DE69734989T2

DE69734989T2 - Antigenpräsentierende zellen, ein verfahren zur deren herstellung und deren verwendung als zelluläre impfstoffen

Info

Publication number: DE69734989T2
Application number: DE69734989T
Authority: DE
Inventors: Mohamed Chokri; Jacques Bartholeyns; Jean-Loup Romet-Lemonne
Original assignee: IDM Immuno Designed Molecules
Current assignee: IDM Immuno Designed Molecules
Priority date: 1996-05-21
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2017-05-16
Also published as: WO1997044441A1; EP0925356A1; AU2961597A; EP0925356B1; DK0925356T3; AU732536C; EP0808897A1; US20020192192A1; JP2000503545A; ATE314460T1; US20020182725A1; US20020192193A1; ES2256886T3; DE69734989D1; AU732536B2; JP3428025B2

Description

Die Erfindung betrifft neue antigenpräsentierende Zellen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als zelluläre Vakzine.
Makrophagen sind seit ihrer Beschreibung durch Metchnikoff (Immunity in Infective Diseases, Cambridge Press, 1905) als Zellen bekannt, die exogene Teilchen (Antigene, Zelltrümmer, Bakterien) sehr wirksam phagozytieren (einverleiben) und verdauen. Sie sezernieren auch eine Vielzahl von Immuneffektor-Monokinen. Sie spielen daher eine zentrale Rolle beim Einleiten der unspezifischen und der spezifischen Immunantworten. Die Gewinnung großer Mengen humaner Makrophagen, die in Kultur aus Blutmonozy ten differenziert sind, wurde bereits beschrieben (Internat. Anmeldung PCT/EP93/01232, Ref. 1–6). Diese Makrophagen exprimieren typische Antigene und Funktionen und wurden vollständig charakterisiert (Ref. 7–14).
In Gegenwart von IFNγ aktivierte Makrophagen (Makrophagen-aktivierte Killer: MAK) bringen selbst bei niedrigem Effektor/Target-Verhältnis selektive Zytostase und Zytotoxizität für eine große Anzahl menschlicher Tumoren hervor. Murine aktivierte Makrophagen, die lokal in den Tumor oder in seine Nachbarschaft eingebracht wurden, infiltrierten in murinen Modellen die Tumormasse, hemmten das Wachstum des Tumors und verminderten die Bildung von Metastasen. Auch humane Makrophagen hemmten das Wachstum menschlicher Tumoren, die nude- oder scid-Mäusen transplantiert worden waren; dieser Effekt wurde nach lokaler oder systemischer Injektion einer geringen Zahl von Makrophagen (weniger als 1 Million MAK) bei Mäusen mit makroskopischen Tumoren erzielt (Ref. 15–20).
Patienten mit metastasierendem Krebs wurden 10⁸ bis 4 × 10⁹ autologe MAK systemisch oder intraperitoneal infundiert. Tumorizide Monozyten (AKM) wurden Patienten mit kolorektalen Karzinomen ebenfalls intraperitoneal infundiert. Die klinische Toleranz der MAK war ausgezeichnet, bei geringen Nebenwirkungen, wie leichtem Fieber und Schüttelfrost, und ohne Autoimmun- oder Akute-Phase-Reaktivität. Es wurde nicht über vollständige antitumorale Antwort berichtet; verbesserte Prognose und verlängerte beschwerdefreie Intervalle nach intraperitonealer Injektion von AKM wurden beschrieben, während Tumornekrose, Stabilisierung, Reduktion von Aszitesflüssigkeit und Änderungen der Chemoresistenz nach MAK-Therapie beobachtet wurden (Ref. 21–26).
Die bekannte Beschränkung dieser Makrophagen besteht darin, dass sie für das Priming einer spezifischen Immunantwort gegen ein spezifisches exogenes Antigen oder einen Tumor durch Stimulation von MHC-Klasse-I-restringierten zytotoxischen T-Lymphozyten (CD8+) nicht sehr potent sind. Sie sind effizienter darin, Antigene im Zusammenhang mit MHC-Klasse-II-Molekülen den T-Helfer-Lymphozyten (CD4+) zu präsentieren.
Diese Makrophagen haben jedoch das Potential, durch den exogenen Pfad von Phagozyten lösliche Antigene zu prozessieren und zu präsentieren, aber es sind hohe Konzentrationen von Proteinen oder Antigenen erforderlich (Ref. 38–42, 45–47, 50).
Zellen, die diese Funktionen der Phagozytose, Verdauung, Prozessierung und Präsentation auf hohem Niveau exprimieren, wären für die Entwicklung zellulärer Vakzine erforderlich.
Dendritische Zellen sind durch ihre Morphologie (Dendrite) und einige Membranantigene gekennzeichnet, und sie werden als professionelle antigenpräsentierende Zellen, die sich in Geweben befinden, betrachtet. Sie sind die potentesten Zellen für die Stimulation von primären T-Lymphozyten-Immunantworten (Ref. 43–44, 47–49, + Dendritic cells in fundamental and clinical immunology, 1995, Plenum Press N.Y., Banchereau und Schmitt Eds.).
Vorläufer dendritischer Zellen bilden sich aus dem Knochenmark und finden sich in Blut und Lymphe. Aus diesen Ursprüngen stammende dendritische Zellen können durch Kultur in Gegenwart von GM-CSF + IL4 + TNF erhalten werden. Sie zeigen Unterschiede in Bezug auf ihren Reifegrad und die Mikroumgebung.
Die dendritischen Zellen, die aus Blut abgeleitet werden können, sind am potentesten darin, allogene Lymphozyten-Mischreaktionen zu induzieren und naive T-Lymphozyten zu stimulieren. Diese klassischen dendritischen Zellen sind jedoch technisch relativ schwer zu erhalten und phagozytieren schlecht.
Im Gegensatz zu Makrophagen exprimieren sie CD14 und CD64 (hochaffiner Fγ-Rezeptor) nicht.
Um das Problem der schlechten Phagozytose und Prozessierung spezieller Antigene durch dendritische Zellen zu umgehen, wurden diese Zellen mit kleinen Peptiden inkubiert („gepulsed"), die an MHC-I-Molekülen fixiert waren, um primäre Immunantwort und Vakzination gegen neue antigene Peptide zu induzieren (Ref. 51).
Der Erhalt dendritischer Zellen durch in-vitro-Differenzierung erfordert die Gegenwart von GM-CSF und eines zweiten Zytokins, das IL 4 (Ref. 44) oder IL 13 (Ref. 49) sein kann, plus TNF.
Eines der Ziele der Erfindung besteht darin, Zellen mit hoher Phagozytose und effizienter Antigenpräsentation bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, sehr potente antigenpräsentierende Zellen bereitzustellen, die aus humanen Blutmonozyten abgeleitet sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Zellen bereitzustellen, die Membran-Rezeptoren präsentieren, wobei Targeting und erhöhte Antigenpräsentation mit Verwendung bispezifischer Antikörper erlaubt wird (Ref. 27–31, 37).
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Zellen bereitzustellen, die mit cDNA transfiziert werden können, um in der Gentherapie eingesetzt zu werden (Ref. 32–36).
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das die Gewinnung von Zellen der Makrophagen-Linie mit hoher Phagozytose, Verdauungsaktivität, prozessierender MHC-Klasse-I und -Klasse-II-Antigenpräsentation aus menschlichem Blut ermöglicht (Ref. 46, 50, 52).
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine reproduzierbares Verfahren bereitzustellen, mit dem die oben definierten Zellen erhalten werden können, wobei das Verfahren keine Kombination exogener Zytokine erfordert, definierte Medien und Rezipienten, die einen Zellprozessor darstellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, zelluläre Vakzine bereitzustellen, welche die hohe Phagozytose, Prozessierung, MHC-II-Peptidpräsentation der Makrophagen und auch die potente MHC-I-T-Lymphozyten-Stimulation mit einem hohen Niveau akzessorischer Moleküle für die Präsentation der dendritischen Zellen zeigen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die Monozyten-abgeleitete antigenpräsentierende Zellen (MD-APCs) aufweist, wobei das Verfah ren umfasst:

