DE60016567T2

DE60016567T2 - Makrophagenhaltige zusammensetzung mit antiinfektiösen und hematopoietischen eigenschaften sowie deren herstellungsmethode

Info

Publication number: DE60016567T2
Application number: DE60016567T
Authority: DE
Inventors: Bernard Klein; Yang Zhao LU; Jacques Bartholeyns
Original assignee: IDM Immuno Designed Molecules; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Current assignee: IDM Immuno Designed Molecules; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: DE60016567D1; AU782937B2; AU2293800A; EP1150694A1; WO2000045827A1; EP1150694B1; ATE284220T1; US6737051B1; CA2361608A1; ES2233327T3

Description

Die Erfindung betrifft eine Zellzusammensetzung, welche Makrophagen enthält und welche anti-infektive and haematopoietische Eigenschaften zeigt, sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben.
Zur Sammlung haematopoietischer Vorläuferzellen ist die periphäre haematopoietische Apherese ein häufig benutztes Verfahren als Alternative zur Knochenmarkspunktierung und anschließender Aufreinigung. Diese Zellen werden in allogenen oder autologen Transplantationen zur Behandlung genetisch bedingter Krankheiten sowie hauptsächlich bei neoplastischen Erkrankungen zur Unterstützung von hochdosierter Chemotherapie oder Radiotherapie eingesetzt.
Positive Selektion der Aphereseprodukte für Zellen, welche das CD34 Antigen (CD34+ Stammzellen) tragen, sowie Kryokonservierung bis zum Gebrauch ist die anerkannte Methode der Wahl.
Sie leidet jedoch unter verschiedenen Nachteilen, einschließend Kostenaspekte (der Prozess der Selektion der Zellen durch mit Antikörpern beschichteten Partikeln), eine limitierte Anzahl von Vorläuferzellen, die auf diesem Wege erhalten werden, sowie Verzögerungen in der Wiederherstellung des Immunsystems (resultierend in infektiösen Komplikationen in der der Transplantation folgenden Periode).
Die Anzahl der Vorläuferzellen im Blut kann durch der Apherese vorhergehende Einstellung des behandelten Patienten mit GM-CSF und / oder G-CSF koloniestimulierenden Faktoren und eventuell mit einem chemotherapeutischen Arzneimittel wie einem Cyclophosphamid erhöht werden.
Krebspatienten jedoch erleiden häufig Rezidive als Folge der Präsenz residualer Tumorzellen, welche der Behandlung gegenüber resistent sind (Bhatia M et al.: Quantitative analysis reveals expansion of human hematopoietic repopulating cells after short-term ex vivo culture. J Exp Med. 186: 619–624, 1997; Bonnet D et al.: Cytokine treatment or accessory cells are required to initiate engrafment of purified primitive human hematopoietic cells transplanted at limiting doses into NOD/SCID mice, Bone Marrow Transplant. 23: 203–209, 1999, Breems DA et al.: Stroma-contact prevents loss of hematopoietic stemm cell quality during ex vivo expansion of CD34+ mobilized peripheral blood stem cells. Blood. 91: 111–117, 1998; Civin et al.: Highly purified CD34+ positive cells reconstitute hematopoiesis. J Clin Oncol. 14: 2224–2233, 1996; Morrison SJ et al.: The biology of hematopoietic stem cells. Annu Rec Cell Dev Biol. 11:35–71, 1995; Traycoff CM et al.: Proliferation-induced decline of primmitive hematopoietic progenitor cell activity is coupled with an increased in apoptosis of ex vivo expanded CD34+ cells. Exp Hematol. 26: 53–62, 1998).
Ein Ziel der Erfindung ist es, eine neue Zellzusammensetzung, die Makrophagen enthält, zu erstellen, welche interessante Eigenschaften in der Krebs-Immuntherapie und in der Stammzellentransplantation aufweist.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Zurverfügungstellung einer neuen Methode zur Zellbildung, die unter verbesserten standardisierten Methoden die Ausbreitung von Vorläufer- und Stammzellen aus periphärem Blut ohne kostenspielige Reinigung einer definierten Zellpopulationen ermöglicht.
Die Ziele der Erfindung werden mit der Zellzusammensetzung, bestehend aus Makrophagen, myeloiden Zellen und Vorläuferzellen vorzugsweise in einem niedrigen Verhältnis von rund 1%, vorzugsweise 0,1 zu 20%, erreicht. Die genannten myeloiden Zellen sind in der bevorzugten Menge von rund 10% zu 30% vorhanden, die Makrophagen in einer Menge von 10% zu 70%, wobei die Prozentangaben im Verhältnis zur Gesamtmenge der Zellen ausgedrückt werden.
Makrophagen, myeloide Zellen und Vorläuferzellen werden als CD 14+ und CD 64+ (Makrophagen) Zellen, CD 33+ (myeloide Zellen) und CD 34+ Zellen und/oder GM-CFU (Vorläuferzellen) definiert. GM-CFU sind Zellen mit der Fähigkeit, innerhalb von 14 Tagen Kolonien von Granulozyten und Makrophagen in einer halbfesten Kultivierungslösung, welche Cytokine beinhaltet, zu bilden.
GEMM-CFU sind myeloide Stammzellen, die BFU-E, CFU-GM, CFU-M, CFU-EO und CFU-B ergeben können. BFU-E sind Vorläuferzellen mit der Fähigkeit, sich in Erythrozyten zu differenzieren.
Entsprechend einer vorteilhaften Ausführungsform enthält die erfinderische Zellzusammensetzung T Lymphozyten vorzugsweise im Verhältnis 10 zu 60% ausgehend von der Gesamtmenge der Zellen.
Entsprechend einer vorteilhaften Ausführungsform enthalten die Vorläuferzellen knapp 0,1 bis 20 % der Stammzellen Im Verhältnis zur Gesamtmenge der Vorläuferzellen. Stammzellen werden über ihre CD 34 Moleküle und/oder ihre Fähigkeit, Kolonien in einer halbfesten, Cytokine enthaltenden Kultivierungslösung bilden zu können, definiert.
Entsprechend einer vorteilhaften Ausführungsform werden die Vorläuferzellen aus peripheralen mononuklearen Blutzellen gebildet, in denen sie möglicherweise auch einbezogen sind. Im Besonderen sind sie dabei zu aus den Folgenden ausgesucht: Myelo-erythroide Vorläuferzellen, myeloide Vorläuferzellen, lymphoide Vorläuferzellen und eine Mischung hieraus.
Der Ausdruck „einbezogen" bedeutet, dass die Vorläuferzellen in der Zellzusammensetzung vorhanden sind.
Der Ausdruck „gebildet aus" bedeutet, dass die Vorläuferzellen von den eigentlich in der Zellzusammensetzung vorhandenen Stammzellen differenziert werden.
In der erfinderischen Zellzusammensetzung werden Makrophagen, myeloide Zellen und Lymphozyten, wenn vorhanden, einbezogen oder aus den mononuklearen Blutzellen gebildet. Die Zellzusammensetzung der Erfindung hat eine neue Kombination geeigneter Eigenschaften bei der Krebs-Immuntherapie und Stammzellentransplantation erreicht. Diese Eigenschaften beinhalten:

1) die Entfernung von eventuell vorhandenen Tumorzellen im Transplantat durch Makrophagen und cytotoxischen T/NK Zellen,
2) Vernichtung der verbliebenen Krebserkrankungen im Patienten durch Makrophagen und/oder Antigen darstellende Zellen (MAC-DCs dendritische Zellen) vorhanden im autologen oder allogenen Transplantat,
3) Verhinderung der meisten infektiösen Folgen nach einer Injektion am Anfang der nach einer Aplasiephase folgenden therapeutischen Behandlung des Patienten und einer möglichen Verunreinigung der polynuklearen Zellen und ihrer Vorläufer, welche im Produkt vorhanden sind, dank der wirkungsvollen anti-viralen, antibakteriellen und anti-parasitischen Eigenschaften der Makrophagen,
4) Förderung der Transplantatannahme durch die erhöhte Anzahl von Stammzellen, haematopoietischen Zellen, Vorläufern von myeloiden, erythroiden und lymphoiden Zellen als auch von Zellen, die sich im Zwischenstadium der Differenzierung befinden, im Transplantat,
5) Bedeutende Verkürzung der Aplasiephase (einher gehend mit Fieber und Infektionen beim Patienten) durch eine deutliche Erhöhung der Genesungsrate verschiedener Blutpopulationen.

