DE69012105T2

DE69012105T2 - Proliferation von cd4-lymfocyten.

Info

Publication number: DE69012105T2
Application number: DE69012105T
Authority: DE
Inventors: Kam Leung; Robert Townsend
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1989-02-21
Filing date: 1990-02-08
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2010-02-09
Also published as: AU645488B2; WO1990010059A1; EP0460065B1; HU902289D0; AU5196590A; EP0460065A1; DK0460065T3; DE69012105D1; ATE110770T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Helfer/Induktor-Untergruppe der T-Lymphozyten, die wichtige immunregulierende Zellen sind, welche an Helfer/Induktor-Immunfunktionen beteiligt sind, exprimieren auf ihrer Zelloberfläche das CD4-Oberflächenantigen. CD4 ist ein Zelloberflächenprotein mit 55 kDa, das an der Erkennung von MHC-Klasse-II-Antigenen beteiligt wurde (Biddison et al. (1982) J. Exp. Med. 156:1065- 1076). Derartige CD4-positive (CD4&spplus;) T-Zellen umfassen ungefähr 45% der menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL) (Ledbetter et al. (1981) J. Exp. Med. 153:310). Das CD4-Antigen wird ferner in niedrigen Dichten auf Monozyten gefunden (Wood et al. (1982) J. Immunol. 131:212). Gegenwärtig umfassen die gebräuchlichsten Verfahren zum Reinigen von CD4&spplus;-Lymphozyten aus peripherem Blut die Verwendung monoklonaler Antikörper für die Affinitätsentfernung oder die spezifische Abreicherung von Zelltypen. Diese Affinitätstrennungsverfahren schließen das Panning (Engleman et al. (1981) J. Immunol. 127:2124), Zellsortieren (Parks und Herzenberg (1984) Methods Enzymol. 108:197-241) und das Komplementtöten ein (McCluskey et al. (1984) Int. J. Cell Cloning 2:296-303).
Das Panning-Verfahren zur Zelltrennung umfaßt eine Petrischale, die mit Antikörpern überzogen ist, welche für einen Zelloberflächenmarker spezifisch sind, der auf der (den) Unterpopulation(en) der zu isolierenden Lymphozyten oder Zellen vorhanden ist. Zellen, die an der Schale spezifisch haften, werden von denjenigen Zellen getrennt, welche nicht haften. Dies ist eine der besseren Verfahren zum Isolieren von CD4&spplus;-Lymphozyten, aber dieses Verfahren ist durch die Ineffektivität beim Isolieren reiner Populationen und der Schwierigkeit bei Anpassen an einen großen Maßstab begrenzt. Weiter ist das Panning eine mühsame Technik und ist aufgrund der Verwendung von Antikörpern kostspielig.
Für das Zellsortierverfahren zur Zelltrennung werden Zellen üblicherweise mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper fluoreszenzmarkiert und die Zellen werden durch den Zellsortierer auf der Grundlage der Anwesenheit oder Abwesenheit des Antikörpers ausgewählt. Dieses Verfahren ist teuer und äußerst zeitaufwendig, da das Sortieren nur in kleinem Maßstab ausgeführt werden kann. Es ist ferner schwierig, während des Sortierens die Sterilität aufrecht zu erhalten.
Bei dem Komplementtötungsverfahren zur Zellisolierung werden dem Zellgemisch für die unerwünschte Zellpopulation spezifische Antikörper zugesetzt und das Komplement wird anschließend zum spezifischen Lysieren der Antikörper-gebundenen Zellen zugesetzt. Dieses Verfahren ist zum Entfernen aller unerwünschter Zellen sehr ineffektiv und ist in größerem Maßstab schwierig auszuführen. Es gibt andere Verfahren zur Zelltrennung, wie etwa diejenigen, welche die Verwendung magnetischer Kugeln oder Affinitätssäulen einschließen (Braun et al. (1982) J. Immunol. Methods 54:251-258) und viele derselben besitzen Einschränkungen wie die vorstehenden Verfahren.
