遠心分離にかけ、そして冷却トリス（Ｔｒｉｓ）溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ７．４、を含む）中に再懸濁し、４℃で５分間混合し、そして７００ｇでの遠心分離にかけた。上清を除去し、そして３３００ｇでの遠心分離にかけた（１０分間、４℃）。このペレットを再度洗浄し、そして膜分画を含む２つの上清を合わせた。２６０μｌの膜調製物（３ｍｇ／ｍｌ）を２６０μｌの完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバンドで乳化させ、そしてＢＡＬＢ／ｃマウス内に腹膜内（ｉ．ｐ．）注入した。３週間後にマウスの脾臓を取り出した。脾臓細胞を骨髄腫細胞株ＮＳ−０と、１０：１の比率で融合させた。融合はポリエチレングリコールを用いて実施し、そしてそのハイブリドーマを、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．、ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、（Ｌｏｎｄｏｎ）２５６：４９５（１９７５））に従う選択培地中で増殖させた。細胞結合の調査のためにエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて増殖中のハイブリドーマからの上清のスクリーニングを行った（Ｇｌａｓｓｙ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄＳｕｒｈ，Ｃ．Ｄ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ、８１：１１５（１９８５））（このアッセイはダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞に結合するものである）。陽性ハイブリドーマの上清をその後に更に、ヒトＰＢＭの増殖を誘導する能力により［³Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いて選択した。陽性クローンを限界稀釈によりサブクローン化し、検査を反復し、増幅させ、そして培養物として増殖させた。ｍＡｂを５０％硫酸アンモニウム沈殿により培養培地から精製し、その後にＰＢＳに対する徹底的な透析を行った。更に進んだ精製を、セファロース結合化抗 −マウス抗体カラム上での親和性クロマトグラフィーにより実施した。培養培地全細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）Ｎａ−ピルビン酸（１．１ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ）、ならびに抗生物質（ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）２００ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）を補足してあるＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、そして５％ＣＯ₂で湿潤させたインキュベーター内でインキュベートした。用いたＩＬ−２単位はＣｅｔｕｓ単位である（１Ｃｅｔｕｓ単位は３国際単位に等しい）。細胞調製物ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭ）は、フィコール−ヒパキュ濃度勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａ社）により健常成人ドナーから取得された。セファデックスＧ１０カラムによりＰＢＭから単球を枯渇させた。Ｔ細胞はＳＲＢＣロゼット法により分離した。ＣＤ３陽性でかつＬｅｕ１９陽性の細胞の枯渇は免疫磁気技術により実施した。ＢＡＴｍＡｂもしくは対照物と共に５〜６週間インキュベートしたＰＢＭの培養物をＰＢＳで３度洗浄した。ＣＤ３もしくはＬｅｕ１９（ＣＤ５６）のいずれかに対して複合体形成を行わない抗体を完全ＲＰＭＩ培地中の細胞に添加し、そして４℃で１時間インキュベートした。抗マウス抗体で被包化させた磁気ビーズを３０分間添加した。これらのビーズに付着した細胞を磁石で除去し、そして非付着細胞を細胞障害性活性について分析し、そしてフローサイトメトリーによる染色を施した。細胞障害性アッセイ細胞障害性アッセイは以下のように実施した：２〜４×１０⁶標的細胞を２００μＣｉの⁵¹Ｃｒ−クロム酸塩と、１時間、無血清培地中で混合させた。