– Ausgehen von einer Zusammensetzung, die Leukozyten enthält, die von gesunden Probanden oder von Patienten stammen, und die aus peripherem Blut durch Apherese erhalten wurde,
– Entfernen von Blutplättchen und Antikoagulans aus dem Aphereseprodukt, wie durch Zentrifugieren des Aphereseproduktes,
– Isolieren mononukleärer Zellen (Monozyten + Lymphozyten) von roten Blutkörperchen und Granulozyten, um weniger als 10 % Granulozyten und weniger als 5 % rote Blutkörperchen zu haben,
– Kultur der im vorigen Schritt erhaltenen mononukleären Zellen, indem sie in hydrophoben Beuteln in ein geeignetes Kulturmedium gebracht werden, das als einzige chemische Liganden, die Rezeptoren an der Membran mononukleärer Zellen haben,
– Histamin oder Agonist des Histamin-Rezeptors (H1 in Aktion) und einen N2-Antagonisten
– oder IL-13

Der Ausdruck „zusätzlich" entspricht der Tatsache, dass kein GM-CSF im Standardzustand zu der Kultur zugegeben wird, doch schließt dies nicht aus, dass exogener GM-CSF zu der Kultur zugesetzt werden könnte, um die Ausbeute und die Funktion der erhaltenen MD-APCs zu verbessern.
Die Erfindung betrifft Makrophagen mit den folgenden Eigenschaften:

– sie präsentieren an ihrer Oberfläche: – Antigen CD14 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, – Antigen CD64 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200,
– sie sind im Wesentlichen frei von den Oberflächenantigenen CD1a und CD1c, wobei das Vorhandensein bzw. die mittleren Intensitäten von CD14, CD64 und die Abwesenheit von CD1a und CD1c beispielsweise durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt werden,
– sie zeigen eine Phagozytose-Eigenschaft, wie sie durch den folgenden Test bestimmt wird: die Phagozytosekapazität wird durch Aufnahme von Formalin-fixierter Hefe be stimmt, beispielsweise durch 2-stündiges Kultivieren von Makrophagen, Zugabe von Hefe in einem Verhältnis von 1/10 Makrophage/Hefe und Inkubieren bei 37 °C, 5-%-CO₂-Atmosphäre während 2–3 Stunden, Fixieren durch die May-Grünwald-Giemsa(MGG)-Färbung, und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes phagozytischer Makrophagen beispielsweise durch mikroskopische Analyse,
– sie haben die Eigenschaft, die Proliferation allogener Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den folgenden Test bestimmt: allogene primäre Lymphozyten-Mischreaktion (MLR) wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, indem eine zunehmende Anzahl (2 × 10³ bis 2 × 10⁵) Makrophagen in 100 μl Medium/Vertiefung zu 2 × 10⁵ allogenen T-Zellen, die vom Buffy coat gereinigt wurden, in 100 μl Medium/Vertiefung zugegeben wurde und nach 5-tägiger Inkubation bei 37°C die Zellproliferation nach einem kolorimetrischen Verfahren, wie Hydrolyse von Tetrazoliumsalz WST-1 (Boehringer Mannheim, Deutschland) (leicht rot) zu Formozan (dunkelrot), bestimmt wurde.

Allgemeiner betrifft die Erfindung Monozyten-abgeleitete antigenpräsentierende Zellen (MD-APCs), insbesondere Makrophagen, die die folgenden Eigenschaften haben:

– sie präsentieren an ihrer Oberfläche: – Antigen CD14 und CD64 mit einer mittleren Intensität von etwa 5 bis etwa 200, – Antigen CD80 und CD86 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, – Antigen CD40 und Mannoserezeptor mit einer mittleren Intensität von 50 bis 500,
– sie sind im Wesentlichen frei von den Oberflächenantigenen CD1a und CD1c, i.e. mit einer mittleren Intensität von weniger als 20, wobei das Vorhandensein bzw. die mittleren Intensitäten von CD14, CD64, CD80 und CD86 und die Abwesenheit von CD1a und CD1c beispielsweise durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt werden,
– sie zeigen eine Phagozytose-Eigenschaft, wie sie durch den folgenden Test bestimmt wird: die Phagozytosekapazität wird durch Aufnahme von Formalin-fixierter Hefe bestimmt, beispielsweise durch 2-stündiges Kultivieren von MD-APCs, Zugabe von Hefe in einem Verhältnis von 1/10 MD-APCs/Hefe und Inkubieren bei 37 °C, 5-%-CO₂-Atmosphäre während 2–3 Stunden, Fixieren durch die May-Grünwald-Giemsa(MGG)-Färbung, und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes phagozytischer MD-APCs beispielsweise durch mikroskopische Analyse,
– sie haben die Eigenschaft, die Proliferation allogenen Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den folgenden Test bestimmt: allogene primäre Lymphozyten-Mischreaktion (MLR) wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, indem eine zunehmende Anzahl (2 × 10³ bis 2 × 10⁵) MD-APCs in 100 μl Medium/Vertiefung zu 2 × 10⁵ allogenen T-Zellen, die vom Buffy coat gereinigt wurden, in 100 μl Medium/Vertiefung zugegeben wurde und nach 5-tägiger Inkubation bei 37°C die Zellproliferation durch Messung des Brdu-Einbaus während der DNA-Synthese nach dem ELISA-Verfahren (Boehringer Mannheim, Deutschland) oder nach einem kolorimetrischen Verfahren, wie Hydrolyse von Tetrazoliumsalz WST-1 (Boehringer Mannheim, Deutschland) (leicht rot) zu Formozan (dunkelrot), bestimmt wurde.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „Makrophagen" nicht nur Makrophagen, sondern antigenpräsentierende Zellen, die von Monozyten abstammen und die hier im Folgenden als MD-APCs bezeichnet werden.
Der Ausdruck „im Wesentlichen frei von den Oberflächenantigenen CD1a und CD1c" bedeutet, dass keine solchen Oberflächenantigene vorhanden sind oder dass nur eine schwache Intensität für diese Oberflächenantigene vorhanden ist, wobei diese schwache Intensität etwa zehnmal weniger ist als die Intensität, die in Gegenwart solcher Oberflächenantigene erhalten wird, wie in Immunfluoreszenzanalyse bestimmt, oder wobei diese Intensität niedriger als 20 ist.
Im folgenden Text wird oft auf die „Abwesenheit von Oberflächenantigen CD1a und CD1c" Bezug genommen, was als „im Wesentlichen frei von solchen Antigenen", wie oben erläutert (Intensität niedriger als 20), zu verstehen ist.
Die Erfindung betrifft auch MD-APCs, die an ihrer Oberfläche Antigen MHC-II mit einer mittleren Intensität von etwa 100 bis etwa 600 präsentieren, wie durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
Die Erfindung betrifft auch Makrophagen, die im Wesentlichen frei von Oberflächenantigen CD83 sind, wie durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
Der Ausdruck „im Wesentlichen frei von Oberflächenantigen CD83" entspricht einer Intensität von weniger als 20.
Die erfindungsgemäßen MD-APCs zeigen Adhäsionseigenschaften, wie sie durch den folgenden Test bestimmt werden:
Die MD-APCs werden 2 Stunden in einem Kulturmedium (I.M.D.M. oder R.P.M.I.) an Kunststoffkolben kultiviert und der Prozentsatz (%) anhaftender Zellen wird beispielsweise durch mikroskopische Analyse quantitativ bestimmt.
Die Kulturmedien I.M.D.M. und R.P.M.I. sind im Handel erhältlich.
Die Erfindung betrifft eine MD-APC-Kultur, worin:

– etwa 10 % bis etwa 50 % der MD-APCs Antigen CD14 an ihrer Oberfläche präsentieren,
– etwa 10 % bis etwa 50 % der MD-APCs Antigen CD64 an ihrer Oberfläche präsentieren,
– etwa 80 % bis etwa 100 % der MD-APCs Antigen MHC-II an ihrer Oberfläche präsentieren,
– etwa 70 % bis etwa 100 % der MD-APCs Adhäsionseigenschaften zeigen,
– etwa 30 % bis etwa 100 % der MD-APCs Antigene CD80 und CD86 an ihrer Oberfläche präsentieren,
– etwa 30 % bis etwa 100 % der MD-APCs hohe Phagozytose-Eigenschaft zeigen, wobei jeder Makrophage die oben genannten Eigenschaften hat, die so sind, dass diese Eigenschaften gemäß den Intensitäten ausgedrückt werden, wie oben spezifiziert.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung von Makrophagen, welches die Kultur mononukleärer Zellen in einem Kulturmedium umfasst, das Histamin oder einen Agonisten des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und einen H₂- Antagonisten in Kombination mit „zusätzlichem" GM-CSF enthält.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung von MD-APCs, welches die Kultur mononukleärer Zellen in einem Kulturmedium umfasst, welches einen chemischen Liganden enthält, der Rezeptoren auf der Membran mononukleärer Zellen hat, beispielsweise Histamin oder ein Agonist des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und einen H₂-Antagonisten, in Kombination mit „zusätzlichem" GM-CSF.
Ein Beispiel für einen Agonisten des Histamin-Rezeptors ist 2-Methylhistamin.
Als Beispiel für einen H₂-Antagonisten kann man Cimetidin, aber auch Tiotidin, Burima mid, Metiamid, Ranitidin nennen.
Als Beispiel für andere chemische Liganden, die mit mononukleären Zellen wechselwirken und die Differenzierung in MD-APCs erlauben, kann man entgiftetes LPS anführen, wie Lipid A, C3 und andere Liganden von Komplement-Rezeptoren, Taxole, Oxydoreduktoren wie Flavenoide oder Polyphenole, Liganden zu CD40, zu den TNF-Rezeptoren oder zu Vitamin-D₃-Rezeptoren.
Wenn die Konzentration von Histamin oder Cimetidin oder anderer chemischer Liganden für Membranrezeptoren niedriger als der niedrigere Wert des angegebenen Bereiches ist, gibt es im Wesentlichen keinen Effekt, i.e. weniger als 10 % Differenz mit Zellen, die in Abwesenheit von Histamin und Cimetidin kultiviert wurden.
Wenn die Konzentration von Histamin oder Cimetidin höher als der höhere Wert des angegebenen Bereiches ist, wird das Kulturmedium toxisch.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem das Kulturmedium einen chemischen Liganden enthält, beispielsweise Histamin und Cimetidin oder einen H₂-Antagonisten, in Kombination mit „zusätzlichem" GM-CSF, wobei Histamin in einer Konzentration von etwa 10^–2 M bis etwa 10^–6 M, vorzugsweise etwa 10^–4 M enthalten ist, Cimetidin oder der H₂-Antagonist in einer Konzentration von etwa 10^–4 M bis etwa 10^–9 M, vorzugsweise etwa 10^–6 M enthalten ist und zusätzlicher GM-CSF in einer Konzentration von etwa 50 U/ml bis etwa 1000 U/ml, vorzugsweise etwa 500 U/ml enthalten ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren wie oben definiert, bei dem das Kulturmedium IL-13 in Kombination mit „zusätzlichem" GM-CSF enthält.
Wenn zusätzlicher GM-CSF in die Kultur eingebracht wird, beträgt die Gesamtkonzentration von GM-CSF etwa 50 U/ml bis etwa 2000 U/ml, vorzugsweise etwa 50 U/ml bis etwa 500 U/ml.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung enthält das Kulturmedium folgende Elemente nicht: exogene Zytokine, wie IL4, IL10, TNF.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, welches umfasst:

– Isolierung von Leukozyten von gesunden Probanden oder von Patienten aus dem peripheren Blut durch Apherese und Entfernen von Blutplättchen und Antikoagulans aus dem Aphereseprodukt,
– Isolieren mononukleärer Zellen (Monozyten + Lymphozyten) von roten Blutkörperchen und Granulozyten, um weniger als 10 % Granulozyten und weniger als 5 % rote Blutkörperchen zu haben,
– Kultur der im vorigen Schritt erhaltenen mononukleären Zellen, indem sie in geeignetes Kulturmedium gebracht werden, das einen chemischen Liganden mononukleärer Zellen enthält, wie Histamin oder einen Agonisten von Histamin, einen H₂-Antagonisten, wie Cimetidin, in Kombination mit GM-CSF, für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um differenzierte MD-APCs zu erhalten, vorzugsweise etwa 5 bis 15 Tage, und gegebenenfalls Abtrennung der MD-APCs von den Lymphozyten und Gewinnung der MD-APCs oder der MD-APCs und Lymphozyten.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem dem Kulturmedium der MD-APCs zugesetzt wird:

– rohe Antigene, beispielsweise autologe Tumormembran, abgetötete Tumorzellen, bakterielle Capside, virale Homogenate, die von Nukleinsäuren gereinigt sind,
– spezifische Peptide, gegen die eine Immunantwort erwünscht ist,
– cDNA oder genetisches Material, das mit Vektoren verknüpft ist (z.B. gluconiertes Polylysin), um die Transfektion der Macrophagen mit Material zu ermöglichen, das für das relevante Peptid oder Protein codiert, das an der MD-APC-Membran präsentiert werden soll und gegen das eine Immunantwort erwünscht ist,
– oder bispezifische Antikörper, die auf der einen Seite auf ein Oberflächenantigen oder einen Oberflächenrezeptor der MD-APCs, auf der anderen Seite auf ein relevantes Antigen, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, zielen („Targeting").

Die Erfindung betrifft auch MD-APCs, die nach dem hier oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren enthalten werden können.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff erfindungsgemäße MD-APCs enthalten.
Die Erfindung betrifft auch zelluläre Vakzin-Zusammensetzungen, die als Wirkstoff erfindungsgemäße MD-APCs enthalten.
Die Erfindung betrifft auch das Medium, das für das Wachstum und die Differenzierung von Monozyten in MD-APCs gemäß dieser Erfindung erforderliche Elemente enthält und das zusätzlich chemische Liganden mononukleärer Zellen enthält, wie Histamin, Cimetidin, in Kombination mit GM-CSF.
Als Beispiel für andere chemische Liganden, die mit mononukleären Zellen wechselwirken und die Differenzierung in MD-APCs erlauben, kann man entgiftete LPS wie Lipid A, C3 und andere Liganden von Komplement-Rezeptoren, Taxole, Oxydoreduktoren wie Flavenoide oder Polyphenole, Liganden zu CD40, zu den TNF-Rezeptoren oder zu Vitamin-D3-Rezeptoren nennen.
Die Erfindung betrifft auch einen Zellprozessor oder ein Kit, enthaltend:

– Mittel, um Lymphozyten und Monozyten frei von Verunreinigungen zu gewinnen,
– geeignete Puffer- und Waschlösungen und gegebenenfalls geeignete Mittel zum Konservieren von Makrophagen,
– Mittel, um eine Kultur für die Monozyten und gegebenenfalls Lymphozyten zu bereiten, chemische Liganden mononukleärer Zellen enthaltend, beispielsweise Histamin, Cimetidin oder einen H₂-Antagonist in Kombination mit GM-CSF,
– gegebenenfalls Mittel für die Transfektion kultivierter Zellen und Mittel zum Targeting von Antigenen zu MD-APCs.

Bezüglich der Konservierung von MD-APCs ist zu sagen, dass sie Mittel zum Einfrieren beispielsweise in 10%igem Glycerin oder DMSO (Dimethylsulfoxid) in Gegenwart von autologem oder AB⁺-Serum beinhalten kann.
Die Erfindung betrifft auch einen Zellprozessor oder ein Kit, wie oben beschrieben, enthaltend:

– Mittel zum Gewinnen und Zentrifugieren von Blut, um ein Leukozytenkonzentrat zu erhalten,
– Mittel zum Abtrennen von Lymphozyten und Monozyten von den anderen weißen Blutkörperchen und zum Eliminieren der verunreinigenden roten Blutkörperchen,
– Kulturmedium für MD-APCs und gegebenenfalls Lymphozyten mit Komplementen und insbesondere chemischen Liganden mononukleärer Zellen, wie Histamin und Cimetidin oder einem H₂-Antagonisten, in Kombination mit GM-CSF,
– geeignete Mittel zum Konservieren von Makrophagen,
– geeignete Puffer- und Waschlösung.