Weiter ist die Behandlung menschlicher, peripherer Lymphozyten mit L-Leucinmethylester zum Töten lysosomhaltiger Zellen aus der WO8801642 bekannt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erzeugen und Vermehren einer Lymphozytenpopulation, die wenigstens 90% CD4&spplus;-Lymphozyten enthält, welches
(a) das Behandeln peripherer, mononukleärer Blutzellen mit 5-10 Mm L-Leucyl-leucinmethylester oder 5-10 mM L-Leucinmethylester unter Abreichern von Monozyten und großer granulärer Lymphozyten und anschließend ohne positive Selektion oder Affinitätsentfernung von Nicht-CD4&spplus;-Lymphozyten,
(b) das kontinuierliche Kultivieren der peripheren, mononukleären Blutzellen in einem ein T-Zellenstimulans oder Interleukin-2 oder beides enthaltendem Kulturmedium bei 37ºC während 4-21 Tagen umfaßt.
Das vorliegende Verfahren beseitigt die Notwendigkeit für eine mühsame positive Selektion und Affinitätstrennungsverfahren. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner Wirksamkeit beim Expandieren von CD4-T-Zellen, seiner Fähigkeit, an einen großen Maßstab angepaßt zu werden, seiner technischen Einfachheit und seines Kosten-Nutzen-Verhältnisses am praktischsten.
Wenn Versuche unternommen werden, die Zellzahl von Lymphozyten aus PBMC direkt zu expandieren, neigt der Phänotyp der sich daraus ergebenden Zellen dazu, stark zu variieren, im allgemeinen aber enthalten derartige expandierte PBMC-Populationen niedrige Mengen CD4&spplus;-Zellen und hohe Mengen CD8&spplus;-Zellen oder Leu 19-Zellen. Wir haben gefunden, daß wenn PBMC zuerst mit L-Leucinmethylester (LME) oder L-Leucyl-leucinmethylester (LLME) behandelt und danach mit Mitogenen stimuliert wird, gefunden wird, daß CD4-positive Zellen die Kulturen dominieren, wenn sie expandieren. Von derartigen Kulturen wird gezeigt, daß sie in Abhängigkeit vom Typ der verwendeten Stimulantien um die 10- bis 1000fache Zellzahl expandieren und eine Reinheit von mehr als 90% CD- 4-positive Lymphozyten aufrecht erhalten.
Gewisse Aminosäuremethylester werden leicht von den Lysosomen von Monozyten absorbiert, wo sie zu der entsprechenden Aminosäure und Methanol hydrolysiert werden (Theile et al.) (1983) J. Immunol. 131:2282-2290). Die freie Aminosäure reichert sich in den Lysosomen an und schafft dadurch ein osmotisches Ungleichgewicht. Wasser füllt in der Folge die Lysosome, läßt sie dadurch anschwellen und bersten und tötet auf diese Weise die Zelle. Im Fall von LME wird die freie Aminosäure und etwaiger verbliebener LME in Leucyl-leucinmethylester überführt, der nach Zerstörung der Monozyten freigesetzt wird (Theile et al. (1985) J. Immunol. 134:786-793).
Die Erfindung bezieht sich weiter auf die
Verwendung einer durch das Verfahren der Ansprüche 1 bis 4 erhaltenen Lymphozytenpopulation zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer durch einen Mangel an CD4&spplus;-Lymphozyten gekennzeichneten Krankheit, wodurch periphere, mononukleäre Blutzellen aus dem Patienten erhalten werden und mit dem Verfahren von Anspruch 1 behandelt werden, um eine an CD4&spplus;-Lymphozyten angereicherte Zellpopulation zu liefern, und die an CD4&spplus;- Lymphozyten angereicherte Zellpopulation anschließend dem Patienten wieder zugeführt wird;
und eine Zusammensetzung, die eine wäßrige Suspension nach den Verfahren der Ansprüche 1-4 erhaltener menschlicher Lymphozyten, von denen mindestens 90% CD4&spplus;-Lymphozyten sind, und Interleukin-2 umfaßt;
ein Verfahren zum Erzeugen und Vermehren einer an CD4&spplus; angereicherten, Tumor-infiltrierenden Lymphozytenpopulation, welches
(a) das Behandeln Tumor-infiltrierender Lymphozyten mit L-Leucyl-leucinmethylester unter Abreichern von Monozyten und großer granulärer Lymphozyten und anschließend ohne positive Selektion oder Affinitätsentfernung von Nicht-CD4&spplus;-Lymphozyten
