JPH06508528A - インビトロ由来ヒト好中球前駆体細胞 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 インビトロ由来ヒト好中球前駆体細胞 ＆切９分野 本発明は、インビトロ由来ヒト好中球前駆細胞群に関し、および、この細胞群の 臨床および研究への適用における用途に関する。

光肌９背旦 感染および疾患と闘うヒト免疫系の主要細胞は白血球（ｌ　ｅｕｋｏｃｙｔｅ） であり、血液中を循環している。全白血球の約５０乃至６５パーセントが”好中 球”と称されている細胞タイプであり、この細胞は、白血球の感染と闘う能力の 多くを媒介している。ヒトが正常数よりも実質的に少数の循環好中球を有してい ると、この患者は”好中球減少症”、すなわち、循環好中球数か異常に少数であ ることを特徴とする状態に罹患していると見なされる。

好中球減少症に罹患している患者は、いかなる感染または疾患とも闘うことがで きる好中球か少なくなるので、血液中に循環する好中球数が減少すると患者のこ うした闘う能力が障害され、感染および疾患の実質的リスクに曝される。好中球 減少症の重篤な症例では、感染および疾患と闘うことができる好中球が本質的に 全くない。

好中球減少症自体は、疾病、遺伝的異常、薬剤、毒物、および放射線、ならびに 、大量化学療法（ｉｌＤｃ）および従来の腫瘍療法のような多くの治療法の結果 であることもある。たとえば、多くの癌が極高用量の放射線または抗新生物（抗 癌）剤に感受性であることか見いだされている。これらの癌には、悪性メラノー マ、胃、卵巣、および胸部の癌、肺小細胞癌、および小児の悪性腫瘍（網膜芽腫 および翠九の腫瘍）、ならびに、ある脳腫瘍、特に神経膠芽腫が含まれる。しか し、上記の大ＩＨＤＣは造血系の障害（ｃｏｍｐ　ｒ　ｉｍｉ　ｓ　ｅ）の原因 となることが頻繁であり、その結果、数多くの日和味感染のいずれかによる死亡 が起こるので、あまり広くは使用されていない。

たとえ悲惨な（ｄｅｖａｓｔａｔ　１ｏｎ）ものでないにしてもこうしたＨＤＣ による造血系の障害の原因は、一般に理解されている。ＩＤＣは、骨髄において 好中球、血小板、赤血球、リンパ球、およびその他の白血球を産生ずる急速に増 殖する細胞に作用する。造血系か正常に作用していると、血小板および好中球は 、寿命の長いリンパ球および赤血球と異なり急速に増殖しがっ高速で代謝される 。

その際、ＩＤＣの結果、腫瘍（新生物）細胞が破壊されるだけでなくまた免疫系 作用を保持するために必要な好中球という武器を産生ずることに関与している造 血系の細胞も破壊されることになる。好中球始原細胞および前駆細胞が完全に破 壊されると、成熟好中球を産生ずる患者の能力が短期的にではあるが消失し、そ れによって、感染と闘う患者の能力が重度に障害される。すると、患者は、”免 疫系が傷害され（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉ　５ｅｄ）”　、日和味感染に 曝されることになる。こうした状態の結果、最終的に、疾病および死亡が起こる 。造血系に重篤な障害が起こるとその他の状況も起こり、それに対して好中球お よび前駆細胞が実質的に減少する結果となる。

ＩＤＣによるものであろうとその他によるものであろうと、好中球減少症による 問題を理解するために、ヒト血液細胞についての基本的本質をそれらの産生源と その分化も含めて理解することがまず最初に必要である。

造血とは、血液細胞の増殖と分化を称する。ヒトでの主な造血部位は、約２０週 齢を経過した胎児では、骨髄である。血液細胞は、通常骨髄にある多分化性の幹 細胞から分化する。これらの幹細胞は、増殖しかつ分化する能力を有している。

増殖は幹細胞群を維持し、一方、分化の結果、種々のタイプの成熟血液細胞が形 成されることになり、これらは、リンパ球、骨髄細胞または赤血球系統の３つの 主要血液細胞系統のひとつに分類される。リンパ球系統は、Ｂ細胞およびＴ細胞 から構成され、それらは、抗体産生および抗原検出において集合的に作用し、そ れによって、細胞性および体液性免疫系として作用する。単核球（マクロファー ジ）、顆粒球（好中球を含む）および巨核球からなる骨髄系統は、抗原を血流中 でモニターし、血流から抗原を除去し、感染性物質と闘い除去し、そして、血液 凝固に関連する血小板を産生ずる。赤血球系統は赤血球がら構成され、これらは 、全身にくまなく酸素を運搬する。

幹細胞群は、骨髄において総細胞群のわずかのパーセントしか構成していない。

幹細胞ならびに関与始原細胞は好中球、赤血球、血小板等になることになってお り、これらの幹／始原細胞の表面に存在する特定の始原細胞”マーカー”抗原の 存在によって大抵のその他の細胞から識別できる。この特定のマーカー抗原を認 識可能な抗体群は、”識別群３４”または”ＣＤ３４”と称される。この名称” ＣＤ３４＋”は、ＣＤ３４抗体群によって認識される特定の細胞表面抗原を有す るものとして細胞を説明するために用いられる。幹細胞は、従って、ＣＤ３４＋ である。しかし、骨髄中におけるＣＤ３４＋である細胞の大部分は、８９２８球 始原細胞および骨髄始原細胞である。

好中球は、中間前駆細胞群を経て幹細胞から分化し、このことは、核の大きさ、 核の形状、細胞径、核／細胞質比率、顆粒球の存在／不在、および染色特性（第 １図およびＡｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎ ｄ　Ｐａｔｈｏｌｏ　、第２版、Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎら、参照）を 含めてそれらの顕微鏡形態の外観から識別可能である。まず最初に、インビト三 では直接測定が不可能である多機能幹細胞が、骨髄”始原細胞”を産生じ、この 細胞が全骨髄細胞系統の前駆体を産生ずる。第１の骨髄始原細胞は、”コロニー 形成単位−一顆粒球、赤血球、マクロファージおよび巨核球”をさしてＣＦＵ− ＧＥＭＭと称される。このＣＦＵ−ＧＥＭＭ始原細胞は、次に、ＣＦＵ−０Ｍ始 原細胞を産生ずるであろうが、この細胞は、別に、”コロニー形成単位−一顆粒 球およびマクロファージ”として公知である。これらの説明用語の全てにおいて 、”コロニー”とは、５０個を超える細胞を産生可能な細胞を称し、これは、本 明細書の実施例５に記載の条件下でクローン成長のインビトロアッセイにおいて １４日間で測定される。これらの細胞は、少なくとも６回、分裂する。

ＣＦＵ−ＧＭは関与始原細胞であり、別の言葉で述べれば、ＣＦＵ−ＧＭは、顆 粒球およびマクロファージのみに分化することになっている。それは、その他の 細胞タイプに分化することもできなければ、または、初期始原細胞へ分化するこ とも不可能である。このＣＦＵ−０Ｍ始原細胞は、その後、骨髄芽球に分化でき る。ＣＦＵ−ＧＥ％１％ｉから骨髄芽球に分化するために要する時間は、約１− ４［」であると考えられている。１個の骨髄ｕ球は、好中球に対する”前駆体” と称することもできる細胞群の第１であり、このような細胞はいったん十分に発 生分化（分化）できるようになると好中球のみを形成でき、好中球は６回未満の 細胞分割しかできず、従って、先に説明したようにインビトロコロニーアッセイ においてコロニーを形成しない。

いったん分化が骨髄芽球段階に至ると、骨髄芽球は、最終分化を受け前骨髄球に なり、次に、この前骨髄球は、約４−６日の時間で骨髄球に分化する。さらに５ 日程度以内に骨髄球は後骨髄球に分化し、次に、バンド状好中球に分化する。

これらのバンド状好中球は、最終的に、成熟した分割好中球に分化し、これらは 、約０．　３乃至２日の半減期を有する。用語”始原細胞”は、幹細胞およびコ ロニーを形成可能な細胞を称するために用いられる。”前駆体”は、骨髄芽球、 前骨髄球および骨髄球を称するために使用され、ある場合には、後骨髄球および バンド状好中球をも称するために使用される。