これらの標的細胞を完全培地で３度洗浄し、そして最終的にはＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中に再懸濁させ、そしてウエル当たり１０⁴細胞でプレート培養した。エフェクター細胞を培養し、リンパ球を、様々なｍＡｂ、イソタイプ対照のＩｇＧ、もしくはＩＬ−２と共に様々な期間インキュベートした正常末梢血から調製した。アッセイ前には細胞をＲＰＭＩ培地中で３度洗浄し、１％のトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）を用いて生存細胞についての染色を実施し、丸底マイクロタイタープレート中で様々なエフェクター−標的比率で標的細胞と混合させ、そして３７℃下、５％ＣＯ₂中で３時間インキュベートした。この培養上清を回収し、そしてβ−シンチレーション計数器内での計測を行った。最大同位体放出（ＭＲ）は、ｔｒｉｔｏｎｘ−１００との標的細胞のインキュベーションにより産生される。自発的放出（ＳＲ）を培地単独を用いる標的のインキュベーションにより測定する。細胞溶解のパーセンテージを（ＥＲ−ＳＲ／ＭＲ− ＳＲ）×１００［式中、ＥＲは実験誤差による放出値である］により算出する。ヒトリンパ球亜集団中での細胞障害性の誘導ＰＢＭ細胞（４×１０⁶／ｍｌ）をＢＡＴｍＡｂの存在下で６日間培養した。その後に細胞を３度洗浄し、そして抗マウスＦ（ａｂ’）₂で被包化させた磁気ビーズによるＣＤ３およびＬｅｕ１９細胞の枯渇化を施し、そしてＫ５６２およびダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞に対する細胞障害性についての検査を行った。フローサイトメトリー細胞の表面抗原を、ＦＡＣＳ４４０（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いるフローサイトメトリーにより検出した。各分析について１０⁴細胞を用いた。細胞を、ヒトＣＤ３、ＩＬ−２レセプターに対する至適濃度のマウスｍＡｂ、もしくは産生されたｍＡｂＢＡＴ−１〜９を用いる連続インキュベーションにより染色した。ＦＩＴＣ−複合体形成化ヤギ抗−マウスＦ（Ａｂ’）₂をこの間接的染色における第二抗体として用いた。各インキュベーションは、１％ＢＳＡおよび０．５％アジ化Ｎａを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、４℃下で実施し、そしてその後に同一緩衝液での３度の洗浄を実施した。１０⁴の染色化細胞を分析した。ＢＡＴｍＡｂ結合性決定基（一つもしくは複数）の検出ダウディー（Ｄａｕｄｉ）Ｂリンパ芽球様細胞溶解物におけるＢＡＴｍＡｂ結合性決定基（一つもしくは複数）の検出はウエスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）技術を用いて実施した。簡便に記載すると、ＰＢＳ中に懸濁される５０×１０⁶細胞／ｍｌを徐々に３０％グリセロールと同時に重層し、そして膜を連続遠心分離により分離した。膜調製物の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により分離し、そしてその後にニトロセルロースブロットに転移させ、このブロットをＰＢＳ中の１％低脂肪乳中に浸した。このニトロセルロースブロット上のＢＡＴｍＡｂ結合性蛋白質の検出は、そのブロットをＢＡＴｍＡｂと共に室温で２時間インキュベーションし、次いで抗−マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）₂に対するパーオキシダーゼ−セイヨウカラシ−複合体形成化抗体と共に３０分間インキュベーションすることにより実施した。その後に細胞をすすぎ、そしてバンドをＯ−ジアニジジン基質を用いて検出した。マウス腫瘍モデル３つのマウス腫瘍モデルを用い、それらはすなわち：Ｂ１６黒色腫、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌（３ＬＬ）、およびメチルコラントレン誘導性線維肉腫（ＭＣＡ１０５）、であった。５０〜２００×１０⁶細胞をＣ５７ＢＬマウス（８週令）に静脈内（ｉ．ｖ．）投与により注入した。２週間後にＢＡＴ−１（１〜１０μｇ／マウス）を注入し（静脈内投与（ｉ．ｖ．））、そして１０日後にマウスを屠殺し、そして定着性肺転移を計数した。実施例実施例１ａ．結合性特性ＢＡＴ１〜９と表示され、Ｂリンパ芽球様細胞での免疫化により取得された９つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）について最初にダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞に対する結合についての選択を行い、そしてその後にヒト末梢血リンパ球増殖の誘導についての選択を行った。