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DE4207365A1 - Verfahren zur in-vitro-immunisierung von lymphocyten sowie zum testen auf die immunisierung stimulierende aktivitaet - Google Patents

Verfahren zur in-vitro-immunisierung von lymphocyten sowie zum testen auf die immunisierung stimulierende aktivitaet

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DE4207365A1
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Hiroki Murakami
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Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur extrem effektiven in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten für die Herstellung von gegen ein antigenspezifischen Antikörpern, sowie ein Verfahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität durch Verwendung des oben verwendeten Zellkultur­ systems.
Seit Köhler und Milstein 1975 ein Verfahren etabliert haben, monoklonale Antikörper produzierende Mäuse-Hybridomzellinien in vitro zu erzeugen (Nature 1975, 256, 495-497), sind un­ zählige monoklonale Antikörper mit Mäuseursprung entwickelt worden, die gegen verschiedene Antigene gerichtet sind, und viele von diesen werden gegenwärtig für in-vitro-Diagnose­ zwecke, wie etwa Serumdiagnose, eingesetzt.
Obgleich menschliche monoklonale Antikörper ebenfalls durch Anwendung der Methode von Köhler und Milstein produziert werden können und diese Antikörper mit Mäuse- und Humanur­ sprung für therapeutische Zwecke denkbar sind, ist bisher kein monoklonaler Antikörper in der praktischen Therapie eingesetzt worden.
Es ist ein allgemein akzeptiertes Konzept, daß monoklonale Antikörper mit Humanursprung gegenüber solchen mit Mäuseur­ sprung zur Verabreichung an Menschen bevorzugt sind. Der Einsatz menschlicher monoklonaler Antikörper im klinischen Bereich ist jedoch bisher behindert worden, und zwar teil­ weise wegen des Fehlens effektiver Verfahren zur Bereit­ stellung menschlicher, mit den erforderlichen Antigenen immunisierter Lymphocyten, die für die Erzeugung von be­ troffenen Hybridomen unverzichtbar sind, und teilweise wegen ethischer Überlegungen, daß Immunisierungen mit geeig­ neten Antigenen direkt in Menschen nicht möglich ist. In diesem Zusammenhang sind ausgedehnte Anstrengungen unter­ nommen worden, effiziente in-vitro-Immunisierungsverfahren zu etablieren, um diese Schwierigkeiten zu überwinden (J. Immunol. 1985, 135, 383-3838; Human Hybridoma and Mono­ clonal Antibody, Plenum Press, 1985, S. 71-91).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die anti­ genspezifische und effiziente in-vitro-Imnunisierung von Lymphocyten zur Verfügung, die die Erzeugung von Hybridomen mit menschlichem und tierischem Ursprung, die antigen­ spezifische monoklonale Antikörper produzieren, erleichtern kann. Darüber hinaus wurde ein einfaches Verfahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierender Aktivität ent­ wickelt.
Gemäß einer Ausführungsform des in-vitro-Immunisierungsver­ fahrens der vorliegenden Erfindung umfaßt das Verfahren das Immunisieren von Lymphocyten, die spezifisch auf ein Antigen ansprechen, durch Kultivieren in einem Medium, das ein Adju­ vans und ein oder mehrere Lymphokine enthält, in Abwesen­ heit eines polyklonalen Aktivators.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des in-vitro-Immuni­ sierungsverfahren der vorliegenden Erfindung schließt an den ebigen Schnitt die Immortalisierung der immunisierten Lymphocyten.