Die Erfindung bezieht sich auch auf die Vorbereitung einer Zellzusammensetzung, welche Makrophagen, myeloide Zellen und Vorläuferzellen beinhaltet. Die genannten Vorläuferzellen sind vorzugsweise in einer Menge von knapp 0,1% bis 10% vorhanden, wobei genannte Makrophagen vorzugsweise in einer Menge von 10 bis 60% enthalten sind, und wobei diese Prozentsätze auf der Berücksichtigung der gesamten Zellmenge beruhen, nachdem die Vorläuferzellen im Blut des Patienten mobilisiert wurden, z. B. nachdem der oben genannte Patient vormedizinisch mit G-CSF und/oder GM-CSF, oder G-CSF und Zyklophosphamiden behandelt wurde, so dass dies zur Erhöhung der Anzahl an Vorläuferzellen in peripheralem Blut geführt hat.
Der Terminus „Mobilisierung" bedeutet in diesem Zusammenhang die Stimulation von Knochenmarkszellen zur Freisetzung einer erhöhten Anzahl an Vorläuferzellen im Blut.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann einen zusätzlichen Schritt zur Kokultivierung mononuklearer Blutzellen und Vorläufern umfassen, der nach der Herauswaschen der Blutplättchen, der Granulozyten und Erythrozyten für ungefähr 4 bis 10 Tage in einem Medium, welches eine Differenzierung von Monozyten in Makrophagen und myeloide Vorläufer in polynukleare Zellen erlaubt, besteht.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kokultivierung von mononukulären Blutzellen und Vorläufern in der Anwesenheit von Zytokinen oder Wachstumsfaktoren durchgeführt, z. B. IL3, IL6, Stammzellfaktor, EPO, Thrombopoietin, GM-CSF, G-CSF, Flat-3 ligand, c-kit ligand oder deren Agonisten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch den zusätzlichen Schritt einer Makrophagenaktivierung am Ende der Kokultivierung, z. B. durch Zuführung von gammainterferon oder Muramylpeptiden umfassen. Das Ziel der Aktivierung von Makrophagen ist es, eine höhere anti-infektiöse und anti-tumerale Aktivität zu erreichen.
Das Ziel der Aktivation von Makrophagen ist es, mehr anti-infektive und antitumorale Aktivität zu erreichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann einen weiteren Schritt zur Konzentration der erhaltenen Zellen am Ende der Kokultivierung umfassen, und Resuspension in einem zur Verabreichung an den Patienten geeigneten Vehikel.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin nach der Resuspension der Kokultur den Schritt umfassen, einen Teil oder die gesamte Resuspension einzufrieren.
Es ist zu beachten, dass das erzielte zelluläre Produkt nach einer ex vivo Differenzierung und einer Expansion von Stamm-, Vorläufer- und myeloiden Zellen, T Lymphozyten und differenzierte Makrophagen beinhaltet, die am Ende des Vorgangs aktiviert werden (z. B. durch γ-Interferon). Die Kokultivierung von 3 bis 12 Tagen wurde bei 37° C in einem non-adhärenten Beutel und in definiertem Medium (IMDM Basis) durchgeführt und ermöglicht eine gesteigerte Wiederauffindung von CD34+ Zellen und/oder von intermedialen haematopoitischen Vorläuferzellen. Dies bedeutet, dass normale haematopoitische Vorläufer nicht nur durch aktivierte Makrophagen ge schont werden, sondern auch zu einer größeren Proliferation und Differenzierung angeregt werden.
Die Erfindung bezieht sich auf die gemäß dem oben definierten Verfahren erzielte Zellzusammensetzung.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Substanz eine wie oben definierte zellulare Zusammensetzung beinhaltet.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Wiederherstellung der Haematopoiese eines aplasischen Patienten und/oder dem Schutz des Patienten vor infektiösen Erkrankungen oder residualen Tumoren, welche den Einsatz einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie oben aufgeführt umfasst.
Der Ausdruck „Wiederherstellung von Haematopoiese" bedeutet die Erhöhung des hemotopoietischen Zellniveaus, um eine normale Funktionsweise zu erreichen, die ähnlich derer gesunder Individuen ist, um einen Schutz gegen Infektionen (welche durch Blutzellzählungen und Identifikationen gemessen werden können) zu erzielen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Methode zur Verringerung der Aplasiephase eines Patienten, z. B. von 11 Tagen zu 1 bis 3 Tagen, die den Einsatz einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie oben definiert umfasst.
Der Begriff Aplasia ist definiert als eine pathologisch niedrige Anzahl von haematopoietischen Zellen in Blut.
Die erfinderische Zellzusammensetzung gemäß der oben gegebenen Definition ist dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Zusammensetzung von periphären mononukleären Blutzellen abgeleitet oder von einer solchen umfasst wird, die

