JPH0198477A - ＩｇＧモノクローナル抗体−生産性ハイブリドマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、広義には、新規な交雑細胞ライン（ｈｙｂｒ
ｉｄ　　ｃｅｌｌ　　１ｉｎｅ）さらに詳しくはすべて
の正常なヒトのヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）　Ｔ細胞に見
い出されるある抗原に対するモノクローナル抗体の生成
のための交雑細胞ラインに関する。

１９７５年におけるＫ　ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎによる免疫されたマウスからの肺細胞へのマウスの
骨髄腫の融合（ｆｕｓｉｏｎ）　　［Ｎａｔｕｒｅ　２
５６．４９５−４９７　（１９７５）］は、均質な（い
わゆる「モノクローナル」）抗体をつくる連続な細胞ラ
インを得ることができることを初めて証明した。

この基本の研究以来、種々の交雑細胞［いわゆる［ハイ
ブリドマ類（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）　Ｊ］の生成およ
びこれらのハイブリドマ類によりつくられた抗体の種々
の科学的研究への使用について多くの努力が向けられて
きた。たとえば、次の文献を参照：９ｕｒｒｅｎｔ　　
Ｔｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　
　ａｎｄ　　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌｕｍｅ　
　８１−“Ｌ　ｙｍｐｈｏｃｙｔａ　　Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａｓ”、　Ｆ　、　Ｍｅｌｃｈｅｒｓ、　Ｍ、　Ｐｏ
ＬＬｅｒ、およびＮ　、　Ｗａｒｎｅｒ、　Ｅｄｉｔｏ
ｒｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ。

１９７８、およびそこに含まれる参考文献；Ｃ９Ｊ　、
　Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１
．　　ｌ　４．９−２０　（Ｍａｙ、　　ｌ　９７８）
　　；　Ｐ、　ＰａｒｈａｍおよびＷ。

Ｆ　、　Ｂｏｄｍｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　　２７６．３
９７−３９９（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ、　　１９７８）　；
　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｏｌｕｍｅ　　
　２．　　Ｄ、Ｍ、Ｗｉｅｒ、　　Ｅｄｉｔｏｒ、　　
Ｂ　ｌａｃｋｗｅｌｌ、１９７８、Ｃｈａｐｔｅｒ　　
２５　；およびＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄ　　　Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ　　Ｎｅｗｓ、　　Ｊａｎｕａｒｙ　　
　ｌ、　　１９７９．１５−１７゜これらの文献は同時
にハイブリドマ類からモノクローナル抗体を生成する試
みによって得られる利益および複雑さを示している。一
般的技術は概念的によく理解されているが、各特定の場
合に多くの困難に出合い、そして変更が要求される。事
実、一定のハイブリドマを生成しようと試みる前には、
所望のハイブリドマが得られるか、得られた場合抗体を
生成するか、あるいはそのように生成された抗体が所望
の特異性をもつか、を確めることができない。成功の程
度は、主として、使用する抗原のタイプおよび所望のハ
イブリドマを単離するために使用する選択技術によって
影響を受ける。

人間のリンパ球細胞表面の抗原に対するモノクローナル
抗体を生成する試みは、数例報告されて６９および１６
４−１６９参照。これらの報告された実験において使用
されている抗原は、培養したリンパ芽球性白血病および
ヒトの慢性リンパ球性白血病の細胞ラインであった。得
られた多くのハイブリドマ類は、すべてのヒト細胞の種
々の抗原に対して抗体を生成するように思われた。ハイ
ブリドマ類はいずれも、ヒトのリンパ球の前もって定め
たクラスに対して抗体を生成しなかった。

人間および動物の免疫系に含まれるリンパ球に２つの主
なりラスが存在することを理解すべきである。これらの
うちの第１クラス（胸腺誘導細胞、すなち、Ｔ細胞）は
、ヘモポイエチン幹細胞から胸腺において分化されてい
る。胸腺内にある間、分化する細胞は「胸腺細胞」と名
づけられる。成熟したＴ細胞は胸腺から出、そして組織
、リンパ管、および血流の間を循環する。これらのＴ細
胞は、再循環する小さいリンパ球の貯留（ｐｏｏｌ）の
大きい比率を形成する。それらは免疫学的特異性を有し
、そして細胞介在免疫応答（組織移植注入のような）に
おいてエフェクター（ｅｆ　ｒｅｃｔｏｒ）細胞として
直接関与する。Ｔ細胞は液性抗体を分泌しないが、後述
するリンパ球の第２クラスによるこれらの抗体の分泌に
時々要求される。Ｔ細胞のいくつかの型は免疫系の他の
面において調節機能をはたす。この細胞共働の過程の機
構はまだ完全には理解されていない。

リンパ球の第２クラス（骨髄誘導細胞、すなわち、Ｂ細
胞）は、抗体を分泌するものである。それらもまたへモ
ポイエチン幹細胞から発生するが、それらの分化は胸腺
によって決定されない。鳥類において、それらはファプ
リキウス嚢（Ｂ　ｕｒｓａｏｆ　　Ｆ　ａｂｒｉｃｉｕ
ｓ）と呼ばれる胸腺に類似する器管において分化されて
いる。しかし、哺乳動物においては、同等の器管は発見
されておらず、そしてこれらのＢ細胞は骨髄内で分化す
ると考えら・れる。

ここで、Ｔ細胞は「ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）　Ｊ、［
抑制体（Ａ　ｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）　Ｊおよび「キラー
（ｋｉｌｌｅｒ）　ＪＴ細胞と呼ばれる、少なくともい
くつかのサブタイプに分けられ、それらは（それぞれ）
反応を促進し、反応を抑制し、あるいは異種細胞を殺す
（分離する）機能ををすることが認められた。これらの
サブクラスはネズミの系統についてよく理解されている
が、それらは人間の系についてわずかに最近記載された
だけである。たとえば、次の文献を参照：　Ｒ，Ｌ、　
Ｅｖａｎｓ、　ａｔ　ａｌ、、　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　
ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、
　Ｖｏｌｕｍｅｌ　４５．２２１−２３２、ｌ　９７７
　、およびり、ＣｈｅｓｓおよびＳ　、　Ｆ　、　Ｓ　
ｃｈｌｏｓｓｍａｎ−“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　　Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　　Ｈｕｍ
ａｎ　　Ｔ−Ｃｅｌｌ　　５ｕｂｓｅｔｓ　　Ｂｅａｒ
ｉｎｇ　　Ｕｎｉｑｕｅ　　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ
ｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎｓ”Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　
　Ｔｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｇｙ
”、Ｏ、Ｓ　ｔｕｔｍａｎ、　Ｅ　ｄｉｔｏｒ、　Ｐ　
ＩｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、　ｌ　９７７、Ｖｏｌｕｍｅ　
　７．３６３−３７９゜ Ｔ細胞のクラスまたはサブクラスを同定または抑制する
ことができることは、種々の免疫調節の不調または状態
の診断まｌ；は処置にとって重要である。

たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫は、それらが
Ｂ細胞またはＴ細胞のいずれを源とするかによって、異
なる予後を有する。こうして、病気の予後の評価はこれ
らのリンパ球の２つのクラスを区別することに依存する
。たとえば、次の文献を参照：　Ａ　、　Ｃ、Ａ　１ｓ
ｅｎｂｅｒｙおよびＪ、Ｃ，Ｌｏｎｇ、　Ｔｈｅ　　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ、　５８　：　３００　（Ｍａｒｃｈ、　　
ｌ　９７５）　　；Ｄ、　Ｂｅｌｐｏｍｍｅ、　ａｔ　
ａｌ、、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｄｉａ
ｇｎｏｓｉｓｏｆ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ　　ａｎｄ　
　Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ、　Ｓ、　Ｔｈ１ｅｒｆｅｌｄｅ
ｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｄｉｔｏｒｓ、　　Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ、　　ＨｅｉｄｅＩｂｅｒｇ、　ｌ　９７７．
３３−４５．およびり、Ｂｅ１ｐある種の病気の状態（
たとえば１．若年性リウマトイド関節炎およびある種の
白血病）は、Ｔ細胞のサブクラスの不釣合いに関連する
。１故免疫の病気は一般に「ヘルパー」Ｔ細胞の過剰ま
たはある種の「抑制体」Ｔ細胞の欠乏に関連するが、悪
性の病気は一般に「抑制体」Ｔ細胞の過剰に関連するこ
とが示唆された。