(b) das kontinuierliche Kultivieren der Tumor-infiltrierenden Leukozyten in einem ein T-Zellenstimulans und Interleukin-2 enthaltendem Kulturmedium bei 37ºC umfaßt;
ein Verfahren zum Herstellen eines Human-Immunschwäche-Virus, wobei periphere, mononukleäre Blutzellen aus einem mit dem Virus infizierten Patienten erhalten werden und mit dem Verfahren von Anspruch 1 behandelt werden, um eine an CD4&spplus;-Lymphozyten angereicherte, Virus-infizierte Zellen enthaltende Zellpopulation zu liefern, und der Virus anschließend aus der Zellpopulation isoliert wird;
ein Verfahren zum Nachweis eines Human-Immunschwäche-Virus in peripheren, mononukleären Blutzellen, welches das Behandeln der Zellen durch das Verfahren von Anspruch 1 unter Liefern einer an CD4&spplus;-Lymphozyten angereicherten, virusinfizierte Zellen enthaltenden Zellpopulation und anschließend das Testen der Zellen auf die Anwesenheit des Virus, falls dieser vorhanden ist, umfaßt;
ein Verfahren zum Herstellen autologer Zielzellen zur Verwendung in Tests zum Feststellen der Anwesenheit zytolytischer Effektorzellen in einer mit dem Human-Immunschwäche-Virus infizierten Person, welches das Erhalten peripherer, mononukleärer Blutzellen aus der Person, Behandeln der Zellen mit dem Verfahren von Anspruch 1 und anschließend das Hinzufügen von äußerem Hüllglykoprotein des Virus unter Erzeugen der Zielzellen umfaßt.
Der LLME kann danach durch zytotoxische Lymphozyten, die nicht direkt durch LME beeinflußt werden, absorbiert werden und zerstört sie auf ähnliche Weise. Zellen direkt zugesetzter LLME verhält sich in ähnlicher Weise (Lipsky und Theile, US-Patent 4 752 602; Theile und Lipsky (1986) J. Immunol. 136:1038-1048).
Wenn Tumor-infiltrierende Lymphozytenzellen (TIL) aus Tumorzellenzubereitungen expandiert werden, neigen CD8-tragende Zellen zum Dominieren der Kulturen (Topalian et al. (1987) J. Immunol. Methods 102:127-141). Durch Einsetzen dieses neuen Verfahrens des Behandelns der Tumorzellen mit LME oder LLME vor der Kultur wird von den sich daraus ergebenden, expandierten Zellkulturen gefunden, daß sie stark an CD4-tragenden Lymphozyten angereichert sind.
Die Verwendung von LME oder LLME in Tumorzellenzubereitungen in einem Verfahren zum Erzeugen einer an CD4-positiven Lymphozyten stark angereicherten Zellpopulation ist zuvor nicht berichtet worden. Die Reinigung von CD4-T-Zellen aus peripherem Blut, die von der Verwendung dieser Verbindungen unterstützt wird, ist zuvor beschrieben worden (Geppert und Lipsky (1987) J. Immunol. 138:1660-1666). Das Verfahren von Geppert und Lipsky unterscheidet sich jedoch von dem vorliegenden Verfahren in mehrfacher Hinsicht. Zuerst verwenden Geppert und Lipsky ein umständliches, mehrstufiges Reinigungsverfahren, das mehrere Affinitätsabreicherungen und positive Selektionsschritte zum Reinigen der CD4&spplus;- Lymphozyten umfaßt, wogegen wir dies nicht tun. Zu dieser Reinigung werden außer dem LME-Behandlungsschritt einschließlich zweier Panning-Schritte 6 Reinigungsschritte benötigt. Diese Schritte sind zeitaufwendig, schwierig auszuführen und in größerem Maßstab unausführbar. Lipsky et al. haben ferner dieselbe Grundstrategie zum Isolieren von CD8-T-Zellen verwendet (Theile und Lipsky (1988) Clinical Immunology and Immunopathology 48:405-423). Zweitens expandierten Geppert und Lipsky diese Zellen nicht zur Verwendung bei Immuntherapien, sondern sie untersuchten bloß die verschiedenen, für die Aktivierung gereinigter T-Zellenpopulationen notwendigen Parameter.

