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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft die Zellselektions- und -expansionstechnik, und
insbesondere eine Ausrüstung
für die
extrakorporale Zellkultur und Zelltransplantation.
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ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
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Zytoreduktive
Therapien beinhalten die Verabreichung ionisierender Strahlung oder
chemischer Toxine, die schnell teilende Zellen töten. Normalerweise entstehen
Nebenwirkungen durch die zytotoxischen Auswirkungen auf normale
Zellen und können den
Einsatz zytoreduktiver Therapien einschränken. Eine häufig zu
beobachtende Nebenwirkung ist Myelosuppression, oder Schädigung von
Knochenmarkszellen, was einen Anstieg weißer und roter Blutkörperchen
und Blutplättchen
ergibt. Durch Myelosuppression entwickeln Patienten Zytopenie, oder
Blutzellenverminderung, welche das Risiko von Infektionen und Blutungsstörungen erhöht. Zytopenien
erhöhen
Morbidität,
Mortalität
und führen
zu einer Unterdosierung bei der Krebsbehandlung. Andererseits ist die
hochdosierte Chemotherapie therapeutisch von Vorteil, weil sie im
Vergleich zur Standarddosistherapie eine erhöhte Häufigkeit der Abwehrreaktion
bei Patienten mit metastatischen Krebsen, insbesondere Brustkrebs,
erzeugen können.
Dies kann selbst bei einigen Patienten mit einer schlechten Prognose
zu einer längeren
krankheitsfreien Remission führen. Dennoch
ist die hochdosierte Chemotherapie toxisch und viele der klinischen
Komplikationen betreffen Infektionen, Blutungsstörungen und andere Auswirkungen
in Verbindung mit anhaltenden Myelosuppressionsperioden.
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Viele
klinische Forscher haben die Dosiersysteme und -zeitpläne der zytoreduktiven
Therapie manipuliert, um die Dosierung für die Krebstherapie zu erhöhen, während die
Schädigung
des Knochenmarks eingeschränkt
wird. Ein alternatives Verfahren nutzt die Tatsache, dass Blutzellen
aus hämatopoietischen
Stammzellen ent stehen, welche sich spezifisch entlang bestimmter
Abstammungslinien differenzieren, d. h. erythroider, megakaryozytischen, granulozytischen,
monozytischen und lymphozytischen Linien. Die gezielte Beschäftigung
mit diesen Stammzellen zur Zellseparation ist daher von großem Interesse
bei der Behandlung von Krebspatienten, welche sich einer zytoreduktiven
Therapie unterziehen. Ein therapeutischer Ansatz beinhaltet Knochenmark-
oder periphere Blutzellentransplantate, aus denen vor der zytoreduktiven
Therapie Knochenmark oder zirkulierende hämatopoietische Vorläufer- oder
Stammzellen entnommen und in Zellkultur proliferiert werden. Die
expandierte Zellpopulation kann dann nach der Therapie mit Hilfe
von Reinfusion wieder an den Patienten zurückgegeben werden, um die komplette
hämatopoietische
Funktion wieder herzustellen. Gegebenenfalls kann ein Auswahlschritt
eingesetzt werden, um die relative Anzahl der hämatopoietischen Vorläufer in
dem entnommenen Explantat zu erhöhen.
Durch die Reinfusion isolierter Stamm- oder Vorläuferzellen kann die Reinfusion
anderer Zelltypen, einschließlich
maligner Zellen, bedeutend minimiert werden. Zusätzlich kann während der
allogenen Transplantation durch die Auswahl von lediglich Stamm-
oder Vorläuferzellen
die Anzahl der transplantierten T-Zellen bedeutend reduziert werden,
um das Risiko der Induzierung der Graft-versus-host-Krankheit (GvHD)
beim Patienten zu minimieren.
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Es
ist eine Vielzahl von Zellauswahlmethoden zum Identifizieren und
Separieren hämatopoietischer
Stamm- oder Vorläuferzellen
aus einer Zellpopulation bekannt. Die Verfahren und Materialien
zum Identifizieren und Selektieren solcher Zelltypen sind bekannt.
Zum Beispiel können
monoklonale Antikörper
eingesetzt werden, um sich an ein Markerprotein oder ein Oberflächenantigenprotein
zu binden, welches sich auf Stamm- oder Vorläuferzellen befindet. Zu solchen
Markern oder Zelloberflächenantigenen für hämatopoietische
Stammzellen gehören
CD34, My-10 und Thy-1. Bei einem Verfahren sind die Antikörper auf
einer Oberfläche,
zum Beispiel Glasperlen, fixiert und werden mit einer Mischung aus
Zellen, von denen angenommen wird, dass die Stammzellen enthält, in Kontakt
gebracht. Dies erlaubt es den Antikörpern, die Stammzellen so sicher
an die Glasperlen zu binden. Alternativ dazu können die Antikörper mit
der Zellmischung inkubiert werden und die so ent stehende Kombination
wird mit einer Oberfläche
in Kontakt gebracht, die eine Affinität für den Antikörperzellenkomplex aufweist.
Unerwünschte
Zellen und Zellmasse werden entfernt, wodurch eine relativ reine
Stammzellenpopulation bereitgestellt wird. Stammzellen mit dem CD34-Marker
machen nur etwa 1% bis 3% der mononukleären Zellen im Knochenmark aus.
Die Menge von CD34+-Stammzellen im peripheren
Blut ist um etwa das 10- bis 100-fache geringer als im Knochenmark.
So sind Verfahren zum Erhöhen
oder Expandieren der Anzahl isolierter Stammzellen erwünscht, um
die Anzahl der entnommenen Stammzellen, die aus dem Knochenmark
des peripheren Blutes benötigt
werden zu reduzieren, um eine schnelle und vollständige Knochenmarkserholung
nach ablativen Dosen von Strahlen- oder Chemotherapie bereitzustellen.