ある種の白血病において、過剰のＴ細胞は発育の停止し
た状態において生成される。診断はこうしてこの不釣合
い、すなわち、過剰を検知することができることに依存
しうるであろう。たとえば、次の文献を参照：　Ｊ　、
　Ｋｅｒｓｅｙ、　ｅＬ　ａｌ、、　”　５ｕｒｆａｃ
ｅ　　Ｍａｒｋｅｒｓ　　Ｄｅｆｉｎｅ　　Ｈｕｍａｎ
　　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　　Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ　
　ｗｉｔｈ　　Ｄ　ｉｆｆｅｒｉｎｇ　　Ｐ　ｒｏｇｎ
ｏｓｅｓ”。

Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｂ　ｆｏｏｄ　
　Ｔ　ｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ。

Ｖｏｌｕｍｅ　２０、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａ
ｇ、　　１９７７．１７−２４、およびその中に含まれ
る参考文献。

後天性無ガンマアゲロブリン血症（ａｏｇｕｉｒｅｄａ
ｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）　、すなわち免
疫グロブリンが生成されない病気の状態は、少なくとも
２つの明確な型からなる。型■において、免疫グロブリ
ンの生成不能は抑制体（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）　Ｔ細
胞の過剰により、一方型■においてそれはヘルパーＴ細
胞の不足による。両方の型において、患者のＢ細胞、す
なわち、抗体を実際に分泌するリンパ球の不足もしくは
欠乏は存在しないように見える。しかしながら、これら
のＢ細胞は抑制され、あるいは［助けられず（”ｎｏｔ
　　ｈｅｌｐｅｄ”）　Ｊ　、その結果免疫グロブリン
は生成が大きく減少するか、生成しなくなる。後天性無
ガンマアゲロブリン血症の例はこうして抑制体Ｔ細胞の
過剰またはヘルパーＴ細胞の不存在について試験するこ
とによって決定することができる。

治療サイドにおいて、まだ明確に証明されていないが、
Ｔ細胞のサブクラスに対する抗体を過剰量で投与するこ
とは自己免疫の病気または悪性の病気において治療上有
益であるという、いくらかの示唆がある。たとえば、ヘ
ルパーＴ細胞のガン（ある種の皮膚Ｔ細胞リンパ臘およ
びある種のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病）はヘルパー
Ｔ細胞の抗原に対する抗体によって処理することができ
る。ヘルパー細胞の過剰により起こされる自己免疫（ａ
ｕｔｏｉｍｍｕｎｅ）の処置は、同じ方式でまた達成す
ることができる。

ヒトＴ細胞の全クラス（いわゆる抗ヒト胸腺細胞のグロ
ブリン、すなわち、ＡＴＧ）に対する抗血清は、移植組
織を受ける患者において治療上有用であると報告されて
いる。細胞介在免疫応答（移植組織を拒否する機構）は
Ｔ細胞に依存するので、Ｔ細胞に対する抗体を投与する
と、この拒否の過程を防止または遅延する。たとえば、
次の文献を参照：　Ｃｏ５１ｍ１．　ｅｔ　ａｌ、、　
”Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　　Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　　Ｔｒ
ｉａｌ　　ｏｆ　　ＡＴＧ　　ｉｎ　　Ｃａｄａｖｅｒ
　　ＲｅｎａｌＡｌｌｇｒａｆｔ　　Ｒｅｃｉｐｉｅｎ
ｔｓ：　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　　ｏｆＴ　Ｃｅｌｆ　
　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ”、　Ｓ　ｕｒｇｅｒｙ　　土
０：１５５−１６３　（１９７６）およびその中に含ま
れる参考文献。

ヒトＴ細胞のクラスおよびサブクラスの同定および抑制
は、従来、動物をヒｌ−Ｔ細胞で免疫し、その動物を出
血させて血清を取り、そしてこの抗血清を（たとえば）
地元（ａｕｔｏｌｏｌｇｏｕｓ）であるが、異種ではな
いＢ細胞で吸着して望まない反応性をもつ抗体を除去す
ることによって得た、ヒトＴ細胞のだめの自発性自己抗
体または選択的抗血清を使用することによって達成され
た。これらの抗血清の製造は、とくに吸着および精製の
工程において、きわめて困難である。吸着され且つ精製
された抗血清でさえ、所望の抗体に加えて、いくつかの
理由で、多くの不純物を含有する。第１に、血清はＴ細
胞で免疫する前に数百刃の抗体分子を含有する。第２に
、この免疫法は注入したすべてのヒト細胞について見い
出される種々の抗原に対する抗体を生成させる。単一の
抗原に対する抗体は選択的に生成されない。第３に、こ
のような方法で得られた特異性抗体の力価は通常極めて
低く（たとえば１：ｌＯＯより大きい希釈度において不
活性）そして非特異性抗体に対する比は１／１０６より
小である。

たとえば、前述のＣｈｅｓｓおよびＳ　ｃｈｌｏｓｓｍ
ａｎの文献（３６５ページ以降参考）および前述のＣｈ
ｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｅ　ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
　　Ｎ　ｅｗｓを参照。ここには先行技術の抗血清の欠
点およびモノクローナル抗体の利点が記載されている。

今回、本質的にすべての正常なヒト抹消ヘルパーＴ細胞
（正常なヒトの抹消Ｔ細胞の約５５％）について見い出
される抗原に対する新規なモノクローナル抗体を生成で
きる新規なハイブリドマ（ＯＫＴ４と標示）が見出され
た。そのように生成された抗体は正常なヒトのヘルパー
Ｔ細胞についての単一の決定因子に対して単一特異性（
ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり、そして他の抗ヒト
免疫グロブリンを本質的に含有しないが、これと対照的
に先行技術の抗血清は多数のヒト抗原に対して反応性の
抗体で本来汚染されており、そして先行技術のモノクロ
ーナル抗体はヒトＴ細胞の抗原について単一特異性では
ない。その上、このハイブリドマは培養して抗体を生成
することができる。この場合動物を免疫し、殺し、次い
で先行技術の不純の抗血清を得るときにさえ、必要な長
たらしい吸着および精製の工程を実施することを要しな
い。

したがって、本発明の１つの目的は、本質的にすべての
正常なヒトのヘルパーＴ細胞について見い出される抗原
に対する抗体を生成するハイブリドマ類を提供すること
である。

本発明のさらに別の面において、これらのハイブリドマ
類を製造する方法を提供する。

本発明の他の目的は、本質的にすべての正常なヒトのヘ
ルパーＴ細胞について見い出される抗原に対する本質的
に均質な抗体を提供することである。

さらに他の目的は、これらの抗体を用いる病気の処置ま
たは診断の方法を提供することである。

本発明のその他の目的および利益は、本発明の開示を検
討すると明らかになるであろう。

前述の目的および利益を達成するため、本発明によれば
、本質的にすべての正常なヒトのヘルパーＴ細胞につい
て見い出される抗原に対する新規な抗体を生成する新規
なハイブリドマ、この抗体それ自体、およびこの抗体を
用いる診断および治療の方法が提供される。該ハイブリ
ドマはＭｉｌｓＬｓｉｎおよびＫｏｈｌｅｒの方法に一
般に従って製造される。正常のＥロゼッｌ−（ｒｏｓｅ
ｔｔｅ）陽性のヒトＴ細胞でマウスを免疫した後、免疫
したマウスの脾細胞をマウスの骨髄腫ラインからの細胞
と融合し、そして得られたハイブリドマ類を正常のＥロ
ゼツト陽性のヒトＴ細胞に選択的に結合する抗体を含有
する上澄液を用いてそれらについて選別した。