Genaue Beschreibung der Erfindung

PBMC werden typischerweise aus dem gesamten Blutprodukt unter Verwenden von Ficoll-Hypaque (Boyun (1989) Tissue Antigens 4:269-274) isoliert.
Einige der durch Oberflächengene definierten menschlichen lymphoiden Untergruppen werden in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 DURCH OBERFLÄCHENANTIGENE DEFINIERTE MENSCHLICHE LYMPHOIDE UNTERGRUPPEN (B-ZELLEN) (ALLE T- UND NK-ZELLEN) (MONOZYTEN) (T-ZELLEN) (HELFER)
Die gebräuchlicherweise für Lymphozyten-Untergruppen verwendete Nomenklatur wird in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Lymphozyten-Untergruppen und spezifische monoklonale Antikörper (Mabs) (B-D = Becton Dickinson) andere Namen Mabs:
Die isolierten PBMC werden anschließend mit einer Konzentration an LME oder LLME während einer zum wirksamen Verringern oder Entfernen zytotoxischer CD8-T-Zellen, NK-Zellen und LAK-Vorläufer ausreichenden Zeit inkubiert.

Tabelle 3

Wirkung der LME-Konzentration und der Länge der Behandlung von PBMC auf die CD4-Erzeugung. PBMC wurden aus Rotkreuz-Buffycoat durch Ficoll-Trennung isoliert. Die Zellen wurden in AIM V- Medien auf 1 x 10&sup7;/ml eingestellt und in fünf Teile geteilt. Jedes Fünftel wurde mit einer unterschiedlichen LME-Konzentration (0, 0,5, 1,0, 5,0 und 10 mM) behandelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (30, 45, 60 und 75 min) wurde jeweils ein Viertel der Zellen entnommen und 2 Mal in AIM V gewaschen. Die Zellen wurden anschließend zu 1 x 10&sup6;/ml mit 400 E/ml zugesetztem IL2 in AIM V kultiviert. PHA wurde jeder Kultur zu 1 ug/ml zugesetzt und 6 Tage kultiviert. Die FACS-Analyse wurde an Tag 6 ausgeführt. Die Daten werden als % CD4&spplus; ausgedrückt. Behandlungsdauer (min)
Wie in Tabelle 3 dargestellt, ist die Behandlung von PBMC während 45 bis 75 Minuten unter Verwenden von > 1,0 bis 10 mM LME beim Erzeugen von Kulturen mit einem Gehalt von > 90% CD4-Zellen wirkungsvoll. Nach ungefähr 60 min Behandlung werden die Zellen 2 Mal zum Entfernen des LME oder LLME gewaschen. Die Zellen werden anschließend bei 37ºC in AIM V-Zellkulturmedium mit den gewünschten Stimulantien, zum Beispiel Lectin (wie etwa Phytohämagglutin [PHA]) oder ein Antigen (zum Beispiel ein Tumorantigen), mit oder ohne Zusatz von exogenem IL2 kultiviert. Die IL2- Aktivitätseinheiten werden durchgehend als BRMP-Einheiten (E) ausgedrückt (Programm zur Änderung der biologischen Antwort). In 4 bis 7 Tagen beginnt das Zellwachstum und setzt sich bei Anwesenheit von IL2 2 bis 3 Wochen fort. Die sich daraus ergebende, auf eine Zellexpansion um das 10- bis 1000fache folgende Zellpopulation besteht aus mehr als 90% CD4&spplus;-Zellen.
Tabelle 4 und 5 fassen typische Ergebnisse mittels des Verfahrens der Erfindung zusammen. Kurz gesagt wurden PBMC 60 Minuten mit 5 mM LME (Sigma) behandelt und in 400 E/ml IL2 und AIM V- Medium (Gibco) ununterbrochen kultiviert. Kulturen wurden entweder mit PHA (Wellcome) zu 1 ug/ml, bestrahlten IM9 (ATCC)-Tumorzellen bei einem Verhältnis Antwortzellen zu Stimulatorzellen (R:S) von 5:1 oder mit nichts stimuliert.

TABELLE 4

PBMC wurden 60 min in Anwesenheit oder Abwesenheit von 5 mM LME inkubiert. Die Zellen wurden zum Entfernen des LME 2 Mal gewaschen. Die Zellen wurden in AIM V-Medium serumfrei bei einer Dichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml und 400 E/ml IL2 kultiviert. Mitogene wurden den bezeichneten Kulturen zugesetzt (PHA = 1 ug/ml und IM9 = 20%). Man ließ die Zellen wachsen und zählte zu verschiedenen Zeitpunkten durch einen Trypanblau-Ausschluß. Die Gesamtexpansion wurde aus diesen Zellzählungen berechnet und als - fache Expansion ausgedrückt. An den Tagen, an denen Zellzählungen durchgeführt wurden, wurde den Kulturen frisches Medium und IL2 verabfolgt. Kumulative Vermehrung Tag unbehandelt LME-behandelt

TABELLE 5

Die Kulturen in Tabelle 4 wurden periodisch auf die vorhandenen % CD4&spplus;-Lymphozyten getestet. Leu 3a (Becton Dickinson) wurde zum Definieren von CD4 verwendet und ein FACSCAN (Becton Dickinson) wurde zur Analyse verwendet. Die Daten werden als % CD4&spplus; ausgedrückt. Tag unbehandelt LME-behandelt
Das Zellwachstum (Tabelle 4) war sowohl für die behandelten als auch für die unbehandelten Zellen ähnlich. Der Phänotyp der unbehandelten Zellen am Tag 15 schwankte stark, wobei der Gehalt an CD4-positiven Zellen sehr niedrig war (alle weniger als 50%). Im Gegensatz dazu zeigen die LME-behandelten Zellkulturen alle einen Zellgehalt von mehr als 90% CD4-positiven Zellen am Tag 15 und halten diesen hohen Wert an CD4-positiven Zellen während der Kultur bis Tag 21 aufrecht.
Es wurden auch Versuche unter Verwenden von 0,5 mM LLME anstelle von LME durchgeführt. Tabelle 6 und 7 veranschaulichen gegenüber den mittels LME erhaltenen Ergebnissen ähnliche Befunde.