これらの細胞の表面抗原の変化が進行性の形態分化の間に観察できる。たとえば 、幹細胞であるＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＣＦＵ−ＧＭはＣＤ３４＋である。ＣＦ Ｕ−ＧＭ段階以上に分化する造血系細胞は、もはや、ＣＤ３４＋ではない。発現 の同様の進行は、細胞表面抗原であるＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡにおいても観 察される。この前骨髄始原細胞以後の好中球前駆細胞は、ＣＤ３４−１ＣＤ３３ ＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ４５ＲＡ−５およびＣＤ１５＋として特定さ れる。さらに成熟した細胞は、また、ＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ１６＋（Ｔｅｒｓ ｔａｐｐｅｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ４：６５７，１９９０）として特定される。

しかし、細胞表面抗原発現におけるこうした遷移は突然というよりはむしろ緩慢 であり、特定前駆細胞タイプの一部の細胞か特定細胞表面抗原陽性でありまた同 一タイプのその他の細胞がこの抗原に対して陰性であることもあることに注目す べきである。さらに、ある特定の細胞タイプが特定細胞表面抗原に対して陽性で あるかまたは陰性であるかを決定することは、こうした決定に使用する特定方法 によって部分的にではあるか変わってくる。細胞表面抗原発現による細胞分化の 特性解析は、細胞形態のような細胞分化を特性解析するためのその他の手段によ って確認できる。

特異的成長因子が幹細胞上で特異的レセプターと反応して、それらの分化を関与 始原細胞へ向ける。これらの因子は、造血系細胞の増殖と分化を制御する。少な くとも４種のコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）が好中球産生の制御で協同すること が公知である。これらの４種の因子はＧＭ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球およびマクロファ ージ）、ＩＬ−３（インクロイキ：／３）　、Ｇ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球）およびｃ ｓＦ−１としても公知であるＭ−ＣＳＦ（マクロファージ）と称され、マクロフ ァージ、Ｔ細胞、内皮細胞およびその他のタイプの細胞によって合成される。始 原細胞のＣ３Ｆ応答能は、この特定のＣ３Ｆに対するレセプターが細胞表面に存 在するがどうかによって部分的にはあるが決定され、また、特定Ｃ３Ｆの濃度に よっても部分的にではあるが決定される。また、アクセサリ−細胞を介してがま たはその他のＣ−キットリガンド、ｌ−６（インクロイキン−６）、ＩＬ−１１ （インタロイキン−１１）、ＩＬ−４（インクロイキン−４）およびＩＬ−１（ インクロイキン−１）のようなその他の必須成長因子との相乗作用による間接的 刺激を示唆するものもある。

好中球前駆細胞の分化に伴う形態および細胞表面抗原発現の変化に加えて、それ らは、増殖能を喪失する。一般に、成熟度のより低い好中球前駆細胞、すなわち 、骨髄芽球、前骨髄球、および骨髄法はど、その増殖能を保持する。しがし、よ り成熟度の高い好中球、すなわち、後骨髄球およびバンド状好中球は、成熟した 分割好中球に分化し続けるにもかかわらず、増殖能を喪失する。

ＨＤＣ誘発好中球減少症を治療するために数種の治療法が提言されている。これ らの方法は、好中球減少症を部分的に改善させるが完全に排除することはできな い。また、骨髄細胞は、好中球回復に必要な細胞成分を付与するために用いられ てきた。しかし、この特定の治療方法は、好中球減少症の期間を約２−３週に短 縮するのみである。

障害された造血系を再構成するために骨髄を用いることに関して、いくつかの問 題が関連している。まず第１に、骨髄中の幹細胞数が極めて限定されていること である。幹細胞および始原細胞は、骨髄、牌臓、および血液中で核形成細胞の極 めて数パーセントしか付与しない。骨髄に対して牌臓には、これらの細胞のおよ そ１０分の１しか存在せず、成人血液中にはこれよりはるかに少ししが存在して いない。例として、＋側の核形成骨髄細胞中の約１個が始原細胞である；幹細胞 は、もっと低い頻度で出現する。第２に、幹細胞が成熟好中球に分化するために 必要な時間は、少なくとも１０−１５日のオーダーの有意な時間が必要である。

異なる（同種間）適合ドナーから採取した骨髄を用いて、移植用骨髄を供与する 。移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および移植拒絶反応がＨＬＡ適合兄第間ドナー によるレシピ−エンドにおける骨髄移植さえも制限している。同種間骨髄移植レ シピ−エンドの約半数がＧＶＨＤを発症する。ＧＶＨＤの現在の治療法は完全で はなく、本疾患は有効性を損なうものであるカヅ致死的である。したがって、Ｇ ＶＨＤのリスクの故に、悪性腫瘍、重篤な再生不良性貧血、サラセミア、および 先天性免疫不全状態のような骨髄移植の適用がなければ致死的である疾患を有す る患者に対するこうした適用が制限されている。毎年実施されている骨髄移植１ ５．０００例中約７，０００例が同種間である。その他の多くの患者も、ＧＶＨ Ｄまたは移植拒絶反応が重篤なリスクでなければ骨髄細胞移植によって治療する ことができるかも知れない（鎌状赤血球貧血のような）疾患を有している。

同種間骨髄移植の別法として、自家骨髄移植がある。自家骨髄移植において、Ｈ ＤＣのような治療前に患者自身の骨髄の一部を採取し、その後患者に移植して戻 す。このような方法は、ＧＶＨＤのリスクを取り除く。しがし、自家骨髄移植は 、それでもなお、骨髄中に存在する幹細胞数が限定されていること、および、幹 細胞か成熟好中球に分化するために必要な時間の故に、同種間骨髄移植によって 起こる問題と同一の問題の多くが起こる。さらに、自家骨髄は、また、腫瘍細胞 によって汚染されていることもある。

骨髄移植による問題を克服するためのひとつの方法として、幹細胞をドナー骨髄 またはその他から単離することが試みられ、また、ＨＤＣ以後のような時期に免 疫系を再生するためにこうした幹細胞を使用することが行われている。同種間状 況におけるこの手技の背後にある理論は、幹細胞の性質が原始的であり（顕著な 宿主特異的性状を示さない）、従って、移植レシピ−エンドにおいて異物または 抗原として認識されず、従って、受容を改善することが期待されるであろうとい うことである。さらに、これらの単離された細胞には最小数のＴ細胞しが含まれ てないので、ＧＶＨＤにおけるような副作用を回避することができる。

また、この手技にも問題がある。骨髄中における幹細胞数は極めて限定されてい ること、および、約１０−１５日が幹細胞の成熟好中球分化に必要であることか ら、患者への導入のために適当な数の好中球を産生ずるために前記細胞の歪２旦 土における顕著な増殖か起こらなければならない。したがって、免疫障害患者に おける幹細胞の移植では、最善の結果においてさえも、有意な期間、免疫の障害 が継続する。

Ｇ−Ｃ３ＦまたはＧＭ−Ｃ３Ｆのような造血系成長因子は、単独でまたは）（Ｄ Ｃに引き続き幹細胞群の自家または同種間移植と併用して、投与されてきた。好 中球はこうした治療の結果その数が増加するが、重篤な好中球減少症の期間が約 １０日に短縮されるのみである。幹細胞からの好中球の産生には通常的１０−１ ５日を要するので、造血系成長因子による始原細胞の産生と分化および結果とし て起こる好中球を含む成熟白血球の再構成の刺激には、かなりの時間を要する。

化学療法または成長因子によって動員される末梢血幹細胞（Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｃ）は 、同様に、好中球減少症を治療するためにも使用されてきた。動員されたＰＢＳ Ｃは、始原細胞とおそらく骨髄系が抑制された骨髄の回復時に自然に出現する前 駆細胞との混合物を示すと考えられている。始原細胞とおそらく前駆細胞の上記 混合物は、同様に、好中球減少症を約９日に短縮するのみである。さらに、これ らの混合物中における前駆細胞はおそらく凍結に堪えられないであろう。その理 由として、顆粒球を含有する細胞は現在公知の方法を用いては十分に凍結されず 、従って、その後の治療のために保存することができないであろう。

一般的に述べると、これらの方法のいずれも、重篤な好中球減少症の期間を約８ −１０日以下に短縮することに成功していない。なお好中球減少症がこのように 長期にわたると、患者は感染に感受性となり、その治療には入院を必要とし、か なりの費用を要する。

成熟好中球の輸血は、また、好中球減少症を治療する手段として試みられてきた 。このような輸血は極めて高費用を要することになることがあり、がっ、健常な トナーを時間を要し、苦しくかつリスクの高い手技に巻き込むことになる（Ｃ１ ｉｆｔら、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｃｏｍ１ｉｃａ ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ　（Ｐａｒｔｌ＋） 、Ｖｏｌ、７６：６３１−６３６　（１９８４））。成熟好中球輸血を用いる際 に大きな問題となるのは、もし輸血された成熟好中球がレシピ−エンド各人にお いて正常に機能しかつ循環できないならば、有害な反応が起こり悪影響を伴う（ ＷｒｉｇｈｔＳＴｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃ ｉｎｅ、Ｖｏｌ、７６：６３７−６４４　（１９８４））。