Die Erfindung betrifft auch Produkte, die erfindungsgemäße MD-APCs und Lymphozyten enthalten, als kombinierte Zubereitung für die gleichzeitige, separate oder aufeinander folgende Verwendung bei der Zelltherapie.
Die Erfindung betrifft auch Produkte, wie hier oben beschrieben, die MD-APCs und Lymphozyten in einem Verhältnis von mindestens 20 % bis 50 % MD-APCs, ausgedrückt in der Zellzahl, aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch bispezifische Antikörper, die ein Antigen eines MD-APCs gemäß der Erfindung und ein Antigen einer Tumorzelle oder eines Pathogens, das auf die MD-APCs zu zielen ist, erkennen können.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur klinischen Behandlung, umfassend die Verabreichung einer geeigneten Menge MD-APCs gemäß der Erfindung, vorzugsweise einer Menge von etwa 10⁸ bis etwa 5 × 10⁹ MD-APCs.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, umfassend die Verabreichung von Lymphozyten aus der Kultur in einer Menge von etwa 4 × 10⁹ bis etwa 10 × 10⁹ Lymphozyten.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines chemischen Liganden mononukleärer Zellen, wie eines Agonisten des Histamin-Rezeptors, insbesondere Histamin, und eines H₂-Antagonisten, insbesondere Cimetidin, in Kombination mit GM-CSF, für die Zubereitung von MD-APCs mit den folgenden Eigenschaften:

– sie präsentieren an ihrer Oberfläche: – Antigen CD14 und CD64 mit einer mittleren Intensität von etwa 5 bis etwa 200, – Antigen CD80 und CD86 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, – Antigen CD40 und Mannoserezeptor mit einer mittleren Intensität von 50 bis 500,
– sie sind im Wesentlichen frei von den Oberflächenantigenen CD1a und CD1c, i.e. mit einer mittleren Intensität von weniger als 20, wobei das Vorhandensein bzw. die mittleren Intensitäten von CD14, CD64, CD80, CD86, und die Abwesenheit von CD1a und CD1c beispielsweise durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt werden,
– sie zeigen hohe Phagozytose-Eigenschaft, wie sie durch den folgenden Test bestimmt wird: die Phagozytosekapazität wird durch Aufnahme von Formalin-fixierter Hefe be stimmt, beispielsweise durch 2-stündiges Kultivieren von MD-APCs zur Selektion adhärenter Zellen, Zugabe von Hefe in einem Verhältnis von 1/10 Makophagen/Hefe und Inkubieren bei 37 °C, 5-%-CO₂-Atmosphäre während 2–3 Stunden, Fixieren durch die May-Grünwald-Giemsa(MGG)-Färbung, und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes phagozytischer MD-APCs beispielsweise durch mikroskopische Analyse,
– sie haben die Eigenschaft, die Proliferation allogener Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den folgenden Test bestimmt: allogene primäre Lymphozyten-Mischreaktion (MLR) wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, indem verschiedene Anzahl 2 × 10³ bis 2 × 10⁵ MD-APCs in 100 μl Medium/Vertiefung zu 2 × 10⁵ allogenen T-Zellen, die vom Buffy coat gereinigt wurden, in 100 μl Medium/Vertiefung zugegeben wurden und nach 5-tägiger Inkubation bei 37°C die Zellproliferation nach einem kolorimetrischen Verfahren, wie die Spaltung von Tetrazoliumsalz WST-1 (leicht rot) zu Formozan (dunkelrot) bestimmt wurde.

Die Monozyten-abgeleiteten antigenpräsentierenden Zellen gemäß dieser Erfindung und die MD-APCs können wie folgt erhalten werden:

a) Isolierung von Leukozyten aus dem Blut durch Apherese und Eliminierung von Blutplättchen durch Zentrifugieren. Wenn gesammelte Zellen < 10 % Granulozyten und Hämatokrit < 5 % haben, können sie als solche in Kultur gebracht werden. Ansonsten müssen mononukleäre Zellen zuerst durch Zentrifugieren auf Ficoll Paque mit Dichte 1,077 bereitet werden.
b) Mononukleäre Zellen werden dann 5 bis 15 Tage in hydrophoben Beuteln aus Ethylenvinylacetat (EVA, Stedim) oder Polypropylen (Life Cell, Baxter) bei 37 °C, 5 % CO₂, kultiviert. Zellen werden bei 5.10⁶/ml in I.M.D.M. (wie zuvor) oder ein äquivalentes Medium gebracht, das ergänzt ist mit Indomethacin (5 × 10^–6 M), Mercaptoethanol (3 × 10^–5 M), nichtessentiellen Aminosäuren (1 %, Gibco) und 2 bis 5 % rekonstituiertem autologem oder AB⁺-Serum, mit GM-CSF, 500 U/ml, chemischen Liganden, die mit mononukleären Zellen wechselwirken und Differenzierung in MD-APCs erlauben, wie entgiftete LPS wie Lipid A, C3 und andere Liganden von Komplement-Rezeptoren, Taxole, Oxydoreduktoren wie Flavenoide oder Polyphenole, Liganden zu CD40, zu den TNF-Rezeptoren oder zu Vitamin-D₃-Rezeptoren; als Beispiele für Liganden Histamin (10^–4M), Cimetidin (10^–6 M) oder ein anderer H₂-Antagonist von Histamin, oder mit Histamin, Cimetidin in Abwesenheit exogener Zytokine. Endogene Zytokine werden durch mononukleäre Zellen, die durch Liganden stimuliert sind, freigesetzt; und exogenen Antigenen, Peptiden oder Transfektanten (cDNA + Vektor), die für das relevante Antigen codieren.
c) Nach dem Kultivieren werden die spezifischen Monozyten-abgeleiteten antigenpräsentierenden Zellen (MD-APCs) zentrifugiert, gewaschen und für die Injektion in den Patienten resuspendiert, um humorale und zelluläre Immunantwort gegen das Antigen zu induzieren.

Die Spezifität des zellulären Vakzins wird während der in vitro Kultur nach einem der folgenden Punkte erreicht.

a) Kultur von MD-APCs, wie oben unter (b) erläutert, in Gegenwart roher Antigene, beispielsweise autologer Tumormembran, bakterieller Capside, viraler Homogenate, die von Nukleinsäuren befreit sind;
b) Kultur von MD-APCs, wie oben unter (b) erläutert, in Gegenwart spezifischer Peptide, gegen die eine Immunantwort vorteilhaft wäre,
c) oder Kultur von MD-APCs, wie oben unter (b) erläutert, in Gegenwart von cDNA oder genetischem Material, das mit Vektoren verbunden ist (beispielsweise gluconiertes Polyphysin), um die Transfektion von MD-APCs mit Material zu erlauben, das für das relevante Peptid oder Protein codiert, das auf der Membran präsentiert werden soll.

Um spezifische zelluläre Vakzine zu erhalten, ist es auch möglich, am Ende der Differenzierungsstufe der Makrophagenkultur bispezifische Antikörper zuzusetzen, die auf ein Membran-Antigen zielen, oder einen Zuckerrezeptor für MD-APCs einerseits und das relevante Antigen andererseits.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte:

– Isolierung von Leukozyten aus dem Blut gesunder Probanden oder Patienten durch Apherese, um die Aphereseprodukte (i.e. konzentrierte Leukozyten) zu erhalten,
– Eliminierung von Blutplättchen, beispielsweise durch Zentrifugieren der Aphereseprodukte, um ein Leukozyten-angereichertes Produkt zu erhalten,
– Abtrennung der mononukleären Zellen einerseits und der verunreinigenden roten Blutkörperchen und Granulozyten andererseits aus den Leukozyten-angereicherten Produkten,
– Kultivieren der mononukleären Zellen (Monozyten + Lymphozyten) in einem Medium, das chemische Liganden mononukleärer Zellen, wie Histamin und Cimetidin und GM- CSF aufweist, während etwa 5 bis 15 Tagen, um differenzierte Monozyten-abgeleitete antigenpräsentierende Zellen (MD-APCs) zu erhalten.