– 10 bis 50% Monozyten,
– 10 bis 70% Lymphozyten,
– 0,1 bis 20% Vorläuferzellen,
– 1 bis 50% polynukläre Zellen,
– 0,1 bis 20% Stammzellen

Erklärung der Figuren
1 zeigt die Inhibition des Wachstums von Myelomazelllinien durch aktivierte MAK.
Die Anzahl lebensfähiger Zellen (×10E4/ml) ist gegen die Zeit (in Tagen) aufgetragen.
XG-1, XG-2, XG-14 Myelomzelllinien wurden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS und 3 ng/ml IL-6 bei einer Konzentration von 5 × 10E5 Zellen/ml kultiviert. Die Charakteristika der Zelllinien XG-1 und XG-2 sind in Blood 83: 3654 – 3663, 1994 beschrieben, die von XG-14 im Journal of Immunology 163: 514 – 524, 1999. Die Zellen wurden in teflonbeschichteten Kulturschalen kultiviert. Myelomazellen wurden entweder allein oder in Anwesenheit von 5 × 10E5 aktivierter MAK kultiviert. In einer Gruppe wurden nur MAK allein kultiviert. Jeden Tag wurde die Zahl lebensfähiger Zellen durch Trypanblauexklusion bestimmt. Die Anzahl von Myelomzellen wurde durch Färbung mit anti-CD38 Antikörpern und FACS-Analyse bestimmt. Die Ergebnisse sind die eines repräsentativen Experimentes von dreien.

Die Kurve mit Rauten entspricht MAK.
Die Kurve mit schwarzen Quadraten entspricht XG-1.
Die Kurve mit leeren Quadraten entspricht MAK und XG-1.
Die Kurve mit schwarzen Dreiecken entspricht XG-2.
Die Kurve mit leeren Dreiecken entspricht MAK und XG-2.
Die Kurve mit schwarzen Kreisen entspricht XG-14.
Die Kurve mit leeren Kreisen entspricht MAK und XG-14.

2 zeigt die Inhibition des Wachstums von Myelomazellen durch aktivierte Makrophagen, welche lösliche Mediatoren produzieren.
Die Anzahl lebensfähiger Zellen (×10E4/ml) ist gegen die Zeit (in Tagen) aufgetragen.
XG-1, XG-2, XG-14 Myelomzelllinien wurden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS und 3 ng/ml IL-6 bei einer Konzentation von 5 × 10E5 Zellen/ml kultiviert. 2 × 10E5 Zellen wurden in der unteren Kammer von Transwell Kulturschalen kultiviert, welche 2 × 10E5 MAK in der oberen Kammer enthielten (oder nicht).

Die Kurve mit schwarzen Rauten entspricht XG-1.
Die Kurve mit leeren Rauten entspricht MAK / XG-1.
Die Kurve mit schwarzen Dreiecken entspricht XG-2.
Die Kurve mit leeren Dreiecken entspricht MAK / XG-2.
Die Kurve mit schwarzen Quadraten entspricht XG-14.
Die Kurve mit leeren Quadraten entspricht MAK / XG-1.