米国特許第４，７１４，６８０号は、成熟リンパ球および骨髄細胞を実質的に含 まないがコロニー形成細胞をさらに破壊することができるヒトリンパ造血幹細胞 の懸濁液を記載している。このような組成物は、幹細胞からの好中球の産生に約 １０−１５日を要するという事実を考えれば好中球減少症の治療に使用できるが 、しかし、このような組成物も好中球減少症の期間を短縮しないであろう。

米国特許第５，００４，６８１号は、新生児または胎児血液の凍結保存造血幹細 胞および始原細胞、および、上記幹細胞および始原細胞を融解し治療に適用する ことに関連している。特に、本発明は、造血系（または免疫）再構成のための胎 児または新生児幹細胞の治療への適用に関連している。

米国特許第５，０６１，６２０号は、ヒト造血幹細胞と５％未満の系統関与細胞 との細胞性組成物を得る方法を記載している。また、このような組成物は、好中 球減少症の治療に使用することもできるが、同様に、このような組成物は、好中 球減少症の期間を短縮しないであろう。その理由として、好中球が幹細胞および ＣＦＵ−ＧＥＭＭから分化するのに１０−１５日を要することが挙げられるであ ろう。

米国特許第５，０８７，５７０号は、分化または関与造血細胞を実質的に含まな い濃厚造血幹細胞組成物に関している。前記細胞は、ある特定のマーカーを有す る細胞を除去することおよびその他の特定のマーカーを有する細胞を選択するこ とによって、得られる。結果としての組成物を用いて、各造血系統または造血系 統群を付与し、宿主の幹細胞を再構成し、かつ、種々の造血成長因子の定量法を 同定する。

完全に排除するのではないにしても好中球減少症の期間を顕著に短縮させるため の有効な手段が、依然として必要とされている。このような治療によって、ＩＤ Ｃまたは従来の癌療法に関連するもののようなその他の形態の化学療法を受けた 患者は感染と闘うことができ、それによって、完全に排除するとはいわないまで も罹患および死亡のリスクを減少させることができる。同様の利点が、薬剤、毒 物、放射線または疾病誘発好中球減少症または遺伝的／先天的好中球減少症に罹 患している患者で現実のものとなる。さらに、また、このような治療を用いて、 重篤な好中球減少症に罹患していないにもかかわらず好中球レベルが低下してい る患者を治療することができる。

Ｒ襲卑豊釣 本発明は、ヒト好中球前駆細胞組成物を提供し、この細胞性組成物は、少なくと も約１６％の骨髄芽球および前骨髄球および少なくとも約５０個の細胞を産生ず る約５％未満のコロニー形成単位（ＣＦ　Ｕ）からなることを特徴とする。これ とは別に、前記組成物の細胞性成分は、少なくとも１６％のＣＤ１５＋ＣＤ１１ ｂ−細胞からなり、その少なくとも６０％が骨髄芽球および前骨髄球である。前 記骨髄芽球および前骨髄球は増殖し分割好中球に分化する能力を有している。前 記好中球前駆体は、ＢＦＵ−Ｅを含む赤血球系統関与細胞を実質的含有しなくす るように精製することかできる。前記組成物は、さらに、骨髄球、後骨髄球、バ ント状好中球、および／または分割好中球からなることができる。前記の骨髄球 、後骨髄球、バンド状好中球および／または分割好中球は、インビトロ好中球前 駆細胞から由来することもできる。好中球前駆細胞自体は、末梢血、骨髄または 謄帯血から由来することかできる。

本発明は、また、好中球減少症に罹患している患者を治療する方法を提供する。

この好中球減少症は、ＨＤ　Ｃ１従来の癌療法、薬剤、疾病、遺伝的疾患、毒物 、および放射線の結果であることもある。また、本発明は、重篤な好中球減少症 に罹患していないが好中球数か減少している患者の治療方法も提供する。前記方 法は、上記に記載の組成物を投与することからなる。前記投与方法は、静注する こともでき、幹細胞およびその他の系統非関連細胞を投与して補助することもで きる。

本発明は、さらに遺伝子療法を提供し、本療法は、化学療法剤または好中球成分 の欠失または異常に対して耐性の遺伝子のような遺伝子を好中球始原細胞中に安 定して導入すること、その後この好中球始原細胞をインビトロで培養し増殖させ 好中球前駆細胞に分化させること、および遺伝的に改変させた好中球前駆細胞か らなる組成物をたとえば静注で化学療法剤を受けるかも知れない患者に投与する ことまたは好中球異常を改善するために投与することからなることを特徴とする 。これとは別に、前記遺伝子は患者に投与するために好中球前駆細胞中に導入本 発明のその他の発明的特徴と利点は下記の説明から明らかとなるであろう。

図面Ω皿巣ム説朋 図１は細胞形態、細胞表面抗原発現、および遷移時間の観点からみた好中球分化 を示す。

図２は細胞総数が４０倍以上になる２６日間培養の動態を示す。

図３はＣＤ３４＋細胞の２１日間培養におけるＣＤ１５およびＣＤｌｌｂ分化を 示す。

図４は第５図に示した形態決定のためのＣＤ１５およびＣＤ１１ｂソ一ト細胞図 ５は第４図に示したＣＤ１５およびＣＤ１１ｂソート細胞の形態を示す。

女　な５　の−　な！■ 本発明は、濃厚ヒト好中球前駆細胞群を提供する。前記濃厚ヒト好中球前駆細胞 群は、ヒト幹細胞および／または好中球始原細胞のインビトロ培養に由来してい る。前記ヒト幹細胞および／または好中球始原細胞は、請帯血のような胎児また は新生児または成人の肝であってもその他の造血系細胞源も使用することができ るが、骨髄または末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）から得ることができる。ヒト好中球 始原細胞の特定供給源は、結果として得られる好中球前駆細胞群が適用される特 定の用途に一部ではあるが依存するであろう。

研究への適用ではいかなるヒト好中球始原細胞源も使用することができるが、骨 髄、特に同種間骨髄に対して自家骨髄、および末梢血ＣＤ３４＋細胞が、癌療法 を受けている患者またはＩ　Ｄ　Ｃ以後に好中球減少症となっている患者の治療 のためのヒト好中球始原細胞の好適な供給源である。このような細胞供給源は、 また、疾患、薬剤、毒物または放射線によって誘発された好中球減少症または遺 伝的好中球減少症に罹患している患者の治療に好適である。さらに、上記の細胞 供給源は、また、好中球減少症自体にはかかっていないがしかし好中球群が減少 している患者の治療に有用である。

骨髄細胞は、腸骨稜、脛骨、大腿骨、胸骨のような骨髄源からまたは別の骨体か ら得ることができる。骨髄は、当業者に周知の手技によフて前記骨から吸引する ことができる。前記骨髄は、同種間移植の場合にはドナーから採取するか、また は、自家移植の場合には患者自身から採取することができる。骨髄は、回収細胞 の意図する用途に主に応じて、所望のように処理することができる。

白血球、特に単核球（ＭＮＣ）は、白血球搬出法によって末梢血から採取するこ とができる。その後、前記ＭＮＣを固相に結合させたＣＤ３４またはその他の幹 および／または始原細胞認識系のようなモノクローナル抗体を含有する装置中を 通過させる。このＣＤ３４モノクローナル抗体は、好中球始原細胞を含むＣＤ３ ４＋細胞を結合し、前記細胞の残りは、結合されずに前記装置を通過する。十分 な数の好中球始原細胞を単離させ、患者を前記装置からはずす。このような方法 の利点は、極大屯の血液から極めて稀な末梢血幹細胞および始原細胞の採取を可 能とし、ドナーには骨髄採取に伴う費用と苦痛および麻酔、鎮痛、輸血および感 染のリスクを回避させることができることである。

その他の供給源から得られた好中球始原細胞は、実質的に粗い分離によってその 他の細胞から採取用に分離できる。赤血球およびリンパ球系統に沿って分化させ ることに関与する細胞のような多数の系統関与細胞は、もし所望であれば除去で きる。しかし、前記好中球始原細胞から系統関与細胞の所望でないいかなる属ま たはあらゆる属を除去することが必要ではないことが当業者には理解されるであ ろう。ある形態の陽性選択がいかなる精製プロトコールでも用いることができる ので、前記所望でない系統関与細胞は選択されないであろう。前記所望でない系 統関与細胞の全てについて最初にある形態の陰性選択を行い、最終的な好中球始 原細胞の陽性選択に際して上記細胞数を最小とする。陰性選択すなわち細胞除去 と陽性選択すなわち細胞ｔ４ｉ離とを併用することによって、実質的に均質な好 中球始原細胞を得ることかできる。

