JPH06505151A - ヒト幹細胞含有組成物の培養方法及び形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト幹細胞含有組成物の培養方法及び形質転換方法技術分計 １旦技虚 正常成人の循環血液細胞は赤血球、白血球、血小板及びリンパ球を含むがこれら の細胞は骨髄内の細胞に由来する。骨髄内の細胞は非常に未分化な前駆細胞と呼 ばれる細胞に由来する。前駆細胞はメチルセルロースや寒天のような半固体の培 地中で１〜３週間培養すると分化した血液細胞が集まったコロニーを生ずること より検定出来る。前駆細胞それ自体も一種の前駆細胞である幹細胞と呼ばれる細 胞に由来している。幹細胞は分裂時に幹細胞自身の再生と前駆細胞への分化の両 方を行なう能力を有する。それ故分裂する幹細胞は未分化の幹細胞といくぶん分 化の進んだ前駆細胞を生産する。血液細胞を生産する他に幹細胞は骨芽細胞と破 骨細胞をも生産すると考えら江多分他組織の細胞も幹細胞から派生するであろう 。この明細書はヒト造血幹細胞の最初のインビトロ培養を成功させた方法及び組 成物を記述する。この方法により造血幹細胞は増殖し、前駆細胞及びより成熟し た血液細胞に分化した。

１９７０年代の後半、造血骨髄細胞をインビトロで増殖させる液体培養系が発達 した。この培養系は、正常及び白血病の造血の分析及びレトロウィルス媒介によ る遺伝子導入の様な骨髄の実験的操作に非常に重要な価値を持つ可能性がある。

この培養系を用いてマウスの造血の詳細な分析が可能になりマウス系の細部が理 解出来る様になった。更に培養マウス骨髄細胞へのレトロウィルス遺伝子導入を 可能にした。このことはマウス造血細胞に標識を付けることを可能にし、多機能 幹細胞の存在を証明し、白血病発生の過程に於ける種々の遺伝子の研究を可能に した。

しかしレトロウィルス遺伝子を培養マウス骨髄細胞に導入することは可能になっ たが、培養ヒト骨髄細胞に遺伝子導入することは未だ不可能である。なぜなら現 在に至るまでヒト骨髄細胞の長期培養は、その培養期間を長く出来ない事と、幹 細胞を生存させておき前駆細胞を生産する能力を維持する事が出来ないという制 限があるからである。

ヒト骨髄細胞の液体培養は最初は造血能力が制限されており、生産される前駆細 胞や分化した血液細胞数は減少し、６週から８週の培養で細胞生産は停止した。

その後この系に種々の修正がなされたが僅かな改善が見られたたけであった。こ の問題を解決することは非常に価値のあることである。もし成功すればヒト幹細 胞及び前駆細胞を増加させることが出来、骨髄移植、化学療法からの保護に使用 し、そのような細胞を選択、操作して遺伝子導入に使い、また分化した血液細胞 を生産し、輸血療法に用いることも可能になる。

造血とインビトロ骨髄液体培養の研究は付着層内の繊維芽細胞と内皮細胞が中心 細胞基質の要素であることを明らかにした。これらの細胞は増殖している造血細 胞に付着する場を与えると共に前駆細胞の増殖と分化を促進する造血細胞増殖因 子を誘導することが出来る。これらの造血細胞増殖因子は、顆粒球コロニー刺激 因子（Ｇ−Ｃ８Ｆ）　、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ ）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）等を含む。

しかしそのような付着層上でのヒト骨髄細胞インビトロ培養はたいていはうまく 行かなかった。マウスや木ネズミ（ｔｒｅｅ　ｓｈｒｅｗ）の骨髄細胞は液体培 養出来るがヒト液体骨髄培養は非付着性の造血前駆細胞或いはクローンを形成す る前駆細胞を６〜８週間以上十分な量を生産しない。３〜５力月保持する培養が 報告されたが、幹細胞から前駆細胞を安定して４〜６週以上生産し続ける細胞培 養は報告されていない。

更に、非付着性細胞及び前駆細胞の生産はこれらの培養の短い生存期間中に典型 的に低下するので、幹細胞が生きのびているのか増殖しているのかはつきりしな い。分離して調べて見ると刺激を受けない骨髄基質細胞は、検出し得る諸造血増 殖因子（ＨＧＦｓ）を殆ど分泌しない。

これらの培養中に安定した前駆細胞及び分化した血液細胞の生産が見られないこ とから、これらの培養は幹細胞の連続的再生、拡大を支持出来ないものと考えら れた。それゆえこれらの培養はある必須の幹細胞刺激因子を欠いているか及び／ 又は新しい幹細胞阻害因子を含んでいるものと仮定された。ＨＧＦを検出できな い事と基質細胞が誘導されていない事の説明はなされたが、ＨＧＦの検出できな い事とヒト骨髄液体培養が他の種の動物のそれと比較して成功しない事を説明す る、検証され得る仮説は、インビトロの培養系は付着性骨髄基質細胞がインビボ で持つ総合造血支援機能を提供しないと言うものである。

骨髄移植のための幹細胞と前駆細胞の増殖はヒト長期骨髄培養に応用出来る可能 性がある。ヒトの自己及び同種骨髄移植は現在、白血病、リンパ腫或いは他の生 命を脅かす病気の治療法として行なわれている。この治療法に於いて十分な細胞 を移植するためには、供与者の骨髄を大量に採集しなければならない。

幹細胞と前駆細胞を増殖させる培養は大量の骨髄供与の必要性を減少させ、小量 の骨髄の供与を受け、受血者に輸血する前にインビトロで幹細胞と前駆細胞を増 殖させることを可能にする。小量の幹細胞及び前駆細胞が血流中に存在すること が知られている。もしこれらの幹細胞と前駆細胞を泳動法により採集し、増殖さ せる事が可能であれば、移植に必要な数の幹細胞と前駆細胞を末梢血から採集し 、骨髄供与の必要性を除くことができる。

骨髄移植には患者の体重１ｋｇ当り約ｌＸｌ０’から２Ｘ１０’の骨髄単核細胞 を移植しなければならない。これは体重７０ｋｇの受血者は７０ｍ１ｌの骨髄供 与を必要とすることになる。７０顧の骨髄は供与者の骨髄のほんの一部ではある が、供与過程で供与者に強度の処置を必要とし、多量の血液が失われる。もし幹 細胞と前駆細胞を１０倍に増やすことが出来れば、供与過程は大巾に軽減し、末 梢血から幹細胞と前駆細胞を採集しこれを増殖させて用いることが可能になるか も知れない。

前駆細胞の増殖が可能になれば、化学療法の補助として有用であろう。これもま たヒト骨髄長期培養の応用のひとつである。癌治療医のジレンマは殆どの化学療 法剤は細胞分裂している全ての細胞を殺すことにより癌細胞を破壊すると言うこ とである。骨髄は体内で最も増殖の盛んな組織のひとつで、それゆえ最初に化学 療法剤で損傷をうける器官であることが多い。その結果血液細胞生産能は化学療 法を行なっている期間急速に破壊されるので、化学療法を中止し造血系が血液細 胞を回復するのを待たなければ、患者に化学療法を再び行なう事は出来ない。

静止幹細胞が活性化して化学療法を再開できるに十分な白血球数に回復するまで は１力月かそれ以上かかるかも知れない。そして２回目の化学療法中も血球数の 降下は繰り返される。化学療法の間隙期間に血球が再生されるが、不幸にして癌 細胞もこの期間に増殖し自然淘汰されて化学療法剤に対して耐性を持つようにな る可能性がある。

化学療法間の間隙時間を短くするために大量の前駆細胞と未分化の血液細胞を患 者に戻すことが出来る。この方法により患者の血球数が低くなる時間を大巾に短 縮でき、化学療法の再開を早めることが出来る。化学療法の期間が長いほど、ま た化学療法間の間隙時間が短いほど癌細胞を殺すことに成功する可能性は高くな る。

前駆細胞を増殖させるに必要な造血細胞は骨髄回収か或いは末梢血採集に依って 得られる。骨髄採集により約４ｘｌＯ’　ＣＦＵ−ＧＭ前駆細胞を得ることが出 来る。５リツトルの末梢血から泳動により１０’　ＣＦＵ−ＧＭが得られるが、 供与者をＧＭ−Ｃ８Ｆで前処理することにより１０’　ＣＦＵ−ＧＭに増やすこ とが可能である。患者の急速な回復にはｌＸｌ０’から５ｘｌＯ８ＣＦＵ−ＧＭ が必要であるが、これは通常の骨髄供与或いは末梢血供与で得られる量の１００ 倍から１０００倍である。

それ故、骨髄或いは末梢血のＣＦＵ−ＧＭを１００倍から１０００倍増やすこと が出来れば、抗癌剤投与、癌の治療に重要な影響を与えるであろう。

遺伝子療法は医学の中で急速に進歩している分野であり、計り知れない臨床応用 の可能性を持っている。遺伝子療法は病気の治療に数多くの応用の可能性が考え られ、それに関して広範囲に論評されている。例として下記の参照文献を挙げら れる： Ｂｏｇｇｓ、Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、（１９９０１８：８０ −９６、Ｋｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｖｅ唐煤B （１９８９）　７　（２１：１７９−１９２、Ｌｅｈｎ、　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒ ｏｗ　Ｔｒａｎｓｐ、（１９９０１５：２８７−２９３、及■ Ｖｅｒｍａ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ、（１９９０１ｐｐ、　６８− ８４゜遺伝的形質転換したヒト幹細胞は遺伝子療法の手段として臨床医学に広く 応用出来る可能性がある。

遺伝子療法は従来の医療から発展してきた臨床療法に新しい方法を加えた。何世 紀もかけて進歩してきた最古の医療は組数な外科処置と天然混合物を医薬として 投与することであった。前世紀になって生化学的薬理学が医療の主たる方法とし て現われた。この範例の下では純粋な生化学的分子が患者に与えられる。一般的 にそのような薬剤は毒薬（例えば抗生物質或いは抗癌剤など）、内在の受容体を 刺激する生理的模倣剤（例えば阿片やアドレナリン拮抗剤）或いは内在受容体を 刺激する生理的拮抗薬（例えば血圧降下剤や麻酔剤）である。

遺伝子療法はその定義によれば医療目的で細胞内に遺伝子を挿入することである 。遺伝子療法の背景にある原則は薬理学的物質を投与するよりもむしろ、機能す る遺伝子を導入して、そのＲＮＡ或いは蛋白生産物が目的細胞或いは組織に希望 する生化学的効果をもたらすことである。遺伝子療法が古典的な生化学的薬理学 に較べて有利である可能性のあるのは次の理由による。第一に、導入された遺伝 子は蛋白やＲＮＡを含めて非常に複雑な分子を造ることが出来る。これらの分子 自体を投与して目標に到達させるのは非常に困難か不可能である。次に、希望す る遺伝子を特定の目標細胞に制御導入すれば特定の組織でその遺伝子生成物の生 産を制御出来る。最後に遺伝子療法は、遺伝子が目標細胞とその子孫細胞内で機 能し続けるので原則として個体内では永久的である。

遺伝子治療を成功に導く為には幾つかの問題を解決しなければならない。第一に 、希望する治療遺伝子を選択した細胞に導入することが出来なければならない。

第二に、その遺伝子は目標細胞内で十分に発現し、遺伝子の生成物が適当なレベ ルに達しなくてはならない。最後にＲＮＡ或いは蛋白生成物は目標細胞内で適当 に処理されて機能を持ち、臨床治療としての意味を持たなければならない。ヒト 細胞に遺伝子をインビトロで導入する数種の方法を表１に示しである。

表１；ＤＮＡ導入法の比較 相同組換えの様な他の方法も多くの研究室で開発された。遺伝子療法の研究はこ こ数年来進行中でインビトロでの数種の細胞タイプに於ける実験から、動物実験 に進み最近ヒトの臨床試験の段階に入ったものもある。

造血系は遺伝子療法の導入系としては理想的な対象である。造血細胞は骨髄吸引 或いは末梢血を採集することにより容易に得ることが出来る。インビトロでの遺 伝子導入が成功すれば、処理された細胞は静脈より再注入され骨髄に到達し、そ こで増殖する。分化した血液細胞は体内を循環しているので遺伝子を改変された 細胞は特定の遺伝子生成物を希望するどの組織にも導入することが出来る。

最も重要な事は造血組織は非常に強い（多分無限の）自己再生能力を持つ幹細胞 を含んでいる事である。この事はもし遺伝子がこれらの幹細胞に安定して導入さ れれば造血組織に再注入した際これらの変化した幹細胞は増殖し、骨髄を新しい 遺伝子を表現している細胞で再び満たすことが出来る事を意味する。これにより 長期間の、多分−生の間の希望する遺伝子生成物の供給を可能にするであろう。

同様にして他の組織に存在する幹細胞や胚幹細胞に遺伝子を導入する事に成功す れば同様に長期にわたる、希望する遺伝子生成物の供給が可能になる。

造血幹細胞の遺伝子療法は造血系に特有の病気にも他の器官系の病気にも広い応 用が可能である。造血系の病気は遺伝性であっても、後天的であっても遺伝子療 法での治療が可能である。例えばアルファ及びベータ・タラセミアのようなヘモ グロビン異常はグロビンのアルファ又はベータ鎖をコードする遺伝子と高度の組 織特異性を与える制御配列を導入する事により治療する事が出来る。（Ｇｒａｓ ｓｙｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８７１５１：９７５−９８８参照 ）。同様に鎌型赤血球性貧血は胎児グロビン遺伝子を造血幹細胞に導入する事に より治すことが出来る。なぜなら制御された胎児ヘモグロビンの高度の発現は鎌 状ヘモグロビンの存在にも拘らず赤血球の鎌型化を防ぐに十分であるからである 。（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ。

＋１９７９＋　１３３：４３５参照）。

白血球付着不全（ＬＡＤ）或いは慢性肉芽腫病（ＣＯＤ）のような、機能的蛋白 不全によって引き起こされる好中球の遺伝子病は欠陥遺伝子や欠損遺伝子を高度 の組織特異性を与える制御配列と共に造血幹細胞に導入する事により治療する事 が出来る（Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　２４ ８：１４１３−１４１６参照）。フォンウィレンブランッ（ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅ ｂｒａｎｄｓｏ）病のような血小板に関する遺伝病はウィレンブランッ（Ｗｉｌ ｌｅｂｒａｎｄｓ）因子をコードする遺伝子とその遺伝子を発現させ、その生成 物を分泌させる配列とを導入することにより治す事が出来る。

アデノシン・デアミナーゼの欠損による重度複合免疫不全のようなリンパ球免疫 不全病を造血幹細胞遺伝子療法で治療するのが特に適していることは明らかであ る。ＡＤＡ遺伝子を用いて循環Ｔ細胞をレトロウィルス遺伝子療法で治療する方 法は、この病気の患者の臨床上の免疫不全経験を減少させるのに成功したが、遺 伝子を導入したＴリンパ球は生体内では限られた寿命しか無いため効果は一時的 なものであった（Ｋａｓｉｄ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡＩ　（１９９０１８７：４７３−４７７、或いはＣｕ１ｖ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡＩ 、（１９９１１８８：３１５５−３P９ ５参照）。しかしながら、もし遺伝子を造血幹細胞に導入出来れば、これらの幹 細胞から派生するＴリンパ球はＡＤＡ遺伝子を含み発現することであろう。それ 故遺伝子導入した幹細胞は患者の生涯生存し増殖を続けるであろうから、Ｔ細胞 ＡＤＡ不全は幹細胞の一回の遺伝子療法で永久的に治療出来る（Ｗｉｌｓｏｎ　 ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡＩ、（１９９０１８７： ４３９−４４３参照）。

造血素の遺伝的な酵素異常の治療に加えて、幹細胞遺伝子療法は幹細胞とその子 孫をウーイルスや化学療法剤のような外来作用物から保護するにも有用であるか も知れない。例えばＨＩＶのＴＡＴＩ−ランス活性化因子の゛ｒＡＲ結曾位結電 位置・ドするＤＮＡ配列を導入領るどＴ細胞をＨＩ　■つ・１゛ルスの感象・か ら保護することが示され！：　（Ｓｕｌｌｅｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ　Ｃｅ１ｌ　（ １９９０１６３：６０１−６０８参１？４）、、５二の配列を造血幹細胞に導入 し安定さぜれば１７れらの幹細胞から派生したＨＩＶの伝染に比較的あるいは絶 対的に抵抗を持つ′ｆ細胞のプ＝−ルが出来る。

同様にして多薬剤耐性遺伝子或いはメトトレキセート耐性遺伝ｒをコードする遺 伝子をピ斗骨髄幹細胞に導入ケるのに成功すると癌の化学療法の影響に比較的耐 性のある幹細胞を造り出す事が出来る３、これらの遺伝子操作された細胞′で自 己骨髄移植を行なった後は患者は抗癌剤に依・、〕で普通引き起こされる深刻な 骨髄抑制から幹細胞が保護される事より抗癌剤（ごよる化学療法に耐えることが 出来る。

これにより患者は癌化学療法剤のより効果的な使用量を、より少ない毒性で受け る事が出来る。

造血幹細胞遺伝子療法が白血病、リンパ腫及び再生不良性貧血等の後天的造血病 に対して有用である、〕とを予想する事はたやすい。一度これらの病気の遺伝的 原因が発見されたなら、その遺伝子生成物を投与し細胞内の異常遺伝子の生成物 を克服するか、或いは直接遺伝子異常を修正する（多分遺伝子を切り外し、置換 することにより）様な遺伝子を導入することにより異常を修正出来るであろう。

しかし更に広い１ノベルでは造血幹細胞遺伝子療法は造血系以外の病気の治療に も有用である可能性がある。治療効果のある司溶性蛋白をコードするＤＮＡ配列 の遺伝子導入を１−れば、′８望劃るｌの、治療効果のある分子を恒久的に分泌 する分化した血液細胞を生産することが出来る。例としてはこの方法は、例えば インスリン遺伝子を持つＤＮＡ配列とインスリン遺伝子の発現を適切に調節をす る（多分血中グルコースのレベルの上昇に反応して）調節遺伝子配列を導入して 糖尿病の治療に当てるのに有用である。全身性の高血圧は幹細胞にアンギオテン シン変換酵素、血管平滑筋のカルシウム・チャンネル或いはアドレナリン受容体 等の拮抗的阻害剤として機能する分泌ペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入す ることにより治療が可能である。アルツハイマー病は中枢神経系内のアミロイド のプラクを破壊する酵素をコードするＤＮＡ配列を幹細胞に導入する事により治 療可能であるかも知れない７、 遺伝子療法の多くの応用、特に幹細胞への遺伝子導入はよく知られており、広範 に論評されている（Ｂｏ（ｇｓ　ｅｔ　ａｌ、上記、Ｋｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、　 上記、Ｌｅｈｎ＋　ｉ記、及びＶｅｒｍａ　ｃｔ、　ａｌ、　ｌ記）４、分化し 、たヒト幹細胞への治療的遺伝子導入（例えばＴリンパ球への）のある程度の成 功例が増加している（Ｋａ１８ｄ　ｅｔ　ａｌ　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ、　Ａｅａ ｄ、　Ｓｅｉ、ｆＵｓＡｌ　（１９１１０１８７：４７３−４７７、Ｃｕ１ｖｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、、　Ａｃａｄ、@Ｓｅｉ、（Ｕ ＳＡ）　（１９９１１８８：３１５５−３１５９参照）。

