DE69133459T2

DE69133459T2 - Methoden für die ex-vivo replikation und stabile genetische transformation von menschlichen stamm-zellen

Info

Publication number: DE69133459T2
Application number: DE69133459T
Authority: DE
Inventors: G. Stephen EMERSON; F. Michael CLARKE; O. Bernhard PALSSON; M. Richard SCHWARTZ
Original assignee: University of Michigan Ann Arbor
Current assignee: University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 1990-12-17
Filing date: 1991-12-17
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2011-12-18
Also published as: ATE295412T1; EP1473360A3; JP2006158401A; CA2100268A1; AU5059296A; EP0575350A1; JPH11221074A; AU665525B2; EP1473360A8; EP0575350B1; US5399493A; EP0575350A4; WO1992011355A1; DE69133459D1; AU687674B2; EP1473360A2; US5670351A; KR100225307B1; JPH06505151A; KR930703434A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Erreichen einer ex vivo-Teilung humaner Stammzellen in Kultur.
Stand der Technik
Alle zirkulierenden Blutzellen in einem normalen Erwachsenen, einschließlich Erythrozyten, Leukocyten, Thrombozyten und Lymphocyten, entstehen im Knochenmark als Vorläuferzellen. Diese Zellen stammen wiederum von sehr unreifen Zellen ab, Progenitorzellen genannt, die in 1–3-wöchigen Kulturen in halbfesten Medien, wie beispielsweise Methylcellulose oder Agar, mittels ihrer Entwicklung zu zusammenhängenden Kolonien reifer Blutzellen analysiert werden. Die Progenitorzellen selbst stammen von einer Gruppe von Progenitorzellen ab, die Stammzellen genannt werden. Stammzellen besitzen die Fähigkeit, nach Teilung, sowohl zur Selbsterneuerung als auch zur Differenzierung in Progenitorzellen. Daher erzeugen sich teilende Stammzellen sowohl zusätzliche, primitive Stammzellen als auch etwas differenziertere Progenitorzellen. Neben der Generierung von Blutzellen können Stammzellen auch zu Osteoblasten und Osteoklasten und möglicherweise auch zu Zellen anderer Gewebe führen. Dieses Dokument beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen, welche zum ersten Mal eine erfolgreiche in vitro-Kultivierung humaner hämatopoetischer Stammzellen ermöglichen, was zu ihrer Proliferation und Differenzierung zu Progenitorzellen und reiferen Blutzellen führt.
In den späten 1970er-Jahren wurde das Flüssigkultursystem zur Kultivierung hämatopoetischen Knochenmarks in vitro entwickelt. Die Kulturen haben hohen potentiellen Wert für die Analyse normaler und leukämischer Hämatopoese und für die experimentelle Manipulation des Knochenmarks, beispielsweise für einen durch Retroviren vermittelten Gentransfer. Diese Kulturen ermöglichten eine detaillierte Analyse muriner Hämatopoese und führten zu einem detaillierten Verständnis des murinen Systems. Daneben ermöglichte es einen retroviralen Gentransfer in kultivierte murine Knochenmarkszellen. Dies ermöglichte das Markieren der murinen hämatopoetischen Zellen, was die Existenz der multipotenten Stammzelle bewies, und das Studium der verschiedenen Gene im Verlauf einer Leukämogenese.
Während es jedoch möglich war, retrovirale Gene in kultivierte murine Knochenmarkszellen zu transferieren, war dies bei kultivierten humanen Knochenmarkszellen noch nicht möglich, da Langzeitkulturen des humanen Knochenmarks bislang sowohl in ihrer Langlebigkeit als auch in ihrer Fähigkeit, Stammzellen am Leben zu halten, und in ihrer Fähigkeit, dauerhaft Progenitorzellen zu produzieren, limitiert sind.
Es stellte sich anfangs heraus, dass Flüssigkulturen humanen Knochenmarks begrenztes hämatopoetisches Potential besitzen, da sie sinkende Zahlen an Progenitorzellen und reifen Blutzellen produzieren und die Zellproduktion nach 6 bis 8 Wochen beendet ist. Weitergehende Modifikationen des ursprünglichen Systems führten nur zu geringen Verbesserungen. Eine Lösung dieses Problems ist von unschätzbarem Wert, da dies beispielsweise die Expansion humaner Stammzellen und Progenitorzellen für Knochenmarkstransplantationen und zum Schutz bei Chemotherapie, die Selektion und Manipulation solcher Zellen, d.h. für einen Gentransfer, und die Produktion reifer humaner Blutzellen zur Transfusionstherapie ermöglichen würde.
Untersuchungen der Hämatopoese und in vitro-Flüssigkulturen des Marks haben Fibroblasten und Endothelzellen in adhärenten Schichten als zentrale zelluläre Stromaelemente identifiziert. Diese Zellen stellen Anheftungsstellen für sich entwickelnde hämatopoetische Zellen bereit und können auch induziert werden, um hämatopoetische Wachstumsfaktoren, welche die Proliferation und Differenzierung der Progenitorzellen anregen, zu sezernieren. Diese hämatopoetischen Wachstumsfaktoren schließen Granulozyten-Kolonien-stimulierenden Faktor (G- CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Interleukin-6 (IL-6) ein.
Kulturen humaner Knochenmarkszellen auf solchen adhärenten Layern in vitro waren jedoch größtenteils enttäuschend. Anders als entsprechende Kulturen anderer Spezies, wie beispielsweise Maus und Spitzhörnchen, können Flüssigkulturen von humanem Mark länger als 6 bis 8 Wochen weder signifikante Mengen nichtadhärenter hämatopoetischer Vorläuferzellen noch klonogener Progenitorzellen produzieren. Und obwohl von Kulturen berichtet wurde, die 3–5 Monate überdauerten, wurde keine Kultur beschrieben, die länger als 4–6 Wochen kontinuierlich stabil Progenitorzellen aus Stammzellen produziert.
Zudem nahm die Produktion von nichtadhärenten Zellen und Progenitorzellen während der kurzen Lebensdauer dieser Kulturen üblicherweise sogar ab, so dass unklar ist, ob das Überleben der Stammzellen oder die Proliferation überhaupt von diesen Kulturen unterstützt wird. Ferner sezernierten nicht stimulierte Knochenmarksstromazellen, wenn sie isoliert untersucht wurden, wenn überhaupt wenig nachweisbare hämatopoetische Wachstumsfaktoren (HGFs).
Die mangelhafte Produktion stabiler Progenitorzellen und reifer Blutzellen in diesen Kulturen hat zu der Annahme geführt, dass sie nicht in der Lage sind, eine kontinuierliche Stammzellerneuerung und -expansion zu unterstützen. Es wurde daher angenommen, dass den Kulturen entweder ein oder mehrere entscheidende Stimulanzien fehlen und/oder dass sie ein oder mehrere neuartigen Stammzellinhibitoren enthalten. Während aber Erklärungen für das Versagen des Nachweises von HGFs und für nicht induzierte Stromazellkulturen vorgeschlagen wurden, wäre die Nullhypothese, welche das Versagen des Nachweises von HGFs mit dem relativen Versagen der Flüssigkulturen von humanem Mark kombiniert, dass die Kultursysteme, die in vitro verwendet werden, nicht im vollen Umfang die hämatopoetische Supportfunktion der adhärenten Knochenmarksstromazellen in vivo erbringen.
Die Expansion von Stammzellen und Progenitorzellen für Knochenmarkstransplantationen stellt eine mögliche Anwendung für Langzeitkulturen humanen Knochenmarks dar. Humane autologe oder allogene Knochenmarkstransplantationen werden derzeit als Therapien für Erkrankungen wie Leukämie, Lymphom und andere lebensbedrohliche Erkrankungen verwendet. Für diese Verfahren muß jedoch eine große Menge Spenderknochenmark entfernt werden, um sicherzustellen, dass genügend Zellen für eine Verpflanzung vorhanden sind.
Eine Kultur, die eine Expansion von Stammzellen und Progenitorzellen liefert, würde den Bedarf ana großen Knochenmarksspenden senken und würde es möglich machen, eine kleine Spende Mark zu erhalten und dann die Zahl von Stammzellen und Progenitorzellen in vitro vor der Infusion in den Empfänger zu expandieren. Es ist auch bekannt, dass eine kleine Anzahl von Stammzellen und Progenitorzellen im Blutkreislauf zirkuliert. Wenn diese Stammzellen und Progenitorzellen durch Phorese gesammelt und expandiert werden könnten, wäre es möglich, die benötigte Anzahl an Stammzellen und Progenitorzellen für eine Transplantation aus peripherem Blut zu erhalten und den Knochenmarksspenden zu vermeiden.
Eine Knochenmarkstransplantation erfordert, dass für eine Verpflanzung etwa 1 × 10⁸ bis 2 × 10⁸ mononukleäre Knochenmarkszellen pro Kilogramm Patientengewicht infundiert werden müssen. Dies erfordert eine Knochenmarksspende mit gleicher Anzahl an Zellen, was in der Größenordnung von 70 ml Mark für einen 70 kg schweren Spender liegt. Obwohl 70 ml einen kleinen Teil des Spendermarks ausmachen, erfordert dies doch eine stark wirkende Spende und einen signifikanten Blutverlust beim Spenden. Wenn Stammzellen und Progenitorzellen zehnfach expandiert werden könnten, könnte man das Spenden stark reduzieren und es würde möglicherweise nur das Sammeln von Stammzellen und Progenitorzellen aus dem peripheren Blut und die Expansion dieser Stammzellen und Progenitorzellen beinhalten.
Eine Expansion von Progenitorzellen wäre auch als ergänzende Behandlung zur Chemotherapie nützlich und stellt eine weitere Anwendung für Langzeitkulturen humanen Knochenmarks dar. Das Problem, vor dem ein Onkologe steht, ist, dass die meisten Chemotherapeutika, die zur Zerstörung von Krebs verwendet werden, bei der Chemotherapie dadurch wirken, dass sie alle Zellen töten, die eine Zellteilung durchlaufen. Das Knochenmark ist eins der am stärksten proliferierenden Gewebe im Körper und ist daher häufig das Organ, das zu Beginn von den chemotherapeutischen Medikamenten geschädigt wird. Das Ergebnis davon ist, dass die Produktion von Blutzellen während der chemotherapeutischen Behandlung schnell unterbunden wird und die Chemotherapie beendet werden muß, um dem hämatopoetischen System zu ermöglichen, den Vorrat an Blutzellen wiederaufzufrischen, bevor der Patient erneut mit Chemotherapie behandelt wird. Es kann einen Monat oder länger dauern, bis die einmal ruhenden Stammzellen die Anzahl an weißen Blutzellen wieder auf ein so akzeptables Niveau gebracht haben, dass die Chemotherapie wieder aufgenommen werden kann, während der sich der Abfall in der Zahl der Blutzellen wiederholt. Während sich die Blutzellen zwischen den chemotherapeutischen Behandlungen regenerieren, bleibt dem Krebs leider Zeit zu wachsen und, als Folge natürlicher Selektion, möglicherweise gegen chemotherapeutische Wirkstoffe resistenter zu werden.
Um die Zeit zwischen chemotherapeutischen Behandlungen zu verkürzen, könnten an den Patienten wieder große Mengen an Progenitorzellen und unreifen Blutzellen zurückgeführt werden. Dies hätte die Wirkung, dass die Zeit, in der der Patient eine geringe Menge an Blutzellen aufweist, enorm verkürzt werden könnte, was eine schnellere Wiederaufnahme der chemotherapeutischen Behandlung erlauben würde. Je länger die Chemotherapie dauert und je kürzer die Dauer zwischen den Behandlungen ist, desto größer sind die Chancen, den Krebs erfolgreich abzutöten.
Die für eine Expansion der Progenitorzellen benötigten hämatopoetischen Zellen können entweder aus der Entnahme von Knochenmark oder dem Sammeln aus peripherem Blut stammen. Das Ernten von Knochenmark würde zum Erhalt von etwa 4 × 10⁵ CFU-GM Progenitorzellen führen. Eine Phorese von 5 Litern peripherem Blut würde etwa 10⁵ CFU-GM bringen, wobei diese Menge durch vorhergehende Behandlung des Spenders mit GM-CSF auf 10⁶ erhöht werden könnte. Eine schnelle Erholung des Patienten würde eine Transfusion von etwa 1 × 10⁸ bis 5 × 10⁸ CFU-GM erfordern, was 100 bis 1.000 mal mehr ist, als man mit einer üblichen Knochenmarksspende oder einer Spende von peripherem Blut erreichen kann. Daher würde die Expansion von Knochenmark oder peripherem Blut zur Erhöhung der Anzahl von CFU-GM um 2 bis 3 Größenordnungen die Chemotherapie und die Krebsbehandlung signifikant beeinflussen.
Die Gentherapie ist ein schnell wachsendes Gebiet der Medizin, das zudem ein unschätzbares klinisches Potential aufweist. Die Gentherapie besitzt viele mögliche Anwendungsmöglichkeiten bei der Behandlung von Krankheiten und wurde ausführlich beschrieben. Siehe zum Beispiel, Boogs, Int. J. Cell Cloning. (1990) 8: 80–96, Kohn et al, Cancer Invest. (1989) 7(2): 179–192, Lehn, Bone Marrow Transp. (1990) 5: 287–293, und Verma, Scientific Amer. (1990) Seiten 68–84. Genetisch transformierte humane Stammzellen haben als gentherapeutische Mittel ein breites Anwendungspotential in der klinischen Medizin.
Die Gentherapie beschreibt einen sich entwickelnden Ansatz bei der klinischen Behandlung, der aus früheren Ansätzen in der medizinischen Versorgung entstand. Die frühesten Ansätze bei der medizinischen Versorgung, die sich über die Jahrhunderte entwickelten, umfaßten grausame chirurgische Verfahren und die Applikation von Rohmischungen als medizinischen Mitteln. Im letzten Jahrhundert kam die biochemische Pharmakologie als Hauptmaßnahme der medizinischen Behandlung hinzu. Unter diesem Paradigma wurden den Patienten reine biochemische Moleküle zugeführt. Solche pharmakologische Mittel wirken allgemein entweder als Gifte (wie antimikrobielle Substanzen oder Chemotherapeutika gegen Krebs), als physiologische Mimetika, die die endogenen Rezeptoren stimulieren (z.B. Opiate, adrenerge Agonisten) oder als physiologische Antagonisten, die endogene Rezeptoren blockieren (z.B. Antihypertensiva, Anästhetika).
Gentherapie bedeutet per definitionem die Einschleusung von Genen in Zellen zum Zweck der medizinischen Therapie. Das der Gentherapie zugrundeliegende Prinzip ist, statt der Verabreichung von Dosen pharmakologischer Moleküle ein funktionelles Gen zuzuführen, dessen RNA- oder Proteinprodukt die erwünschte biochemische Wirkung in der Zielzelle oder dem Gewebe erzeugt. Es gibt gegenüber der klassischen biochemischen Pharmakologie verschiedene potentielle Vorteile der Gentherapie. Erstens können eingeschleuste Gene extrem komplexe Moleküle, einschließlich RNA und Proteinen, produzieren, welche selbst nur außergewöhnlich schwer oder unmöglich zu applizieren und zuzuführen sind. Ferner kann eine kontrollierte Insertion des erwünschten Gens in die spezifischen Zielzellen die Produktion des Genprodukts auf bestimmte Gewebe beschränken. Und zuletzt kann die Gentherapie in einem Lebewesen im Prinzip permanent sein, da das Gen in den Zielzellen und deren Nachkommen weiter funktioniert.
Es gibt verschiedene Probleme, die daher für eine erfolgreiche Gentherapie angegangen werden müssen. Zuerst muß man in der Lage sein, das gewünschte therapeutische Gen in die gewählten Zellen einschleusen zu können. Zweitens muß das Gen in der Zielzelle adäquat exprimiert werden und zu der richtigen Menge an Genprodukt führen. Schließlich muß die produzierte RNA oder das produzierte Protein von der Zielzelle richtig prozessiert werden, so das es funktionsfähig ist, d.h., dass die Gentherapie tatsächlich zu einer klinischen Therapie führt. Verschiedene Verfahren zur Einschleusung von Genen in humane Zellen in vitro sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Vergleich der Methoden der DNA-Übertragung.
Andere Methoden, wie homologe Rekombination, werden ebenfalls in vielen Labors entwickelt. Die Forschung in der Gentherapie erfolgte über mehrere Jahre an verschiedenen Zelltypen in vitro, hat sich auf tierische Studien ausgeweitet und derzeit die ersten humanen, klinischen Versuche gestartet.
Das hämatopoetische System stellt eine ideale Wahl als Transportsystem für die Gentherapie dar. Hämatopoetische Zellen sind leicht zugänglich, einfach durch Knochenmarksaspiration oder durch Ernten der mononukleären Zellen des peripheren Bluts. Sobald die genetische Einschleusung in vitro erfolgt ist, können die behandelten Zellen intravenös reinfundiert werden, worauf die genetisch transformierten in das Knochenmark wandern („Homing") und sich dort entwickeln. Da reife Blutzellen durch den ganzen Körper zirkulieren, können die genetisch veränderten Zellen das spezifische Genprodukt in jedes gewünschte Gewebe transportieren.
Am wichtigsten ist, dass hämatopoetische Gewebe Stammzellen enthalten, die eine extensive (vielleicht unbegrenzte) Fähigkeiten zur Selbsterneuerung besitzen. Dies beinhaltet, dass wenn genetisches Material stabil in diese Stammzellen transduziert wäre, diese veränderten Stammzellen dann nach Reinfusion des hämatopoetischen Gewebes expandieren und das Mark wieder mit Zellen, die das neue Gen exprimieren, bevölkern können. Dies führt zu einer langanhaltenden, vielleicht lebenslangen Versorgung mit dem gewünschten Genprodukt. Ähnlich führt ein erfolgreicher stabiler Gentransfer in Stammzellen, die in anderen Geweben lokalisiert sind, zu einer entsprechenden lebenslangen Versorgung mit dem Genprodukt.
Erfolgreiche Gentherapie mit hämatopoetischen Stammzellen hat einen breiten Anwendungsbereich sowohl für Erkrankungen, die für das hämatopoetische System spezifisch sind, als auch für andere Erkrankungen des Organsystems. Im hämatopoetischen System können sowohl vererbte als auch erworbene Erkrankungen durch eine Gentherapie mit Stammzellen behandelt werden. Beispielsweise könnten Hämoglobinmangelerkrankungen wie α- und β-Thalassämien durch Einschleusen des für die α- oder β-Globinkette codierenden Gens zusammen mit regulatorischen Sequenzen behandelt werden, die eine sehr starke gewebespezifische Expression in Erythrocyten ermöglichen (siehe, Grosveld et al, Cell (1987) 51: 975–986). Auf ähnliche Weise könnte Sichelzellanämie durch die genetische Einschleusung des fötalen Globingens in hämatopoetische Stammzellen geheilt werden, da die regulierte Expression von großen Mengen an fötalem Hämoglobin ausreicht, die Sichelbildung in roten Blutzellen trotz der gleichzeitigen Anwesenheit von sichelförmigem Hämoglobin zu verhindern (siehe, Sunshine et al, J. Molec. Biol. (1979) 133: 435).
Genetische Krankheiten von Neutrophilen, die durch funktionellen Proteinmängel verursacht wird, wie beispielsweise Leukozytenadhäsionsdefizienz (LAD) oder chronische Granulomatose (CGD), könnten durch genetische Einschleusung des für das defekte oder fehlende Gen codierenden Gens zusammen mit regulatorischen DNA-Sequenzen behandelt werden, die eine sehr starke gewebespezifische Expression in hämatopoetischen Stammzellen ermöglichen (siehe Wilson et al, Science (1990) 248: 1413–1416). Genetische Erkrankungen, die Thrombozyten betreffen, wie beispielsweise die von-Willebrand-Erkrankung, könnten durch genetische Einschleusung des Gens geheilt werden, das für den von-Willebrand-Faktor codiert, zusammen mit Sequenzen, die dessen Expression und Sezernierung ermöglichen.
Die besondere Eignung der Gentherapie mit hämatopoetischen Stammzellen für den Austausch kongenital fehlerhafter Genprodukte wird insbesondere bei der Behandlung von lymphozytären Immundefizienzen, wie beispielsweise schwerer kombinierter Immundefizienz infolge von Adenosindeaminase-Mangel deutlich. Es hat sich herausgestellt, dass eine retrovirale Gentherapie zirkulierender T-Zellen mit dem ADA-Gen die klinische Immundefizienz bei solchen Patienten erfolgreich mildern kann, obwohl diese Wirkungen nur vorübergehend sind, da die transfizierten T-Lymphozyten in vivo eine endliche Lebensdauer besitzen (siehe Kasid et al, Proc. Nat. Acad. Sci (USA) (1990) 87: 473–477, oder Culver et al, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1991) 88: 3155–3159). Wenn das Gen jedoch erfolgreich in hämatopoetische Stammzellen transfiziert werden könnte, würden alle T-Zellen, die von diesen Stammzellen abstammen, das ADA-Gen enthalten und exprimieren. Da die transfizierten Stammzellen daher während der ganzen Lebenszeit des Patienten persistieren und proliferieren würden, würde die ADA-Defizienz der T-Zellen mit einer einzigen Gentransferbehandlung der Stammzellen dauerhaft behandelt werden (siehe Wilson et al, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (1990) 87: 439–443).
Neben der Behandlung von vererbten enzymatischen Anomalitäten des hämatopoetischen Systems könnte die Gentherapie mit Stammzellen für den Schutz von Stammzellen und deren Nachkommenschaft vor toxischen exogenen Agentien, wie beispielsweise Viren oder Chemotherapie, nützlich sein. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass der Gentransfer von DNA-Sequenzen, die für die TAR-Bindungsstelle des HIV-TAT-transaktivierenden Faktors codieren, die T-Zellen vor der Ausbreitung einer Infektion mit dem HIV-Virus schützen (siehe, Sullenger et al, Cell (1990) 63: 601–608). Eine stabile Überführung dieser Sequenzen in hämatopoetische Stammzellen würde zu einem Pool von T-Zellen führen, die alle von diesen Stammzellen abstammen und die verhältnismäßig oder vollkommen resistent gegen die Ausbreitung von HIV sind.
In ähnlicher Weise würde eine erfolgreiche Transfektion der Gene, die für das Gen für die Multi-Drug-Resistenz (MDR) oder das Methotrexatresistenzgen codieren, in die Stammzellen des humanen Knochenmarks Stammzellen erzeugen, die gegen die Auswirkungen einer Krebs-Chemotherapie relativ resistent sind. Nach einer autologen Knochenmarkstransplantation mit diesen genetisch manipulierten Zellen wären Patienten in der Lage, eine Chemotherapie mit Mitteln zu tolerieren, vor denen ihre Stammzellen geschützt sind, ohne an der schweren Knochenmarkssuppression zu leiden, die im Allgemeinen von diesen Krebsmedikamenten verursacht wird. Dadurch könnten die Patienten wirksamere Dosen der Krebschemotherapie mit geringerer Toxizität erhalten.
Es ist leicht zu erkennen, dass eine Gentherapie mit hämatopoetischen Stammzellen auch bei erworbenen hämatopoetischen Krankheiten wie beispielsweise Leukämie, Lymphom und aplastische Anämie, nützlich ist. Wenn die genetische Ursache einer solchen Erkrankung erst einmal entdeckt wurde, würde das Einschleusen eines Gens, dessen Produkt das des anomalen Gens in der Zelle entweder überlagert oder es direkt berichtigt (möglicherweise, indem es das Gen herausspleißt und ersetzt), die Anomalität heilen.
Auf einer breiteren Ebene kann eine Gentherapie mit hämatopoetischen Stammzellen jedoch genauso für die Behandlung von Erkrankungen außerhalb des hämatopoetischen Systems nützlich sein. Ein Gentransfer von DNA-Sequenzen, die lösliche therapeutische Proteine tragen, könnten zu reifen Stammzellen führen, die die erwünschten Mengen eines therapeutischen Moleküls permanent sezernieren. Dieser Ansatz könnte sich zur Behandlung von beispielsweise Diabetes mellitus eigen, beispielsweise durch Einschleusen von DNA-Sequenzen für Insulin zusammen mit regulatorischen DNA-Sequenzen, die eine angemessene Expression des transfizierten Insulingens steuern, vielleicht als Antwort auf erhöhte Glucosespiegel im Plasma. Systemischer Bluthochdruck könnte durch das genetische Einschleusen von DNA-Seuqenzen in Stammzellen behandelt werden, die für sekretorische Peptide codieren, die als kompetitive Inhibitoren des Angiotensin umwandelnden Enzyms, der Calciumkanäle der glatten Gefäßmuskeln oder der adrenergen Rezeptoren fungieren. Die Alzheimer-Erkrankung könnte möglicherweise durch das genetische Einschleusen von DNA-Sequenzen in Stammzellen behandelt werden, die für Enzyme codieren, die die Amyloid-Plaques im zentralen Nervensystem abbauen.
Die vielen Anwendungmöglichkeiten der Gentherapie, insbesondere über genetische Insertion in Stammzellen, sind also allgemein bekannt und wurden ausführlich beschrieben (siehe, Boogs et al, supra, Kohn et al, supra, Lehn, supra und/oder Verma et al, supra). Es gibt tatsächlich immer mehr Beispiele für einen erfolgreichen therapeutischen Gentransfer in differenzierte humane Stammzellen, wie beispielsweise für T-Lymphozyten beschrieben ist (siehe, Kalsd et al, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1990) 87: 473–477, Culver et al, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1991) 88: 3155–3159).
Bedauerlicherweise war es vor der vorliegenden Erfindung nicht möglich, einen (stabilen) Gentransfer in humane Stammzellen zu erreichen. Während verschiedene Gruppen die Möglichkeit eines durch Retroviren vermittelten Gentransfers in humane hämatopoetische Zellen gezeigt haben, wurden humane primitive hämatopoetische Stammzellen nicht erfolgreich transfiziert. Dies steht in scharfem Gegensatz zu Experimenten bei Mäusen, bei denen ein durch Retroviren vermittelter Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen in gewissem Maße möglich war (siehe, Wilson et al, Proc. Nat. Acad. Sci (USA) (1990) 87: 439–443).
Das Haupthindernis beim Erreichen einer erfolgreichen Gentherapie mit humanen hämatopoetischen Stammzellen war das Unvermögen, Gene in humane hämatopoetische Zellen unter Bedingungen einschleusen zu können, bei denen sich die Stammzellen teilen und proliferieren. Ein erfolgreiches stabiles Einschleusen von Genen in eine Zielzelle erfordert, dass die Zielzelle mindestens einen Zellteilungszyklus durchläuft. Wenn sich die Stammzellen in Gegenwart des gewünschten genetischen Materials nicht teilen, wird das Material daher nicht stabil in die Stammzellen inseriert. Vor der Entwicklung der vorliegenden Erfindung gab es kein System, das eine ex vivo-Teilung und -Proliferation humaner Stammzellen unterstützte, und es war keine erfolgreiche genetische Transformation humaner Stammzellen möglich.
Die Literatur, die für das vorliegende Dokument relevant ist, schließt auch das U.S. Patent 4,721,096 ein, das ein dreidimensionales System beschreibt, welches Stromazellen für das Wachstum von hämatopoetischen Zellen umfaßt. Siehe dazu auch die hierin zitierten Referenzen. Glanville et al, Nature (1981) 292: 267–269, beschreiben das murine Metallothionein-I-Gen. Wong et al, Science (1985) 228: 810–815, beschreiben humanen GM-CSF. Lemischka et al, Cell (1986) 45: 917–927, beschreiben einen durch Retroviren vermittelten Gentransfer als Marker für hämatopoetische Stammzellen und das Verfolgen des Schicksals dieser Zellen nach Transplantation. Yang et al, Cell (1986) 47: 3–10, beschreiben humanes IL-3. Chen et al, Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 2745–2752, beschreiben die Transformation von Säugerzellen durch Plasmid-DNA. Greaves et al, Cell (1989) 56: 979–986, beschreiben das humane CD2-Gen. Civin et al, J. Immunol. (1984) 133: 1576, beschreiben das CD34-Antigen. Martin et al, Cell (1990) 63: 203–211, beschreiben humanes S-CSF; Forrester et al, J. Cell. Science (1984) 70: 93–110 (1984), diskutieren parallele Durchflußkammern. Coulombel et al, J. Clin. Invest. (1986) 75: 961 beschreiben den Verlust von CML-Zellen in statischen Kulturen.
Es besteht daher ein beachtlicher Bedarf nach Verfahren und Zusammensetzungen für die ex vivo-Replikation und die stabile genetische Transformation von humanen Stammzellen und für die Optimierung humaner hämatopoetischer Progenitorzellkulturen, insbesondere im Hinblick auf das große Potential der Stammzellexpansion, Progenitorzellexpansion und der Gentherapie, die mit solchen Systemen möglich wird. Bedauerlicherweise waren Versuche, entsprechende Ergebnisse zu erreichen, bislang enttäuschend.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der Erfindung besteht demnach darin, neuartige Verfahren, einschließlich Bedingungen für Kulturmedien und Reaktoren, für die ex vivo-Replikation und die stabile genetische Transformation von humanen Stammzellen bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung neuartiger Verfahren durch die Erfinder, einschließlich Bedingungen für Kulturmedien und Reaktoren, die eine ex vivo-Teilung humaner Stammzellen ermöglichen. Diese Verfahren sind wie in den anliegenden Ansprüchen 1–7 definiert. Sie beruhen auf der Kultivierung humaner Stammzellen in einem flüssigen Kulturmedium, das entweder kontinuierlich oder periodisch mit einer Rate von 1 Milliliter (ml) Medium pro ml Kultur über etwa 24 bis 48 Stunden ausgetauscht wird, vorzugsweise durch Perfusion, und der Entfernung von Stoffwechselprodukten und der Wiederauffüllung der verbrauchten Nährstoffe, während die Kultur unter physiologisch verträglichen Bedingungen gehalten wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kommt die obige Austauschrate des Mediums in Verbindung mit der Zugabe von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren zum rasch ausgetauschten Kulturmedium zur Anwendung.
Die Erfinder haben gefunden, dass die erhöhte Austauschrate des erfindungsgemäß verwendeten Mediums, gegebenenfalls unter Zugabe von hämatopoetischen Wachstumsfaktoren zum rasch ausgetauschten Kulturmedium, überraschenderweise (1) Kulturen unterstützt, in denen humane Stammzellen über längere Zeiträume von mindestens 5 Monaten proliferieren, (2) Kulturen unterstützt, in denen humane hämatopoetische Progenitorzellen durch Teilung und Differenzierung humaner Stammzellen durch eine ausgedehntere Kultivierungsdazer von mindestens 5 Monaten hergestellt werden, und (3) den erhöhten Stoffwechsel und die Sezernierung von GM-CSF aus humanen Stromazellen, einschließlich humanen Knochenmarksstromazellen stimuliert. Die vorliegende Erfindung ermöglicht zum ersten mal das Überleben und die Proliferation humaner Stammzellen in Kultur.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein ex vivo-Kultursystem zur Verfügung, das die kontinuierliche Proliferation humaner Stammzellen unterstützt, um ein erfolgreiches Einschleusen genetischen Materials in die humanen Stammzellen zu ermöglichen, was zur Bildung genetisch stabil transformierter humaner Stammzellen führt. Diese Ausführungsform kann zum Transfer von beliebigem genetischen Material verwendet werden, das in einen rekombinanten Retrovirus oder irgendeinen anderen Vektor zum Gentransfer eingebaut werden kann, der eine Zellteilung erfordert. Genetisch modifizierte humane Stammzellen, die auf diese Weise hergestellt wurden, können, wie oben beschrieben, bei zahlreichen verschiedenen klinischen Erkrankungen angewandt werden.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Verbesserung der Effizienz des genetischen Transfers in humane hämatopoetische Progenitorzellen bereit, und stellt gleichzeitig genetisch stabil transformierte humane Stammzellen und/oder genetisch stabil transformierte humane hämatopoetische Progenitorzellen zur Verfügung.
Es werden auch Verfahren zur Verfügung gestellt, die Reaktoren und Zusammensetzungen verwenden, welche eine effiziente Proliferation der hämatopoetischen Zellen in Kultur erlauben, insbesondere Zellen in einem frühen Reifestadium, einschließlich Stammzellen. Die Verfahren verwenden Stromazellen, die normal transformiert sind, welche eine konstitutive oder induzierbare Produktion von Wachstumsfaktoren liefern, wobei die Zellen physikalisch voneinander getrennt sind, um eine leichte Abtrennung der hämatopoetischen Zellen zu ermöglichen. Dadurch, dass für eine kontinuierliche Perfusion und nach Bedarf für ein Recycling der Zellen gesorgt ist, können hohe Dichten und Ausbeuten lebensfähiger hämatopoetischer Zellen erreicht werden. Der Reaktor verwendet eine Proteinoberfläche für die Stromazellen und entweder die Oberfläche oder eine andere Barriere, um die Trennung der Stromazellen und der hämatopoetischen Zellen aufrecht zu halten.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt eine schematische Ansicht einer Perfusionskammer dar;