種々の手技を用いて、その他の系統関与細胞から好中球始原細胞を分離すること ができる。実質的に粗い分離について、すなわち、存在する総細胞の１０％まで 、通常約５％以下、一般に約１％以下がたとえばＣＤ３４のような′陽性選択マ ーカーを有する場合の分離について、効率の異なる種々の手技を用いることがで きる。使用した分離手技は、採取する細胞分画の生存性維持を最大とするもので あるべきである。用いる特定の手技は、当然、分離効率、方法の細胞毒性、分離 の容易さおよび速度、および必要な設備および／または技術的熟練度に依存する であろう。

分離操作には、抗体塗布磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグ ラフィ、モノクローナル抗体に結合させたかまたは補体と結合させて使用する細 胞毒性物質、および固相マトリックスに結合させたモノクローナル抗体を利用す る”パニング、または別の便利な手技が含まれる。磁気ビーズまたはその他のア ガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空ファイバー膜およびプラスチックシ ャーレのような固相マトリックスに結合させた抗体は、直接分離を可能とする。

前記抗体を結合させた細胞は、単純に前記固相を前記細胞懸濁液から物理的に分 離することによって除去できる。固相結合抗体と細胞とのインキュベーションの 正確な条件および時間は、使用した系に特異的な数種の要因により強く依存する であろう。しかし、適当な条件の選択は、当業者に周知である。

その後、未結合細胞を、ＣＤ３４＋細胞が前記固相結合抗体に結合するように十 分な時間を与えてから生理的緩衝液で溶出するかまたは洗い流すことができる。

その後、結合細胞を、固相と使用した抗体の性質に主に依存していかなる適当な 方法でも前記固相から分離する。

抗体は、ビオチンに結合させることができ、その後、支持体に結合させたアビジ ンまたはストレプトアビジンまたは蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）で使用す ることができる蛍光発色団によって除去することができ、細胞分離が可能となる 。ＦＡＣＳは、その他のより高度の検出レベルの中でも、複数のカラーチャンネ ル、低角度および鈍角光分散検出チャンネル、およびインピーダンスチャンネル を使用し、細胞を分離、すなわち、選別する。所望の細胞の生存性を損なうもの でない限り、いかなる手技も用いることができる。

最初に、始原細胞を、細胞表面ＣＤ３４発現によってその他の細胞から分離でき る。たとえば、ＣＤ３４＋細胞は、磁気ビーズをＣＤ３４−反応性モツクローナ ル抗体を塗布した磁気ビーズ分離によって陽性として選別できる。このＣＤ３４ ＋細胞を次に、磁気ビーズから除去できる。ＣＤ３４＋細胞の磁気ビーズからの 放出は、培養放出またはその他の方法によって行うことができる。単離されたＣ Ｄ３４＋細胞の純度は、もし所望であればたとえばＦＡＣ３ＣＡＮ”フローサイ トメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＳＳａｎ　ＪｏｓｅＳ　ＣＡ） によってチェックできる。ＣＤ３４＋細胞を濃厚にすることが好適であり、使用 した培地の用量を最小としかつ培養中の選択された細胞のその後の増殖と分化に 影響を及ぼす因子を産生ずるアクセサリ−細胞を生きているものも死んだものも または死につつあるものも両者を除去する。しカル、この濃厚ＣＤ３４＋細胞群 が必ずしも純粋である必要はない。

生成した濃厚好中球始原細胞群を次に培養し増殖させ、かつ、好中球前駆細胞に 分化させる。濃厚となったＣＤ３４＋細胞調製物を、培養用プレート中の適当な 培地にいれる。培養用プレート中培地が明確規定されかつ濃厚であるのが、好都 合である。適切な培地の例として、ＭｃＣｏｙ’　ｓ　５Ａ培地（Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ。

Ｓ　ｔ、Ｌｏ　ｕ　ｉ　ｓ、　ＭＯ）があり、これは、さらに、ウシ胎児血清（ Ｈｙｃｌ。

ｎｅＳＬｏｇａｎＳＵＴ）　、ウマ血清（Ｈｙｃ　Ｉ　ｏｎｅ）　、ハイドロコ ーチシン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）　、α−チオグリセロール、およびゲンタマイシン （Ｇｉｂｃｏ）を含有する。前記培地は、さらに、組換えＩ　Ｌ−３（ｒ　Ｉ　 Ｌ−３）　、組換えＧ−Ｃ８Ｆ　（ｒＧ−Ｃ３Ｆ）　、組換えＧＭ−Ｃ５Ｆ　（ ｒＧＭ−Ｃ５Ｆ）（Ａｍｇｅｎ。

Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、ＣＡ）、Ｃ−ｋｉｔ　リガンド（スティール因子 ）、および幹細胞因子（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｂｏｓ　ｔｏｎ、ＭＡ）のような造血 系成長因子からなるはずである。当業者であれば、その他の適切な培地およびそ の他の適切な造血系成長因子か種々の組み合わせで使用できることを理解するで あろう。

前記培地が培養期間中に交換されないことが望ましい。ただし、週単位で前記培 養物に栄養を与えるべきではあるが。しかし、ある場合には、培地を少なくとも １週間におよそ１回または２回、時々交換することが望ましい場合もある。しか し、骨髄から得られたＣＤ３４＋濃厚細胞群は、上記に記載のようなある培養条 件下では増殖しないＣＤ１９＋ＣＤ３４＋細胞を有意数、含有することもある。

当業者であれば、好中球前駆細胞の強い増殖が、完全とはいわないまでも有意に ＣＤ１９＋細胞を欠失している骨髄ＣＤ３４＋細胞を用いて得ることもでき、ま たはこれとは別に、ＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ１９＋細胞群が極めて減少している 調帯または末梢血から得ることもできることが、理解されるであろう。

培養期間中の選択した日において、細胞アリコツトを取り出しかつ蛍光結合ＣＤ １５およびＣＤ１１ｂモノクローナル抗体で標識し、ＣＤ１５およびＣＤ１１ｂ 細胞表面抗原の発現に基づいてＦＡＣ３ＣＡＮ”フローサイトメータ（Ｂｅｅｔ ｏｎ　ＤｉｓｋｉｎｓｏｎＳＳａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で選別する。ＣＤ１５お よびＣＤ１１ｂ抗原発現によって選別された細胞を、さらに、形態およびコロニ ー形成単位の能力で特性解析できる。細胞は、形状によって、骨髄芽球、前骨髄 球、分割好中球、前単核球および単核球として特性解析できる。コロニーアッセ イは、その他の培地成分と成長因子類を含有するメチルセルロース中で実施でき 、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭの存在を決定 できる。

適当な時間培養後、少なくとも約６０％が骨髄芽球および前骨髄球であるＣＤ１ ５＋ＣＤ１１ｂ−細胞を単離し、好中球減少症に罹患している患者の治療に使用 できる。好中球前駆細胞は、細胞性成分が少なくとも約１６％の骨髄芽球および 前骨髄球および少なくとも約５０個の細胞のコロニー形成単位約５％未満からな る組成物の形状で投与できる。これとは別に、前記組成物の細胞性成分は、少な くとも６０％が骨髄芽球および前骨髄球であるＣＤ１５＋Ｃｄ１ｌｂ−細胞少な くとも約１６％および少なくとも約５０個の細胞のコロニー形成単位約５％未満 からなることもできる。前記骨髄芽球および前骨髄球は、増殖しかつ分割好中球 に分化する能力を有している。前記組成物類は、精製してＢＦＵ−Ｅを含む赤血 球系統関与細胞を実質的に含まないようにすることができる。前記組成物類は、 さらに、骨髄球、後骨髄球、バンド状好中球、および／または分割好中球からな ることができる。前記骨髄球、後骨髄球、バンド状好中球、および／または分割 好中球は、インビトロ好中球前駆細胞に由来することができる。