所望のハイブリドマ類を引き続いてクローン化し、特徴
づけた。その結果、本質的にすべての正常なヒトＴ細胞
についての抗原に対する抗体（ＯＫＴ４と表示する）を
生成するハイブリドマが得られた。この抗体は本質的に
すべての正常なヒトのヘルパー抹消Ｔ細胞と反応するが
、非ヘルパーＴ細胞を含む他の正常な抹消の血液のリン
パ球細胞と反応しない。更に、この抗体により認識され
る細胞表面の抗原は正常のヒトの胸腺細胞のほぼ８０％
について検知される。型■の後天性無ガンマクロプリン
血症の患者は、ブラインド（ｂｌｉｎｄ）試験において
０ＫＴ４抗体により検知された。また、主題の抗体はＲ
ｈｅｓｕｓサルの抹消Ｔ細胞の約５５％と反応する。

先行技術において示された困難および抗原として悪性の
細胞ラインを用いて報告された成功の不足をみると、本
発明の方法が所望のハイブリドマを提供したことは驚く
べきことであった。交雑細胞のこの予測されえない性質
は１つの抗原または細胞ラインから他のものへの補外（
ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅ）を許さないことに注意すべき
である。事実、本発明者らは、抗原としてＴ細胞・の悪
性細胞ラインを用いると、所望の抗体を生成しないハイ
ブリドマ類が形成することを見い出した。細胞表面から
分離した精製した抗原を使用する試みも不成功に終っｔ
こ　。

主題のハイブリドマおよびそれにより生成された抗体は
、表示“０ＫＴ４”によりここで同定され、該特定の物
質は本明細書から明らかとなる。

このハイブリドマおよび生ずる抗体の製造および特性は
、以下の説明および実施例から一層理解できるであろう
。

ハイブリドマを製造する方法は一般に次の工程からなる
： Ａ、Ｅロゼツト陽性の精製した正常なヒト末梢Ｔ細胞で
マウスを免疫する。メスのＣＡＦ、マウスが好ましいこ
とがわかったが、他のマウスの系統を使用できると考え
られる。免疫スケジュールおよびＴ細胞の濃度は、有効
量の適当に準備した脾細胞を生成するようなものである
べきである。

０．２ｍ１２のリン酸塩緩衝食塩溶液中の２ＸＩＯ’細
胞／マウス／注射を用いて、１４日の間隔で、３回免疫
を行うことは有効であることがわかった。

Ｂ、免疫したマウスから肺臓を除去し、適当な媒体中の
牌懸濁液を調製する。約１　ｍＱ／牌臓肺臓体で十分で
ある。これらの実験の技術はよく知られている。

Ｃ１懸濁した脾細胞を適当な細胞ラインからのマウスの
骨髄腫の細胞と、適当な融合媒体の使用により融合する
。肺細胞対骨髄腫細胞の好ましい比は約５対ｌである。

約１０”個の脾細胞について合計約０．５〜１．ｏｍＱ
の融合媒体は適当である。

多くのマウスの骨髄種の細胞は知られており、そして一
般に学問的共同体のメンバーまたは種々の寄託機関、た
とえば、ザ・ソータ・インスチチュート・セル・ディス
トリビューション・センター（ｔｈｅ　　Ｓ　ａｌｋ　
　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　Ｃｅｌｌ　　Ｄ　１ｓｔｒ
ｉｂｕｔｉｏｎ　　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｌａ　　Ｊｏｌｌ
ａ、　ＣＡ）から入手できる。使用する細胞ラインは好
ましくはいわゆる「薬物抵抗性」型であって、未融合の
骨髄腫細胞が選択した媒体中で生存せず、一方交雑細胞
が生存するようにすべきである。最も普通のクラスは８
−アザグアニン抵抗性の細胞ラインであり、これは酵素
ヒポキサンチン・グアニン・ホホリボシル・トランスフ
ェラーゼ（ｐｈｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　　ｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ）を欠き、それゆえＨＡＴ　（ヒボキサン
チン、アミノプテリン、およびチミジン）媒体により支
持されない。また、使用する骨髄腫細胞ラインはいわゆ
る「非分泌」型である、すなわち、それはそれ自体抗体
を生成しないことが一般に好ましいが、分泌型を使用で
きる。しかしながら、ある場合において、分泌する骨髄
腫ラインは好ましいことがある。好ましい融合促進剤は
平均分子量が約１０００〜約４０００であるポリエチレ
ングリコール（商業的にＰＥＧ　ｌ　０００などとして
入手できる）が好ましいが、この分野において知られて
いる他の融合促進剤を使用できる。

Ｄ、別の容器内において、未融合の脾細胞、未融合の骨
髄腫細胞、および融合した細胞の混合物を、未融合の骨
髄腫細胞を支持しない選択的媒体中で希釈し、未融合の
細胞を死亡させるのに十分な時間（約１週間）培養する
。この希釈は限定されたものの型であることができ、こ
の希釈において希釈剤の体積は統計的に計算して各別々
の容器［たとえば、マイクロタイタープレートの各ウェ
ル１中である数の細胞（たとえば、１〜４）を単離する
。媒体は薬物抵抗性（ｔ；とえば、８−アザグアニン抵
抗性）で未融合の骨髄腫細胞ラインを支持しないもの（
たとえば、ＨＡＴ媒体）である。

それゆえ、これらの骨髄腫細胞は死ぬ。未融合の脾細胞
は非悪性であるので、有限の数の世代をもつだけである
。こうして、ある期間（約１週間）後、これらの未融合
の脾細胞は再生しない。融合した細胞は、これに対して
、骨髄腫の親の悪性をもち、そして脾細胞の親の選択的
媒体中で生存できるので、再生し続ける。

Ｅ、ハイブリドマを含有する各ウェル中の上澄液を、Ｅ
ロゼツト陽性の精製したヒトＴ細胞に対する抗体につい
て評価する。

Ｆ、所望の抗体を生成するハイブリドマを選択しくたと
えば、限定希釈により）そしてクローン化する。

いったん所望のハイブリドマを選択し、クローン化する
と、終結の抗体は２つの方法の１つで生成させることが
できる。最も純粋なモノクローナル抗体は、所望のハイ
ブリドマを適当な媒体中で適当な長さの時間試験内で培
養し、次いで所望の抗体を上澄液から回収することによ
って生成される。適当な媒体および適当な培養時間の長
さは、既知であるか、あるいは決定内容である。この試
験管内技術は、他の特異性の抗ヒト免疫グロブリンを本
質的に含まない、単一特異性モノクローナル抗体を本質
的に生成する。媒体は外因性血清（たとえば、胎児の子
牛の血清）を含有するので、少量の他の免疫グロ゛プリ
ンが存在する。しかしながら、この試験管内の方法は、
モノクローナル抗体の濃度がわずかに約５０μｇ／ｍｕ
であるので、十分な量または濃度を生成できない。

非常に大きい濃度のわずかに純度に劣るモノクローナル
抗体を生成させるため、所望のハイブリドマをマウス、
好ましくは先天性または生先天性のマウスに注射できる
。ハイブリドマは適当な潜伏時間後抗体生成の腫瘍を形
成させ、その結果宿主マウス血流および腹膜滲出液（腹
水）中に高濃度の所望とする抗体（約５〜２０　ｍｇ／
　ｎ＋Ｑ）が生ずる。これらの宿主マウスも正常の抗体
を血流および腹水の中に有するが、これらの正常な抗体
の濃度はモノクローナル抗体濃度のわずかに約５％であ
るにすぎない。その上、これらの正常の抗体は特異性が
抗ヒトでないので収穫した腹水または血清から得たモノ
クローナル抗体は汚染する抗ヒト免疫グロブリンを本質
的に含有しない。このモノクローナル抗体は力価が高＜
　（１：　３０．０００以上の希釈で活性である）そし
て特異性免疫グロブリン対非特異性免疫グロブリンの比
が高い（約１／２０）。Ｋ軽量の骨髄腫鋼を組込んだ生
成した免疫グロブリンは非特異性の「無意味な」ペプチ
ド類であり、これらはモノクローナル抗体をその特異性
を減じないで単に希釈するだけである。