不幸に１１．てこの発明の以前にはヒト幹細胞への遺伝子導入をして安定化する 事に成功した例は無い。幾つかの研究グループがヒト造血細胞へ、ヒトのシト１ コウイルスを使って遺伝子導入が可能であることを示したが、ヒト未分化造廂幹 細胞への導入に成功した例は無い。これはレトロウィルス媒介による造血細胞へ の遺伝子導入がある程度可能であるマウスに於ける実験と対照的である（Ｗｉｌ ｓｏｎ　ｅｔａｌ、　Ｐｒｏ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　 （１９９０）　８７：４３９−４４３参照）。

ヒトの造血幹細胞遺伝子療法が成功しなかった主たる原因は幹細胞が分裂、増殖 している状態でヒト造血細胞に遺伝子を導入出来なかった為であった。目標細胞 に遺伝子を安定導入するのに成功するにはその目標細胞が少なくとも１回細胞分 裂をしなければならない。それ故、導入り、たい遺伝子の存在下でも幹細胞が分 裂していなければ、遺伝子は幹細胞に安定に導入されない。本発明以前は、体外 でのヒト幹細胞の分裂と増殖を支持する系は存在せず、ヒト幹細胞の遺伝的形質 転換も可能ではなかった。

本発明に関連する文献を以下に記述する。米国特許Ｎｏ、　４．７２１．０９６ は造血細胞の増殖用の、基質細胞を含む三次元系を記述している。その特許の中 に言及しである文献も参照のこと。グランビル等はマウスのメタロチオネイン− ■遺伝子について記述した（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ 　（１９８１１２９２＋２６７−２８９）　ｏウオングらはヒトＧＭ−Ｃ３Ｆに ついて記述しくＷｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２ ８：８１０−８１５）、レミシュ力等はレトロウィルス媒介の遺伝子導入を造血 幹細胞のマーカーとして利用し、これらの幹細胞が生体に移植された後どうなる かを記述している（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８６ １４５：９１７−９２７）　。ヤン等はヒトＩＬ−３について（Ｙａｎｇ　ｅｔ 　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８６）　４７：３−１０）　、チェノ等はプラスミ ドＤＮＡによる噴孔動物細胞の形質転換について（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍ ｏｌ。Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８７１７：２７４５−２７５２）、グリ ーヴエス等はヒトＣＤ２遺伝子について（Ｇｒｅａｖｅｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ １ｌ　ｆ１９８９）　５６：９７５−９８６）　、シヴイン等はＣＤ３４抗原に ついて（Ｃｉｖｉｒ＋　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８４）　 １３３＋１５７６）　、マーチン等はヒト５−Ｃ３Ｆについて（Ｍａｒｔｉｎ　 ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ＋１９９０）　６３：２０３−２１１）　、フォレスタ ー等はパラレル・フロー・チャンバーについて（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４１，７０＋９３−１１０） 　、またクロンベル等は静止培養に於いてＣＭＬ細胞が失われる事を（Ｃｏｕｌ ｏｍｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　ｆ１９８６１７５：９６１）それぞれ記述している。

それ故ヒト幹細胞の生体外増殖及び安定遺伝的形質転換のための方法及び組成物 、並びにヒト造血前駆細胞培養の最適条件を見出す必要がある。特に幹細胞増殖 、前駆細胞増殖、また遺伝子療法の重要性を考えた場合、その必要性は更に重大 である。不幸にして、今日までそのような目的を達成しようとする試みは期待外 れであった。

光咲Ω皿示 本発明の目的はヒト幹細胞の生体外増殖と安定遺伝子形質転換にのための、培地 の条件、反応器等を包含する新規の方法を提供することである。

本発明の他の目的は（ｉ＋ヒト造血前駆細胞培養及びｆｉｉ）ヒト造血前駆細胞 の安定遺伝子形質転換の最適条件の為の培地条件及び反応器を包含する新規の方 法を提供することである。

本発明はヒト幹細胞の生体外分裂と安定遺伝子形質転換に関する、及び／又は、 ヒト造血前駆細胞培養の最適化に関する、培地の条件、反応器等を包含する新規 の方法を本発明者が発見した事に基づいている。これらの方法はヒト幹細胞及び ／又はヒト造血前駆細胞を液体培地中で培養する方法である。この方法に於いて 、液体培地を２４時間から４８時間の間に１ｍ１１の培養を１ｍ（ｔの培地で連 続的に或いは定期的に（好ましくは潅流により）置換し、代謝生成物を除去し、 減少した栄養素を補い、培養を生理的に適当な状態に維持する。本発明の特に好 ましい実施態様に於いて、上記の培地置換速度は急速に交換される培地に造血増 殖因子を添加する条件に関連して決定される。

本発明者らは急速に交換される培地に最適量の造血増殖因子を添加し、本発明に 従って培地交換速度を増加した場合、驚くべきことに［＋１培養中でヒト幹細胞 が少なくとも５力月間の長期間増殖を続け、（２）培養中でヒト造血前駆細胞が ヒト幹細胞の分裂と分化により少なくとも５力月間の長期間生産され、そして（ ３）ヒト骨髄基質細胞を包含するヒト基質細胞の代謝を活発にし、ＧＭ−Ｃ８Ｆ 分泌を活性化する。本発明は培養に於いてヒト幹細胞の生存と増殖を初めて可能 にした。

本発明はまた、ヒト幹細胞の連続的増殖を支持する体外培養系を提供し、ヒト幹 細胞に遺伝子を導入することを可能にし、遺伝的に安定な形質転換したヒト幹細 胞を得る事に成功した。この発明の実施態様は組換えレトロウィルス、或いは細 胞分裂を必要とする他の遺伝子導入ベクターに組み込ませる事の可能なとのよう な遺伝子の導入にも用いることが出来る。この方法によって製造される遺伝的に 変化したヒト幹細胞は、先に述べた様に臨床的な病気に広範に適用する事が可能 である。

本発明はまた、ヒト造血前駆細胞への遺伝子導入の効率を高める方法を提供する と同時に遺伝的に安定な形質転換したヒト幹細胞及び／又は遺伝的に安定な形質 転換したヒト造血前駆細胞を提供する。

本発明は培養中の造血細胞、特に幹細胞を包含する分化の初期段階の細胞の効率 的な増殖をさせるための反応器及び組成物を提供する。本方法は通常の方法で形 質転換した基質細胞を用いる。その基質細胞は成長因子の本質的な或いは誘導的 な生成を提供し、その細胞は物理的に分離していて造血細胞の分離を容易にする 。連続的潅流を行い適宜細胞のリサイクルを行なう事により、生存し得る造血細 胞を高密度、高収量で得る事が出来る。本反応器は基質細胞に蛋白性の表面を用 い、基質細胞と造血細胞の分離を維持する為に表面或いは他の障壁を用いる。

２面り固！望購吸 図１は潅流室の概略を示す。

図２は潅流培地通路の概略及びフロー・ダイアグラムを図示している。

図３ａは細胞分離のせん断応力を測定する為のフローチャンバーの概略を示す。

図３ｂは図３ａのフローチャンバーの側面を示す。

図３０は造血細胞のせん断応力・プロフィールのグラフである。

図４ａ及び４ｂは造血細胞の増殖、分離用のフローチャンバーの上面及び側面図 である。

図５ａ及び５ｂは基質細胞の連続増殖を可能にするために障壁を順番に取り除い たフローチャンバーの概略を示す。

養に用いられる様な）用の標準系に応用された場合いっても認められる。本発明 の方法に従い、補足的に造血増殖因子を最適濃度に培養に添加し、急速培地交換 速度を用いた場合、本発明者は、驚いた事に、ヒト造血液体培養の標準系を作る 事が出来る事を発見した。その培養は馬、子牛、牛胎児より得られた血清、血漿 又はヒト血清の存在下又は非存在下で実施される培養を含み、質的に優れた操作 で実施できる。

本発明の方法に従って用いられるヒト造血液体培養は１ｍＱ当り１０４から１０ ’細胞の細胞密度で、血清アルブミン、コレステロール及び／又はレシチン、セ レニウム及び無機塩と共に用いる事の出来る既知の標準培地組成（例えばＩＭＤ Ｍ、　ＭＥＭ、　ＤＭＥＭ、　ＲＰＭＩ　１６４０．　Ａｌｐｈａ　Ｍｅｄｉｕ ｍ或いはＭｃＣｏｙ’　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍｌを用いて行なう事が出来る。知られ ている様に、これらの培養は１０−４から１０−７Ｍの濃度のハイドロコーチシ ンの様なコルチコステロイドを補っても良いし、コーチシン、デキサメタシン或 いはソルメドロールの様な他のコルチコステロイドを同じ効果を持つ濃度で補っ ても良い。これらの培養は普通はほぼ生理的なｐＨ９例えば６．９から７．４で 行なわれる。培地は普通４から２０容積％の酸素、好ましくは６から８容積％の 酸素、を含む気相に曝される。

これらの標準培養技術を用いて細胞塊は希望する量に、例えば含まれる幹細胞或 いは造血前駆細胞の量を１０００倍又はそれ以上に増やす事が出来る。負選択法 或いは陽選択法に相当する、異なった既知の方法をこの増大を達成する為に用い る事が出来る。例えば負選択法に相当する例としては分化した細胞は免疫学的技 術を用いて除去される。その免疫学的技術とは例えば非前駆、非幹細胞を一部の マウス抗ヒトモノクローナル抗体で標識し、マウス抗体で覆われた細胞をウサギ 抗マウスＩｇでコートしたプラスチックに付着させて除去する技術である（Ｅｍ ｅｒｓ。

ｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、ｆ１９８５１７６：１２ ８６−１２９０）。

本発明は上記のすべての条件の下でヒト骨髄液体培養条件の根本的な改良、つま り急速栄養培地交換、に依存するものである。標準培養計画は毎週培地と血清の 交換を必要とする。これは１週間に一度培地と血清を交換するか或いは１週間に 二度培地と血清を半分ずつ交換することによってなされる。本発明によれば培養 の栄養培地は連続的に或いは定期的に、好ましくは潅流法により、１ｍ１１当り ２×１０６からｌＸｌ０’の細胞密度の培養に対し２４時間から４８時間の間に 置換される。

細胞密度が１ｍ１１当りｌＸｌ０’から２　Ｘ　１０’の場合は同じ培地交換速 度が用いられる。

細胞密度が１ｍＱ当り１０７以上の場合には培地交換速度は単位時間、細胞当り の培地と血清の流量が一定になるように比例して増加させることが出来る。

本発明による栄養培地の交換は、培地を交換する結果を達成できればいかなる方 法を用いることも可能である。例えば一定量の消費された培地を除き、一定量の 新鮮な培地を加える方法などである。加えられる一定量の培地の流れは重力、ポ ンプその他の適当な手段による。培養の配列構成と包装に依存して培地はいずれ の一方向にも或いは多方向にも流す事が可能である。好ましくは新しい培地は細 胞塊に接触する様に加えられるべきである。生体内の潅流を模倣する方法で培養 に加えられるのが最も望ましい。即ち少なくとも細胞塊の一部を潅流し、そして 全細胞塊まで潅流する方法である。

他の任意のしかし重要な本発明の実施態様は合成造血増殖因子を含む、造血増殖 因子を急速培地交換培養に添加する事にある。この実施態様の特に好ましい態様 は、サイトカインＩＬ−３とＧＭ−Ｃ８Ｆの両方を培地に１日当り０．１から１ １００ｎ／ｍＱの割合で添加する事である。好ましい割合は１日当り０．５から １０ｎｇ／Ｔｎｆｌであり、更に最も好ましい割合は１日当り１から２　ｎｇ／ ｎｉｌである。Ｅｐｏを栄養培地に１日当り０．００１から１０Ｕ／媛、好まし くは０．０５から０．１５Ｕ／ｍ１２添加する事が出来る。

マスト細胞増殖因子（ＭＣＦ、Ｃ−キラトリ力ンド、スチール因子）を培地に１ 日当り１から１１００ｎ／ｍＱ、好ましくは１０から５０ｎｇ／ｍｕ添加する事 が出来る。ＩＬ−１（アルファ又はベータ）を３日から５日の期間に１０から１ ００Ｕ／ｍｆｌｉ加する事が出来る。更にＩＬ−６，Ｇ−Ｃ３Ｆ、基本線維芽細 胞増殖因子、ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＰＤＧ Ｆ或いはＥＧＦを１日当り１から１１００ｎ／ｍ１１ｍ加することもできる。

本発明者は、ＩＬ−３、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＥｐｏを上記の様に用いた場合、特異 的に赤血球細胞を産生ずる系統を得る事を発見した。代りにＩＬ−３とＧＭ−Ｃ ８Ｆを（ＩＬ−６或いはＧ−Ｃ８Ｆを加えたり、加えなくとも）使用した場合は 、培養は顆粒球を優先的に生産する。本発明の培養で時間と共にＴ及びＢリンパ 球が失われる事を本発明者は発見した。

培地中の代謝生成物のレベルは通常特定の範囲に維持される。グルコースの濃度 は通常５から２０ｍＭの範囲に維持される。乳酸塩の濃度は通常３５鯨下に維持 される。グルタミンの濃度は一般的に１から３ｍＭの範囲に維持される。アンモ ニウム塩の濃度は通常２．４威以下に維持されている。これらの濃度は定期的に 或いはオンラインで連続的に既知の方法を用いて監視する事が出来る（Ｃａｌｄ ｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌＪ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、［９９１）　１４７ ：３４４−３５３参照）。

本発明に従って培養出来る細胞はあらゆるヒト幹細胞或いはヒト幹細胞を含む細 胞塊である。細胞塊はヒト末梢単核細胞、ヒト骨髄細胞、ヒト胎児肝臓細胞、胚 幹細胞及び／叉はヒト謄帯血細胞を包含する。これらの細胞塊はヒト幹細胞及び ／又はヒト造血前駆細胞を含む。ヒト骨髄に見出されるいかなるヒト幹細胞も含 めて、ヒトの幹細胞を含む他の細胞塊も本発明に従って使用出来る可能性がある 。

本発明の好ましい実施態様に於いて、細胞培養は細胞塊中のヒト幹細胞の含有量 を増加させる可能性がある。そのような含有量増加は上記の様にしてなされる可 能性があるが、本発明に従って用いられた場合、ヒト幹細胞（ヒト骨髄に存在す るヒト幹細胞及びヒト骨髄幹細胞を含む）に遺伝子導入による遺伝子療法の為の 最初の有用な手段を提供する。ヒト骨髄に存在する幹細胞はヒト骨髄、末梢血、 胎児肝臓或いはヒト謄帯血から得る事が出来る。

一般にこの実施態様に於いて、安定した遺伝的に形質転換したヒト幹細胞を得る 為に、レトロウィルスで感染したバンケンング細胞或いはそのようなパッヶジン グ細胞培養から得られた上清或いは他の遺伝子導入ベクターは本発明に従ってヒ ト幹細胞培養に加えられる。本発明は幹細胞と造血前駆細胞の分裂のレベルの増 加をもたらすが、対照的に従来の培養は造血前駆細胞の低レベルの分裂（つまり 減退している培養）を提供するのみであった。本発明の培養系によって初めて培 養での細胞の増加が可能になった。このことは細胞にレトロウィルスを感染させ るのに必要である。従来の系でレトロウィルス感染を減退細胞培養で行なったが 、従来の細胞にはレトロウィルス感染は起こらなかった。本発明は幹細胞のイン ビトロ・レトロウィルス感染を起こさせる非常に有効な方法を提供する。特別に 幹細胞の含有量を増加させた場合、更に特別に合成増殖因子を含む造血増殖因子 を用いた場合はレトロウィルス感染は更に有効である。

本発明者は組換えレトロウィルスを含む上清を培養に加えるとウィルスとそのウ ィルスが担う遺伝子がヒト（造血）幹細胞に導入される事を発見した。これらの 幹細胞の分裂と分化によって派生した前駆細胞及びこれらの前駆細胞が更に分裂 と分化を行なって出来た成熟した血液細胞はインビトロ造血細胞培養の期間中は 導入されたＤＮＡを含んでいた。本発明者は次の事を観察した。レトロウィルス が培養の初期にのみ加えられた場合、トランスフェクトされた前駆細胞と成熟し た血液細胞が得られたが、それ等の細胞は存在していた幹細胞が培養初期に増殖 し、安定な遺伝子導入を受けたものからのみ派生したものである。なぜならこの 系ではレトロウィルス感染細胞は隣接した細胞を感染させる事が出来ないからで ある。希望する遺伝子を含む前駆細胞とより成熟した細胞とは、それ故、初期の レトロウィルス感染期間に形質転換した、より未成熟の幹細胞より遺伝子を受け 継いでいる。

本発明のこの面でのより好ましい実施態様に於いては、骨髄、末梢血、胎児肝臓 或いは膀帯血から分離されたヒト造血細胞は、最初に、より成熟した血液細胞を 除去し幹細胞の含有率を増加させる。これは造血細胞を、成熟した血液細胞と、 骨髄前駆細胞のエピトープに反応するが幹細胞のエピトープとは反応しないマウ ス・モノクローナル抗体とをインキュベートし、それから標識された細胞をウサ ギ抗マウスＩｇ免疫吸着面に免疫吸着させて除去する事により達成される。その ようにして得られた無系統細胞（Ｌｉｎ−）を本発明に従ってレトロウィルス或 １、）ｉ；ｉ：他のベカピー゛、と共に培気ｆ　−゛）、、ｔｒｉ”；Ｋ　Ｉ、 ＜　Ｉ；瓢培背（ま（連４　（：：’＝　Ｆ　（的Ｊ、ＬべＬｔ　ｉ　ｍｇ／ｍ ｎ、／　Ｒ）　Ｍび［Ｎ、、、　３　（’Ｊ（’Ｊ：　１．、＝　＜ば１　ｍｇ ／ｍ（Ｉ／［１）　ノγｉ・在■・ｃ、■J加え、ｒ、、ｉ。

加えなく　（：ｔｒｉイが丁ＩＬ−”−１１（好：！　Ｌ　＜　ｉ；乃０［Ｊ／ ｍＱ／４目）、同ｌ゛５＜加え’ｉ：：　’ｌ：ｒ加λなく　”（１’）良いノ ｉ’　Ｃ−：λ゛ツトリタｌンド←、・°スト細胞増殖因子）（好ましく１．ｉ 、１０ツノＨ／ｍＱ／　［１）　’Ｄ存存在下行なう。

■、・１・ｌ−１つ・イルス感染は培希開始後２かつ）２１日、好ましく；は１ ０Ｉ＋−）ら１４１コ１１Ｊ゛槁地（、二組控えｉ、ｚ　ｉ□　Ｄつ・イルスで 感染Ｉ、た）７・１・ニー１ウイルス・・パッゲジング細胞培養；−、漬る・混 入１．．．？′Ｔ（例λば５から２０％容積／容積）行な）か或いはＬ　ｉ−ｒ λ−細胞を直接１．・トロウィルスで感染したしｉ−ｒ：ｊつ５イルス・パッケ ジング細胞の１−で培養して行な・うか或いは両方の方法を同時に行な・う、。

好ま１７＜は１／ドロウ、イルス」清を用い、ウィルス存在下での、インキュベ −１・ば１２日から１６目である。また好ましくはバッケジング細胞は集密近く まで増殖させ、培地を交換１．／、更に１２時間から１５時間インキュベートす る。それから培地を集めてヒト幹細胞のトランスフェクションに用いる。しかし この過程は必ずしも厳密に行なわれる必要は無く、）ノドロウ・イルス・パッケ ジング細胞のどのような１４清も使用して良い。本発明に依ればどのようなレト ロウィルス・パッヶジング細胞系（既知の）をどのような既知の方法でも用いる ことが可能である（Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０） 　２４８：１４１３−１４１６及び／叉はＳｕｌｌｅｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　 Ｃｅ１ｌ　（１９９O）　６ ：１６０１−６０８参照）。実例としてのバッケジング細胞系はＮＩＨ３Ｔ３細 胞及び腎臓癌細胞５６３７を含む。