本発明の組成物の細胞性成分は、好中球前駆細胞、特に骨髄芽球および前骨髄球 が濃厚となっており、骨髄中で通常見られるものを超えている。たとえば、成人 において、骨髄芽球と前骨髄球をまとめた数的範囲はパーセントで１２．５％で ある。また、幼児に近づきつつある新生児および就学前児童においても同様に１ ２．５％である。幼児および学童においては１５．０％であり、かつ、日齢の新 生児では１０．０％しかない。（Ｇｅｉｇｙ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＴａｂＩ ｅｓ、Ｖｏｌ、３、Ｃ，Ｌｅｎｔｎｅｒ編著、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ、Ｂａ５ｅ １．５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ、１９８４゜）前記組成物は、骨髄移植を必要とし ている患者に対して、この患者の造血および免疫系を再構成するために十分な量 で静注で投与できる。前記組成物は、幹細胞およびその他の系統非関与細胞を添 加することができる。当業者であれば、精確で有効な量を容易に決定でき、この 量は、当然ながら、使用する特定の治療法によって治療される状況そのものに依 存するであろう。

公表された論文をサーベイし、ヒト患者に自家骨髄再構成のために注入したＣＦ Ｕ−ＧＭの数が造血系再構成の成功を示すインジケータとして信用できることが 示唆された（Ｓｐ　ｉ　ｔ　ｚｅ　ｒ、　Ｇ、ら、１９８０ＳＢｌｏｏｄ５５　 （２）：　３１７−３２３　：Ｄｏｕａｙら、１９８６、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏ ｌ、１４：３５８−３６５）。患者の体重で公表されたデータを標準化すること によって、さらに、患者１名の体重を１５０ポンド（６７，５ｋｇ）と仮定する ことによって、自家骨髄細胞を用いる造血系再構成が成功するために必要なＣＦ Ｕ−ＧＭの数を１算すると、２−４２５Ｘ１０“／ｋｇ・患者体重の範囲となり 、ｌ０ＸＩＯ’ＣＦ　Ｕ　−Ｇ　Ｍを超えるものを用いるとより迅速な回復が観 察された。したがって、等量またはより多数の好中球および／または好中球前駆 細胞からなる本発明の組成物を、単独でまたは幹細胞／始原細胞と併用して投与 すると、はるかに短期間にヒト造血系の再構成に成功することが予想される。

好中球前駆細胞か培養で増殖しかつ分化するということおよび長い期間にわたり 生存したままであるという能力を有しているという本発明の独自の特徴の故に、 インビトロ培養から初期量の細胞を単離しこの量の細胞を患者に投与することが 可能である。ある期間経過した後、生存好中球および／または好中球前駆細胞の １個乃至それ以」二のアリコツトをさらに培養から単離し患者に投与することも てきる。

好中球前駆細胞は、また、疾病、薬剤、毒物または放射線によって誘発された好 中球減少症、ならびに、遺伝的すなわち先天的好中球減少症の治療に用途を見い だすこともできる。たとえば、異常好中球前駆細胞は、遺伝子で改変した自家ま たは同種間好中球前駆細胞によって治療することができる。このような遺伝子療 法では、野生型遺伝子をたとえば均質または無作為組換えによって好中球前駆細 胞またはその始原細胞中に導入することが行われる。同様に、薬剤耐性遺伝子は 、好中球前駆細胞またはそれらの始原細胞中に導入でき、好中球前駆細胞および その後方化しより成熟した好中球細胞を１個以上の薬剤、特に化学療法に使用さ れる薬剤に対して耐性とすることが可能である。このような好中球細胞は、化学 療法を受ける以前にまたはその間に患者に移植することもでき、それによって、 化学療法剤によって誘発される好中球減少症のリスクを排除する。特異的に好中 球と関連している疾病以外の疾患も治療でき、この疾患は、ホルモン、酵素、イ ンターフェロン、因子等のような特定の分泌産物に関連している。自然の産生と 平行するタンパク質の産生も、前記タンパク質の産生が誘導遺伝子発現のための 適切な制御配列を用いることによって、通常このようなタンパク質を産生ずる細 胞タイプとは異なる細胞タイプ中で起こるにしても、達成できる。これとは別に 、リボ酵素、アンチセンスまたはその他のメツセージも好中球中に挿入でき、特 定遺伝子産物または疾患に対する感受性を阻害する。

また、この好中球前駆細胞を用いて、重篤な好中球減少症でないが好中球のレベ ルが低下しているヒト患者を治療することができる。このような細胞群は、患者 において既存の好中球レベルを補助しこの細胞群数を増加せることもできるであ ろう。一般に、正常好中球範囲は、好中球的１，８００個／μ！血液乃至好中球 約７，０００個／μｍ血液と考えられている。一部の患者は、好中球約５００個 ／μｌ血液という低い好中球レベルを示すことがあっても、臨床的には病的であ るとは見られない。しかし、好中球レベルが好中球約５００個／μｌ血液以下の 患者は好中球減少症と見なされ、感染と発熱のリスクがある。

また、この好中球前駆細胞を好中球の増殖と分化の研究に使用することもできる 。たとえば、造血系成長因子のような増殖と分化に関連する因子を評価すること ができる。さらに、サイトカインの併用および細胞外条件も評価することができ る。同様に、前記細胞自体を用いて特定培地および流体の細胞増殖および／また は分化活性を評価できる、など。

この好中球前駆細胞は、長い保存期間にわたり液体窒素中で凍結できる。その後 この細胞を融解し必要に応じ使用する。

使用可能な凍結保護剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌ ｏｃｋ、　Ｊ、Ｅ、およびＢ１５ｈｏｐ、Ｍ、Ｗ、Ｈ，，１９５９、Ｎａ　ｔ　 ｕ　ｒｅ１８３：１３９４−１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ、Ｍ、Ｊ、 、１９６１、Ｎａｔｕｒｅ１９０：１２０４−１２０５）、ヘタスターチ、グリ セロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ、Ａ、Ｐ、、１９６０、Ａｎ ｎ、Ｎ。

Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８５：５７６）、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉ ｔｅｒ、　Ｈ，Ａ、およびＲａｖｄｉｎＳＲ，Ｇ、、１９６２、Ｎａｔｕｒｅ１ ９６　：　５４８）　、アルブミン、デキストラン、ショ糖、エチレングリコー ル、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−７ンニトール（Ｒｏｗｅ、Ａ、 Ｗ、ら、１９６２、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、２１　：１５７）、Ｄ−ソルビトール、 ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅｒ、Ｍ、Ａ、ら、 １９６０゜Ｊ、Ａ　１．Ｐｈ　５ｉｏ１．１５：５２０）、アミノ酸（Ｐ　ｈ　 ａ　ｎ　Ｔ　ｈ　ｅＴｒａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｎｄｅｒ、Ｍ、Ａ、、１９６０、Ｅ ｘ、Ｃｅ１ｌＲｅｓ、２０：６５１）、メタノール、アセトアミド、グリセロー ル−酢酸（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ、Ｊ、Ｅ、　、１９５４、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、５ ６：２６５）、および無機塩類（Ｐｈａｎ　Ｔｈｅ　Ｔｒａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｎ ｄｅｒ、Ｍ、Ａ、、１９６０、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘ　、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、 １０４：３８８；Ｐｈａｎ　Ｔｈｅ　Ｔｒａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｎｄｅｒ、Ｍ、Ａ 、　、１９６１、Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏ　Ｐｒｏｃｅ　ｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ｔｈ１ｒｄｄｉ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｒａｄｉｏｌｏ　、１１ ｂｅｒｙ、Ｐ、Ｌ、Ｔ、編著、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、５９頁 ）。

典型的には、前記細胞は、１０％ＤＭＳ０．５０％血清、および４０％ＲＰＭ１ 　１６４０培地中に保存できる。いったん融解したら、適切な造血系成長因子を 導入することによって細胞を増殖させさらに分化するように誘導できる。

これとは別に、前記の好中球前駆細胞は、適切な成長因子を付与することによっ て、培養で増殖させかつ成熟好中球細胞に分化させることもできる。本発明によ って培養した成熟好中球は、約４−５週間培養可能である。単離したばかりの好 中球を成長因子の存在下で培養した場合でも７２時間未満であり、これは典型的 生存期間よりも有意に長い。

下記の実施例はさらに本発明を例示するために役立つが、本発明の範囲を限定す るためではない。

大嵐例１ 本実施例は、陽性選択によってＣＤ３４＋細胞群を濃厚にする好適な方法を記載 している。　単核球細胞を、骨髄から１．０７７ｇ／ｄｌ　Ｈｉｓｔｏｐａｑｕ ｅ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、　ＭＯ）上に単離した。本細 胞を、カルシウム／マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＣＭＦ−Ｐ ＢＳ、Ｇｉ　ｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）で洗浄し、２％ウシ胎 児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）Ｉｓｃｏｖｅｓ改変Ｄｕｌｂｅｃ ｃｏ培地（ＩＭＤＭ、Ｓ　ｉ　ｇｍａ）中にｌＸｌ０’細胞／ｍ＋の濃度となる ように再懸濁した。