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Ein
weiteres Verfahren der Zellselektion beinhaltet das Eliminieren
sich teilender Zellen durch Verwendung bestimmter Antimetaboliten.
Durch die Kombination der Zytokinstimulation mit einer Antimetabolitenbehandlung
kann in ansprechende Zellen der Zelltod induziert werden. Dadurch
können
gegen die proliferativen Effekte des/der Zytokine/s resistente Zellen
positiv ausgewählt
werden. Siehe Berardi et al., Science, 267: 104 (1995).
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Bragger
et al., Blood 81 (10) 1993, S. 2579–2584 bezieht sich auf die
Auswirkungen verschiedener Wachstumsfaktoren auf die ex vivo Expansion
von CD34+-Vorläuferzellen
für die
mögliche Verwendung
bei der Transplantationstherapie. US-Patentschrift 5,199,942 beschreibt
ein Verfahren für
die autologe, hämatopoietische
Zelltransplantation bei einem Patienten, welcher sich einer zytoreduktiven
Therapie unterzieht.
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Die
Verwendung expandierter Stammzellen ermöglicht die Transplantation
auch in Situationen, in denen keine adäquate Anzahl von Stammzellen
entnommen werden kann. Ein als extrakorporale Stammzellenkultur
und -transplantation bezeichnetes Verfahren (ESCCAT), auch bekannt
als ex vivo Expansion, beinhaltet das Entfernen autologer oder allogener
Stammzellen, normalerweise aus peripherem Blut, Knochenmark oder
Nabelschnurblut, sowie das Isolieren der Stammzellen gefolgt von
der in vitro Expansion dieser Zellen. Nach der Expansion gelangen
die Zellen mittels Infusion wieder in den Patienten zurück.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft eine Zellselektions- und -expansionstechnik,
und insbesondere die extrakorporale Stammzellenkultur und -transplantation
(ESCCAT). Speziell betrifft die Erfindung eine Ausrüstung für die extrakorporale
Zellkultur und Zelltransplantation, welche ein Zellbindungsprotein
für humane
hämatopoietische
Stamm- oder Vorläuferzellen
in einer Zellmischung entnommen aus einem Menschen umfasst, jedoch
nicht darauf beschränkt
ist. Das Zellbindungsprotein enthält mindestens ein flt3-Rezeptor-Bindungsprotein
und einen monoklonalen Antikörper,
welcher an einen zellulären
Marker bindet, der aus der Gruppe bestehend aus: CD34, Thy-1 oder
My-10 ausgewählt
ist. Die Ausrüstung
beinhaltet außerdem
eine feste Matrix oder Oberfläche
zum Isolieren hämatopoietischer
Stamm- und Vorläuferzellen
aus der Zellmischung, sowie eine Zusammensetzung zum Expandieren
der isolierten hämatopoietischen
Zellen und Vorläuferzellen,
welche eine effektive Menge an flt3-Ligand und einen Wachstumsfaktor
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-3, IL-6, TPO;
EPO, SF und ein GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein
aufweist.
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Alternativ
werden das Zellbindungsprotein und die feste Matrix oder Oberfläche mit
einem Wachstumsfaktor zum Stimulieren der Zellteilung in nicht-hämatopoietischen Stamm- und
Vorläuferzellen und
einem Antimetaboliten zum Induzieren des Zelltodes in sich teilenden
Zellen ersetzt. Der Antimetabolit kann aus der Gruppe bestehend
aus 5-Fluorouracil und 4-Hydroxycyclophosphamid ausgewählt sein,
und der Wachstumsfaktor ist aus der Gruppe bestehend aus SF und
flt3-Ligand ausgewählt.
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Gegebenenfalls
können
die Ausrüstungen gemäß der Erfindung
einen Behälter
zum Aufnehmen der entnommenen Zellmischung aufweisen, wobei der
Behälter
so an gepasst ist, dass er die entnommenen Zellen und optional das
Auswahlmittel aufnimmt.
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Die
Ausrüstung
gemäß der Erfindung
bietet eine Reihe zellulärer
Expansionsfaktoren, die bei ESCCAT zum Stimulieren der Proliferation
der Stammzellen, die zu Selbsterneuerung in der Lage sind, sowie
für die
Proliferation und Differenzierung von „lineage-commited" Vorläuferzellen
von Nutzen sind. Zu solchen zellulären Wachstumsfaktoren gehören die
Interleukine –1
und –3
(IL-1 bzw. IL-3), der Granulozyten-/Makrophagenkolonie-stimulierende Faktor
(GM-CSF), Molekularfusionen von GM-CSF und IL-3 (PIXY321), der flt3-Ligand
und der Granulozytenkolonie-stimulierende Faktor (G-CSF). Zu weiteren
hämatopoietischen
Wachstumsfaktoren gehören
der Stammzellenfaktor (SF) (auch bekannt als c-kit-Ligand, Mastzellenwachstumsfaktor
und Steel-Faktor), Thrombopoietin (TPO), Erythropoietin (EPO) und
IL-6. Diese Faktoren sind nützlich
für das Fördern der
in vitro Expansion der isolierten Stamm- und Vorläuferzellen.
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Die
Ausrüstungen
gemäß der Erfindung
ist von Nutzen für
die Selektion und Expansion jeder Zellpopulation welche den gewünschten
Phänotyp aufweist.
