JPH04281799A - 体外免疫方法 - Google Patents
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- JPH04281799A JPH04281799A JP3069273A JP6927391A JPH04281799A JP H04281799 A JPH04281799 A JP H04281799A JP 3069273 A JP3069273 A JP 3069273A JP 6927391 A JP6927391 A JP 6927391A JP H04281799 A JPH04281799 A JP H04281799A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リンパ球を抗原で特異
的に効率よく免疫する体外免疫方法及びその培養系を利
用した免疫活性測定方法に関する。
的に効率よく免疫する体外免疫方法及びその培養系を利
用した免疫活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９７５年にＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓ
ｔｅｉｎはマウスを用い、モノクローナル抗体産生株化
細胞が得られることを明らかにした（Ｎａｔｕｒｅ （
１９７５） ２５６； ４９５−４９７参照）。 その後、多くの抗原に対してマウスのモノクローナル抗
体が作成されてきた。また、今日多数のマウスのモノク
ローナル抗体が診断（体外診断、血清診断等）を目的と
し、実用化されてきている。
ｔｅｉｎはマウスを用い、モノクローナル抗体産生株化
細胞が得られることを明らかにした（Ｎａｔｕｒｅ （
１９７５） ２５６； ４９５−４９７参照）。 その後、多くの抗原に対してマウスのモノクローナル抗
体が作成されてきた。また、今日多数のマウスのモノク
ローナル抗体が診断（体外診断、血清診断等）を目的と
し、実用化されてきている。
【０００３】一方、これらの抗体を治療の目的で使用す
る方法が予想されているにも関わらず、実際には治療を
目的としたモノクローナル抗体は実用化されていない。 この理由としては、人の体内に投与するにはヒト型のモ
ノクローナル抗体が望ましいが、ヒト型のモノクローナ
ル抗体を得ることが非常に困難であること、また、ヒト
型モノクローナル抗体を得る際に必要な、免疫されたヒ
トリンパ球を得ることが非常に困難であることによる。 特に倫理上の問題から、目的とする抗原によって免疫さ
れたリンパ球を得るために、その抗原を患者もしくはボ
ランティアなどに投与することができないからである。
る方法が予想されているにも関わらず、実際には治療を
目的としたモノクローナル抗体は実用化されていない。 この理由としては、人の体内に投与するにはヒト型のモ
ノクローナル抗体が望ましいが、ヒト型のモノクローナ
ル抗体を得ることが非常に困難であること、また、ヒト
型モノクローナル抗体を得る際に必要な、免疫されたヒ
トリンパ球を得ることが非常に困難であることによる。 特に倫理上の問題から、目的とする抗原によって免疫さ
れたリンパ球を得るために、その抗原を患者もしくはボ
ランティアなどに投与することができないからである。
【０００４】このため、リンパ球を体外に取り出した後
に免疫を行う体外免疫法が研究されるようになってきた
。この体外免疫法に関しても、いくつかの報告がなされ
ているが（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３５；
３８３１−３８３８、 Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ； Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）， ｐｐ
．７１−９１）、必ずしも成功を納めているものではな
い。
に免疫を行う体外免疫法が研究されるようになってきた
。この体外免疫法に関しても、いくつかの報告がなされ
ているが（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３５；
３８３１−３８３８、 Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ； Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）， ｐｐ
．７１−９１）、必ずしも成功を納めているものではな
い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術に鑑み、リンパ球を抗原で特異的に効率よく免疫する
体外免疫方法を確立すること、更にこのリンパ球を用い
て抗原特異的モノクローナル抗体を得ること、及び簡便
な免疫活性測定方法を提供することを目的としてなされ
たものである。
術に鑑み、リンパ球を抗原で特異的に効率よく免疫する
体外免疫方法を確立すること、更にこのリンパ球を用い