細胞をその後、１μｇの抗ＣＤ３４−モノクローナル抗体ＱＢＥＮＤＩＯ（Ｑｕ ａｎｔｕｍ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅｎｇｌａｎｄ）で感作したヒツジ抗マウ ス抗体（Ｄｙｎａｌ、０ｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を塗布した磁気ビーズと接触さ せ、前記細胞懸濁液からＣＤ３４＋細胞を捕捉するために用いた。ＣＤ３４＋細 胞は、基本的に、５ｔｒａｕｓｓら、Ａｍ、Ｊ、Ｐｅｄ、Ｈｅｍａｔｏｌ、０ｎ ｃｏｔ、１３：２１７　（１９９１）に記載のようにしてわずかに改変して、陽 性として選択した。磁気ビーズおよび細胞は、ビーズ：細胞比率１：１または５ ：１で２．５ｒｐｍで４°Ｃ１３０分間回転させた。

ＣＤ３４選択後、ビーズ−細胞複合体を磁気試験管ホールグーを用いて単離した （Ｆｅｎｗａｌ　Ｄｉｖ、、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）６　ＣＭＦ−ＰＢＳで何回か 洗浄した後、このＣＤ３４＋細胞を、ＲＰＭＩ　１６４０　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ） 中５０Ｕ／ｍｌのＣｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ”　（Ｂｏｏｔｅｓ　Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃ３１　Ｃｏ、、ｌ、１ｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ、ＩＬ）を添加するこ とおよび３７°Ｃの水浴中で１５分間インキュベーションすることによって、ビ ーズから放出させた。

ビーズから放出された細胞は、ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体、すなわち 、Ｆ　ＩＴＣ−８Ｇ１２　（Ｆｅｎｗａ　Ｉ）で氷上で１５分間染色することニ ヨッておよびこの染色された細胞をサイドスキャッタ一対蛍光ディスプレイを用 いるＦＡＣ８ＣＡＮ　フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で定量することによって、評価した。このＣＤ３４ ＋細胞群は、Ｆ　ｒＴｃ蛍光と低すイドスキャッターを有する群として分解され た。

本操作に従って得られたＣＤ３４＋細胞の純度は、第１表に示したように、平均 で６６±１６％（平均±ＩＳ、Ｄ、　、ｎ＝７）であり、その範囲は、約４０％ から約９３％であった。

実験　初期細胞　培養　細胞＃　％ＣＤ１５十　％ＣＤ１５＋＃　調製物　日数 　の増加　ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１Ｂ＋％ＣＤ　ＣＤ３４＋中　倍数　領域Ｂ　領 域Ｃ３４＋　ＣＤ１９の％ １　５４　Ｎ、Ｄ、　１２　８．３　２　７９２　６９　Ｎ、Ｄ。　１２　６． ９　５０　４７３　９３　Ｎ、Ｄ、　１２　３．３　１１　７４４　５５　４９ 　１１　２．７　５２　３０５　７９　５８　１２　１２．２　４１　３９６　 ４０　５５　１２　７．８　４５　３６７　７２　７３　１０　３．７　５８　 １２平均　６６　５９　平均（ＤＩＯ−１２）　６　、４　３７　４５　、３Ｓ 、Ｄ、１６９ Ｎ、Ｄ、＝未決定 大嵐例又 本実施例は、ＣＤ３４＋細胞のインビトロ培養の好適な方法を記載している。

ＣＤ３４＋細胞の濃厚調製物を、４ウエル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｏ ｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、ＣＡ）または２５−７５ｃｍ”７ラスコ（Ｃｏｓｔｅｒ 、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中に最初の細胞濃度をウシ胎児血清（Ｓ　ｉ　ｇ ｍａ）１２．５％、ウマ血清（Ｈｙｃ　１ｏｎｅ）１２．５％、１０μＭ　ハイ ドロコーチシン（Ｓ　ｆ　ｇｍａ）　、１０μＭ　ａ−チオグリセロール（Ｓ　 ｉ　ｇｍａ）および１０μｇ／ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）含有ＭｃＣｏｙ’ 　ｓ　５Ａ培地（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）中１−２Ｘ１０’細胞／ｍ＋として入れた。

組換え成長因子ｒｌＬ−３、ｒＧ−Ｃ８Ｆ、およびｒＧＭ−Ｃ３Ｆ　（Ａｍｇｅ ｎ、ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ、ＣＡ）を、それぞれ、濃度３００Ｕ／ｍｌ、２ ００Ｕ／ｍ！および３００Ｕ／ｍｌで添加した。

本培養物を５％ＣＯ，１５％０．，３７°Ｃの高湿度インキュベーター中に入れ 、これらの条件下で３７日間までインキュベーションした。本培養物に対して、 週間隔で上記の培地を添加し、細胞濃度を１−２Ｘ１０’細胞／ｍｌに戻した。

第２図は、ＣＤ３４＋濃厚細胞群がインビトロで極めて増殖性であることを示し ている。細胞総数は、第１０−１２日まで漸次増加し、この時点で強い増加が観 察された。細胞増殖は培養２０日以降も継続し、これらの培養物中で産生された 細胞は、約３７日まで生存を保持できた。濃厚ＣＤ３４＋始原細胞群は１０−１ ２日で平均６．４±３．４倍および２６−３５日以降は平均５６±１５．６倍に 増殖することが可能であった（第１表参照）。ＣＤ３４＋細胞の比率は、漸次低 下し、培養７−１０日以降は約５％未満の細胞がＣＤ３４＋であり、このことは 、ＣＤ３４＋好中球始原細胞が好中球前駆細胞および成熟分割好中球に分化した ことを示唆している。ＣＤｌ５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の増加が証拠となる成熟した 分割好中球の増加を第３図に示した。

大嵐例１ 本実施例は、培養ＣＤ３４＋細胞の表現型の変化を評価するために用いた方法を 説明するものである。

ＣＤ３４＋細胞培養中のある選択した日において、１−２Ｘ１０’細胞アリコツ トを培養プレートまたはフラスコから取り出し、０．０５％ウシ血清アルブミン および０．１％アジド含有リン酸緩衝生理食塩水中で１回または２回洗浄した。

その後、本細胞をＣＤ１５　（ＬｅｕＭｌ）ＦＩＴＣ結合およびＣＤ１１ｂ　（ Ｌｅｕ１５）ＰＥ結合モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）で氷上で１０分間標識 した。

ＰＡＢ中でもう一度洗浄し、細胞をＰＡＢ　１ｍｌ中に懸濁しＣＤ１５およびＣ Ｄ１ｌｂの発現をＦＡＣ３ＣＡＮ”　フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉ ｅｋｉｎｓｏｎ）を用いて調べた。

濃厚前骨髄球（第０日）は、第３図および第４図の領域Ｃに示したように、大１ １（７）ＣＤＩ　５＋ＣＤ１　ｌ　ｂ＋細胞を含有シテイル。、：のＲのＣＤ１ ５＋ＣＤ１１ｂ十細胞は、後骨髄球、バンド状好中球および分割好中球を示して いる。少数のＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞も同様に骨髄で見られる（第３図およ び第４図、領域Ｂ）。この群のＣＤｌ５＋ＣＤ１１ｂ−細胞は、前骨髄球および 骨髄球を示している。

濃厚ＣＤ３４＋細胞調製物（４厚にした後、第０日）は、第３図に示したように ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の一部を保持している。しがし、培養３日後におい て、ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ一群が第３図に示したように観察される。この群のＣ Ｄｌ５＋ＣＤ１１ｂ−細胞は、さらに、第７−１０日まで増加し、および第１３ −２０日から、ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ十群が観察される。このｃＤ１５＋ＣＤ１ １ｂ＋群は、培養物が分割好中球に成熟したことを示唆している。ＣＤ１５−Ｃ Ｄ１１ｂ＋群は第４図の領域りに示されており、培養第３−１３日に観察された が、培養第１３日以降は、単核球またはマクロファージを示すこの特定細胞群は もはや存在しなかった。

実施例Ａ 本実施例は、培養ＣＤ３４＋細胞の形状の変化を評価するために用いた方法を説 明している。

実施例３に定義した細胞をＣＤ１５およびＣＤｌｌｂ発現の観点がらＦＡＣ３ｔ ａｒ”フローサイトメータでソートし、それらの形状を識別した。約１０，００ ０−３０，０００個の細胞が、試験管またはサイトスピン漏斗にソートされた。