Zum Beispiel finden die Ausrüstungen
Anwendung bei der Expansion und Transplantation hämatopoietischer
Stamm- oder Vorläuferzellen,
der Expansion und Transplantation von T-Zellen oder B-Zellen sowie
bei der Gentherapie.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft eine Zellselektions- und -expansionstechnologie,
und insbesondere die extrakorporale Zellkultur und Zelltransplantation.
Wie hierin beschrieben beinhaltet die Erfindung eine ESCCAT-Ausrüstung, welche
Folgendes enthält:
- 1) ein Zellbindungsprotein für die Selektion
humaner hämatopoietischer
Stamm- oder Vorläuferzellen
in der aus einem Menschen entnommenen Zellmischung;
- 2) eine feste Matrix oder Oberfläche für die Isolierung hämatopoietischer
Stamm- und Vorläuferzellen
aus der Zellmischung; und
- 3) eine Zusammensetzung für
die Expansion der isolierten hämatopoietischen
Stamm- und Vorläuferzellen,
welche eine wirksame Menge flt3-Ligand und einen Wachstumsfaktor
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: GM-CSF, G-CSF, IL-1, IL-3, IL-6, TPO,
EPO, SF und einem GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein
aufweist.
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Der
optionale Behälter
ist so gestaltet, dass er zunächst
die entnommenen Zellen und gegebenenfalls das Selektionsmittel aufnimmt.
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Die
Zellmischung kann aus einer Quellenvielfalt entnommen werden. Für die Selektion
hämatopoietischer
Stamm- oder Vorläuferzellen
werden die Zellen normalerweise aus Quellen wie Knochenmark, peripherem
Blut oder Nabelschnurblut entnommen.
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Definitionen
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Die
Begriffe „Stammzellen" und „Vorläuferzellen" betreffen Zellen
früher
Abstammungslinien die pluripotent sind. Die Begriffe werden hier
austauschbar verwendet, wie dies im Fachgebiet üblich ist. Der Begriff „Stamm-
oder Vorläuferzellen" bedeutet entweder
Stammzellen, Vorläuferzellen
oder eine Mischung von sowohl Stamm- als auch Vorläuferzellen.
Wie im Fachgebiet üblicherweise
verwendet, sind Stamm- und Vorläuferzellen
normalerweise durch die folgenden Zelleigenschaften identifizierbar: CD34+, CD33–, CD38–,
Thy-1+ und My-10+.
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Der
Begriff „flt3-L" betrifft eine Gattung
von Polypeptiden, welche sich an den flt3-Rezeptor, der auf Vorläufer- und
Stammzellen zu finden ist, binden und damit unabhängig Komplexe
bilden. Ferner durch den Begriff „flt3-L" eingeschlossen sind die in EP-A 627
487, durch Bezugnahme hierin eingefügt, beschriebenen Proteine.
Der Begriff „flt3-L" beinhaltet Proteine,
welche die Aminosäuresequenz
von 1 bis 235 von SEQ. ID. NR. 6 wie in EP-A 627 487 gezeigt aufweisen,
sowie die Proteine, welche einen hohen Ähnlichkeitsgrad oder einen
hohen Identitätsgrad
damit aufweisen und welche biologisch aktiv sind und den flt3-Rezeptor
binden. Außerdem
betrifft der Begriff biologisch aktive Genprodukte der DNA von SEQ.
ID. NR. 5 wie in EP-A 627 487 gezeigt. Ferner durch den Begriff „flt3-L" eingeschlossen sind
die membrangebundenen Proteine (zu denen eine intrazelluläre Region,
eine Membranregion und eine extrazelluläre Region gehören), sowie
lösliche
oder verkürzte
Proteine, welche primär
den extrazellulären Teil
des Proteins aufweisen, die biologische Aktivität beibehalten und sekretiert
werden können.
Spezifische Beispiele solcher löslicher
Proteine sind diejenigen, welche die Aminosäuren 28–160 von SEQ. ID. NR. 6 wie
in EP-A 627 487 gezeigt enthalten.
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Der
Begriff „IL-1" bedeutet entweder
eine der beiden oder beide Formen, IL-1α und IL-1β (March et al., Nature, 315:
614 (1985)). Sowohl IL-1α als
auch IL-1β binden
an IL-1-Rezeptoren (Typ I und Typ II). IL-1α ist sowohl als Vorläufer wie
auch in der ausgereiften Form aktiv, wohingegen dies bei IL-1β nur in seiner
ausgereiften Form der Fall ist (March, et al., Id.). Der Begriff „IL-1" betrifft auch aktive
Fragmente und Analoga mit veränderten
Aminosäuresequenzen und
-derivaten, wie Fusionsproteine, welche eine IL-1-Komponente und
biologische IL-1-Aktivität
aufweisen, siehe Mosley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 4572
(1987).
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Der
Begriff „IL-3" betrifft eine Gattung
von Interleukin-3-Polypeptiden wie in US-Patenschrift Nr. 5,108,910, durch Bezugnahme
hierin eingefügt,
beschrieben. Zu solchen Polypeptiden gehören Analoga, welche Aminosäuresequenzen
aufweisen, die im Wesentlichen den nativen humanen Interleukin-3-Aminosäuresequenzen ähnlich sind,
welche, zum Beispiel, in den EP-Veröffentlichung Nr. 275,598 und
282,185, beide durch Bezugnahme hierin eingefügt, offenbart werden. Der Begriff „IL-3" beinhaltet außerdem Analoga
und Allele von IL-3-Molekülen, welche
zumindest einen Teil der biologischen Aktivität, welche sie mit nativem humanem
IL-3 gemein haben,
zeigen. Exemplarische Analoga von IL-3 sind in EP-Veröffentlichung
Nr. 282,185 offenbart. Zu weiteren Formen von IL-3 gehören humanes IL-3[Pro8Asp15Asp70], humanes IL-3[Ser8Asp15Asp70] und humanes
IL-3[Ser8]. Eine DNA-Sequenz, welche humanes IL-3-Protein
codiert, welches zur Verwendung in der Erfindung geeignet ist, ist
von der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangsnummer
ATCC 67747 frei erhältlich.