て抗原特異的モノクローナル抗体を得ること、及び簡便
な免疫活性測定方法を提供することを目的としてなされ
たものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意研究した結果、アジュバンド物質及
びリンホカインを含み、ポリクローナル活性化物質を含
まない培養液中で、リンパ球を抗原で特異的に効率よく
免疫できることを見出し、本発明を完成するに至った。
を達成するため鋭意研究した結果、アジュバンド物質及
びリンホカインを含み、ポリクローナル活性化物質を含
まない培養液中で、リンパ球を抗原で特異的に効率よく
免疫できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明の体外免疫方法の１つは
、アジュバンド物質及びリンホカインを含み、ポリクロ
ーナル活性化物質を含まない培養液中にて、リンパ球を
抗原で特異的に免疫することを特徴とする。
、アジュバンド物質及びリンホカインを含み、ポリクロ
ーナル活性化物質を含まない培養液中にて、リンパ球を
抗原で特異的に免疫することを特徴とする。
【０００８】また、本発明の体外免疫方法のもう１つは
、アジュバンド物質及びリンホカインを含み、ポリクロ
ーナル活性化物質を含まない培養液中にて、リンパ球を
抗原で特異的に免疫し、かつ、不滅化させることを特徴
とする。
、アジュバンド物質及びリンホカインを含み、ポリクロ
ーナル活性化物質を含まない培養液中にて、リンパ球を
抗原で特異的に免疫し、かつ、不滅化させることを特徴
とする。
【０００９】更に、本発明の免疫活性測定方法は、アジ
ュバンド物質とリンホカインと抗原とを含み、かつ、被
試験物を添加した培養液中でリンパ球を培養し、免疫活
性を測定することを特徴とする。
ュバンド物質とリンホカインと抗原とを含み、かつ、被
試験物を添加した培養液中でリンパ球を培養し、免疫活
性を測定することを特徴とする。
【００１０】以下、本発明について具体例を挙げて更に
詳細に説明する。本発明において、抗原としては、株化
された癌細胞又は不溶化された可溶性抗原が好ましく使
用される。例えば予め２４ウェルプレート上で培養して
おいた癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原が用いられる。
詳細に説明する。本発明において、抗原としては、株化
された癌細胞又は不溶化された可溶性抗原が好ましく使
用される。例えば予め２４ウェルプレート上で培養して
おいた癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原が用いられる。
【００１１】アジュバンド物質としては、ムラミルジペ
プチド（ｍｕｒａｍｙｌ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）又はＯ
Ｋ−４３２（中外製薬株式会社製、商品名「ピシバニー
ル」）が好ましく用いられる。ムラミルジペプチドを用
いる場合、培養液中の最終濃度は０．１ 〜１０００μ
ｇ／ｍｌとすることが好ましく、０．５ 〜５０μｇ／
ｍｌとすることが更に好ましい。ＯＫ−４３２を用いる
場合、培養液中の最終濃度は２５〜２５０００ ｎｇ／
ｍｌ とすることが好ましく、５０〜１００００ ｎｇ
／ｍｌ とすることが更に好ましい。
プチド（ｍｕｒａｍｙｌ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）又はＯ
Ｋ−４３２（中外製薬株式会社製、商品名「ピシバニー
ル」）が好ましく用いられる。ムラミルジペプチドを用
いる場合、培養液中の最終濃度は０．１ 〜１０００μ
ｇ／ｍｌとすることが好ましく、０．５ 〜５０μｇ／
ｍｌとすることが更に好ましい。ＯＫ−４３２を用いる
場合、培養液中の最終濃度は２５〜２５０００ ｎｇ／
ｍｌ とすることが好ましく、５０〜１００００ ｎｇ
／ｍｌ とすることが更に好ましい。
【００１２】リンホカインとしては、インターロイキン
２、インターロイキン６よりなる群から選ばれた少なく
とも一種が好ましく用いられる。インターロイキン２は
、好ましくは１〜１０００Ｕ／ｍｌ 、更に好ましくは
２〜５００ Ｕ／ｍｌ で用いる。インターロイキン６
は、好ましくは１〜１０００Ｕ／ｍｌ 、更に好ましく
は２〜５００ Ｕ／ｍｌ で用いる。なお、インターロ
イキン２とインターロイキン６とを併用することにより
、免疫効率を更に高めることができる。
２、インターロイキン６よりなる群から選ばれた少なく
とも一種が好ましく用いられる。インターロイキン２は
、好ましくは１〜１０００Ｕ／ｍｌ 、更に好ましくは
２〜５００ Ｕ／ｍｌ で用いる。インターロイキン６
は、好ましくは１〜１０００Ｕ／ｍｌ 、更に好ましく
は２〜５００ Ｕ／ｍｌ で用いる。なお、インターロ
イキン２とインターロイキン６とを併用することにより
、免疫効率を更に高めることができる。
【００１３】培養液としては、例えばダルベッコＭＥＭ
（ＤＭＥＭ）培地、ハム−Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １
６４０培地、ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭ
ＥＭ及びハム−Ｆ１２培地を２：１：１で混合した培地
）、ＥＲＤＦ培地（ＲＤＦ培地のアミノ酸及びビタミン
を強化した培地）等が用いられるが、好ましくはＲＤＦ
あるいはＥＲＤＦ培地が用いられる。
（ＤＭＥＭ）培地、ハム−Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １
６４０培地、ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭ
ＥＭ及びハム−Ｆ１２培地を２：１：１で混合した培地
）、ＥＲＤＦ培地（ＲＤＦ培地のアミノ酸及びビタミン
を強化した培地）等が用いられるが、好ましくはＲＤＦ
あるいはＥＲＤＦ培地が用いられる。
【００１４】リンパ球としては、例えば末梢血、手術の
際に得られるリンパ節もしくは脾臓から得られるものを
用いることができる。本発明の方法では、どの組織由来
のリンパ球を用いても体外免疫を行なうことができる。
際に得られるリンパ節もしくは脾臓から得られるものを
用いることができる。本発明の方法では、どの組織由来
のリンパ球を用いても体外免疫を行なうことができる。
【００１５】また、従来の体外免疫方法で通常用いられ
ているポリクローナル活性化物質、例えば内毒素（エン
ドトキシン）、レクチン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、ＣｏｎＡ）
、デキストラン硫酸等を含んだ培地中でリンパ球を培養
した場合には、体外免疫の効率が低下することがわかっ
た。したがって、本発明の体外免疫方法では、ポリクロ
ーナル活性化物質を含まない培地を用いることが必要で
ある。
ているポリクローナル活性化物質、例えば内毒素（エン
ドトキシン）、レクチン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、ＣｏｎＡ）
、デキストラン硫酸等を含んだ培地中でリンパ球を培養
した場合には、体外免疫の効率が低下することがわかっ
た。したがって、本発明の体外免疫方法では、ポリクロ
ーナル活性化物質を含まない培地を用いることが必要で
ある。
【００１６】培養方法は、予め培養しておいた免疫原と
しての癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原を用意し、これにアジ
ュバンド物質及びリンホカインを含む培養液中に懸濁し
たリンパ球を添加し、４〜１０日間程度培養すればよい
。
しての癌細胞株、もしくはラテックス粒子などに吸着さ
せて不溶化した状態の可溶性抗原を用意し、これにアジ
ュバンド物質及びリンホカインを含む培養液中に懸濁し
たリンパ球を添加し、４〜１０日間程度培養すればよい
。
【００１７】こうしてリンパ球を培養した後、リンパ球
を回収し、必要ならばリンパ系株化細胞と融合するか、
もしくはエプスタイン−バーウィルス感染させることに
よって不滅化することができる。この操作によって、抗
原特異的モノクローナル抗体を生産する細胞株を得るこ
とができ、モノクローナル抗体の持続的な生産が可能と
なる。
を回収し、必要ならばリンパ系株化細胞と融合するか、
もしくはエプスタイン−バーウィルス感染させることに
よって不滅化することができる。この操作によって、抗
原特異的モノクローナル抗体を生産する細胞株を得るこ
とができ、モノクローナル抗体の持続的な生産が可能と
なる。
【００１８】ヒト型リンパ球を用いた場合、ヒト型モノ
クローナル抗体を生産する細胞株、或はヒト型モノクロ
ーナル抗体が得られるが、他の動物のリンパ球を用いる
と、使用した動物の型のモノクローナル抗体生産細胞株
、或はその動物の型のモノクローナル抗体が得られる。
クローナル抗体を生産する細胞株、或はヒト型モノクロ
ーナル抗体が得られるが、他の動物のリンパ球を用いる
と、使用した動物の型のモノクローナル抗体生産細胞株
、或はその動物の型のモノクローナル抗体が得られる。
【００１９】一方、本発明の免疫活性測定方法は、アジ
ュバンド物質とリンホカインと抗原とを含み、かつ、被
試験物を添加した培養液中でリンパ球を培養し、免疫活
性を測定する方法である。免疫活性の測定は、後述する
方法により、抗原特異的免疫グロブリンを生産するリン
パ球数を間接的に調べることによって行なうことができ
る。そして、被試験物を添加しないで培養したものと、
被試験物を添加して培養したものとを比較し、どちらが
免疫活性が高いかを調べることにより、被試験物の免疫
に及ぼす影響を調べることができる。
ュバンド物質とリンホカインと抗原とを含み、かつ、被
試験物を添加した培養液中でリンパ球を培養し、免疫活
性を測定する方法である。免疫活性の測定は、後述する
方法により、抗原特異的免疫グロブリンを生産するリン
パ球数を間接的に調べることによって行なうことができ
る。そして、被試験物を添加しないで培養したものと、
被試験物を添加して培養したものとを比較し、どちらが