TABELLE 6

PBMC wurden 60 min in Anwesenheit oder Abwesenheit von 500 uM LLME inkubiert. Die Zellen wurden zum Entfernen des LLME 2 Mal gewaschen. Die Zellen wurden in AIM V-Medium (serumfrei) bei einer Dichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml und 400 E/ml IL2 kultiviert. Mitogene wurden den bezeichneten Kulturen zugesetzt (PHA = 1 ug/ml und IM9 = 20%). Man ließ die Zellen wachsen und zählte zu verschiedenen Zeitpunkten durch einen Trypanblau-Ausschluß. Die Gesamtexpansion wurde aus diesen Zellzählungen berechnet und als -fache Expansion ausgedrückt. An den Tagen, an denen Zellzählungen durchgeführt wurden, wurde den Kulturen frisches Medium und IL2 zugeführt. Eine siebte Kultur wurde ohne IL2 angesetzt. Diese Kultur wurde mit PHA (1 ug/ml) stimuliert und das Wachstum und die CD4-Reinheit (Tabelle 7) wurde mit der mit PHA stimulierten Kultur mit IL2 verglichen. Gesamtvermehrung Tag unbehandelt LLME-behandelt

TABELLE 7

Die Kulturen in Tabelle 6 wurden periodisch auf die vorhandenen % CD4&spplus;-Lymphozyten getestet. Leu 3a (Becton Dickinson) wurde zum Definieren von CD4 verwendet und ein FACSCAN (Becton Dickinson) wurde zur Analyse verwendet. Die Daten werden als % CD4&spplus; ausgedrückt. Tag unbehandelt LME-behandelt
Zusätzlich erhielt eine Kultur PHA, aber niemals exogenes IL2. Anfänglich wurde rasches Wachstum beobachtet, dieses Wachstum flachte jedoch nach 2 Wochen Kultur (Tabelle 6) ab. Der Wert der CD4-Zellen war in der Kultur, die kein IL2 erhielt, etwas höher als die Kultur, die PHA plus IL2 enthielt (Tabelle 7). Somit schien der Zusatz von IL2 das CD8-Zellwachstum in größerem Maß zu fördern als das CD4-Zellwachstum.
Tabelle 8 zeigt eine Zusammenfassung der auf die Behandlung mit LME und in IL2 kultivierten, folgenden Phänotypen der PBMC für 8 verschiedene Donoren ohne die zuvor beschriebene Mitogenbehandlung (IL2) oder mit vorhergehender Mitogenbehandlung (IM9 oder PHA). Die Daten zeigen die Prozentsätze CD4- und CD8-Zellen in den Kulturen am Tag 0 und nach etwa zwei Wochen Kultur. Im allgemeinen ist der Prozentsatz CD4-Zellen bei mit LME behandelten Zellen größer als 90% (22 von 24 Kulturen). TABELLE 8 DONOR Tag Kontrolle Kontrolle Kontrolle Zusammenfassung ND = nicht durchgeführt
Das Verfahren zum Erhalten von Kulturen von Zellen, die an CD4- positiven Lymphozyten hoch angereichert sind, wurde bei einem Versuch, die Expansion CD4&spplus;-Tumor-infiltrierender Lymphozyten (TIL) zu erhalten, auf Tumorzubereitungen angewandt (Topalian et al. (1988) J. Clinical Oncology 6:839-853). Einzelne gefrorene Tumor-Zubereitungen wurden aufgetaut und auf 4 aliquote Proben aufgeteilt. Beispiele erhielten entweder 5 mM LME-Behandlung, 0,5 mM LLME-Behandlung, 5 mM Phenylalaninmethylester(PME)-Behandlung oder keine Behandlung. Diese Behandlungen wurden ungefähr 1 Stunde durchgeführt und die Kulturen wurden anschließend zweimal mit AIM V-Medium gewaschen. Die Zellen wurden mit 4000 E/ml IL2 in einer Konzentration von 5 x 10&sup6; Zellen/ml wieder in AIM V-Medium suspendiert und bei 37ºC kultiviert bis die Zellexpansion aufhörte. Am Tag 21 und 27 wurde zum Bestimmen der Phänotypen der verschiedenen Kulturen eine fluoreszenzaktivierte Zellensortierunganalyse (FACS) ausgeführt. Tabelle 9 faßt die Ergebnisse dieser Analyse zusammen und Tabelle 10 veranschaulicht die Expansion jeder der TIL-Kulturen. An beiden Tagen 21 und 27 ist der relative CD4-Zellgehalt der LLME-Kultur bezüglich der nicht mit LME behandelten Kultur verstärkt. Die Vermehrung war bei den LLME-behandelten und unbehandelten Kulturen vergleichbar. Es ist anzumerken, daß bei dem Versuch von Tabelle 9, LME bei Anreichern des CD4&spplus;-Zellgehalt unwirksam war. Im allgemeinen hängt die Wirksamkeit von LME vom Gehalt ausreichender Monozyten in der Kultur ab, die zum Überführen von LME in LLME notwendig sind.