ＢＡＴｍＡｂのイソタイプは、ＥＬＩＳＡおよびオクテリオニー（Ｏｃｈｔｅｒｉｏｎｙ）アッセイの両方により決定した。ＢＡＴ１、２、３、６、７、および９はＩｇＧ１クラスのものであることが見いだされた一方で、ＢＡＴ４および５はＩｇＭクラスのものであった。ＢＡＴ８はＩｇＧ２ａであった。先のｍＡｂの精製末梢血ヒトＴ細胞への結合をＦＡＣＳ分析により、間接的免疫蛍光染色を用いて分析した。図１は、そのような実験のＦＡＣＳ分析を示す。図示されるようにＢＡＴｍＡｂは末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞に結合する。結合の程度は、ＢＡＴ−２の４４％、ＢＡＴ−５の３８％、ＢＡＴ−１の３２％からＢＡＴ−４（１３％）の幾分弱目の結合にまで変化した。同一血液ドナーからの精製化末梢血Ｂリンパ球はこれらのｍＡｂには結合しなかった（データ非公開）。ｂ．ヒトリンパ球亜集団へのＢＡＴ−１ｍＡｂの結合図２に示されるように、更に進んだＦＡＣＳ分析により、ＢＡＴ−１はＣＤ３＋ヒトＰＢＭ、ならびにジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ−細胞株の細胞に結合することが示された。ＢＡＴ−１がＣＤ３＋ＰＢＭに結合するという所見は、二重ラベル化細胞のＦＡＣＳ分析を用いても更に詳細に確認された（図３）。以下の表１に示されるようにＢＡＴ−１は、ＣＤ３保持細胞に対する結合に加えてＬｅｕ１９／ＮＫ細胞にも結合する。ｃ．様々なタイプの細胞に対するＢＡＴｍＡｂの結合様々なタイプの細胞に対するＢＡＴｍＡｂの結合を決定した。以下の表２に示されるように、ＰＢＬ、ダウディー（Ｄａｕｄｉ）、およびジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞株に対する結合に加え、ＢＡＴｍＡｂは、Ｋ５６２（赤白血病細胞株）およびＭＣＦ７（ヒト乳癌細胞株）に結合する。結合の程度はＢＡＴｍＡｂおよび検査された細胞のタイプ間で変化した。ｍＡｂ２〜９はマウス腎癌（ＭＲ２８）にのみ非常に弱い親和性で結合した。ＢＡＴ−８のみがＭＥＬ（マウス赤白血病）細胞に、やはり非常に低い親和性で結合した。実施例２ＢＡＴｍＡｂ結合部位の分析およびＢＡＴ−１結合性蛋白質の精製ＢＡＴ−１ｍＡｂと相互作用を行う膜蛋白質の分子量を決定する目的で、ダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞の膜調製物を可溶化し、そしてその蛋白質をＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分離させた。ニトロセルロース転移化ブロットをＢＡＴ−１ｍＡｂと共にインキュベートし、そしてバンドを、抗−マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’ ）₂に対するセイヨウワサビ−パーオキシダーゼ複合体形成化抗体を用いる別のインキュベーション、およびＯ−ジアニジジン基質を用いる検出により決定した。ＢＡＴ−１結合性蛋白質の分子量が約４８〜５０ＫＤａであることが見いだされた（図４）。このＢＡＴ−１ｍＡｂ結合性蛋白質を、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に対して複合体形成させたＢＡＴｍＡｂを用いて精製した。この結合性蛋白質は、分子生物学的技術を用いるクローニングにより調製することも可能である。インビボでのＢＡＴ−１のマウスへの投与によりＢＡＴ抗体の誘導がもたらされる。実施例３ＢＡＴｍＡｂの機能上での特性決定ａ．ＢＡＴｍＡｂ誘導性チミジン取り込みヒト末梢血細胞を６日間、増加濃度の一連のＢＡＴｍＡｂの存在下で培養し、そして細胞回収前２０時間目に［³Ｈ］チミジンでパルスした。図５に見られるように、ＢＡＴｍＡｂの濃度を徐々に上昇させることにより、ＰＢＭ細胞内の［³Ｈ］チミジン取り込みのわずかながらではあるが顕著な増加がもたらされた。しかしながら高用量の抗体によっては細胞による取り込みに減少が生じた。対照実験ではイソタイプ適合化抗体はＰＢＬ細胞内の［³Ｈ］チミジンは増加せず、このことによりＢＡＴｍＡｂのアゴニスト効果はこれらの結合特異性特性に依存することが示された。例えば、ＩｇＧ１イソタイプのｍＡｂ（これは我々の研究室において卵巣癌細胞に対して作製したものである）は［³ Ｈ］チミジン取り込みの増加は生じず、このことはやはりＩｇＧ１クラスに属するＢＡＴ１、２、３、６、７、および９ｍＡｂと対照をなす。ｂ．