実施例　Ｉ Ａ、免疫および体細胞の交雑 メスのＣＡＦ１マウス（Ｊ　ａｃｋｓｏｎ研究所；生ま
れてから６週間）を、０．２ｍ１２のリン酸塩緩衝食塩
溶液中の２ＸｌＯ’のＥロゼツト精製したＴ細胞で腹膜
内的に１４日の間隔で免疫した。第３回目の免疫後、牌
をマウスから取り出し、そしてステンレス鋼の網に組織
を通すことによって単一細胞の懸濁液をつくった。

細胞の融合をＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方
法に従って実施した。ｌＸｌ０”の脾細胞を、ＲＰＭ１
１６４０媒体（Ｇ　１ｂｃｏ、　Ｇ　ｒａｎｄ　　Ｉ　
５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中の３５％のポリエチレグリコー
ル（ＰＥＧ１０００）と５％のジメチルスルホキシドと
からなる融合媒体の０．５ｍ４中において、２Ｘ１０’
のＰ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ１骨髄腫細胞（Ｂｒ、　Ｍ、　５
ｃｈａｒｆｆ、　Ａｌｂａｒｔ　　Ｅｉｎｓｔｅｉｎ　
　ＣｏＣｏ１１ｅ　　ｏｆ　　Ｍａｄｉｃｉｎｅ、　Ｂ
　ｒｏｎｘ、　Ｎ　Ｙにより供給）と融合した。

これらの骨髄腫細胞はＩｇＧ１にＬ鎖（ｌｉｇｈｔｃｈ
ａｉｎｓ）を分泌する。

細胞の融合後、細胞をＨＡＴ媒体（ハイポキサンチン、
アミノブチリン、およびチミジン）中で３７°Ｃにおい
て５％のＣＯ２を使用して湿った雰囲気中で培養した。

数週間後、ハイブリドマ類を含有する培養液から４０〜
１００μＱの上澄液を、Ｍｅｎｄａｓ（Ｊ、　　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、　　ｌ　１１　：　８６０．　１９７３）が
記載するように健康なヒトの供与者の血液から調製した
、Ｅロゼツト陽性（Ｅつ個体群とＥロゼツト陰性（Ｅつ
個体群とに分けた１０６の末梢リンパ球のベレットに加
えた。これらの細胞へ結合するマウスのハイブリドマ抗
体の検出は、ラジオイムノアセイおよび／または間接免
疫蛍光法により決定した。第１の方法において、細胞は
初めｌＯＯμＱの親和性精製したｌ！Ｊ山羊の抗マウス
ＩｇＧ　（ｌ　Ｏ’ｃｐｍ／μｇ；　５００μｇ／ｚｉ
ｉ）の１００μＱと反応させた（山羊の抗マウスのヨウ
素化の詳細はＫｕｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　、　Ｂ
　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５１　（８）：２３９９，１９７６に記載されている
）。別法として、培養液の上澄液で培養した細胞を蛍光
を付与した山羊の抗マウスＩｇＧ（Ｇ／Ｍ　　Ｆ　Ｉ　
ＴＣ）　　（Ｍｅｌｏｙ研究所、Ｓ　ｐｒｉｎａｆ　１
ｅｌｄ。

ＶＡ　、Ｆ／Ｐ−２，５）で染色し、この蛍光性抗体被
覆細胞を引き続いてシトフルオログラフ（Ｃｙｔｏｆｌ
ｕｏｒｏｇｒａｆ）　ＦＣ２００／４８００Ａ　（Ｏｒ
ｔｈｏ　　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｗｅｓｔｗｏ
ｏｄ、　Ｍ　Ａ　）について実施例■に記載するように
分析した。Ｅ＋リンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する
抗体を含有するハイブリドマ培養液を選択し、クローン
化した。引き続いて、分校系を２．６．Ｉ　Ｏ，１４−
テトラメチルペンタデカン（Ａ　Ｉｄｒｉｃｈ　　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏｍｐａｎｙから商品名Ｐｒ１ｓｔ
ｉｎｅで市販されている）で準備したＣＡＦ、マウスに
一定クローンのｌＸｌ０’細胞（０，２ｍ１２の体積）
を注射することによって、腹膜内に移植した。次いでこ
れらのマウスからの悪性腹水を使用して、実施例■にお
いて後述するように、リンパ球を特徴づけた。主題の交
雑抗体０ＫＴ４は、標準の技術によりサブクラスＩｇＧ
２であり、補体を固定すると証明された。

実施例　■ Ａ、リンパ球個体群の単離 人間の末梢血液の単核細胞を、健康な志願者の提供者（
１５〜４０才）から、Ｂ　ｏｙｕｍ、　Ｓ　ｃａｎｄ。

Ｊ　、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、　
２１　（Ｓｕｐｐｌ、　９７）ニア７．１９６８の技術
に従い、フィコール−ハイバック（Ｆ　１ｃｏｌｌ　−
Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離（Ｐ　ｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｆ　ｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐ　ｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、ＮＪ）により単離した。分別しない単核
細胞を、Ｃｈｅｓｓｓ、　ｅＬ　ａｌ、、　　Ｊ　、　
　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　　ｌ　１３　：１１１３　（１
９７４）にすでに記載されているように、Ｓ　ｅｐｈａ
ｄｅｘ　　Ｇ　−２００抗−Ｆ　（ａｂ’）１カラムク
ロマトグラフイーにより、表面１ｇ”（Ｂ）およびＩ　
ｇ−（ＴプラスＮ　ｕｌｌ）の個体群に分離した。

Ｔ細胞はＩｇ−個体群を５％の羊の赤血球（Ｍ　ｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ａ　５ｓｏｃｉａＬｅｓ、
　Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ。

ＭＤ）でＥロゼツト化することによって回収した。

ロゼツト化した混合物をフィコール−ハイバック（Ｆ　
１ｃｏｌ　ｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ）上で層状にし、回収
したＥ′″ペレットを０．１５５モルのＮＨ２Ｃｌ（１
０ｍＱ／　ｌ　Ｏ’細胞）で処理した。このようにして
得られたＴ細胞の個体群は、標準法により決定して、く
２％ＥＡＣロゼツト陽性および〉９５％Ｅロゼツト陽性
であった。さらに、非ロゼツトＩｇ−（Ｎｕｌｌ細胞）
個体群をフィコール表面から収穫した。

この後者の個体群はく５％Ｅ＋および≦２％ｓＩｇ＋で
あった。表面Ｉｇ”（Ｂ）個体群は、前述のようにＳ　
ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−２００カラムクロマトグラフ
イーおよび引き続く正常なヒト・ガンマグロブリンによ
る溶離から得られた。この個体群は〉９５％表面１ｇ＋
およびく５％Ｅ＋であった。

正常なヒト大食細胞は、ポリスチレンへの付着により、
単核個体群から得た。こうして、単核細胞を最終培地（
ＲＰＭＩ　ｌ　６４０．２．５ミリモルのＨＥＰＥＳ　
［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロ
パンスルホン酸１緩衝剤、０゜５％の重炭酸ナトリウム
、２００ミリモルのＬ−グリタミン、および１％ペニシ
リン、−ストレプトマイシンからなり、２０％の熱失活
したヒトＡＢ血清を補足した）中に２ＸＩＯ’細胞濃度
で最懸濁し、プラスチックのペトリ皿（ｌＯＯＸ２０ｍ
ｍ）（Ｆａｌｃｏｎ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　　Ｄｉｓｈ；　Ｆａｌｃｏｎ。