Die hierin verwendete Nomenklatur bezüglich der Aminosäuresequenzen
in Klammern bezeichnet, welche Aminosäuren sich von der nativen humanen
Form unterscheiden. Zum Beispiel bezieht sich humanes IL-3[Ser8Asp15Asp70] auf ein humanes IL-3-Protein, bei welchem die Aminosäure 8 zu
einem Serin-Rest verändert
wurde, Aminosäure
15 wurde zu einem Asparaginsäure-Rest
verändert
und auch Aminosäure 70
wurde zu einem Asparaginsäure-Rest
verändert.
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Der
Begriff „IL-6" betrifft eine Gattung
von Proteinen wie in der PCT-Veröffentlichung
WO 88/00206,
EP 257406 und
EP-A 331,640, jede davon durch Bezugnahme hierin eingefügt, beschrieben. IL-6
ist identisch mit Proteinen, welche als „Interferon-Beta-2" (Zilberstein et
al., EMBO J., 5: 2529 (1986)) bezeichnet werden, sowie mit dem „26-kd-Protein
induzierbar in humane Fibroblasten" (Haegeman et al., Eur. J. Biochem.,
159: 625 (1986)). Zu solchen Proteinen gehören Analoga, welche eine Aminosäuresequenz
aufweisen, die den nativen humanen IL-6-Aminosäuresequenzen im Wesentlichen ähnlich ist,
und welche dahingehend biologisch aktiv sind; dass sie in der Lage
sind, an einen IL-6-Rezeptor zu binden, ein durch das Binden des
IL-6-Rezeptors initiiertes biologisches Signal zu transduzieren oder
mit Anti-IL-6-Antikörpern
zu reagieren. Nukleotidsequenzen und abgeleitete Aminosäuresequenzen
von IL-6 sind, zum Beispiel, in WO 88/00206 offenbart. Der Begriff „IL-6" beinhaltet außerdem Analoga
nativer humaner IL-6-Moleküle,
die ausreichend sind, um die biologische Aktivität von nativem humanem IL-6
beizubehalten.
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Wie
hierin verwendet betrifft „GM-CSF" eine Gattung von
Proteinen wie in US-Patentschrift
Nr. 5,108,910 und 5,229,496, jede davon durch Bezugnahme hierin
eingefügt,
beschrieben. Zu solchen Proteinen gehören Analoga, welche eine Aminosäuresequenz
aufweisen, die den nativen humanen GM-CSF-Aminosäuresequenzen im Wesentliche ähnlich ist
(z. B. wie frei erhältlich
unter ATCC 53157 oder ATCC 39900) und welche biologisch aktiv sind; dass
sie in der Lage sind, an einen GM-CSF-Rezeptor zu binden, ein durch
das Binden des GM- CSF-Rezeptors
initiiertes biologisches Signal zu transduzieren oder mit Anti-GM-CSF-Antikörpern zu
kreuz reagieren. Aminosäuresequenzen
werden zum Beispiel in Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 82: 6250 (1985) offenbart. Im Handel verfügbares GM-CSF (Sargramostim)
ist von der Immunex Corp., Seattle, WA erhältlich. Der Begriff „GM-CSF" beinhaltet außerdem Analoga
nativer humaner GM-CSF-Moleküle,
die ausreichend sind, um die biologische Aktivität des nativen humanen GM-CSF
beizubehalten. Zu exemplarischen Analoga von GM-CSF gehören zum
Beispiel diejenigen, die in EP-Veröffentlichung Nr. 212914 und
WO 89/03881, jede davon durch Bezugnahme hierin eingefügt, beschrieben
sind. Weitere Analoga von GM-CSF können außerdem verwendet werden, um
Fusionsproteine mit IL-3 zu erzeugen. Eine DNA-Sequenz, welche ein
besonders bevorzugtes GM-CSF-Protein
codiert, bei welchem potentielle Glykosylierungsstellen entfernt
worden sind, ist von der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC 67231
frei erhältlich.
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Der
Begriff „GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein" bedeutet eine C-Terminus-
an N-Terminus-Fusion von
GM-CSF und IL-3. Die Fusionsproteine sind bekannt und in US-Patentschrift
Nr. 5,199,942; 5,108,910 und 5,073,627, jede davon durch Bezugnahme
hierin eingefügt,
beschrieben. Das bevorzugte Fusionsprotein ist PIXY321 wie in US-Patentschrift Nr.
5,199,942 beschrieben.
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Der
Begriff „im
Wesentlichen ähnlich" bedeutet, dass die
Variante einer Aminosäuresequenz
vorzugsweise zumindest zu 80%, am bevorzugtesten zumindest zu 90%,
identisch mit einer nativen Aminosäuresequenz ist. Die Prozentidentität kann zum
Beispiel durch einen Vergleich der Sequenzinformationen mit Hilfe
des GAP-Computerprogrammes,
Version 6.0, beschrieben von Devereux et al., Nucl. Acids Res.,
12: 387 (1984) und zu beziehen von der Universität von Wisconsin, Genetics Computer
Group (UWGCG), bestimmt werden. Das GAP-Programm nutzt das Alignmentverfahren
von Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48: 443 (1970)), in der Überarbeitung
von Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981)). Zu den
bevorzugten Standardparametern für
das GAP-Programm gehören:
(1) eine unäre
Vergleichsmatrix (welche einen Wert von 1 für Gleichheit und 0 für Nichtgleichheit
enthält)
für Nukleotide
und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov and Burgess, Nucl.