Das Verfahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Kulti­ vieren von Lymphocyten über der Antigen-Schicht in einem Medium, das ein Adjuvans, ein oder mehrere Lymphokine und die Testsubstanz enthält, in Abwesenheit eines polyklonalen Aktivators, und den Nachweis der von den immunisierten Lymphocyten produzierten Immunoglobuline.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Lymphocyten in antigenspezifischer Weise in einem Kultivierungsmedium, das ein Adjuvans und ein oder mehrere Lymphokine enthält, in Abwesenheit von polyklonalem Akti­ vator in vitro effizient immunisiert werden können. Die immunisierten Lymphocyten können, falls erwünscht, immortalisiert werden. Die höchste Effizienz der in-vitro- Immunisierung kann erzielt werden, wenn sowohl das Adjuvans als auch die Lymphokine in Kombination gleichzeitig im Medium enthalten sind. Wenn der polyklonale Aktivator zur obigen Mischung zugegeben wird, sinkt die Immunisierungs- Effizienz signifikant ab. Die Anmeldung ist nicht auf Lymphocyten aus speziellen Geweben beschränkt, sondern die in-vitro-Immunisierung der vorliegenden Erfindung kann bei jedem Lymphocyten angewendet werden.
Die in vitro immunisierten Lymphocyten, die die antigen­ spezifischen monoklonalen Antikörper produzieren, können entweder durch Hybridisierung mit Zellen einer geeigneten Lymphocyten-Zellinie oder durch Infizieren mit Epstein-Barr- Virus immortalisiert werden, was die effiziente Produktion des antigenspezifischen monoklonalen Antikörpers er­ leichtern kann. Anwendungen menschlicher monoklonaler Anti­ körper sind bisher aufgrund der Schwierigkeiten behindert worden, eine genügend hohe Spezifizität gegenüber dem ge­ wünschten Zielantigen sowie eine angemessene Produktion zu erreichen. Die vorliegende Erfindung eröffnet vielver­ sprechende Möglichkeiten für weite Anwendungen menschlicher monoklonaler Antikörper für die Prävention, Diagnose und Therapie, indem sie die prompte und effiziente Produktion gewünschter antigenspezifischer monoklonaler Antikörper erleichtert.
Das Verfahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität kann es erleichtern, verschiedene wirksame Materialien, die die Immunisierungs-Effizienz erhöhen, durch Messen ihrer Wirkungen auf die Immunisierungsreaktion während der Kultivierung der Lymphocyten in dem Medium, das die Testmaterialien in Gegenwart von Adjuvans, Lymphokinen und Antigen enthält, zu erleichtern.
Bei der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt unlösliche Antigene verwendet, wie etwa Krebszellen bekannter Linien und Latexteilchen, auf denen lösliche Antigene adsorbiert sind.
Für das Adjuvans wird bevorzugt entweder Muramyl-Dipeptid (MDP) oder OK-432, das von Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Japan, erhältlich ist, verwendet. MDP-Konzentrationen im Kultivierungsmedium, die von 0,1-1000 µg/ml und bevorzugt von 0,5-50 µg/ml variieren, sind erfolgreich verwendet worden. Für OK-432 sind die effektiven Konzentrationen im Kultivierungsmedium 25-25000 ng/ml, bevorzugt 50-10000 ng/ml.
Als Lymphokin wird wenigstens eines der Interleukine(ILe)-2 und -6 oder ihre Kombination verwendet. Die effektiven Konzentrationen der ILe im Kultivierungsmedium sind: für IL-2: 1-1000 Einheiten/ml, bevorzugt 2-500 Einheiten/ml; für IL-6: 1-1000 Einheiten/ml, bevorzugt 2-500 Einheiten/ml. Eine extrem hohe Effizienz der in-vitro-Immunisierung kann mit der kombinierten Verwendung von IL-2 und IL-6 erzielt werden.
Obwohl die Kultur erfolgreich in einem Medium, wie Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), Hams F12, RPMI 1640, RDF (eine 2:1:1-Mischung von RPMI 1640, DMEM und Hams F12) und ERDF (RDF, das an Aminosäuren und Vitaminen ange­ reichert ist), durchgeführt werden kann, sind die letzteren zwei Medien bevorzugt.
Frische Lymphocyten mit beliebigen Ursprung, wie etwa aus peripherem Blut, chirurgisch dissizierten Lymphknoten und Milz, können für die in-Vitro-Immunisierung gemäß der vor­ liegenden Erfindung erfolgreich eingesetzt werden.