遺伝子を発現させるのに適当なプロ千〜ター及びエンハンサ−要素と共に組換え レトロウィルスに挿入出来るいかなる遺伝子もヒト幹細胞及び造血前駆細胞に導 入することが出来る。本発明は培養の中で幹細胞の生存と増殖を可能とし、安定 してトランスフェクトされ遺伝的に変えられたヒト造血細胞を培養中で製造する 条件を初めて提供した。「安定してトランスフェクトされた」及び「安定して形 質転換された」という語は本明細書では外来のＤＮＡがヒト幹細胞染色体に導入 される事を意味する。これは本発明が体外で分裂しているヒト幹細胞をそのよう な外来のＤＮＡに曝すことを可能にした結果出来る様になったのである。

本発明に従って、少なくとも５力月の培養期間中、ヒト造血前駆細胞がヒト幹則 ｌｉＣ萌）ら重要と分化１．、、＝　Ｊ、’　＝）”’ｉＸ牛産ｉすＩ、る、ｌ 、−）なｊ７ｉ薬方法４・得る１−どがａ−＋來〈）。即Ｉ、＝１培養中での幹 細胞の生存ノー増殖を支持”べろ培養ｊｊ法を得ることゾ）〜出：）ｔ４　；Ａ 、、、本発明行が得２Ｘ：；−−〜−，’、’　ＩＪ：体外１−ト骨髄培羨の動 向を決定する非昂（こ重要）：ζ寂数（よ培地潅流速度（°すある。二”どを示 した。培地交換速度を従来の１週一度のダグペター速度から毎日培地交換をオる 、週当り７倍量に増加した場合体外造血に重要な影響がある事を本発明のデータ は示ｌ、た。本発明者によ）で行なわｉ］、１：実験に於ける全ての培養におい で、かなりの細胞が最初の３へ・４週の間「失われた。６−の後退の後、培養は 安定１．培地潅流速度の効果が」、りはっきりしＣきた。

培地交換速度、週当り３．５回が１￥Ｓ養の増殖を最も高め、また前駆細胞の生 産面から培養最長の寿命をもたらした。特に注意すべき点は４から１０週目上か げ″（“ｊ２週毎の非付着性細胞の生産数は恒常的であるか又は増加した。

培養の全期間に亙って、３６５週以降に生産された細胞の累積数は、従来のテグ スター法で生産された場合の殆と３倍であった。更に前駆細胞の安定生産は１８ 週まで維持されていた。

ヒト骨髄にあるような基質細胞は、本発明の培養中に存在してもよいし、存在し なくてもよい。典型的な培養に於いては基質細胞は細胞培養中に１０００分の１ から１０分の１（基質細胞数／全細胞数）存在している。

本発明の他の一面に於いて、本発明者は驚いたことには、本発明の培養はヒト骨 髄基質細胞の代謝活性を促進し、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ−６の分泌を高める事を 発見した。ＧＭ−Ｃ８Ｆはヒト骨髄基質細胞上清中には検出されないが、本発明 に従った急速培地交換はヒト骨髄基質細胞を刺激して３００セントグラム／ｍＱ １日から２００ピコグラム／ｍＱ、７日のＧＭ−Ｃ３Ｆを分泌させた。ヒト骨髄 基質細胞によるＩＴ、−６の分泌もまた本発明に従った急速培地交換により１〜 ２ｎｇ／＋＋ｄ１７日から２〜４ｎｇ／ｍ＋１７日増加した。この増加は本発明 の急速培地交換速度を用いた時にも、またその急速培地交換速度を用いると共に 造血増殖因子を添加した場合のいずれにも観察された。本発明者によって得られ たデータに基づいて本発明の急速培地交換速度のヒト基質細胞サイトカイン生産 能に及ぼす影響は、どのような複合組織培養中の基質細胞においても観察される はずである。

実例として、本発明に従って用いられる培地は３つの基本成分よりなる。第１の 成分はＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭ１１６４０．アルファ培地或いはマ ツコイの培地或いは既知の培養培地成分である。第２は血清成分である。これは 少なくとも、馬血清、ヒト血清を含み、更に随意的に牛胎児血清、牛新生児血清 及び／又は子牛血清から成る。第３の成分はハイドロコーチシン、コーチシン、 デキサメサシン、ソルメドロール或いはこれらの組み合わせ、好ましくはハイド ロコーチシンの様なコルチコステロイドである。

使用出来る種々の培地の成分を以下に示す。

イスコブの改変ダルベコ培地（ＩＭＤＭ）’−’・３７フコイの５Ａ培地ｍυｔ ・ｈａ １．１１ｃｃｏｙ、　Ｔ　入、　ｌＬＩｒｗｅｌｌ、　Ｌ　ａｌｌｄＫｒｕｘ　 Ｐ、Ｐ、　（ｌＪ５９）Ｐｒｏｅ、　Ｓｏｃ、　ｂｐｅｒ、@Ｂｉｏｌ、　１ｉ ａ１．１０α１１５ ２、に丁Ｃ１ｍにｅｌｌｏｇ−〇、Ｓ、、Ｊｒ、（１％コ）Ｊ、１ｌａｔ、Ｃａ ｎｃａｒＩ＋＋ｓＬ、ａ２２Ｌ３、　＋ｗａｋａｔＬＳ、　ａｎｄ　ｃｒａｃｅ 、　Ｊ、　Ｔ、、　Ｊｒ、　＋１％４）Ｎ、　Ｙ、　Ｊ、　ｌｋｄ、　６４　： 　］＆　２Q７９ ａ、　ＨＣＩ　ｆＯｒｍ　ｌ１ｓｔｅ＋Ｉ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ＣａｗｉＬｔｅａ　Ｉｎ@Ｖｉｔｒｏ（１９ ７４）９　：　ｉ ｂ、　１ｂｎｏｈｙｄｒａ＋ｅ　ｆｏｒｍ　１ｉｓｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｔｉ ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　５ｔｖｄａｒｄｓ　Ｃｏａ＋５奄奄狽■＝@Ｉｎ　 Ｖｉｔｒｏ（１９７４＋９　住血清成分は培地中に少なくとも１％（Ｖ／Ｖ）か ら５０％（Ｖ／Ｖ）存在し得る。血清濃度は好ましくは１５から３０％（Ｖ／Ｖ ）付近である。血清濃度を高める場合は交換速度を比例して増加させる。第３の 成分は１０−７Ｍから１０’Ｍ存在し得るが、好ましくは５　Ｘ　１０−’から ５　Ｘ　１０−５Ｍである。培地の成分は３つの成分を加えた時に１００％にな る様に構成されている。選択的に、血清成分は数種存在する標準的な代用血清混 合物のどれとも交換できる。典型的な代用血清混合物はインスリン、アルブミン 、及びレシチンかコレステロールを含む。以下の文献を参照：　Ｍｉｇｌｉａｃ ｃｉｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｘｐ、　）Ｉｅｍａｔｏｌ、　（１９９０１１８：１ ０４９−１０５５、ｌ５ｃｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｘｐ、　bｅ１ｌ　Ｒｅｓ 。

（１９８０１１２６：１２１−１２６、及びＤａｉｎｉａｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ 、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、（１９８５１７６：ｌ２３V−１ ２４２゜ 実例として、ヒト造血幹細胞の細胞濃度は次のようにして増殖させる。吸引採集 された骨髄から赤血球をフィコール：ハイバーク密度勾配遠心により除去する。

その後、単核細胞を分化した血液成分を認識する抗体の「カクテル」と共にイン キュベートする。ここで、分化した血液成分とは、赤血球、顆粒球、マクロファ ージ及び分化したリンパ球（Ｂ−及びＴ−細胞両方）を含む。更に決定前駆細胞 を認識する抗体（抗ＣＤ３３を含む）を加える。分化した細胞はパニング、磁気 ビーズ、或いは蛍光活性セルソーター（ＦＡＣ３）等を含む種々の方法の１つに より除去される。分化した細胞を除去する事により造血幹細胞の組変えウィルス による感染の機会、それ故希望する遺伝子の導入の機会は非常に改善される。

他の実施態様に於いて、培養中で造血細胞の増殖の為の方法が提供される。その 方法は効果的な増殖環境を維持する為に、増殖因子を提供する為の通常に形質転 換した線維芽細胞を用い、蛋白成分を線維芽細胞と造血細胞の混合物に加え、実 質的な連続潅流を行い、随意的に培地の再利用を行なう。

それ故この実施態様の方法の詳細を、潅流条件、反応器とその内部構造及び形質 転換線維芽細胞の３つに分けて説明する。

らゆる形の容器が含まれる。反応器は実質的に骨に於ける潅流を模倣する状態を 作り出す事が出来るものとする。生体内では骨髄１顧あたり毎分的０．０８ｍｆ ｌの血清が潅流している。１゛−わ、は１０°細胞１１−１当り０．３−の血清 量（１゛相当する。それ故、代１１産物を増殖制限Ｌ２ない１ノベルに維持する 為に、培地は２４時間の間に、平均少なくとも５０％、好ましくは１００％交換 する必要がある。経験的に生体内清流；輝渡を模倣すれば、交換速度は・般的に ＩＥＩＩＯ’細胞当り約０．５から１．０ｍ１２潅流培地である６゜ バイオリアクター内の潅流速度は反応器内の細胞密度に依存して変化Ｖる。２− ・・−＋ｏｘ　ｉｏｌ″細胞／細胞７細σ培養ではこの速度は２４へ・４８時間 当りｉ、　ｍｆｌの反応器の体積に対１．て」′ｍＯの培地に相当する。この場 合使用された培地は２０％の血清（１０％牛脂児血清と１０％ウマ血清の混合物 か或いは２０％牛脂児血清）を含む。細胞密度がより高い場合には潅流速度は細 胞数当りと時間当りの血清流が一定になる様に、比例して増加する。それ故細胞 が５Ｘ１０８細胞／ｍ＋１で培養される場合は、潅流速度は反応器体積１ｍｌ当 り毎分０．１−である。この流速は細胞密度に相当する血清と培地の流量に一致 し、培養内の正常ヒト骨髄基質細胞からの造血増殖因子の内部生産を刺激する。

この血清と培地の流速で誘導される造血増殖因子にはＧＭ−Ｃ８Ｆが含まれ、さ らに５−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−６、Ｇ−Ｃ３Ｆ及び他の造血増殖因子が含まれＣいても よい。幹細胞と前駆細胞が基質細胞と付着している場所で受ける縦方向流れによ るせん断応力が１．０から５゜０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の間になるように、これらの 流速はバイオリアクター内で決定されるであろう。

種々の培地を造血及び基質細胞の増殖の為に用いる事が出来る。実例としての培 地はＭＥＭ、ＩＭＤＭ、及びＲＰＭＩを含み、これら培地は５〜２０％牛脂児血 清、５〜２０％子牛血清及び０〜１５％ウマ血清の組み合わせで補う事が出来る し及び／又は血清なしでＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、或いは基質細胞や 幹細胞を刺激するための他の増殖因子等で補う事が出来る。特殊な系統のある細 胞だけを特に得たい場合、形質転換した線維芽細胞によって提供される増殖因子 を補う為に更に増殖因子を潅流培地に加える事が出来る。基質細胞の分泌により 或いは添加により潅流培地に加える事の出来る増殖因子はＧＭ−Ｃ８Ｆ、Ｇ−Ｃ ３Ｆ。

Ｍ−Ｃ８Ｆ、インターロイキン１−７（特に１．３．６及び７）　、ＴＧＦ−ア ルファ或いはベータ、エリスロボエ、チン、或いは同様の物質、特にヒト因子等 である。特に興味があるのは０．５〜２　ｎｇ／ｍｌｌ、好ましくは１　ｎｇ／ ｍＱのＧＭ−Ｃ８Ｆ、及び最終濃度０．　ｌ”＝２Ｕ／ｍｌ／日のエリス１１ボ Ｌチン、１００−□−３００Ｂ／＋ｎｌ）７日のＧ−Ｃ８Ｆ及び約１〜１０ｎｇ ／ｍｌ！／目の幹細胞増殖因Ｔ−（Ｓ−Ｃ８Ｆ、マスト細胞増殖因了哉いはキ・ ソト・りがンド、ｋも呼ばれる）等である。ひとつ或いはそれ以上、好まＩパは 少なくと・ｔ）ふたつの増殖因子が形質転換した細胞から分泌され、潅流培地中 には増殖因子の希望する１ノベルを維持するに十分な量の形質転換した細胞が存 在することが分かっている。） 反応器内では生理的温度、・つまり３７°Ｃに維持されている。、３３°Ｃを含 めて低い温度で行なう事も可能であるが通常は２５°Ｃ以下ではない。湿度は一 般に１００％で気相は５％のニ、酸化炭素を含んでいる。潅流培地は反応器外で 酸素添加しても良いし７、反応器内でしでもよい。反応器内で酸素添加する種々 の手段がある。反応器内酸素添加はハローファイバー、焼結ガラス・ディスク、 シリコン管、或いは適当な有孔性と疎水性を持つ他の膜を用いて行う事が出来る 。栄養素のレベルと代謝生成物のレベルは比較的狭い範囲に維持される。グルコ ースのレベルは約５から２０ｍＭの範囲で通常１０から２０ｍＭであり、乳酸の １７ベルは通常３５鯨下に維持しているが２０＃、Ｌ上であることも可能である 。グルタミンの濃度は一般的には１から３酬の範囲に、通常は１．５から２．５ ｍＭの範囲に維持している。アンモニアの濃度は通常２．５ｍＭ以下に維持して いるが、好ましくは２．０ｍ似下である。

液体の流れは重力、ポンプ或いは他の方法によってなされても良い。流れの方向 は反応器内のバッキングの性質に依存して、どの１方向でも構わないし多方向で も差し支えない。望ましくは流れの方向が反応器を横切って実質的に水平である ラミナー・フローを用いても良いし、流れが反応器の底から上方へ向かう垂直流 を用いても良い。

ヒト造血細胞が腫瘍細胞、例えば白血病、リンパ腫或いは癌を含むと疑われる場 合は、潅流速度を正常前駆細胞と腫瘍性の造血細胞とを分離する様に調節出来る 。正常の造血前駆細胞は約１．５〜２．　Ｏｄ　ｙ　ｎ　ｅ／ａｎ２の縦方向液 体流によるストレスに耐える親和力で基質及び実質蛋白に付着している。対照的 に腫瘍細胞とそれ等の前駆細胞は基質に対する親和力がかなり弱まっており、約 ０，０５〜１．２ｄｙｎｅ／ｃｎ２の範囲である。しかし、正常と腫瘍前駆細胞 が耐える事の出来るシアー・ストレスの中間のシアー・ストレス、通常１　ｄｙ ｎｅ／ｃｍ”以上を与える潅流流速を用いれば、ＩＩｍ！前駆細胞を正常前駆細 胞から分離出来る。分離を達成するには一般的には潅流を少なくとも２日維持し 、好ましくは少なくとも５日、更に好ましくは７日或いはそれ以上維持する。こ のようにして患者からの正常造血細胞を拡大し、同時に適当な流速を採用する事 により腫瘍細胞を分離出来る。この方法により腫瘍を持つ患名からの自己造血細 胞を化学療法或いはＸ線療法の間正常造血細胞を拡大して、患者に返し、患者の 造血及び免疫系を回復させる。

せん断応力を用いて造血、腫瘍細胞を正常造血細胞とを分離する実例としては慢 性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の状況がある。ＣＭＬ細胞のせん断応力耐性は０．０ ５−１、２ｄｙｎｅ／ａａ２の範囲である。この差が個々の骨髄標品について効 率の良いＣＭＬ細胞除去を可能にした。ぜん断応力約１．２〜１．５ｄｙｎｅ／ ａａ”、好ましくは１．３ｄｙｎｅ／ｃｍ２を用いて、ＣＭＬ細胞は効率良く分 離出来る。

個々の骨髄細胞内のせん断応力耐性は先細放射状フローチャンバー（ａ　ｔａｐ ｅｒｅｄ　ｒａｄｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｃｈａｍｂｅｒｌを用いて決定出来る。放 射状フローチャンバーに於いては、細胞がうけるせん断応力はチャンバ・−の始 まりからの距１！ｌｉｄの関数１／ｄとして減少する。せん断応力のバンドを細 胞集団について分析し、希望する細胞集団を残存させるようにぜん断応力をセッ トする。

白血病幹細胞を除去するために、白血病患者の骨髄標品の前駆細胞と幹細胞は最 初に放射状フローチャンバーに入れられる。放射状フローチャンバーはポリカー ボネートかカラスよりなる２枚のプレートより成り、下方のプレートに骨髄基質 細胞が付着出来る様になっている。最初の測定は１）造血細胞の注入の前に骨髄 基質細胞の集密的細胞単層を形成しておき１２−２４時間後に液体を流し始める か、或いは２）患者の骨髄を基質細胞の単層なしに直接フローチャン／１−に植 え、３〜４日待ってから液体を流す（通常０．０５〜１．０ｃｅ／分）。プレー トの端をゴムのガスケットを用いてシールし、調節ねじて一緒にする。チャンバ ーの狭い注入口に貯蔵タンクから注射器型の定圧ポンプによって管を通して液体 をチャンバー内に入れる。広い捕集端で液体と除去された細胞は別の管を通り捕 集される（図３及び図３ｂ参照）。一定期間の潅流の後（通常３〜７日）、付着 していない細胞を除去し、プレートを分離し３〜５領域のそれぞれから細胞を別 々に吸引とゴムの　′ポリスマンで取り、各々の分画を標準的な方法で白血病細 胞の有無を調べる（通常は染色体バンディングによる核型分析）。各々の分画で の白血病細胞の分析はどの分画（つまりどのくらいのせん断応力）で白血病細胞 が基質細胞に付着出来なくなり、除去されたかを示す。このチャンバーでは細胞 にがかるせん断応力は入り［１からの距離が遠のくにつれて対数的に減少する（ 図３Ｃ参照）。典型的に、付着しない細胞は全て或いは殆ど全て白血病であるが 、最も狭い、チャンバーの半分に付着しているのは殆ど全て正常である。

これらの測定の結果に基づいて、一連の平行、矩形のチャンバーを設置し、その 中に液体を一定の流速で流し、下面にせん断応力をかける。その流速は先細りチ ャンバーの中で基質細胞から白血病細胞は除去するが全部の正常細胞は除去しな いせん断応力に相当するものである。慢性骨髄白血病患者の骨髄の場合、このせ ん断応力は典型的にはｏ、ｏｉ〜０．０５ｄｙｎｅ／ａ＋＋２である。実際の流 速はチャンバーの大きさと形状に依存する。患者からの骨髄細胞をこれらの矩形 チャンバーの中で５Ｘ１０’／ｍ１１から５０Ｘ１０’／ｍ（ｌの濃度で、イス コブの改変ダルベツコの培地に５〜２０％（典型的には１０％）の牛胎児血清と ０〜１５％（典型的には１０％）のウマ血清を加え、更に１０−’Ｍハイドロコ ーチシンを加えた（加えない場合もある）培地で培養する。骨髄細胞を１２〜２ ４時間液体の流れなしで培養し、その後流れを開始する。

細胞を３〜７日間培養し、非付着性の細胞は捨てられる。付着細胞を矩形プレー トから吸引と機械的振動で回収し、集める。これらの細胞は直接患者に戻すか後 で用いるために標準技術で液体窒素中で保存する。