Acids Res., 14: 6745 (1986), wie von Schwartz and Dayhoff, eds.,
Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research
Foundation, S. 353–358,
1979 beschrieben; (2) ein Strafwert von 3,0 für jeden Spalt und ein zusätzlicher
Strafwert von 0,10 für
jedes Symbol in jedem Spalt; und (3) kein Strafwert für Endspalten.
Varianten können
konservativ substituierte Sequenzen umfassen, was bedeutet, dass
ein bestimmter Aminosäurerest
durch einen Rest ersetzt wird, der ähnliche physiochemische Eigenschaften aufweist.
Beispiele konservativer Substitutionen beinhalten die Substitution
eines aliphatischen Restes mit einem anderen, wie Ile, Val, Leu
oder Ala für
einander, oder Substitutionen eines polaren Restes mit einem anderen,
wie zwischen Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn. Weitere
solcher konservativer Substitutionen, zum Beispiel Substitutionen
ganzer Regionen mit ähnlichen
hydrophoben Eigenschaften, sind gut bekannt. Natürlich vorkommende Varianten der
Zellexpansionsfaktoren werden auch von der Erfindung mit eingeschlossen.
Beispiele solcher Varianten sind Proteine, die aus alternierenden
mRNA-Splicing-Ereignissen oder aus proteolytischer Spaltung des
nativen Proteins entstehen, wobei die native biologische Eigenschaft
erhalten bleibt.
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Der
Begriff „gereinigt
oder isoliert" bedeutet, dass
das gereinigte oder isolierte Material im Wesentlichen frei von
einer Verbindung mit anderen Zellen, Proteinen oder Polypeptiden
ist, zum Beispiel als ein Reinigungsprodukt aus rekombinanter Wirtszellenkultur
oder als ein gereinigtes Extrakt.
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Der
Begriff „autologe
Transplantation" steht für ein Verfahren,
bei dem Zellen, welche einen gewünschten
Phänotyp
aufweisen, aus einem Patienten entfernt und dem gleichen Patienten
wieder verabreicht werden.
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Der
Begriff „allogene
Transplantation" steht für ein Verfahren,
bei dem Zellen, welche einen gewünschten
Phänotyp
aufweisen, aus einem Menschen entfernt und einem anderen Menschen
verabreicht werden. Der Begriff „gen-identische Transplantation" bedeutet, dass die
Zelltransplantation zwischen genetisch identischen Menschen stattfindet.
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Die
Begriffe „Expansion" und „expandieren" bedeuten wie hierin
verwendet die Anreicherung der, oder das Anreichern, Erhöhen oder
Bereitstellen einer Erhöhung
in der Anzahl der Zellen, welche den gewünschten Phänotyp aufweisen.
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Der
Begriff „ESCCAT" steht für ein Verfahren,
welches Folgendes umfasst: (1) das Sammeln von Zellen, welche einen
gewünschten
Phänotyp aufweisen,
aus einem Menschen; (2) das Expandieren der Zellen ex vivo mit einer
Zusammensetzung, welche eine effektive Menge eines Zellexpansionswachstumsfaktors
enthält,
um ein Zellpräparat
bereitzustellen, welches eine erhöhte Anzahl der gewünschten
Zellen aufweist; und (3) das Verabreichen des Zellpräparates
an den Patienten in Verbindung mit oder nach der zytoreduktiven
Therapie.
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Der
Begriff „wirksame
Menge" wie in Zusammenhang
mit den Zellexpansionsfaktoren verwendet, bedeutet die Menge des
Expansionsfaktors, die notwendig ist, um das gewünschte Niveau der Zellexpansion
zu erreichen. Für
einen Durchschnittsfachmann ist leicht ersichtlich, dass eine wirksame
Menge eines bestimmten Zellexpansionsfaktors von einer Vielzahl
von Variablen abhängt.
Zu diesen Variablen gehören
das gewünschte
Niveau der Expansion, ob der Faktor mit anderen Faktoren kombiniert
ist oder nicht, sowie die zu expandierenden Zelltypen. Die Bestimmung
der wirksamen Menge liegt im Bereich der Fachkenntnisse.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Zellexpansionswachstumsfaktor aus der Gruppe bestehend
aus einem GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein, IL-1α oder flt3-Ligand ausgewählt.
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In
einer anderen Ausführungsform
beinhaltet die Ausrüstung
für die
extrakorporale Zellkultur und Zelltransplantation gemäß der Erfindung
eine Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge eines Expansionsfaktors
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: G-CSF, IL-3, IL-6, TPO, EPO und SF aufweist.
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Außerdem sind
die Ausrüstungen
der Erfindung in der Gentherapie von Nutzen. Die Gentherapie beinhaltet
das Verabreichen von mit exogener DNA-transfizierten Zellen an einen
Wirt, die dort einpflanzen gelassen werden. Siehe z. B. Boggs, International
J. Cell Cloning, 8: 80–96
(1990); Kohn et al., Cancer Invest., 7(2): 179–192 (1989); Lehn, Bone Marrow
Transpl., 5: 287–293
(1990); und Verma, Scientific American, S. 68–84 (1990). Da bei der Teilung der
Zellen genetischer Transfer der exogenen DNA an die Zellen stattfindet,
kann die Effizienz eines solchen Transfers mit Hilfe der Ausrüstungen
gemäß der Erfindung
erheblich gesteigert werden. Die Verwendung einer Zusammensetzung,
welche eine effektive Menge von mindestens einem Zellexpansionsfaktor
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: GM-CSF, G-CSF, IL-1α, IL-3, IL-6,
TPO, EPO, flt3-Ligand, SF und einem GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein aufweist, unterstützt die
ausgewählten
Zellen bei einer schnelleren Proliferation oder Differenzierung. Dadurch
kann die genetische Aufnahme in den entnommenen Zellen enorm verbessert
werden. Im Allgemeinen sind Gentherapiemethoden in der Technik bekannt
und beinhalten die Schritte (a) das Kultivieren isolierter Stammzellen
in Wachstumsmedien, welche mindestens einen Zellexpansionsfaktor
ausgewählt
aus der oben aufgelisteten Gruppe aufweisen; (b) das Transfizieren
der kultivierten Zellen aus Schritt (a) mit dem exogenen Gen; und
(c) das Verabreichen der transfizierten Zellen an das Säugetier.