3 zeigt die Stimulation der Erzeugung haematopoietischer Kolonien durch aktivierte MAK.
2 × 10E3 aufgereinigte CD34 Zellen (Reinheitsgrad >90%) wurden in Methylzellulose enthaltendem semifesten Kulturmedium in Anwesenheit haematopoietischer Zytokine entweder allein oder mit 10E5 aktivierten MAK kultiviert. Die Anzahl von GM-CFU, BFU-E und GEMM-CFU wurden nach 14 Tagen Kultur bestimmt. Die Ergebnisse sind die eines repräsentativen Experimentes von dreien.
Die Y-Achse zeigt die Anzahl von Kolonien.
Auf der X-Achse repräsentieren die Säulen mit parallelen Linien GEMM-CFU, the Säulen mit schwarzen und weißen Quadraten repräsentieren GM-CFU und die grauen Säulen repräsentieren BFU-E.
4 zeigt die Stimulation des Wachstums von CD34 Zellen durch aktivierte MAK.
Aufgereinigte CD34 Zellen (Reinheitsgrad >90%) wurden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS und 50 ng/ml IL-3 und CSF kultiviert. Die Anzahl an CD34-Zellen wurde täglich durch Markierung mit CD34 Antikörper und FACS-Analyse bestimmt. CD34-Zellen wurden entweder allein oder in Anwesenheit von 10E5 aktivierter MAK kultiviert. Die Ergebnisse sind die eines repräsentativen Experimentes von zweien.
Auf der Y-Achse die Anzahl von CD34 Zellen (×10E4/ml) und auf der X-Achse die Zeit aufgetragen (in Tagen Kultur).

Die Kurve mit Rauten entspricht CD34.
Die Kurve mit Quadraten entspricht CD34/MAK.
Die Kurve mit Dreiecken entspricht CD34/MAK (Adhäsion).