TABELLE 9

Tumor-Zellen wurden vom NCI erhalten und nach der Standardvorschrift für die Kultur vorbereitet. Proben wurden eingefroren und für den späteren Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Diese Proben wurden aufgetaut und 2 mal gewaschen. Die Zellen wurden in AIM V-Medium auf 1 x 10&sup7;/ml eingestellt. Vier aliquote Mengen wurden entnommen und 60 min entweder mit PME (5 mM), LME (5 mM), LLME (500 uM) oder nichts behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen 2 Mal in AIM V-Medium gewaschen und bei 5 x 10&sup5; Zellen/ml in AIM V-Medium mit 4000 E/ml IL2 kultiviert. Man ließ die Zellen wachsen und die Phänotypen der Kulturen wurden am Tag 0, 21 und 27 durch FACS-Analyse verglichen. Die Daten werden als % CD4&spplus; ausgedrückt. Kultur Tag Kontrolle

TABELLE 10

Die vom NCI erhaltenen und mit verschiedenen Aminosäuremethylestern behandelten Tumorzellen wurden in AIM V-Medium mit 4000 E/ml IL2 wie in Tabelle 9 beschrieben kultiviert. Man ließ die Kulturen wachsen und die Expansion wurde durch Zellzählen verfolgt. Gesamte Zellzahl (x 10&sup6;) Kultur Tag Kontrolle
Das vorliegende Verfahren sorgt für die wirksame Erzeugung einer großen Zahl CD4-Lymphozyten. Dieses Verfahren besitzt sowohl therapeutische als auch analytische Anwendungen. CD4-Zellen können therapeutisch bei der Behandlung von Krankheitszuständen verwendet werden, wie etwa Krebs oder mit einem Mangel an oder einer Funktionsstörung der CD4-Zellen verbundenen Krankheiten, wie etwa AIDS. Bei Krebs können aus TIL-Zubereitungen stammende CD4-Zellen als Immunmodulatoren verwendet werden, um Tumore spezifisch zu bekämpfen, indem die zum Verringern von Tumoren notwendigen Helferfunktionen in vivo bereitgestellt werden (Rosenstein et al. (1984) J. Immunol. 132:2117-2122). Ferner können aus dem peripheren Blut stammende CD4-Zellen auf eine ähnliche Weise zum Bereitstellen der notwendigen Helfer-Immunfunktion verwendet werden, um die Tumorreduktion zu bewirken.
Die von TIL stammenden CD4&spplus;-Lymphozyten können allein oder in Kombination mit anderen Zelltypen oder Effektorzellpopulationen verwendet werden. CD4-TIL-Zellen können in vivo zusammen mit Effektorzellen verabreicht werden, die aus Standard-TIL-Zubereitungen stammen, oder Effektorzellen, die aus dem peripheren Blut stammen. Aus dem peripheren Blut stammende CD4-Zellen können ferner beim Versuch, einen Krebspatienten immunzumodulieren, mit den von TIL stammenden CD4&spplus;-Zellen verabreicht werden. Entweder von TIL oder PMBC stammende CD4-Zellen können in vitro Kulturen oder autologen Effektorzellen zum möglichen Verstärken des Wachstums oder von Funktionen dieser Effektoren zugesetzt werden.
Bei Krankheitszuständen wie etwa AIDS kann eine große Zahl CD4- positiver Lymphozyten aus dem peripheren Blut des Patienten zur erneuten Infusion stammen, um die verarmte CD4-Population in dem Blut des Patienten wiederherzustellen. Um dies zu tun, müssen PBL aus Patienten mit der richtigen Konzentration eines antiviralen Mittel wie etwa AZT behandelt werden, um die Replikation des Virus in vitro zu hemmen (Perno et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1111-1125). Ferner kann lösliches, rekombinantes CD4 (r-CD4) zum Verhindern der Infektion neuer Zellen in vitro verwendet werden (Fisher et al. (1988) Nature 331:76-78). Man kann dieses lösliche, mit einem Toxin konjugierte r-CD4 möglicherweise zum Entfernen infizierter Zellen vor dem Kultivieren verwenden (Till et al. (1988) Science 424:1166-1168).
Wir testeten, ob die Anwesenheit von AZT die Fähigkeit, CD4- Zellen mittels des Verfahrens der Erfindung zu erzeugen, stört. Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse des Zufügens von AZT zu PBMC- Kulturen, die mit 5 mM behandelt, mit IM9-Tumorzellen stimuliert und danach in AIM V-Medium mit 400 E/ml r-IL2 kultiviert wurden. AZT wurde den Kulturen in wechselnden Konzentrationen zugesetzt und während der Dauer der Kultur aufrecht erhalten. Von AZT wurde gefunden, daß es das Wachstum dieser Zellen in gewissem Ausmaß hemmt; das Wachstum ist bei wirksamen AZT-Konzentrationen (0,1 ug/ml) jedoch immer noch bedeutend (100fache Expansion). Wie in Tabelle 12 dargestellt verringerte AZT den relativen Wert des CD4-Zellgehalts in diesen Kulturen nicht.