ヒトＰＢＭにおいて細胞障害性を誘導するＢＡＴｍＡｂ様々な期間ＢＡＴｍＡｂと共にインキュベートしたヒト末梢血単核細胞の培養物を、腫瘍細胞株を溶解する能力について検査した。以下の表３に示されるように、一連のＢＡＴと共に一週間インキュベートしたヒトＰＢＭはＫ５６２（ヒト赤白血病（ＮＫ感受性））およびＲＣ−２９（腎癌細胞株（ＮＫ耐性））細胞に対する細胞障害性を示した。ＢＡＴｍＡｂで刺激したヒトＰＢＭの細胞障害性活性の増加の動態を調査した。図６に示されるように、ヒト結腸癌（ＨＴ−２９）および腎細胞癌（ＲＣ− ２９）に対する最高細胞障害性は、ＢＡＴｍＡｂを用いるヒトＰＢＭの７日のインキュベーションの後に達成された。ｃ．ＢＡＴ−誘導化細胞障害性に関わるリンパ球亜集団の特徴決定ＢＡＴｍＡｂにより誘導されたヒトＰＢＭの細胞障害性活性の増加がＭＫ細胞、Ｔ細胞、あるいはその両方の活性化に起因するかどうかを評価する目的では、ＮＫ細胞とＴ細胞を精製し、そしてＢＡＴにより誘導されるそれらの細胞障害性を決定した。ＮＫおよびＴ細胞の精製のためには、Ｌｅｕ１９および抗ＣＤ３モノクローナル抗体をヒトＰＢＭ細胞と共にインキュベートし、その後に抗マウスＩｇＧ被包化磁気ビーズとのインキュベーションを行った。このことにより、対応する抗体に結合する細胞亜集団の枯渇がもたらされた。以下の表４に示されるように、溶解単位数はＣＤ３枯渇化細胞培養物およびＬｅｕ１９枯渇化細胞培養物の両方で増加した。ＢＡＴ６および８をこれらの実験に用い、そして標的はヒト赤白血病（Ｋ５６２）およびヒトリンパ腫（ダウディー（Ｄａｕｄｉ））であった。実施例４細胞障害性の誘導におけるＢＡＴｍＡｂとＩＬ−２との間の相乗作用ヒトＰＢＭにおける細胞障害性の誘導については、ＰＢＭ細胞の、ＩＬ−２と組み合わせたＢＡＴｍＡｂとのインキュベーションの際に検討を行った。至適濃度以下（１Ｕ／ｍｌ）のＩＬ−２を増加濃度のＢＡＴ−２ｍＡｂと共に添加した。Ｋ５６２およびＨＴ２９腫瘍細胞株に対する細胞障害性を培養物中１週間後に検査した。以下の表５に示されるように、両方の種類の標的細胞に対するＰＢＭ細胞の細胞障害性の誘導においては、低濃度のＢＡＴ−２がＩＬ−２との相乗作用を示した。ＩＦＮ−αがＭＨＣ−１クラスの抗原の発現を亢進させることがこれまでに示されている。従って、ＩＦＮ−αの投与は、様々な腫瘍細胞（ＭＨＣクラスＩ抗原を有するもの）に対する細胞障害性細胞により媒介されるＢＡＴの抗腫瘍効果を増強させるように思われる。実施例５ＢＡＴ−１マウスの免疫刺激化効果：ａ．インビトロでの調査ｍＡｂＢＡＴ−１は、ヒトＰＢＬにおいて見られるものに類似するマウス脾臓細胞内での刺激化特性を示す。これらの特性には：（ｉ）［³Ｈ］−チミジン取り込みにより測定されるインビトロでの脾臓細胞増殖の増加（表６）；（ｉｉ）ＢＡＴ−１およびＩＬ−２の組み合わせ物との脾臓細胞のインキュベーションによる相乗刺激化効果（表６）；Ｃ５７ＢＬマウス脾臓細胞を、様々な濃度のＢＡＴ−１、およびそのような濃度のＢＡＴ−１とインターロイキン−２（１ｕ／ｍｌおよび１０ｕ／ｍｌ）との組み合わせ物を用いてインビトロで５日間インキュベートした。（ｉｉｉ）ＢＡＴ−１の存在下でのマウス脾臓細胞培養物の細胞障害性の増加、およびＩＬ−２の存在下でのインキュベーションの際の細胞障害性の更なる増加（表７）、が含まれる。ＢＡＴ−１活性化脾臓細胞による死滅化効果に感受性を示すマウス腫瘍標的細胞には：Ｂ１６黒色腫、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌（３ＬＬ）、線維肉腫（ＭＣＡ１０５）、腎臓細胞癌（ＭＲ２８）、およびリンパ腫（ＹＡＣ）、が含まれていた（表８）。ｂ．インビボでの調査以下の表９に示されるように、ＢＡＴ−１はインビボでの投与の際に免疫−刺激効果を示した。それらの効果には次のものが含まれていた：（ｉ）１０日前にＢＡＴ−１の注入を施したマウスからの脾臓細胞内の［³Ｈ］チミジン取り込みの刺激化（表９Ａ）。最大刺激化（１０倍）は１０μ ｇ／マウスの用量のＢＡＴの投与時に達成された。（ｉｉ）ＢＡＴ−１の注入を施したマウスからの脾臓細胞における細胞障害性の誘導（表９Ｂ）。細胞障害性アッセイの１０日前に様々な用量で投与したＢＡＴ −１により、マウス黒色腫（Ｂ１６−Ｆ１０）細胞、腎細胞癌（ＭＲ−２８）細胞、およびリンパ腫（ＹＡＣ）細胞に対する細胞障害性が誘導された。最大効果は１０μｇ／マウスの用量でのＢＡＴ投与時に達成された。マウスＣ５７ＢＬおよびＢＡＬＢ／ｃに様々な濃度のＢＡＴｍＡｂを静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射した。１０日後の細胞障害性および［³Ｈ］チミジン取り込みを単離化脾臓細胞内で決定した。