2 zeigt eine schematische Darstellung und ein Flußdiagramm des Wegs des Perfusionsmediums;
3a zeigt eine schematische Ansicht einer Durchflußkammer zur Messung der Scherspannung für die Trennung der Zellen;
3b zeigt eine Seitenansicht der Durchflußkammer der 3a;
3c zeigt ein Diagramm eines Scherspannungsprofils für hämatopoetische Zellen;
4a und 4b zeigen die Auf- und Seitenansicht einer Durchflußkammer zur Kultivierung und Abtrennung hämatopoetischer Zellen; und
5a und 5b sind Ansichten einer Durchflußkammer, bei der die Barrieren nacheinander entfernt werden, um ein kontinuierliches Wachstum der Stromazellen zu ermöglichen.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung können beobachtet werden, wenn immer die vorliegende Erfindung auf irgendein Standardsystem für Flüssigkulturen humaner Stammzellen angewandt wird, wie man sie bei (einer) hämatopoetischen Kulturen) findet. Mittels der erfindungsgemäßen raschen Austauschraten des Mediums, gegebenenfalls unter Zugabe ergänzender hämatopoetischer Wachstumsfaktoren, haben die Erfinder überraschend gefunden, dass es möglich ist, Standardsysteme für Flüssigkulturen für humane hämatopoetische Zellen herzustellen, einschließlich Kulturen in Gegenwart oder Abwesenheit von tierischem Serum oder Plasma, einschließlich Serum von Pferd, Kalb, fötalem Kalb oder Mensch, die qualitativ bessere Leistungen bieten.
Erfindungsgemäße Flüssigkulturen humaner hämatopoetischer Zellen können mit Zelldichten von 10⁴ bis 10⁹ Zellen pro ml Kultur realisiert werden, wobei übliche bekannte Medienbestandteile wie beispielsweise IMDM, MEM, DMEM, RPMI 1640, Alpha-Medium oder McCoy-Medium verwendet werden, welche Kombinationen von Serumalbumin, Cholesterin und/oder Lecithin, Selen und anorganischen Salze verwenden können. Bekanntermaßen können diese Kulturen mit Corticosteroiden, wie beispielsweise Hydrocortison in einer Konzentration von 10^–4 bis 10^–7 M, oder anderen Corticosteroiden in gleich wirkender Dosis, wie beispielsweise Cortison, Dexamethasom oder Solumedrol, supplementiert werden. Diese Kultivierungen erfolgen üblicherweise bei einem in etwa physiologischen pH, d.h. von 6,9 bis 7,4. Das Medium wird üblicherweise einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre ausgesetzt, die zwischen 4 und 20 Vol.-% Sauerstoff, vorzugsweise 6 bis 8 Vol.-% Sauerstoff enthält.
Mit diesen Standardkulturtechniken kann die eingesetzte Zellmasse um jede gewünschte Menge angereichert werden, beispielsweise auf das Dreifache oder mehr, entweder hinsichtlich des Gehalts an Stammzellen oder des Gehalts an hämatopoetischen Progenitorzellen. Verschiedene bekannte Verfahren können dazu verwendet werden, diese Anreicherung zu erreichen, entsprechend entweder einem negativen Selektionsverfahren oder einem positiven Selektionsverfahren. Gemäß dem Verfahren der negativen Selektion werden beispielsweise reife Zellen mit Hilfe immunologischer Methoden entfernt, z.B. durch Markierung von Nicht-Progenitor-, Nicht-Stammzellen mit einer Reihe monoklonaler Maus-Anti-Mensch-Antikörper und anschließende Entfernung der mit Maus-Antikörper beschichteten Zellen durch Adhäsion an mit Kaninchen-Anti-Maus-Ig beschichtete Plastikplatten. Siehe z.B. Emerson et al, J. Clin. Invest. (1985) 76: 1286–1290.
Die vorliegende Erfindung beruht auf einer grundlegenden Änderung der Bedingungen von Flüssigkulturen des humanen Knochenmarks unter irgendeiner der obigen Bedingungen, dem raschen Austausch des Nährmediums. Übliche Zeitpläne für Kulturen erfordern, dass Medium und Serum wöchentlich ausgetauscht werden, entweder als einmaliger Austausch, der wöchentlich durchgeführt wird, oder zweimal die Woche ein Austausch der Hälfte des Mediums und des Serums. Erfindungsgemäß wird das Nährmedium der Kultur für Zellen, die mit einer Dichte von 2 × 10⁶ bis 1 × 10⁷ Zellen pro ml kultiviert werden, entweder kontinuierlich oder periodisch mit einer Rate von etwa 1 ml pro ml Kultur innerhalb von etwa 24 bis etwa 48 Stunden ausgetauscht, vorzugsweise durch Perfusion. Für Zelldichten von 1 × 10⁴ bis 2 × 10⁶ Zellen pro ml kann die gleiche Austauschrate für das Medium verwendet werden. Für Zelldichten, die größer als 10⁷ Zellen pro ml sind, kann die Austauschrate für das Medium proportional erhöht werden, um einen konstanten Durchfluß von Medium und Serum pro Zelle pro Zeiteinheit zu erreichen.
Der erfindungsgemäße Austausch des Nährmediums kann auf jede beliebige Art und Weise erfolgen, mit der man das Ergebnis des Austauschs des Mediums erreicht, z.B. durch Entfernung eines Aliquots des verbrauchten Kulturmediums und Austausch gegen ein frisches Aliquot. Der Strom des Aliquots kann mit Hilfe der Schwerkraft, durch eine Pumpe oder irgendeine andere geeignete Vorrichtung erfolgen. Der Strom kann in eine beliebige Richtung oder mehrere Richtungen gehen, abhängig von der Beschaffenheit und der Packung der Kultur. Vorzugsweise wird das neue Medium so zu der Kultur gegeben, dass es in Kontakt mit der Zellmasse tritt. Besonders bevorzugt wird es so zur Kultur gegeben, dass es einer in vivo-Perfusion gleicht d.h. so, dass es durch mindestens einen Teil der Zellmasse und bis zur gesamten Zellmasse perfundiert wird.
Eine weitere optionale, aber wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruht auf der Zugabe hämatopoetischer Wachstumsfaktoren, einschließlich synthetischer hämatopoetischer Wachstumsfaktoren, zu den rasch ausgetauschten Kulturen. Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform werden die beiden Cytokine IL-3 und GM-CSF zusammen zum Medium gegeben, und zwar mit einer Rate von 0,1 bis 100 ng/ml/Tag, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 10 ng/ml/Tag, besonders bevorzugt von 1 bis 2 ng/ml/Tag, gegeben. Epo kann in einer Menge von etwa 0,001 bis 10 U/ml/Tag, vorzugsweise von 0,05 bis 0,15 U/ml/Tag, zum Nährmedium gegeben werden. Der Mastzellen-Wachstumsfaktor (MCF, c-Kit-Ligand, Steel-Faktor) kann in einer Menge von 1 bis 100 ng/ml/Tag, vorzugsweise von 10 bis 50 ng/ml/Tag, zum Nährmedium gegeben werden. IL-1 (α oder β) kann ebenfalls in einer Menge von 10 bis 100 Einheiten/ml alle 3 bis 5 Tage zugegeben werden. Zusätzlich können IL-6, G-CSF, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, PDGF oder EGF mit einer Rate von 1 bis 100 ng/ml/Tag zugegeben werden.
Die Erfinder haben festgestellt, dass man, wenn IL-3, GM-CSF und Epo, wie oben beschrieben, verwendet werden, eine linienspezifische Entwicklung roter Blutzellen erhält. Alternativ dazu produziert die Kultur, wenn IL-3 und GM-CSF, mit oder ohne IL-6 oder G-CSF, verwendet werden, vorzugsweise Granulozyten. Die Erfinder haben auch beobachtet, dass bei den erfindungsgemäßen Kulturen T- und B-Lymphozyten mit der Zeit verloren gehen.
Die Stoffwechselproduktmenge im Medium wird normalerweise in einem bestimmten Bereich gehalten. Die Glucosekonzentration wird normalerweise im Bereich von etwa 5 bis 20 mM gehalten. Die Lactatkonzentration wird gewöhnlich unter 35 mM gehalten. Die Glutaminkonzentration wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 3 mM gehalten. Die Ammoniumkonzentration liegt gewöhnlich unter 2,4 mM. Diese Konzentrationen können entweder mit periodischen Messungen oder mit kontinuierlichen On-line-Messungen mit bekannten Verfahren überwacht werden. Siehe, z.B., Caldwell et al, J. Cell. Physiol. (1991) 147: 344–353.
Die Zellen, die erfindungsgemäß kultiviert werden können, können beliebige humane Stammzellen oder humane Stammzellen enthaltende Zellmassen sein, einschließlich humaner mononukleärer Zellen aus peripherem Blut, humaner Knochenmarkszellen, humaner fötaler Leberzellen und/oder humaner Nabelschnur-Blutzellen. Jede dieser Zellmassen enthält humane Stammzellen. Andere Zellmassen, die humane Stammzellen enthalten, können erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden, einschließlich humaner Stammzellen, die sich in humanem Knochenmark finden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Zellkultur angereichert werden, um den Gehalt an humanen Stammzellen in der Zellmasse zu vermehren. Eine solche Anreicherung kann wie oben beschrieben erreicht werden und stellt, wenn sie erfindungsgemäß verwendet wird, ein erstes nützliches Mittel für eine Gentherapie mittels eines Gentransfers in humane Stammzellen dar, einschließlich humaner Stammzellen, die im humanen Knochenmark vorliegen, und humaner Knochenmarksstammzellen. Stammzellen, die im humanen Knochenmark vorliegen, sind Zellen, die aus humanem Knochenmark, peripherem Blut, fötaler Leber oder humanem Nabelschnurblut erhältlich sind.
Im Allgemeinen wird bei dieser Ausführungsform eine Verpackungszellinie, die mit einem Retrovirus infiziert ist, oder ein Überstand, der aus der Kultur einer solchen Verpackungszellinie erhalten wurde, oder ein anderer Gentransfervektor zu den erfindungsgemäß kultivierten humanen Stammzellen gegeben, um genetisch stabil transformierte humane Stammzellen zu erhalten. Die vorliegende Erfindung liefert eine erhöhte Replikation von Stammzellen und humanen hämatopoetischen Progenitorzellen, während frühere Kulturen im Gegensatz dazu nur die Replikation humaner hämatopoetischer Progenitorzellen mit abnehmender Geschwindigkeit ermöglichten (d.h. abnehmende Kulturen). Das vorliegende Kultursystem sieht zum ersten Mal eine Expansion von Zellen in Kultur vor, die zur retroviralen Infektion von Zellen benötigt wird. Frühere Systeme, bei denen eine retrovirale Infektion mit abnehmenden Kulturen durchgeführt wurde, lieferten keine Infektion früherer Zellen. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere, wenn sie zusammen mit einem angereicherten Pool an Stammzellen, und besonders bevorzugt, wenn sie zudem noch zusammen mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, einschließlich synthetischer Wachstumsfaktoren, durchgeführt wird, ein sehr wirksames Mittel zur Infektion von Stammzellen in vitro zur Verfügung.
Die Erfinder haben entdeckt, dass die Zugabe von rekombinante Retroviren enthaltenden Überständen zu den Kulturen zu einer Einschleusung der Viren und der Gene, die sie tragen, in die humanen (hämatopoetischen) Stammzellen führt. Die Progenitorzellen, die durch Teilung und Differenzierung aus diesen Stammzellen hervorgehen, und die reifen Blutzellen, die durch weitere Teilung und Differenzierung aus diesen Progenitorzellen hervorgehen, enthalten die transfizierte DNA über die gesamte Dauer der hämatopoetischen Kultur in vitro. Die Erfinder haben beobachtet, dass sie, wenn das Retrovirus nur zu Beginn der Kulturdauer hinzugefügt wird, transfizierte Progenitorzellen und reife Blutzellen erhalten, die nur aus den Stammzellen hervorgehen, die zu Beginn der Kultur vorliegen, proliferieren und genetisch stabil transformiert sind, da keine retroviral infizierte Zelle eine Nachbarzelle infizieren kann. Progenitorzellen und reifere Zellen, die das gewünschte genetische Material enthielten, erhielten das Gen von den primitiveren Stammzellen, die während der anfänglichen retroviralen Infektionsperiode genetisch transformiert worden waren.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung werden humane hämatopoetische Zellen, die entweder aus Knochenmark, peripherem Blut, fötaler Leber oder Nabelschnurblut isoliert wurden, zuerst durch Entfernung der reifen Blutzellen auf Stammzellen angereichert. Dies wird durch Inkubation der hämatopoetischen Zellen mit murinen monoklonalen Antikörpern, die Epitope auf reifen Blutzellen und Knochenmarksvorläuferzellen, aber nicht auf Stammzellen erkennen, und anschließende Entfernung der markierten Zellen durch Immunadhäsion an eine immunoadsorbierende Oberfläche mit Kaninchen-Anti-Maus-Ig erreicht. Die resultierenden lineage-negativen (Lin^–) Zellen werden anschließend in Gegenwart eines Retrovirus oder eines anderen Gentransfervektors erfindungsgemäß kultiviert. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung in Gegenwart von GM-CSF (vorzugsweise 1 mg/ml/Tag) und IL-3 (vorzugsweise 1 mg/ml/Tag) mit oder ohne IL-1 (vorzugsweise 50 U/ml/4 Tage-Periode), mit oder ohne c-Kit-Ligand (Mastzellen-Wachstumsfaktor) (vorzugsweise 10 μg/ml/Tag).
Die retrovirale Infektion kann entweder erfolgen, indem man in das Kulturmedium Überstände (z.B. 5 bis 20% Vol/Vol) einschließt, die von retrovirale Verpackungszellinien produziert wurden, die mit rekombinanten Retrovirus infiziert waren, und zwar während der ersten 2 bis 21, vorzugsweise 10 bis 14 Tage der Kultur, oder durch Kultivierung der Lin^–-Zellen direkt über den infizierten retroviralen Verpackungszellinien selbst, oder beides.
Vorzugsweise werden retrovirale Überstände verwendet und die Inkubationszeit in Gegenwart des Virus liegt bei 12 bis 16 Tagen. Die Verpackungszellinien werden ebenfalls vorzugsweise bis nahe Konfluenz gezüchtet, das Medium ausgetauscht und die Zellinien weitere 12 bis 15 Stunden inkubiert. Das Medium wird dann gesammelt und bei der Transfektion der humanen Stammzellen verwendet. Dieses Protokoll ist jedoch nicht strikt erforderlich, und es kann jeder Überstand, der von einer retroviralen Verpackungszellinie produziert wurde, verwendet werden. Jede (bekannte) retrovirale Verpackungszellinie kann erfindungsgemäß verwendet und gemäß einem bekannten Protokoll kultiviert werden (siehe, z.B., Wilson et al, Science (1990) 248: 1413–416 und/oder Sullenger et al, Cell (1990) 63: 601–608). Beispielhafte Verpackungszellinien schließen NIH 3T3-Zellen und die Nierenkrebszellinie 5637 ein.
Jedes Gen, das zusammen mit geeigneten Promotor- und Verstärkerelementen, die dessen Expression ermöglichen, in einen rekombinanten Retrovirus eingeschleust wurde, kann in humane Stamm- und hämatopoetische Progenitorzellen eingebaut werden. Die Erfindung stellt zum ersten Mal Bedingungen zur Verfügung, die ein Überleben und eine Proliferation der Stammzellen in diesen Kulturen ermöglichen, wodurch die Bildung stabil transfizierter, genetisch modifizierter humaner hämatopoetischer Stammzellen in diesen Kulturen möglich wird. Die Begriffe "stabil transformiert" und "stabil transfiziert" werden in diesem Text verwendet, um den Einbau exogener DNA in humane Stammzellchromosom(en) zu bezeichnen, der durch die vorliegende Erfindung möglich gemacht wird, da sie es ermöglicht, sich ex vivo teilende humane Stammzellen solch exogener DNA auszusetzen.
Erfindungsgemäß erhält man Kulturen, in denen humane hämatopoetische Progenitorzellen durch Teilung und Differenzierung aus humanen Stammzellen über eine Kulturdauer von mindestens fünf Monaten produziert werden. Das heißt, dass man eine Kultur erhält, die ein Überleben der Stammzellen und deren Proliferation in Kultur unterstützt.
Die Daten, die von den Erfindern erhalten wurden, zeigen an, dass die Perfusionsrate des Mediums eine äußerst signifikante Variable bei der Bestimmung des Verhaltens der ex vivo-Kulturen von humanem Knochenmark darstellt. Diese Daten zeigten, dass eine signifikante Wirkung auf die ex vivo-Hämatopoese erhalten wird, wenn die Austauschrate des Mediums von der üblichen Dexter-Rate von einmal pro Woche auf eine tägliche Austauschrate des Mediums von 7 Volumeneinheiten pro Woche erhöht wurde. In Experimenten, die von den Erfindern durchgeführt wurden, zeigten alle Kulturen einen signifikanten Verlust an Zellen während der ersten 3 bis 4 Wochen. Nach dieser Abnahme stabilisierten sich die Kulturen und die Wirkung einer Perfusionsrate für das Medium wurde deutlicher.
Eine Austauschrate des Mediums von 3,5 mal pro Woche führte zu den proliferativsten Kulturen und auch zu den Kulturen mit der höchsten Langlebigkeit in Bezug auf die Produktion von Progenitorzellen. Besonders zu beachten ist, dass während den Wochen 4 bis 10 die alle vierzehn Tage produzierte Zahl nichtadhärenter Zellen tatasächlich stabil oder ansteigend war.
Über den gesamten Verlauf der Kulturen war die kumulative Anzahl an Zellen, die nach Woche 3,5 produziert wurde, fast dreimal höher als diejenige, die mit dem herkömmlichen Dexter-Protokoll für Kulturen produziert wird. Ferner bleibt die stabile Produktion von Progenitorzellen bis Woche 18 erhalten.
Humane Stromazellen, wie beispielsweise Stromazellen, die sich in humanem Knochenmark finden, können in den Kulturen der Erfindung vorliegen oder nicht. In üblichen Kulturen liegen die Stromazellen in der Zellkultur in einer Menge von etwa 10^–3 bis 10^–1 vor (Stromazellen/Zellen insgesamt).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung haben die Erfinder gefunden, dass die Kulturen der Erfindung überraschenderweise zu einem erhöhten Stoffwechsel und einer erhöhten GM-CSF- und IL-6-Sezernierung aus humanen Knochenmarksstromazellen führen. Während im Überstand von humanen Knochenmarksstromazellen kein GM-CSF nachgewiesen werden kann, regt ein rascher erfindungsgemäßer Austausch des Mediums humane Knochenmarksstromazellen an, 300 Centogramm/ml/Tag bis 200 Picogramm/ml/Tag GM-CSF auszuscheiden. Die Sezernierung von IL-6 durch humane Knochenmarksstromazellen wird durch einen raschen erfindungsgemäßen Austausch des Mediums ebenfalls von 1 bis 2 ng/ml/Tag auf 2 bis 4 ng/ml/Tag erhöht. Diese Zunahme wird sowohl beobachtet, wenn nur die rasche Medienaustauschrate der Erfindung angewandt wird, als auch, wenn die rasche Austauschrate zusammen mit der Zugabe hämatopoetischer Wachstumsfaktoren zur Anwendung kommt. Auf Grundlage der von den Erfindern erhaltenen Daten sollte die Wirkung der raschen Medienaustauschraten der Erfindung auf die Produktion von Cytokinen durch humane Stromazellen bei humanen Stromazellen in beliebigen komplexen Gewebekultursystemen beobachtet werden.
Beispielhaft kann das erfindungsgemäß verwendete Medium drei Grundbestandteile enthalten. Der erste Bestandteil ist ein Medienkomponente bestehend aus IMDM, MEM, DMEM, RPMI 1640, Alpha-Medium oder McCoy-Medium, oder eine äquivalente bekannte Kulturmediumkomponente. Der zweite ist eine Serumkomponente, die wenigstens Pferdeserum oder Humanserum umfaßt und gegebenenfalls außerdem fötales Kälberserum, Serum von einem neugeborenen Kalb und/oder Kälberserum umfassen kann. Der dritte Bestandteil ist ein Corticosteroid, wie beispielsweise Hydrocortison, Cortison, Dexamethasom, Solumedrol oder eine Kombination davon, vorzugsweise Hydrocortison.
Die Zusammensetzung verschiedener Medien, die verwendet werden können, ist nachfolgend angegeben.
Iscove-modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM)^1,2,3
Die Serumkomponente kann in der Kultur in einer Menge von mindestens 1% (v/v) bis 50% (v/v) vorliegen. Die Serumkonzentration kann vorzugsweise um die 15 bis 30% (v/v) liegen. Bei höheren Serumkonzentrationen wird die Austauschrate proportional erhöht. Der dritte Bestandteil kann in einer Menge von 10^–7 M bis 10^–4 M vorliegen und liegt vorzugsweise in einer Menge von 5 × 10^–6 bis 5 × 10^–5 M vor. Die Medienkomponente stellt den Rest dar, so dass sich alle drei Bestandteile auf 100% addieren. Alternativ dazu kann die Serumkomponente durch irgendeine der verschiedenen Ersatzmischungen für Standardseren ersetzt werden, welche üblicherweise Insulin, Albumin und Lecithin oder Cholesterin umfassen. Siehe Migliaccio et al, Exp. Hematol. (1990) 18: 1049–1055, Iscove et al, Exp. Cell Res. (1980) 126: 121–126 und Daniak et al, J. Clin. Invest. (1985) 76: 1237–1242.
Beispielhaft kann die Konzentration humaner hämatopoetischer Stammzellen wie folgt erhöht werden. Rote Blutzellen werden mittels Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation aus einem Knochenmarksaspirat entfernt. Die mononukleären Zellen werden anschließend mit einem "Cocktail" von Antikörpern inkubiert, die reife Blutelemente, einschließlich roter Blutzellen, und rote Blutzellen, Granulozyten, Makrophagen und reife Lymphozyten (sowohl B- als auch T-Zellen) erkennen. Daneben sind Antikörper enthalten, die „committed" Progenitorzellen (einschließliche Anti-CD33) erkennen. Die reifen Zellen werden anschließend mit Hilfe verschiedener Verfahren, einschließlich Panning, Magnetkügelchen oder Zellsortierung in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) entfernt. Durch Entfernung der reifen Elemente wird die Möglichkeit einer Infektion mit rekombinantem Virus und damit der Transfer eines/der gewünschten Gens/Gene auf hämatopoetische Stammzellen sehr erleichtert.
In einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren zum Züchten hämatopoetischer Zellen in Kultur bereitgestellt, wobei Fibroblastenzellen, die normal transformiert wurden, verwendet werden, um Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu stellen, wobei proteinhaltige Bestandteilen zu den Mischungen aus Fibroblastenzellen und hämatopoetischen Zellen zugegeben werden und eine im wesentlichen kontinuierliche Perfusion, gegebenenfalls mit Recycling, erfolgt, um ein wirksames Milieu für die Züchtung beizubehalten.
Die Beschreibung des Verfahrens dieser Ausführungsform kann daher in die Beschreibung der Perfusionbedingungen, des Reaktors und seines inneren Aufbaus, und der transformierten Fibroblasten aufgeteilt werden.
Der Reaktor umfaßt ein Gefäß, das irgendeine geeignete Form besitzen kann, die die notwendige Zellverteilung, das Einbringen von Nährstoffen und Sauerstoff, die Entfernung von Stoffwechselabfallprodukten, gegebenenfalls Recycling der hämatopoetischen Zellen, Substitution von Stromazellen und Ernten hämatopoetischer Zellen ermöglicht. Der Reaktor sollte Bedingungen bieten, welche im wesentlichen eine Knochenperfusion imitieren. In vivo werden etwa 0,08 ml Serum pro ml Knochenmark pro Minute perfundiert. Dies ergibt umgerechnet etwa 0,3 ml Serum pro 10⁶ Zellen pro Tag. Das Medium wird daher innerhalb von 24 Stunden durchschnittlich zu mindestens 50%, vorzugsweise zu mindestens 100% ausgetauscht, so dass eine Menge an Stoffwechselprodukten verbleibt, die das Wachstum nicht limitiert. Die Austauschrate wird im Allgemeinen bei etwa 0,5 bis 1,0 ml Perfusionsmedium pro 10⁶ Zellen pro Tag liegen, wodurch die in vivo-Perfusionsraten empirisch imitiert werden.
Die Perfusionsrate im Bioreaktor variiert abhängig von der Zelldichte im Reaktor. Für Zellen, die mit 2–10 × 10⁶ Zellen/ml kultiviert werden, liegt diese Rate bei 1 ml/ml Reaktorvolumen pro 24–48 Stunden, wobei das verwendete Medium 20% Serum, entweder 10% fötales Kälberserum und 10% Pferdeserum oder 20% fötales Kälberserum, enthält. Für höhere Zelldichten werden die Perfusionsraten proportional erhöht, um einen konstanten Serumfluß pro Zelle pro Zeiteinheit zu erreichen. Daher wird die Perfusionsrate, wenn die Zellen mit 5 × 10⁸ Zellen/ml kultiviert werden, bei 0,1 ml/ml Reaktorvolumen pro Minute liegen. Diese Durchflußgeschwindigkeiten, die die Durchflußgeschwindigkeiten des Serums und des Mediums an die Zelldichte anpassen, sind für die Anregung der endogenen Produktion hämatopoetischer Wachstumsfaktoren in den normalen humanen Knochenmarksstromazellen in der Kultur unbedingt notwendig. Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, die durch diese Durchflußraten von Serum und Medium induziert werden, umfassen GM-CSF und können auch S-CSF, IL-6 und G-CSF sowie andere hämatopoetische Wachstumsfaktoren beinhalten. Diese Geschwindigkeiten werden in den Bioreaktoren so eingestellt, dass die Scherspannung durch die Longitudinalströmung, der die Stammzellen und Progenitorzellen an ihren Anheftungsstellen an die Stromazellen ausgesetzt sind, zwischen 1,0 und 5,0 Dyn/cm² liegt.
Es wurden verschiedene Medien für die Züchtung von hämatopoetischen Zellen und Stromazellen verwendet. Beispielhafte Medien schließen MEM, IMDM und RPMI ein, die mit Kombinationen von 5–20% fötalem Kälberserum, 5–20% Kälberserum und 0–15% Pferdeserum supplementiert sein können, und/oder mit serumfreien Medien, die mit PDGF, EGF, FGF, HGF oder anderen Wachstumsfaktoren zur Anregung von Stromazellen oder Stammzellen supplementiert sind. Um die von den transformierten Fibroblasten gelieferten Wachstumsfaktoren zu supplementieren, können zusätzliche Wachstumsfaktoren in dem Perfusionsmedium enthalten sein, insbesondere dann, wenn bestimmte Zellen einer besonderen Lineage erwünscht sind. Zu den Wachstumsfaktoren, die entweder als Folge der Sezernierung durch Stromazellen oder durch Zugabe im Perfusionsmedium enthalten sein können, gehören GM-CSF, G-CSF oder M-CSF, die Interleukine 1–7, insbesondere 1, 3, 6 und 7, TGF-α oder -β, Erythropoetin und dergleichen, insbesondere humane Faktoren. Von besonderem Interesse ist die Anwesenheit von etwa 0,5–2, vorzugsweise 1 ng/ml G-MCSF und von 0,5–2, vorzugsweise 1 ng/ml sowie 0,1–2 U/ml/Tag Endkonzentration an Erythropoetin, von etwa 100–300 ng/ml/Tag G-CSF und etwa 1–10 ng/ml/Tag Stammzellenwachstumsfaktor (S-CSF, auch als Mastzellen-Wachtumsfaktor oder Kit-Ligand bezeichnet). Es versteht sich von selbst, dass einer oder mehrere, vorzugsweise mindestens zwei der Wachstumsfaktoren durch Sezernierung aus transformierten Zellen zur Verfügung gestellt werden, die in einer Menge vorliegen, die ausreicht, um die gewünschte Menge an Wachsttumsfaktoren in dem Perfusionmedium aufrecht zu erhalten.
Zweckmäßig wird in dem Reaktor physiologische Temperatur verwendet, nämlich 37°C, obwohl auch niedrigere Temperaturen, einschließlich 33°C, aber üblicherweise nicht unter 25°C, verwendet werden können. Die Feuchtigkeit liegt im Allgemeinen bei 100%, wobei die Luft etwa 5% Kohlendioxid enthält. Das Perfusionsmedium kann extern vom Reaktor oder intern im Reaktor oxygeniert werden, wobei verschiedene Einrichtungen für eine interne Oxygenierung vorgesehen sind. Eine interne Oxygenierung kann mit Hilfe von Hohlfasern, porösen Sinterplatten, Silikonröhrchen oder anderen Membranen geeigneter Porosität und Hydrophobizität erreicht werden. Die Nährstoffmenge und die Menge an Stoffwechselprodukten wird normalerweise in einem relativ engen Bereich gehalten. Die Glucosemenge liegt üblicherweise im Bereich von etwa 5 bis 20 mM, gewöhnlich von 10 bis 20 mM, die Lactatkonzentration wird üblicherweise unter etwa 35 mM gehaltenund kann über 20 mM zugelassen sein. Die Glutaminkonzentration wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 3 mM, gewöhnlich 1,5 bis 2,5 mM gehalten, während die Ammoniakkonzentration üblicherweise unter etwa 2,5 mM, vorzugsweise unter etwa 2,0 mM gehalten wird.
Die Strömung des Fluids kann aufgrund der Schwerkraft, mit Hilfe einer Pumpe oder anderen Vorrichtungen erfolgen, wobei die Strömung in eine beliebige Richtung oder mehrere Richtungen sein kann, abhängig von der Art der Packung im Reaktor. Wünschenswerterweise kommt eine Laminarströmung zum Einsatz, wobei eine im wesentlichen horizontale Strömung durch den Reaktor oder eine vertikale Strömung verwendet wird, wobei dir Strömung im Reaktor von unten nach oben oder in umgekehrter Richtung stattfindet.
Wenn man bei der Quelle für die humanen hämatopoetischen Zellen vermutet, dass sie neoplastische Zellen, z.B. leukämische Lymphome oder Karzinome enthält, kann die Perfusionsströmung so gewählt werden, dass die normalen Progenitorzellen von den neoplastischen hämatopoetischen Zellen abgetrennt werden. Man hat gefunden, dass normale, hämatopoetische Progenitorzellen an Stroma- und Matrixproteine mit einer Affinität adhärieren, die einer Kraft von ungefähr 1,5–2,0 Dyn/cm² durch die Longitudinalströmung des Fluids standhalten kann. Im Gegensatz dazu haben neoplastische Zellen und ihre Vorläufer eine wesentlich schwächere Affinität zum Stroma, die im Bereich von etwa 0,05–1,2 Dyn/cm² liegt. Indem man für eine Perfusionsströmungsgeschwindigkeit sorgt, die Scherspannungraten zwischen denjenigen liefert, die von normalen und neoplastischen Progenitorzellen toleriert werden, im Allgemeinen größer als 1 Dyn/cm², kann man eine Trennung der neoplastischen Progenitorzellen von den normalen Progenitorzellen erreichen, wobei die Perfusion im Allgemeinen für mindestens etwa zwei Tage, vorzugsweise mindestens etwa fünf Tage und besonders bevorzugt sieben Tage oder länger, beibehalten wird. Auf diese Weise kann man normale hämatopoetische Zellen von einem Patienten expandieren, während man gleichzeitig geeignete Strömungsgeschwindigkeiten verwendet, um neoplastische Zellen abzutrennen. Auf diese Weise kann man autologe hämatopoetische Zellen von einem Patienten bereitstellen, der an Neoplasie leidet, die normalen hämatopoetischen Zellen während einer Behandlungsperiode des Patienten mit Chemotherapie oder Röntgenbestrahlung expandieren und anschließend die normalen hämatopoetischen Zellen wieder in den Patienten einbringen, um die Hämatopoese und das Immunsystem des Patienten wiederherzustellen.
Beispielhaft für die Verwendung von Scherspannung zur Abtrennung der hämatopoetischen Tumorzellen von normalen hämatopoetischen Zellen ist die Situation bei chronischer myelogener Leukämie (CML). Die Scherspannungstoleranz für CML-Zellen liegt im Bereich von 0,05–1,2 Dyn/cm². Dieser Unterschied ermöglicht ein wirksames Entfernen der CML-Zellen bei einer Knochenmarksprobe eines Individuums. Bei Anwendung einer Scherspannung von etwa 1,2–1,5, vorzugsweise 1,3, Dyn/cm² können die CML-Zellen effizient abgetrennt werden.
Scherspannungstoleranz in Knochenmarkszellen eines Individuums kann mit Hilfe einer konischen, radialen Durchflußkammer bestimmt werden. In der radialen Durchflußkammer nimmt die von der Zelle erfahrene Scherspannung mit dem Abstand "d" vom Eingang der Kammer als Funktion von 1/d ab. Die Bereiche können dann hinsichtlich der Zellpopulation untersucht werden und die Scherspannung für die gewüschte Zellpopulation, die man zurückhalten möchte, eingestellt werden.