免疫活性が高いかを調べることにより、被試験物の免疫
に及ぼす影響を調べることができる。
【００２０】
【作用】本発明の体外免疫方法では、アジュバンド物質
及びリンホカインを含み、ポリクローナル活性化物質を
含まない培養液中で、リンパ球を抗原と作用させること
により、リンパ球を特異的に効率よく免疫できる。アジ
ュバンド物質とリンホカインを共に添加した場合に、免
疫効率は最も高くなり、ポリクローナル活性化物質を添
加すると、免疫効率は低下する。
及びリンホカインを含み、ポリクローナル活性化物質を
含まない培養液中で、リンパ球を抗原と作用させること
により、リンパ球を特異的に効率よく免疫できる。アジ
ュバンド物質とリンホカインを共に添加した場合に、免
疫効率は最も高くなり、ポリクローナル活性化物質を添
加すると、免疫効率は低下する。
【００２１】また、免疫された抗原特異的リンパ球を、
リンパ系株化細胞と融合させるか、又はエプスタイン−
バーウィルス感染させることにより不滅化すれば、抗原
特異的モノクローナル抗体を効率よく生産することがで
きる。
リンパ系株化細胞と融合させるか、又はエプスタイン−
バーウィルス感染させることにより不滅化すれば、抗原
特異的モノクローナル抗体を効率よく生産することがで
きる。
【００２２】更に、アジュバンド物質とリンホカインと
抗原とを含み、かつ、被試験物を添加した培養液中でリ
ンパ球を培養し、免疫活性を測定することにより、各種
物質の免疫に対する影響を調べることができる。
抗原とを含み、かつ、被試験物を添加した培養液中でリ
ンパ球を培養し、免疫活性を測定することにより、各種
物質の免疫に対する影響を調べることができる。
【００２３】
【実施例】実施例１
（１） 特定抗原に対するリンパ球の体外免疫Ａ５４９
細胞（ヒト肺線癌細胞株、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）
を、１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含有するＥＲＤＦ培
地に、 １×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸
濁し、２４ウェルプレートに１ｍｌ ずつ分注して、３
６時間、３７℃で培養した。
細胞（ヒト肺線癌細胞株、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）
を、１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含有するＥＲＤＦ培
地に、 １×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸
濁し、２４ウェルプレートに１ｍｌ ずつ分注して、３
６時間、３７℃で培養した。
【００２４】一方、健康な人の末梢血からフィコール（
ファルマシア社製）によりリンパ球を分離し、ＥＲＤＦ
培地で４回洗浄した。その後、リンパ球密度を２×１０
６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、予めＡ５４９細胞の培
養を行っていた上記２４ウェルプレートに０．５ｍｌ／
ｗｅｌｌ添加した。
ファルマシア社製）によりリンパ球を分離し、ＥＲＤＦ
培地で４回洗浄した。その後、リンパ球密度を２×１０
６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、予めＡ５４９細胞の培
養を行っていた上記２４ウェルプレートに０．５ｍｌ／
ｗｅｌｌ添加した。
【００２５】このとき、ＯＫ−４３２、ムラミルジペプ
チド（以下、ＭＤＰとする）、インターロイキン２（ゼ
ンザイム社製）（以下、ＩＬ−２とする）、インターロ
イキン６（ゼンザイム社製）（以下、ＩＬ−６とする）
を、培養液中の最終濃度がそれぞれ２５０ｎｇ／ｍｌ、
１０μｇ／ｍｌ、 １００Ｕ／ｍｌ、 １０Ｕ／ｍｌ
になるように、かつ、いろいろな組合せで添加した。こ
うして、リンパ球及び各因子を添加した後、４日間培養
を行い、以下に述べる方法で免疫活性を測定した。
チド（以下、ＭＤＰとする）、インターロイキン２（ゼ
ンザイム社製）（以下、ＩＬ−２とする）、インターロ
イキン６（ゼンザイム社製）（以下、ＩＬ−６とする）
を、培養液中の最終濃度がそれぞれ２５０ｎｇ／ｍｌ、
１０μｇ／ｍｌ、 １００Ｕ／ｍｌ、 １０Ｕ／ｍｌ
になるように、かつ、いろいろな組合せで添加した。こ
うして、リンパ球及び各因子を添加した後、４日間培養
を行い、以下に述べる方法で免疫活性を測定した。
【００２６】（２） 免疫活性の測定
上記培養後、リンパ球及び培養上清を除去し、プレート
上に残ったＡ５４９細胞を３回ＥＲＤＦで洗浄した後、
０．０６％グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５
分間固定を行った。更に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓ 溶液を用いて３回洗浄し、０．２％ゼラチン−０．