Bei diesem Verfahren für die in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten werden signifikante Abnahmen in der Immunisierungs-Effizienz in Gegenwart von polyklonalen Akti­ vatoren, wie etwa Endotoxinen, Dextransulfat und Lectinen, einschließlich Phytohämagglutinin, Phytolacca americana- Mitogen (pokeweed mitogen), Concanavalin A etc., die üb­ licherweise bei den herkömmlichen Verfahren verwendet werden, beobachtet. Demgemäß ist es für die in-vitro- Immunisierung der vorliegenden Erfindung wesentlich erfor­ derlich, Kultivierungsmedien zu verwenden, die frei von polyklonalem Aktivator sind.
Die in-vitro-Immunisierung wird während der Verlaufs der Kultur für 4 bis 10 Tage durchgeführt, nachdem eine Lympho­ cyten-Suspension im Kulturmedium, das ein Adjuvans und ein oder mehrere Lymphokine enthält, zum unlöslichen Antigen, wie etwa den Krebszellen oder den oben beschriebenen latex­ gebundenen Antigenen, zugesetzt worden ist.
Die so für die in-vitro-Immunisierung kultivierten Lympho­ cyten werden geerntet und, falls erforderlich, entweder durch Hybridisierung mit Zellen einer geeigneten Lymphocyten-Zellinie oder durch Infizieren mit Epstein-Barr- Virus immortalisiert. Durch die Immortalisierung können neue Zellinien geschaffen werden, die unbegrenzt antigen­ spezifische monoklonale Antikörper produzieren, was die Produktion von monoklonalen Antikörpern erleichtert. Die in­ vitro-Immunisierung mit menschlichen Lymphocyten führt zur Bildung von Zellinien, die menschliche monoklonale Antikörper produzieren, diejenige mit tierischen Lymphocyten führt zur Bildung von Zellinien, die tierische monoklonale Antikörper der entsprechenden eingesetzten tierischen Spezies produzieren.
Der Test auf die Immunisierung stimulierende Aktivität kann durch die in-situ-Immunanfärbung von Antikörpern durchge­ führt werden, die aus immunisierten Lymphocyten ausge­ schieden und in Vertiefungen des Kulturgefäßes an das Anti­ gen gebunden worden sind. Der Stimulierungseffekt des Test­ materials auf die Immunisierungs-Effizienz kann als Differenz der Anzahl immunangefärbter Tupfen von Anti­ körpern die, während der Kultivierung der Lymphocyten an das überschichtete Antigen gebunden worden sind, in Gegenwart oder bei Abwesenheit des Testmaterials bewertet werden. Die vorliegende Erfindung ist im folgenden mit Beispielen weiter veranschaulicht.
Beispiel 1
Es werden die Wirkungen von Adjuvantien und Lymphokinen auf die in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten gezeigt.
Die in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten mit Antigen- Zellen wurde durchgeführt, wie unten beschrieben. Zellen der A549-Linie (eine menschliche Lungen-Carcinomzellinie, ATCC CCL-185), suspendiert in ERDF-Medium, das 10% fötales Kalbsserum (FCS) enthält, bei einer Dichte von 1·104 Zellen/ml, wurden in aliquoten Teilen von 1 ml auf eine Platte mit 24 Vertiefungen verteilt und für 36 h bei 37°C kultiviert. Die normalen Lymphocyten, eingestellt auf eine Dichte von 2·106 Zellen/ml, die aus der Fraktionierung mit Ficoll-Paque (erhältlich von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Upsala, Schweden) von peripherem Blut von einem gesunden Freiwilligen, gefolgt von viermaliger Waschung mit ERDF- Medium, gewonnen worden waren, wurden in aliquoten Teilen von 0,5 ml zur obigen Kultur von A549-Zellen in den Ver­ tiefungen zugegeben. Gleichzeitig wurden MDP, OK-432, die ILe-2 und -6 (erhältlich von Genzyme Corp., MA, USA) in ver­ schiedenen Konzentrationskombinationen, einschließlich einer Kombination von 250 ng/ml, 10 µg/ml, 100 Einheiten/ml bzw. 10 Einheiten/ml, in die Kultur eingebracht. Die Kultivierung wurde für 4 Tage bei 37°C fortgesetzt.