Ｏｘｎａｒｄ、　ＣＡ　）中で３７℃において一夜培養
した。よく洗って非付着性細胞を除去した後、２゜５ミ
リモルのＥＤＴＡを含有する冷たい血清不合媒体で強く
洗い、時々使い捨て注射器のプランジャーのゴムの先端
で引っかいて、付着した個体群を脱着した。８５％より
多い細胞個体群は、ラテックス粒子を摂取することがで
き、そしてライトーギエムサ（Ｗ　ｒｉｇｈｔ　−Ｇ　
ｉｅｍｓａ）染色により半球の形態学的特性を有した。

Ｂ、正常な胸腺 正常人の胸腺を２ケ月〜１４才の年令の患者から、心臓
の矯正手術のもとに得た。胸腺の新しく得た部分を媒体
１９９　（Ｇｉｂｃｏ）中の５％胎児の子牛の血清中に
直ちに入れ、鉗子とはさみで小さく切り、引き続いて金
網を通してプレスすることによって単細胞の懸濁液にし
た。細胞を次に前節Ａで説明したうに、フィコール−ハ
イバックで層状にし、回し、洗浄した。このようにして
得られた胸腺細胞は〉９５％生活力があり、そして〉９
０ロゼツト陽性であった。

Ｃ０細胞ライン（Ｃｅｌｌ　　１ｉｎｅｓ）正常な４個
体（ＬａｚＯ０７、Ｌａｚ１５６、Ｌａｚ２５６およ□
びＳＢ）からエプスタイン−パールウィルス（Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ　−Ｂａｒｒ　　Ｖｉｒｕｓ）　　（Ｅ　Ｂ　Ｖ
）変形したＢ細胞ラインを前述のように調製した。

白血病の患者から確立したＴ細胞ラインヘルツ。

ＨＪＤ−１，Ｌａｚｌ　９１、およびＨＭＩは、Ｄｒ。

Ｈ、Ｌ　ａｚａｒｕｓ　（Ｓ　１ｄｎｅｙ　　Ｆ　ａｒ
ｂｅｒ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　
Ｂ　ｏｓｔｏｎ、　Ｍ　Ａ　）により提供された。

上記細胞を調製するｑ当って、確立したリンパ芽球細胞
ラインへのヒトリンパ球の形質転換は、エプスタイン−
バールウィルスの生物学的性質としてよく知られている
。このような細胞の形質転換は、度々文献に記載され、
例えばジェイ・エイチ・ポペ、エム・ケイ・ホーンおよ
びダブリュ・スコツトがインタナショナル・ジャーナル
・オプ・カンサー３号８５７−８６７頁［Ｐｏｐｅ％Ｊ
、　Ｈ，。

Ｍ、　ｋ、　Ｈｏｒｎｅ　　ａｎｄ　　Ｗ、　５ｃｏｔ
ｔ　　ｉｎ　　Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３　；　８５７−８６７、（１
９６８）］における「ヘルペス様ウィルスを含有するヒ
ト白血球細胞ラインから日別したものによる試験管内に
おいてヒト胎児リンパ球の形質転換」　［“Ｔ　ｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｆ　ｅｔａｌ　　Ｈ
ｕｍａｎ　　Ｌ　ｙｎ＋ｐｈｏｃｙｔｅｓＩｎ−Ｖｉｔ
ｒｏ　　Ｂｙ　　Ｆｉｌｔｒａｔｅｓ　　ｏｆ　　ａ　
　Ｈｕｍａｎ　　Ｌｅｕｋｅｎ＋ｉｃ　　Ｃｅ１ｌ　　
Ｌｉｎｅ　　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　　Ｈｅｒｐｅｓ　
−Ｌ　ｉｋａ　　Ｖ　１ｒｕｓ”、　］　という表題の
論文に詳細に説明されている。

Ｌ）細胞 白血病細胞は１２人のＴ−ＡＬＬの患者から得られた。

これらの個体の細胞は、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ、　ｅ１
旦、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
７３　：　１２８８（１９７６）によりすでに記載され
ているように、羊の赤血球との自発ロゼツト形成（〉２
０％Ｅつ、およびＴ細胞特異性異質抗血清、抗ＨＴＬ（
抗−ＢＫ）およびＡ９９との反応性によりＴ細胞結合を
もつとすでに決定された。３個体からの腫腸細胞はウサ
ギおよび／または馬の抗ＴＨ２と反応性（Ｔ　Ｈｚつで
あったが、残る９個体からの細胞は非反応性であった（
　Ｔ　Ｈ！−）。

なお、ここで“ウサギおよび／または馬抗ＴＨ２′は、
特有の機能特性“ＴＨｊ＋”を有する、Ｔ細胞個体群の
特殊なサブセットと結合するウサギまたは馬から誘導さ
れた異種抗血清のことである。このことは下記の文献に
述べられている：イーΦエル・エヌ・ラインヘルツとニ
ス・エフ番シュロスマン［Ｒｅ１ｎｈａｌｚ、　Ｅ　、
　Ｌ　、　Ｎ、、　Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎｎ、　Ｓ、　
Ｆ、　］のＪ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉ　ｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ１２２．１３３５−１３４１　　（１９７９
）。

ＴＨ，−Ｔ−ＣＬＬの２人の患者からの白血病細胞も使
用した。両方の急性および慢性の白血病細胞を１０％の
ジメチルスルホキシドおよび２０％のＡＢヒト血清中の
一１９６℃の蒸気相液体窒素中で、表面特性づけの時間
まで、凍結保存した。

分析した腫腸個体群は、すべての場合においてライトー
ギュムサ（Ｗｒｉｇｈ　−Ｇ　ｉｅｍｓａ）形態学によ
り〉９０％芽細胞であった。

実施例　■ シトフルオログラフ　（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐ
ｈｉｃ）分析スヘての細胞個体群のシトフルオログラフ
分析を、シトフルオログラフ（ＣＢｏｆｌｕｏｒｏｇｒ
ａｆ）　Ｆｃ２００／４８００Ａ　（○ｒｔｈｏ　　Ｉ
　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で蛍光共役した羊の抗マウス
ＩｇＧ（Ｇ／Ｍ　　ＦＩＴＣ）　　（Ｍｅｌｏｙ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて間接免疫蛍光法によ
り実施した。要約すると、１〜２Ｘ１０’細胞をＱ、１
５ｍ１２のＯＫＴ、でｌ：１０００希釈において処理し
、４℃で３０分間培養し、２回洗浄した。次いで細胞を
０．１５ｍ１２のｌ：４０希釈のＧ／Ｍ　　ＦＩＴＣで
４℃において３０分間反応させ、遠心分離し、３回洗浄
しｔ；。次いでこれらの細胞をシトフルオログラフで分
析し、蛍光の強さ／細胞をパルス高さ分析器に記録した
。

同様な反応性のパターンは１：３０，０００の希釈で観
察されたが、これよりさらに希釈すると反応性は失なわ
れた。バックグラウンドの染色は、非生戊性交雑クロー
ンで腹膜的に免疫したＢ　ａｌｂ／　ｃ　Ｊマウスから
の１　：　１０００腹水のＯ，１５ｍｆｆ部分を代わり
に使用することによって得ｔ：。

０ＫＴ４＋細胞および０ＫＴ４−細胞を分離するように
設計した実験において、１００ＸＩＯ’の未分別単核細
胞または胸腺細胞を、４１ｔｌａの１＝１０００希釈（
７）ＯＫＴ４ｆ標識付けし、Ｇ／ＭＦＩＴＣで現像した
。同一の染色アプローチを用いて、前記実施例１ｒＡに
おけるように単離したヒトＴ細胞を調製した。蛍光で活
性化したセルソータ（ＦＡ　ＣＳ　−１）　　（Ｂｅｃ
ｔｏｎ　−Ｄ　１ｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）を用いて、リンパ球を０ＫＴ４”個
体群と０ＫＴ４−個体群とに分離した。後の種類の生活
力はすべての場合においてトリパン（Ｔｒｙｐａｎ）ブ
ルー排除により〉９５％であった。すべての分離した個
体群の純度は≧９５％であった。