５ ％ＢＳＡ で３７℃、２時間ブロッキングを行った
。
上に残ったＡ５４９細胞を３回ＥＲＤＦで洗浄した後、
０．０６％グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５
分間固定を行った。更に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓ 溶液を用いて３回洗浄し、０．２％ゼラチン−０．
５ ％ＢＳＡ で３７℃、２時間ブロッキングを行った
。
【００２７】溶液を捨てた後、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ
とビオチン化抗ヒトＩｇＭ を混合した溶液を添加し
、３７℃、１時間反応を行った。これを洗浄した後、ア
ビジン−ペルオキシダーゼ複合体を添加し、３７℃、１
時間反応を行い、更に洗浄後、通常のジアミノベンジジ
ンを含む反応液により発色を行った。
とビオチン化抗ヒトＩｇＭ を混合した溶液を添加し
、３７℃、１時間反応を行った。これを洗浄した後、ア
ビジン−ペルオキシダーゼ複合体を添加し、３７℃、１
時間反応を行い、更に洗浄後、通常のジアミノベンジジ
ンを含む反応液により発色を行った。
【００２８】その後、各ウェル中の陽性コロニーの数を
計測することにより、免疫活性を測定した。この陽性コ
ロニーは、抗原特異的免疫グロブリンを生産するリンパ
球数と比例している。このようにしてアジュバンド物質
とリンホカインの影響を調べた結果を表１、表２に示す
。
計測することにより、免疫活性を測定した。この陽性コ
ロニーは、抗原特異的免疫グロブリンを生産するリンパ
球数と比例している。このようにしてアジュバンド物質
とリンホカインの影響を調べた結果を表１、表２に示す
。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】表１及び表２に示されるように、アジュバ
ンド物質及びリンホカインを同時に添加した方がＡ５４
９に反応する陽性コロニーの数は多い。特に、ＭＤＰ、
ＩＬ−２及びＩＬ−６の組合せが最も効果的であること
が明らかとなった。このことは、Ａ５４９に反応する抗
体を生産するリンパ球数が多いことを示している。
ンド物質及びリンホカインを同時に添加した方がＡ５４
９に反応する陽性コロニーの数は多い。特に、ＭＤＰ、
ＩＬ−２及びＩＬ−６の組合せが最も効果的であること
が明らかとなった。このことは、Ａ５４９に反応する抗
体を生産するリンパ球数が多いことを示している。
【００３２】実施例２
二人の癌患者由来のリンパ節リンパ球と、三人の健常人
の末梢血由来のリンパ球を分離し、それぞれのリンパ球
を用いて実施例１と同様に培養及び免疫活性の測定を行
なった。この結果を表３に示す。
の末梢血由来のリンパ球を分離し、それぞれのリンパ球
を用いて実施例１と同様に培養及び免疫活性の測定を行
なった。この結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
【００３４】表２から明らかなように、リンパ球を分離
する組織として、リンパ節を用いた場合と末梢血を用い
た場合とで明らかな差はみられない。すなわち、体外免
疫法を行うために必要なリンパ球は、どのような組織か
ら分離しても可能であることを示している。
する組織として、リンパ節を用いた場合と末梢血を用い
た場合とで明らかな差はみられない。すなわち、体外免
疫法を行うために必要なリンパ球は、どのような組織か
ら分離しても可能であることを示している。
【００３５】実施例３
体外免疫法に及ぼすポリクローナル活性化物質（例えば
レクチン、リボ多糖類など）の影響について調べた。す
なわち、ＯＫ−４３２、ＭＤＰ、ＩＬ−２、ＩＬ−６の
他に、ポークウィートマイトージェン（ＰＷＭ）及びリ
ボ多糖類（ＬＰＳ）を培地中にそれぞれ１％及び２５μ
ｇ／ｍｌ添加した他は、実施例１と同様にして培養し、
免疫活性を測定した。この結果を表４に示す。
レクチン、リボ多糖類など）の影響について調べた。す
なわち、ＯＫ−４３２、ＭＤＰ、ＩＬ−２、ＩＬ−６の
他に、ポークウィートマイトージェン（ＰＷＭ）及びリ
ボ多糖類（ＬＰＳ）を培地中にそれぞれ１％及び２５μ
ｇ／ｍｌ添加した他は、実施例１と同様にして培養し、
免疫活性を測定した。この結果を表４に示す。
【００３６】
【表４】
【００３７】通常、体外免疫法においては、ポリクロー
ナル活性化物質の存在が必要とされているが、表４の結
果は、これらの物質が阻害的に働くことを示している。
ナル活性化物質の存在が必要とされているが、表４の結
果は、これらの物質が阻害的に働くことを示している。
【００３８】実施例４
実施例１と同様にして、ＭＤＰ、ＩＬ−２及びＩＬ−６
を添加した培地中でリンパ球を培養した後、リンパ球を
回収し、リンパ球系株化細胞であるＲＦ−Ｓ１（ヒトミ
エローマ細胞株とマウスミエローマ細胞株との融合細胞
突然変異株）（微工研菌寄第１２０９１号）と細胞融合
を行った。なお、リンパ球としては健常人の末梢血から
分離したものを用い、抗原としてはＡ５４９細胞を用い
た。