Zum Entfernen leukämischer Stammzellen werden Progenitorzellen und Stammzellen aus Knochenmarksproben von Patienten mit Leukämie zuerst in eine radiale Durchflußkammer gegeben. Die Radialströmungskammer besteht aus zwei parallelen Platten, die aus Polycarbonat oder Glas gefertigt sind, die eine Adhäsion von Knochenmarksstromazellen an die tieferen Platten erlauben. Die Messungen zu Beginn können durchgeführt werden, indem man entweder 1) vor der Infusion der hämatopioetischen Zellen ein vorgebildetes konfluentes Monolayer aus Knochenmarksstromazellen etabliert und dann nach 12–48 Stunden einen Fluidstroms initiiert, oder indem man 2) das Knochenmark des Patienten ohne Verwendung eines vorgebildeten Stromamonolayers direkt in inokuliert und dann 3–4 Tage wartet, bevor man den Fluidstrom, üblicherweise 0,05–1,0 cc/min, etabliert. Die Platten sind an den Kanten mit einer Gummidichtung abgedichtet und werden mit Stellschrauben zusammengehalten. Am engen Ende, dem Infusionsende, der Kammer leitet ein Schlauch Flüssigkeit aus einem Voratsbehälter mit einer Spritzpumpe mit konstantem Druck in die Kammer. Am weiten Ende, dem Sammelende, werden das Fluid und die entfernten Zellen durch einen separaten Schlauch aufgefangen (siehe 3 und 3b). Nach der Perfusionsperiode (üblicherweise 3–7 Tage) werden die nichtadhärenten Zellen entfernt und die Platten werden getrennt, Zellen aus jedem der 3–5 Bereiche werden durch Absaugen und Gummiwischer entfernt, und jede Fraktion wird mit Hilfe von Standardmethoden (gewöhnlich Karyotypanalyse durch Chromosomenbänderung) auf das Vorhandensein von leukämischen Zellen untersucht. Der Vergleich der leukämischen Analysen jeder Fraktion zeigt, in welcher Fraktion (d.h. bei welcher Scherspannung) die leukämischen Zellen nicht mehr am Stroma haften können und abgetrennt werden. In diesen Kammern nimmt die von den Zellen erfahrene Scherspannung exponentiell als Funktion des Abstands vom Einlass ab. (Siehe 3c). Üblicherweise sind die nichtadhärenten Zelle alle oder fast alle leukämisch, während Zellen, die in der nächstliegenden Hälfte der Kammer adhärieren, fast alle normal sind.
Auf Grundlage der Ergebnisse dieser Messungen wird eine Reihe paralleler rechteckiger Kammern aufgebaut, in denen die Strömungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit (siehe 4a und 4b) über die untere Fläche eine Scherspannung erzeugt, bei der festgestellt hat, dass sie in der konischen Kammer die leukämischen Zellen vom Stroma entfernt, ohne alle normalen Zellen zu entfernen. Im Fall des Knochenmarks von Patienten mit chronischer myelogener Leukämie beträgt diese Scherspannung üblicherweise 0,01–0,05 Dyn/cm². Die tatsächliche Durchflußgeschwindigkeit hängt von der Größe und Geometrie der Kammern ab. Knochenmarkszellen des Patienten werden in diesen rechteckigen Kammern mit einer Konzentration von 5 × 10⁶/ml bis 50 × 10⁶/ml in Iscove's modifiziertem Dulbecco-Medium mit 5–20% (üblicherweise 10%) fötalem Kälberserum plus 0–15% (üblicherweise 10%) Pferdeserum mit oder ohne 10⁶ M Hydrocortison kultiviert. Die Knochenmarkszellen werden 12–24 Stunden lang ohne Fluidstrom kultiviert und anschließend wird der Fluidstrom initiiert. Die Zellen werden 3–7 Tage lang kultiviert und zu diesem Zeitpunkt werden alle nichtadhärenten Zellen verworfen. Die adhärenten Zellen werden von den rechteckigen Platten durch Aspiration und mechanisches Schütteln zurückgewonnen und dann gesammelt. Diese Zellen können dann entweder direkt in den Patienten zurückgeführt werden oder für einen späteren Gebrauch mit Standardmethoden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden.
Andere Zellen als jene des hämatopoetischen Systems können ebenfalls über die unterschiedliche Toleranz gegenüber Scherspannung getrennt werden. Wenn unterschiedliche Subpopulationen von Zellen innerhalb einer komplexen Zellmischung vorliegen, können also die oben beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, einen Zelltyp von Interesse aus einer Zellsuspension, die von z.B. Haut, Leber, Muskeln, Nerven oder Epithel stammt, abzutrennen. Besonderes Interesse gilt dabei der Abtrennung von Tumorzellen aus einer Population normaler Zellen. Die abzutrennende Zellpopulation wird mit einem geeigneten Stromasubstrat wie unten beschrieben, beispielsweise einem gereinigten Protein oder einem Zellbestandteil, an die die jeweiligen Zellen adhärieren, in Kontakt gebracht. Die Scherspannungstoleranz für jede der adhärenten Subpopulationen wird wie oben beschrieben bestimmt. Der Fluidstrom kann dann in geeigneter Weise eingestellt werden, so dass die gewünschte Subpopulation am Stroma verbleibt. Die gewünschten Zellen werden dann wie oben beschrieben gesammelt.
In dem Reaktor können zahlreiche verschiedene Packungen verwendet werden, um für ein adhärentes Wachstum der Zellen zu sorgen, wobei eine gewisse physische Trennung zwischen den Stromazellen und den hämatopoetischen Zellen erhalten bleibt und ein gewisser Kontakt zwischen oder eine enges Nebeneinander von Stromazellen und hämatopoetischen Zellen zugelassen wird. Auf diese Weise können die von den Stromazellen sezernierten Faktoren leicht von den hämatopoetischen Zellen aufgenommen werden und deren Proliferation und, falls zweckmäßig, deren Differenzierung und Reifung anregen.
Die Proteinmatrix, die die Zellen tragen soll, kann die Form von zerkleinerten Kollagenpartikeln annehmen, z.B. Schwämme oder poröse Kollagenkügelchen, von Schwämmen oder Kügelchen, die aus extrazellulärem Knochenmatrixprotein aus Knochenmark bestehen, oder von proteinbeschichteten Membranen, bei denen das Protein Kollagen, Fibronectin, Hämonectin, RGDS-Peptid, gemischtes Knochenmarksmatrixprotein oder dergleichen ist. Die Porengrößen der Membranen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 5 μm, um Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen zuzulassen und dennoch noch eine physische Trennung beizubehalten.
Es können Membranen verwendet werden, die proteinbeschichtet sind. Es können verschiedene Membranmaterialien wie Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfonat etc. verwendet werden. Es können verschiedene Proteine, insbesondere Kollagen oder die anderen Proteine, die oben angegeben wurden, verwendet werden. Die Membran sollte genügend kleine Poren besitzen, damit die transformierten Zellen nicht durch die Membranen hindurchgehen können aber wachsen und eine konfluente Schicht auf einer Seite der Membran bilden können und Teile der Zellmembran in die Poren expandieren können. Im Allgemeinen liegen die Poren im Bereich von 1 bis 5 μm. Auf diese Weise können die hämatopoetischen Stammzellen auf der gegenüberliegenden Seite der Membran wachsen und mit den transformierten Zellen in Wechselwirkung treten, wobei die Faktoren direkt aus den transformierten Zellen in die hämatopoetischen Progenitorzellen transferiert werden können. Die Progenitorzellen, die Stammzellen, sind in der Lage, an die intrudierten cytoplasmatischen Projektionen zu binden, die in die Poren eingedrungen sind. Hämatopoetische Differenzierung aus den Stammzellen erfolgt auf einer Seite der Membran und die differenzierte Nachkommenschaft ist nicht in der Lage, sich durch die Poren zurückzuquetschen, die schon größtenteils von der Stromazellschicht belegt sind, wenn man sich der Konfluenz nähert oder diese erreicht hat. Man könnte beispielsweise mehrere Kammern vorsehen, in denen Stromazellen wachsen können, und die hämatopoetischen Zellen könnten entsprechend der Kammer, in der die Stromazellen in einer subkonfluenten Menge vorliegen, verlagert werden. Durch eine bewegliche Barriere zwischen den Kammern kann man daher, wenn sich die Stromazellen der Konfluenz nähern, im Allgemeinen nach etwa 8–12 Wochen, die Barriere zwischen den Kammern öffnen oder entfernen und den Stromazellen ermöglichen, in die neue Kammer zu gelangen und den hämatopoetischen Zellen ermöglichen, in Kontakt mit den subkonfluenten Stromazellen zu treten, während die subkonfluenten Stromazellen die Faktoren in die Kammer speisen, die die hämatopoetischen Zellen umfaßt (5a und 5b). Der Transfer der hämatopoetischen Zellen kann durch geeignete Strömungsgeschwindigkeiten oder andere übliche Mittel erreicht werden. Man kann verschiedene Vertiefungen in der Kammer vorsehen, die durch geeignete Wände voneinander getrennt sind, und nach Ansäen in einer Vertiefung bewegen sich die Zellen, wenn die Zellen konfluent werden, dann zur nächsten Vertiefung besiedeln die nächste Vertiefung in subkonfluenter Weise. Eine andere Modifikation des Systems ist eine solche, bei der die hämatopoetischen Zellen, nach 8–12 Wochen in Kultur, neuen proliferierenden Stromazellen ausgesetzt werden. Dies erfolgt auf eine von mehreren möglichen Arten. Die Exposition mit proliferierenden Stromazellen erfolgt auf eine von mehreren möglichen Arten. Bei der ersten Methode wird die Kultur 3–5 Minuten EDTA ausgesetzt, wodurch die hämatopoetischen Stammzellen von den Stromazellen entfernt werden. Die entfernten Zellen werden dann in ein neues Kulturgefäß überführt, welches selbst Knochenmarksstromazellen enthalten kann, die 3–7 Tage zuvor angesäht wurden. Dieses Vorgehen wird alle 8–12 Wochen wiederholt. Ein anderer möglicher Ansatz ist es, weitere Oberfläche bereitzustellen, indem man das Kulturvolumen erhöht und nach 8–12 Wochen zusätzliche Kollagenkügelchen zur Kultur gibt. Schließlich können kleine organische Moleküle oder Proteine, insbesondere Hormone, wie beispielsweise Thrombozytenwachstumsfaktor (mit 100– 500 ng/ml), Interleukin-1-alpha, Tumornekrosefaktor alpha oder basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder andere für Fibroblasten mitogene Moleküle alle 3–7 Tage zu den Kulturen gegeben werden. Diese Exposition mit mitogenen stimulierenden Stromafaktoren fördert die kontinuierliche Proliferation von Knochenmarksstromazellen und ihre kontinuierliche Produktion hämatopoetischer Wachstumsfaktoren. Man kann so für einen kontinuierlichen subkonfluenten Zustand der Stromazellen sorgen.
Ein kontinuierlicher Fluidstrom kann ebenfalls zur selektiven Abtrennung normaler Zellen von krebsartigen Zellen in einer Knochenmarks-population verwendet werden. Bei diesem Ansatz wird zuerst eine radiale Durchflußkammer zur Bestimmung der spezifischen Adhäsionseigenschaften des Stromas von normalen gegenüber krebsartigen Zellen verwendet und anschließend eine rechteckige Durchflußkammer verwendet, die zum Erreichen einer zur Entfernung der krebsartigen Zellen ausreichenden Scherbeanspruchung eingestellt ist, um die normalen und die krebsartigen Zellen zu trennen.
Das vorliegende Verfahren und die vorliegende Vorrichtung sehen auch die Möglichkeit vor, Stammzellen, die durch den Strom des Perfusionsmediums verloren gegangen sind, im Kreislauf zurückzuführen. Der Membranproteinoberflächenmarker CD34 trennt unreife hämatopoetische Zellen im wesentlichen von reifen hämatopoetischen Zellen ab. Indem man solche Zellen, die CD34⁺ sind, wegfängt und zurückführt, läßt sich also der Verlust von Stammzellen an das Medium vermeiden.
Zum Wegfangen und Rückführen der unreifen Zellfraktion in den Reaktor lassen sich verschiedene Verfahren verwenden. Beispielsweise könnte man die Zellen mit einem Antikörper markieren, der für CD34 spezifisch ist, und dann Antikörper gegen diesen Antikörper einsetzen, um die CD34⁺-Zellen zu sammeln und in den Reaktor zurückzuführen. Alternativ zur positiven Selektion könnte man eine negative Selektion durchführen, wobei man die reifen Zellen entfernen würde, indem man Antikörper gegen verschiedene, mit reifen Zellen assoziierte Marker einsetzt, beispielsweise Antikörper gegen Glycophorin A, CD33, M01, OKT3, OKT4, OKT8, OKT11, OKT16, OKM1, OKM5, Leu7, Leu9, Leu M1, Leu M3 usw. Für Marker, die für reife Zellen der verschiedenen hämatopoetische Zellinien, lymphoid, myeloid und erythroid, spezifisch sind, stehen verschiedene Antikörper zur Verfügung, und diese Antikörper können dazu verwendet werden, um reife Zellen aus dem Medium, das aus dem Reaktor strömt, zu entfernen, gefolgt vom Ernten der verbleibenden Zellen und deren erneuter Etablierung im Reaktor. Auf diese Weise läßt sich die zwangsläufige Abnahme in den Kulturen aufgrund des Verlustes von Stammzellen vermeiden und ein unbegrenztes Überleben der Stammzellen in vitro gewährleisten.
Die Auftrennung mit Antikörpermarkern läßt sich auf verschiedene Weise erreichen, wobei Standardverfahren, einzeln oder in Kombination, eingesetzt werden, beispielsweise "Panning", fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, Antikörper, die an verschiedene Oberflächen, z.B. Polystyroloberflächen, metallische Mikrokügelchen und Magnete usw., gebunden sind. Die Antikörper werden an eine Oberfläche gebunden, die eine Trennung zwischen adhärenten und nicht adhärenten Zellen zuläßt, oder die Antikörper werden markiert, direkt oder indirekt, was eine Selektion zwischen markierten und unmarkierten Zellen erlaubt.
Indem man sich an die vorliegenden Verfahrensvorschriften hält, läßt sich eine deutlich verlängerte Wachstumsdauer von hämatopoetischen Zellen in vitro erreichen, die im allgemeinen ex vivo in Kultur eine humane Hämatopoese über wenigstens sechs Monate liefert, wobei Granulopoese über wenigstens vier Monate und Erythropoese über wenigstens drei Monate unterstützt werden. Zusätzlich werden über den gesamten Kulturverlauf kontinuierliche hämatopoetische Nachkommenzellen erzeugt, was zu einer Netto-Expansion von Nachkommenzellen führt, die mehr als das 10-fache der eingesetzten Zellen beträgt.
Indem man sich an die vorliegenden Verfahrensvorschriften hält, wird auch eine erhöhte Zellteilungsrate der Stammzellen gefördert, was eine effiziente Insertion von retroviral transfiziertem genetischen Material erlaubt. Gene, die mit Hilfe des passenden retroviralen Vektors während einer anfänglichen zweiwöchigen Infektionsdauer inseriert wurden, können in bis zu 10–30% aller Nachkommen- und Vorläuferzellen, die während der anschließenden Kultivierung über vier Monate in Kultur entstehen, exprimiert werden. Die vorliegenden Verfahren fördern also den erfolgreichen Transfer von genetischem Material in eine hochproliferative humane hämatopoetische Stammzelle.
1 ist eine schematische Ansicht einer Perfusionskammer. Reaktor 10 mit Deckplatte 12 und Bodenplatte 14 werden durch Schrauben 16 zusammengehalten, die durch Flügelmuttern 18 in Position gehalten werden. Um ein Verziehen zu vermeiden, werden drei Schrauben verwendet. Die Kammer 20 weist drei Zonen auf, wobei die mittlere Zone 22 die Trägermatrix für die Stromazellen, das Bett aus Stromazellen und die Knochenmarkszellen enthält. Die zentrale Zone 22 ist von der oberen Zone 24 und der unteren Zone 26 durch Membranen oder Siebmaschen 28 bzw. 30 getrennt. Zweckmäßig kann eine Polysulfonmembran oder ein Edelstahlsieb eingesetzt werden, dessen Maschengröße klein genug ist, um Zellen in der mittleren Zone der Kammer zurückzuhalten. Die trennende Grenzfläche kann mit Hilfe des inneren Zylinders 27 in die Kammer eingebaut werden, der unterteilt ist, um mechanische Unterstützung für die Trennmembran zu bieten. Die obere Zone 24 und die untere Zone 26 müssen nicht gleich sein und weisen Schlauchleitungen oder Membranen auf, durch die flüssiges Medium und Gase ausgetauscht werden. Die Gase werden durch einen hydrophoben Schlauch, z.B. Aus Silikon, ausgetauscht, dessen Länge (und damit Gas/Flüssig-Kontaktfläche) variiert werden kann, um ausreichend Gasstrom zuzulassen, damit dem Bedarf der in der mittleren Zone metabolisierenden Zellpopulation nachgekommen wird. Die Medien können durch Öffnung 32 direkt aus der oberen oder unteren Zone abgepumpt oder abgezogen werden und durch Zuleitungsschlauch 34 zugefüttert werden.
Falls gewünscht, können die obere und untere Zone bei Verwendung eines externen Oxygenierapparats weggelassen werden. In dieser Situation wird die Trennmembran unter dem Glaszylinder 36 in Position gehalten, der in die zylindrisch vertieften Platten 12 und 14 paßt, und die Fläche innerhalb der zylindrischen Vertiefung soll für gute Strömungsverteilung durch die Membran sorgen. Diese Geometrie erlaubt es, daß sich das Fluid aus der begrenzten Zahl von Einlaßöffnungen vermischt und sich für den Radialdruck ein Gleichgewicht einstellt, was zu einem uniformen Flüssigkeitsstrom durch die Trennmembran führt. Dieser Aufbau eignet sich für Kammern mit relativ wenig Zellen, so daß die Oxygenierung nicht limitierend wird.
In 2 ist eine schematische Darstellung des Regelkreises gezeigt, der die Perfusionskammer mit dem seitlichen Medienreservoir, dem Oxygenator, der Sensorkammer und den Proben-/Einspritzöffnungen verbindet.
Eine externe Frischmedium-Quelle 50 wird mittels Pumpe 52 durch Leitung 56 in ein Medienreservoir gepumpt, und verbrauchtes Medium wird mittels Pumpe 52 durch Leitung 58 aus Reservoir 54 zur Weiterverarbeitung in den Behälter 60 für verbrauchtes Medium abgeführt. Eine zweite Pumpe 62 pumpt Medium aus dem Medienreservoir 54 durch Leitung 64 durch einen Hohlfaseroxygenator 66. Das Medium wird durch Leitung 68 in die erste Kammer von Bioreaktor 70 geleitet. Falls zweckmäßig, wird ein Mittel zum Einspritzen von Medienkomponente 82 bereitgestellt, um die Komponente zum Transport durch das Medium in die erste Kammer von Bioreaktor 70 in Leitung 68 einzuspeisen. Bei der Komponente kann es sich um Testkomponenten, zusätzliche Faktoren o.ä. handeln. Das Medium aus Bioreaktor 70 wird durch die mittlere Kammer 72 in die zweite Kammer 74 des Bioreaktors geleitet. Von dort wird das Medium durch Leitung 76 zu den in Reihe liegenden Sensoren 78 geleitet, um die Veränderungen in der Medienzusammensetzung festzustellen.
Beispielsweise ist es wünschenswert, daß das Verhältnis von Glutamin:Glucose, abhängig von den verwendeten Zellinien, im Bereich von etwa 1:5–8 liegt; beispielsweise bevorzugt 1:8 für transfizierte 3T3-Zellen. Außerdem liegt die Ammoniumkonzentration vorzugsweise unter etwa 2,0 mM und die Lactatkonzentration beträgt vorzugsweise weniger als 35 mM. Durch Überwachen des aus dem Reaktor ausströmenden Mediums kann das in den Bioreaktor eingebrachte Medium modifiziert werden, der Sauerstoffpartialdruck kann verändert werden, die Gasstromgeschwindigkeit kann geändert werden, verschiedene Komponenten können vermehrt werden oder die Perfusionsgeschwindigkeit kann erniedrigt oder erhöht werden.
Von den Sensoren 78 wird das Medium mittels Pumpe 62 durch Leitung 80 in Reservoir 54 geleitet.
Über den oben beschriebenen Strömungsweg wird das Medium im seitlichen Reservoir mit Hilfe einer separaten Pumpe langsam ausgetauscht. Diese Organisation erlaubt eine getrennte Regelung der Medienaustauschgeschwindigkeit (der äußeren Pumpe) und der Durchströmgeschwindigkeit durch den Oxygenator und die Perfusionskammer. Erstere wird eingesetzt, um die längerfristige Änderung in der Medienzusammensetzung und die Perfusion zu regeln, während letztere eingesetzt werden kann, um das Potential des gelösten Sauerstoffs und die Strömungsmuster in der Kammer zu regeln. Die Verwendung einer engmaschigen biokompatiblen Membran erlaubt eine Pfropfen- oder Kolbenströmung in der Kammer und erlaubt somit die genaue Steuerung der Zufuhr von Wachstumsfaktoren und von anderen speziellen Verbindungen, die man in sehr genauen Mengen in die hämatopoetischen Zellen und die Stromazellen einschleusen möchte.
Nach Autoklavieren der Kammer und der Komponenten des Regelkreies wird der Reaktor in einer sterilen Umgebung zusammengebaut. Das Medium kann einige Tage im Kreis durch den seitlichen Regelkreis und die Kammer geführt werden, wobei auf Zeichen von Verunreinigungen überprüft wird. Wenn ein steriler Zusammenbau erfolgt ist, wird die mittlere Zone der Kammer entweder mit der extrazellulären Matrix allein oder mit einem zuvor inokulierten Träger für die extrazelluläre Matrix, der die Stromazellen enthält, inokuliert. Die Stromazellen werden dann entweder: (1) über einige Tage in der Kammer gehalten, wobei ihre Stoffwechselleistung und/oder ihr Ansprechen auf Wachstumsfaktoren überwacht wird, und wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wird das Knochenmark inokuliert; oder (2) unmittelbar mit Knochenmark angesät. In beiden Fällen wird die Zellschicht am Boden der mittleren Zone der Perfusionskammer gehalten. Die Zellen legen zusätzliche extrazelluläre Matrix ab und die Zellschicht adhäriert an die Trennmembran. Zu diesem Zeitpunkt kann die Kammer umgedreht werden und die Zellschicht kann sich dann an der Decke der mittleren Zone befinden. Bei dieser Anordnung setzen sich die reifenden Zellen am Boden der mittleren Zone ab, da sie ihre Adhäsionsfähigkeit an die Stromaschicht verlieren. Dieses Charakteristikum ist wichtig, um Schädigungen zu verhindern, die reife Zellen an der Stromaschicht und/oder an weniger reifen hämatopoetischen Zellen verursachen. Dieses Charakteristikum erleichtert auch das kontinuierliche Entfernen reifer Zellen.
Diese Zellen werden geerntet, indem die Zellen mittels einer Spritze entnommen werden oder indem man die Zellen, durch den Druck des perfundierten Mediums, kontinuierlich durch die Austrittsschlauchleitung aus der Kammer strömen läßt.
Die Stromazellen sind größtenteils Fibroblasten, die mit ein oder mehr Genen transformiert sind, die die gewünschten hämatopoetischen Wachstumsfaktoren liefern. Es können die gleichen oder verschiedene Zellen mit den Genen transfiziert werden, abhängig von der jeweiligen Wahl der Wirtszellen können die gleichen oder verschiedene Zellen für eine Vielzahl von Genen verwendet werden.
Es können zahlreiche verschiedene normale Zellen oder stabile Linien eingesetzt werden. Es wurde jedoch gefunden, daß nicht alle Zellstämme zulässig sind, da die Transformation einiger Zellinien zu einem Überwachstum der Zellen führen kann. Zweckmäßig sind die eingesetzten Zellen nicht neoplastisch, sondern benötigen die Adhäsion an einen Träger. Bei den Säugerzellen muß es sich nicht um Humanzellen und nicht einmal um Primatenzellen handeln. Ebenso kann die adhärente Zellschicht auch eine Vielzahl nicht-transformierter Zellen beinhalten, einschließlich normaler humaner adhärenter Knochenmarkszellen, normaler humaner adhärenter Milzzellen und normalen Thymusepithels.
Verfahren zum Transformieren von Säugerzellen, einschließlich Fibroblasten, sind allgemein bekannt, und es gibt umfangreiche Literatur, von der zuvor lediglich ein paar wenige Fundstellen angegeben wurden. Die Konstrukte können die natürlich vorkommende regulatorische Initiationsregion für die Transkription verwenden, die den Promotor und, falls zweckmäßig, den Enhancer umfaßt, oder es kann eine andere transkriptionelle Initiationsregion beteiligt sein, die induzierbar oder konstitutiv ist.
Es steht eine große Zahl von Initiationsregionen für die Transkription zur Verfügung, die induzierbar oder konstitutiv sind und mit einem natürlich vorkommenden Enhancer assoziiert sein können, oder es kann ein Enhancer vorgesehen sein, nur in einem bestimmten Zelltyp induziert werden oder in einer Vielzahl oder in allen Zelltypen funktionsfähig sein. Die Initiationsregion für die Transkription kann aus einem Virus oder einem natürlich vorkommenden Gen stammen, kann synthetisch sein oder eine Kombination von all diesem darstellen.
Promotoren, die verfügbar sind und Anwendung gefunden haben umfassen die chromosomalen Promotoren, beispielsweise die Metallothionein I- und II-Promotoren von Maus und Mensch, den Actinpromotor etc., oder virale Promotoren, beispielsweise die SV40-Promotoren der frühen Gene, den CMV-Promotor, Adenovirus-Promotoren, Promotoren, die mit den LTRs von Retroviren assoziiert sind etc. Diese Promotoren stehen zur Verfügung und lassen sich leicht in geeignete Vektoren inserieren, die Polylinker zur Insertion der Initiationsregion für die Transkription sowie der interessierenden Gene umfassen. Für andere Fälle stehen Expressionsvektoren zur Verfügung, die einen Polylinker zwischen einer Initiationsregion für die Transkription und einer Terminationsregion für die Transkription bieten, wobei auch für die verschiedenen Signale im Zusammenhang mit der Prozessierung des Messengers für die Translation gesorgt wird, d.h. die Cap-Site und das Polyadenylierungssignal. Die Konstruktion der Expressionskassette, die die regulatorischen Regionen und das Strukturgen umfaßt, kann mit Hilfe von ein oder mehreren Restriktionsenzymen, Adaptern, Polylinkern, durch in vitro-Mutagenese, Auffüllen von Primern ("Primer-Repair"), Ausschneiden o.ä. erfolgen.
Die Expressionskassette ist gewöhnlich Teil eines Vektors, der einen Marker und ein oder mehr Replikationssysteme beinhaltet. Der Marker erlaubt den Nachweis und/oder die Selektion von Zellen, in die die Expressionskassette und der Marker eingebaut wurden. Es können verschiedene Marker eingesetzt werden, insbesondere Marker, die Resistenz gegen ein Toxin, insbesondere ein Antibiotikum, vermitteln. Bevorzugt wird eine Neomycin-Resistenz verwendet, die einem Säugerzellenwirt Resistenz gegen G418 verleiht. Die Replikationssysteme können ein prokaryontisches Replikationssystem umfassen, das eine Klonierung während der verschiedenen Schritte erlaubt, bei denen die einzelnen Komponenten der Expressionskassette zusammengebaut werden. Das andere Replikationssystem kann dazu verwendet werden, ein episomales Element in der Wirtszelle zu halten, obgleich das Replikationssystem in den meisten Fällen so gewählt werden wird, daß es die Integration der Expressionskassette in ein Chromosom des Wirts erlaubt.
Zum Einbringen der Expressionskassette in den Wirt kann jede üblicherweise eingesetzte Methode verwendet werden, einschließlich Transformation mit Calciumpräzipitierter DNA, Transfektion, Infektion, Elektroporation, ballistischer Teilchen o.ä. Sobald die Wirtszellen transformiert sind, können sie in einem geeigneten Nährmedium mit einem Selektionsmittel amplifiziert werden, um diejenigen Zellen zu selektionieren, die den Marker enthalten. Überlebende Zellen können dann amplifiziert und eingesetzt werden.
Wirtszellen, die eingesetzt werden können, umfassen die Zellinie CV1 der afrikanischen grünen Meerkatze, NIH-3T3-Mauszellen, normale humane Knochenmarksfibroblasten und normale Milzfibroblasten aus Mäusen. Es ist zu beachten, daß die Zellen in manchen Fällen, abhängig von der Wahl des Vektors und der Zellinie, neoplastisch werden können. Es ist wichtig, daß die resultierenden transformierten Zellen zur Adhäsion in der Lage sind, wodurch die transformierten Zellen an einem Träger, beispielsweise Proteinschwämmen, proteinbeschichteten Membranen o.ä., gebunden bleiben.
Wenn der Vektor zur Expression des geeigneten Wachstumsfaktors konstruiert worden ist, kann er mit Hilfe beliebiger geeigneter Methoden zur Transformation von Zellen verwendet werden. Die resultierenden transformierten Zellen können dann zum Ansäen der bereits beschriebenen Träger verwendet werden. Diese Träger können in den Reaktor eingebracht werden oder können sich zum Zeitpunkt des Ansäens im Reaktor befinden. Man läßt die Zellen ausreichend lang wachsen, um sicherzustellen, daß die Zellen lebensfähig sind und in der Lage sind, die gewünschten Wachstumsfaktoren zu produzieren.
Der Reaktor kann dann in zweckmäßiger Weise mit den hämatopoetischen Zellen angesät werden. Bei den hämatopoetischen Zellen kann es sich um im wesentlichen reine Stammzellen, um eine Mischung hämatopoetischer Zellen ein oder mehrerer Zellinien, die im wesentlichen frei von reifen Zellen ist, oder um eine Mischung handeln, die alle oder im wesentlichen alle verschiedenen Zellinien des hämatopoetischen Systems in ihren verschiedenen Reifestadien umfaßt.
Man läßt die Zellen unter im wesentlichen kontinuierlicher Perfusion durch den Reaktor wachsen, wobei man die verschiedenen beteiligten Nährstoffe und Faktoren überwacht. Zum größten Teil werden die primären Faktoren von den Stromazellen geliefert, so daß man gewöhnlich zu einer Gleichgewichtskonzentration der Wachstumsfaktoren kommt. Da gefunden wurde, daß konditionierte Überstände beim Wachstum der hämatopoetischen Zellen wirksam sind, kann man ein Verhältnis von Stromazellen zu hämatopoetischen Zellen vorsehen, bei dem der Wachstumsfaktor im Reaktor auf einer geeigneten Konzentration gehalten wird.
Transfiziertes Stroma kann zum Einschleusen von Genen in humane Stammzellen dienen. Bei Mäusen wird der retroviral vermittelte Gentransfer in Stammzellen ermöglicht, indem man die Mäuse mit 5-FU vorbehandelt und dann die geernteten Knochenmarkszellen in konditioniertem WEHI-Medium, das IL-3 und GM-CSF enthält, wachsen läßt (Lemischka, Cell (1986) 45: 917). Das künstliche Stroma, gezüchtet mit einer retroviralen Verpackungszellinie, die einen interessierenden retroviralen Vektor sezerniert, kann dazu verwendet werden, um Gene effizient in humane Stammzellen einzuschleusen. Beispielsweise könnten humane T-Zellen gegen HIV-Infektionen resistent gemacht werden, indem Stammzellen mit dem retroviralen Vektor, der eine HIV-Antisense-Sequenz unter der Kontrolle einer regulatorischen CDC2-Sequenz enthält (Greaves, Cell, (1989) 56: 979–986), infiziert werden, was eine gewebespezifische Expression in T-Zellen erlauben würde. Von der retroviralen Huckepack-Zellinie würde ein Faktor geliefert, der für die Replikation des Retrovirus essentiell ist; dieser Faktor wäre in der hämatopoetischen Target-Zelle nicht vorhanden. Sobald das Virus in die hämatopoetische Target-Zelle transferiert wird, wäre es nicht mehr zur Replikation in der Lage.
In den 3a und b ist die Radialströmungskammer 100 mit Einlaß 102 und Auslaß 104 und mit Kammer 106 dargestellt, wobei die Pfeile 108 die Strömungsrichtung angeben. Auf einer Stromaschicht 112 in der Kammer werden hämatopoetische Zellen angesät und wachsen gelassen. Die Strömungsgeschwindigkeit bestimmt, welche Zellen adhärieren können, wobei nicht adhärente Zellen 114 durch den Auslaß 104 ausströmen.
In den 4a und 4b wird die Wachstumskammer 120 mit Einlaß 122 und Auslaß 124 gezeigt. In 4b umfaßt Einlaß 122 ein Verteilerstück 128, das einzelne Kammern 126 speist, die Zellen 110 und Stroma 112 für Wachstum und Auftrennung enthalten.
In den 5a und 5b sind Wachstumskammern gezeigt, in denen die Barrieren 134, 136 und 138 schematisch während der Kultivierung entfernt werden: Barriere 134 nach etwa Woche 8–10; Barriere 136 nach etwa Woche 18–20 und Barriere 138 nach etwa Woche 28–32.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung läßt sich ein tieferes Verständnis mit Hilfe bestimmter spezieller Beispiele erreichen, die hier nur zur Veranschaulichung dienen und, soweit es nicht anders angegeben, nicht einschränkend sein sollen.
Beispielhafte Zelltrennung und Färbeverfahren
Auftrennung der Knochenmarkszellen auf Ficoll:

1. Verdünnen der Knochenmarksprobe in einem Verhältnis von 1:4 in I-MDM, das bei Raumtemperatur gehalten wird (Iscove's Modified Dulbecco-Medium; Kat.-Nr. 430-2200).
2. Vorsichtiges Schichten von 35 ml der verdünnten Knochenmarksprobe auf 15 ml Ficoll-Paque bei Raumtemperatur (Sp. Gr. 1,077 g/cc; Pharmacia; Kat.-Nr. 17-0840-02) in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen.
3. Zentrifugieren bei 700 × g (1800 rpm auf Beckmann) für 30 min bei Raumtemperatur (20°C).
4. Entfernen des größten Teils der oberen Schicht nach Zentrifugation (wobei noch etwa 5 ml über der Interphase zurückbleiben), Auffangen der Interphasenschicht (Knochenmarkszellen) und dreimaliges Waschen in eiskaltem I-MDM wie folgt:

Erstes Waschen: 1400 rpm/15 min/4°C:

Zweites Waschen: 1200 rpm/10 min/4°C.

Drittes Waschen: 1200 rpm/10 min/4°C.
5. Nach dem dritten Waschen werden die Zellen entweder in Medium oder einer „Balanced Salt"-Lösung etc suspendiert (abhängig davon, was mit ihnen gemacht werden soll) und nach Herstellung einer 1:10-Verdünnung der Zellen in Essigsäure ausgezählt (10 μl Zellsuspension = 90 μl 2%ige Essigsäure in PBS; dies ermöglicht es nur WBCs auszuzählen, da RBCs in Essigsäure lysiert werden).
6. Die Zellen werden dann in geeignetem Medium in der gewünschten Endkonzentration suspendiert (was die Medien betrifft, so wird auf die verschiedenen Anwendungen verwiesen).

Fluoreszenzfärbung für MY-10 positive Knochenmarkszellen:
Reagentien
Standardpuffer:

Pulverförmiger Bacto Dried DIFCO-Puffer (Baxter; Kat.-Nr. 2314-15GB): 200 g
10% NaN₃ (Natriumazid) 20 g
Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (56°C, 30 min) 200 ml
Volumen mit dd-H₂O auf 20 Liter auffüllen; pH 7,15–7,25; Aufbewahren bei 4°C 1 Monat haltbar

2%ige Paraformaldehydlösung

Paraformaldehyd 10 g
dd-H₂O 500 ml
10 N NaOH (unterm Abzug) 8–20 Tropfen
Pulverförmiger Bacto Dried Difco-Puffer 5 g
dd-H₂O in 500 ml-Kolben geben und auf einer Heizplatte unterm Abzug bei 60°C rühren.
Zugeben von 10 g Paraformaldehyd
Zutropfen von NaOH, bis die Lösung klar wird
Zugeben von 5 g DIFCO
Abkühlen lassen, pH mit 2 N HCl auf 7,35–7,45 einstellen.

1. Nach Auszählen werden die Zellen einmal in Standardpuffer gewaschen (100 rpm, 5 min, 4°C).
2. Die Zellen werden anschließend in einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml in Standardpuffer suspendiert.
3. Zwei 50 μl-Aliquote der Zellen werden in 2 15 ml-Zentrifugenröhrchen sedimentiert
4. Zu einem Röhrchen werden 50 μl einer 1:5-Verdünnung von Anti-HPCA-1 gegeben (anti-Human Progenitor Cell Antigen; Becton Dickonson; Kat.-Nr. 7660; in Standardpuffer 1:5 vedünnt). Zum anderen Röhrchen werden 50 μl einer 1:5-Verdünnung von Mlg gegeben (Maus-IgG1-Kontrolle; Becton Dickinson; Kat.-Nr. 9040; in Standardpuffer 1:5 verdünnt).
5. Beide Röhrchen werden dann ½ Stunde lang auf Eis inkubiert.
6. Nach der Inkubation werden die Zellen zweimal in 5 ml Standardpuffer gewaschen (1000 rpm, 5 min, 4°C).
7. Nach dem zweiten Waschen werden die Zellpellets in 50 μl einer 1:40-Verdünnung von GAM-FITC resuspendiert (Affinitätsisoliertes Ziege-F(ab')2-anti-Maus-IgG und -IgM, an human-Ig adsorbiert, Fluorescein-konjugiert; TAGO; Kat.-Nr. 4353; in Standardpuffer 1:40 verdünnt).
8. Die Zellen werden ½ Stunde lang im Dunkeln auf Eis inkubiert.
9. Nach der Inkubation werden die Zellen zweimal in 5 ml Standardpuffer gewaschen (100 rpm, 5 min, 4°C) und jedes Pellet wird in 100 μl Standardpuffer plus 100 μl 2%iger Paraformaldehydlösung resuspendiert.
10. Die Zellen werden dann mit einem Durchflußzytometer auf Fluoreszenz getestet. % positive Fluoreszenz stellt % Fluoreszenz in der anti-HPCA-1-Probe minus % Fluoreszenz in der MIg-Probe dar.

Fluoreszenzfärbung der Knochenmarkszellen zum Aussortieren reifer Progenitorzellen:
Zielsetzungen:
Der Zweck dieser Färbung besteht darin, hämatopoetische Stammzellen (die primitivsten Stammzellen) anzureichern, indem man mit Hilfe des Durchflußzytometers oder magnetischer Kügelchen reife Zellpopulationen entfernt. Es ist immer eine gute Idee, zum Färben auf MY-10-positive Zellen etwas Zellen als Gesamt-Knochenmarkszellen zurückzubehalten (nach Ficoll-Trennung), um mit dem Ergebnis der Sortierung zu vergleichen und den Anreicherungsgrad zu bestimmen.

1. Die Zellen werden wie oben beschrieben auf Ficoll-Paque aufgetrennt. (Entfernen von 0,5 × 10⁶ Zellen und Aufteilen in 2 Portionen zum Anfärben mit anti-HPCA-1/GAM-FITC und MIg/GAM-FITC).
2. Nach dem dritten Waschen wird das Zellpellet in dem Cocktail monoklonaler Antikörper suspendiert (siehe den Abschnitt, der die Herstellung des Cocktails beschreibt), wobei 1 ml Cocktail pro 10⁷ Zellen verwendet wird, und die Zellen werden 1 Stunde lang auf Eis inkubiert.
3. Die Zellen werden anschließend dreimal in eiskaltem I-MDM im Überschuß gewaschen (1000 rpm, 5 min, 4°C).
4. Nach dem dritten Waschen werden die Zellen in einer 1:40-Verdünnung von GAM-FITC (verdünnt in I-MDM, kein Standardpuffer) im Verhältnis von 50 μl pro 0,25 × 10⁶ Zellen suspendiert und auf Eis im Dunkeln ½ Stunde inkubiert.
5. Nach der Inkubation werden die Zellen dreimal in eiskaltem I-MDM gewaschen und nach dem letzten Waschen werden sie in 2–4 ml eiskaltem I-MDM suspendiert und bis zur Sortierung auf Eis gehalten.
6. Die Zellen werden dann auf Basis der Fluoreszenz auf dem Durchflußzytometer sortiert, um die oberen 85% des Fluoreszenzhistogramms auszuschließen. Zur besseren Anreicherung sollte die Sortierung zweimal wiederholt werden.
7. Nach der Sortierung werden die Zellen ausgezählt, gewaschen und ein Aliquot wird auf MY-10-positive Zellen gefärbt (wie oben beschrieben), um den Anreicherungsgrad im Vergleich zu angefärbten Aliquoten von Gesamt-Knochenmarkszellen zu bestimmen.

Selektion auf unreife Zellen mit magnetischen Antikörpern:

1. Befolgen der Schritte 1–3 für das Verfahren zur Fluoreszenzfärbung von Knochenmarkszellen zum Aussortieren reifer Zellen. Anmerkung: Natriumazid ist in keinem der Puffer enthalten.
2. In der Zwischenzeit dreimaliges Waschen einer geeigneten Menge an magnetischem Ziege-anti-Maus-Ig (Biomag; Collaborative Research; Kat.-Nr. 74340-50; 1 mg/ml; 5 × 10⁸ Partikel/ml) in eiskaltem I-MDM bei 1500 rpm, 5 min, 4°C (um das als Konservierungsmittel verwendete Natriumazid auszuwaschen).
3. Resuspendieren des Zellpellets, das nach dem dritten Waschen in "Schritt 1" erhalten wurde, in Biomag im Verhältnis von 50 Partikel Biomag/Zelle (z.B. für 1 × 10⁶ Zellen 5 × 10⁷ Partikel verwenden, also 0,1 ml Biomag).
4. Sedimentieren der Zellen in einer T-25- oder T-75-Gewebekulturflasche (abhängig von den Zellzahlen) und ½ Stunde Inkubieren auf Eis unter zwischenzeitlichem Schütteln.
5. Flasche nach Inkubation auf den Flachmagnet (mit dem Biomag geliefert) legen, mit einem Gummiband oder Klebefilm sichern und bei 4°C für 10–15 min inkubieren.
6. Magneten und Flasche aufrecht stellen und den Überstand sammeln.
7. Zweimaliges Wiederholen der Schritte 4–6.
8. Auszählen der Zellen, einmaliges Waschen in eiskaltem I-MDM, Entnehmen eines Aliquots zum Färben auf MY-10-positiv und Resuspendieren in geeignetem Medium zur weiteren Verwendung.