Die die Immunisierung stimulierenden Aktivitäten der Adjuvantien und Lymphokine wurden mit den so kultivierten Lymphocyten in situ getestet. Nach Entfernung des über­ stehenden Mediums zusammen mit den Lymphocytenzellen aus oben beschriebener Kultur wurden die an der Vertiefung an­ haftenden A549-Zellen mit 0,06% Glutaraldehyd für 15 min bei 4°C fixiert, gefolgt von dreimaliger Waschung mit ERDF.
Die Vertiefungen, die immobilisierte Antigenzellen ent­ hielten, an die von den immunisierten Lymphocyten ausge­ schiedene antigenspezifische Antikörper gebunden worden waren, wurden dreimal mit einer phosphatgepufferten Koch­ salzlösung (PBS), die 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen, gefolgt von Blockierung mit 0,2% Gelatine-0,5% Rinder­ serum-Albumin in PBS für 2 h bei 37°C. Nach Verwerfen der Blockierungslösung wurde eine Mischung von biotinyliertem anti-Human-IgG und biotinyliertem anti-Human-IgM zugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach extensivem Waschen der Vertiefungen wurde Avidin-Peroxidase-Konjugat zugesetzt und die Reaktion für 1 h bei 37°C fortgesetzt, gewaschen und schließlich wurden die Tupfen von an die Antigen-Zellen gebundenen Antikörpern durch die Abscheidung von farbigen Materialien sichtbar gemacht, die durch die Aktivität von Peroxidase unter Verwendung von 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) als Substrat gebildet wurden. Die die Immunisierung stimulierenden Aktivitäten von Adjuvantien sowie diejenigen der ILe wurden durch mikroskopisches Auszählung der Anzahl angefärbter Tupfen in jeder Vertiefung, d. h. der Anzahl von Lymphocyten, die die antigenspezifischen Immunglobuline produzierten, bestimmt.
Die Wirkungen von Adjuvamtien und Lymphokinen auf die in­ vitro-Immunisierung sind in den Tabellen 1 und 2 zusammenge­ faßt.
Tabelle 1
Wirkungen von Adjuvantien und Lymphokinen auf in-vitro- Immunisierung (Experimentalsatz 1)
Tabelle 2
Wirkungen von Adjuvantien und Lymphokinen auf in-vitro- Immunisierung (Experimentalsatz 2)
Die Tabellen 1 und 2 zeigen, daß die Zugabe eines Adjuvans und eines Lymphokins in Kombination und das Auftreten von Lymphocyten, die auf A549-Zellen ansprechende Antikörper produzieren, sehr viel effektiver ist als die jeweils unab­ hängige Zugabe der Additive, insbesondere in der Kombi­ nation: MDB, IL-2 und IL-6.
Beispiel 2
Ein ähnliches Experiment wie in Beispiel 1 wurde mit den Lymphocyten aus Lymphknoten von zwei Krebspatienten sowie mit solchen aus peripherem Blut dreier gesunder Freiwilliger durchgeführt.
Tabelle 3
in-vitro-Immunisierung mit lymphocyten aus unterschiedlichen Geweben
Wie in Tabelle 3 gezeigt, kann kein signifikanter Unter­ schied in der in-vitro-Immunisierung-Effizienz zwischen den Lymphocyten aus Lymphknoten und denjenigen aus peripherem Blut beobachtet werden, was darauf hinweist, das Lymphocyten aus jedem Gewebe in gleicher Weise für die in-vitro- Immunisierung der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
Beispiel 3
Es wurden die Wirkungen polyklonaler Aktivatoren, wie etwa Lectinen und Lipopolysacchariden, auf die in-vitro- Immunisierung untersucht. Die experimentellen Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß 1% Phytolacca americana-Mitogen (pokeweed mitogen, PWM) oder 25 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS) in das Kultivierungsmedium einbezogen wurden.