造血系の細胞以外の細胞でもせん断応力に対する耐性の差による分離が可能であ る。細胞の複合体の中に区別し得る細胞集団がある場合は、上記の方法を用いて 皮膚、肝臓、筋肉、神経或いは上皮細胞に由来する細胞懸濁の中に興味のある細 胞を分離する事も可能である。特に興味のある事は正常細胞の集団中に存在する 腫瘍細胞を分離することである。分離されるべき細胞集団を後記の様な適当な基 質、例えば目的とする細胞が付着し得る精製された蛋白或いは細胞成分の様な基 質に接触させる。各々の付着した細胞の小集団についてせん断応力耐性を上記の 方法で決める。そして目的とする細胞を上記のようにして集める。

反応器の中で種々のノ１ツキングを用いて細胞の付着増殖の場を提供し、一方で は基質細胞と造血細胞の間のある程度の物理的な隔離を保持し、また一方では基 質細胞と造血細胞の間のある程度の接触或いは接近を維持する。この様にして基 質細胞によって分泌された因子がたやすく造血細胞に取り込ま札造血細胞の増殖 と、適当であれば廻しと成熟化を助長する。

細胞を支持する蛋白マトリックスは切削されたコラーゲン粒子の形を取っても良 い。例えば多孔性のコラーゲンのスポンジ或いはビーズ；骨髄からの細胞外の骨 マトリックス蛋白より成るスポンジ或いはビーズ；或いは蛋白でコートされた膜 等が挙げられる。たたしここで蛋白はコラーゲン、フィブロネクチン、ヘモネ゛ 　クチン、ＲＧＤペプチド、混合した骨髄マトリックス蛋白或いは似た物でも良 い。

膜孔サイズは物理的な隔離を維持しながら異なったタイプの細胞の相互作用を維 持する為に、一般的には１〜５μの範囲にある。

蛋白でコートした膜を用いてもよい。種々の膜の材料を用いることが出来る。

例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルフォネート 等である。種々の蛋白、特にコラーゲン或いは既に示された他の蛋白質を用いる 事が出来る。膜孔は十分小さく形質転換した細胞は膜を通り抜けてはならないが 、その膜の１面に細胞を増殖させ、集密的細胞単層を形成させ細胞膜の一部を孔 の中へ伸ばす様にする。一般に孔のサイズは１〜５μの範囲にある。このように して造血幹細胞は膜の反対側の面で増殖し、形質転換細胞と相互作用を持ち、こ こで種々の因子は形質転換細胞から造血前駆細胞へ直接伝達される。前駆細胞、 幹細胞は孔を通って侵入してきた細胞質突起に付着する事が出来る８幹細胞から の造血分化は膜の片側で起こり分化した子孫細胞は、基質細胞が集密単層を形成 した際、孔は既に塞がれているので、孔を通り抜けることは出来ない。例えば複 数のチャンバーを提供し基質細胞を増殖させ、集密状態に達していないチャンバ ーに造血細胞を移動させる事が出来る。かくして、可動の障壁をチャンバーの間 に設け、基質細胞が集密状態に近すいた時（一般に８〜１２週）チャンバー間の 障壁を開くか除去するかして基質細胞が新しいチャンバーに移動するようにし、 造血細胞が集密状態に達していない基質細胞と接触するようにする。その間集密 状態に達していない基質細胞は種々の因子を造血細胞を含むチャンバーに与える （図５ａ及び図５ｂ）。造血細胞の移動は適当な流速か又は他の適当な方法で達 成する事が出来る。適当な壁で分けられたチャンバーに種々のウェルを作ること が出来る。ひとつのウェルに細胞を植えて集密になると細胞は隣のウェルに移動 し隣のウェルを集密以下の状態で細胞を植えた事になる。本システムの他の変更 は８〜１２週の培養の後、造血細胞は新鮮な増殖している基質細胞に曝される事 である。この新基質細胞に曝す事は幾つかの方法のうちのひとつにより達成され る。

第１の技術では、培養をＥＤＴＡに３〜５分曝し基質細胞から造血幹細胞を分離 する。分離された細胞はそこで新しい培養容器に移される。その培養容器は３〜 ７日以前に植えられた骨髄基質細胞を含んでいる。この過程を８〜１２週毎に繰 り返す。他の異なった方法は８〜１２週後に培養の体積を増やし培養にコラーゲ ンのビーズを加えて表面積を増やす方法である。最後に小有機物分子又は蛋白、 特に血小板由来の増殖因子（１００〜５００ｎｇ／ｍＱ）のようなホルモン、イ ンターロイキン１α、腫瘍壊死因子α、又は塩基性線維芽細胞増殖因子又は他の 線維芽細胞のマイトジェニック分子を３〜７日毎に培養に加える。基質細胞をマ イトジェンに曝すと骨髄基質細胞の連続した増殖と造血増殖因子の生産が促進さ れる。かくて基質細胞を連続して集密以下の状態に置くことが出来る。

連続した液体の流れは骨髄細胞集団の中の正常細胞と癌細胞を選択的に分離する のにも用いる事が出来る。この方法に於いては、放射状フローチャンバーを最初 に用いて正常及び癌細胞の特異的基質付着性を決定し、癌細胞を除去するせん断 応力を与える流速のフローチャンバーで手術前に正常細胞と癌細胞を分離する。

本方法と器具は潅流培地の流れによって失われた幹細胞を再使用する機会も提供 する。膜表面蛋白マーカーＣＤ３４は実質的に未熟の造血細胞を成熟した造血細 胞から分離する。かくして、ＣＤ３４”である細胞を捕集し、再使用する事によ り培地中の幹細胞が不足することを防止できる種々の技術を用いて細胞の未熟分 画を捕集し反応器へ戻す事が出来る。例えばＣＤ３４に特異的な抗体で細胞を標 識し、それからその抗体に対する抗体を用いてＣＤ３４“細胞を集め反応器に戻 す事によって行うことが出来る。正選択法に代わって、負選択法を用いて成熟し た細胞特有のマーカーに対する抗体で成熟細胞を除去することができる。成熟細 胞のマーカーとは糖蛋白Ａ、ＣＤ３３．ＭＯ１，０ＫＴ３，０ＫＴ８，０ＫＴＩ 　１，０ＫＴ１６．ＯＫＭＩ、ＯＫＭ５．Ｌｅｕ７．Ｌｅｕ９．ＬｅｕＭｌ等で ある。種々の造血細胞系統の成熟細胞（リンパ球、骨髄細胞、赤血球）の特異的 なマーカーに対する種々の抗体を得る事が出来、これらの抗体を用いて反応器か らの流出液から成熟細胞を除去し、残りの細胞を集めて反応器に戻す事が出来る 。この方法で、幹細胞を失う事による培養の衰退を防ぐ事が出来、幹細胞の無制 限のインビトロ生存を維持する事が出来る。

抗体マーカーを用いての分離は種々の方法によって達成する事が出来る。パニン グ、蛍光活性化セルソーティング、種々の表面、例えばポリスチレン表面、金属 小球及び磁性体等に抗体を結合する様な標準技術を単一に或いは複合して用いる 事が出来る。抗体を固相表面に結合させて、付着、非付着細胞間の分離をするこ とができる。或いは抗体を標識し、直接に或いは間接に標識された細胞と標識さ れない細胞の分離も可能である。

本技法を用いれば造血細胞のインビトロ増殖の期間を延長する事が出来る。一般 的に生体外でのヒトの造血機能は少なくとも６力月維持され、顆粒球形成機能は 少なくとも４力月、赤血球形成機能は少なくとも３力月維持される。更に加える に、造血前駆細胞は培養期間中連続して生産され、投入細胞の１０倍以上の前駆 細胞の純収率を得る。

更に加えるに、本技法によれば幹細胞の細胞分裂の速度を大きく増大させ、レト ロウィルス媒介の遺伝子導入を効率良く行なわせることができる。初期２週間の 感染期間に適当なレトロウィルスによって導入された遺伝子はその後４カ月にわ たる培養期間に生産された全ての前駆細胞の１０〜３０％の中で発現させる事が 出来る。本技法はそれ故高度に増殖しているヒト造血幹細胞に遺伝子を導入する ことを可能にする。

図１は潅流チャンバーの概略図である。反応器１０、蓋プレート１２及び床プレ ート１４はボルト１６で組み立てられ、ウィングナツト１８で固定される。歪み を避ける為に３本のボルトが用いられる。チャンバー２０は３区画があり、中区 画２２は基質細胞の為の支持マトリックス、基質細胞床、及び骨髄細胞を含む。

中区画２２は上区画２４と下区画２６から膜或いは網の２８及び３０で分けられ ている。好適には、ポリスルフォン膜を用いることが出来るし或いは細胞をチャ ンバーの中区画にとどめておける細かい網目を持つステンレススチールの網を用 いる事も出来る。分離間層を、分離膜に機械的な支持を与える為に区分しである 内筒２７を用いて、チャンバーに置く。上区画及び下区画は同一である必要はな く、液体培地或いはカス交換のための管や膜が通る。ガスは疎水性の管、例えば シリコン製管を通して交換される。管の長さくそれによるガス／液体接触領域） は、中区画で代謝している細胞集団の要する十分なガスの流れができる様に変え る事が出来る。培地は上区画成いは下区画からボート３２を通じて注入、取り出 し可能であり、供給管３４を通じて加えることも可能である。

希望するなら、上区画及び下区画は外部酸素添加器を用いて除く事が出来る。

この場合、分離膜は円筒溝プレート１２と１４に適合するカラス筒３６の下に置 かね、円筒溝の内側領域は膜を通じての流れの分布を良くする為に切り込みを入 れである。この構造は有限数の導入ボートからの液体が混合し、放射状の圧力が 平衡化□し、分離膜を通しての液体の流れを均一にする。この機構は酸素添加が 限界に達しない様な、比較的小数の細胞を培養するチャンバーに適当である。

図２に示しであるのは潅流チャンバーを横培地チャンバー、酸素添加器、センサ ー・チャンバー及び取り出し／注入ボートとをつなぐループの概略図である。

外部新鮮培地源５０はポンプ５２により配管５６を通して培地槽に供給し、使用 された培地は配管５８を通して槽５４からポンプ５２により使用済み培地容器６ ０に導かれ更に処理される。２番目のポンプ６２は培地を培地槽５２から配管６ ４を通してホローファイバー酸素添加器６６に注入する。培地は配管６８を通っ てバイオリアクターＩＯの第１チヤンバーに導かれる。適宜に培地成分の注入装 置８２を装着し、培地成分を配管６８を通して培地によってバイオリアクター７ ０の第１チヤンバーに供給する。

培地成分は試験成分、添加因子等である。バイオリアクター７０からの培地は中 チャンバー７２を通ってバイオリアクターの第２チヤンバー７４に導かれる。そ こから培地は配管７６により培地組成の変化を検出する為のインライン・センサ ーＩ８に導かれる。

例えばグルタミン：グルコース比は使用する細胞系に依存して約１＝５〜８の範 囲にあるのが望ましく、例えば形質転換３Ｔ３細胞は１：８であるのが好ましい 。更にアンモニアの濃度は好ましくは２．０ｍＭ以下、乳酸の濃度は４０銅以下 であることが望ましい。バイオリアクターからの流出液を監視する事により、バ イオリアクターに供給される培地を変更する事が出来る。酸素分圧を変え、カス 流量を変化、３−１景−１稍ノ？の成分を強化ｌ５、漏流速度を増加成いは減少 ６−る事が出、東で）。、センサー７Ｂから培地は配管００を通ってポンプ６２ により槽５４に導かれる。

上記の流れ径路により槽中の培地は別のポンプを用いてゆっくりと交換される。

。τの機構は培地交換速度（外ポンプによる）と酸素添加器と清流チャンバー・ を通る流速との別々の制御を可能にする。前当は培地成分と潅流の長期の交換の 制御に用いられ、後右は可溶酸素分圧の制御とｙ′ヤンハー・内の流れバタ・− ンの制ａ１（、；ｍ用いられる。小メツシュ牛体適合膜の使用はチャンバー・内 でのプラグ（ピスト〉・）力１・−・を可能に１，２造匍細胞や基質細胞にに対 ｌ−２、非常に正確な量を加えることが望まり、る増殖因子や他の特別な化合物 の供給の正値な制御が出来るようにした。

チャンバーとループの構成要素を高圧蒸気減菌した後、反応器は無菌状態で組み 立てられる。培地は横ループとチャンバーを通して数日循環し汚染の徴候を監視 する。無菌組み立てが完成したならば、チャンバーの中区画へ細胞外マトリック スのみ或いはＸ質細胞を含む既に接種しである細胞外マトリックスを入れる。

基質細胞をそれから二Ｊ）チャンバー内に数日間とどめ代謝活動及び／又は増殖 因子に対する反応性を監視する。もし結果が満足するものであれば、骨髄を接種 する；或いは２）骨髄をただちに接種する。どちらの場合も細胞層は潅流チャン バーの中区画の底に保持される。細胞は追加の細胞外マトリックス下におき、細 胞層は分離膜に付着する。この時チャンバーをひつくり返し細胞層を中区画の天 井に持ってくる事も可能である。この構成では成熟細胞は基質細胞に対する付着 力を失うに連れて、中チャンバーの底にたまる。この特色は成熟細胞が基質細胞 及び／又は成熟度の低い造血細胞に損傷を与えるのを防ぐ為に重要である。この 特色は成熟細胞の連続除去を容易にする。

これらの細胞は細胞を注射器で回収し或いは潅流培地の圧力によりチャンバーよ り細胞を取り出し管を通して流出させる。

基質細胞は、大部分については、必要な造血増殖因子を提供するひとつ或いはそ れ以上の遺伝子で形質転換された線維芽細胞である。同じ或いは異なった細胞を 宿主細胞の特異的な選択方式により種々の遺伝子で形質転換出来る。複数の遺伝 子に対して、同じ或いは異なった細胞を用いる事が出来る。

非常に多くの正常細胞或いは安定細胞系統を用いる事が出来る。しかし、ある系 統の細胞の形質転換はく−の細胞の過剰な増殖る：もたらず事かあるので、全Ｃ の細胞系統を使用出来るわ（Ｊではない。使用される細胞系は癌情のものではな く、支持体Ｌ’ｍ（（−ｉｆ−るもの−（７ｋ）るのが望まｌｙい。哺乳動物細 胞はヒト由来のものである必要は無く、づルｅある必要、ｉ）無い。種４′の形 質転換していない細胞もイー」着細胞層（、゛加λＣも１１い。それ等の細胞は 正常ヒト骨髄伺着細胞、正常）：１・牌ＦＡ何着細胞及び正常ヒｌ−胸腺ｌ−皮 細胞である４、線維身″を含む哺乳動物細胞を形質転換づ−る方法はよく知られ ており多くの文献があるが子の内の少数の参考文献は前記した１、構成物はプロ １ン−クー・、適当であればエンハンサ−より成る天然の転写開始制御領域を用 いても良いし、定常或いは誘導性の異なった転写開始領域を用いでも良い。

数多くの転写開始領域を得る事が出来、それらは誘導性であり、又は定常性であ る。天然にあるエンハンサ−がある場合もあるし、】−ンハンサーを加えても良 い。ある特定の細胞にのみ誘導出来るし、数種の細胞にも全部の細胞にも機能を 持たせる事も出来る。転写開始領域はウィルス、天然の遺伝子、合成或いはこれ らの組み合わせから得る事が出来る。

入手可能で、使用可能なプロモーターは染色体プロモータ・−を含み、それ等は ７１クス又はヒトメタロチオネイン−Ｉ或いは−ＩＩプロモーター、アクチン・ プロモーター等であり、ウィルス・プロモーターとしてはＳＶ４０初期遺伝子プ ロモーター、ＣＭＶプロモーター、アデノウィルス・プロモーター、レトロウィ ルスＬＴＲのプロモーター等である。これらのプロモーターは手に入れる事が出 来、転写開始領域及び目的遺伝子を挿入する為のポリリンカーを持つ適当なベク タ・−にたやすく挿入する事が出来る。他の場合、転写開始領域と転写終了領域 の間にポリリンカーがあり、メツセンジャーＲＮＡの翻訳のための処理に関係あ る種々のシグナル、例えばキャップの位置、ポリアゾニレ−ジョン・シグナルを 提供する発現ベクターを手に入れることが出来る。制御領域と構造遺伝子より成 る発現カセットを構成するにはひとつ又はそれ以上の制限酵素、アダプター、ポ リリンカー、インビトロ突然変異、プライマーリペア−１切除等を使用する。

発現カセットは通常マーカーとひとつ又はそれ以上の複製系を含むベクターの一 部である。マーカーは発現カセットとマーカーが導入された細胞の検出及び／又 は選択を可能にするものである。種々のマーカーを用いる事が出来るが、ｌ−キ シン、特に抗生物質に刻する抵抗性を与えるマーカーが特に好ましく用いられる 。

好まｌバは宿主として用いられる哺乳動物細胞に０４１８に対する耐性をｑえる ゲンタマイシン耐性が用いられる。複製系は原核生物複製系より成り、それによ り発現カセットの種々の成分を組み立てる種々の段階でのクローニングを可能に する。宿主細胞に於いてエビソーム要素を維持する為に他の複製系を用いる事も 可能である。しかし複製系の大部分は発現カセットが宿主の染色体に組み込まれ るようにさせる性質のものから選択される。

発現カセットを宿主に導入する為に通常用いられる技術のどれを用いても良い。

それ等はカルシウム沈澱ＤＮＡ、）ランスフエクション、感染、エレクトロポレ ーション、誘導粒子等である。−＝一度宿主細胞が形質転換されたら、それ等の マーカーを持つ細胞を選択薬剤を含む適当な栄養培地中で選択、増大させる事が 可能である。生存した細胞は更に増大させる事が可能である。

使用可能な宿主細胞はアフリカミトリサル細胞系ＣＶＩ、マウス細胞ＮＩＨ−３ Ｔ３．正常ヒト骨髄線維芽細胞、ヒト膵臓線維芽細胞、正常マウス骨髄線維芽細 胞及び正常マウス膵臓線維芽細胞等を含む。時によるとベクターと細胞系統の選 択によっては細胞が癌化する事があるので注意が必要である。得られた形質転換 細胞が付着能を持っていて蛋白スポンジ、蛋白コート膜等の支持体への結合を維 持出来る事が重要である。

一度適当な増殖因子を発現するベクターが作成されたら、適当な方法で細胞を形 質転換させるのに用いる事が出来る。得られた形質転換細胞を先に記述した支持 体にシードする事が出来る。これらの支持体は反応器に導入されるか或いはシー ドする時に既に反応器中に入っている。細胞は十分な時間増殖させ、細胞が生存 して必要な増殖因子を生産する事が出来るようにする。

次に、反応器に適当な時期に造血細胞をシードする。造血細胞は、実質的に純粋 な幹細胞、ひとつ或いはそれ以上の系統の成熟した造血細胞が実質的に存在しな い造血細胞の混合物、或いは造血系の全ての又は実質的に全ての系統の、種々の 段階の成熟度の細胞より成る混合物を含む。

反応器を通る実質的に連続な潅流を行い、そして種々の栄養素と関連する種々の 因子を監視しながら、細胞を増殖させる。大抵の場合、主要な因子は基質細胞か ら供給されるので、通常は増殖因子の濃度の平衡状態が達成される。調節された 上清は造血細胞の増殖に効果的である事が見出されているので、これを用いて反 応器内の増殖因子を適当な濃度１ノベルに維持するような基質細胞と造血細胞の 比を与える事が出来る。