5 zeigt die Stimulation des Wachstums von haematopoietischen Vorläuferzellen durch aktivierte MAK.
Gereinigte CD34 wurden wie in 4 beschrieben kultiviert. Die Anzahl der haematopoietischen Vorläuferzellen wurde durch Kultivierung in Methylzellulose und haematopoietische Zytokine enthaltendem semisoliden Medium bestimmt. Die Anzahl von GM-CFU wurde nach 14 Tagen Kultur bestimmt.
Die Y-Achse repräsentiert die Anzahl von Granulozyten und Makrophagen-Kolonien. Über der X-Achse ist die Anzahl der Tage der Kultur der CD34-Zellen mit oder ohne MAK aufgetragen.
Die mit „B" markierte Kurve entspricht den CD34 Zellen und die mit „J" markierte entspricht CD34 / MAK Zellen.
In den nachfolgenden Beispielen haben die Abkürzungen die folgenden Bedeutungen:
CD: cluster of Differentiation (Differenzierungshaufen); DMSO. Dimethylsulfoxid; RPMI Rosewell Park Medical Institute; FKS: Fötales Kälberserum; FACS: Fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren; SCF: Stemmzellfaktor.
Beispiel 1
Ein an multiplem Myeloma erkrankter Patient wurde mit Cyclophosphamid (4g/m²) und einer täglichen Injektion von G-CSF (5μg/kg) behandelt. Die Anzahl periphärer CD34-Zellen wurde jeden Tag bestimmt und die Apherese wurde begonnen, wenn die Anzahl CD34 positiver Zellen über 10/μl war. Mononukleäre Zellen (weniger als 10% polynukleäre Zellen) wurden durch Apherese gesammelt, zwei Mal in PBS gewaschen und über 6 Tage in einem MAK TM Zellprozessor bei einer Konzentration von 5 × 10E6 Zellen/ml in zwei Zellkulturbeuteln von 500 ml bei 37 Grad C, 5% CO2, kultiviert. Das Kulturmedium enthielt 500 U/ml GM-CSF. Am Tag 6 wurde für einen Tag IFN-gamma (250 U/ml) hinzugefügt. Vor der Kultur sowie an Tag 1,2,5,6,7 der Kultur und nach der Abtrennung der Zellen wurde eine Zellprobe genommen, um die Zellzahl sowie die Anteile von CD34, CD14, CD33, CD64, HLA-DR, CD16, CD3 Zellen und die Konzentration der Granzlozyten-Makrophagen formenden Einheiten (GM-CFU) zu bestimmen.
Der Phänotyp der Zellmembran der Zellen wurde durch FACS Analyse mit FITC markierten Mausantikörpern (Immunotech, Marseilles, Frankreich), oder Isotypen-Kontrollantikörper bestimmt. Die Konzentration von GM-CFU wurde durch Methylzellulose und verschiedene haematopoietische Zytokine enthaltendes semisolides Medium bestimmt (Villejuif, Frankreich).
Einen fortschreitenden dreifachen Zuwachs der Anzahl von CD34 Zellen und GM-CFU wird beobachtet. Diese Daten zeigen an, dass das Zellkultursystem das Wachstum von haematopoietischen Vorläuferzellen begünstigt.
Zellen aus der Apherese (mobilisierte Myelompatienten) konnten ebenfalls gefroren gehalten werden. Nach Auftauen von 5,7 × 10E9 Zellen, welche 44% CD3+ Zellen (Lymphozyten) und 42% CD14+ Zellen (Monozyten) enthielten, konnten diese ausgesät und in definiertem Medium bei 37 Grad C kultiviert werden.
Lymphozyten (CD3+) und CD14+ Zellen neigten dazu, weniger zu werden (Siehe Tabelle 1). CD64+ Makrophagen gab es wenige bis zur Aktivierung durch IFN gamma an Tag 6, welche diese Population deutlich in der Zahl vergrößerte. Diese Population war hauptsächlich anwesend nach der Reinigung durch Elutriation an Tag 7.
Wenn die Subpopulation an CD34+ Zellen in der Kultur verfolgt wurde, wurde ein Anstieg der Anzahl und dem prozentualen Anteil der Zellen mit CD34+ Phänotyp beobachtet. 7 × 10E7 CD34+ Zellen waren zu Beginn der Kultur anwesend, und wuchsen auf 21 × 10E7 nach 6 Tagen (siehe Tabelle 1).
Die Präsenz von in das Kulturmedium sezernierter Zytokine und eine größere Anzahl von T Lymphozyten (57% in diesem Experiment) schienen für die Proliferation von CD34+ Zellen und Vorläuferzellen von Bedeutung zu sein. Wiederholbar wurden Makrophagen erhalten, welche nach dem Auftauen eine gute Lebensfähigkeit zeigten. Diese konnten schließlich durch Elutriation auf über 90% gereinigt werden, um durchschnittlich 5 × 10E9 Makrophagen zu erhalten, welche aus einer Apherese differenziert worden waren (60 Patienten analysiert). Die totale Zellpopulation, welche nach der Kultur wiederhergestellt wurde, wird in Patienten injiziert, um eine schnellere Erholung der haematopoietischen Vorläufer zu ermöglichen, und die Zeit der Aplasie zu verkürzen.
Tabelle 1
Beispiel 2
Ziele
In den Figuren und im folgenden Ausführungsbeispiel werden aktivierte Makrophagen entsprechend der PCT/EP93/01232 bereitgestellt.
Aktivierte Makrophagen (MAK) sind in der Lage, verschiedene menschliche Tumorzellen zu töten. Wir haben untersucht, ob MAK, welche aus Apheresezellen gewonnen wurden, indem sie wärend der haematopoietischen Stammzellmobilisierung im periphären Blut durch Cyclophosphamid und Granulozyten-Koloniestimulierenden Faktor (G-CSF) gesammelt werden, in der Lage sind, humane maligne Plasmazellen zu töten. Wir haben ebenso ihren Effekt auf das Wachstum von menschlichen haematopoietischen CD34 Stammzellen sowie die Fähigkeit von CD34 Zellen, haematopoietische Kolonien in semifestem Medium zu erzeugen, untersucht.