Ｃ５７ＢＬマウスからの脾臓細胞をＢ１６黒色腫標的細胞について、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞をＭＲ−２９およびＹＡＣ細胞について検査した（エフェクター：標的の比率５０：１）。３〜４の個別の実験における各群は６〜１６の間の匹数のマウスを含んでいた。各マウスについての細胞障害性および［³Ｈ］チミジン取り込みは三重実験で実施し、そして平均値から算出された結果をｎ匹のマウスの平均値±標準誤差で表示し、対照とＢＡＴ処理化動物との間の変化についてのｐ−値が示されている。実施例６マウス腫瘍に対するＢＡＴ−１の免疫療法効果表１０に示されるように、腫瘍細胞の接種後１４日目の黒色腫誘導化マウスへのＢＡＴ−１の投与により、Ｂ１６、３ＬＬ、およびＭＣＡ腫瘍を保持するマウスの肺における肺転移数が減少した。ａ１．樹立された肺転移モデルを用いるＢ１６黒色腫−誘導化マウスにおける肺転移を根絶するＢＡＴ−１Ｃ５７ＢＬマウスに５０×１０³のＢ１６黒色腫細胞の注入（静脈内（ｉ．ｖ．））を施した（表１０）。注入後２４日目には、図７の上段に見られるように肺に多数の転移が発症した（実際には密集状態に至っていた）。これに対し、図７の下段に見られるように、Ｂ１６黒色腫の接種を施した２週間後にＢＡＴ−１（１０ μｇ／マウス）の注入を施したマウスの肺には実際的に転移は存在していなかった。図８には、先と類似の条件下で実施された６回の個別実験の結果をまとめてある。ａ２．Ｂ１６腫瘍接種に関する様々な時期に注入したＢＡＴ−１ｍＡｂの抗腫瘍効果表１１に示されるように、黒色腫細胞の注入を施し、そして１０〜１４日後にＢＡＴ−１ｍＡｂ投与による処理を施したマウスには転移が存在せず、かつ正常な肺重量を保持することが見いだされた。これらのマウスの肺における転移数の顕著な減少は、完全な状態ではないにせよ腫瘍接種後５日目には認識され、そして遅くとも腫瘍投与後１９日目には観察される。腫瘍細胞の接種と同一の日にちでのＢＡＴ−１の注入では治療効果は得られなかった。ｂ．樹立化肺転移モデルを用いるルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌（３ＬＬ）−接種化マウスにおける肺転移を根絶するＢＡＴ−１実験条件は、２×１０⁵ ３ＬＬ細胞を注入したことを除いて、Ｂ１６黒色腫について記載されたもの（先を参照されたい）に類似していた。図９の上段は、多数の転移を伴う３ＬＬ−接種化マウスからの肺を示す。図９の下段は、腫瘍細胞を予め接種してあり、そしてその１４日後にＢＡＴ−１処理を施したマウスからの肺を示し、図中に示されるようにそれらにはほとんど転移が存在しない。ｃ．樹立化肺転移モデルを用いるＭＣＡ線維肉腫（ＭＣＡ１０５）−接種化マウスにおける肺転移を根絶するＢＡＴ実験条件は、３ＬＬルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌モデルについて記載されたものに類似する。図１０の上段は多数の転移を伴うＭＣＡ１０５接種化マウスからの肺を示す。図１０の下段は、予め腫瘍を接種し、そしてその後にＢＡＴ−１処理を施したマウスからの肺を示し、図中に示されるようにそれらにはほとんど転移が存在しない。実施例７Ｂ１６および３ＬＬ腫瘍を保持するマウスを救済するＢＡＴ−１先に記載した要領でＢ１６黒色腫細胞もしくは３ＬＬ細胞を接種したマウスは、腫瘍接種後２５〜３５日以内に死亡する。これに対し図１１に見られるように、腫瘍接種後１４日目にＢＡＴ−１（１０ μｇ／マウス）を注入した全マウスは１００日以上生存した。５カ月間の追跡調査を行った動物の大多数は疾病兆候を全く示さず、かつ病理学的調査の際にも転移の所見が存在しなかった。実施例８ＢＡＴ−１ｍＡｂで処理したマウスからの脾臓細胞の養子免疫細胞移入予めＢＡＴ−１ｍＡｂ単独で処理してあるか、もしくは最初にＢ１６黒色腫細胞の注入を施しそしてその後にＢＡＴ−１ｍＡｂで処理したマウスからの脾臓細胞を、レシピエントマウス内に移入した。このレシピエント細胞に、Ｂ１６黒色腫細胞もしくは３ＬＬ腫瘍細胞のいずれかの接種を施した。以下の表１２に見られるように、ＢＡＴ−１ｍＡｂ注入マウスからの脾臓細胞の養子免疫細胞移入により、移入された脾臓細胞を受け取る腫瘍保持マウス内での腫瘍の退縮が誘導された。Ｂ１６黒色腫細胞での接種および１４日後のＢＡＴ−１での注入の両方を施したマウスの１０⁵の脾臓細胞をレシピエントである腫瘍保持マウスに養子免疫細胞移入させた際に、最も効果的な治療の所見が得られた。表１２に示されるように、この場合には、Ｂ１６腫瘍保持レシピエントにおける黒色腫腫瘍細胞の完全除去、および３ＬＬ腫瘍保持レシピエントにおける顕著な腫瘍退縮が存在したが、それは転移数および肺重量において示される。