トランスフェクトした基質細胞はヒト幹細胞への遺伝子導入を助ける事ができる 。マウスに於いては、レトロウィルス媒介の幹細胞への遺伝子導入はマウスを５ −ＦＵで前処理し、ＩＩ、−３及びＧＭ−Ｃ８Ｆを含むＷＥＨＩ調節培地で採集 した骨髄細胞を増殖させることにより可能になった（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ、　Ｃ ｅ１ｌ　（１９８６］４５：９１７）。興味あるレトロウィルスを分泌している レトロウィルス・パッケジング細胞と共に増殖している、人工基質が遺伝子をヒ ト幹細胞に効率良く導入する為に用いる事が出来る。例えばヒトＴ細胞は幹細胞 をＣＤ２制御配列の支配下にあるＨＩＶのアンチセンス配列を含むレトロウィル ス・ベクターで感染させる事によりＨＩＶ感染に抵抗性を持つように成る（Ｇｒ ｅａｖｅｓ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）　５６：９７９−９８６）。レトロウイ ルスパッケジング細胞によって提供される、レトロウィルスの複製に必須の因子 がある。この因子は目標となる造血細胞には存在しない。ウィルスが一度造血目 標細胞に導入されれば、ウィルスは複製出来ない。

図３ａとｂに於いて、取り入れ口１０２、取り出し口＋０４．２５のチャンバー １０６を持つ放射状フローチャンバー１００が示されている。矢印１０８は流れ の方向を示す。

造血細胞１１０はチャンバー内の基質層１１２の上にシードされ増殖する。流速 がどの細胞が付着出来るかを決定し、付着出来ない細胞１１４は取り出し口１０ ４を通って外へ出る。

図４ａと４ｂに於いて、取り入れ口１２２と取り出し口１２４のある増殖チャン バー１２０が示されている。図４ｂに於いては取り入れ口１２２はマニフォール ド１２８より成る。マニフォールドは細胞１１０と基質１１２を含む個々のチャ ンバー１２６に入る。

そこで細胞は増殖し分離される。

図５ａと５ｂに於いて、増殖チャンバーとその中で障壁１３４．１３６．１３８ が培養中除かれている状態を図示している。障壁１３４は約８〜ｌＯ週目に；障 壁１３６は約１８〜２０透口に；障壁１３８は約２８〜３２目上に除かれる。

本発明の詳細な説明をした後、更に理解を深めるために、次に特定の実施例を挙 げて説明をする。ここで提供する実施例は例示のみを目的とし、特記した場合を 除いて本発明を制限するものではない。

細胞分離及μ乗色力抹 フ　コールによる　の １、骨髄試料を室温に保ったＩ−ＭＤＭ（イスコブの改変ダルベツコ培地；Ｇよ りＣＯ；カタログＮｏ、　４３０−２２００）で１：４の比で希釈する。

２、室温で、５０ｍ１１の遠心管の中で希釈した骨髄試料３５ｍＱを注意深＜１ ５−のフィコール−バク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）　（比重１．０７７ｇ／ ｃｃ　；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　；カタログＮｏ、　１７−０８４０−０２）に のせる。

３、７００Ｘｇ　（１８００ｒｐｍ、　Ｂｅｃｋｍａｎ遠心機）で３０分、室温 （２０°Ｃ）で遠心分離する。

４、遠心分離後、上層の大部分を除き（間層の上層５ｍｌを残す）、間層（骨髄 細胞）を回収し、氷冷したＩ−ＭＤＭで次の様に３回洗浄する：第１洗浄：　１ ４００ｒｐｍ／１５分／４℃第２洗浄：　１２０Ｏｒｐｍ／ｌｏ分７４°Ｃ第３ 洗浄：　１２００ｒｐｍ／　１０分／４℃５．３回目の洗浄の後、細胞は培地か 或いは平衡塩類溶液等（細胞の使用目的に依存）に懸濁し、細胞を酢酸液で１： １０に希釈した後に（細胞懸濁液１０成＝２％酢酸を含むＰＢＳ９０ｄ）細胞数 をカウントする。この方法では赤血球は酢酸中で溶血するので、白血球のみをカ ウントすることになる。

６、次に、適当な培地中に細胞を希望する最終濃度に懸濁する（培地については 各々の応用参照）。

ＭＹ−１０の　の　゛　： 試薬 標準緩衝液： 粉末バクト乾燥ＤＩＦＣＯ緩衝液 （Ｂａｚｔｅｒ　；カタログＮｏ、２３１４−１５ＧＢ）　：　２００ｇ１０％ ＮａＮ５　（アジ化ナトリウム）２０ｇ非動化牛脂児血清（５６°Ｃ１３０分） 　２００ｍ１ｔ２回蒸留水で２０リツトルに希釈；ｐＨ７，１５〜７．２５　； ４℃で保存 １力月有効 ２％パラフォルムアルデヒド溶液 パラフォルムアルデヒド＝１０ｇ ２回蒸留水　５００顧 １ＯＮ　ＮａＯＨ（ドラフト内で）　８〜２０滴粉末パクト乾燥ＤＩＦＣＣＭｉ 衝液　５ｇドラフト内で２回蒸留水を５００ｍ１ｌフラスコに入札ホットプレー ト上で撹拌して６０℃にする。

パラフォルムアルデヒドＩＯｇを加える。

ＮａＯＨを溶液が透明になるまで滴下する。

ＤＩＦＣ０５ｇを加える。

冷却し、２Ｎ塩酸でｐＨを７，３５〜７．４５にする。

１、細胞数を数えた後、標準緩衝液で１回洗浄する（１００ｒｐｍ、　５分、４ ℃）。

・　２８次に、細胞を標準緩衝液に２　Ｘ　１０’細胞／ｍＱの濃度に懸濁する 。

３．２つの１５雄遠心管に、それぞれ５０ｕｆｔの細胞懸濁液を入れる。

４、ひとつの遠心管には、１：５に希釈した５０通の抗ＨＰＣＡ−１を加える（ 抗ヒト前駆細胞抗原；　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；カタログＮｏ、　 ７６６０　；標準緩衝液で１：５に希釈する）。他の遠心管には、１：５に希釈 した５０成のＭＩｇを加える（マウスＩｇＧ１コントロール；　Ｂｅｃｔｏｎ　 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；カタログＮｏ、　９０４０　；標準緩衝液で１：５に希釈 する）。

５、両方の遠心管を水中で１７２時間インキュベートする。

６、インキュベーション後、細胞を５−の標準緩衝液で２回洗浄する（１０００ ｒｐｍ、　５分、４°Ｃ）。

７．２回目の洗浄後細胞ペレットは１：４０に希釈したＧＡＭ−ＦＩＴＣ（アフ ィニティーで分離された抗マウスＩｇＧ及び抗ＩｇＭヤギＦ　（ａｂ’　）　２ 、ヒトエｇ吸収、フルオレシン結合１ＴＡＧＯ；カタログＮｏ、　４３５３　； 標準緩衝液で１：４０に希釈する）５０成に再懸濁する。

８、細胞を水冷下、暗闇で１／２時間インキュベートする。

９、インキュベーション後、細胞を５ｍ１２の標準緩衝液で２回洗浄しく１１０ ０ｐｐ。

５分、４℃）、各々のベレットは、標準緩衝液１ｉ）ｂ１２と２％パラフォルム アルデヒド１００ｄの溶液に再懸濁する。

１０、次に、フローサイトメーターで細胞を蛍光分析する。％蛍光陽性は抗ＨＰ ＣＡ−１標品の％蛍光からＭＩｇ棉品の％蛍光を引いたもの。

Ｗ　選外　るための　の　゛　： 目的； この染色法の目的は、成熟細胞集団を除去し、フローサイトメーター又は磁気ビ ーズを用いることにより、造血幹細胞（最も原始的な幹細胞）を濃縮することで ある。選別の結果と比較し濃縮程度をめるために、いくつかの細胞を（フィコー ル（Ｆｉｃｏ団分離後）全骨髄細胞として保持して、ＭＹ−１０陽性細胞を染色 するすることは、常に良い方法であると考えられる。

１、細胞は前記したようにフィコール−バク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）で分 離される（０．５ＸＩＯ’細胞を除去し、２つに分け、抗−ＨＰＣＡ−１／ＧＡ Ｍ−ＦＩＴＣ及びＭＩｇ／ＧＡＭ−ＦＩＴＣで染色する）。

２．３回目の洗浄後、細胞ペレットをモノクローナル抗体混合液（この混合液の 作り方の記載部分を参照）に１０７細胞あたり該混合液１ｍＭを用いて懸濁し、 細胞を氷上で１時間インキュベートする。

３、その後、細胞を過剰の氷冷Ｉ−ＭＤＭで３回洗浄する（１０００ｒｐｍ、　 ５分。

４°Ｃ）。

４．３回目の洗浄後、細胞を１＝４０に希釈したＧＡＭ−ＦＩＴＣ（標準緩衝液 ではなく１．Ｔ−ＭＤＭで希釈したもの）に０．２５ｘ１０６細胞当たり５０成 の比率で恕濁し、水冷下、暗闇で１７２時間インキュベートする。

５、インキュベーション後、細胞を水冷Ｉ−ＭＤＭ中で３回洗浄し、最後の洗浄 後、２〜４ｍ１ｌの水冷Ｉ−ＭＤＭに懸濁し、選別まで氷冷して保持する。

６、その後、蛍光に基づくフローサイトメーターで細胞を選別し、蛍光ヒストグ ラムの上部８５％を除く。より良く濃縮するために、この選別を三鷹繰り返して もよい。

７、１ＩＪｙｊｌＪ後、細胞をカウントし、洗浄し、アリコートはＭＹ−１０陽 性細胞の染色を（上記のようにして）行ない、全骨髄細胞の染色アリコートと比 較して濃縮程度をめる。

いた　、の５　： １、成熟細胞を選別するために、骨髄細胞の蛍光染色法操作の工程１〜３に従う 。

注：アジ化ナトリウムはいずれの緩衝液にも含まれない。

２、その間に、適当量の磁気ヤギ抗−マウスＩ　ｇ　（Ｂｉｏｍａｇ；　Ｃｏ１ １ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ；カタログＮｏ、　７４３４０−５０ 　；　Ｉｇ／＋ｎＱ　；　５　Ｘ　１０’粒子／−）を水冷Ｉ−ＭＤＭ中、１５ ００ｒｐｍ、　５分、４℃で３回洗浄する（防腐剤として用いられているアジ化 ナトリウムを洗い出すため）。

３、「工程１」における３回目の洗浄後に得られた細胞ベレットを、バイオマグ 中に５０粒子バイオマグ／細胞の割合で再懸濁する（例えば、ｌＸｌ０’細胞に 対して５Ｘ１０’粒子を用いる。従って、ｏ−１ｍｆｆのバイオマグである）。

４、細胞を（細胞数により）Ｔ−２５又はＴ−７５組織培養フラスコに人ね、断 続的に攪拌しながら水冷下、１７２時間インキュベートする。

５、インキュベートした後、該フラスコ（バイオマグが入っている）を平らな磁 石の上に置き、輪ゴム又はテープでしつかり留め、４°Ｃで１０〜１５分インキ ュベートする。

６、該磁石及びフラスコを垂直に立て、上清を集める。

７６エ程４〜６を２回以上繰り返す。

８、細胞をカウントし、氷冷Ｉ−ＭＤＭ中で１回洗浄し、アリコートを除去して ＭＹ−１０陽性に対して染色を行ない、適当な培地に再懸濁してさらに使用する 。

ＬｔｉｉｗＭ４ 材料及Ｖガ汰： 細胞：　ヒト骨髄細胞は、通知を受け承諾した個人の腸骨稜からの吸引物にヘパ リンを加えたものから得た。フィコール−バク（Ｐｈａｒｍａｅｉａ、　Ｎｏ、 １’７’０８４０−０２）密度勾配遠心分離により骨髄を分離し、低密度細胞（ ＜　１．０７７ｇｍ／ａｍ１）を集め、イスコブの改変ダルベツコ培地（ＩＭＤ Ｍ）で３回洗浄した。細胞を２回目と３回目の洗浄の間にカウントした。その後 、細胞を２連又は３連の２４ウ工ル組織培養プレー）　（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｎｏ 、３５２４）に３２２ｄ／ウエル、１．２、及び５　Ｘ　１０’細胞／Ｔｎｆｌ で播種した。

長８条住：　低密度細胞を湿潤５％Ｃｏ、７９５％空気雰囲気下、ｌＯ％ウシ胎 児血清（Ｈｙｅｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、１０％ウマ血清（Ｈ ｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｌ、１％ペニシリン／ストレプトマイ シン（Ｓｉｇｍａ、　１０，０ＯＯＵ／−ペニシリンＧ及びＩ（ｍｇ／ｄストレ ブＩ・マイシン、カタログＮｏ、　Ｐ３５３９）及び１０−５Ｍヒドロコルチゾ ン（１７−ヒトロキシコルチコステロン、　ＳｉｇｍａｓカタログＮｏ、　ＨＯ ８８８）を補給したＩＭＤＭ中でインキユベートシた。培養を、３種の培地交換 スケジュール、すなわち１００％毎日培地交換（７／週）、５０％毎日培地交換 （３゜５７週）、叉は５０％週２回培地交換（１７週）の・うちの一つで処理し また。培地交換の期間中、週２回、非何着性細胞の５０％を各培養ウェルから除 去し１、Δ、モサイトメーターを用いてカウントした二。

細胞をカリ〉・トするために除去し１；時（２回、７週）、３．５／週及び１／ 週、培臂の栄養補給の間に除去された培地は、細胞カウ′：：／ト用に全部とっ ておき、新規培地をウェルに戻した。７７週培養は細胞カウント用に除去された 培地の１７２をとってお（」ばよく、残りの１／２中の非付着性細胞はスウ心分 Ｈして戻ｌまた。て・の後、新規培地を各ウェルに添加ｌ１７、細胞カウントの ために除去された培地を補充した。細胞がカウントのために除去されなった目は 、７／週及び３．５／週培養ウコールから、それぞれ培地の１００％又は５０％ の培地を除去しまた。細胞を遠心分離Ｉ、２、さらに新規培地とともに元のウェ ルに戻した。

メーブＩＶＶ切ル！−ス＝ニス及Ｖ形態学的アツ−欠イー：　−週間毎に、細胞 カウント用（Ｊ′除去された非付着性細胞を〕゛６リトロボエヂン（ｅｒｙｔ、 ｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）　、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ〜３の存在−ト、メチルセル １：トースにブレートシ、顆粒球マクロファージ＝−コ０ニー形成ユニツＩ□　 （ＣＦＴ、Ｊ−ＧＭ）を数えた。除去細胞のアリコー斗を細胞遠心分離し、ライ ト−ギムＶ　（Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ）で染色し、差分細胞カウントを行 なった。

統計学的解析二　週２回の細胞産生の結果は、同型培養から平均上ＳＥＭとして 表わされる。培養グループ間に有意差の生じる確率は、一対のｔ−検定を用いて 、急速交換培養（７／週及び３．５／週）とそれに対抗するコントロール培養（ １／週）との標準化累積細胞産生値の比較によりめた。統計学的有意性は５％レ ベルで判定した。

結果： 匪住看性細胞産生Ｑ双度薯：　非付着性細胞産生は、接種細胞密度の関数（１〜 ５ＸＩＯ’細ｗｍσの範囲にわたっての）及び培地交換速度の両者を試験した。

培地交換速度は、１培地体積交換／週、すなわち伝統的なデクスター（Ｄｅｘｔ ｅｒ）培養速度から、７培地体積交換／週まで、様々であった。集められた週２ 回の細胞数は、培養当たりの接種細胞数で割ることにより標準化した。

各培地交換速度において、標準化した細胞コＬ〆クヤヨンカーブは接種密度でそ れ程変化はしなかで）た。７／週、３．５／週及び１／週の３つの培地潅流速度 で保持された培養の細胞産生は、培養当たりの接種細胞数に標準化した場合、同 様であった。接種密度間のＵ終累１ｍ＋細胞産生の１１４較から、３つの培地交 換速度のいダれに４３いても顕著な差異は全くホさオ］、なか〕た（リンプルの 全組の一対の１．−検定によりｐ＞、２０）。

反対（こ、培地交換速度は、−ｔｔらの培養：コ′」“３ける細胞産生の速度及 びが命［、“５に−８く影響した。１／Ｍ（コントロール）、３，５／週及び７ ７週で交換された培地の細胞産生は全て初めの数週間にわたり減少した。しかし ながら、培養産生性の差異は培養の第３週以降に明らかにな＝）た３、第３−１ ｎ週の間に、細胞産生は７／週培養においては一定であり、１／週培養において は低ｌノベルで一定であったが、３．５／週培養においＣは指数関数的に増加し た。第１０〜１２週以後には、↑、Ｔｈ−の培養において細胞産生は培養が終結 するまで減退した。

１／週交換培養の結果は、伝統的なヒト・デクスター培養の様々な系＋、Ｔ：お いで共通して見られる結果と同じであったが、−力、３．５／ｉ及び７７／週の 急速交換培養では、前の最適培養方法に比べて細胞産生性の増加が見られた。毎 日培地の１／２が交換される培養（３，５７週）では、コントロ・−ル（１／週 ）叉は毎１−１完全交換（７／週）培地よりも実質的に長期間細胞産生の増加が 維持された１、第３週及び第９週の間、３．５／週交換培養から集められた非付 着性細胞の数は指数対数的に増加し、２，１週間毎に２倍になった。

３゜５／週及び１／週プロトコールでの細胞産生は、培養の産生のバーセンチー ジとし゛Ｃ３，５７週交換速度下での細胞産生をグロットすることにより、１／ 週の交換速度と直接比較することができる。この比較により、最初の減少相では 、２つのプロトコールでの細胞産生は同じであることが示される。しかし、第３ ．５週及び第１８週の間では、３．５／週交換速度丁での細胞産生は常に高い。

したがって、培養物の増殖能は、初めの減少後の細胞の産生能により測定するこ とができる。第３週以後の標準化累積細胞産生（Σ’ｌ−７，Ｃｔ／Ｃｏ）は７ ／週、３，５／週の培地交換速度に対ｒる細胞接種密度には依存１７なか−）た 。同様の培地交換速度での培養から得られる細胞産生データは、質的にも統計学 的にも類似しており、従って、密度は平均化さね、組合せて、大きな統計シンプ ルを得た（下表）。第３．５週及び第２０週の間の密度平均化累積細胞産生は２ ７７週培養では０．２２　；　３．５週培養では０．４０　；及び１／週培養で は０．１５であった。したがって、１／週から７７週への培地交換速度の増加は 、細胞産生を代表的なデクスター培養培地交換スケジュールよりも約６０％程増 加させた。３．５／週交換速度は、１／週デクスタープロトコールと比較してほ とんどその３倍の累積細胞産生増加となった。これらのデータの一対のも一検定 を用いた統計学的解析は、７／週対１／週及び３゜５／週対１７週において共に ５％程度の有意性で著しい差異があることを証明した。したがって、３．５／週 の培地交換速度は、１／週の伝統的なデクスタープロトコールより細胞産生速度 を改善する。

１−マクロファー乏前ａｌ肥産生：　顆粒球−マクロファージ前駆細胞アッセイ は、成る培地潅流スケジュール及び接種密度の反復実験から行なわれた（表２） 。培地潅流速度は、産生される顆粒球−マクロファージ前駆細胞の数に著し２い 影響をボｌ１．た１、３．５／週培地交換培茸で（ま、前駆細胞産生のが命が層 ・ｔ）長かった。これらの培買物では、第４週と第１８週の間Ｃ，二前駆体が安 定な速度で産生された。