Erzeugung von MAK
Aktivierte MAK wurden mit Hilfe von Kits, bezogen von IDM (Paris, Frankreich), erzeugt. MAK wurden aus Apheresezellen von zwei Patienten während der Mobilisierung von haematopoietischen Stammzellen im periphären Blut durch Cyclophosphamid und G-CSF gesammelt. Apheresezellen wurden 6 Tage mit 500 ng/ml GM-CSF und einen weiteren Tag mit IFN-gamma (250U/ml) kultiviert. Am Tag 7 wurden MAK durch Zählerelutriation gereinigt. Wir haben vorhergehend gezeigt, dass diese Zellen mehr als 80–90% MAK enthielten, welche HLA-DR und CD64 exprimieren (Patentanmeldung 99 400 239.2). MAK wurden in physiologischer NaCl-Lösung, enthaltend 4% Albumin und 10% DMSO, gefroren. Für die unten beschriebenen Manipulationen wurden die MAK aufgetaut und für einen Tag mit RPMI1640, 10% FKS (Biowittaker, Belgien) und 500 U/ml GM-CSF kultiviert.
Effekt von MAK auf das Wachstum von Plasmazelllinien
Drei maligne Plasma-Zelllinien wurden im Labor erzeugt: XG-1, XG-2, XG-14. Das Überleben und Wachstum dieser Zelllinien ist von der Hinzufügung von exogenen Zytokinen abhängig. Kulturen wurden in einer 24-Loch Zellkulturplatte, welche mit Teflon beschichtet war (Polylabo Block 80776), angelegt, um die Anhaftung von MAK zu verhindern. Die Zellen wurden in RPMI1640 Zellkulturmedium mit 10% FKS (Biowittaker, Belgien) und 3 ng/ml Interleukin 6 (Sandoz, Schweiz) kultiviert. 5 × 10E5 Myelomzellen wurden entweder allein oder in Anwesenheit von 5 × 10E5 aktivierten MAK über 3 Tage kultiviert. In einer Kulturgruppe wurden 5 × 10E5 MAK Zellen allein kultiviert. An Tag 1, 2 und 3 der Kultur wurde die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblauexklusion bestimmt. Wie in 1 gezeigt, hemmt die Hinzufügung von MAK das Wachstum der drei Myelomzelllinien. Wir untersuchten ebenfalls, ob MAK Myelomzellen phagozytierten oder einen löslichen Faktor sezernierten, der Myelomzellwachstum hemmen kann. Ko-Kulturen wurden angelegt, wobei ein Transwell-Filter benutzt wurde, in denen zwei Kammern durch einen 0,45 μm Filter getrennt sind. 2 × 10E5 aktivierte MAK Zellen wurden in 100 μl Kulturmedium in der oberen Kammer kultiviert, und in der niedrigeren Kammer wurden 2 × 10E5 Myelomzellen in 600 μl Kulturmedium, enthaltend 3 ng/ml IL-6, ausplattiert. Die Anzahl an Myelomazellen wurde an Tag 1, 2 und 3 der Kultur bestimmt. Wie in 2 gezeigt ist, führte die Hinzufügung von aktivierten MAK zu reduziertem Wachstum der Myelomzellen. Diese Reduktion war geringer als die, welche durch Kontakt der MAK mit Myelomzellen erreicht wurde. Diese Daten weisen darauf hin, dass aktivierte MAK teilweise das Myelomzellwachstum durch Sezernierung eines löslichen Faktors inhibieren.
Effekt aktivierter MAK auf Wachstum und Differenzierung von haematopoietischen CD34 Stammzellen
Die Effekte von aktivierten MAK auf das Wachstum von CD34 Zellen und auf ihre Fähigkeit, in haematopoietische Zellen zu differenzieren, wurde untersucht. Zunächst wurden aktivierte MAK mit gereinigten menschlichen CD34 Zellen (>90% CD34 Zellen) in Methylzellulose und einen Cocktail haematopoietischer Zytokine enthaltendem Kulturmedium (Stemgem, Frankreich) über 14 Tage ko-kultiviert. Am Tag 14 wurde die Zahl der Granulozyten-Makrophagen Kolonien (GM-CFU), Häufung Erythroider formende Kolonien (BFU-E) und vermischte Kolonien (GEMM-CFU) bestimmt. Wie in 3 gezeigt, führte die Hinzufügung von aktivierten MAK zum Anstieg von haematopoietischen Kolonien, was anzeigt, dass aktivierte MAK CD34 nicht beeinflussten, sondern im Gegenteil deren Differenzierung in haematopoietische Kolonien verstärkten. In einem weiteren Experiment wurden aktivierte MAK mit gereinigten CD34 Zellen über mehrere Tage in Anwesenheit von Interleukin 3 (IL-3) und Stammzellfaktor (CSF) kokultiviert. Die Anzahl von CD34 Zellen wurde täglich durch Anfärben mit anti-CD34 monoklonalen Antikörper und FACS Analyse bestimmt. Die Anzahl der haematopoietischer Vorläufer wurde durch Kultur in Methylzellulose und haematopoietische Zytokine enthaltendem semisoliden Medium bestimmt. Wie in 4 und 5 gezeigt, verstärkten MAK das Wachstum von CD34 Zellen sowie haematopoietischer Vorläuferzellen.
Zusammengefasst haben aktivierte MAK keinen inhibitorischen Effekt auf Wachstum und Differentierung von haematopoietischen CD34 Zellen. Im Gegenteil stimulieren aktivierte MAK das kurzfristige Wachstum von CD34 Stammzellen und haematopoietischen Vorläufern.