これらの結果により、Ｂ１６接種およびＢＡＴ−１処理を施したマウスからの脾臓細胞のみが、Ｂ１６および３ＬＬの両腫瘍に対する抗腫瘍効果を呈することが示された。従って、ＢＡＴ−１は非特異的細胞性エフェクターメカニズムを亢進するように思われる。それに加えて腫瘍の存在により、このようなエフェクター細胞のＢＡＴ−１誘導化産生の亢進が強化された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月２８日【補正内容】ｍＡｂを５０％硫酸アンモニウム沈殿により培養培地から精製し、その後にＰＢＳに対する徹底的な透析を行った。さらなる精製を、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｗｅｄｅｎ、の登録商標）結合化抗−マウス抗体カラム上での親和性クロマトグラフィーにより実施した。培養培地全細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）Ｎａ−ピルビン酸（１．１ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（０．３ｍｇ／ｍｌ）、ならびに抗生物質（ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）２００ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）を補足してあるＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、そして５％ＣＯ₂で湿潤させたインキュベーター内でインキュベートした。用いたＩＬ−２単位はＣｅｔｕｓ単位である（１Ｃｅｔｕｓ単位は３国際単位に等しい）。細胞調製物ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭ）は、フィコール−ヒパキュー濃度勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、の登録商標）により健常成人ドナーから取得された。セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｗｅｄｅｎ、の登録商標）Ｇ１０カラムによりＰＢＭから単球を枯渇させた。Ｔ細胞はＳＲＢＣロゼット法により分離した。ＣＤ３陽性でかつＬｅｕ１９陽性の細胞の枯渇は免疫磁気技術により実施した。ＢＡＴｍＡｂもしくは対照物と共に５〜６週間インキュベートしたＰＢＭの培養物をＰＢＳで３度洗浄した。ＣＤ３もしくはＬｅｕ１９（ＣＤ５６）のいずれかに対して複合体形成を行わない抗体を完全ＲＰＭＩ培地中の細胞に添加し、そして４℃で１時間インキュベートした。抗マウス抗体で被包化させた磁気ビーズを３０分間添加した。これらのビーズに付着した細胞を磁石で除去し、そして非付着細胞を細胞障害性活性について分析し、そしてフローサイトメトリーによる染色を施した。細胞障害性アッセイ細胞障害性アッセイは以下のように実施した：２〜４×１０⁶標的細胞を２００μＣｉの⁵¹Ｃｒ−クロム酸塩と、１時間、無血清培地中で混合させた。これらの標的細胞を完全培地で３度洗浄し、そして最終的にはＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中に再懸濁させ、そしてウエル当たり１０⁴細胞でプレート培養した。エフェクター細胞を培養し、リンパ球を、様々なｍＡｂ、イソタイプ対照のＩｇＧ、もしくはＩＬ−２と共に様々な期間インキュベートした正常末梢血から調製した。アッセイ前には細胞をＲＰＭＩ培地中で３度洗浄し、１％のトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）を用いて生存細胞についての染色を実施し、丸底マイクロタイタープレート中で様々なエフェクター−標的比率で標的細胞と混合させ、そして３７℃下、５％ＣＯ₂中で３時間インキュベートした。この培養上清を回収し、そしてβ−シンチレーション計数器内での計測を行った。最大同位体放出（ＭＲ）は、Ｔｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、の登録商標）ｘ−１００との標的細胞のインキュベーションにより産生される。自発的放出（ＳＲ）を培地単独を用いる標的のインキュベーションにより測定する。細胞溶解のパーセンテージを（ＥＲ−ＳＲ／ＭＲ−ＳＲ）×１００［式中、ＥＲは実験誤差による放出値である］により算出する。ヒトリンパ球亜集団中での細胞障害性の誘導ＰＢＭ細胞（４×１０⁶／ｍｌ）をＢＡＴｍＡｂの存在下で６日間培養した。