Tabelle 4
Wirkung polyklonaler Aktivatoren auf in-vitro-Immunisierung
Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die polyklonalen Aktivatoren die gegenwärtige in-vitro- Immunisierung signifikant hemmen, obgleich diese Aktivatoren im allgemeinen für die herkömmlichen in-vitro-Immunisierungs­ verfahren erforderlich sind.
Beispiel 4
Dieses Beispiel zeigt, daß die effiziente Erzeugung von Human-Hybridomen, die antigenspezifische Antikörper in das Kultivierungsmedium ausscheiden, durch die Immortalisierung der Lymphocyten, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in vitro immunisiert worden sind, erreicht werden kann.
Lymphocyten aus peripherem Blut eines gesunden Freiwilligen wurden in einem Medium kultiviert, das MDP, IL-2 und IL-6 enthielt, in Gegenwart von A549-Zellen als Antigen. Die so immunisierten Lymphocyten wurden gesammelt und mit dem her­ kömmlichen Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol mit Zellen von RF-S1 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3751), die eine mutante Lymphocyten-Zellinie ist, die aus Myelomen mit Human- und Mäuse-Ursprung abgeleitet ist, hybridisiert. Nach der Hybridisierung mit RF-S1-Zellen wurden die Lymphocyten in Platten mit 96 Vertiefungen verteilt und kultiviert. Die verbrauchten Medien wurden mit einem enzymverknüpften immun­ sorbierenden Test (ELISA), wie unten beschrieben, auf antigen-spezifische Antikörper getestet. Die verbrauchten Medien, die auf die 96 Vertiefungen der Platte verteilt worden waren, in denen bis zu Konfluenz gezüchtete A549- Zellen mit Glutaraldehyd fixiert und in derselben Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, blockiert worden waren, wurden für 1 h bei 37°C inkubiert, gefolgt von einer weiteren Inkubation mit Avidin-Peroxidase-Konjugat. Die Menge an Immunglobulinen, die an die inmobile Phase gebunden waren, wurden durch Messen der gebundenen Peroxidase-Aktivität unter Verwendung von 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)-Di­ ammoniumsalz (ABTS) als Substrat photometrisch gemessen. Die Vertiefungen, die positive Farbentwicklung zeigten, d. h. diejenigen, die Antikörper enthielten, die mit A549-Antigen spezifisch reaktiv waren, wurden ausgezählt.
Tabelle 5
Auftreten von gegen A549-Zellen spezifischen Antikörpern in den verbrauchten Medien nach Kultivierung von Hybridomen, erzeugt durch Hybridisierung von in-vitro-immunisierten Lymphocyten und RF-S1-Zellen
Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß signi­ fikant höhere Raten bei der Erzeugung von Hybridomen, die antigenspezifische monoklonale Antikörper produzieren, mit dem vorliegenden in-vitro-Immunisierungsverfahren erzielt werden können.
Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims (8)

1. Verfahren zur in-vitro-Immunisierung von Lymphocyten, dadurch gekennzeichnet, daß Lymphocyten, die spezifisch auf ein Antigen ansprechen, durch Kultivieren in einem Medium, das ein Adjuvans und ein oder mehrere Lynphokine enthält, in Abwesenheit eines polyklonalen Aktivators immunisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an die Immunisierung eine Immortalisierung der immunisierten Lymphocyten anschließt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte immunisierte Lymphocyten dadurch immortalisiert werden, daß er mit Zellen einer oder mehrerer Lymphocyten- Zellinien hybridisiert oder mit Epstein-Barr-Virus hybridisiert wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Adjuvans Muramyl-Dipeptid oder OK-432 verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Lymphokin ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Interleukin-2 und Interleukin-6 besteht.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigen Krebszellen oder unlöslich­ gemachtes lösliche Materialien verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphocyten aus Blut, Lymphknoten oder Milzen stammen.
8. Verfahren zum Testen auf die Immunisierung stimulierende Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß Lymphocyten in einem Medium, das ein Adjuvans, ein oder mehrere Lymphokine und die Testsubstanz enthält, in Abwesenheit eines polyklonalen Aktivators über der Antigen-Schicht kultiviert und von den immunisierten Lymphocyten produzierte Immunglobuline nachge­ wiesen werden.
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