Die Lymphozyten können vor dem Kultivierungsschritt von den Monozyten abgetrennt werden.
Die Lymphozyten können nach dem Kultivieren von den MD-APCs abgetrennt werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden chemische Liganden für mononukleäre Zellen, wie Histamin, in einer Konzentration von 10^–2 M bis etwa 10^–6 M, vorzugsweise etwa 10^–4 M verwendet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird GM-CSF in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 1000 U/ml, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 500 U/ml verwendet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das Kulturmedium RPMI, IMDM, MEM oder DMEM, ausgewählt hinsichtlich eines sehr niedrigen Endoxingehaltes.
Diese Medien sind im Handel erhältlich.
Vorteilhafterweise enthält das Kulturmedium Indomethacin (oder einen anderen Cyclooxygenase-Inhibitor) und/oder Cimetidin (einen Histamin H₂-Antagonisten) und/oder chemische Liganden mononukleärer Zellen.
Ein vorteilhaftes Verfahren für die Herstellung von MD-APCs gemäß dieser Erfindung ist wie folgt:
Apherese
Leukozyten von gesunden Probanden oder von Patienten werden aus dem peripheren Blut durch Apherese unter Verwendung des Cobe Spectra Durchfluss-Blutzellen-Separators abgetrennt, wobei die Verunreinigung durch Granulozyten sehr niedrig (< 10 und weniger als 5 % rote Blutkörperchen) gehalten wird. Das Aphereseprodukt wird 10 min bei 280g zentrifugiert, um die Verunreinigung durch Blutplättchen zu reduzieren. Das Blutplättchen-angereicherte Plasma wird entfernt, und das Leukozyten-Pellet wird in einer Phosphatpufferlösung (PBS), die 0,1 % Glucose, 0,17 % PO₃HNa₂, 2H₂O, 0,27 PO₃H₂Na, 0,14 % NH₄Cl, 0,78 % NaCl enthält (Lösung TS745 Laboratoire Bruneau, Frankreich), resuspendiert.
Das angereicherte Leukozyten-Pellet wird mit durchschnittlich 7 bis 1,5 × 10¹⁰ Leukozyten (50 % mononukleärer Zellen) erhalten.
Isolation mononukleärer Zellen
Wenn die gesammelten Leukozyten mehr als 10 % Verunreinigung durch Granulozyten und/oder 5 % Hämatokrit haben, werden humane mononukleäre Zellen von roten Blutkörperchen und von verunreinigenden Granulozyten durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 1000 g auf einem COBE 2991 oder Stericell Zellprozessor unter Verwendung von Ficoll Paque mit Dichte 1,077 (Pharmacia) abgetrennt. Nach dreimaligem Waschen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium werden die Monozyten mit etwa 20 % bis 50 % Reinheit gewonnen, wie Channelyser-Analyse (Coulter Margency, Frankreich) zeigt.
Kultur
Differenzierte humane MD-APC werden durch 5-15-tägiges Kultivieren mononukleärer Zellen in hydrophoben Beuteln aus EVA (Ethylenvinylacetat, STEDIM, Aubagne) oder Polypropylen (Life Cell, Baxter) bei 37 °C und 5 % CO₂, 95 % befeuchtete Atmosphäre, erhalten. Die gesamten mononukleären Zellen werden zu 5 × 10⁶ Zellen/ml in Iscovemodifiziertes Medium (I.M.D.M., Gibco) oder ein äquivalentes Medium, das durch Penicillin (100 IU/ml), Streptomycin (100 μg/ml), L-Glutamin (2 mM, Gibco), Brenztraubensäure (2 mM, Gibco), Indomethacin (5 × 10^–6 M, Sigma), Cimetidin (10^–8 bis 10^–4 M), Histamin (10^–6 bis 10^–2 M oder andere chemische Liganden), Mercaptoethanol (3 × 10^–5 M, Gibco), nichtessentielle Aminosäuren (1 %, Gibco) und 2–5 % autologes oder AB-Serum ergänzt ist, gebracht. Die Zugabe von GM-CSF (500 U/ml, SANDOZ) erfolgte in einem Vergleichsversuch.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren so, dass abgetötete Tumorzellen gleichzeitig mit Monozyten, vorzugsweise in einem Verhältnis von etwa 1 Million abgetöteter Tumorzellen/ml, in das Kulturmedium gegeben werden, wobei beide Zellarten vorzugsweise vom selben Patienten stammen und wobei die abgetöteten Tumorzellen gleichzeitig wie Makrophagen prozessiert werden.
Die abgetöteten Tumorzellen können dann gleichzeitig mit den Leukozyten prozessiert werden, in einer Menge von etwa 1 × 10⁶/ml.
Dieses Verfahren erlaubt es, MD-APCs und Lymphozyten zu erhalten, die spezifisch für den Tumor sind und die sehr wirksam in vivo eine Immunantwort auf die spezifischen Tumorzellen induzieren.
Die Erfindung betrifft auch MD-APCs, die nach dem oben definierten Verfahren erhalten werden können.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff MD-APCs, wie oben definiert, enthalten.
Die Erfindung betrifft auch ein Medium, das die Elemente enthält, die für das Wachstum und die Differenzierung von Monozyten in MD-APCs gemäß der Erfindung erforderlich sind, und zusätzlich chemische Liganden für mononukleäre Zellen, beispielsweise Histamin und GM-CSF.
Die Monozyten-abgeleiteten antigenpräsentierenden Zellen gemäß dieser Erfindung können Teil eines Zellprozessors oder eines Kits sein, enthaltend:

– Mittel, um Lymphozyten und Monozyten frei von Verunreinigungen zu gewinnen,
– geeignete Puffer- und Waschlösungen und gegebenenfalls geeignete Mittel zur Konservierung von MD-APCs,
– Mittel zur Bereitung einer Kultur für die Monozyten und gegebenenfalls die Lymphozyten, chemische Liganden für mononukleäre Zellen enthaltend, beispielsweise Histamin und/oder GM-CSF.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung enthält der Zellprozessor oder das Kit:

– Mittel zum Gewinnen und Zentrifugieren von Blut, um ein Leukozytenkonzentrat zu erhalten,
– Mittel zum Abtrennen von Lymphozyten und Monozyten von den anderen weißen Blutkörperchen und zum Eliminieren der verunreinigenden roten Blutkörperchen,
– Kulturmedium für MD-APCs und gegebenenfalls Lymphozyten mit Komplementen und insbesondere und/oder GM-CSF und gegebenenfalls Indomethacin und/oder Cimetidin;
– geeignete Mittel zum Konservieren der MD-APCs,
– geeignete Puffer- und Waschlösungen.