その後に細胞を３度洗浄し、そして抗マウスＦ（ａｂ’）₂で被包化させた磁気ビーズによるＣＤ３およびＬｅｕ１９細胞の枯渇化を施し、そしてＫ５６２およびダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞に対する細胞障害性についての検査を行った。フローサイトメトリー細胞の表面抗原を、ＦＡＣＳ４４０（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いるフローサイトメトリーにより検出した。各分析について１０⁴細胞を用いた。細胞を、ヒトＣＤ３、ＩＬ−２レセプターに対する至適濃度のマウスｍＡｂ、もしくは産生されたｍＡｂＢＡＴ−１〜９を用いる連続インキュベーションにより染色した。ＦＩＴＣ−複合体形成化ヤギ抗−マウスＦ（Ａｂ’）₂をこの間接的染色における第二抗体として用いた。各インキュベーションは、１％ＢＳＡおよび０．５％アジ化Ｎａを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、４℃下で実施し、そしてその後に同一緩衝液での３度の洗浄を実施した。１０⁴の染色化細胞を分析した。実施例２ＢＡＴｍＡｂ結合部位の分析およびＢＡＴ−１結合性蛋白質の精製ＢＡＴ−１ｍＡｂと相互作用を行う膜蛋白質の分子量を決定する目的で、ダウディー（Ｄａｕｄｉ）細胞の膜調製物を可溶化し、そしてその蛋白質をＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分離させた。ニトロセルロース転移化ブロットをＢＡＴ−１ｍＡｂと共にインキュベートし、そしてバンドを、抗−マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’ ）₂に対するセイヨウカラシ−パーオキシダーゼ複合体形成化抗体を用いる別のインキュベーション、およびＯ−ジアニジジン基質を用いる検出により決定した。ＢＡＴ−１結合性蛋白質の分子量が約４８〜５０ＫＤａであることが見いだされた（図４）。このＢＡＴ−１ｍＡｂ結合性蛋白質を、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｗｅｄｅｎ）の登録商標）に対して複合体形成させたＢＡＴｍＡｂを用いて精製した。この結合性蛋白質は、分子生物学的技術を用いるクローニングにより調製することも可能である。インビボでのＢＡＴ− １のマウスへの投与によりＢＡＴ抗体の誘導がもたらされる。実施例３ＢＡＴｍＡｂの機能上での特性決定ａ．ＢＡＴｍＡｂ誘導性チミジン取り込みヒト末梢血細胞を６日間、増加濃度の一連のＢＡＴｍＡｂの存在下で培養し、そして細胞回収前２０時間目に［³Ｈ］チミジンでパルスした。図５に見られるように、ＢＡＴｍＡｂの濃度を徐々に上昇させることにより、ＰＢＭ細胞内の［³Ｈ］チミジン取り込みのわずかながらではあるが顕著な増加がもたらされた。しかしながら高用量の抗体によっては細胞による取り込みに減少が生じた。対照実験ではイソタイプ適合化抗体はＰＢＬ細胞内の［³Ｈ］チミジンは増加せず、このことによりＢＡＴｍＡｂのアゴニスト効果はこれらの結合特異性特性に依存することが示された。例えば、ＩｇＧ１イソタイプのｍＡｂ（これは我々の研究室において卵巣癌細胞に対して作製したものである）は［³ Ｈ］チミジン取り込みの増加は生じず、このことはやはりＩｇＧ１クラスに属するＢＡＴ１、２、３、６、７、および９ｍＡｂと対照をなす。請求の範囲１．モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片であって、ｉ．コレクションナショナルデカルチャーデマイクロオルガニズム（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体、もしくはｉｉ．（ｉ）に属する抗体が結合する抗原に結合するモノクローナル抗体、である、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片。２．ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌される、請求の範囲１に記載のモノクローナル抗体もしくは断片。３．請求の範囲１もしくは２に記載の抗体を分泌する不滅化細胞株。４．ハイブリドーマ細胞株である、請求の範囲３に記載の不滅化細胞株。５．ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株である、請求の範囲４に記載のハイブリドーマ細胞株。６．請求の範囲１もしくは２に記載の抗体の有効量を、治療を必要とする被検体に投与し、その結果その個体の免疫系に影響を及ぼすことを含む、疾患もしくは障害の治療方法。