サイトスピンスライドを、このサイトスピン漏斗を６０Ｏｒｐｍで７分間、５ｈ ａｎｄｏｎ　Ｃｙｔｏｓｐｉｎ２（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いて遠心 分離し調製した。その後、細胞をライトギムザ染色（Ｈａｒ　１ｅｃｏ、Ｇｉｂ ｂｓ　ｔｏｗｎ、ＮＪ）で３０秒間染色した。染色後、細胞をリン酸緩衝液（Ｓ ｉｇｍａ）で１分洗浄した。骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、バンド状 好中球および分割好中球の存在ならびに前単核球および単核球の存在について、 スライドを評価した。

第４図の左図に示したＣＤ１５およびＣＤ１１ｂソート新鮮骨髄細胞の形状分析 で、骨髄芽球とリンパ球を領域Ａ　（ＣＤ１５−ＣＤ１１ｂ−）　、前骨髄球と 骨髄球を領域Ｂ　（ＣＤｌ５＋ＣＤ１１ｂ−）　、後骨髄球、バンド状好中球お よび分割好中球を領域Ｃ（ＣＤ　１５＋ＣＤ　１１　ｂ＋）　、および単核球を 領域Ｄ（ＣＤＩ５−ＣＤＩｌｂ＋）で明らかとなった。これらのデータは、示し ていない。

７日間培養したＣＤ１５およびＣＤ１１ｂソートＣＤ３４＋細胞のライトギムザ 染色サイトスピン調製物を形状分析し第４図に示したが、骨髄芽球、リンパ球お よび初期前骨髄球を領域Ａ　（ＣＤ１５−ＣＤ１１ｂ−）、前骨髄球を領域Ｂ（ ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−）　、後骨髄球およびバンド状好中球を領域Ｃ（ＣＤＩ ５＋ＣＤ１　ｌｂ＋）　、およびマクロファージを領域Ｄ　（ＣＤ１５−ｃＤｌ ｌｂ＋）で明らかとした。３５日間培養したソート細胞中領域Ｃの分析（第４図 、右図）から、成熟好中球の存在が明らかとなった。これらのデータは、第５図 、Ａ−Ｈにそれぞれ示しである。これらの研究は、フローサイトメトリで観察さ れた形状の段階が正しいことを証明し、かつ、好中球のインビトロ分化において 、ＣＤ１５およびＣＤｌ１ｂの連続した発現が確認された。

実施例１ 本実施例は、ＣＤ３４＋培養細胞中に存在する増殖性細胞の種類を決定するため に用いたコロニーアッセイを説明する。

ＣＤ３４＋細胞培養のある選択した日において、細胞アリコツトをメチルセルロ ース、ｌ５ｃｏｖｅ’　ｓ　ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ）、３０％ＦＢＳ　（Ｓ　ｉ 　ｇｍａ）、７％Ｌｅｐｔａｌｂ　（Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌｓ。

Ｋａｎｋａｋｅｅ、ＩＬ）およびそれぞれ、濃度１５０Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍ １．１５０Ｕ／ｍｌ、１６０Ｕ／ｍｌ、ＩＯＵ／ｍｌの組換え成長因子ｒ　Ｉ　 Ｌ　−３、ｒＧＭ−Ｃ３Ｆ、ｒＧ−Ｃ３Ｆ、ｒｌＬ−６およびエリスロポエイチ ン（Ａｍｇｅｎ）含有３５ｍｍのシャーレに入れ、最終濃度５−１０ｘｌＯ’細 胞／ｍ１とした。コロニーアッセイを三重に設定し、このコロニー（約５０個以 上の細胞のＣＦＵすなわちコロニー形成単位）を、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ　 （コロニー形成用位−−マクロファージＬ　ＢＦＵ−Ｅ　Ｃバースト形成単位− 一赤血球）またはＣＦＵ−ＧＥＭＭのいずれかとして計数した。

ＣＦＵ−０Ｍコロニーの数は、培養初期に増加し、平均して１週後４．３倍また は２週後５．６倍になった。第１０日付近でＣＦＵ−ＧＭの最大増加が起こり、 この時点で存在するＣＦＵは主にＣＦＵ−ＧＭであった。これと対照的に、ＢＦ Ｕ−Ｈの数は、一般に、培養２週までに当初の数の半分未満に減少した。同様に 、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＣＦＵ−Ｍの数も減少した。

大施例互 本実施例は、前記の増殖性とＣＤ３４＋培養細胞中に存在するコロニー形成細胞 を評価するために用いた方法を説明する。

ＣＤ３４＋細胞培養中の選択した日（９−１４日）において、前記細胞のアリコ ツトをＣＤ１５およびＣＤ１１ｂに結合する抗体で染色した。実施例３に記載の 領域由来細胞をその後、コロニーアッセイにソートし、以前に使用したものと同 一の液体培養中に入れた。

第１＋表に、４回の実験結果を示した。領域Ａ　（ＣＤ１１ｂ−ＣＤＩ５−）由 来細胞はさらに７日間培養した後約２−５．７倍に増加し続け、約０．４−２％ のコロニー形成細胞を含有している。領域Ｂ　（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１５＋）由来 細胞は約９．５−１２倍に増加し続け、約１．１−３％の非赤血球コロニー形成 細胞を含有している。コロニー形成細胞は領域Ｃに存在せず、その後培養しても 増殖は全く起こらなかった。これらのデータは、前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細 胞が筆旦表 増殖およびＣＤ３４＋細胞高含量の請帯血由来ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１５表現型に存 在するＣＦＣ 実験回数 ％ＣＤ３４　４５　８０　８０　５９ 培養日数　１１　１４　９　９ 細胞変化倍数　＊７２　５４　２７　３４領域Ａ（ｌｌｂ−１５−）　＊＊５． ７　２　ＮＤ　ＮＤ変化倍数 ＣＦＵ−ＧＭ　＊＊１９　１４　８　２９ＣＦＵ−Ｍ　３８　１４　２５　９７ ＢＦＵ−Ｅ　１７　１４　３９　６０ ＣＦＵ−ＭＩＸ　Ｏ０６２２ クローニング効率　０．５５　０，４２　０，７８　２．０８領域Ｂ（ｌｌｂ− １５＋）　９．５　１２　ＮＤ　ＮＤ変化倍数 ＣＦＵ−ＧＭ　４１　６４　１１　２７ＣＦＵ−Ｍ　６９　１８８　２９５　２ ４６ＢＦＵ−Ｅ　０　０　０　０ ＣＦＵ−ＭＩＸ　Ｏ０００ クローニング効率　１．１　２，５２　３．０６　２．７３領域Ｃ（１ｔｂ＋ｔ ５＋）　１．Ｉ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ変化倍数 ＣＦＵ−ＧＭ　ＯＮＤ　９　０ ＣＦＵ−Ｍ　ＯＮＤ　０　０ ＢＦＵ−Ｅ　ＯＮＤ　ＯＯ ＣＦＵ−ＭＩＸ　ＯＮＤ　ＯＯ クローニング効率　０　０　０．０９　０ＮＤ＝　未決定 ＊　初期培養期間における細胞数変化倍数＊＊　さらに７日間培養した後のソー ト表現型からの細胞数変化倍数＊＊＊　ソート表現型の１０４細胞当たりのコロ ニー前記の好中球前駆細胞は、ＨＤＣおよび従来の癌療法のようなその他の化学 療法に関連する好中球減少症、疾病、薬剤、毒物、放射線およびその他の物質に よる好中球減少症、遺伝的好中球減少症の治療に用いることができ、また、重篤 な好中球減少症に罹患しているわけではないが好中球群が減少している患者の治 療に用いることができる。また、前記好中球前駆細胞は、好中球増殖と分化のよ うな好中球の研究に使用することができる。

本文に引用した刊行物および特許出願は全て、各文献がそれぞれ特異的に参考と して引用されたかのように同一程度に参考として引用した。

本発明は、好適な態様を中心として説明してきたが、前記の好適な態様が改変可 能であることが当業者であれば自明であろう。本発明は、特に本文で説明した以 外にも実施することができる。したがって、本発明には、付属のクレームの精神 と範囲に包含されるあらゆる改変を含むものである。