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In
Fällen,
in denen es wünschenswert
ist, hämatopoietische
Stamm- oder Vorläuferzellen
auszuwählen,
zu isolieren oder zu expandieren, ist eine bevorzugte Ausrüstung diejenige,
bei der die Mittel zum Isolieren der hämatopoietischen Stammzellen
zumindest eines/n der Folgenden aufweisen: a) ein flt3-Rezeptor-Bindungsprotein
und b) einen monoklonaler Antikörper,
der an einen Zellmarker ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: CD34, Thy-1 oder My-10 bindet.
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Bezüglich der
besonderen Aspekte der Ausrüstungen
der Erfindung umfassen die Ausrüstungen Mittel
zum Auswählen
der Zellen, welche den gewünschten
Phänotyp
aufweisen, aus der entnommenen Zellmischung. Die Auswählen geeigneter
Selektionsmittel ist abhängig
vom gewünschten
Phänotyp der
zu isolierenden Zelle. Hämatopoietische
Stammzellen sind aufgrund ihrer physischen Eigenschaften, wie der Expression
des membrangebundenen flt3-Rezeptors wählbar oder dadurch, dass sie
die folgenden Zellmarker aufweisen: CD34, Thy-1 und My-10. Monoklonale
Antikörper
die ein beliebiges dieser Antigene erkennen, wurden in US-Patentschrift
Nr. 4,714,680 (Anti-My-10), hierin durch Bezugnahme eingefügt, beschrieben.
Anti-CD34 ist gewerblich
erhältlich
von Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) und monoklonale Anti-Thy-1-Antikörper können mit
Hilfe der von Dalchau et al., J. Exp. Med., 149: 576 (1979), hierin
durch Bezugnahme eingefügt,
beschriebenen Verfahren leicht erzeugt werden. Es kann auch ein
flt3-Rezeptor-Bindungsprotein, wie monoklonale Anti-flt3-Antikörper oder
der flt3-Ligand, beschrieben in EP-A 627 487, verwendet werden, wobei
der flt3-Ligand von der Immunex Corporation, Seattle, WA erhältlich ist.
Das Zellbindungsprotein wird mit der entnommenen Zellmischung in
Kontakt gebracht und die Kombination wird für einen Zeitraum inkubieren
lassen, der ausreichend ist, um die Bindung der gewünschten
Zelle an das Zellbindungsprotein zu erlauben.
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Ein
alternatives Mittel zum Auswählen
der latenten Stammzellen ist das Induzieren des Zelltodes in die
sich teilenden, eher abstammungsgebundener, [„lineage-committed"] Zelltypen mit Hilfe eines Antimetaboliten
wie 5-Fluorouracil (5-FU) oder einem Alkylierungsmittel wie 4-Hydroxycyclophosphamid (4-HC).
Die nicht-latenten
Zellen werden durch die Zugabe von Wachstumsfaktoren, die lediglich
eine geringe oder gar keine Wirkung auf die Stammzellen haben, stimuliert
zu proliferieren und sich zu differenzieren, wodurch die Nicht-Stammzellen
veranlasst werden, zu proliferieren und sich zu differenzieren, was
sie anfälliger
für die
zytotoxischen Wirkungen von 5-FU oder 4-HC macht. Siehe Berardi
et al., Science, 267: 104 (1995), hierin durch Literaturhinweis eingefügt.
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Ferner
sind in der Ausrüstung
der Erfindung Mittel zum Isolieren der ausgewählten Zellen, welche den gewünschten
Phänotyp
aufweisen enthalten. Das Isolieren der Zellen kann zum Beispiel
mit Hilfe der Affinitätschromatographie,
Antikörper-beschichteter Magnetperlen
oder auf einer festen Matrix, wie Glasperlen, Kolben, usw. fixierten
Antikörpern
durchgeführt
werden. Antikörper,
die einen Stammzellenoberflächenmarker
erkennen, können
mit anderen chemischen Komponenten wie Biotin, welches mit einer
Avidin- oder Streptavidin-Komponente fixiert an einer festen Unterlage
entfernt werden kann, Fluorochrome, welche bei der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung
(FACS) von Nutzen sind, oder ähnlichen verschmolzen
oder konjugiert werden. Vorzugsweise wird die Isolierung durch eine
Immunaffinitätssäule erreicht.