実施例　■ ０ＫＴ４＋および０ＫＴ４−細胞をＦＡＣＳ上に分離し
、２０％のヒトＡＢ血清、１％ペニシリン−ストレプト
マイシン、２００ミリモルのし一グルタミン、２５ミリ
モルのＨＥＰＥＳ緩衝剤（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　　Ａ　５ｓｏｃｉａｔｅｓ）および０．５％の重
炭酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ　１６４０　（Ｇｒ
ａｎｄ　　Ｉ　５ｔａｎｄ　　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　　Ｃｏｍｐａｎｙ）中に培養する２　Ｘ　１０　”／
ｍＱの細胞を入れた。５％ａＣＯ２の湿った雰囲気中で
３７℃において２４時間後、ＲｅｉｎｈｅｒｙおよびＳ
　ｃｈｌｏｓｓｍａｎ、　　Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ
ｌ、　　１２２　：１３３５−１３４１　（１９７９）
に記載されているように、各個体群の１〜２ＸＩＯ’の
細胞をエフイン（ｅｑｕｉｎｅ）抗ＴＲＩ、と反応させ
、蛍光共役１ｇＧフラクションのウサギの抗馬１ｇ（Ｃ
ａｐｐｅｌ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄ　ｏ
ｗｉｎｇｔｏｎ、　Ｐ　Ａ　）で染色した。

実施例　■ 機能的研究 Δ工１殖の研究 未分離およびＦＡＣ３分別のリンパ様細胞の有糸応答を
、微量培養において、コンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａ
ｖａｌｉｎ）　Ａ　（Ｃｏｎ　　Ａ）　　（Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈａｍ、　Ｌａ　　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）およびフ
ィトへマグクルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔ
ｉｎｉｎ）　　（Ｐ　ＨＡ　）の最適投与に対して試験
した（　Ｂ　ｕｒｒｏｕｇｈｏ　−Ｗａｌｌｃｏｍｅ　
　Ｃ。

ｍｐａｎｙ、　Ｇｒｅｅｖｉｌｌｅ、　ＮＧ）　６異種
抗原増殖応答を、これらの同じ個体群について、マイト
マイシン処理Ｌａｚ１５６、刺激としてＤｒ、　Ｈ，Ｌ
ａｚａｒＵＳから得られたＥＢＶ変形したヒトＢリンパ
芽球様細胞ラインを用いて、同時に測定した。破傷風ト
キソイド（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　　Ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎｔ　　ｏｆＰ　ｕｂｌｉｃ　　Ｈｅａｌｔｈ　
　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　Ｂ　ｏｓｔｏｎ、　Ｍ　Ａ　）に対する増殖を
、ｌｏμｇ／ｍＱの最終濃度を用いて試験した。Ｈｅｒ
ｐｅｓ　−Ｚ　ｏｓｔｅｒ抗原は、Ｄ　ｒ、　　Ｊ　ｏ
ｈｎ　　Ｚ　ａｉａ　（Ｈａｒｗａｒｄ　　Ｍ　ｅｄｉ
ｃａｔ　　Ｓ　ｃｈｏｏｌ、　Ｂ　ｏｓｔ、　Ｍ　Ａ　
）から入手し、ｌ二〇希釈度に希釈した。上に記載され
る方法で得られｊ；５％の大食細胞を、すべての個体群
に試験管内培養の開始時に加えた。糸状体（ｍｉｔｏｇ
ｅｎ）刺激された培養を４日後０．２μＣｉの３Ｈ−チ
ミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）（１，９Ｃｉ／ミリモルの比活
性）（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｍａｎｎ　　Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ　　ｏｆ　　Ｂｅｃｋｏｎ。

Ｄ　１ｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ、　Ｎ
　Ｙ　）でパルスし、１８時間後ＭＡＳＨＩ［装置（Ｍ
　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡ　５ｓｏｃｉａｔｅ
ｓ）で収穫した。３Ｈ−ＴｄＲの結合をパラカード・シ
ンチレーション・カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ　　Ｉ　
ｎｓＬｒｕｍｅｎｔ　　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｄ　ｏｗｎ
ｅｒ’　ｓ　　Ｇｒｏｖｅ、　　Ｉ　Ｌ）で測定した。

可溶性抗原および異種抗原刺激培養物を、５日後、前述
のように、３Ｈ，−ＴｄＲで１８時間パルスし、収穫し
、計数した。

Ｂ、細胞毒性の研究 細胞性リンパ崩壊（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　　Ｉ
ｙｍｐｈｏｌｙｓｉｓ）　　（ＣＭＬ）のための増感培
養を、多マイクロタイタープレートウェル中にすべて２
Ｘ１０″／ｍＱの細胞において、分別しないＴ細胞、Ｆ
ＡＣ８分離０ＫＴ４ゝおよび０ＫＴ４−のＴ細胞の部分
集合、または異なる比のマイトマイシン処理した刺激体
細胞と再結合した０ＫＴ４＋および０ＫＴ４−のＴ細胞
を入れることによって確立した。５日の終りにおいて、
生育していない細胞をフィコール−ハイバック（Ｆ　１
ｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ）遠心分離により除去した
。次いで分別しないＴ細胞の個体群と分別したＴ細胞の
個体群を”Ｃｒクロム酸ナリトウムでラベルしたターゲ
ット（ｔａｒｇｅｔ）細胞に加え、そして６時間の細胞
培養径比クロム放出を決定した。他の実験において、未
分別のＴ細胞を前述のようにマイトマインン旭理した刺
激体細胞で増感し、次いでＭＬＣ中で５口径ＦＡＣ３上
で０ＫＴ４＋および０ＫＴ４−のＴ細胞の部分集合に分
別し、そして比クロム放出を決定した。次の式を用いて
細胞毒性を決定した： すべての試料は３回反復実験し、結果を平均で表わした
。自発的な放出はすべての場合において最大の崩壊（１
ｙｓｉｓ）の２０％より小であった。

ハイブリドマの生成、および生ずるモノクローナル抗体
の生成および特性づけは、上の実施例におけるように実
施した。大量の主題の抗体を、主題のハイブリドマのマ
ウスへの腹膜内注射および悪性腹水の収穫により調製し
たが、ハイブリドマは試験管内でこの分野においてよく
知られた技術により培養し、抗体を上澄液から取り出す
ことができることは、明らかに考えられる。

主題のハイブリドマの試料は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ
　　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、　２
０８５２）に１９７９年４月２６日に寄託され、ＡＴＣ
Ｃ番号ＣＲＬ８００２が付された。

第１図に示すように、一定の正常な個体のヒト抹消血液
Ｔ細胞の個体群のほぼ４５％は０ＫＴ４と反応性である
が、これに対して同じ個体から単離された全Ｂ細胞、無
特徴細胞および大食細胞の個体群は０ＫＴ４と非反応性
である。他の正常な１５個体からのリンパ球の個体群に
ついて同様な結果が得られた。こうしてモノクローナル
抗体は、正常なヒト抹消Ｔ細胞のほぼ５５％の表面上に
含有される抗原と反応性であるが、前述の３つの細胞の
型の表面上の抗原と非反応性であると、特性づけられる
。後述するように、ヒト抹消Ｔ細胞の個体群の０ＫＴ４
＋部分はヘルパーＴ細胞の亜群である。この特異の反応
性は、主題の抗体○ＫＴ４を検出でき、そして他の抗体
と区別できる１つの試験である。

第２図に示すように、６力月の乳児からの正常なヒト胸
腺細胞の約８０％は０ＫＴ４と反応性である。２力月〜
１９才の年令の正常な個体からの６つの追加の胸腺の試
料を用いて、同様な結果（約８０％の反応性）が得られ
た。第２図における反応性のパターンは、主題の抗体０
ＫＴ４を検出し、それを他の抗体と区別する第２の方法
を提供する。