好中球分化 第１図　細胞形態、細胞表面抗原発現および遷移時間の観点から見た好中球分化 第２図　細胞総数が４０倍以上も増加する２６日間培養の動態ＣＤ１５（Ｌｅｕ Ｍｌ　） 初日　培養第７日　培養第３５日 第４図　第５図に示した形態決定のためのＣＤ１５およびＣＤ１１ｂソ一ト細胞 第５図 培養第７日からの骨髄芽球を示す第４図の領域Ａ（ＣＤ１５−１ＣＤ１１ｂ−） 培養第７日からの前骨髄芽球を示す第４図の領域Ｂ（ＣＤ１５＋、ＣＤ１１ｂ− ）新鮮骨髄由来バンド状好中球を示す第４図の領域Ｃ１（ＣＤ１５＋、ＣＤ１１ ｂ＋） 培養第７日からのバンド状好中球を示す第４図の領域Ｃ２（ＣＤ１５＋、ＣＤ１ １ｂ＋）培養第３５日からの分割好中球を示す第４図の領域Ｃ３（ＣＤ１５＋、 ＣＤ１１ｂ＋） 培養第７日からの単核球およびマクロファージを示す第４図の領域Ｃ４（ＣＤＩ ５ｄｉｍ、ＣＤ１１ｂ＋） フロントページの続き （７２）発明者　スミス　ステイーブンアメリカ合衆国、イリノイ州　６０００ ５、アア　ロード　５１０ （７２）発明者　ウンベルザクト、クリステン　エル。

アメリカ合衆国、イリノイ州　６００６７、バラティン　ノース　プラム　ロー ド　２４３（７２）発明者　パン　エプス　デニス　イー。

アメリカ合衆国、イリノイ州　６００１３、キャリー　リバー　ドライブ　１９ ７

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト好中球前駆細胞の組成物で、前記細胞性成分が少なくとも約１６％の骨 髄芽球および前骨髄球および約５％未満のコロニー形成単位からなることを特徴 とする組成物。
2. ２．前記好中球前駆細胞が、増殖しかつ分割好中球に分化する能力を有している ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. ３．ＢＦＵ−Ｅを含む赤血球系統関与細胞を実質的に含まないことを特徴とする 請求の範囲第２項に記載の組成物。
4. ４．さらに、骨髄球、後骨髄球、バンド状好中球および分割好中球からなる群が ら選択される１種以上の細胞タイプからなることを特徴とする請求の範囲第２項 に記載の組成物。
5. ５．前記付加細胞型が前記インビトロ好中球前駆細胞に由来することを特徴とす る請求の範囲第４項に記載の組成物。
6. ６．前記好中球前駆細胞が、末梢血、骨髄、および臍帯血からなる群から選択さ れた原料から得られた好中球始原細胞に由来することを特徴とする請求の範囲第 １項に記載の組成物。
7. ７．前記細胞性成分が少なくとも約１６％のＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−好中球前駆 細胞および約５％未満のコロニー形成単位からなることを特徴とするヒト好中球 前駆細胞の組成物。
8. ８．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が骨髄芽球および前骨髄球からなることを 特徴とする請求の範囲第７項に記載の組成物。
9. ９．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が少なくとも約６０％の骨髄芽球および前 骨髄球からなることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の組成物。
10. １０．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が増殖しかつ分割好中球に分化する能力 を有していることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の組成物。
11. １１．ＢＦＵ−Ｅを含む赤血球系統関与細胞を実質的に含まないことを特徴とす る請求の範囲第１０項に記載の組成物。
12. １２．さらに、骨髄球、後骨髄球、バンド状好中球および分割好中球からなる群 から選択される１種以上の細胞タイプからなることを特徴とする請求の範囲第１ ０項に記載の組成物。
13. １３．前記付加細胞型が前記インビトロ好中球前駆細胞に由来することを特徴と する請求の範囲第１２項に記載の組成物。
14. １４．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が、末梢血、骨髄、および臍帯血からな る群から選択された原料から得られた好中球始原細胞に由来することを特徴とす る請求の範囲第７項に記載の組成物。
15. １５．好中球群が減少しているヒト患者の治療方法で、前記方法が前記患者に対 してヒト好中球前駆細胞組成物を投与することからなり、前記細胞性成分が少な くとも約１６％の骨髄芽球および前骨髄球および約５％未満のコロニー形成単位 からなることを特徴とする治療方法。
16. １６．前記ヒト患者が、大量化学療法（ＨＤＣ）に関連する好中球減少症、およ び従来の癌療法に関連する好中球減少症、薬剤誘発好中球減少症、疾病誘発好中 球減少症、遺伝的好中球減少症、毒物誘発好中球減少症、および放射線誘発好中 球減少症からなる群から選択された好中球減少症に罹患していることを特徴とす る請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. １７．前記組成物が静注で投与されることを特徴とする請求の範囲第１５項に記 載の方法。
18. １８．前記好中球前駆細胞が増殖しかつ分割好中球に分化する能力を有している ことを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の方法。
19. １９．ＢＦＵ−Ｅを含む赤血球系統関与細胞を実質的に含まないことを特徴とす る請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．さらに、骨髄球、後骨髄球、バンド状好中球および分割好中球からなる群 から選択される１種以上の細胞タイプからなることを特徴とする請求の範囲第１ ８項に記載の方法。
21. ２１．前記付加細胞型が前記インビトロ好中球前駆細胞に由来することを特徴と する請求の範囲第２０項に記載の方法。
22. ２２．前記好中球前駆細胞が、末梢血、骨髄、および臍帯血からなる群から選択 された原料から得られた好中球始原細胞に由来することを特徴とする請求の範囲 第１５項に記載の方法。
23. ２３．前記方法がさらに、幹細胞およびその他の始原細胞の併用投与からなるこ とを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の方法。
24. ２４．好中球群が減少しているヒト患者を治療する方法で、前記方法が、前記患 者に対してヒト好中球前駆細胞の組成物を投与することからなり、前記細胞性成 分が少なくとも約１６％のＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−好中球前駆細胞および約５％ 未満のコロニー形成単位からなることを特徴とする方法。
25. ２５．前記ヒト患者が、大量化学療法（ＨＤＣ）に関連する好中球減少症、およ び従来の癌療法に関連する好中球減少症、薬剤誘発好中球減少症、疾患誘発好中 球減少症、遺伝的好中球減少症、毒物誘発好中球減少症、および放射線誘発好中 球減少症からなる群から選択された好中球減少症に罹患していることを特徴とす る請求の範囲第２４項に記載の方法。
26. ２６．前記組成物が静注で投与されることを特徴とする請求の範囲第２４項に記 載の方法。
27. ２７．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が骨髄芽球および前骨髄球からなること を特徴とする請求の範囲第２４項に記載の方法。
28. ２８．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が少なくとも約６０％の骨髄芽球および 前骨髄球からなることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。
29. ２９．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が増殖しかつ分割好中球に分化する能力 を有していることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の方法。
30. ３０．前記組成物がＢＦＵ−Ｅを含む赤血球系統関与細胞を実質的に含まないこ とを特徴とする請求の範囲第２９項に記載の方法。
31. ３１．前記組成物が、さらに、骨髄球、後骨髄球、バンド状好中球および分割好 中球からなる群から選択される１種以上の細胞型からなることを特徴とする請求 の範囲２９項に記載の方法。
32. ３２．前記付加細胞型が前記インビトロ好中球前駆細胞に由来することを特徴と する請求の範囲第３１項に記載の方法。
33. ３３．前記ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ−細胞が、末梢血、骨髄、および臍帯血からな る群から選択された原料から得られた好中球始原細胞に由来することを特徴とす る請求の範囲第２４項に記載の方法。
34. ３４．前記方法がさらに、幹細胞およびその他の始原細胞の併用投与からなるこ とを特徴とする請求の範囲第２４項に記載の方法。
35. ３５．ヒト遺伝子治療法で、 （ａ）野生型ヒト遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択されるＤＮＡ の好中球始原細胞中への導入、 （ｂ）前記好中球始原細胞の増殖と好中球前駆細胞への分化、および（ｃ）前記 好中球前駆細胞からなる組成物の患者への投与からなることを特徴とする治療法 。
36. ３６．前記組成物が静注で投与されることを特徴とする請求の範囲第３５項に記 載の治療法。
37. ３７．前記薬剤耐性遺伝子が、化学療法剤耐性の遺伝子であることおよび前記患 者が前記化学療法剤を受けることを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の治療 法。
38. ３８．ヒト遺伝子治療法で、 （ａ）野生型ヒト遺伝子および薬剤耐性遺伝子からなる群から選択されるＤＮＡ の好中球始原細胞中への導入、および（ｂ）前記好中球前駆細胞からなる組成物 の患者への投与からなることを特徴とする治療法。
39. ３９．前記組成物が静注で投与されることを特徴とする請求の範囲第３８項に記 載の治療法。
40. ４０．前記薬剤耐性遺伝子が、化学療法剤耐性の遺伝子であることおよび前記患 者が前記化学療法剤を受けることを特徴とする請求の範囲第３８項に記載の治療 法。