Immunaffinitätssäulen können jede
Form annehmen, umfassen aber meist einen Festbettreaktor. Das Festbett
in diesen Bioreaktoren besteht vorzugsweise aus einem porösen Material,
welches eine im Wesentlichen gleichmäßige Beschichtung eines Substrates
aufweist. Das poröse
Material, welches ein hohes Oberfläche/Volumen-Verhältnis bietet,
ermöglicht
es der Zellmischung über
eine große
Kontaktfläche
zu fließen,
während
der Zellfluss aus dem Bett heraus nicht behindert wird. Zu typischen
Substraten gehören
Avidin und Streptavidin, allerdings können auch andere konventionelle
Substrate verwendet werden. Das Substrat sollte entweder durch seine
eigenen Eigenschaften oder durch die Zugabe einer chemischen Komponente
eine hohe Affinität
für eine
Komponente zeigen, die auf dem Zellbindungsprotein zu finden ist,
wie ein monoklonaler Antikörper. Die
monoklonalen Antikörper
erkennen ein Zelloberflächenantigen
auf den zu isolierenden Zellen und sind normalerweise so weitermodifiziert,
dass sie eine Biotin-Komponente
darstellen. Es ist gut bekannt, dass Biotin eine hohe Affinität für Avidin
besitzt und die Affinität
dieser Substanzen fixiert den monoklonalen Antikörper dadurch wiederentfernbar
an die Oberfläche
des Bettes. Solche Säulen
sind in der Technik gut bekannt, siehe Berenson, et al., J. Cell Biochem.,
10D: 239 (1986). Die Säule
wird mit einer PBS-Lösung
gewaschen, um das ungebundene Material zu entfernen. Zielzellen
können
mit Hilfe konventioneller Verfahren von den Perlen freigesetzt werden.
Die Immunaffinitätssäulen des
oben beschriebenen Typs, welche biotinylierte monoklonale Anti-CD34
Antikörper
fixiert an einer Avidin-beschichteten
Packung verwenden, sind zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 93/08268 beschrieben. Eine Variante dieses Verfahrens verwendet
Zellbindungsproteine wie die monoklonalen Antikörper oder den flt3-Ligand,
wie oben beschrieben, wiederentfernbar befestigt an einer fixierten
Oberfläche
im Isolierungsmittel. Das gebundene Zellbindungsprotein wird dann
mit der entnommenen Zellmischung in Kontakt gebracht und für einen
Zeitraum inkubieren lassen, der ausreichend ist, um die Isolierung
der gewünschten
Zellen zuzulassen.
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Alternativ
dazu können
die monoklonalen Antikörper,
welche die Zelloberflächenantigene
erkennen, mit einer fluoreszenten Markierung, z. B. Chromophor oder
Fluorophor, versehen und durch Zellsortierung nach dem Fehlen oder
der Menge des markierten Produktes isoliert werden.
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Eine
weitere alternative Ausführungsform des
Isolierungsmittels basiert auf konventionellen magnetischen Separationsverfahren
und -geräten. Ein
Beispiel eines Verfahrens zur Beschichtung einer magnetisch-intensivierenden
Gradienten-Matrix zum Einsatz in einer Separationsvorrichtung ist
in US-Patentschrift Nr. 5,385,707, durch Bezugnahme hierin eingefügt, offenbart.
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Ferner
in die Ausrüstungen
der Erfindung eingeschlossen sind Inkubationsmittel. Solche Mittel sind
so angepasst, dass sie die isolierten Stammzellen, eine Zusammensetzung,
welche eine effektive Menge eines Zellexpansionswachstumsfaktors
aufweist, und ein Zellwachstumsmedium aufnehmen und enthalten. Das
Inkubationsmittel kann jedes Gerät
oder jede Vorrichtung sein, welche/s die isolierten Stammzellen
während
des Zellexpansionsprozesses in Kontakt mit dem Expansionsfaktor
und dem Wachstumsmedium enthält.
Zu geeigneten Inkubationsmitteln gehören zum Beispiel Beutel, Hohlfasern, Glasflaschen,
Mehrfachvertiefungen-Platten
oder Petri-Schalen. Viele solcher Inkubationsmittel sind aus einer
Vielzahl gewerblicher Quellen beziehbar. Besonders bevorzugte Inkubationsmittel
sind sterile Beutel und Hohlfasern.
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Zellexpansionswachstumsfaktoren
werden auch in den Ausrüstungen
gemäß der Erfindung
bereitgestellt. Zu solchen Expansionsfaktoren gehören GM-CSF,
G-CSF, IL-1, IL-3, IL-6, TPO, EPO, flt3-Ligand, SF und ein GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein.
Die bevorzugten Expansionsfaktoren sind GM-CSF, flt3-Ligand, IL-1α und GM-CSF/IL-3-Fusionsproteine. Die
Expansionsfaktoren werden in den Ausrüstungen in Form einer Zusammensetzung
bereitgestellt, welche die Faktoren enthält. Beispiele solcher Zusammensetzungen
sind diejenigen, welche einen rekombinant erzeugten oder anderweitig
gereinigten Expansionsfaktor in einer konventionellen Stabilisie rungsformel
aufweisen. Weitere Zusammensetzungen, welche die Ausrüstung enthalten
kann, weisen aufbereitete Medien gewonnen aus Säugetierzellen auf, welche eine
Menge des Expansionsfaktors enthalten, die ausreicht, um die gewünschten
Zellen zu expandieren.
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Die
Ausrüstungen
gemäß der Erfindung
umfassen außerdem
ein Zellwachstumsmedium. Eine Vielzahl von Wachstumsmedien kann
verwendet werden und die Zusammensetzung solcher Medien kann von
einem Durchschnittsfachmann leicht bestimmt werden. Geeignete Wachstumsmedien
sind Lösungen,
welche Nährstoffe
oder metabolische Zusatzstoffe enthalten, und zu ihnen gehören diejenigen,
welche Serum-vermindert oder Serum-basiert sind. Repräsentative
Beispiele von Wachstumsmedien sind RPMI, TC 199, Iscove's modifiziertes Dulbecco's-Medium (Iscove
et al., F. J, Exp. Med., 147: 923 (1978)), DMEM, Fisher's, Alpha-Medium,
NCTC, F-10, Leibovitz's
L-15, MEM und McCoy's.