1. Medienaustausch
Material und Methoden:
Zellen: Humane Knochenmarkszellen wurden aus heparinisierten Aspiraten aus dem Beckenkamm aufgeklärter und zustimmender Individuen erhalten. Das Knochenmark wurde durch eine Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation (Phamacia, Nr. 17-0840-02) aufgetrennt und die Zellen mit geringerer Dichte (< 1,077 gm/cm³) wurden gesammelt und 3mal mit Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM) gewaschen. Die Zellen wurden zwischen dem zweiten und dritten Waschen ausgezählt. Die Zellen wurden dann auf 24-Loch-Gewebekulturplatten (Costar Nr. 3524) zweifach oder dreifach mit 1, 2 und 5 × 10⁶ Zellen/ml mit 322 μl/Vertiefung angesät.
Langzeitkulturbedingungen: Die Zellen mit geringerer Dichte wurden in IMDM, das mit 10% fötalem Kälberserum (Hyclone Laboratories), 10% Pferdeserum (Hyclone Laboratories), 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma, 10.000 U/ml Penicillin G und 10 mg/ml Streptomycin, Kat-Nr. P3539) und 10^–5 M Hydrocortison (17-Hydroxycorticosteron, Sigma, Kat-Nr. H0888) supplementiert war, in einer befeuchteten 5% CO₂/95% Luft-Atmosphäre inkubiert. Die Kulturen wurden nach einem von drei Programmen für den Medienaustausch behandelt, nämlich täglicher 100%iger Medienaustausch (7/Woche), 50%iger täglicher Medienaustausch (3,5/Woche) oder zweimal wöchentlicher 50%iger Medienaustausch (1/Woche). Zweimal pro Woche wurden während des Medienaustauschs 50% der nichtadhärenten Zellen aus jeder Kulturvertiefung entfernt und mit einem Hämozytometer ausgezählt.
Wenn die Zellen zum Auszählen (zweimal/Woche) entnommen wurden, wurde das gesamte Medium, das während dem Füttern der 3,5/Woche- und 1/Woche-Kulturen entfernt worden war, für Zellzählungen aufbewahrt und wieder frisches Medium in die Vertiefungen gegeben. Die 7/Woche-Kulturen machten die Aufbewahrung der Hälfte des entfernten Mediums für Zellzählungen erforderlich, während die nichtadhärenten Zellen in der restlichen Hälfte des entfernten Mediums abzentrifugiert und zurückgeführt wurden. Anschließend wurde in jede Vertiefung frisches Medium gegeben, um das für die Zellzählungen entfernte Medium zu ersetzen. An Tagen, an denen keine Zellen zum Auszählen entnommen wurden, wurden 100% oder 50% des Mediums aus jeder Vertiefung der 7/Woche- bzw. 3,5/Woche-Kultur entfernt, die Zellen wurden abzentrifugiert und mit zusätzlichem frischen Medium in die ursprünglichen Vertiefungen zurückgegeben.
Methylcellulose und morphologische Tests: Einmal alle zwei Wochen wurden die nicht adhärenten Zellen, die für die Zellzählungen entnommen worden waren, in Gegenwart von Erythropoetin, GM-CSF und IL-3 auf Methylcellulose ausplattiert und die Granulocyten-Macrophagen-Kolonien-bildenden Einheiten (CFU-GM) wurden ausgezählt. Aliquote der entnomenen Zellen wurden cytozentrifugiert, mit Wright-Giemsa gefärbt und es wurde eine Differentialzellzählung durchgeführt.
Statistische Untersuchungen: Die Ergebnisse der zweimal wöchentlichen Zellproduktion sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SEM) von wiederholten Kulturen ausgedrückt. Die Wahrscheinlichkeit signifikanter Unterschiede zwischen Gruppen von Kulturen wurde durch Vergleich der normierten Werte für die kumulative Zellproduktion aus den rasch ausgetauschten Kulturen (7/Woche und 3,5/Woche) mit den zugeordneten Kontrollkulturen (1/Woche) mit Hilfe eines paarweisen t-Tests bestimmt. Statistische Signifikanz wurde bei einem Niveau von 5% angenommen.
Ergebnisse:
Kinetik der Produktion nichtadhärenter Zellen: Die Produktion nichtadhärenter Zellen wurde sowohl als Funktion der Zelldichte des Inokulums (über den Bereich von 1–5 × 10⁶ Zellen/ml) und der Austauschrate des Mediums untersucht. Die Austauschrate des Mediums wurde zwischen einem einmaligen Volumenaustausch des Mediums pro Woche, der traditionellen Dexter-Kultivierungsrate, und einem siebenmaligen Volumenaustausch des Mediums pro Woche variiert. Die zweimal wöchentlich gesammelte Zahl an Zellen wurde normiert, indem durch die Zahl der Zellen, die pro Kultur inokuliert wurden, geteilt wurde.
Bei keiner Austauschrate des Mediums änderten sich die normierten Kurven für die Zellsammlung signifikant mit der Inokulumdichte. Die Zellproduktion für die Kulturen, die bei den drei Mediumperfusionsraten von 7/Woche, 3,5/Woche und 1/Woche gehalten wurden, waren ähnlich, wenn man auf die Anzahl an Zellen, die pro Kultur inokuliert worden war, normierte. Ein Vergleich der letztendlichen kumulativen Zellproduktion zwischen den Inokulumdichten zeigte keine signifikanten Unterschiede bei irgendeiner der drei Austauschraten für das Medium (p > 0,20 nach einem paarweisen t-Test für alle Probenpaare).
Die Austauschrate des Mediums beeinflusste im Gegensatz dazu stark die Rate und Langlebigkeit der Zellproduktion in diesen Kulturen. Die Zellproduktion der Kulturen, die 1/Woche (Kontrolle), 3,5/Woche und 7/Woche ausgetauscht wurden, nahm bei allen über die ersten Wochen ab. Unterschiede in der Produktivität der Kulturen wurden jedoch nach Woche 3 in Kultur sichtbar. Zwischen den Wochen 3 bis 10 war die Zellproduktion in den 7/Woche-Kulturen konstant, bei den 1/Woche-Kulturen auf einem geringeren Niveau konstant, nahm aber bei den 3,5/Woche-Kulturen exponentiell zu. Nach den Wochen 10–12 nahm die Zellproduktion in allen Kulturen bis zur Beendigung der Kultur ab.
Die Ergebnisse für die 1/Woche ausgetauschten Kulturen sind zu denen äquivalent, die üblicherweise bei traditionellen humanen Dexter-Kulturen bei einer Vielzahl von Systemen beobachtet werden, wogegen die rasch ausgetauschten 3,5 und 7/Woche-Kulturen eine erhöhte Zellproduktivität im Vergleich zu früheren optimalen Kultivierungsverfahren zeigten. Kulturen, bei denen täglich ½ des Mediums ausgetauscht wurde (3,5/Woche) behielten wesentlich länger eine erhöhte Zellproduktion bei als entweder die Kontrolle (1/Woche) oder Kulturen mit vollständigem täglichen Austausch (7/Woche). Zwischen Woche 3 und 9 nahm die Anzahl nichtadhärenter Zellen, die aus den 3,5/Woche ausgetauschten Kulturen gesammelt wurde, exponentiell zu, mit einer Verdoppelung alle 2,1 Tage.
Die Zellproduktion unter den 3,5/Woche- und 1/Woche-Protokollen kann direkt verglichen werden, indem man die Zellproduktion unter der 3,5/Woche-Austauschrate als Prozentsatz der Produktion der Kulturen mit einer Austauschrate von 1/Woche vergleicht. Dieser Vergleich zeigt, dass die Zellproduktion während der anfänglichen Abnahmephase unter den beiden Protokollen ähnlich ist. Die Zellproduktion unter der 3,5/Woche-Austauschrate ist jedoch zwischen den Wochen 3,5 und 18 durchweg höher.
Das Proliferationspotential der Kulturen kann daher über ihre Fähigkeit gemessen werden, im Anschluß an die anfängliche Abnahme Zellen zu produzieren. Die normierte kumulative Zellproduktion nach Woche 3 (Σⁿ _i=7, C_i/C_o) war für die Medienaustauschraten 7/Woche, 3,5/Woche unabhängig von der Zelldichte der Inokulation. Die Daten für die Zellproduktion von den Kulturen bei ähnlichen Medienaustauschraten waren qualitativ und statistisch ähnlich und wurden daher dichtegemittelt und zum Erhalt einer größeren statistischen Probe kombiniert (unteres Feld). Die dichtgemittelte kumulative Zellproduktion zwischen den Wochen 3,5 und 20 war: 0,22 für die 7/Woche-Kulturen; 0,40 für die 3,5/Woche-Kulturen; und 0,15 für die 1/Woche-Kulturen. Die Zunahme der Medienaustauschrate von 1/Woche auf 7/Woche erhöhte daher die Zellproduktion um etwa 60% gegenüber dem typischen Programm für den Medienaustausch bei einer Dexter-Kultur. Die 3,5/Woche-Austauschrate führte zu einer fast 3-fachen Zunahme der kumulativen Zellproduktion verglichen mit dem 1/Woche-Dexter-Protokoll. Eine statistische Analyse dieser Daten mit einem paarweisen t-Test zeigte beim Signifikanzniveau von 5% signifikante Unterschiede sowohl zwischen 7/Woche und 1/Woche als auch 3,5/Woche und 1/Woche. Die Medienaustauschrate von 3,5/Woche verbessert daher die Rate der Zellproduktion gegenüber dem traditionellen Dexter-Protokoll von 1/Woche.
Produktion von Granulozyten-Makrophagen-Progenitorzellen:
Tests von Granulozyten-Makrophagen-Progenitorzellen wurden mit Wiederholungsversuchen eines gegebenen Medienperfusionsprogramms und einer gegebenen Inokulumdichte durchgeführt (Tabelle 2). Die Perfusionsrate des Mediums zeigte eine ausgeprägte Wirkung auf die Anzahl der produzierten Granulozyten-Makrophagen-Progenitorzellen. Die Kulturen mit einem Medienaustausch von 3,5/Woche zeigten die größte Langlebigkeit hinsichtlich der Progenitorzellproduktion. Diese Kulturen produzierten Progenitorzellen mit einer stabilen Rate zwischen den Wochen 4 und 18.
Die besten Bedingungen hinsichtlich der Progenitorzellproduktion haben die 3,5-mal pro Woche ausgetauschten und mit 5 × 10⁶ Zellen/ml inokulierten Kulturen. Diese Kulturen produzierten bis Woche 20 eine signifikante Anzahl an Progenitorzellen. Eine statistische Analyse mit Hilfe eines paarweisen t-Tests zeigte, dass die Kulturen mit einer optimalen Medienaustauschrate von 3,5/Woche deutlich mehr Granulozyten-Makrophagen-Progenitorzellen nach Woche 8 produzierten als die entsprechenden 7/Woche- und 1/Woche-Kulturen, und zwar bei allen drei Inokulierungsdichten bei einem Signifikanzniveau von 1%. Die Anzahl produzierter Progenitorzellen ist wichtig, da sie ein indirektes Maß für die Erneuerung der Stammzellen darstellt. Progenitorzellen können nach mehreren Wochen nur bei Differenzierung aus einer früheren Zelle, vermutlich einer Stammzelle, die noch in der Kultur vorhanden ist, in Kultur vorliegen. Daher lassen diese Daten vermuten, dass physiologischere, raschere Austauschraten für das Medium/Serum und höhere Zelldichten für Bedingungen gesorgt haben, die in gewissem Maße eine Stammzellerneuerung über fünf Monate unterstützt haben.
Morphologie nichtadhärenter Zellen: Um zu bestimmen, ob sich die lang anhaltende Hämatopoese, die von den 3,5/Woche-Kulturen unterstützt wird, qualitativ von den anderen Kulturen unterschied, wurden die nichtadhärenten, zwischen den Wochen 10 und 19 gesammelten Zellen angefärbt und morphologisch typisiert. Bei den Austauschraten von 1/Woche und 7/Woche waren die produzierten Zellen bei Woche 15 und danach größtenteils Makrophagen (Tabelle 3), was den Ergebnissen aus Untersuchungen in anderen Laboratorien ähnelt. Im Gegensatz dazu produzierten die Kulturen, die mit einer Rate von 3,5 Volumeneinheiten Medium pro Woche perfundiert wurden und die mit 5 × 10⁶ Zellen/ml angesät worden waren, bis Woche 19 hindurch Granulozyten sowie Makrophagen. Es scheint daher, dass diese Medienaustauschrate und diese Inokulumdichte die Granulopoese in vitro effektiver rekonstituierte.
Tabelle 2: Durchschnittliche Zahl nichtadhärenter Progenitorzellen, die Langzeit-Knochenmarkskulturen (LTBMCs) entnommen wurden, als Funktion der Perfusionsrate des Mediums und der Inokulumdichte.
Replikatproben wurden bei jeder Perfusionsrate des Mediums und Ansähdichte gesammelt und jeweils als ein Mittelwert ± SEM tabelliert. Die kumulative CFU-GM-Produktion nach der Woche 8 ist bei allen Ansähdichten auf dem 1%-Signifikanzniveau statistisch gesehen höher bei den 3,5/Woche-Kulturen als bei den entsprechenden Kulturen, die eine Perfusion mit 7/Woche oder 1/Woche durchlaufen haben.
Dieses Ergebnis stützt die Hypothese, dass die Bedingungen für eine humane Dexter-Langzeitkultur suboptimal sind und dass eine effektivere ex vivo-Knochenmarksrekonstitution erreicht werden kann, wenn sich eine in vitro-Kutlur dem hämatopoetischen Milieu mehr annähert.
Physische Erscheinung: Die Medienaustauschrate beeinflußte die physische Erscheinung der Kulturen signifikant. Nach 10 Wochen in Kultur zeigten die 7/Woche-Kulturen eine große Anzahl an Fettzellen im Stroma, während die 3,5/Woche-Kulturen weniger Fettzellen aufwiesen und die 1/Woche-Kulturen nie Fettzellen entwickelten. Bei Beendigung der Kultur nach 26 Wochen bestand das Stroma der 7/Woche-Kulturen aus etwa 20–30% Fettzellen, während die 3,5/Woche-Kulturen immer noch nur ein paar Fettzellen aufwiesen. Die Verteilung adhärenter Kolonien variierte auch zwischen Kulturen mit unterschiedlichen Medienperfusionsraten. Adhärente Kolonien in den 3,5/Woche-Kulturen persistierten länger als jene in den 7/Woche- und 1/Woche-Kulturen.
Tabelle 3: Morphologie nichtadhärenter Zellen als Funktion der Perfusionrate des Mediums und der Inokulumdichte.
Die Daten entstammen den gesammelten Replikatproben mit jeder Perfusionsrate des Mediums und Ansähdichte und sind als Prozentsatz an Makrophagen (%M_⌀), Granulozyten (reife Granulozyten und Banden, %G) und unreife Granulozyten (Metamyelozyten und weniger reife Zellen, %myeloide Vorläufer) angegeben.
II. Medienaustausch in Kombination mit Supplementierung des Mediums mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren
Material und Methoden:
Zellen: Humane Knochenmarkszellen wurden nach „informed consent" aus heparinisierten Aspiraten des Beckenkammknochenmarks nach einem Protokoll des Universität of Michigan Human Investigation Committee erhalten. Das Knochenmark wurde durch eine Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation (Pharmacia) aufgetrennt und die Zellen mit geringerer Dichte (< 1,077 g/cm³) wurden gesammelt und 3mal mit IMDM gewaschen. Die Zellen wurden zwischen dem zweiten und dritten Waschen ausgezählt. Die Zellen wurden dann auf 6-Loch-Gewebekulturplatten (Costar-Nr. 3406) oder collagenbeschichteten 6-Loch-Platten (Rattenschwanz-Collagen Typ 1, Biocoat. Collaborative Research Inc. Kat.-Nr. 40400) in zweifach mit 5 × 10⁶ Zellen/ml bei 1,5 ml/Vertiefung angesät.
Kulturmedium: Das verwendete Medium war IMDM (Gibco Laboratories. Kat.-Nr. 430-2200), das 10% fötales Kälberserum (Hyclone Laboratories), 10% Pferdeserum (Hyclone Laboratories), 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma, 10.000 U/ml Penicillin G und 10 mg/ml Streptomycin, Kat.-Nr. P3539) und 10^–5 M Hydrocortison (17-Hydroxycorticosteron, Sigma, Kat.-Nr. H0888) enthielt.
Hämatopoetische Wachstumsfaktoren (HGH): Als Folge der häufigen Supplementierung der Kultur über einen raschen Medienaustausch wurden hämatopoetische Wachstumsfaktoren dem Medium in etwa 1/20 der Konzentrationen zugegeben, von denen gefunden wurde, dass sie eine maximale Koloniebildung in Klontests fördern. Die verwendeten Konzentrationen betrugen 1 ng/ml IL-3, 1 ng/ml GM-CSF (Amgen Biologicals, Kat.-Nr. 13050), 0,1 U/ml Epo (Terry Fox Labs. Vancouver, Kanada).
Test hämatopoetischer Progenitorzellen: Nichtadhärente hämatopoetische Zellen, die der Kultur entnommen wurden, wurden ausgezählt und mit 1 × 10⁵ Zellen/ml oder weniger Zellen in Methylcellulose ausplattiert. GM-CSF und Epo wurden der Methylcellulose mit 20 ng/ml bzw. 2 U/ml zugegeben. Die Zellen wurden in 24-Loch-Platten mit 0,25 ml/Vertiefung ausplattiert und bei 37°C 14 Tage lang inkubiert. Die Kolonien wurden dann unter einem Umkehrmikroskop ausgezählt und Kolonien mit mehr als 50 Zellen wurden als GM-Kolonien-bildende Einheiten (CFU-GM), Erythroid-Burst-Foming-Units (BFU-E) oder Granulocyte-Erythroid-Megakaryocyte-Makrophage-Colony Forming Unit (CFU-GEMM) gezählt.
LTBMC-Bedingungen: Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂/95% Luft-Atmosphäre inkubiert und die Perfusion (Mediumaustausch) fand mit einer Rate von 50% täglichem Medienaustausch statt. Während der ersten Woche in Kultur wurden alle während des täglichen Mediumaustauschs entfernten Zellen abzentrifugiert und in die ursprünglichen Vertiefungen zurückgegeben. Nach der ersten Woche in Kultur wurden 50% der gesamten nichtadhärenter Zellen auf zweimal wöchentlicher Basis während des Medienaustausch aus den Kulturen entfernt, mononukleäre Zellen ausgezählt und wieder frisches Medium in die Vertiefungen gegeben. Die restlichen fünf Tage pro Woche, wenn die Zellen nicht ausgezählt wurden, wurde 50% des Mediums aus jeder Kultivierungsvertiefung entfernt und durch frisches Medium ersetzt, das entfernte Medium wurde zentrifugiert, das Medium vom Zellpellet dekantiert und die Zellen in ihre ursprünglichen Vertiefungen zurückgegeben.
Statistische Analyse: Die Wahrscheinlichkeit signifikanter Unterschiede zwischen Gruppen von Kulturen wurde durch Vergleich der normierten Werte für die kumulative Zellproduktion aus den rasch perfundierten, mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren supplementierten Kulturen mit den zugeordneten unbehandelten Kontrollkulturen mit Hilfe eines paarweisen t-Tests bestimmt. Statistische Signifikanz wurde bei einem Niveau von 5% angenommen. Es gab keine statistischen Unterschiede zwischen den rasch perfundierten zugeordneten LTMBCs, die auf Gewebekulturplastik kultiviert wurden, und dem Rattenschwanz-Collagen Typ 1 bei einem 5%-Niveau. Daher wurden die Daten zur Darstellung in dieser und allen anderen Figuren für das Plastik und die Collagenmatrix kombiniert und die statistische Analyse anhand der kombinierten Daten ausgeführt.
Ergebnisse:
Kinetik der Zellproduktion in rasch ausgetauschten mit Wachstumsfaktoren supplementierten LTBMCs: Als ersten Test der Hypothese, dass die Langlebigkeit und Produktivität von Langzeit-Knochenmarkskulturen (LTBMCs) durch ungenügende Produktion von HGFs limitiert werden, hielten wir rasch ausgetauschte ex vivo-Knochenmarkskulturen, die mit IL-3 oder Epo supplementiert waren. In diesen Kulturen wurden 50% des Mediums täglich entfernt durch ein gleiches Volumen an frischem Medium, das mit IL-3 oder Epo supplementiert war, ersetzt. Die entfernten Zellen wurden anschließend abzentrifugiert, das Medium dekantiert und verworfen, die Zellen resuspendiert und die Zellen in die ursprünglichen Kulturen zurückgegeben. IL-3 und Epo verstärkten einzeln die Zellproduktivität der rasch ausgetauschten LTBMCs. Die Kulturen, die nur Epo enthielten, hatten anfangs wegen deutlicher terminaler erythroider Differenzierung eine hohe Zellproduktionsrate. In Woche vier war die Erythropoese jedoch beendet und die Zellproduktionsrate war auf das Niveau der Kontrollkulturen abgefallen. IL-3 und Epo induzierten über die 18 Wochen der Kultivierung einen durchschnittlichen Anstieg der nichtadhärenten Zellproduktion gegenüber den Kontrollen von 175% bzw. 173%.
Es hat sich erwiesen, dass Kombinationen der Wachstumsfaktoren zur Steigerung der nichtadhärenten Zellproduktionsrate effektiver sind. Die höchste Rate der Zellproduktion wurde für die Kombination aus IL-3 + GM-CSF + Epo beobachtet. Diese Kulturen produzierten etwa 25% der Anzahl der zweimal wöchentlich inokulierten Zellen während der ersten 6 Wochen Kultur und zeigten einen durchschnittlich 4,8-fachen Anstieg bei der Produktion nichtadhärenter Zellen gegenüber den Kontrollen während der Wochen 2–8. Die Kombination aus IL-3 + GM-CSF produzierte einen durchschnittlich 3,5-fachen Anstieg bei den nichtadhärenten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen bis einschließlich Woche 8. In getrennten Experimenten verbesserte weder die Zugabe von IL-6 noch von G-CSF zu der Kombination aus IL-3 + GM-CSF + Epo die Produktionsrate nichtadhärenter Zellen, sondern führte stattdessen zu Zellproduktionsraten, die nicht von den Kulturen unterscheidbar waren, welche die Kombination aus IL-3 + GM-CSF enthielten. In allen Fällen war die stimulierende Wirkung auf die Zellproduktion, die durch die Zugabe von HGFs induziert wurde, zwischen Woche 0 und 8 maximal, obwohl die Produktion während der gesamten Kultur höher war als bei den Kontrollen.
Die Kombinationen aus HGFs führte zu hohen absoluten Zahlen nichtadhärenter Zellen, die in rasch ausgetauschten LTBMCs produziert wurden. Die Produktivität der Kulturen kann durch Vergleich der mit der Zeit produzierten kumulativen Anzahl von Zellen (Σⁿ _i=1, C_i, wobei C_i die Anzahl nichtadhärenter Zellen ist, die zum Zeitpunkt i gesammelt wurden) mit der Anzahl inokulierter Zellen (C_o) durch Auftragen des Verhältnisses (Σⁿ _i=1, C_i, C_o) als Funktion der Zeit gezeigt werden. Wenn dieses Verhältnis größer als Eins ist, hat eine Kultur mehr Zellen produziert als angesät wurden und die Kultur hat zu einer Expansion der Anzahl an Zellen geführt.
Die Kombination aus IL-3 + GM-CSF + Epo induzierte eine kumulative Zellproduktion, die mehr als 3mal höher als die Anzahl an angesäten Zellen war. Die Zellproduktionsrate war während der ersten 6 Wochen Kultur am höchsten, währenddessen die Kulturen etwa genauso viele Zellen produzierten wie alle zwei Wochen angesät wurden. Diese maximale Zellproduktionsrate betrug 15% der geschätzten in vivo-Produktionsrate der Knochenmarkszellen, bei der täglich 50% der myeloiden Zellmasse erzeugt werden. Die Kombination aus IL-3 + GM-CSF führte zu einer mehr als 2-fachen Expansion der Zellzahl und bei Raten, die mit denen der Kombination aus IL-3 + GM-CSF + Epo während der Kultivierungswochen 3–7 vergleichbar waren. Unbehandelte, rasch ausgetauschte (50% täglicher Medienaustausch) und langsam ausgetauschte (50% Mediumaustausch zweimal wöchentlich) Kontrollkulturen, die nicht mit HGFs supplementiert waren, produzierten nach 18 Wochen etwa 1- bzw. 0,37-mal soviele Zellen, wie angesät waren. Noch wichtiger ist, dass mehr als die Hälfte aller Zellen aus diesen unsupplementierten Kulturen aus den ersten zwei Probenentnahmen stammte, was anzeigt, dass viele dieser Zellen aus dem ursprünglichen Inokulum stammten und dass eine Supplementierung der Kulturen mit HGFs zur Induktion eines signifikanten Cyclings von Progenitor- und Stamzellen erforderlich ist.
Morphologische Analyse nichtadhärenter Zellen: Die Zugabe multipler HGFs erhöhte auch die Vielfalt myeloider Zellen, die in den Kulturen produziert wurde. Die Kontrollkulturen produzierten nichtadhärente Zellen, die nach Woche 3 in der Kultur überwiegend Makrophagen waren. Die Produktion erythroider Zellen nahm schnell ab, wobei nach 5 Wochen wenig erythroide Zellen nachgewiesen wurden. Die Kulturen, die Epo enthielten (Epo allein, Il-3 + Epo und IL-3 + GM-CSF + Epo), lieferten bis einschließlich Woche 3 einen transienten Anstieg der erythroiden Zellproduktion, wobei ein hoher Prozentsatz (55–75%) nichtadhärenter Zellen erythroid waren. Wenn IL-3 + GM-CSF + Epo vorlag, fuhren die Kulturen fort, bis zur Kultivierungswoche 16 erythroide Zellen zu produzieren, wobei etwa 5–15% der nichtadhärenten Zellen als erythroid typisiert wurden. Daher war die Erythropoese in Gegenwart von IL-3 + Epo durchgehend aktiv.