Die Erfindung betrifft auch Produkte, die erfindungsgemäße MD-APCs und Lymphozyten enthalten, als kombinierte Zubereitung für die gleichzeitige, separate oder aufeinander folgende Verwendung in adoptiver Immuntherapie.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Produkte, wie sie oben definiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie die MD-APCs und die Lymphozyten in einem Verhältnis von mindestens 20 % bis 50 % MD-APCs, ausgedrückt in der Zellzahl, enthalten.
In dieser Ausführungsform werden einem Patienten sowohl MD-APCs als auch Lymphozyten injiziert.
Die Erfindung betrifft auch bispezifische Antikörper, die in der Lage sind, ein Antigen einer MD-APC gemäß der Erfindung zu erkennen, beispielsweise FCγRI (CD64) und ein Antigen eines relevanten Antigens.
Die bispezifischen Antikörper können hergestellt werden, wie das von Chokri et al., Res. Immunol., 143 (1992), beschrieben wurde.
Die bispezifischen Antikörper können zur gleichen Zeit wie die erfindungsgemäßen MD-APCs injiziert werden, oder sie können vor dem Injizieren mit MD-APCs vorinkubiert werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs und Pathogenen, welches die Verabreichung einer geeigneten Menge erfindungsgemäßer MD-APCs, vorzugsweise in einer Menge von etwa 1 × 10⁸ bis etwa 5 × 10⁹ MD-APCs, beinhaltet.
Beschreibung der Figur
1a zeigt die Proliferation allogener T-Zellen, die durch erfindungsgemäße MD-APCs induziert wird, welche in Gegenwart von Histamin (10^–4 M) und Cimetidin (10^–6 M) als Adjuvans, mit oder ohne GM-CSF (100 U/ml), gesammelt wurden, im Vergleich zu Standard-Makrophagen, die nur in Gegenwart von GM-CSF (500 U/ml) hergestellt wurden.
1b zeigt die Stimulation durch MD-APCs, die in Gegenwart von GM-CSF oder GM-CSF + IL-13 gewonnen wurden.
In der 1a wurde die optische Dichte (450–690 nm) gegen das Verhältnis zwischen den erfindungsgemäßen MD-APCs und den Responder-Lymphozytenzellen aufgetragen.
Die weißen gepunkteten Balken entsprechen der Gegenwart von GM-CSF zu 500 U/ml; die hellgrauen Balken entsprechen der Gegenwart von Histamin (10^–4 M) und Cimetidin (10^–6 M ).
Die dunkelgrauen Balken entsprechen der Gegenwart von GM-CSF (500 U/ml) in Kombination mit Histamin (10^–4 M) und Cimetidin (10^–6 M).
Die Ergebnisse zeigen, dass die Fähigkeit der MD-APCs, die Proliferation allogener Lymphozyten zu stimulieren, stark erhöht ist. Die Stimulierung der allogenen Lymphozyten-Proliferation durch MD-APCs ist sehr potent (mindestens 200 % Zunahme bezogen auf Standard-Makrophagen). Die Kombination des Histamin/Cimetidin-Effekts oder des IL-13-Effektes mit GM-CSF kann diese Aktivität potenzieren (maximal 300 % Zunahme bezogen auf die Induktion durch Makrophagen).
In der 1b wurde die optische Dichte (450–690 nm) gegen das Verhältnis zwischen den erfindungsgemäßen MD-APCs und den Responder-Lymphozytenzellen aufgetragen. Die Kurven mit dunklen Kästchen entsprechen der Gegenwart von GM-CSF/IL-13 und die Kurve mit den Kreisen entspricht der Gegenwart von GM-CSF.
Beispiel: Herstellung von MD-APCs gemäß dieser Erfindung
1 – Apherese:
Leukozyten von gesunden Probanden oder von Patienten werden aus dem peripheren Blut durch Apherese unter Verwendung des Cobe Spectra Blutzellen-Separators abgetrennt, wobei die Verunreinigung durch Granulozyten möglichst niedrig gehalten wird. Das Aphereseprodukt wird in phosphatgepufterter Lösung (PBS) (Endvolumen = 450 ml) verdünnt. Das Aphereseprodukt wird 10 min bei 2808 zentrifugiert, um Blutplättchen und Antikoagulans zu entfernen.
2 – Isolierung mononukleärer Zellen
Wenn die gesammelten Zellen > 10 % Granulozytenverunreinigung und/oder > 5 % Hä matokrit haben, sollten sie über Ficoll Paque (Dichte = 1,077) zentrifugiert werden, um rote Blutkörperchen und Granulozyten zu entfernen.
3 – Kultur:
Die Monozyten-abgeleiteten antigenpräsentierenden Zellen (MD-APCs) werden nach 5- bis 15-tägigem Kultivieren mononukleärer Zellen in hydrophoben Beuteln aus EVA (Ethylenvinylacetat/STEDIM) oder äquivalenten Beuteln (Teflon) bei 37 °C und 5 % CO₂ in befeuchteter Atmosphäre gewonnen. Die mononukleären Zellen werden zu 5 × 10⁶ Zellen/ml in Iscove-modifiziertes Medium (I.M.D.M., Gibco) oder ein äquivalentes Medium gebracht, das durch Zugabe (siehe PCT/EP93 Seite 7) von Liganden für mononukleäre Zellen ergänzt wurde, wie Histamin (10^–4 M) oder Analoga und Cimetidin (10^–6 M) oder ähnliche H₂-Antagonisten, in Gegenwart oder Abwesenheit von GM-CSF (500 U/ml).
Als Beispiel für andere chemische Liganden, die mit mononukleären Zellen wechselwirken und die Differenzierung in MD-APCs ermöglichen, kann man nennen: entgiftete LPS wie Lipid A, C3 und andere Liganden von Komplement-Rezeptoren, Taxole, Oxydoreduktoren wie Flavenoide oder Polyphenole, Liganden zu CD40, zu den TNF-Rezeptoren oder zu Vitamin-D₃-Rezeptoren.
4 – Charakterisierung und Funktionalität
a – Durchflusszytometrie
Nach der Reifung von MD-APCs erfolgte die Phänotyp-Analyse der erhaltenen Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von murinem FITC- oder P.E.-markierten monoklonalen Antikörpern, die gegen Membranproteine gerichtet sind.
b – Lymphozyten-Mischreaktionen (MLR)
Um die Induktion der T-Zell-Antwort auf MD-APCs zu bewerten, wurde allogene primäre MLR in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, indem verschiedene Anzahl von MD-APCs zu 2 × 10⁵ allogenen T-Zellen zugegeben wurde, die vom Buffy coat gereinigt waren. Nach 5 Tagen bei 37 °C wurde die Zellproliferation nach einem kolorimetrischen Verfahren, wie WST-1, bestimmt.
c – Phagozytose
Die Phagozytosekapazität der verschiedenen erhaltenen Zellen wurde durch die Aufnahme von Formalin-fixierter Hefe bestimmt. Kurz gesagt, wurden die Zellen 2 Stunden kultiviert, um adhärente Zellen zu selektieren. Die Hefe wurde in einem Verhält nis von 1/10 Makrophagen/Hefe zugesetzt, und es wurde 2 bis 3 Stunden bei 37 °C, 5-%-CO₂-Atmosphäre inkubiert und dann durch die May-Grünwald-Giemsa(MGG)-Färbung fixiert. Der Prozentsatz der phagozytischen Zellen wurde durch mikroskopische Analyse quantitativ bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 angeführt.
Tabelle 1
Die Tabelle 1 zeigt, dass es zur Gewinnung einer großen Menge MD-APCs nach 5 bis 11 Tagen Kultur mononukleärer Zellen in hydrophoben Beuteln in Gegenwart von Histamin (10^–4 M) und Cimetidin (10^–6 M) (a) und zusätzlichem GM-CSF (500 U/ml) (b) als Adjuvans kommt. Im Vergleich zur Produktion reifer Makrophagen unter Standardbedingungen ist die Gewinnung von MD-APCs in der gleichen Größenordnung.
Tabelle 2 Phänotyp von MD-APCs, die unter verschiedenen Bedingungen nach 6 Tagen Kultur produziert wurden
Diese Tabelle entspricht der Immunfluoreszenzprofilanalyse mittels Durchflusszytometrie von MD-APCs, die in Kultur (6 Tage) unter unterschiedlichen Bedingungen erzeugt wurden. Die Zellen, die unter Bedingungen mit Histamin (10^–4 M) und Cimetidin (10^–6 M) (a) erhalten wurden, sind in Bezug auf Makrophagenmarker (CD14, CD64 und HLA-DR) positiv. Die Kombination mit GM-CSF (b) ändert das phänotypische Profil der MD-APCs nicht. Sie exprimieren auch klar CD54 und CD58. CD80 (B7.1) und CD86 (B7.2) werden ebenfalls auf ihrer Membran exprimiert, aber auf geringerem Niveau. Im Gegensatz dazu werden CD1a, CD1c und CD83, die positive Marker dendritischer Zellen sind, von den MD-APCs schwach exprimiert.
Anhand dieser Daten kann bestätigt werden, dass die antigenpräsentierenden Zellen, die in dem erfindungsgemäßen Kultursystem gebildet werden, von dendritischen Zellen verschieden sind.
Tabelle 3 % phagozytischer Zellen nach 3 h Kontakt mit fixierter Hefe
Die MD-APCs werden hinsichtlich der phagozytischen Aktivität unter Verwendung von Formalin-fixierter Hefe untersucht. Nach 3 h Inkubation und MGG(May-Grünwald-Giemsa)-Färbung werden die intrazellulären Partikel durch mikroskopische Analyse quantitativ bestimmt. Die in Gegenwart von Histamin/Cimetidin (a) gebildeten MD-APCs zeigen bedeutende Phagozytosekapazität (60 %) und diese Kapazität erhöht sich in Gegenwart von GM-CSF in der Kultur (80 %) (b).
Anhand der obigen Ergebnisse wird gezeigt, dass humane mononukleärer Zellen, die in Gegenwart von Histamin und Cimetidin kultiviert werden, jeweils in Kombination mit oder ohne GM-CSF, hauptsächlich während 1 Woche, in reife antigenpräsentierende Zellen differenzieren. Während des Kultivierens erwerben diese Zellen ein hohes Niveau akzessorischer Funktionen wie.
Die Ergebnisse der Erfindung zeigen, dass die in dem erfindungsgemäßen Kultursystem erhaltenen MD-APCs von den dendritischen Zellen (DC) verschieden sind, da DC als FC(CD64)-Rezeptor-negativ, schlecht haftend und nicht-phagozytische Zellen beschrieben wurden, die nur eine kleine Zahl Lysosome besitzen.
Im Gegensatz dazu die erfindungsgemäßen MD-APCs, sie:

(a) zeigen hohes Adhäsionsvermögen,
(b) zeigen bedeutende phagozytische und Prozessierungsaktivität,
(c) exprimieren auf hohem Niveau HLA-DR Membran-Antigene und auf niedrigem Niveau CD1a und CD1c, das durch dendritische Zellen stark exprimiert wird,
(d) sind auch positiv in Bezug auf CD54, CD58, CD80 und CD86 Membran-Antigene,
(e) stimulieren T-Zellproliferation in allogener MLR-Reaktion, und das in weit besserer Art als Makrophagen, die nach Methoden des Standes der Technik erhalten werden.