を添加した培地中でリンパ球を培養した後、リンパ球を
回収し、リンパ球系株化細胞であるＲＦ−Ｓ１（ヒトミ
エローマ細胞株とマウスミエローマ細胞株との融合細胞
突然変異株）（微工研菌寄第１２０９１号）と細胞融合
を行った。なお、リンパ球としては健常人の末梢血から
分離したものを用い、抗原としてはＡ５４９細胞を用い
た。
【００３９】細胞融合は、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法により行った。細胞融合後、９６ウェル
プレートに細胞をまき、細胞の生育してきたウェル数を
測定した。更に、その培養上清中に抗原特異的な免疫グ
ロブリンが含まれているかどうかを、次のような方法で
測定した。
いる通常の方法により行った。細胞融合後、９６ウェル
プレートに細胞をまき、細胞の生育してきたウェル数を
測定した。更に、その培養上清中に抗原特異的な免疫グ
ロブリンが含まれているかどうかを、次のような方法で
測定した。
【００４０】まず、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレート
上でコンフルエントになるまで培養を行ない、培養上清
を除去した後、３回ＥＲＤＦで洗浄した。そして、０．
０６％グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５分間
固定を行なった。更に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ
溶液を用いて３回洗浄し、０．２ ％ゼラチン−０．
５ ％ＢＳＡ で３７℃、２時間ブロッキングを行った
。
上でコンフルエントになるまで培養を行ない、培養上清
を除去した後、３回ＥＲＤＦで洗浄した。そして、０．
０６％グルタルアルデヒド溶液を用いて４℃、１５分間
固定を行なった。更に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ
溶液を用いて３回洗浄し、０．２ ％ゼラチン−０．
５ ％ＢＳＡ で３７℃、２時間ブロッキングを行った
。
【００４１】溶液を捨てた後、細胞融合後細胞の生育し
てきたウェルの培養上清を加え、３７℃、１時間反応を
行なった。これを洗浄した後、アビジン−ペルオキシダ
ーゼ複合体を添加し、３７℃、１時間反応を行い、更に
洗浄後、通常のＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３
−エチルベンゾチアリゾン−６−スルホン酸）二アンモ
ニウム塩）を含む反応液により発色を行った。そして、
発色したもの、すなわち抗原特異的に反応する免疫グロ
ブリンが含まれるウェル数を測定した。この結果を表５
に示す。
てきたウェルの培養上清を加え、３７℃、１時間反応を
行なった。これを洗浄した後、アビジン−ペルオキシダ
ーゼ複合体を添加し、３７℃、１時間反応を行い、更に
洗浄後、通常のＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３
−エチルベンゾチアリゾン−６−スルホン酸）二アンモ
ニウム塩）を含む反応液により発色を行った。そして、
発色したもの、すなわち抗原特異的に反応する免疫グロ
ブリンが含まれるウェル数を測定した。この結果を表５
に示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】表５の結果から明らかなように、体外免疫
法を用いることにより、抗原特異的なモノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマの出現率が顕著に上昇する
。
法を用いることにより、抗原特異的なモノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマの出現率が顕著に上昇する
。
【００４４】
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、ア
ジュバンド物質及びリンホカインを含み、ポリクローナ
ル活性化物質を含まない培養液を用いることにより、効
率のよいリンパ球の体外免疫が可能となる。また、その
リンパ球の由来として特殊な組織由来のものを用いるこ
となく、どのようなものを用いても体外免疫が可能であ
る。更に、このようにして免疫されたリンパ球を用いて
、目的とする抗原に対するモノクローナル抗体を得るこ
とが可能となる。特に、ヒト型のモノクローナル抗体は
、その作製の難しさ、目的とする抗原に対して反応する
ものを得ることが非常に困難であることが、その普及を
妨げてきたが、本発明によって、目的とする抗原特異的
ヒト型モノクローナル抗体が効率よく得られるようにな
り、予防、診断、治療への道が開かれる。また、本発明
の免疫活性測定方法によれば、各種物質の免疫に及ぼす
影響を容易に調べることができる。
ジュバンド物質及びリンホカインを含み、ポリクローナ
ル活性化物質を含まない培養液を用いることにより、効
率のよいリンパ球の体外免疫が可能となる。また、その