Zu besonderen Beispielen von Nährstoffen,
die dem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein werden, gehören Serumalbumin,
Transferrin, Lipide, Cholesterol, ein Reduzierungsagens wie 2-Mercaptoethanol oder Monothioglycerol,
Pyruvat, Butyrat und ein Glucocorticoid wie Hydrocortison 2-Hemi-Succinat.
Insbesondere gehören
zu den Standardmedien eine Energiequelle, Vitamine oder andere Zell-unterstützende organische
Verbindungen, ein Puffer wie HEPES, Tris, die den pH-Wert des Mediums
stabilisieren sowie verschiedene anorganische Salze. Insbesondere verwiesen
sei auf die PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 95/00632, worin die Vielzahl der Serum-freien Zellwachstumsmedien
beschrieben ist, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingefügt ist.
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Wie
oben dargelegt, kann der optionale Behälter zur Aufnahme der aus einem
Menschen entnommenen Zellen jede sterile Vorrichtung oder jedes sterile
Gerät sein,
welches geeignet ist, um die Zellmischung zunächst aufzunehmen. Vorzugsweise
ist der Behälter
ein steriler Beutel, welcher eine Öffnung zur Aufnahme der Mischung
entnommener Zellen aufweist.
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Die
Ausrüstungen
gemäß der Erfindung
können
zum Beispiel wie folgt bei der Transplantation peripherer Stammzellen
(PSC) oder peripherer Blutvorläuferzellen
(PBPC) verwendet werden. Normalerweise wird die PBPC- und PSC-Transplantation bei Patienten
durchgeführt,
deren Knochenmark zum Beispiel aufgrund von Knochenmarksanomalie
oder malignem Befall nicht für
die Entnahme geeignet ist. PBPC und PSC werden mit Hilfe von in
der Technik bekannten Aphereseverfahren entnommen. Siehe zum Beispiel
Bishop et al., Blood, Vol. 83, Nr. 2, S. 610–616 (1994). Kurz, PBPC und
PSC werden mittels konventioneller Geräte, zum Beispiel einem Haemonetics
Apheresegerät,
Model V50 (Haemonetics, Braintree, MA) entnommen. Normalerweise
werden nicht öfter
als fünf
Mal die Woche Vier-Stunden-Entnahmen durchgeführt, bis etwa 6,5 × 108 mononukleäre Zellen (MNC)/kg des Patienten
entnommen sind. Die Zellen werden in Standardmedium suspendiert und
dann zentrifugiert, um rote Blutkörperchen und Neutrophilen zu
entfernen. Zellen, die sich an der Schnittstelle zwischen den beiden
Phasen befinden (in der Technik auch bekannt als der Leukozytenfilm) werden
entfernt und in HBSS resuspendiert. Die suspendierten Zellen sind
vorrangig mononukleär
und ein wesentlicher Teil der Zellmischung sind frühe Stammzellen.
Die so entstehende Stammzellensuspension wird dann mit biotinylierten
monoklonalen Anti-CD34-Antikörpern
in Kontakt gebracht. Der Kontaktzeitraum wird für eine ausreichende Zeit aufrecht erhalten,
damit eine wesentliche Interaktion zwischen den monoklonalen Anti-CD34-Antikörpern und den
CD34-Antigenen auf der Stammzellenoberfläche stattfinden kann. Normalerweise
ist ein Zeitraum von mindestens einer Stunde ausreichend. Die Zellsuspension
wird dann mit dem in der Ausrüstung
bereitgestellten Isolierungsmittel in Kontakt gebracht. Das Isolierungsmittel
kann eine mit Avidin-beschichteten Perlen gefüllte Säule umfassen. Solche Säulen sind in
der Technik gut bekannt, siehe Berenson, et al., J. Cell Biochem.,
10D: 239 (1986). Die Säule
wird mit einer PBS-Lösung
gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Zielstammzellen
können
mittels konventioneller Verfahren von den Perlen und vom monoklonalen
Anti-CD34-Antikörper
befreit werden. Die so gewonnenen Stammzellen können in einem regulierbaren
Gefrierapparat (z. B. Cryo-Med, Mt. Clemens, MI) eingefroren und
dann in der Gasphase von flüssigem
Stickstoff gelagert werden. Zehnprozentiges Dimethylsulfoxid kann dann
als ein Kryoschutzmittel verwendet werden. Nachdem alle Entnahmen
aus dem Spender durchgeführt
worden sind, werden die Stammzellen aufgetaut und in das Inkubationsmittel
gegeben. Aliquote, welche Stammzellen, in der Ausrüstung bereitgestelltes
Wachstumsmedium wie McCoy's
5A-Medium, 0,3% Agar und mindestens einen der in der Ausrüstung bereitgestellten
Expansionsfaktoren: rekombinantes humanes GM-CSF, rekombinanter
humaner flt3-L und rekombinante humane GM-CSF/IL-3-Fusionsmoleküle (PIXY321)
mit Konzentrationen von etwa 200 U/ml enthalten, werden in dem in
der Ausrüstung
bereitgestellten Inkubationsmittel bei 37°C in 5% CO2 in kompletter
Feuchtluft für
14 Tage kultiviert und expandiert. Gegebenenfalls kann den Kulturen
humanes IL-1α hinzugefügt werden.
Die bevorzugteste Kombination von Expansionsfaktoren umfasst flt3-L plus
entweder IL-3 oder ein GM-CSF/IL-3-Fusionsprotein. Die expandierten
Stammzellen können
dem Patienten dann über
Reinfusion intravenös
wieder verabreicht werden.