IL-3 ± Epo führte zu einer nichtadhärenten Zellpopulation, die bei Woche 5 überwiegend (60–70%) aus späten Granulozyten (LG) bestand. Der Prozentsatz an LGs nahm stetig ab, bis er in der Woche 18 etwa 20% erreichte. Die Produktion der Makrophagen nahm entsprechend zu. Wenn GM-CSF zu IL-3 ± Epo gegeben wurde, blieb der hohe Prozentsatz an LG 18 Wochen lang bestehen. Die Kombination aus IL-3 + GM-CSF führte daher 18 Wochen lang zu einer aktiven Granulopoese und die Zugabe von Epo hielt die Erythropoese ebenfalls aufrecht. Mikroskopische Aufnahmen der Kontrolle und der mit IL-3 + GM-CSF + Epo supplementierten Kulturen nach 5,5 Wochen in Kultur zeigten die dramatische Zunahme der Kulturdichte und der Vielzahl produzierter Zellen.
Kinetik der Produktion nichtadhärenter Progenitorzellen: Die Progenitorzellproduktion stieg mit Zugabe multipler HGFs an. Die Produktion Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-bildender Einheiten (CFU-GMs) in den unbehandelten Kontrollen hielt über 18 Wochen lang an und war stabil, was mit den früheren Ergebnisse übereinstimmt, die mit rasch perfundierten LTMBC ohne HGF erhalten wurden. CFU-GM, produziert in den Kulturen mit IL-3 + GM-CSF und mit IL-3 + Epo ± GM-CSF, war während der Wochen 3 bis 5 etwa 10mal höher als die Kontrollen.
Es wurde berichtet, dass die Produktion von Erythroid-Burst-Foming-Units (BFU-E) in humaner LTBMC niedrig war und schnell aufhört (Coutinho et al, Blood (1990) 75(11): 2118–2129). Die rasch ausgetauschten, unbehandelten Kontrollen, zeigten einen raschen Abfall der BFU-E-Produktion, wenn auch über 17 Wochen in Kultur geringe Mengen an BFU-E produziert wurden. Die Zugabe von Epo allein beeinflusste die Anzahl an produzierten BFU-Es nicht wesentlicht. IL-3 allein löste eine leichte kurzlebige Anregung der BFU-E-Produktion in den Wochen 3–5 aus. Andererseits induzierte IL-3 plus entweder Epo oder GM-CSF während Woche 3–5 der Kultur eine 10- bis 20-fache Zunahme der Menge nichtadhärenter BFU-Es im Vergleich mit den Kontrollen.
III. Transformation humaner Stammzellen
Material und Methoden:
Zellen: Humane Knochenmarkszellen wurden nach „informed consent" aus heparinisierten Aspiraten des Beckenkammknochenmarks nach einem Protokoll des Universität of Michigan Human Investigation Committee erhalten. Das Knochenmark wurde durch eine Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation (Pharmacia) aufgetrennt und die Zellen mit geringerer Dichte (< 1,077 g/cm³) wurden gesammelt und 3mal mit IMDM gewaschen. Die Zellen wurden zwischen dem zweiten und dritten Waschen ausgezählt. Für die CD18-Gentransferexperimente wurde das Knochmark nach „informed consent" von einem CD18-defizienten Spender erhalten.
Lineage-negative(Lin^–)-Selektion von Knochenmarkszellen
Reife mononukleäre Zellen wurden aus der obigen Zellpräparation durch Inkubation der Zellen mit einer Mischung aus monoklonalen Antikörpern (Mab) nach dem dritten Waschen mit IMDM entfernt. 10⁷ Zellen wurden 1 Stunde in 1 ml Mab-Cocktail unter leichtem Mischen alle 10–15 Minuten auf Eis inkubiert. Der verwendete Mab-Cocktail ist in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4: Präparat monoklonaler Antikörper, das zur Abtrennung mononukleärer Lineage⁺-Knochenmarkszellen verwendet wurde.
Zugabe von IMDM, um für den Mab-Cocktail ein Gesamtvolumen 100 ml herzustellen, Filtersterilisation, Aliquots in 1 ml Säulen und Lagerung bei –20°C.
Die Zellen wurden 3mal mit eiskaltem IMDM im Überschuß gewaschen und bei 4°C abzentrifugiert. Eine geeignete Menge an magnetischem Ziege-anti-Maus-Ig (Biomag; Collaborative Research Corp., Kat.-Nr. 74340-50, 1 mg/ml, 5 × 10⁸ Partikel/ml) wurden 3mal in eiskaltem IMDM gewaschen und zentrifugiert. Die Zellen wurden in Biomag mit 50 Partikeln/Zelle resuspendiert und in eine T-25- oder T-75-Gewebekulturflasche gegeben und auf Eis ½ Stunde mit zwischenzeitlichem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Flasche auf einen Flachmagneten gelegt, der Magnet an der Flasche gesichert und bei 4°C für 10–15 Minuten inkubiert. Der Magnet und die Flasche wurden in aufrechte Position gebracht und der Überstand gesammelt. Die Inkubation unter Abdunkelung, Magnetzugabe, Aufrechtstellen und Sammeln des Überstands wurde noch 2 mal wiederholt. Die Zellen wurden ausgezählt und auf 6-Loch-Gewebekulturplatten (Costar Nr. 3406) angesät.
Kulturmedium: Das verwendete Medium war IMDM (Gibco Laboratories, Kat.-Nr. 430-2200), das 10% fötales Kälberserum (Hyclone Laboratories), 10% Pferdeserum (Hyclone Laboratories), 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma, 10.000 U/ml Penicillin G und 10 mg/ml Streptomycin, Kat.-Nr. P3539) und 10^–5 M Hydrocortison (17-Hydroxycorticosteron, Sigma, Kat.-Nr. H0888) enthielt.
Hämatopoetische Wachstumsfaktoren Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren waren die oben diskutierten optimalen. Die verwendeten Konzentrationen betrugen 1 ng/ml oder 0,4 U/ml IL-3 (ein Geschenk von Genetics Institute, Cambridge, MA), 1 ng/ml GM-CSF (ein Geschenk vom Genetics Institute, Cambridge, MA), 50 U/ml IL-1a (Genzyme Corp.), 0,1 U/ml Epo (Terry Fox Labs, Vancouver, Kanada), 10 ng/ml MGF (Mastzellenwachstumsfaktor, der c-kit-Ligand, Immunex Corp., Seattle, WA) und 2,0 ng/ml Hybrikine ([PIXY321] Immunex Corp., Seattle, WA).
Test hämatopoetischer Progenitorzellen: Nichtadhärente hämatopoetische Zellen, die während der wöchentlichen Probenentnahme aus der Kultur entfernt wurden, wurden ausgezählt und mit 1–10⁵ Zellen/ml oder weniger Zellen in Methylcellulose ausplattiert. MGF, GM-CSF und Epo wurden mit 50 ng/ml, 20 ng/ml bzw. 2 U/ml zu der Methylcellulose gegeben. Die Zellen wurden in 24-Loch-Platten mit 0,25 ml/Vertiefung ausplattiert und bei 37°C 14 Tage lang inkubiert. Die Kolonien wurden anschließend unter einem Umkehrmikroskop ausgezählt und Kolonien mit mehr als 50 Zellen wurden als GM-Kolonien-bildende Einheiten (CFU-GM), Erythroid-Burst-Foming-Units (BFU-E) oder Granulocyte-Erythroid-Megakaryocyte-Makrophage-Colony Forming Units (CFU-GEMM) gezählt.
Retroviren produzierende Zellinien: Zwei Retroviren produzierende Zellinien wurden von Dr. Eli Gilboas Labor am Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, erhalten. Die Zellinie produzierte amphotrophe virale Partikel, die das NEO-Gen enthielten, das eine Neomycin-Phosphotransferase produziert, welche eine Resistenz gegen das Neomycin-Analoge G418 von Säugern vermittelt. Beide Zellinien produzieren auch retrovirale Partikel, denen die erforderlichen retroviralen Genen fehlen, so dass die mit dem Retrovirus infizierten Zellen nicht selbst infektiöse Partikel produzieren können.
Die SAX-enthaltende Verpackungszellinie ist eine auf 3T3 basierende Zellinie, die einen modifizierten Moloney Murine Leukemia-Virus (MoMuLV) enthält. Das SAX-Provirus enthält das NEO-Gen, ein Adenosindeaminasegen mit SV40-Promotor, in einer XhoI-Restriktionsschnittstelle. Das SAX-Provirus enthält auch die ψ-Verpackungsregion, es fehlen ihm aber die gag-(Kernproteine), pol-(Reverse Transkriptase) und env(Hüllproteine)-Gene. Dieses zweite retrovirale Partikel enthält eine doppelte Kopie der fremden DNA und die retroviralen Partikel werden als DC-29 (double copy – 29. Klon) bezeichnet. Das DC-29-Provirus enthält zwei Kopien des NEO-Gens und andere retrovirale und fremde DNA in einer 3T3-Zellinie.
Für die CD18-Experimente wurde die amphotrope Verpackungszellinie Psi-Crip, die mit einem retroviralen Vektor, der eine humane CD19-DNA voller Länge enthielt, infiziert war, verwendet (Wilson et al, Science (1990) 248: 1413–1416). Bei diesem Retrovirus wurde eine vollständige cDNA für das humane CD18 in die BamHI-Schnittstelle eines Vektors kloniert, der das rekombinante Gen von heterologen Sequenzen exprimiert, die die 5'-Region des Hühner-β-Actingens, BA-CD18 genannt, umfassen. Die Sequenzen 5' zum unmittelbar frühen (IE)-Gen des humanen Cytomegalovirus wurden in PUC19 subkloniert und ein Teil, der die IE-Enhancersequenzen enthielt, wurde auf einem Fragment von Xho I (vom Polylinker) bis NcoI (–220 des IE-Gens) entfernt. Es wurden synthetische Linker verwendet, um die NcoI-Schnittstelle in eine XhoI-Schnittstelle umzuwandeln und das modifizierte Fragment wurde in die singuläre XhoI-Schnittstelle von BA-CD18, die 5' zum β-Actinpromotor positioniert ist, kloniert. Dieser neue Vektor wurde CMV-BA-CD18 genannt.
Produktion Retroviraler Partikel: Die retroviralen SAX-Partikel wurden von Dr. Clay Smith in Dr. Eli Gilboas Laboratorium als Virusüberstandslösungen, die eingefroren und bei –80°C gelagert wurden, zur Verfügung gestellt. Die DC-29 und CD18 retroviralen Partikel wurden durch Züchten der viralen Verpackungszellinien DC-29 und CD18 bis fast zur Konfluenz in einer T-75-Flasche, Wechsel des gesamten Mediums, Inkubation der Zellen für 12–15 Stunden und anschließendes Sammeln des Mediums, das die viralen Partikel enthält, produziert. Der das Virus enthaltende Überstand wurde anschließend zentrifugiert, um die viralen Verpackungszellen zu entfernen, das Medium wurde entfernt und in Aliquoten bei –80°C eingefroren.
LTBMC mit Überstand mit SAX-Retrovirus, DC29-Retrovirus oder CD18-Retrovirus.: Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂/95% Luft-Atmosphäre inkubiert. Während der ersten zwei Kultivierungswochen wurden zwei Drittel des Mediums (1 ml) täglich aus jeder Kultivierungsvertiefung entfernt und das Medium durch ein gleiches Volumen an frischem Medium, das HGFs (0,85 ml) und den Überstand virusproduzierender Zellen enthielt, ersetzt; (0,15 ml). Der retrovirale Überstand, der Medium enthielt, wurde unmittelbar vor Gebrauch aufgetaut und, wenn er nicht vollständig benötigt wurde, auf Eis im Kühlschrank aufbewahrt. Das aus den Kulturen entfernte Medium wurde zentrifugiert, das Medium dekantiert und die Zellen in die ursprünglichen Vertiefungen zurückgegeben.
LTBMC co-kultiviert mit der SAX-Retrovirus-Verpackungszellinie: Die SAX-Retrovirus-Verpackungszellinie wurde bis zu etwa 10% Konfluenz in T-25-Flaschen (Costar-Nr. 3056) wachsen gelassen und dann einer Strahlung von 2000 rad ausgesetzt. Die oben hergestellten, hämatopoetischen Zellen wurden zu den bestrahlten virusproduzierenden Zellen gegeben und mit 50% täglichem Mediumaustausch 2,5 Wochen lang kultiviert, wobei alle Zellen in die Vertiefungen zurückgegeben wurden. Nach 2,5 Wochen in Kultur wurde eine 0,5 mM EDTA-Lösung in die Flaschen gegeben, um die hämatopoetischen Zellen zu entfernen, während das Stroma zurückgelassen wurde. Die entfernten hämatopoetischen Zellen wurden in 3 Vertiefungen einer 6-Loch-Platte mit 1000 frisch trypsinierten Knochenmarksfibroblastenzellen pro Vertiefung gegeben.
Probenentnahme infizierter LTBMCs: Beginnend mit Kultivierungswoche 2, nachdem die Zugabe der Retroviren beendet war oder die Co-Kultivierung aufgehört hatte, wurde bei den Kulturen täglich 50% Medium ausgetauscht, wobei die nichtadhärenten Zellen in dem ausgetauschten Medium einmal pro Woche zu Analysezwecken entfernt wurden. Nichtadhärente Zellen wurden während des täglichen Mediumaustauschs aus den Kulturen entfernt, die mononukleären Zellen wurde ausgezählt und frisches Medium in die Vertiefungen gegeben. Die restlichen sechs Tage pro Woche, wenn die Zellen nicht ausgezählt wurden, wurde 50% des Mediums aus jeder Kulturvertiefung entfernt und durch frisches Medium ersetzt, das entfernte Medium wurde zentrifugiert, das Medium vom Zellpellet dekantiert und die Zellen in ihre ursprünglichen Vertiefungen zurückgegeben.
Untersucheung auf retrovirale Infektion: Die anfängliche Knochenmarksansaat wurde in 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 und 2,0 mg/ml G418 plattiert, um eine Abtötungskurve zu erhalten, um die G418-Konzentration zu bestimmen, in die die post-infizierten Knochenzellen ausplattiert werden sollten. Die aus den Kulturen entfernten Zellen wurden auf Methylcellulose mit G418 bei 0,0, 0,8 und 1,6 mg/ml G418 ausplattiert. Nach zwei Wochen wurde die Anzahl an Progenitorzellkolonien auf der Methylcellulose ausgezählt. Einzelne Kolonien wurden dann von der Methylcellulose gepickt und mit Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf retrovirale DNA untersucht.
Statistische Untersuchung: Die Wahrscheinlichkeit signifikanter Unterschiede zwischen Gruppen von Kulturen wurde durch Vergleich der Werte für die kumulative Zellproduktion aus den Versuchsproben mit den zugeordneten Kontrollkulturen mit Hilfe eines paarweisen t-Tests bestimmt. Statistische Signifikanz wurde bei einem Niveau von 5% angenommen.
Ergebnisse:
Retrovirale Infektion mit Hilfe des SAX-Retrovirus
Kinetik der Zellproduktion in LTBMCs, die mit SAX-Retroviren infiziert wurden: Die Zellproduktion in retroviral infizierten Kulturen ist ein Anzeichen für die Wahrscheinlichkeit retroviraler Infektion und stellt daher einen nützlichen Messparameter dar. Man vermutet, dass eine retrovirale Integration in das Zielzellengenom nur während der Zellteilung auftritt. Aus diesem Grund erhöht die erhöhte Produktivität der Kultur die Wahrscheinlichkeit der Mitose von Stammzellen und erhöht dadurch die Wahrscheinlichkeit einer retroviralen Infektion. Die höchste Zellproduktion trat bei den Kulturen mit Virus im Überstand auf, die mit IL-3 + GM-CSF und IL-3 + GM-CSF + IL-1α supplementiert waren, was während 4 Wochen in Kultur eine erhöhte Anzahl von Zellen lieferte. Die mit den SAX-Virus-Verpackungszellinien co-kultivierten LTBMCs produzierten in Woche 2 mehr Zellen als die Kulturen mit Zugabe von Überstand, wenn auch die Zellproduktion nach Woche 2 abfiel.
Analyse der retroviralen Infektion in LTBMCs mit einer SAX-Viruszugabe im Überstand: Der Prozentsatz an Progenitorzellen, die bei hohen [G418] überleben, variierte in den Kulturen, die mit IL3 + GM-CSF oder IL-3 + GM-CSF + IL-1α supplementiert waren, während der ersten vier bis sechs Wochen in Kultur zwischen 2 und 50%. Nach 10 Wochen in Kultur (8 Wochen nachdem die Viruszugabe beendet war) überlebten 43% der Progenitorzellen, die zu hämatopoetischen Kolonien klonierbar waren, eine Exposition mit G418. Das zeigt an, dass diese Progenitorzellen wegen des G418-Resistenzgens, das sie enthielten und das von dem Retrovirus während der ersten 14 Tage der Infektionsperiode auf Stammzellen in der Kultur übertragen worden war, G418-resistent geworden waren. Die nicht mit HGFs supplementierten, rasch perfundierten Kulturen zeigten eine durchschnittliche Überlebensrate von Progenitorzellen in hohem [G418] von 12% zwischen den Wochen 8 und 22. Bei Beendigung der Kultur nach 11 Wochen wurde die Stromaschicht der mit IL-3 + GM-CSF supplementierten Kulturen trypsiniert, und 17% der Progenitorzellen, die an das Stromagewebe adhärierten, überlebten in hohem [G418]. Dies läßt die Vermutung zu, dass ein signifikanter Prozentsatz adhärenter Progenitorzellen ebenfalls mit dem SAX-Virus infiziert worden war.
Analyse der retroviralen Infektion in LTBMCs die mir bestrahlten SAX-Virus-Verpackungszellen co-kultiviert waren: Der Prozentsatz an Progenitorzellen, die in G418 bei einer Co-Kultivierung mit bestrahlten SAX-Zellen überlebten, lag zwischen 0 und 36%. Die nicht mit HGFs supplementierten Kulturen produzierten CFU-GM, die in hohem [G418] nur zwischen den Wochen 4–7 überlebten. Nach der Woche 7 wurden keine CFU-GM in diesen Kulturen produziert, die in hohem [G418] überlebten, was die Vermutung nahelegt, dass keine oder nur eine geringe Infektion der Stammzellen stattgefunden hatte. Die mit IL-3 + GM-CSF supplementierten und mit bestrahlten SAX-Zellen 2,5 Wochen co-kultivierten LTMBCs produzierten hohe Prozentsätze an CFU-GM, die in 0,8 mg/ml G418 in Woche 4, 5 und 8 überlebten. Diese Kulturen konnten jedoch in Woche 10 keine CFU-GM produzieren, die gegen G418 resistent waren. Dies legt die Vermutung nahe, dass nur eine geringe oder keine Infektion der Stammzellen in diesen Kulturen stattgefunden hatte oder dass die Stammzellen differenzierten oder abstarben.
Retrovirale Infektion mit dem DC-29-Retrovirus
Kinetik der Zellproduktion in LTBMCs, die mit DC-29-Retroviren infiziert waren: Die Anzahl an Zellen, die in den Kulturen produziert wurde, die mit dem retroviralen DC-29-Überstand infiziert waren, war HGF-abhängig. Die mit IL-3 + GM-CSF + Epo supplementierten Kulturen produzierten zwischen 1,5–4 × 10⁶ Zellen wöchentlich während der 10 Wochen in Kultur. Die mit IL-3 + GM-CSF + Epo + MGF supplementierten Kulturen proliferierten stärker, während die mit Hybrikine + Epo supplementierten Kulturen zur höchsten Zellproduktion führten. Interessanterweise proliferierten die Kontrollkulturen, die mit IL-3 + GM-CSF + Epo supplementiert waren aber keinen retroviralen DC-29-Überstand erhielten, weniger als die ähnlichen Kulturen, die den retroviralen DC-29-Überstand erhielten. Die Zellproduktion in den Kulturen mit IL-3 + GM-CSF + Epo, IL-3 + GM-CSF + Epo + MGF und Hybrikine + Epo (mit Viruszugabe) war signifikant höher als bei der Kontrollkultur (IL-3 + GM-CSF + Epo, keine Viruszugabe) bei 5%, 1% bzw. 1% Signifikanzniveau. Ein Teil der erhöhten Produktion in den Kulturen mit Zugabe von retroviralem Überstand kann auf die Gegenwart eines Wachstumsfaktors/Wachstumsfaktoren wie beispielsweise MGF (c-kit-Ligand) zurückzuführen sein, der bekannterweise von der 3T3-basierten Verpackungszellinie produziert wird.
Analyse der retroviralen Infektion in LTBMCs mit Viruszugabe im DC-29-Überstand: Die Effizienz der retroviralen Infektion wurde durch die Überlebensrate von CFU-GM in 1,6 mg/ml G418, einer Konzentration, die alle Knochenmarkszellen vor der retroviralen Infektion tötete, bestimmt. Der durchschnittliche Prozentsatz der CFU-GM, der bei Woche 8 überlebte (6 Wochen nach Infektion), war bei allen Kulturen hoch, Tabelle 5.
Die Zugabe von MGF zur Kombination aus IL-3 + GM-CSF + Epo scheint in den Wochen 8–10 in Kultur eine erhöhte Infektionseffizienz zu haben, wobei eine der Kulturen 7,7% G418-resistente Kolonien enthielt. Die Daten von Woche 8 lassen vermuten, dass die mit Hybrikine + Epo supplementierten Kulturen eine hohe Infektionseffizienz aufwiesen, obwohl die Daten der Woche 10 keine Infektion vermuten lassen. In Woche 10 ist zu beachten, dass die Anzahl an CFU-GM, die aus verschiedenen Kulturen eliminiert wurden, bis dahin abnahm, wo bei etwa 10%iger Infektion wenige oder gar keine CFU-GM mehr erwartet worden wären. Ferner ist 1,5 mg/ml G418 eine extrem hohe Antibiotikadosis, die wahrscheinlich ausreicht, um die Wirksamkeit des transfizierten G418-Resistenzgens selbst bei leicht suboptimalen Mengen zu überkommen. Daher betrug die Effizienz des Gentransfers in die hämatopoetische Stammzellen in diesen Kulturen in einigen Proben mindestens 7,7% und vielleicht sogar 45% oder mehr.
Kinetik der Produktion nichtadhärenter Progenitorzellen: Weil die Analyse einer retroviralen Infektion bei diesen Experimenten vom Test auf Progenitorzellen abhängt um auf die Existenz von Stammzellen, Infektion und Cycling zu schließen, ist es wichtig die Wirkung von HGFs auf die Progenitorzellproduktion in Kultur zu bestimmen. Bei diesem retroviralen Experiment werden auch MGF und Hybrikine zusammen mit anderen HGFs verwendet. Sowohl MGF als auch Hybrikine wurden nicht bei rasch perfundierten, HGF supplementierten LTBMCs verwendet, und es ist daher notwendig, ihre Wirkungen auf die Hämatopoese zu bestimmen.
Die Progenitorzellproduktion war stark von der HGF-Supplementierung abhängig. Die Zahl der CFU-GM, die aus den Kulturen eliminiert wurde, ist in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Kumulative Zahl Progenitorzellen, die in HGF-supplementierten, rasch perfundierten DC-29-Langzeit-Knochenmarkskulturen eliminiert wurden.
Die vierzehntägige Probennahme aus den Kulturen wurde für CFU-GM untersucht und die nicht untersuchten Werte wurden durch lineare Interpolation zwischen zwei bekannten Datenpunkte abgeschätzt. Die bekannten und interpolierten Werte wurden auf die ungefähre Gesamtanzahl an CFU-GM, die aus den Kulturen entfernt worden waren, summiert.
Eine Zugabe von retroviralem Überstand erhöhte die Eliminierung von Progenitorzellen um das 2,2-fache gegenüber der Nichtzugabe retroviralen Überstands. Der Anstieg in der Anzahl der CFU-GM, die in den mit retroviralem Überstand und IL-3 + GM-CSF + Epo + MGF oder Hybrikin + Epo supplementierten Kulturen eliminiert wurden, war 4,2 bzw. 3,8mal höher als in der nicht infizierten Kontrolle. Die Eliminierung der CFU-GM war statistisch gesehen, am 1%-Signifikanzniveau, in allen virus-supplementierten Kulturen höher, wenn mit der Anzahl der angesäten CFU-GM verglichen wurde.
Progenitorzellproduktion in Kultur: Ein Populationsgleichgewicht im CFU-GM-Kompartiment zeigt, dass die Zugabe von MGF oder Hybrikine zu Kulturen, die mit IL-3 + GM-CSF + Epo supplementiert waren, eine deutliche positive Wirkung auf den CFU-GM-Pool ausübt. Die Zugabe von MGF zu der Kombination aus IL-3 + GM-CSF + Epo erhöhte die CFU-GM-Eliminierung um das 1,9-fache und die CFU-GM-Differenzierung um das 0,5-fache im Vergleich zu ähnlichen Kulturen, die nicht mit MGF supplementiert waren, Tabelle 7.
Tabelle 7 Kumulative Produktion con CFU-GM, die in mit Wachstumsfakor supplementierten, retroviral infizierten rasch perfundierten DC-29-Langzeit-Knochenmarkskulturen eliminiert wurden und differenzierten.
Die vierzehntägige Probennahme aus den Kulturen wurde für CFU-GM untersucht und die nicht untersuchten Werte wurden durch lineare Interpolation zwischen zwei bekannten Datenpunkten geschätzt. Die bekannten und interpolierten Werte wurden auf ungefähr die Gesamtanzahl an CFU-GM, die aus den Kulturen entfernt wurden, summiert.
Die Kombination aus Hybrikine + Epo hatte eine sehr ausgeprägte Wirkung auf die CFU-GM-Produktion und -Differenzierung. Hybrikine + Epo induzierte eine 1,8-fache Zunahme in der CFU-GM-Eliminierung und eine über 3-fache Zunahme bei der CFU-GM-Differenzierung, verglichen mit den vorhergehenden optimalen Kulturen, die mit IL3 + GM-CSF + Epo supplementiert waren. Hybrikine + Epo induzierte auch die Produktion von fast zweimal mehr Granulozyten und Makrophagen als die Kombination aus IL-3 + GM-CSF + Epo + MGF. Dies zeigt an, dass Hybrikine ein wirkungsvoller Induktor der Granulozyten-Makrophagen-Lineage ist.