TABELLE 11

PBMC wurden 60 min mit 5 mM LME behandelt. Die Zellen wurden in AIM V-Medium mit 400 E/ml IL2 bei einer Dichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml behandelt. Die Kulturen wurden zum Auslösen der Expansion mit 20% IM9 stimuliert. Zu den Kulturen wurden wechselnde Mengen AZT (1, 0,1, 0,01 und 0 ug/ml) gegeben. Man ließ die Zellen wachsen und die Expansion wurde verfolgt und als -fache Expansion ausgedrückt. Kumulative Vermehrung Tag

TABELLE 12

Die Kulturen in Tabelle 11 wurden auf am Tag 15 vorhandene % CD4&spplus;- und % CD8&spplus;-Lymphozyten getestet. Leu 3a (Becton Dickinson) wurde zum Definieren von CD4, Leu 2b (Becton Dickinson) wurde zum Definieren von CD8 verwendet und ein FACSCAN (Becton Dickinson) wurde zur Analyse verwendet. Die Daten werden als % Leu 3+ und 2% Leu 2+ ausgedrückt. MLT-Kontrolle
Auf die vorstehende Weise aus einem HIV-Patienten gezüchtete Zellen konnten in den Patienten reinfundiert oder als diagnostisches Mittel in vitro zum Testen der Zellantworten gegen HIV- Determinanten verwendet werden. Durch Beladen dieser Zellen mit dem HIV-Hüllprotein gp120 können sie entweder als Zielzellen bei Zytotoxizitätstests (Lyerly et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4:4601-4605) oder Stimulatoren zum Untersuchen spezifischer Antworten auf gp120 verwendet werden.
Andere Krankheitszustände, bei welchen dieses Verfahren einen möglichen therapeutischen Vorteil liefern könnte, schließen multiple Sklerose (Chofflon et al. (1988) Annals of Neurology 24:185-191), chronische Synovitis (Kingsley et al. (1988) Scand. J. of Immunol. 28:225-232), systemischen Lupus erythematosus (Raziuddin et al. (1988) Clin. and Exper. Immunol. 72:446-449) und andere Krankheitszustände ein, an welchen ein CD4-Mangel beteiligt ist.
Die Fähigkeit, eine große Zahl CD4&spplus;-Lymphozyten zu erzeugen, kann für eine Antikörperherstellung in vitro nützlich sein. CD4&spplus;-T- Zellen können durch das vorliegende Verfahren erzeugt und Kulturen menschlicher Splenozyten zugesetzt werden, die beim Versuch, Antikörper zu erzeugen, in vitro gegen Antigene immunisiert wurden (Ho, Du Pont-Patentanmeldung US-Patentanmeldung 736 660). Diese Technologie kann bei der Entwicklung der Fähigkeit zum in vitro-Herstellen einer großen Zahl menschlicher Antikörper behilflich sein.

Claims

1. Verfahren zum Erzeugen und Vermehren einer Lymphozytenpopulation, die wenigstens 90% CD4&spplus;-Lymphozyten enthält, welches

(a) das Behandeln peripherer, mononukleärer Blutzellen mit 5-10 mM L-Leucyl-leucinmethylester oder 5-10 mM L-Leucinmethylester unter Abreichern von Monozyten und großer granulärer Lymphozyten und anschließend ohne positive Selektion oder Affinitätsentfernung von Nicht-CD4&spplus;-Lymphozyten

(b) das ununterbrochene Kultivieren der peripheren, mononukleären Blutzellen in einem ein T-Zellenstimulans oder Interleukin-2 oder beides enthaltendem Kulturmedium bei 37ºC während 4-21 Tagen

umfaßt.