第３図に示すように、主題の抗体はＢ細胞慢性リンパ芽
球性白血病からの白血球細胞と非反応性である。

主題の抗体０ＫＴ４のほかの特徴づけは、第４および５
図に図解される種々のヒトＴ細胞ラインに対する反応に
よって示される。この図かられかるように、主題の抗原
のヒトＴ細胞ラインに対する反応性は不均質であり、ラ
インＯＥＭについて強く、ラインＨＤＪ−１について不
存在である。

また細胞ラインＬａｚ１９１およびＨＭＩとの反応性は
存在しない。この０ＫＴ４の種々の入手容易なヒトＴ細
胞ラインに対する特異の反応性は、主題の抗体を特徴づ
けかつ説明するなお他の方法を提供する。

第６図は、０ＫＴ４の分離した部分集合（５ｕｂｓｅｔ
ｓ）の抗ＴＨ，との反応性を示す。分別しないＴ細胞個
体群の約２５％は抗ＴＨ２と反応性である。

これと対照的に、０ＫＴ４＋個体群は抗ＴＨ２と反応性
の細胞を含有しないが、０ＫＴ４−の固体群は主として
ＴＨ２”であり、そして分別しないＴ細胞個体群中に見
いだされるすべてのＴＨ２＋細胞を含有する。このこと
が示すように、ＴＨ２”および○ＫＴ４＋の部分集合は
相反であり、互いに区別される。

第７図は、分別しないＴ細胞、○ＫＴ４”Ｔ細胞および
０ＫＴ４−Ｔ細胞の細胞毒性能力を図解したものである
。○ＫＴ４＋固体群はほんのわずかに毒性であるが、０
ＫＴ４−固体群により仲介される毒性は分別しないＴｍ
胞の固体群よりも大きい。第６図と第７図に示された０
ＫＴ４＋および０ＫＴ４−のＴ細胞の固体群の特異的反
応性は、主題の抗体を特性づける手段をさらに提供する
ものである。

第１〜５図に図解される結果は要約であり、下表Ｉの追
加のデータで補足する。この表はＯＫＴ■　（バイブリ
ド？ＡＴＣＣＮ０．ＣＡＬ　８００）、０ＫＴ３　　（
ハイブリドマＡＴＣＣＮｏ、８００１）および０ＫＴ４
　（最後は本願の主題である）と標示されるハイブリド
マにより生成されたモノクローナル抗体を比較するもの
である。第１〜５図中のデータに加えて、表Ｉはまたは
０ＫＴ４は正常のヒト末梢Ｂ細胞、無特徴（ｎｕｌｌ）
細胞および大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）　、なら
びにＴ細胞および無特徴細胞急性リンパ芽球性白血病患
者からの白息　　　　“病細胞およびＥＢＶ変形Ｂ細胞
のラインと非反応性であることを明らかにする。０ＫＴ
Ｉと対照的に、０ＫＴ４はＴ細胞慢性リンパ芽球白血病
患者からの白血病細胞と反応しない。

機能的研究を、蛍光活性化細胞セパレータ＝（ＦＡＣＳ
）で分離したリンパ様固体群について実施した。これら
の研究の結果は下表■〜■に示されており、そしてさら
に主題のモノクローナル抗体の前述の特徴づけを裏書き
する。

これらの研究において、分別しないＴ細胞個体群を１　
：　１０００希釈の０ＫＴ４およびＧ／ＭＦＩＴＣで処
理し、０ＫＴ４＋および０ＫＴ４−の部分集合において
ＦＡＣＳで分離した。得られた個体群の純度（９５％以
上）がわかったとき、５％の大食細胞を試験管内培養前
に分離した個体群に加えた。次いで分別しないＴ細胞の
個体群および単離した０ＫＴ４＋および０ＫＴ４−のＴ
細胞の部分集合をＰＨＡ、ＣｏｎＡ、可溶性抗原、およ
び異常抗原で刺激してそれらの試験管内の増殖の応答を
評価した。

分別しないＴ細胞個体群のＰＨＡおよびＣｏｎＡに対す
る増殖の応答を表■に示す。分別しないＴ細胞個体群に
よる最大の増殖応答は、１μｇ／　１０６細胞のＰＨＡ
を用いて得られ、減少した応答は０．５μｇおよび０．
１μｇ／　１０　’細胞において生ずる。分別しないＴ
細胞を０ＫＴ４およびヤギ−マウスＦＩＴＣで処理し、
引き続いて分別しないと、増殖応答は変化しなかった。

対照的に、ＰＨＡに対する応答の差は分離した０ＫＴ４
＋および０ＫＴ４−のＴ細胞の部分集合を用いて得られ
た。

細胞の０ＫＴ４”個体群はＰＨＡのすべての投与量に対
して分離しないＴ細胞個体群と同様な方法で応答した。

しかしながら、０ＫＴ４−細胞の増殖応答は試験したＰ
ＨＡのすべての投与量において有意に少ない。さらに、
０．１μｇ／　Ｉ　Ｏ’細胞のＰＨＡの投与量において
、０ＫＴ４−のＴ細胞はまったく増殖しないが、０ＫＴ
４＋細胞の部分集合および分別しない細胞はなお応答性
であった。

これらの部分集合のＣｏｎＡへの増殖応答は、他方にお
いて、同様であったが、２つの部分群の細胞は互いにま
たは分別しないＴ細胞個体群と区別されえなかった。異
常抗原に対するＭＬＣにおける応答および可溶性抗原に
対する応答を次に検査した。表■に示すように、０ＫＴ
４およびＧ／ＭＦＩＴＣで処理した分別しないＴ細胞個
体群、両方の０ＫＴ４＋および０ＫＴ４−のＴ細胞サブ
セットは同様な方法でＭＬＣにおいてＬａｚ１５６に対
して応答性であった。しかしながら、６の個体のうちの
２からの０ＫＴ４−細胞を試験し、ＭＬＣにおいて有意
に増殖したが、それらの応答性０ＫＴ４一部分集合より
も少ない’Ｈ−ＴｄＲを組込んだことに注意すべきであ
る（データは示されていない）。これと対照的に、可溶
性抗原への増殖応答は部分集合間の明確な区別を提供し
た。試験しｌ；すべての例において、０ＫＴ４＋のＴｍ
胞は可溶性抗原、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ　
　ｔｏｘｏｉｄ）および帯庖疹（Ｈｅｒｐｅｓ　−Ｚ　
ｏｓＬｅｒ）に対してよく増殖したが、ＯＫＴ、−のＴ
細胞部分集合は実際上非応答性であった。

表■は、Ｔ細胞の０ＫＴ４一部分集合は、ＭＬＣにおい
て単独で増感したとき、あったとして、細胞崩壊を多く
発生できないことを示す。こうして、ＯＫ　Ｔ　４−Ｔ
細胞は分別しない異常増感したＴ細胞個体群中で細胞毒
性／奏効体となったが、それ自体ではそのＭＩＣにおけ
る応答にかかわらずＣＭＬを仲介することを誘発されえ
なかった。

その上、０ＫＴ４＋個体群をＭＩＣにおいてＯＫＴ　４
−Ｔ細胞の不存在で増感するとき、それらは中程度であ
るが、有意の、ＭＩＣにおける崩壊を仲介できた。しか
しながら、○ＫＴ４＋および０ＫＴ４−のＴ細胞の再結
合した混合物は、分離したＴ細胞個体群のそれに似ず、
最高の細胞崩壊を行った。これらの発見は、０ＫＴ４一
部分集合は最高の細胞毒性の応答のみを行うことができ
ないが、０ＫＴ４“個体群からの助けを要求する。この
Ｔ−Ｔ相互作用は、最高の細胞毒性の発生においてＴ　
Ｈ２−’ｒ細胞部分集合群によってＴＨ２＋Ｔ細胞部分
集合へ提供されたＴ細胞の助けに類似する。