Analyse der Neutrophilen, die aus Stammzellen produziert wurden, die mit dem CD18-codierendem Retrovirus infiziert waren: CD18-defizientes Knochenmark wurde wie oben beschrieben auf frühe hämatopoetische Zellen angereichert und anschließend 14 Tage lang bei 50% täglichem Austausch von Medium kultiviert, das mit 1,0 ng/ml/Tag GM-CSF und 1,0 ng/ml/Tag IL-3 und 40 U/ml/Tag IL1α und mit Überstand der CD18-Retrovirus-Produktionszellinie supplementiert war. Von Tag 15 an wurden diese Zellen unter den gleichen Bedingungen ohne Zugabe eines retroviralen Überstands kultiviert. Nichtadhärente Zellen wurden wöchentlich aus den Kulturen entfernt und mittels Durchflußzytometrie mit biotinyliertem monoklonalem anti-CD18-Antikörper mit Standardverfahren auf die Gegenwart von Zelloberflächen-CD18 untersucht (Updyke et al, Meth. Enzymol. (1986) 121: 717–725). Während CD18-defiziente Knochenmarkszellen kein Zelloberflächenprotein CD18 bei dieser Untersuchung exprimieren konnten, exprimierten Neutrophile und Monozyten, die aus den retroviral infizierten Kulturen entstanden, das Zelloberflächen-CD18. In dreifachbestimmten Kulturen betrug die Expression von Zelloberflächen-CD18 3,5%/5%/2% nach 6 Wochen und 11%/28%/3% nach 11 Wochen. Da die in den Kulturen nach 11 Wochen vorhandenen Neutrophilen und Monozyten nur 10–14 Tage früher aus CFU-GM-Progenitorzellen entstanden waren, zeigen diese Daten an, dass humane hämatopoetische Stammzellen während der ersten zwei Wochen der Kultur erfolgreich und stabil mit dem rekombinanten Retrovirus transfiziert worden waren.
Bei der Interpretation der vorliegenden Ergebnisse ist es wichtig zu beachten, dass, obwohl mehrere Gruppen einen durch Retroviren vermittelten Gentransfer in humane hämatopoetische Progenitorzellen gezeigt haben, kein Gentransfer in humane hämatopoetische Stammzellen gezeigt wurde. Der schnelle Abfall der Zellproduktion in herkömmlichen, langsam perfundierten humanen LTBMCs limitierte eine Bestimmung der Infektion aufgrund des Fehlens von Progenitorzellen, die für diesen Test benötigt werden.
Die retrovirale Infektion in den vorliegenden Untersuchungen wurde anfänglich durch Kultivieren der aus den LTBMCs entfernten Zellen in Methylcellulose in Gegenwart des Säugerzellantibiotikums G418 bestimmt. Progenitorzellen, die mit dem SAX- oder DC-29-Retrovirus infiziert waren und das NEO-Produkt exprimierten, werden in der Lage sein zu überleben und bei hohen Konzentrationen von G418 Kolonien zu bilden, wogegen nichtinfizierte Zellen bei hohen Konzentrationen von G418 absterben. Die Produktion von Progenitorzellen, die bei hohen Konzentrationen von G418 sechs oder mehr Wochen nach Beenden der Viruszugabe überleben, erfordert auch, dass jene Zellen kürzlich aus einer primitiveren Zelle (einer Stammzelle) differenziert sind, und lässt daher vermuten, dass Stammzellen infiziert wurden. In ähnlicher Weise erfordert das CD18, das auf der Oberfläche von Neutrophilen und Monozyten exprimiert wird, die während der 11. Woche in Kultur produziert wurden, dass eine primitive hämatopoetische Stammzelle während der ersten 2 Wochen in den Kulturen infiziert wurde, da alle reifen Zellen, Vorläufer und klonogene Progenitorzellen, die während der Infektionsdauer vorhanden sind, nach 4–5 Wochen in der Kultur abgestorben waren.
Der hier verwendete Test einer retroviralen Infektion kann den Prozentsatz an Zellen, die mit dem Retrovirus infiziert wurden, aufgrund einer ungenügenden Expression des NEO-Genprodukts unterschätzen. Es hat sich gezeigt, dass die Unterexpression eines transferierten Genprodukts ein Problem bei humanen und Primatenmodellen darstellt. Daher ist der Prozentsatz an Progenitorzellen, die bei dieser Untersuchung infiziert wurden, wahrscheinlich eine konservative Schätzung.
Der Prozentsatz an Progenitorzellen, die bei hohem [G418] überlebten, lag bei etwa 40% in Woche 10 bei Kulturen, die mit dem SAX-Retrovirus-Überstand infiziert und mit IL-3 + GM-CSF ± IL-1α supplementiert waren. Diese anfänglichen Ergebnisse zeigen, dass während der ersten zwei Wochen in Kultur ein hoher Prozentsatz an Stammzellen in den mit retroviralem Überstand supplementierten Kulturen infiziert worden war.
Der Prozentsatz an Progenitorzellen, die mit dem DC-29-Retrovirus infiziert waren, war in den Kulturen mit IL-3 + GM-CSF + Epo + MGF und Hybrikine + Epo in den ersten 4 Wochen nach beendigung der Viruszugabe hoch (0–21%). Dieser hohe Infektionsgrad von Proigenitorzellen rührte wahrscheinlich von einer direkten Infektion von Progenitorzellen und primitiven Zellen mit dem Retrovirus her. Der Prozentsatz an Progenitorzellen, die bei hohen G418-Konzentrationen überlebten, nahm 4 Wochen nach Beendigung der Viruszugabe ab, erholte sich aber 2 Wochen später auf eine Überlebensrate von 0–22% bei hoher G418-Konzentration.
Die Produktion G418-resistenter Progenitorzellen im DC-29-Experiment kann den Prozentsatz an tatsächlich mit DC-29-Retrovirus infizierten Progenitorzellen unterschätzen. Die hohe Konzentration an G418, die zur Selektion nicht infizierter Kolonien verwendet wird (1,6 mg/ml G418), ist doppelt so hoch wie die, die bei dem SAX-Infektionsexperiment verwendet wurde, und erfordert zum Überleben eine starke Expression des NEO-Genprodukts, der Neomycinphosphotransferase.
Interessanterweise stieg in LTBMCs, die entweder mit SAX- oder DC-29-Retrovirus enthaltendem Überstand, den HGFs IL-3 + GM-CSF ± Epo, IL-1α oder MGF oder der Kombination aus Hybrikine + Epo supplementiert waren, der Prozentsatz an Progenitorzellen, die in G418 überlebten, 6–8 Wochen nach Beendigung der Viruszugabe an. Obwohl der Mechanismus für den Anstieg im Prozentsatz der G418 überlebenden Progenitorzellen bis zu den letztgenannten Stadien der Kulturen nicht bekannt ist, ist eine Möglichkeit die, dass Stammzellen, die während der ersten zwei Wochen in Kultur infiziert wurden, bei fortschreitende Kultur aktiver wurden. Dies würde wirkungsvoll den Prozentsatz der in G418 überlebenden Zellen erhöhen. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die Expression des NEO-Gens in Progenitorzellen erhöht sein kann, die aufgrund der Differenzierung aus einer Stammzelle, die eine unterschiedliche und besser exprimierbare Integrationsstelle besaß als die direkt bei der anfängliche Infektionsperiode der Kultur transfizierten Progenitorzellen, erst spät während der Kultur produziert wurden. Daher lässt die hohe Überlebensrate von Progenitorzellen spät in der Kultur, obwohl es möglicherweise verschiedene Ursachen gibt, stark vermuten, dass Stammzellen in diesen LTBMCs infiziert wurden.
Zusammengenommen dokumentieren diese Daten, dass unter den in der vorliegenden Erfindung offenbarten Kulturbedingungen hämatopoetische Stammzellen in den Kulturen proliferierten, was den Einbau von retroviral übertragenem genetischen Material in diese Zellen möglich machte. Progenitorzellen wurden kontinuierlich und aktiv von diesen Stammzellen produziert und diese vielen Progenitorzellen enthielten und exprimierten die übertragenen Gene. Diese Daten zeigen an, dass genetisch modifizierte humane hämatopoetische Stammzellen in diesen Kulturen vorhanden waren und proliferierten.
IV. EXPERIMENTELLER TEIL
I. Bildung von Transformanten
Der Wachstumsfaktor humaner GM-CSF (Wong, Science, (1985) 228: 810–815) wurde in einen eukaryontischen Expressionsvektor inseriert. Die CDNA von HGM-CSF (EcoRI-AhaIII, ca. 700 bp-Fragment) wurde in ein EcoRI-PstI-Fragment von pSP65 kloniert. (Melton, Nucl. Acids Res. (1984) 2: 7035–7056). Das resultierende Plasmid war pSP65GM-CSF. Der Metallothioneinpromotor der Maus (Glanville, Nature (1981) 292: 267–269) wurde mit EcoRI und BglII verdaut und das etwa 2 kb große Fragment, das den Promotor enthielt, wurde in das EcoRI-BamHI-Fragment von pSP65 inseriert, wobei p65MT entstand. Das Plasmid pMT GM-CSF wurde dann konstruiert, indem pSP65GM-CSF mit EcoRI verdaut wurde, die überhängenden Enden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt wurden und die resultierende linearisierte DNA anschließend mit HindIII verdaut wurde, um das 700 bp-Fragment zu isolieren, das die für GM-CSF codierende Region umfaßte. Dieses Fragment wurde in die aufgefüllte SalI/HindIII-Stelle von p65MT subkloniert. Das 2,7 kb-Fragment, das den Metallothioneinpromotor und die für GM-CSF codierende Region umfaßte, wurde dann isoliert und in pSV2neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet (1982) 1: 327) eingebaut, aus dem der SV40-Promotor entfernt worden war. Dies führt zum SV40-Poly A-Signal stromabwärts der für GM-CSF codierenden Sequenz.
Das Gen für die Neomycinresistenz, das Resistenz gegen das Antibiotikum Gentamycin (G418) vermittelt, wurde pSV2neo entnommen, indem das etwa 3 kb große PvuII-EcoRI-Fragment isoliert und an die PvuII-Stelle EcoRI-Linker angebaut wurden. Das Neo-Resistenzgen mit den EcoRI-Enden wurde unter Bildung des Plasmids MTGM-CSFneo in die EcoRI-Stelle des GM-CSF-Expressionsplasmids subkloniert.
Das Plasmid MTGM-CSFneo wurde allein und als Cotransfektion mit dem Plasmid (Yang, Cell (1986) 47: 3–10), das das IL-3-Gen von Gibbonaffen unter der Kontrolle des SV40-Promotors und eine Poly A-Stelle enthält, durch Elektroporation linearisierter DNA in die Zellen der Zellinie CV1 afrikanischer grüner Meerkatzen und der Mäusezellinie NIH 3T3 transfiziert. Transformanten wurden durch Selektion in Medien selektioniert, die 500 mg/ml G418 enthielten, isoliert und mittels eines Bioassays der Überstände mit AML-193-Zellen (Adams et al., Leukemia (1989) 3: 314) auf Produktion von GM-CSF oder IL-3 gescreent. Mehrere der positiven Zellinien wurden dann als Stroma für humane Knochenmarkszellen in Dexter-Kultur eingesetzt.
Zusätzlich wurden normale Knochenmarkszellen von Mäusen mit dem obigen Plasmid transfiziert, wobei die Calcium/Phosphat-Methode von Okayama (Chen, Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 2745–2752) angewandt wurde. Es wurde gefunden, daß sie Zellen die eingebrachten Gene effizient exprimieren.
Die Sekretion von GM-CSF und IL-3 durch die transfizierten Fibroblasten wurde untersucht. Überstände von 72-stündigen serumfreien Kulturen wurden von den NIH-3T3-Zellen erhalten und mittels 3H-Aufnahme an durch neutralisierende Kaninchen-anti-GM-CSF-Antikörper oder Kaninchen-anti-IL-3-Antikörper inhibierbaren Targetzellen auf hGF-Sekretion getestet. Durch 20 mg/ml GM-CSF induzierte Proliferation wurde als 100 Units GM-CSF definiert und die durch 10 ng/ml IL-3 induzierte Proliferation wurde als 100 Units IL-3 definiert. Die cotransfizierten Zellen produzieten etwa 35 Units/ml GMCSF und etwa 57 Units/ml IL-3.
II. Perfusionskammer
Die Perfusionskammer ist ein Glaszylinder mit Delrin-Kappen, um ein Autoklavieren ohne Deformation und um Biokompatibilität zu gewährleisten. Die Kappen haben zylindrische Vertiefungen, in die der Glaszylinder paßt. Am Boden der Vertiefung wird ein O-Ring plaziert, um das Lumen der Kammer abzudichten. Die Kappen weisen mehrere Löcher auf, in denen Luer(Luer Lock)-Verbindungsstücke vorgesehen sind, in die Leitungen für Medien- und Gaszufuhr eingesetzt werden, sowie einen verlängerter Schlauch in die zentrale Zone der Kammer, um Proben von adhärenten und/oder nichtadhärenten Zellen zu entnehmen. Die Kappen werden mit drei langen Schrauben im Abstand von 120°, die außerhalb des Glaszylinders angebracht sind, befestigt; Flügelschrauben und Dichtungsringe werden zum Festziehen der Anordnung verwendet.
Die Kammer wird an ein seitliches Reservoir gehängt. Der Regelkreis enthält zusätzlich zu dem seitlichen Medienreservoir eine Pumpe, eine Kammer mit prozeßgekoppelten Sensoren, einen Oxygenator und Öffnungen zur Probenentnahme und zum Einspritzen. Das Medium im seitlichen Reservoir wird dann mit einer separaten Pumpe langsam ausgetauscht. Diese Anordnung erlaubt eine getrennte Regelung der Medienaustauschgeschwindigkeit und der Strömungsgeschwindigkeit durch den Oxygenator und die Perfusionskammer. Erstere wird eingesetzt, um die längerfristige Änderung in der Medienzusammensetzung und die Perfusion zu regeln, während letztere eingesetzt werden kann, um das Potential des gelösten Sauerstoffs und die Strömungsmuster in der Kammer zu regeln. Die Verwendung einer engmaschigen Polysulfonatmembran erlaubt eine Pfropfenströmung in der Kammer und die genaue Steuerung der Zufuhr von Wachstumsfaktoren und anderen speziellen Verbindungen, die man in sehr genauen Mengen in den Bioreaktor einschleusen möchte.
Die transfizierten Stromazellen werden entweder über einem Bett aus zerkleinertem Kollagenschwamm ausgesät oder man plaziert die Stromazellen auf einer Seite eines porösen 5 μ-Polycarbonatfilters, der mit Kollagen vorbeschichtet ist, und läßt die Stromazellen über mehrere Stunden an den Filter adhärieren. Man läßt die Zellen in einem geeigneten Nährmedium wachsen, bis die Zellen an einer Seite konfluent werden, während sie zytoplasmatische Projektionen durch die Poren strecken. Dann werden Knochenmarkszellen auf der anderen Seite der Membran ausgesät und die Stammzellen heften sich an die eingedrungenen zytoplasmatischen Projektionen, die durch die Poren gelangt sind.
Nach Autoklavieren der Kammer und der Komponenten des Regelkreises wird der Reaktor in einer sterilen Umgebung zusammengebaut. Das Medium wird dann einige Tage im Kreis durch den seitlichen Regelkreis und die Kammer geführt, wobei auf Zeichen von Verunreinigungen überprüft wird. Die mittlere Zone des Bioreaktors wird dann entweder mit der extrazellulären Matrix allein oder mit einem zuvor inokulierten Träger für die extrazelluläre Matrix, der die Stromazellen enthält, inokuliert. Die Stromazellen können dann für einige Tage in der Kammer gehalten werden, wobei ihre Stoffwechselleistung und/oder ihr Ansprechen auf Wachstumsfaktoren überwacht wird, und wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wird das Knochenmark inokuliert oder es wird unmittelbar mit Knochenmark angesät. In beiden Fällen wird die Zellschicht am Boden der mittleren Zone der Perfusionskammer gehalten.
Die Zellen legen zusätzliche extrazelluläre Matrix ab und die Zellschicht adhäriert an den Träger. Wenn die Membran verwendet wird, kann die Kammer umgedreht werden und die Zellschicht befindet sich dann an der Decke der mittleren Zone. Bei dieser Anordnung setzen sich die reifenden Zellen am Boden der mittleren Zone ab, da sie ihre Adhäsionsfähigkeit an die Stromaschicht verlieren. Die nicht adhärenten Zellen werden dann mit Hilfes des konstanten Strom von Zellen in die Austrittsschlauchleitung, getrieben durch den Perfusionsdruck des Mediums, geerntet.
In einem typischen Versuchslauf wurde die Kammer an Tag 1 mit NIH-3T3-Zellen auf einem zerkleinerten Kollagenschwamm als Träger inokuliert. Über die ersten 40 Tage wurden die Perfusionsgeschwindigkeiten und andere Betriebsvariable eingestellt. An Tag 40 wurde ein angemessenes Gleichgewicht erreicht, das über etwa 20 Tage aufrechterhalten wurde. An Tag 64 wurde die Kammer mit 33 × 10⁶ humanen Knochenmarkszellen angesät. Über die ersten 10 Tage sank die Zahl der geernteten Zellen, bis sich ein Gleichgewicht von etwa 7–8 × 10⁵ Zellen, die alle drei Tage produziert wurden, einstellte. Eine Analyse mittels Durchflußzytometrie zeigte, daß eine konstante Fraktion, etwa 20% der geernteten Zellen, HLA-DR-positiv war. An Tag 90 fiel eine Pumpe aus und der pH fiel über Nacht unter 6,9. Nachdem die Perfusionsgeschwindigkeit wiederhergestellt war, erholte sich die Produktion nicht adhärenter Zellen und näherte sich der früheren Gleichgewichtsproduktionsrate an, als eine Kontamination mit Bakterien auftrat. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Untersuchung beendet.
Die obigen Ergebnisse zeigten, daß eine Perfusionskammer in der Lage ist, ex vivo eine Hämatopoese zustande zu bringen, und daß sich die Hämatopoese nach einem pH-Abfall wiederherstellen läßt, und die Werte für die Glucosekonzentration zeigten, daß die hämatopoetischen Zellen primär aerob auf Glucose wachsen, da die Glucosekonzentration nach Inokulation ohne Zunahme der Lactatkonzentation abfällt, was anzeigt, daß die Oxygenierung limitierend ist. Der (anaerobe) Glucose/Lactat-Metabolismus scheint in erster Linie auf dem NIH-3T3-Stromabett zu beruhen. Ähnlich erreichen die Glutamin- und Ammoniakkonzentrationen Werte vor der Inokulation, sobald die Zahl hämatopoetischer Zellen abnimmt, was impliziert, daß der Glutaminverbrauch der Knochenmarkszellen weit geringer ist als der des Stromabetts.
III. Monitoring der Stoffwechselprodukte
Der Verbrauch und die Bildungsraten von Glucose und Lactat sowie von Glutamin und Ammoniak wurden für transfizierte NIH-3T3-Zellen bestimmt. (Das Medium war IMDM plus 20% FCS). Ein erhöhter Glucoseverbrauch wurde nur bei täglich gefütterten T-Kolben beobachtet, während alle weniger häufig gefütterten Kulturen den gleichen Mustern einer langsam abnehmenden Glucoseaufnahmegeschwindigkeit folgen. Kulturen, die täglich zu 50% ausgetauscht wurden, wurden an Tag 18 auf ein tägliches 100%iges Austauschschema umgestellt, was zu einer unmittelbaren Zunahme des Glucoseverbrauchs führte, der dem gleichen Trend folgte wie der, der für Kulturen beobachtet wurde, die von Tag 1 an täglich zu 100% ausgetauscht wurden. Die Produktionsgeschwindigkeiten für Lactat folgen einem ähnlichen Muster, da die Lactatausbeute auf Glucose im wesentlichen eine Konstante ist (0,9 Lactat/Glucose; dies zeigt einen größtenteils anaeroben Stromastoffwechsel an).
Die Glutamin- und Ammoniakkonzentrationen zeigen ein Muster, das dem Glucose/Lactat-Stoffwechsel analog ist. Bei Verwendung von Werten, die hinsichtlich der chemischen Zersetzung von Glutamin bei 37°C korrigiert sind, zeigt die Geschwindigkeit des Glutaminverbrauchs gegenüber der Geschwindigkeit des Glucoseverbrauchs, daß die Aufnahmeraten konstant sind, nämlich etwa 1:8 für Glutamin:Glucose. Das vorhergesagte optimale Verhältnis schwankt mit der Sauerstoffaufnahmerate, das Verhältnis sinkt bei zunehmender optimaler Aufnahmerate.
Analoge Schlußfolgerungen werden durch Stoffwechseldaten für Glucose/Lactat unterstützt, die von normalen Fibroblasten von Knochenmarksstroma stammen. Unter Bedingungen eines selteneren Medienaustauschs waren die Kulturen in erster Linie anaerob, wobei rasch hohe Gleichgewichtsspiegel von Lactat erreicht und aufrechterhalten wurden. Bei häufigerem Medienaustausch wurde der Zellstoffwechsel schneller und der Glucoseverbrauch und die Lactatproduktion nahmen zu. Es wurde kein nachweisbarer Glutaminverbrauch beobachtet, nachdem die Daten hinsichtlich der spontanen chemischen Zersetzung korrigiert worden waren. Sowohl 3T3-Zellen als auch normale humane Knochenmarkszellen teilen sich weiter und sammeln sich an, wenn die Austauschrate von Serum/Medium oberhalb eines anscheinend kritischen Austauschschemas liegt.
Um die relative Bedeutung der Perfusionsgeschwindigkeit von Serum gegenüber der von Nährstoffen festzustellen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt: (1) eine Reihe T-Kolben mit Medium mit 20% Serum mit täglichem Austausch; (2) zwei Reihen T-Kolben, eine mit 20% Serum, wobei das Medium alle zwei Tage ausgetauscht wird, und eine mit 20% Serum, wobei das Medium täglich ausgetauscht wird; (3) zwei Reihen T-Kolben, eine mit 10% Serum, wobei das Medium alle zwei Tage ausgetauscht wird, eine mit 5% Serum, wobei das Medium täglich ausgetauscht wird; (4) zwei Reihen T-Kolben, eine mit 5% Serum, wobei das Medium alle zwei Tage ausgetauscht wird, und eine mit 2,5% Serum, wobei das Medium täglich ausgetauscht wird. Die Austauschrate des Serums ist innerhalb jeder Gruppe gleich, während die Austauschrate der nährstoffhaltigen Medien variiert. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß es die Austauschrate des Serums ist, die kritisch ist. Während bei Experiment 1) der Glucoseverbrauch zunahm und an Tag 4 auf eine Rate von etwa 9,5 mmol/pro Tag abgeflacht war, begann der Glucoseverbrauch in allen anderen Fällen unterhalb des ursprünglichen Glucoseverbrauchs der Gruppe I und fiel im wesentlichen in linearer Weise ab, gleichgültig ob die doppelte Serummenge eingesetzt wurde und alle zwei Tage ausgetauscht wurde oder ob die Hälfte der Serummenge eingesetzt wurde und das Medium jeden Tag gewechselt wurde. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einer kritischen Perfusionsgeschwindigkeit für das Serum oder ein oder mehrere Serumkomponenten, die das metabolische Wachstumsverhalten der Stromazellen beeinflussen.
Aus den obigen Ergebnissen wird deutlich, daß man hämatopoetische Zellen auf effiziente Weise in einem Bioreaktor züchten kann. Stromazellen lassen sich aus homologen oder heterologen Quellen bereitstellen, wenn die Stromazellen mit Genen transfiziert wurden, um die wichtigen Wachstumsfaktoren zu liefern. Auf diese Weise muß dem Medium kein Serum zugegeben werden, um das Wachstum der Zellen zu fördern. Indem Stromazellen bereitgestellt werden, die so an einen Träger adhärieren, daß die Abtrennung von hämatopoetischen Zellen von den Stromazellen ermöglicht wird, können die hämatopoetischen Zellen kontinuierlich zur Verwendung geerntet werden. Durch geeignete Wahl von Kombinationen von Wachstumsfaktoren können spezifische Zellinien der hämatopoetischen Zellen gezüchtet werden. Falls gewünscht, können die Stromazellen außerdem als Reservoir für transfizierende Viren zum Einschleusen von Genen in die hämatopoetischen Zellen dienen.
Auf alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung zitiert sind, wird hier vollinhaltlich Bezug genommen, als ob auf jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung speziell und einzeln vollinhaltlich Bezug genommen würde.
Offensichtlich sind in Anbetracht der obigen Ausführungen zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Es versteht sich daher von selbst, dass die Erfindung im Rahmen der anhängenden Ansprüche anders als hier speziell beschrieben ausgeführt werden kann.