リンパ球の由来として特殊な組織由来のものを用いるこ
となく、どのようなものを用いても体外免疫が可能であ
る。更に、このようにして免疫されたリンパ球を用いて
、目的とする抗原に対するモノクローナル抗体を得るこ
とが可能となる。特に、ヒト型のモノクローナル抗体は
、その作製の難しさ、目的とする抗原に対して反応する
ものを得ることが非常に困難であることが、その普及を
妨げてきたが、本発明によって、目的とする抗原特異的
ヒト型モノクローナル抗体が効率よく得られるようにな
り、予防、診断、治療への道が開かれる。また、本発明
の免疫活性測定方法によれば、各種物質の免疫に及ぼす
影響を容易に調べることができる。
Claims (8)
- 【請求項１】 アジュバンド物質及びリンホカインを
含み、ポリクローナル活性化物質を含まない培養液中に
て、リンパ球を抗原で特異的に免疫することを特徴とす
る体外免疫方法。 - 【請求項２】 アジュバンド物質及びリンホカインを
含み、ポリクローナル活性化物質を含まない培養液中に
て、リンパ球を抗原で特異的に免疫し、かつ、不滅化さ
せることを特徴とする体外免疫方法。 - 【請求項３】 免疫された抗原特異性リンパ球を、リ
ンパ系株化細胞と融合するか、又はエプスタイン−バー
ウィルス感染させることによって不滅化する請求項２記
載の体外免疫方法。 - 【請求項４】 前記アジュバンド物質が、ムラミルジ
ペプチド又はＯＫ−４３２（中外製薬株式会社製、商品
名「ピシバニール」）である請求項１〜３のいずれか１
つに記載の体外免疫方法。 - 【請求項５】 前記リンホカインが、インターロイキ
ン２、インターロイキン６よりなる群から選ばれた少な
くとも一種である請求項１〜４のいずれか１つに記載の
体外免疫方法。 - 【請求項６】 前記抗原が、株化された癌細胞又は不
溶化された可溶性抗原である請求項１〜５のいずれか１
つに記載の体外免疫方法。 - 【請求項７】 前記リンパ球が、末梢血由来、リンパ
節由来又は脾臓由来のものである請求項１〜６のいずれ
か１つに記載の体外免疫方法。 - 【請求項８】 アジュバンド物質とリンホカインと抗
原とを含み、かつ、被試験物を添加した培養液中でリン
パ球を培養し、免疫活性を測定することを特徴とする免
疫活性測定方法。
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|---|---|---|---|
| JP06927391A JP3147916B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 体外免疫方法 |
| US07/842,262 US5290681A (en) | 1991-03-08 | 1992-02-27 | Method of assaying immunization stimulating activity |
| DE4207365A DE4207365C2 (de) | 1991-03-08 | 1992-03-05 | Verfahren zur in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten sowie zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität |
| FR9202747A FR2673641A1 (fr) | 1991-03-08 | 1992-03-06 | Procede d'immunisation in vitro et procede d'essai de l'activite de stimulation de l'immunisation. |
| GB9204928A GB2254326B (en) | 1991-03-08 | 1992-03-06 | Monoclonal antibodies produced by in vitro immunization of lymphocytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06927391A JP3147916B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 体外免疫方法 |
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|---|---|
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| JP3147916B2 JP3147916B2 (ja) | 2001-03-19 |
Family
ID=13397900
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP06927391A Expired - Fee Related JP3147916B2 (ja) | 1991-03-08 | 1991-03-08 | 体外免疫方法 |