前駆細胞産生（、二、）いてのａ適条件は、週当たり３．５団交４角され、カリ ５ｘｌＱ’細胞／ｍｉ’！で接種されＩ゛。培養であるｇ　、、’ｘｊｉらの培 養は、第２０週まで（、゛相当数の前駆細胞を産生じた。一対のｔ−検定を用い た統計学的解析により、３．５７週の最適培地交換速度培養は、；３種の接挿密 度全てにおいて第８週以後に７７週及び１／週培養よりも１％１、／ベルの有意 性でかなり多くの顆粒球−マクロファージ前駆細胞を産生ずることゾ）５示され た。産生きれＩ・−前駆細胞数は幹細胞再生の非直接的なＲ度なので、重要であ る。前駆口胞は、培養中じ依然として存在する初期細胞、」−、；そらくは幹細 胞から分化することにより、培養の数週間後に存在することが可能である。した がって、これらのデータから、より生理学的で急速な培地／血清交換速度及びよ り高い細胞密度が、５ケ月間の幹細胞再生の幾分かを支持ジーる条・件を提供し たであろうことが示唆される。

非付着性細胞形態：　３．５７週培養により支持される延長化造血機能がそれ以 外の培賃物では性質り界なるか否かを決定するために、第１０週と第１９週の間 に集められた非付着性細胞を染色１１７、形態学的に分類した。３７週及び７７ 週の交換速度において、産生された細胞の大部分は、第１５週付近及びそれ以降 ではマク１コフアージであり（表３）、それは他の研究機関における研究で得ら れた７結采と同様であった。イれとは反対に、週当たり３．５培地体積の速度で 潅流され、５Ｘ１．Ｏ’細細胞カマ播種された培養物は、１９週間を通ｌ：、て マクロファージたけでなく顆粒球をも産生じた。したがって１．二の培地交換速 度及び接種密度はインとＩ・口においてより効果的に顆粒球機能を再構築したと 考えられる。

この結果は、長期ヒトデクスター培養条件が次善であり、かつインビボ造血環境 に近いより優れたインビトロ培養として、骨髄エクスビボのより効果的な再構築 が達成できることを支持するものである。

ｍ外観：　培地交換速度は、培養物の物理的外観に著しく影響した。培養の１０ 週付近で、７７週培養では多数の脂肪細胞が間質に生じ、一方３．５／週培養で はわずかに脂肪細胞が生じ、１７週培養では脂肪細胞は全く生じなかった。２６ 週で培養が終結した時、７７週培養の間質はおよそ２０〜３０％の脂肪細胞から なるが、３．５７週培養ではわずかな脂肪細胞を有するたけであった。付着性コ ロニー分布も、培地潅流速度の異なる培養間ではそれぞれ異なる。３゜５７週培 養における付着性コロニーは、７７週及び１７週培養のものよりも長期間存続し た。

１１、ｊ　る　地の　を　Ａせた声 細胞：　ヒト骨髄細胞は、通知承諾に従い、腸骨稜からの吸引物にヘパリンを加 えたものから、ユニパーシティ・オブ・ミシカン・ヒユーマン・インベスティチ ーション・コミツテイ−（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｈｉｇａｎ　Ｈ ｕｍａｎ　Ｉｎｖｅｎｓｔｉｇａｔｉｏｎ　Ｃ。

ｍｍ１ｔｔｅｅ）から提供されたプロトコールに基づいて得た。骨髄をフィコー ル−バク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配遠心分離により分離し、低密度細胞（ ＜　１．０７７ｇｍ／ａｍ３）を集め、ＩＭＤＭで３回洗浄した。細胞を２回目 と３回目の洗浄の間にカウントした。その後、細胞を６−ウェル組織培養プレー ト（Ｃｏｓｔａｒ　Ｎｏ、　３４０６）又はコラーゲン被覆６−ウェルプレート （ウサギ尾タイプ１コラーゲン、　Ｂｉｏｃｏａｔ、　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉ ｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、カタログＮｏ、　４０４００）上に１．５ｍ Ｑ／ウェルで、５ＸＩＯ’細胞／ｎｉｌで２連に播種した。

ｔＭｉ！ｆａ：　使用した培地は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１０％ウマ血清（Ｈ７ｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、　１０．０Ｏ ＯＵ／唾ペニシリンＧ及び１０１ｇ／Ｔｎｆ１ストレプトマイシン、カタログＮ ｏ。

Ｐ３５３９）及び１０−’Ｍヒドロコルチゾン（１７−ヒトロキシコルチコステ ロン、　Ｓｉｇｍａ。

カタログＮｏ、　ＨＯ８８８）を含有するＩＭＤＭ　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、カタログＮｏ、　４３０−２２００）である。

’　ＨＧＨ：　急速培地交換による頻繁培地補給により、造血成長因子はクロー ナルアッセイ４において最大限のコロニー形成を促進することがわかっているお よそ１／２０の濃度で培地に添加した。使用された濃度はＩＬ−３がｌｏｇ／ｍ Ｑ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（Ａｍｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログＮｏ、　 １３０５０１が１　ｎｇ／ｍｌｌ、Ｅｐｏ　（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｓ、 　Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、　Ｃａｎａｄａ）がＯ，１０７ｍ１１であった。

造血前駆細胞７ｖ＋＜　：　培地から除去された非付着性造血細胞をカウントし 、ｌＸｌ０６細＋ｔａ／ｍｅ又はそれ以下の細胞をメチルセルロースにプレート した。ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＥｐｏを該メチルセルロースにそれぞれ２０ｎｇ／顧及 び２　Ｕ／ｍＱで添加した。細胞を２４−ウェルプレートに０．２５１ｒｆｌ／ ウエルでプレートし、３７℃で１４日間インキュベートした。その後、コロニー を倒立顕微鏡下でカウントし、５０細胞より大きいコロニーはＧＭ−コロニー形 成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭ）　、赤芽球コロニ一群一形成ユニット（ＢＦＵ−Ｅ ）、又は顆粒球赤芽球巨核球マクロファージ−コロニー形成ユニット（ＣＦＵ− ＧＥＭＭ）として記録した。

用１旦μｌ生：　培養は湿潤５％ＣＯ□／９５％空気雰囲気下、３７°Ｃでイ゛ ／キュベー卜シ、５０％毎日培地交換の速度で潅流（培地交換）した。培養の第 １週の間、毎日培地交換の間に除去された細胞は全て遠心分離して元のウェルに 戻した。

培養１週間後、全非付着性細胞の５０％を、培地交換の間培養物から週２回除去 し、単核化細胞をカウントし、新規培地をウェルに戻し、た。細胞をカウントシ ない残りの５日／週は、培地の５０％を各培養ウェルから除去し、新規培地で置 き換えた。

除去した培地は遠心分離し、培地を細胞ベレットからデカントし、細胞を元のウ ェルに戻した。

統２：　培養グループ間に相当な差異が生じる確率は、一対のｔ検定を用いて、 造血成長因子を補給した急速潅流培養物と対する未処理コントロール培養物との 標準化累積細胞産生値の比較により決定した。統計学的有意性は５％レベルで判 定した。組織培養プラスティック上で培養された対抗する急速潅流ＬＴＢＭＣと Ｉ型うット尾コラーゲンには５％レベルで統計的な差異はなかった。

したがって、プラスティック及びコラーゲンマトリックスについてのデータは、 ここにおける図及びそれ以外の図を提示するために組合せ、この組合せのデータ について統計学的解析を行なった。

結果： 急速交換へれた成長因子補給り工刀ＭＣ１ζおけ不徊胞産忠Φ速度論：　長期骨 髄培養（ＬＴＢＭＣ）の寿命と産生能が不十分なＨＧＦの産生により制限される 、という仮説の第１のテストとして、我々は、ＩＬ−３又はＥｐｏが補給された 急速交換エクスビボ骨髄培養を保持した。これらの培養物においては、培地の５ ０％が毎日除去され、ＩＬ−３叉はＥｐｏが補給された同体積の新規培地で置き 換えられた。その後、除去細胞を遠心分離し、培地をデカントして捨て、細胞を 再懸濁し、元の培養物に戻した。ＩＬ−３及びＥｐｏはそれぞれ急速交換ＬＴＢ ＭＣの細胞産生能を促進した。初めからＥｐｏのみを含有する培養物は、実質的 に終結した赤血球の分化により高い細胞産生速度を示した。しかし、４週付近で 、赤血球形成は終了し、細胞産生速度はコントロール培養のレベルまで低下した 。

ＴＬ、３及びＥｐｏは、非付着性細胞産生において、１８週間を通して平均的な 増加を誘発し、コントロールに対して、それぞれ１７５％及び１７３％であった 。

成長因子の組合せは、非付着性細胞産生速度を増加させることにおいて、より効 果的であることが明らかになった。細胞産生のＲ高速度は、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ ８Ｆ＋Ｅｐｏの組合ぜにおいて観察された。これらの培養は、培養において最初 の６週間に週２回接種された細胞数のおよ王２５％を産生じ、非付着性細胞産生 が第２〜８週の間にコントロールに対して平均４．８倍増加した。ＩＬ−３＋Ｇ Ｍ−Ｃ８Ｆの組合せでは、８週通して非付着性細胞がコントロールに比較して平 均３．５倍増加した。分離実験において、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏの組 み合わせにＩＬ−６及びＧ−Ｃ８Ｆのいずれも添加しない場合には、非付着性細 胞産生速度は改善されたが、その代わり、結果的に細胞産生速度が、ＩＬ−３＋ ＧＭ−Ｃ８Ｆの組合せを含有する培養と区別できなくなった。いずれの場合も、 ＨＧＦｆｉ加により誘発される細胞産生における刺激効果は０〜８週の間で最大 となったが、細胞産生は培養全般を通じてコントロールよりも高かった。

ＨＧＦを組合せることにより、急速交換ＬＴＢＭＣにおいて非常に多数の非付着 性細胞が産生された。培養物の産生能は、接種細胞数（Ｃｏ）に対する経時的産 生細胞累積数（ΣＬ＋、ｃ、、ｃ、は時間ｊにおいて集められた非付着性細胞の 数）を、時間の関数としてその割合（Σ’ｌ　＋ｌＩ　Ｃｉｐ　Ｃｏ）をプロッ トして比較することにより示すことができる。この比率が１を越える場合、培養 物は接種された細胞よりも多く細胞を産生じ、この培養物では細胞数が増大１″ □ろ、。

ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏの組合セ文より、接種細胞数よりも３信置りの 累積細胞産生が誘発された。この細胞産生速度は、培養におｉ−］る初めの６週 間で最高であり、この間、培養は２Ｒ間毎に接種された細胞数とおよそ同数の細 胞を産生じた。この最高細胞産生速度は、推定インビボ骨髄細胞産生速度の１５ ％であり、そこでは骨髄細胞塊の５０％が毎日発生する。１培養第３〜７週の間 におい′τ、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆの組合せは、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅ ｐｏの組合せと同等の速度で細胞数は２倍以上増大した。ＨＧＦが補給されない 未処理の急速交換（５０％毎日培地交換）及び遅交換（５０％培地交換週２回） コントロール培養は、それぞれ１８週以降に接種された細胞数の約１及び０，３ ７倍を産生１１．た。より重要なことは、これらの非補給培養物から除去された 全細鞄の半分以上が最初の２つのサンプリングに由来していたことであり、さら にこれらの細胞の多くが初めの接種物からのものであること、及び培養物にＨＧ Ｆを補給することが前駆体と幹細胞の重要なサンプリングを誘発するために必要 であることを示した１丁とである。

非伺１性州胞Φ形態了的Ｍ折：　複数のＨＧＦの添加もまた、培養物で産生され る骨髄細胞の多様性を増加させた。コントロール培養は、培養の第３週後に主に マクロファージである非付着性細胞を産生した。赤血球系細胞の産生ば急に減少 し、第５週後にはわずかな赤血球系細胞しか検出されなかノた。Ｅｐｏを含有す る培養（Ｅｐｏ単独、ＩＬ−３＋Ｅｐｏ、及びＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ十ＥｐＯ ）では、赤血球系細胞の産生は一時的に増加し、高パーセンテージ（５５〜７５ ％）の赤血球系である非付着性細胞が３週を通じて産生された。ＩＬ−３＋Ｅｐ ｏ±ＧＭ−Ｃ８Ｆが存在する場合、培養は続き、培養１６週を通じて、赤血球系 として分類された約５〜１５％の非付着性細胞と共に、赤血球系細胞を産生じた 。したがって、ＩＬ−３＋Ｅｐｏの存在下では、赤血球形成は始終活性であった 。

ＩＬ−３±Ｅｐｏでは、第５週に、主に（６０〜７０％）後期顆粒球（ＬＧ）で ある非付着性細胞集団が生じた。ＬＧのパーセンテージは着々と減少し、第１８ 週で約２０％までになった。それに対応してマクロファージの産生が増加した。

ＧＭ−Ｃ８ＦをＩＬ、−３±Ｅｐｏに添加した場合は、高パーセンテージのＬＧ ′ｂＳ１８週を通じて存続した。したがって、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆの組合せ により、培養の１８週に活性な顆粒球形成が起こり、同様にＥｐｏを添加するこ とにより赤血球形成も保持された。培養５．５週でのコントロール及びＩＬ−３ ＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏを補給した培養の顕微鏡写真からは、培養密度及び産生 細胞の多様性がめざましく向上したことがわかる。

弗付看性前駆細胞産＄曵迷庫涜：　前駆細胞量は、複数のＨＧＦを添加するにし たがって増加した。未処理のコントロールにおける顆粒球マクロファージコロニ ー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭｓ）の産生は、１８週間以上にわたり長く安定で あり、それは急速に潅流されたＨＧＦ無添加のＬＴＥＭＣを用いて得られた初期 の結果と一致する。ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ及び工Ｌ−３＋Ｅｐｏ±ＧＭ−Ｃ３ Ｆ培養中で産生されたＣＦＵ−ＧＭは、第３・・５週の間ではコントロールのお よそ１０倍であった。

ヒトＴ、ＴＢＭＣにおける赤芽球コロ：ニ一群形成゛７−−ツト（ＢＦＵ−Ｅ） の産生は低く、すぐに終結してしまうことが報告されている（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ 　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｌｏｏｄ（１９９０）　７５（団：　２１１８−２１２９１ ゜急速交換で未処理のコントロールは、ＢＦＵ−Ｅ産生が急速に減少１１．たが 、培！１１７週を通じて低！、・ベルのＢＦＵ−Ｅが産生された。、Ｅｐｏた（ プを添加しても、産生されるＢ　Ｆ　ｔ、、Ｊ−Ｅの数はイーれほど大きな影響 を受けなかった。ＩＬ−３だけを添加すると、第３〜５週においてＢＦＵ−Ｅ産 生の穏やかな短い刺激が誘発された。一方、ＩＬ−３にＥｐｏ叉はＧＭ　Ｃ３Ｆ のいずれかを加えたものは、培養第３〜５週の間に非付着性ＢＦＵ−Ｅｌ／ベル がコントロールに比べて１０〜２０倍増加した。

細胞　ヒト骨髄細胞は通知承諾に従い、腸骨稜からの吸引物にヘパリンを加えた ものから、ユニパーシティ・オプ・ミシガン・ヒユーマン・インベステイチーシ ョン・コミッテ４−　（Ｕｎｉｖｅｒｑｉ、ｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｅｈｉｇａｎ　Ｈ ｕｍａｎ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　Ｃｏｍｍ１ｔｔA ｅｅ）から提供されたプロトコールに基づいて得た。骨髄はフィコール−バク（ ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配遠心分離により分離し、低密度細胞（＜　１．０ ７７ｇｍ／ａｎ３）を集め、ＩＭＤＭで３回洗浄した。細胞を２回目と３回目の 洗浄の間にカウント１７た。ＣＤ１８遺伝子伝達実験を行なうために、骨髄は通 告承諾に従い、ＣＤ１８欠失患者提供者から得た。

骨髄細胞の系統降ｉ（し裏狂■）−選択　ＩＭＤＭでの３回目の洗浄後、成熟単 核細胞は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）混合物と共にインキュベートすること により、上記細胞調製物から除去した。１０７細胞を１、ｍＯのＭＡｂ混合液中 、氷上で１０〜１５分毎に静かに混ぜながら１時間インキュベートした。用いた ＭＡｂ混合液を表４に示す。

表４　系統÷骨髄単核細胞を分離するためのモノクローナル抗体の調製ＩＭＤＭ を加えて全量１００−のＭＡｂ混合液をつくり、濾過滅菌し、アリコートを１− カラムに分割し、−２０℃で貯蔵した。

細胞を過剰の氷冷ＩＭＤＭで３回洗浄し、４°Ｃで遠心分離した。適当量の磁気 ヤギ抗−マウスＩ　ｇ　（Ｂｉｏｍａｇ；　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｃａｒｐ、　、カタログＮｏ、　７４３４０−５０．１■／Ｔｎ ｆ１．５ｘ１０８粒子／輔）を水冷ＩＭＤＭで３回洗浄し、遠心分離した。

細胞を５０粒子／細胞で７〜イオマグに再懸濁し、Ｔ−２５叉はＴ−７５組織培 養フラスコに入江氷上で１／２時間、断続的に攪拌しながらインキュベートした 。

インキュベート後、フラスコを平らな磁石の上に置き、磁石をフラスコにしっか り留め、４°Ｃで１０〜１５分間インキュベートした。この磁石とフラスコを垂 直に立て、上清を集めた。遮光、磁石の添加、垂直に立てること、及び上清の収 集を伴うインキュベートを２回以上繰り返した。この細胞をカウントし、６−ウ ェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ　Ｎｏ、３４０６）に接種した。

墳養培填　使用した培地は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）　、１０％ウマ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、　１０．０００Ｕ ４ペニシリンＧ及び１０ＩＩＪＭｍｆｆｉストレプトマイシン、カタログＮｏ。

Ｐ３５３９）及び１０−５Ｍヒドロコルチゾン（１７−ヒトロキシコルチコステ ロン、　Ｓｉｇｍａ。

カタログＮｏ、　Ｈ２ＢＯ３）を含有するＩ　ＭＤＭ　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＮｏ、　４３０−２２００１である。

Ｍ↓育丙子　造血成長因子は最適なものを上記した。用いた濃度は１　ｎｇ／ｍ 又は０．４Ｕ／ｍｌｌのＩＬ−３（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡからの寄贈）、Ｉｎｇ／ｍｌｌのＧＭ−Ｃ８Ｆ　（ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡからの 寄贈）、５００／顧のＩ　Ｌ−１ａ　（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、　）　、０ ．　ＩＵ／ｍｌｌのＥｐｏ　（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｓ、　Ｖａｎｃｏ■ ｖｅｒ　Ｃａｎａｄａｌ、ｔｏｎｇ／ｍｌ＋のＭＧＦ（マスト細胞増殖因子、ｃ −ｋｉｔリカンド、　Ｉ＋ａｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、、　５ｅａｔｔｌｅ、　Ｗ Ａ）　、及び２．　Ｏｎｇ／ｍＱのヒブリカイン（［ＰＩＩＹ３２１］　Ｉｍｍ ｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、、　８ｅａｔｔｌｅ、　ＷＡ）であった。

造血前駆細絶Ｚ里欠子　毎週のサンプリングで培養物から除去された非付着性造 血細胞をカウントし、１〜１０’細胞／Ｔｒｆ１又はそれ以下の細胞をメチルセ ルロースにプレートした。ＭＧＦ、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＥｐｏを該メチルセルロー スにそれぞれ５０ｎｇ／ｍｅ、２０ｎｇ／ｍＱ及び２　Ｕ／ｍ１１ｆｉ加した。

細胞を２４−ウェルのプレートに０．２５ｍ１／ウエルでプレートし、３７℃で １４日間インキュベートした。その後、コロニーを倒立顕微鏡下でカウントし、 ５０細胞以上のコロニーをＧＭ−コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＭ）　、赤 芽球コロニ一群−形成ユニット（ＢＦＵ−Ｅ）　、又は顆粒球赤血球巨核球マク ロファージ−コロニー形成ユニット（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）として記録した。