Claims

Verfahren zum Erreichen einer ex vivo-Teilung humaner Stammzellen, umfassend die Kultivierung einer Zusammensetzung humaner Stammzellen in einem flüssigen Kulturmedium, wobei das Kulturmedium mit einer 50 bis 100%igen täglichen Austauschrate für eine Zelldichte von 1 × 10⁴ bis 1 × 10⁷ Zellen pro ml Kultur ausgetauscht wird, wobei die Kultur unter physiologisch verträglichen Bedingungen gehalten wird.
Verfahren zum Erreichen einer ex vivo-Teilung humaner Stammzellen, umfassend die Kultivierung einer Zusammensetzung humaner Stammzellen in einem flüssigen Kulturmedium, wobei das Kulturmedium mit einer wenigstens 50%igen täglichen Austauschrate ausgetauscht wird, wobei die Kultur unter physiologisch verträglichen Bedingungen gehalten wird.
Verfahren zum Erreichen einer ex vivo-Teilung humaner Stammzellen, umfassend die Kultivierung einer Zusammensetzung humaner Stammzellen in einem flüssigen Kulturmedium, wobei das flüssige Kultur-medium alle 3,5 Tage zu wenigstens 50% ausgetauscht wird, wobei die Kultur unter physiologisch verträglichen Bedingungen gehalten wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Kultivierung humaner Stammzellen, die im humanen hämatopoetischen System gefunden werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Kultivierung humaner Stammzellen, die im humanen Knochenmark gefunden werden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Verwendung eines Mediums, das IL-3, GM-CSF, Steel-Factor, Epo, IL-α, IL-1β, G-CSF, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, PDGF oder EFG enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Kultivierung einer Zusammensetzung humaner hämatopoetischer Stammzellen.