本発明によれば、本質的にすべての正常なヒトのヘルパ
ーＴ細胞上に見い出される抗原に対する抗体を生成でき
るハイブリドマ、このハイブリドマを生成する方法、本
質的にすべてのヒトＴ細胞上に見い出される抗原に対す
るモノクローナル抗体、この抗体を生成する方法、およ
びこの抗体を用いる病気の処置または診断の方法および
組成物が提供される。

ヒトのヘルパーＴ細胞の抗原に対する単一の単分校系抗
体を生成する単一のハイブリドマだけを説明してきたが
、本発明はここに説明する特性を示すすべてのモノクロ
ーナル抗体を包含すると考えられる。主題の抗体０ＫＴ
４はねずみのＩｇＧの４つのサブクラスの１つであるサ
ブクラス！ｇＧ、に属することが決定された。免疫グロ
ブリンＧのこれらのサブクラスは互いにいわゆる「固定
された」領域において異なるが、特定の抗原に対する抗
体はいわゆる「可変の」領域をもち、この領域は免疫グ
ロブリンＧのどのサブクラスがそれに属するかに無関係
に機能的に同一である。すなわち、ここに説明した特性
を示すモノクローナル抗体はサブクラスＩｇＧ、、Ｉ　
ｇＧ　、ａ、　　Ｉ　ｇＧ　、ｂ、またはｘｇａｓ、あ
るいはクラスＩｇＭ、ＩｇＡ、あるいは他の既知のクラ
スＩｇであることができる。

これのクラスまたはサブクラスの間の差異は抗体の反応
パターンの選択性に影響を及ぼさないが、抗体と他の物
質、たとえば、相補的抗体または抗マウス抗体とのほか
の反応に影響を及ぼすことがあるであろう。主題の抗体
はＩｇＧ、に特定したが、ユニに例示した反応性のパタ
ーンを有する抗体類はそれらが属する免疫グロブリンの
クラスまたはサブクラスに無関係に本発明の範囲内に包
含されると考えられる。

さらに、本発明の範囲内に、ここに例示しｔ；ハイブリ
ドマの技術を用いて前述のモノクローナル抗体を生成す
る方法が包含される。ハイブリドマのただ１つの例をこ
こに記載したが、当業者はここに提供した免疫法、融合
法および選択法に従い、ここに説明した反応性の特性を
有する抗体類を生成しうる他のハイブリドマ類を得るこ
とができると考えられる。マウスの既知の種からの既知
の骨髄腫細胞系統から生成した個々のハイブリドマはこ
のハイブドマにより生成された抗体を参照する以外それ
以上同定できないので、前述の反応性の特性を有する抗
体を生成するすべてのハイブリドマ類は本発明の範囲内
に包含され、これらのハイブリドマを用いるこの抗体を
つくる方法も同様に包含されると、考えられる。

本発明のほかの面は、モノクローナル抗体ＯＫＴ４また
はここに明らかにした反応性のパターンを示す他のモノ
クローナル抗体を用いて病気を処理または診断する方法
である。主題の抗体を使用して、個体からのＴ細胞の組
成物と０ＫＴ４抗体との反応によって、を■の後天性無
ガンマグロブリン血症を検知できる。ヘルパーＴｍ胞の
不存在または不足は、０ＫＴ４と反応する合計の末梢Ｔ
細胞個体群の５５％より少量の存在によって示される。

また、この試験を使用して一般にヘルパーＴ細胞の不足
または過剰を検知できる。ヘルパーＴ細胞のガンの処置
は、治療的に有効量の０ＫＴ４抗体をこのような処置を
必要とする個体に投与することによって達成できる。ヘ
ルパーＴ細胞の抗原との選択的反応より、有効量の０Ｋ
Ｔ４抗体は過剰のヘルパーＴｍ胞を減少し、こうしてヘ
ルパーＴ細胞の悪性を軽減する。ヘルパーＴ細胞の過剰
によって起こる自己免疫の病気を、治療的に有効量の０
ＫＴ４抗体をこのような処置の必要な個体に投与するこ
とによって処置することもできる。有効量の０ＫＴ４抗
体を、それぞれ、診断学的にまたは製薬学的に許容でき
る担体として、含有する診断組成物および治療組成物も
本発明の範囲内である。

火　　　　　　　　　　　　　驚 シに−

【図面の簡単な説明】

第１図は、正常のヒトの末梢Ｔ細胞をｌ：１０００の希
釈で０ＫＴ４および６７Ｍ　　ＦＩＴＣと反応させた後
、シトフルオログラフで得た蛍光パターンを示す。比較
のため、モノクローナル抗・体０ＫＴＩおよび０ＫＴ３
を用いた結果を第１〜５図におけるのと同等の条件下で
示す。 第２図は、ヒト胸腺細胞を０ＫＴ４＃よび６７Ｍ　　Ｆ
ＩＴＣと反応させた後、シトフルオログラフで得られた
蛍光パターンを示す。 第３図は、Ｂ細胞の慢性リンパ芽球性白血病患者からの
白血病細胞を０ＫＴ４および６７Ｍ　　ＦＩＴＣと反応
させた後、シトフルオログラフで得た蛍光パターンであ
る。 第４図は、ヒトＴ細胞ラインＨＪＤ−１を０ＫＴ４およ
び６７Ｍ　　ＦＩＴＣと反応させた後、シトフルオログ
ラフで得た蛍光パターンを示す。 第５図は、ヒトＴ細胞ラインＣＥＭを０ＫＴ４および６
７Ｍ　　ＦＩＴＣと反応させた後、シトフルオログラフ
で得た蛍光パターンを示す。 第６図は、Ｔ細胞の個体群をエフイン抗ＴＨ。 血清と反応させた結果を示す。 第７図は、分別しないＴ細胞およびＴ細胞の部分集合の
細胞毒性能力を示す。比崩解（ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙｓ
ｉｃ）百分率は縦座標で示し、そして奏効体（ｅｆｆｅ
ｃｔｏｒ）　／ターゲット（Ｅ／Ｔ）比は横座標で示す
。 ２安９μ Ｕ− 手続補正書（方式） 昭和６３年１１月２１日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１０１４９７号 ２、発明の名称 ＩｇＧモノクローナル抗体−生産性ハイブリドマ３、補
正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　　オーツ・ファーマシューチカル・コーポレーシ
ョン ４、代理人　〒１０７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトＴ細胞で前もって免疫されたマウスから脾細胞
   とマウスの骨髄腫ラインからの細胞との融合により形成
   されたＩｇＧモノクローナル抗体−生産性ハイブリドマ
   であつて、該抗体が： ａ）本質的にすべての正常なヒト末梢ヘルパーＴ細胞（
   すべての正常なヒト末梢Ｔ細胞の約５５％である）と反
   応するが、正常なヒト末梢Ｂ細胞、無特徴細胞または大
   食細胞とは反応せず、 ｂ）正常ヒト胸腺細胞の約８０％と反応し、ｃ）Ｔ細胞
   慢性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ芽球性白血
   病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、または無特徴細胞
   急性リンパ芽球性白血病をもつヒトからの白血病細胞と
   反応せず、ｄ）Ｒｈｅｓｕｓサル末梢Ｔ細胞の約５５％
   と反応し、ｅ）補体を固定し、そして ｆ）抗−ＴＨ＿２血清と非反応性であり且つほんのわず
   かに細胞毒性であるＴ細胞個体群（ＯＫＴ４＾＋）を定
   める、 ことを特徴とする前記モノクローナル抗体−生産性ハイ
   ブリドマ。 ２、それによって生成する抗体がサブクラスＩｇＧ＿２
   である特許請求の範囲第１項記載のハイブリドマ。 ３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕｌ骨髄腫細胞とＥロゼット精製
   したヒトＴ細胞で前もって免疫したＣＡＦ＿１マウスか
   らの脾細胞との融合により形成された特許請求の範囲第
   １項記載のハイブリドマ。 ４、ＯＫＴ４の同定特性を有する特許請求の範囲第１項
   記載のハイブリドマ。