７．個体の免疫系の細胞障害性活性が刺激される、請求の範囲６に記載の方法。８．癌の治療のための、請求の範囲６に記載の方法。９．活性成分としての請求の範囲１もしくは２に記載のモノクローナル抗体の有効量、および生理学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。１０．前記抗体以外に更に、細胞障害性リンパ球の活性を前記抗体のものへの相加的もしくは相乗的様式で亢進させることが可能な作用物質も含む、請求の範囲９に記載の薬剤学的組成物。１１．請求の範囲１もしくは２の抗体が特異的に結合する蛋白質性物質。１２．ゲル電気泳動において確認される約４８〜５０キロダルトンの見かけ上の分子量を有する、請求の範囲１１に記載の物質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｂリンパ芽球様細胞に結合し、かつ末梢血リンパ球の増殖および活性化を誘導し、そして腫瘍保持動物内に注入した際には抗腫瘍効果を誘導するモノクローナル免疫刺激性抗体もしくはその抗原結合性断片。２．Ｂリンパ芽球様細胞、溶解されたＢリンパ芽球様細胞、もしくはそれらの膜調製物からなる群より選択される免疫原で動物を免疫化し、そして免疫化動物内での免疫反応の進展後に、その動物からＢ−リンパ球を取り出し、増殖させ、細胞株の不滅化を行い、そしてその免疫原に結合し、かつ末梢血リンパ球の増殖および活性化を誘導し、かつ腫瘍保持動物中で抗腫瘍効果を誘導することが可能な抗体を産生するものについての選択を行うことにより取得される、請求の範囲１に記載のモノクローナル抗体もしくはその断片。３．コレクションナショナルデカルチャーデマイクロオルガニズム（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体の特性を有する、請求の範囲１に記載のモノクローナル抗体もしくは断片。４．ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌される、請求の範囲１に記載のモノクローナル抗体もしくは断片。５．請求の範囲１に記載の抗体を分泌する不滅化細胞株。６．ハイブリドーマ細胞株である、請求の範囲５に記載の不滅化細胞株。７．コレクションナショナルデカルチャーデマイクロオルガニズム（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌される抗体の特性を有する抗体を分泌する、請求の範囲６に記載の細胞株。８．ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株である、請求の範囲７に記載のハイブリドーマ細胞株。９．請求の範囲１に記載のモノクローナル抗体の有効量を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、疾患もしくは障害の治療方法。１０．疾患もしくは障害が癌である、請求の範囲９に記載の方法。１１．抗体が、コレクションナショナルデカルチャーデマイクロオルガニズム（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌される抗体の特性を有する、請求の範囲９に記載の方法。１２．モノクローナル抗体がＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌される、請求の範囲１に記載の方法。１３．活性成分としての請求の範囲１に記載のモノクローナル抗体の有効量、および生理学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。１４．モノクローナル抗体が、コレクションナショナルデカルチャーデマイクロオルガニズム（ＣＮＣＭ）に受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌されるものの特性を有する、請求の範囲１３に記載の薬剤学的組成物。１５．抗体が、ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−１３９７として寄託されているハイブリドーマ細胞株により分泌されるものである、請求の範囲１４に記載の薬剤学的組成物。１６．前記抗体以外に更に、細胞障害性リンパ球の活性を前記抗体のものへの相加的もしくは相乗的様式で亢進させることが可能な作用物質も含む、請求の範囲１３に記載の薬剤学的組成物。１７．請求の範囲１の抗体が特異的に結合する蛋白質性物質。１８．ゲル電気泳動において確認される約４８〜５０キロダルトンの見かけ上の分子量を有する、請求の範囲１７に記載の物質。