Claims

Makrophagen enthaltende Zellzusammensetzung, welche antiinfektiöse und hämopoetische Eigenschaften zeigt, in der die Makrophagen in einer Menge von 10 bis 70 % vorliegen, wobei sich die angegebenen Prozentzahlen auf die Gesamtzellzahl beziehen.
Zellzusammensetzung nach Anspruch 1, welche myeloide Zellen in einer Menge von 10 % bis 30 % enthält, wobei sich die angegebenen Prozentzahlen auf die Gesamtzellzahl beziehen.
Zellzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, welche T-Lymphozyten enthält, vorzugsweise in einem Anteil von 10 bis 60 % bezogen auf die Gesamtzellzahl.
Zellzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Vorläuferzellen 0,1 % bis 20 % Stammzellen enthalten, bezogen auf die Gesamtzahl der Vorläuferzellen.
Zellzusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Vorläuferzellen aus mononuklearen peripheren Blutzellen gebildet sind und unter Umständen darin enthalten sind, wobei die Vorläuferzellen insbesondere aus myelo-erythroiden Vorläuferzellen, myeloiden Vorläuferzellen, lymphoiden Vorläuferzellen oder einer Mischung davon ausgewählt sind.
Zellzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Makrophagen, myeloiden Zellen und die Lymphozyten wenn vorhanden, aus mononuklearen Blutzellen gebildet sind oder darin enthalten sind.
Verwendung von G-CSF und/oder GM-CSF, oder G-CSF und Cyclophosphamid für die Herstellung einer Zellzusammensetzung, die Makrophagen, myeloide Zellen und Vorläuferzellen enthält, wobei die Vorläuferzellen vorzugsweise in einer Menge von 0,1 % bis 20 % und die Makrophagen vorzugsweise in einer Menge von 10 bis 70 % vorliegen, wobei sich die angegebenen Prozentzahlen auf die Gesamtzellzahl beziehen.
Verfahren zur Herstellung einer Zellzusammensetzung, die Makrophagen, myeloide Zellen und Vorläuferzellen enthält, wobei die Vorläuferzellen vorzugsweise in einer Menge von 0,1 % bis 20 % und die Makrophagen vorzugsweise in einer Menge von 10 bis 70 % vorliegen, wobei sich die angegebenen Prozentzahlen auf die Gesamtzellzahl beziehen, umfassend einen Schritt der Apherese zum Sammeln von mononuklearen Zellen und Vorläufern, einen weiteren Schritt der Co-Kultivierung der mononuklearen Blutzellen und Vorläufer nach Abwaschen der Blutplättchen, der Granulozyten und Erythrozyten für 4 bis 10 Tage in einem Medium, welches die Differenzierung von Monozyten in Makrophagen und von myeloiden Vorläuferzellen in polynukleare Zellen erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Co- Kultivierung in der Gegenwart von Cytokinen oder Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel IL3, IL6, Stammzellfaktor, EPO, Thrombopoetin, GM-CSF, G-CSF, Fiat-3 Ligand, C-kit Ligand oder deren Agonisten, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, umfassend einen zusätzlichen Schritt der Makrophagenaktivierung am Ende der Co-Kultivierung, zum Beispiel durch Zugabe von Inteferon oder Muramylpeptiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, umfassend einen zusätzlichen Schritt der Konzentrierung der erhaltenden Zellen am Ende der Co-Kultivierung und Resuspension in einem zur Verabreichung an einen Patienten geeigneten Vehikel.
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend einen Schritt nach der Resuspension der Co-Kultur, wobei Teile oder die Gesamtheit der Resuspension tiefgefroren werden.
Zellzusammensetzung wie sie nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12 erhalten wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirksubstanz eine Zellzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 13 enthält.
Zellzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 13, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie von einer mononuklearen peripheren Blutzellzusammensetzung abgeleitet ist und/oder darin vorhanden ist, enthaltend: 10 bis 50 % Monozyten, 10 bis 70 % Lymphozyten, 0,1 bis 20 Vorläuferzellen, 1 bis 50 % polynukleare Zellen und 0,1 bis 20 % Stammzellen.
Verwendung einer Zellzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 13 für die Herstellung von Arzneimitteln, für die Wiederherstellung der Hämopoese in einem aplastischen Patienten und/oder für den Schutz von Patienten gegen infektiöse Krankheiten oder gegen Residualtumore.