Die nachstehende Tabelle 4 stellt die vergleichende Charakterisierung von erfindungsgemäßen MD-APCs einerseits und dendritischen Zellen andererseits gegenüber.
Tabelle 4 Vergleichende Charakterisierung antigenpräsentierender Zellen
Tabelle 5:
Sie stellt eine vollständige phänotypische Charakterisierung von MD-APCs zusammen, die nach 6 Tagen Kultur gemäß der Erfindung (Analyse mittels Durchflusszytometrie) gewonnen wurden.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die Monazytenabgeleitete antigenpräsentierende Zellen (MD-APCs) aufweist, wobei das Verfahren umfasst: – Ausgehen von einer Zusammensetzung, die Leukozyten enthält, die von gesunden Spender oder von Patienten stammen, und die aus peripherem Blut durch Apherese erhalten wurden, – Entfernen von Blutplättchen und Antikoagulans aus dem Aphereseprodukt, wie durch Zentrifugieren des Aphereseproduktes, – Isolieren mononukleärer Zellen (Monozyten + Lymphozyten) von roten Blutkörperchen und Granulozyten, um weniger als 10% Granulozyten und weniger als 5% rote Blutkörperchen zu haben, – Kultur der im vorigen Schritt erhaltenen mononukleären Zellen, indem sie in hydrophoben Beuteln in ein geeignetes Kulturmedium gebracht werden, das als einzige chemische Liganden, die Rezeptoren an der Membran mononukleärer Zellen haben: – Histamin oder Agonist des Histamin-Rezeptors (H1 in Aktion) und einen H2-Antagonisten - oder IL-13 in Kombination mit zusätzlichem exogenen GM-CSF enthält, für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um differenzierte MD-APCs zu erhalten, vorzugsweise etwa 5 bis 15 Tage, und gegebenenfalls Abtrennung der MD-APCs von den Lymphozyten und Gewinnung der MD-APCs und Lymphozyten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Entfernung der Blutplättchen und des Antikoagulans aus dem Aphereseprodukt so ist, wie sie durch Zentrifugieren des Aphereseproduktes für 10 min bei 280 g erhalten wird.
Verfahren nach den Ansprüche 1 oder 2, wobei das Kulturmedium – Histamin oder einen Agonisten des Histamin-Rezeptors (H1 in Aktion) – einen H₂-Antagonisten in Kombination mit zusätzlichem exogenen GM-CSF enthält.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Kulturmedium IL-13 in Kombination mit zusätzlichem exogenen GM-CSF enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Kulturmedium Histamin und einen H₂-Antagonisten in Kombination mit zusätzlichem GM-CSF enthält, wobei Histamin in einer Konzentration von etwa 10^–2 M bis etwa 10^–6 M, vorzugsweise etwa 10^–4 M enthalten ist, der H₂-Antagonist in einer Konzentration von etwa 10^–4 M bis etwa 10^–9 M, vorzugsweise etwa 10^–6 M enthalten ist und zusätzliches GM-CSF in einer Konzentration von etwa 50 U/ml bis etwa 1000 U/ml, vorzugsweise etwa 500 U/ml enthalten ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5, worin: – der Agonist des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) 2-Methylhistamin ist und/oder – der H₂-Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cimetidin, Tiotidin, Burinamid, Metiamid und Ranitidin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, worin das Kulturmedium IL-13 und zusätzliches exogenes GM-CSF enthält, wobei das zusätzliche GM-CSF in einer Konzentration von etwa 50 U/ml bis etwa 1000 U/ml, vorzugsweise etwa 500 U/ml enthalten ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei dem Kulturmedium der MD-APCs mindestens eines der folgenden Elemente zugesetzt wird: – rohe Antigene, beispielsweise autologe Tumormembran, abgetötete Tumorzellen, bakterielle Capside, virale Homogenate, die von Nukleinsäuren gereinigt sind, – spezifische Peptide, gegen die eine Immunantwort erwünscht ist, – cDNA oder genetisches Material, das mit Vektoren verknüpft ist (z.B. gluconiertes Polylysin), um die Transfektion der MD-APCs mit Material zu ermöglichen, das für das relevante Peptid oder Protein codiert, das an der MD-APC-Membran präsentiert werden soll und gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, – bispezifische Antikörper, die auf der einen Seite auf ein Oberflächenantigen der MD-APCs, auf der anderen Seite auf ein relevantes Antigen, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, zielen.
Monozyten-abgeleitete antigenpräsentierende Zellen (MD-APCs), die nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhalten wurden.
MD-APCs nach Anspruch 9 mit den folgenden Eigenschaften: – sie präsentieren an ihrer Oberfläche: – Antigen CD 14 und CD64 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, – Antigen CD80 und CD86 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, – Antigen CD40 und Mannoserezeptor mit einer mittleren Intensität von etwa 50 bis etwa 500, – Antigene CD1a und CD1c mit einer mittleren Intensität von weniger als 20, wobei das Vorhandensein bzw. die mittleren Intensitäten von CD 14, CD64, CD80, CD86, CD40, Mannoserezeptor, CD1a und CD1c durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt werden, – sie zeigen eine Phagozytose-Eigenschaft, wie sie durch den folgenden Test bestimmt wird: die Phagozytosekapazität wird bestimmt durch Aufnahme von Formalinfixierter Hefe, durch 2-stündiges Kultivieren von Makrophagen, Zugabe von Hefe in einem Verhältnis von 1/10 Makrophagen/Hefe und Inkubieren bei 37°C, 5%-CO₂-Atmosphäre während 2–3 Stunden, Fixieren durch die May-Grünwald-Giemsa (MGG)-Färbung, und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes phagozytischer MD-APCs beispielsweise durch mikroskopische Analyse, – sie haben die Eigenschaft, die Proliferation allogener Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den folgenden Test bestimmt: allogene primäre Lymphozyten-Mischreaktion (MLR) wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, indem verschiedene Anzahl MD-APCs (2 × 10³ bis 2 × 10⁵ in 100 μl Medium/Vertiefung) zu 2 × 10⁵ allogenen T-Zellen, die vom Buffy coat gereinigt wurden, in 100 μl Medium/Vertiefung zugegeben wurden und nach 5-tägiger Inkubation bei 37°C die Zellproliferation nach einem kolorimetrischen Verfahren, wie Hydrolyse von Tetrazoliumsalz WST-1 (Boehringer Mannheim, Deutschland)(leicht rot) zu Formozan (dunkelrot), bestimmt wurde.
MD-APCs nach Anspruch 9 oder 10, die eine Phagozytosekapazität von 80% zeigen.
MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 11, die an ihrer Oberfläche Antigen MHC-II mit einer mittleren Intensität von etwa 100 bis etwa 400 präsentieren, wie durch Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 12, die im Wesentlichen kein Oberflächenantigen CD83 aufweisen, wie durch Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 13, die Adhäsionseigenschaften zeigen, wie sie durch den folgenden Test bestimmt werden: 2-stündiges Kultivieren der Makrophagen in einem Kulturmedium (I.M.D.M. oder R.P.M.I) an Kunststoffkolben und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes (%) der adhärenten Zellen beispielsweise durch mikroskopische Analyse.
Monozyten-abgeleitete antigenpräsentierenden Zellen (MD-APCs) mit den folgenden Eigenschaften: – sie präsentieren an ihrer Oberfläche: – Antigen CD14 und CD64 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, – Antigen CD80 und CD86 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, – Antigen CD40 und Mannoserezeptor mit einer mittleren Intensität von etwa 50 bis etwa 500, – Antigene CD1a und CD1c mit einer mittleren Intensität von weniger als 20, wobei das Vorhandensein bzw. die mittleren Intensitäten von CD14, CD64, CD80, CD86, CD40, Mannoserezeptor, CD1a und CD1c durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt werden, – sie zeigen eine Phagozytose-Eigenschaft, wie sie durch den folgenden Test bestimmt wird: die Phagozytosekapazität wird bestimmt durch Aufnahme von Formalinfixierter Hefe, durch 2-stündiges Kultivieren von Makrophagen, Zugabe von Hefe in einem Verhältnis von 1/10 Makrophagen/Hefe und Inkubieren bei 37°C, 5%-CO₂-Atmosphäre während 2–3 Stunden, Fixieren durch die May-Grünwald-Giemsa (MGG)-Färbung, und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes phagozytischer MD-APCs beispielsweise durch mikroskopische Analyse, – sie haben die Eigenschaft, die Proliferation allogener Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den folgenden Test bestimmt: allogene primäre Lymphozyten-Mischreaktion (MLR) wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, indem verschiedene Anzahl MD-APCs (2 × 10³ bis 2 × 10⁵ in 100 μl Medium/Vertiefung) zu 2 × 10⁵ allogenen T-Zellen, die vom Buffy coat gereinigt wurden, in 100 μl Medium/Vertiefung zugegeben wurden und nach 5-tägiger Inkubation bei 37°C die Zellproliferation nach einem kolorimetrischen Verfahren, wie Hydrolyse von Tetrazoliumsalz WST-1 (Boehringer Mannheim, Deutschland) (leicht rot) zu Formozan (dunkelrot), bestimmt wurde.