レトロウィルス　生　、　２つのレトロウィルス産生細胞系をメモリアル・スロ ーン・ケタ−リング・キャンサー・センター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ　５ｌｏａｎ　 Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ Ｙ）のドクター・エリ−・ギルボア（Ｄｒ、　Ｅｌｉ　Ｇ１１ｂｏａ）の研究室 から入手した。この細胞系は、哺乳動物ネオマイシンアナログＧ４１８耐性を付 与するネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼ産生ＮＥＯ遺伝子を含有する アンホトロフィックなウィルス性粒子を産生ずる。また、この両細胞系は、レト ロウィルスに感染した細胞がそれ自身感染性のウィルスを産生じないように、必 要なレトロウィルス遺伝子が欠損しているレトロウィルス粒子を産生する。

パッケージング細胞系を含有するＳＡＸは、改変モロニー・ムリン・ロイケミア ・ウィルス［Ｍｏ１ｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｇｌ 　（ＭｏＭｕＬＶ）を含有する３Ｔ３系細胞系である。ＳＡＸプロウィルスはＮ ＥＯ遺伝子、５Ｖ−４０促進化アデノシンデアミナーゼ遺伝子をＸｈｏｌ制限部 位に含有する。また、このＳＡＸプロウィルスはφパッケージング領域を含有す るが、ｇａｇ　（コア蛋白質）、ｐｏｌ（リバーストランスクリブターゼ）及び ｅｎｖ（エンベロープ蛋白質）遺伝子が欠損している。この第２のレトロウィル ス粒子は外来ＤＮＡのダブルコピーを含有しており、このレトロウィルス粒子は ＤＣ−２９（ダブルコピー−２９番目クローン）と表わされる。ＤＣ−２９プロ ウイルスは、ＮＥＯ遺伝子及びその他のレトロウィルス性及び外来のＤＮＡの２ つのコピーを３Ｔ３細胞系に含有している。

ＣＤ１８試験を行なうために、ヒトＣＤ１９　ｃＤＮＡ全長を含有するレトロウ ィルスベクターに感染したアンホトロフィックなパッケージング細胞Ｐｓｉ−Ｃ ｒｉｐを用いた［Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０１ ２４８：１４１３−１４１６）。このレトロウィルスにおいて、ヒトＣＤ１８の ｃＤＮＡ全長は、ＢＡ−ＣＤ１８と呼ばれるトリβ−アクチン遺伝子の５′領域 をスキャンしている異種配列から組換え遺伝子を発現するベクターのＢａｍＨ１ 部位にクローンされた。ヒト・サイトメガロウィルスの５′方向から即時型初期 （ＩＥ）遺伝子までの配列をＰＵＣ１９にサブクローンし、ＩＥ促進配列を含有 する部分をＸｈｏｌ上で（ポリリンカーから）Ｎｃｏｌ　（ＩＥ遺伝子の−２２ ０）フラグメントまで除去した。合成リンカ−を用いてＮｃｏ１部位をＸｈｏ１ 部位に変換し、この改変フラグメントを５′からβ−アクチンプロモータ一方向 に配置したＢＡ−ＣＤ１８のＸｈｏ１部位にクローンした。この新しいベクター をＣＭＶ−ＢＡ−ＣＤ１８と呼んだ。

レ　ロ　ルス　ＳＡＸレトロウィルス粒子はドクター・エリ−・ギルボア（Ｄｒ 、　Ｅｌｉ　Ｇ１１ｂｏａ）の研究室のドクター・クレイ・スミス（Ｄｒ、　Ｃ １ａｙ　Ｓｍ１ｔｈ）より、凍結して一８０℃で保存されたウィルスの上清溶液 として提供された。

ＤＣ−２９及びＣＤ１８レトロウィルス粒子は、ＤＣ−２９及びＣＤ１８ウイル スパツケージング系をＴ−７５フラスコ内でほとんど集密するまで増殖させ、培 地を全て交換し、細胞を１２〜１５時間インキュベートし、その後ウィルス粒子 を含有する培地を集めることにより産生させた。その後、この上清を含有するウ ィルスを遠心分離してウィルスパッケージング細胞を除去し、培地を除去して、 アリコート中、−８０℃で凍結した。

ＳＡＸレトロウィルス　ＤＣ２９レトロ　ルス　はＣＤ１８レトロ　シス上　Ｌ ＴＢＭＣ培養物を湿潤５％Ｃｏ２／９５％空気雰囲気下、３７℃でインキュベー トした。培養の最初の２週間は毎日、培地の２／３　（１ｍｌｌ）を各培養ウェ ルから除去し、培地をＨＧＦ　（０，８５ｍ１１）及びウィルス細胞産生上清（ ０゜１５ｍ）を含有する同体積の新規培地で置き換えた。レトロウィルス上清を 含有する培地を使用直前に解凍し、使用する必要がない場合には冷凍庫の氷上で 保存した。培養物から除去された培地を遠心分離し、培地をデカントし、細胞を 元のウェルに戻した。

ＳＡＸし　ロ　イルスパッケージング　し−ＬＴＢＭＣＳＡＸレトロウィルスパ ッケージング細胞系をＴ−２５フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｎｏ、３０５６）内 でおよそ１０％集密するまで生育させ、それから２０００ラドの放射線にさらし た。上記のようにして調製された造血細胞を照射ウィルス産生細胞に添加し、５ ０％毎日培地交換して全細胞をウェルに戻しながら２．５週間培養した。培養２ ．５目上に、ＥＤＴＡの０．５ｍＭ溶液をフラスコに添加し、間質は残したまま 造血細胞を除去した。除去された造血細胞を、ウェル当たり１０００細胞の新た にトリプシンを添加した骨髄線維芽細胞とともに６−ウェルプレートの３ウエル に添加した。

感乗り工旦ＭΩのサン１Ｗング　培養２週目の初めに、レトロウィルス添加が終 了又は共培養が終了した後で、解析するために交換培地中の非付着性細胞を週に 一度除去しながら、培養物を一日当たり５０％の培地交換した。毎日培地交換を 行なっている間、非付着性細胞を培養物から除去し、単核細胞をカウントし、新 規培地をウェルに戻した。細胞をカウントしない残りの６日／週には、培地の５ ０％を各培養ウェルから除去し、新規培地で置き換え、除去した培地を遠心分離 し、培地を細胞ベレットからデカントして、細胞を元のウェルに戻した。

レトロウィルス、　の　初めの骨髄接種物を、０．０，４．０．８．１．２．１ ，６及び２゜Ｏ１＆／−の　０４１８にプレートし、ポスト感染骨髄細胞をプレ ートするための０４１８の濃度決定用死滅曲線（ｋｉｌｌ　ｃｕｒｖｅ）を得た 。培養物から除去された細胞は０．０．０．８、及び１．６１ｇ／ｍＱのＧ４１ ８を含有するメチルセルロースにプレートした。２週間後、前駆細胞のコロニー 数をメチルセルロース中で数えた。その後、各コロニーをメチルセルロースから 掻き取り、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）によりレトロウィ ルスＤＮＡをアッセイした。

級肚宇的解析　培養グループ間に有意差が生じる確率は、一対のｔ検定を用いて 、試験サンプルと対するコントロール培養物との累積細胞産生値を比較オること により決定した。統計学的な有意性は５％レベルで判定した。

結果 ＳＡ才１に±↓すλイル囚を用髪）な−１４上−ワウイノにス季采５ノー（ｋ上 −ワーウイノにス感束トＴＢ−ＭＱにおける細胞産生の速度論　Ｌ＝１−ロウイ ルス感染した培地における細胞産生はレトロウィルス感染の可能性の指標であり 、したがって、測定の有用なパラメーターである。ターゲット細胞ゲノムへのし トロウィルスの組込みは、唯一、細胞分裂の間に起こると考えられる。この理由 により、増大する培養産生性は幹細胞有糸分裂の可能性を高め、したがって）メ トロウィルス感染の可能性を高めるものである。最高の細胞産生は、培養の４週 間を通じて産生細胞数を増加させるＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ　３＋ＧＭ 　Ｃ８Ｆ＋Ｉ’Ｌ−１αを補給した上清ウィルス添加培養物において起こる。Ｓ ＡＸウィルスパッケージング細胞と共培養されたＬＴＢＭＣは、２週目に−に清 添加培地よりも多くの細胞を産生じたが、２週目以後では細胞産生は減少した。

よｇシ〜Ｘ！ケらヤス含有−し−工一旦ＭΩに、おり３１し上−見りイールス感 碧じ勇判子　高［０４１８］中で生存している前駆細胞のパーセンテージは、Ｉ Ｌ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ又はＩＬ、−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋ＩＬ−１α補給培養物で は、培養の初めの４〜６週において２〜５０％と様々であった。培養第１０週付 近（８週間後にはウィルスの添加は終了していた）では、造血コロニーにクロー ン可能な前駆細胞数の４３％が０４１８にさらされて生存していた。このことか ら、レトロウィルスによって培養物中に存在する幹細胞に転移された０４１８耐 性遺伝子を含有するウィルスにより、最初の感染１４日間で、これらの前駆細胞 が０４１８耐性になっていたことが示される。急速に潅流されたＨＧＦ無補給培 養物は、第８遍と第１１週の間に、平均１２％の高［０４１８］中生存前駆細胞 を有していた。１１週で培養が終了した時、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ補給培養の 間質層にはトリプリジンが添加さ江間質に付着した前駆細胞の１７％が高［０４ １８］中で生存していた。これは、相当なパーセンテージの付着前駆細胞もＳＡ Ｘウィルスに感染したことを示唆するものである。

那Δにい之工自ルー各２さ？ｙヶ二二ンン一くｒオａｖ罰ジ、ξＪ夫培薯ズ１わ り賢工Ｊ「旦）１（ｉ二１５」オーイ１し上見ワイ少ス感宋Φ邂折　照射を受け たＳＡＸ細胞と共培養した場合、０４１８中で生存している前駆細胞のパーセン テージは、０〜３６％と様々であった。ＨＧＦが補給されない培養は、高［０４ １８］中で第４〜７週の間のみ生存するＣＦｔＪ−ＧＭを産生じた。第７週以後 、高［０４１８］中で生存するＣＦｔＪ−ＧＭは、これらの培養では全く産生さ れず、これは、幹細胞の感染がほとんど、あるいは全く起こらなかったことを示 唆する。ＴＬ　３４−ＧＭ−Ｃ８Ｆが補給され照射ＳＡＸ細胞と２．５週間其培 養されたＬＴＢＭＣは、０、ｂｇ／雛　Ｇ４１８中で第４．５及び８週において 生存するＣＦＵ−ＧＭを高パーセンテージ産生した。しかし、第１０週で、これ らの培養は０４１８に耐性のＣＦＵ　ＧＭを産生じなくなった。

このことは、これらの培養では幹細胞の感染がほとんど、あるいは全く起こらな かったか、又は幹細胞が分化あるいは死滅し７ただろ・うことを示唆するもので ある。、ｐＧ−、−２Ｍｋ上ワウイル入明（Ｎたシトーワウイルメ４ｖ窮■２ρ −二Ｔン李−９ｊｊ：／トｑ−ケイル−ス碧各り敞しｑ■、工ＶすＹ■；仁郭け る李円鵬り；ｇ）＾Ｖ度１術ＤＣ−２９レトロウィルス十消に感染した培養中で 産生される細胞数はＨＧＦ依存性であった。ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏ補 給培養では、培養の１０週間を通じて週毎に１．５〜４　Ｘ　１０’細胞が産生 された。ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ３Ｆ＋Ｅｐｏ＋ＭＧＦ補給培養ではさらに多いが、 ヒブリカイン＋Ｅｐｏ補給培養では最も高い細胞産生が見られた。興味深いこと は、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏは補給されているがＤＣ−２９レトロウイ ルス上清が添加されていないコントロール培養は、ＤＣ，−２９レトロウイルス 上清が添加されている類似の培養よりもそれほど多くなかったことである。ＩＬ −３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ十Ｅｐｏ、ＩＬ−３＋ＧＭ−ＣＳＦ十Ｅｐｏ＋ＭＧＦ及びヒ ブリカイン＋Ｅｐｏ培養（ウィルス添加）における細胞産生は、それぞれ５％、 １％及び１％の有意性において、コントロール培養（ＩＬ−３＋ＧＭ−〇ＳＦ＋ Ｅｐｏ、ウィルス無添加）よりも著しく高かった。レトロウィルス上清添加培養 における産生の増加の一部は、３Ｔ３系パツケージング細胞系により産生される ことが知られているＭＧＦ　（ｃ−に、ｉｔリガンド）などの成長因子の存在に よるものであろう。

上清旦Ｑ二？−９りｉ少スス添加旦−Ｈ，ｃゆお（力４にしワーヴイルス感來− の解析レトロウィルス感染の効率は、１．６１１ｇ７／ｍＱ　Ｇ　４１８中のＣ ＦＵ−ＧＭ生存、レトロウィルス感染前に全骨髄細胞を死滅させる濃度により評 価した。第８週（６週間後に感染）におけるＣＦＵ−ＧＭ生存の平均パーセンテ ージは全ての感染培養において高いものであった（表５参照）。

ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ３Ｆ＋Ｅｐｏの組合せにＭＧＦを添加すると、培養の第８〜 １０週における感染効率が増大し、培養物の一つは７．７％の０４１８耐性コロ ニーを含有していると考えられる。第８週におけるデータからは、ヒブリカイン ＋Ｅｐｏ補給培養物が高い感染効率を有していたことが示唆されるが、第１０週 のデータでは感染が全く起こらなかったことが示唆される。第１０週では、いく つかの培養物から除去されたＣＦＵ−ＧＭの数は減少し、およそ１０％感染にお いて、Ｃ、ＦＵ−ＧＭはほとんど、あるいは全く見られないと予想されたであろ うことに注目されたい。さらに、！、　５ｗｋ／ｍｌｌ　Ｇ４１８は極めて高い 抗生物質処方量であり、わずかに次善の最適レベルでさえトランスフェクトされ た０４１８耐性遺伝子の効能を封じ込めるにおそらく十分である。したがって、 これらの培養における造血幹細胞への遺伝子転移の効率は、いくつかのサンプル においては少なくとも７゜７％であるが、おそらく４５％程度又はそれ以上であ ろう。

・寸の これらの試験におけるレトロウィルス感染の解析は、前駆細胞をアッセイして幹 細胞の存在、感染及びサイクリングを推察することによるので、培養におけるＨ ＧＦの前駆細胞産生への効果を調べることは重要である。また、このレトロウィ ルス試験において、ＭＧＦ及びヒブリカインは他のＨＧＦとの組合せで用いられ るものである。従来ＭＧＦ及びヒブリカインは共にＬＴＢＭＣが補給された急速 潅流化ＨＧＦには用いられておらず、したがってそれらの造血形成への効果を調 べることが必要である。

前駆細胞産生は、ＨＧＦ補給に大きく依存した。培養物から除去されたＣＦＵ− ＧＭの数を表６に示す。

表６　ＤＣ−２９、ＨＧＦ補給急速潅流ヒト長期骨髄培養において除去された前 駆細胞の蓄積数 ２週毎に培養物からのサンプルをＣＦＵ−ＧＭについてアッセイし、アッセイさ れない値は２つの既知データより線形内挿してめた。既知及び内挿した値を集計 し、培地から除去したＣＦＵ−ＧＭの全数を見積もった。

レトロウィルス上清の添加により、前駆細胞除去はレトロウィルス上清無添加の 場合の２．２倍に増加した。レトロウィルス上清及びＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ３Ｆ＋ Ｅｐｏ＋ＭＧＦ又はヒブリカイン＋Ｅｐｏ補給培養物において除去されたＣＦＵ −ＧＭの数の増加は、それぞれ非感染コントロールの４．２及び３．８倍大きい ものであった。ＣＦＵ−ＧＭの除去は、接種されたＣＦＵ−ＧＭの数と比較した 時、全てのウィルス補給培養において１％レベルの有意性で統計学上重要であっ た。

における寸　生 ＣＦＵ−ＧＭ区分における集団バランスは、ＭＧＦ又はヒブリカインのＩＬ−３ ＋ＧＭ−Ｃ３Ｆ＋Ｅｐｏ補給培養への添加が、ＣＦＵ−０Ｍプールにおいてかな りの正の効果を有するものであることを示す。ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ３Ｆ十ＥｐＯ の組合せにＭＧＦを添加することは、ＭＧＦが補給されていない同様の培養と比 較して、ＣＦＵ−ＧＭ除去を１．９倍、ＣＦＵ−ＧＭ分化を０．５倍増大させた （表７参照）。

表７　成長因子補給ＤＣ−２９レトロウィルス感染急速潅流ヒト長期骨髄培養に おいて除去され、かつ分化されたＣＦＵ−ＧＭの蓄積産生２週毎に培養物からの サンプルをＣＦＵ−ＧＭについてアッセイし、アッセイされない値は２つの既知 データより線形内挿してめた。既知及び内挿した値を集計し、培地から除去した ＣＦＵ−ＧＭの全数を見積もった。

ヒブリカイン＋Ｅｐｏの組合せは、ＣＦＵ−ＧＭの産生及び分化において極めて 著しい効果を有していた。ヒブリカイン＋Ｅｐｏは、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ３Ｆ＋ ＥｐＯが補給された従来の最適培養と比較して、ＣＦＵ−ＧＭ除去において１゜ ８倍、ＣＦＵ−ＧＭ分化において３倍以上増大させた。また、ヒブリカイン＋Ｅ ｐｏは、ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏ十ＭＧＦの組合せのほとんど２倍の数 の顆粒球及びマクロファージの産生を誘発した。このことは、ヒプリカインが顆 粒球マクロファージ系の強力な誘発剤であることを示している。

レ　ロ　ルス　コー°　るＣＤ１８に　−か少解析　ＣＤ１８欠損骨髄は、上記 のようにして初期造血細胞を濃縮し、それから１．　Ｏｎｇ／ｍｌｌ／日ＧＭ− Ｃ８Ｆ及び１．　Ｏｎｇ／ｙｎＱ／日ＩＬ−３及び４０Ｕ／ｍｅ／日工Ｌ１α及 びＣＤ１８レトロウイルス産生糸上清を補給して、５０％毎日培地交換を行ない ながら１４日間培養した。第１５８目から、レトロウィルス上清を添加しないこ と以外は同様の条件下で該細胞を培養した。非付着性細胞を培養物から毎週除去 し、標準法によりビオチン添加した抗ＣＤ１８モノクローナル抗体を用いたフロ ーサイトメトリーで細胞表面ＣＤ１８の存在を調べた（Ｕｐｄｙｋｅ　ｅｔ　ａ ｌ　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

（１９８６１１２１：　７１７−７２５）。このアッセイにより、ＣＤ１８欠損 骨髄細胞はいかなる細胞表面ＣＤ１８も発現しなかったが、レトロウィルス感染 培地から生じた好中球及び単核細胞は細胞表面ＣＤ１８をまさに発現した。３連 の培地において、細胞表面ＣＤ１８の発現は、６週間で３．５％７５％７２％で あり、１１週間で１１％７２８％７３％であった。１１週間目に培地中に存在す る好中球及び単核細胞は、ＣＦＵ−ＧＭ前駆細胞から１０〜１４日たけ早く発生 したので、これらのデータは、培養の初めの２週間で、ヒト造血幹細胞が組換え レトロウィルスと、うまく安定にトランスフェクトされたことを示す。

この結果の解釈において重要なのは、数種のグループはヒト造血前駆細胞へのレ トロウィルス仲介遺伝子の転移を実証しているが、ヒト造血幹細胞への遺伝子転 移は示されていないことである。アッセイに必要な前駆細胞が存在しなかったの で、急速な細胞産生の減衰、ゆっくりと潅流されたヒトＬＴＢＭＣにより、感染 分析は制限されていた。