2. Verfahren von Anspruch 1, bei welchem in Schritt (b) die Zellen in einem außer T-Zellstimulans Interleukin-2 enthaltendem Medium kultiviert werden.

3. Verfahren von Anspruch 1 oder 2, bei welchem die CD4&spplus;-Zellen um etwa das 10- bis 1000fache vermehrt werden.

4. Verfahren von Anspruch 2, bei welchem die CD4&spplus;-Zellen um wenigstens das 50fache vermehrt werden.

5. Verwendung einer durch das Verfahren von Anspruch 1 bis 4 erhaltenen Lymphozytenpopulation zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer durch einen Mangel an CD4&spplus;-Lymphozyten gekennzeichneten Krankheit.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wodurch die aus einem Virus- infizierten Patienten erhaltenen Zellen in Schritt (b) in Anwesenheit eines antiviralen Mittels in einer zum Hemmen der Virus- replikation und/oder -bindung wirksamen Menge kultiviert werden.

7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei der Patient mit einem Human-Immunschwäche-Virus infiziert ist.

8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Zellen in Schritt (b) in Anwesenheit von Azidothymidin kultiviert werden.

9. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Zellen in Schritt (b) in Anwesenheit von löslichem, rekombinantem CD4 kultiviert werden.

10. Verfahren zum Erzeugen und Vermehren einer an CD4&spplus; angereicherten, Tumor-infiltrierenden Lymphozytenpopulation, welches

(a) das Behandeln Tumor-infiltrierender Lymphozyten mit L-Leucyl-leucinmethylester unter Abreichern von Monozyten und großer granulärer Lymphozyten und anschließend ohne positive Selektion oder Affinitätsentfernung von Nicht-CD4&spplus;-Lymphozyten

(b) das ununterbrochene Kultivieren der Tumor-infiltrierenden Leukozyten in einem ein T-Zellenstimulans oder Interleukin- 2 oder beides enthaltendem Kulturmedium bei 37ºC

umfaßt.

11. Verfahren von Anspruch 10, wobei die sich daraus ergebende Tumor-infiltrierende Leukozytenpopulation wenigstens 40% CD4&spplus;- Lymphozyten enthält.

12. Verwendung der durch das Verfahren von Anspruch 11 erhaltenen Lymphozytenpopulation zur Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Krebs.

13. Zusammensetzung umfassend eine wäßrige Suspension menschlicher Lymphozyten, die durch die Verfahren von Anspruch 1-4 erhalten wurden, wovon mindestens 90% CD4&spplus;-Lymphozyten sind, und Interleukin-2.

14. Zusammensetzung von Anspruch 13, worin die Lymphozyten periphere Blutlymphozyten sind.

15. Verfahren zum Herstellen eines Human-Immunschwäche-Virus, wobei periphere, mononukleäre Blutzellen aus einem mit dem Virus infizierten Patienten erhalten werden und mit dem Verfahren von Anspruch 1 behandelt werden, um eine an CD4&spplus;-Lymphozyten angereicherte, Virus-infizierte Zellen enthaltende Zellpopulation zu liefern, und der Virus anschließend aus der Zellpopulation isoliert wird.

16. Verfahren zum Nachweis eines Human-Immunschwäche-Virus in peripheren, mononukleären Blutzellen, welches das Behandeln der Zellen mit dem Verfahren von Anspruch 1 unter Liefern einer an CD4&spplus;-Lymphozyten angereicherten, virusinfizierte Zellen enthaltenden Zellpopulation und anschließend das Testen der Zellen auf die Anwesenheit des Virus, falls dieser vorhanden ist, umfaßt.

17. Verfahren von Anspruch 16, wobei die Zellen auf die Anwesenheit des Virus durch einen Hybridisierungstest oder Immuntest getestet werden.

18. Verfahren zum Herstellen autologer Zielzellen zur Verwendung in Tests zum Feststellen der Anwesenheit cytolytischer Effektorzellen in einer mit dem Human-Immunschwäche-Virus infizierten Person, welches das Erhalten peripherer, mononukleärer Blutzellen aus der Person, Behandeln der Zellen mit dem Verfahren von Anspruch 1 und anschließend das Hinzufügen von äußerem Hüllglykoprotein des Virus unter Erzeugen der Zielzellen umfaßt.

Patentansprüche für den Vertragsstaat ES

umfaßt.

13. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die eine wäßrige Suspension menschlicher Lymphozyten, die durch die Verfahren von Anspruch 1-4 erhalten wurden, wovon mindestens 90% CD4&spplus;-Lymphozyten sind, und Interleukin-2 umfaßt.

14. Verfahren von Anspruch 13, worin die Lymphozyten periphere Blutlymphozyten sind.