MD-APCs nach Anspruch 15, die eine Phagozytosekapazität von 80 % zeigen.
MD-APCs nach einem der Ansprüche 15 oder 16, die an ihrer Oberfläche Antigen MHC-II mit einer mittleren Intensität von etwa 100 bis etwa 400 präsentieren, wie durch Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
MD-APCs nach einem der Ansprüche 15 bis 17, die im Wesentlichen kein Oberflächenantigen CD83 aufweisen, wie durch Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
MD-APCs nach einem der Ansprüche 15 bis 18, die Adhäsionseigenschaften zeigen, wie sie durch folgenden Test bestimmt werden: 2-stündiges Kultivieren der Makrophagen in einem Kulturmedium (I.M.D.M. oder R.P.M.I) an Kunststoffkolben und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes (%) adhärenter Zellen beispielsweise durch mikroskopische Analyse.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 19 enthalten.
Zelluläre Vakzin-Zusammensetzungen, die als Wirkstoff MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 19 enthalten.
Medium, das die für das Wachstum und die Differenzierung der Monozyten in MD-APCs gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erforderlichen Elemente aufweist, das als einzige chemische Liganden, die Rezeptoren an der Membran mononukleärer Zellen haben, – Histamin oder Agonist des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und einen H₂-Antagonisten wie Cimetidin, – oder IL-13 in Kombination mit zusätzlichem exogenen GM-CSF aufweist.
Medium nach Anspruch 21, das – Histamin oder einen Agonisten des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und – einen H₂-Antagonisten und zusätzliches exogenes GM-CSF enthält.
Medium nach einem der Ansprüche 21 bis 23, das Histamin und einen H₂-Antagonisten in Kombination mit zusätzlichem exogenen GM-CSF enthält, wobei Histamin in einer Konzentration von etwa 10^–2 M bis etwa 10^–6 M, vorzugsweise etwa 10^–4 M enthalten ist, der H₂-Antagonist in einer Konzentration von etwa 10^–4 M bis etwa 10^–9 M, vorzugsweise etwa 10^–6 M enthalten ist und zusätzliches exogenes GM-CSF in einer Konzentration von etwa 50 U/ml bis etwa 1000 U/ml, vorzugsweise etwa 500 U/ml enthalten ist.
Medium nach einem der Ansprüche 21 bis 24, worin: – der Agonist des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) 2-Methylhistamin ist und/oder – der H₂-Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cimetidin, Tiotidin, Burinamid, Metiamid und Ranitidin.
Medium nach Anspruch 25, worin der H₂-Antagonist Cimetidin ist.
Medium nach Anspruch 22, worin dem Kulturmedium IL-13 und GM-CSF zugesetzt sind, wobei das zusätzliche exogene GM-CSF in einer Konzentration von etwa 50 U/ml bis etwa 1000 U/ml, vorzugsweise etwa 500 U/ml enthalten ist.
Zellprozessor oder Kit, enthaltend: – Mittel, um Lymphozyten und Monozyten frei von Verunreinigungen zu gewinnen, – geeignete Puffer- und Waschlösungen und gegebenenfalls geeignete Mittel zur Konservierung Monozyten-abgeleiteter antigenpräsentierender Zellen (MD-APCs), – Mittel zum Bereiten einer Kultur für die Monozyten und gegebenenfalls die Lymphozyten, das als einzige chemische Liganden, die Rezeptoren an der Membran mononukleärer Zellen haben, – Histamin oder einen Agonisten des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und einen H₂-Antagonisten, wie Cimetidin, - oder IL-13 in Kombination mit GM-CSF, enthält, – gegebenenfalls Mittel zur Transfektion kultivierter Zellen und Mittel zum Targeting von Antigenen zu MD-APCs.
Zellprozessor oder Kit nach Anspruch 28, enthaltend: – Histamin oder einen Agonisten des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und – einen H₂-Antagonisten in Kombination mit GM-CSF.
Zellprozessor oder Kit nach Anspruch 28, IL-13 und GM-CSF enthaltend.
Zellprozessor oder Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 28, Mittel zum Bereiten einer Kultur für die Monozyten und gegebenenfalls die Leukozyten enthaltend und Histamin und Cimetidin enthaltend.
Zellprozessor oder Kit nach Anspruch 30, Mittel zum Bereiten einer Kultur für die Monozyten und gegebenenfalls die Leukozyten enthaltend und IL-13 und GM-CSF enthaltend.
Zellprozessor oder Kit nach einem der Ansprüche 28 bis 32, enthaltend: – Mittel zum Gewinnen und Zentrifugieren von Blut, um ein Leukozytenkonzentrat zu erhalten, – Mittel zum Abtrennen von Lymphozyten und Monozyten von den anderen weißen Blutkörperchen und zum Eliminieren der verunreinigenden roten Blutkörperchen, – Kulturmedium für MD-APCs und gegebenenfalls Lymphozyten mit Komplementen und insbesondere als einzige chemische Liganden, die Rezeptoren an der Membran mononukleärer Zellen haben, Histamin oder einen Agonisten des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und einen H₂-Antagonisten, wie Cimetidin, oder IL-13, in Kombination mit GM-CSF, – geeignete Mittel zum Konservieren von MD-APCs, – geeignete Puffer- und Waschlösung.
Zellprozessor oder Kit nach Anspruch 28, Kulturmedium für MD-APCs und gegebenenfalls Lymphozyten enthaltend, wobei die Komplemente Histamin und Cimetidin sind, in Kombination mit GM-CSF.
Zellprozessor oder Kit nach Anspruch 27, Kulturmedium für MD-APCs und gegebenenfalls Lymphozyten enthaltend, wobei die Komplemente IL-13 und GM-CSF sind.
Produkte, die MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 17 und Lymphozyten enthalten, als kombinierte Zubereitung für die gleichzeitige, getrennte oder aufeinander folgende Verwendung in der Zelltherapie.
Produkte nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass sie die MD-APCs und die Lymphozyten in einem Verhältnis von mindestens 20% bis 50% MD-APCs, ausgedrückt durch die Zellzahl, enthalten.
Verwendung von MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 17 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs und Infektionen durch Pathogene.
Verwendung von MD-APCs nach einem der Ansprüche 9 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die Phagozytose involviert, und Stimulierung der Proliferation von T-Lymphozyten.
Verwendung nach Anspruch 38 oder 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament etwa 10⁸ bis etwa 5 × 10⁹ MD-APCs enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 38 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament auch Lymphozyten enthält.
Verwendung von Histamin oder eines Agonisten des Histamin-Rezeptors (H₁ in Aktion) und eines H₂-Antagonisten, insbesondere Cimetidin, oder von IL-13, in Kombination mit GM-CSF, zur in vitro Herstellung von Monozyten-abgeleiteten antigenpräsentierenden Zellen (MD-APCs) mit den folgenden Eigenschaften: – sie präsentieren an ihrer Oberfläche: Antigen CD 14 und CD64 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, Antigen CD80 und CD86 mit einer mittleren Intensität von etwa 20 bis etwa 200, Antigen CD40 und Mannoserezeptor mit einer mittleren Intensität von 50 bis 500, CD1a und CD1c mit einer mittleren Intensität von weniger als 20, wobei das Vorhandensein bzw. die mittleren Intensitäten von CD14, CD64, CD80, CD86, CD40, Mannoserezeptor, CD1a und CD1c durch Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt werden, – sie zeigen hohe Phagozytose-Eigenschaft, wie sie durch den folgenden Test bestimmt wird: die Phagozytosekapazität wird bestimmt durch Aufnahme von Formalinfixierter Hefe, durch 2-stündiges Kultivieren von MD-APCs zur Selektion adhärenter Zellen, Zugabe von Hefe in einem Verhältnis von 1/10 MD-APCs/Hefe und Inkubieren bei 37°C, 5%-CO₂-Atmosphäre während 2–3 Stunden, Fixieren durch die May-Grünwald-Giemsa (MGG)-Färbung, und quantitative Bestimmung des Prozentsatzes phagozytischer MD-APCs beispielsweise durch mikroskopische Analyse, – sie haben die Eigenschaft, die Proliferation allogener Lymphozyten zu stimulieren, wie durch den folgenden Test bestimmt: allogene primäre Lymphozyten-Mischreaktion (MLR) wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, indem verschiedene Anzahl (2 × 10³ bis 2 × 10⁵ in 100 μl Medium/Vertiefung) MD-APCs zu 2 × 10⁵ allogenen T-Zellen, die vom Buffy coat gereinigt wurden, in 100 μl Medium/Vertiefung zugegeben wurden und nach 5-tägiger Inkubation bei 37°C die Zellproliferation nach einem kolorimetrischen Verfahren, wie die Spaltung von Tetrazoliumsalz WST 1 (leicht rot) zu Formozan (dunkelrot), oder wie Brdu-Einbau während der DNA-Synthese, bestimmt wurde.