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| JP (1) | JP3147916B2 (ja) |
| DE (1) | DE4207365C2 (ja) |
| FR (1) | FR2673641A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2002112069A (ja) * | 2000-07-25 | 2002-04-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 画像歪補正装置および画像歪補正方法 |
| US7006255B2 (en) * | 2001-03-29 | 2006-02-28 | Sharp Laboratories Of America | Adaptive image filtering based on a distance transform |
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| GB0724051D0 (en) * | 2007-12-08 | 2008-01-16 | Medical Res Council | Mutant proteins and methods for producing them |
| GB0724860D0 (en) | 2007-12-20 | 2008-01-30 | Heptares Therapeutics Ltd | Screening |
| GB0802474D0 (en) * | 2008-02-11 | 2008-03-19 | Heptares Therapeutics Ltd | Mutant proteins and methods for selecting them |
| DE08718604T1 (de) * | 2008-03-05 | 2009-12-24 | Medical Research Council | Kristallstruktur |
| GB0910725D0 (en) | 2009-06-22 | 2009-08-05 | Heptares Therapeutics Ltd | Mutant proteins and methods for producing them |
| GB201002082D0 (en) | 2010-02-09 | 2010-03-24 | Univ Leiden Medical Ct | Biological material |
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|---|---|---|---|---|
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| US5229275A (en) * | 1990-04-26 | 1993-07-20 | Akzo N.V. | In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies |
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- 1991-03-08 JP JP06927391A patent/JP3147916B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-02-27 US US07/842,262 patent/US5290681A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 DE DE4207365A patent/DE4207365C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-06 FR FR9202747A patent/FR2673641A1/fr active Granted
- 1992-03-06 GB GB9204928A patent/GB2254326B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
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| GB2254326B (en) | 1995-08-23 |
| US5290681A (en) | 1994-03-01 |
| FR2673641A1 (fr) | 1992-09-11 |
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| JP3147916B2 (ja) | 2001-03-19 |
| GB9204928D0 (en) | 1992-04-22 |
| DE4207365C2 (de) | 1999-07-22 |
| GB2254326A (en) | 1992-10-07 |
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