本研究において、レトロウィルスの感染は、初めに哺乳動物細胞抗生物質Ｇ４１ ８の存在下、メチルセルロース中のＬＴＢＭＣから除去された増殖細胞により評 価した。ＳＡＸ又はＤＣ−２９レトロウイルスに感染したＮＥＯ産生物を発現す る前駆細胞は、高濃度の０４１８中で生存しコロニーを形成できるであろうが、 感染していない細胞は高濃度の０４１８中で死滅するであろう。また、ウィルス 添加終了後６週間以上高濃度の０４１８中で生存する前駆細胞の産生においては 、それらの細胞が少し前により原始的な細胞（幹細胞）から分化していたことが 必要であり、したがって、幹細胞が感染していることが示唆される。同様に、好 中球及び単核細胞の表面に発現し、かつ培養の第１１週の間に産生されるＣＤ１ ８では、感染期間に存在する全ての成熟細胞、前駆体及びクロノジェニック（Ｃ ｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）な前駆体が培養中４〜５週間で死滅してしまうので、原始 的な造血幹細胞は培養の初めの２週間の間に感染していることが必要である。

ここにおいて用いられるレトロウィルス感染に関する解析では、ＮＥＯ遺伝子産 生物が十分に発現しないので、レトロウィルスに感染した細胞のパ・−センテー ジを軽視することができる。転移された遺伝子の産生物の発現の低さは、従来、 ヒト及び霊長類モデルにおける問題とされてきた。したがって、本研究における 感染前駆細胞のパーセンテージは、おそらく保守的な評価である。

高［０４１８］中で生存していた前駆細胞のパーセンテージは、ＳＡＸレトロウ ィルス上清で感染させ、かつＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ±ＩＬ−１αを補給した培 養の１０週目上おいて、およそ４０％であった。これらの結果は、高ハーセンア ージの幹細胞が、培養の最初の２週間でＩ／トロウィルス上清を補給した培養中 で感染したことを示す。

ＤＣ−２９レトロウイルスで感染した前駆細胞のパーセンテージは、ウィルス添 加終了後初めの４週間においてＩＴ、−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏ＋ＭＧＦ及び ヒブリカイン＋Ｅｐｏ培地中では高いものであった（０〜２１％）。この高ｌ／ ベル前駆細胞感染は、おそらくレトロウィルスによる前駆体及び原始細胞の直接 感染によるものであった。高０４１８濃度中で生存している前駆細胞のパーセン チ−・ジは、ウィルス添加終了後４週間で減少したが、２週間後には高Ｇ４１８ 濃度中での生存は０〜２２％に戻った。

このＤＣ−２９試験における０４１８耐性前駆細胞の産生は、実際にＤＣ＞２９ レトロウイルスに感染した前駆細胞のパーセンテージを軽視できるであろう。

感染したコロニーを選択するために用いられる高濃度の０４１８　（１，ｂｇ／ ｍ１２のＧ４１８）は、ＳＡＸ感染試験で用いられたものの２倍であり、生存す るためには、ＮＥＯ遺伝子産生物、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼの 高い発現レベルが必要である。

興味深いことに、上清を含有するＳＡＸ又はＤＣ−２９レトロウイルス、ＨＧＦ 　ＩＬ−３＋ＧＭ−Ｃ８Ｆ＋Ｅｐｏ、ＩＬ−１（Ｚ、又はＭＧＦ、又はヒブリカ イン＋Ｅｐｏの組合せのいずれかを補給したＬＴＢＭＣにおいて、０４１８中で 生存している前駆細胞のパーセンテージは、ウィルス添加終了後６〜８時間で増 加した。Ｇ４１８生存前駆細胞のパーセンテージが培養の後の段階になるに従っ て増加してゆくそのメカニズムはわかっていないが、一つの可能性としては、培 養の初めの２週間に感染した幹細胞が、培養が進行するに従ってより活性になっ たということである。これは０４１８中で生存している細胞のパーセンテージを 効果的に増加させるであろう。もう一つの可能性とし７ては、最初の感染培養期 間中に直接トランスフェクトされた前駆細胞とは異なる、より発現可能な組込み 部位を有する幹細胞からの分化により、ＮＥＯ遺伝子の発現が、培養中の後期に 産生された前駆細胞において増大したのだろうということである。したがって、 おそらくいくつかの原因によると考えられるが、培養におけるこの高レベルの前 駆細胞生存率は、幹細胞がこれらのＬＴＢＭＣ中で感染したことを強く示唆する ものである。

さらに、これらのデータは、本発明において開示された培養条件下で造血幹細胞 が培養中に増殖しており、レトロウィルスで転移された遺伝性物質をこれらの細 胞へ組込むことができることを証明するものである。前駆体はこれらの幹細胞か ら連続的かつ活発に産生され、これら前駆体の多くはトランスフェクトされた遺 伝子を含有し、発現した。これらのデータは、遺伝学的に改変されたヒト造血幹 細胞が存在し、これらの培養中で増殖していたことを示すものである。

■、大実 験、形貝転換細胞の形成 成長因子ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ　（Ｗｏｎｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２ ２８：８１０−８１５）を原核性発現ベクターに挿入した。ｈＧＭ−Ｃ３Ｆ　ｅ ＤＮＡ　（ＥｃｏＲＩ　〜Ａｈａｌｎ、およそ７００ｂｐフラグメント）をｐｓ Ｐ６５のＥｃｏＲＩ　〜ＰｓｔＩフラグメントにクローン化した（Ｍｅｌｔｏｎ 、　Ｎｕｅｌ、　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４１２：　７０３５−７０５６ ）　、　得られたプラスミドをＳＰ６５ＧＭ−Ｃ３Ｆとした。マウス　メタロチ オネインプロモーター（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、（１９８１１２ ９２：　２６７−２６９）をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、該プロモータ ーを含有するおよそ２ｋｂのフラグメントをｐｓＰ６５のＥｅｏＲＩ〜ＢａｍＨ Ｉフラグメントに挿入してｐ６５ＭＴを作製した。その浚、ｐＳＰ６５ＧＭ−Ｃ ８ＦをＥｅｏＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ） フラグメントを突出部に充填し、得られた連結されたＤＮＡをｌ−１ｊｎｄｌＴ Ｉで消化してＧＭ−〇ＳＦのコード領域からなる７００ｂｐフラグメントを単離 することにより、プラスミドｐＭＴ　ＧＭ−Ｃ３Ｆを構築した。このフラグメン トをｐ６５ＭＴの５ａｌＩ充填／Ｈｉｎｄｌ１１部位にザブクローンした。その 後、メタロチオネインプロモーター及びＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域を含む２゜７ｋ ｂフラグメントを単離し、５Ｖ−４０ブロモ−・ターが除去されたｐＳＶ２ｎｅ ｏ　［５ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒに、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　 Ｇｅｎｅｔ　（１９８２）　ｌ　３２７１においた。１：の結果、ＧＭ−Ｃ３Ｆ コ一ド配列の下流に５Ｖ−４０ポリＡシグナルが存在するものが得られた。

抗生物質ゲンタマイシン（Ｇ４１８）への耐性を付Ｊｊするネオマイシン耐性遺 伝子は、およそ３ｋｂＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離し、ＥｃｏＲ ，Ｉリンカ−をＰｖｕＩＩ部位におくことにより、ｐｓＶ２ｎｅｏから取り出し た。ＥｅｏＲＩ末端を有するｎｅｏ耐性遺伝子をＧＭ−Ｃ８Ｆ発現プラスミドの Ｅｅ。

Ｒ１部位にサブクローン化してプラスミドＭＴＧＭ−Ｃ３Ｆｎｅｏを作製した。

単独で、及び５Ｖ−４０プロモーター及びポリ八部位のコントロール下、ギボン エイブ（ｇｉｂｂｏｎ　ａｐｅ）　ＩＬ−３遺伝子をコヘードするプラスミドと 共にトランスフェクションするもの（Ｙａｎｇ、　Ｃｅ１ｌ　ｆ１９８６１４７ ：３−１０）としてのプラスミドＭＴＧＭ−Ｃ３Ｆｎｅｏを、線形化ＤＮＡの電 気穿孔法によりアフリカミトリサル細胞系ＣＶｆｆ及びマウス細胞系ＮＩＨ３Ｔ ３細胞へトランスフェクトした。形質転換細胞を、５００ｍｇ／ｍＩ２のＧ４１ ８を含有する培地選択により選択し、単離し、ＡＭＬ−１９３細胞（Ａｄａｍｓ 　ｅｔ、　ａｌ、　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　（１９８９）　３：　３１４１を用いる 上清のバイオアッセイにより、ＧＭ−Ｃ８Ｆ又はＩＬ−３の産生でスクリーンし た。その後、陽性の系のうちいくつかをでデクスター培養におけるヒト骨髄細胞 用ストローマとして使用した。

さらに、オカヤマのカルシウム／リン酸法（Ｃｈｅｎ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ、　（１９８７１７：２７４５−２７５２１を用いて正常マウス骨髄 細胞を上記プラスミドとトランスフェクトし、誘導遺伝子を効果的に発現するこ とがわかった。

トランスフェクトされた線維芽細胞によるＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ−３分泌を調べ た。無血清７２時間培養土清音ＮＩＨ−３Ｔ３細胞より得、ウサギ抗ＧＭ　Ｃ８ Ｆ又は抗ＩＬ−３抗体を中和することにより阻害可能なターゲット細胞にお（′ ３る３Ｈの取り込みによってｈＧＦ分泌をアッセイした。２Ｈｇ／ｙｄ　ＧＭ− Ｃ８Ｆにより誘発された増殖を１００ユニットＧＭ−Ｃ８Ｆとし、１０ｎｇ／ｍ ｌｌ　ＩＬ−３により誘発された増殖を１００ユニットＩＬ−３とした。共にト ランスフェクトされた細胞は、約３５　Ｕ／ｍｆｌのＧＭ−Ｃ３Ｆ及び約５７Ｕ ／ｍｕの］、Ｉ４−３を産生した。

Ｉｌ、　１ｉｆＶ：ｚ／ｊ二 潅流チャンバー・は、分解や生体融合する。−となく加圧滅菌できるようにチル リンｆＤｅｌｒｉｎ）キャップが付いたガラス製のシリンダーである。キャップ には円柱状のグルー・・ブがあり、そこへカラスシリンダーがフィツトづる。グ ループの底部にはチャンバ・−・のル・−・メン（ｌｕｍｅｎ）をシールするた めの０リングがある。キャップにはいくつかの穴があり、そこにはルアー（Ｌｕ ｅｒ　Ｌｏｋ）フィッティングがあり、さらにそのルアーフィッティングには付 着性及び／又は非（＝ｊ着性細胞をリンブリングするために、チャンバー中央部 へ伸びるチューブたけでなく、培地及びカス供給ラインも配置されている。この ギャップは、１２０°間隔でガラスシリンダーの外側に配置されている３つの長 いボルトで取（りけてあり、組立をしっかりさせるために蝶ナツト及びワッシャ ーが用いられている。

チャンバーはサイドの貯蔵槽に掛（′３る。ループにはポンプ、オンラインセン サーのチャンバー、酸素供給器、及びサンプル注入孔、さらにサイド培地貯蔵槽 がある。そして、サイド貯蔵槽中の培地は、セパレートポンプを用いてゆっくり 交換される。この構成は、酸素供給器及び潅流チャンバーを通じて培地交換速度 及び流速の独立制御を可能にする。前者は培地組成の長期変化を制御し潅流する ために用いら江後者はチャンバー中の溶解酸素の膨張及びフローパターンを制御 するために用いることができる。小さなメツシュのポリスルフォネート膜を用い れば、チャンバー内でのプラグフロー及び非常に正確な量の成長因子及びバイオ リアクターに導入させたい他の特別な成分の供給を正確に制御することが可能に なる。

トランスフェクトされた間質細胞は、寸断したコラーゲンスポンジ層の上に接種 されるか、あるいは該間質細胞はコラーゲンでプレコートされた５μ孔のポリカ ーボネートフィルターの片側に置か瓢間質細胞が長時間フィルターに付着できる ようになっている。細胞は、細胞質突出物を孔を通じて送りながら、細胞が片側 に集密するまで適当な栄養培地中で生育できるようになっている。その後、骨髄 細胞を膜のもう一方側に接種し、孔を通過して入り込んできた細胞質突出物に幹 細胞を付着させる。

ループのチャンバー及び成分を加熱滅菌した後、滅菌環境下でリアクターを組み 立てる。そして雑菌混入のサインをモニターしながら、培地をサイドループ及び チャンノ１−を通じて数日間循環させる。そしてバイオリアクターの中央部に、 細胞外マトリックスのみ、もしくは間質細胞を含有する前接種された細胞外マト リックス支持体を接種する。その代謝挙動及び／又は成長因子の反応性をモニタ ーしながら、間質細胞をその後数日間チャンバー内に保持してもよく、結果が満 足できるものであれば、骨髄細胞を接種するか、或いはすぐに骨髄細胞を接種す る。いずれの場合においても、細胞層は潅流チャンバーの中央底部に保持される 。

細胞にはさらに細胞外マトリックスを接種し、細胞層は支持体に付着する。膜が 使用される場合、チャンバーは倒置させてもよく、その場合、細胞層は中央部の 天井に位置する。この配置において、間質細胞への付着がゆるむと、成熟してい る細胞は中央チャンバーの底部に沈む。そして、非付着細胞は、培地潅流圧力に よって作動する出管の方への一定の細胞の流れにより採取される。

代表的な実験においては、第１日目にチャンバーでは、寸断されたコラーゲンス ポンジ支持体上にＮＩＨ−３Ｔ３細胞が接種される。最初の４０日間は、潅流速 度及び他の操作変数を調整した。４０日目にはかなり安定した状態になり、それ は約２０日間持続した。６４日目に、チャンバーに３３ｘｌＯ’ヒト骨髄細胞を 接種した。

初めの１０日間で、採取された細胞の数は減少し、３日毎に約７〜８ＸＩＯ’細 胞が産生される安定した状態に落ち着いた。フローサイトメトリー解析は、一定 のフラクション、すなわち採取細胞の約２０％はＨＬＡ−ＤＲ陽性であることを 示した。

９０日目には、ポンプの故障が起こり、ｐＨは一夜で６．９以下に下がった。潅 流速度を元に戻すと、非付着性細胞の産生は回復し、雑細菌混入が起こる前の安 定した状態の産生速度に近づいた。この時点で本研究を終了した。

上記の結果は、潅流チャンバーでは生体外造血形成を行なうことができ、ｐＨ下 落後造血形成を生体外で元に戻すことができるであろうことを証明し、またグル コース濃度のデータは、酸素添加が制限されることを示す乳酸塩濃度の増加が起 こらずに接種後にグルコース濃度が低下するので、おもに造血細胞はグルコース 上で好気的に生育することを示した。グルコース／乳酸塩（嫌気性）代謝は、主 にＮＩＨ−３Ｔ３間質層によると考えられる。同様に、一度造血細胞数がレベル ダウンすると、グルタミン及びアンモニア濃度は接種前のレベルになり、これは 骨髄細胞によるグルタミン消費が間質層と同レベルであったことを意味する。

■・　のモニ　１ング グルタミンとアンモニアのみならずグルコースと乳酸塩の消費及び形成速度もト ランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞についてめた。（培地はＩＭＤＭ＋２０ ％ＦＣ８であった。）グルコース消費の増加は毎日栄養補給したＴ−フラスコに ついて観察されたたけであったが、低頻度栄養供給培地では全てが、同じゆるや かに減少するグルコース摂取速度パターンに従う。毎日５０％交換した培養を、 第１８日日に毎日１００％交換スケジュールに変更したところ、グルコース消費 はただちに増加し、続いて第１日目から毎日１００％交換した培地において観察 されたものと同じ傾向を示した。グルコースにおける乳酸塩の収率が本質的に一 定である場合、乳酸塩産生速度は同様のパターンに従う（０，９乳酸塩／グルコ ース；主に嫌気性間質代謝であることを示している。）グルタミン及びアンモニ ア濃度は、グルコース／乳酸塩代謝に類似したパターンを示す。３７℃における グルタミンの化学的分解に対して補正された値を用いると、相対摂取速度を表わ すグルタミン消費速度対グルコース消費速度は一定で、約１＝８　グルタミン： グルコースである。予測される最適比率は酸素摂取速度に伴って変化し、最適摂 取速度が増加するに従って、比率は下がる。

同じようなことが、正常骨髄間質線維芽細胞から得られるグルコース／乳酸塩代 謝データからも支持された。低頻度培地交換の条件下においては、培養は根本的 には嫌気性であり、高い安定したレベルの乳酸塩の生成がすぐに達成され、かつ 持続した。より頻度の高い培地交換では、細胞代謝はより急速になり、グルコー ス消費及び乳酸塩産生は増加した。自然な化学的分解のデータを補正した後で、 グルコース消費が全く検出されないことが観察された。３Ｔ３細胞及び正常ヒト 骨髄細胞の両者にたいして、上記の血清／培地交換速度である場合、細胞は分割 し続け、ぎっしりと詰まり、それは臨界的な交換スケジュールである。

さらに血清の潅流速度対栄養素の還流速度の相対的な重要性を確認するために、 以下の実験を行なった：１）毎日交換される２０％血清含有培地の入った一組の Ｔ−フラスコ；２）２組のＴ−フラスコ、−組には２０％血清及び隔日交換され る培地が入っており、もう−組には１０％血清及び毎日交換される培地が入って いる；３）２組のＴ−フラスコ、−組は１０％血清及び隔日交換される培地が入 ってあり、もう−組には５％血清及び毎日交換される培地が入っている；４）２ 組のＴ−フラスコ、−組には５％血清及び隔日交換される培地が入っており、も う−組には２．５％血清及び毎日交換される培地が入っている。血清交換速度は 各グループで同じであるが、培地を含有する栄養素の交換速度は様々である。こ れらの実験の結果から、血清の交換速度が臨界的であることが示される。実験１ ）については、グルコース消費が増加し、第４日付近で実質的に安定して約９． ５ミリモルフ日の速度になったが、それ以外の全ての場合には、２倍量の血清を 用いて培地を隔日に交換、又は半量の血清を用いて培地を毎日交換したこととは 関係なく、グルコース消費はグループエの最初のグルコース消費以下からスター トして減少し、実質的に直線となった。このことは、間質細胞の代謝生育挙動に 影響する血清又は一つ以上の血清成分の臨界的な潅流速度が必要であることを支 持する。

上記の結果から、効果的な方法でバイオリアクター内で造血細胞を生育させるこ とができるであろうことは明確である。間質細胞は類似又は異種の提供源から提 供することができ、そこにおいて間質細胞は重要な成長因子を提供するための遺 伝子でトランスフェクトされている。この方法では、細胞の生育を補助するため に、血清を培地に添加する必要はない。造血細胞を間質細胞から分離することを 可能にする方法で支持体に付着する間質細胞を提供することにより、造血細胞は 連続的に採取されて利用される。因子の組合せを適当に選択することにより、造 血細胞の特異的な系統が生育されるであろう。さらに、所望により、遺伝子を造 血細胞へ導入するためのトランスフェクトウィルスの貯蔵槽として間質細胞を提 供してもよい。

本明細書中で引用されている全ての刊行物及び特許出願は、ここにおいて引例と して加入するものとし、各刊行物及び特許出願を明確に独立して引例に加入され るものとして示した。

＊＊＊＊＊ 明らかに、上記の技術から鑑みて本発明の多くの改変及び変形が可能である。

したがって、添付する請求の範囲内で、本発明はここにおいて特に記載した以外 の方法でも実施できることが理解される。

図１ 図２ 図４ａ 図５ａ 国際調査報告 フロントベージの続き （５１）Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理＃号／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１ ６ （３１）優先権主張番号　７４０，５９０（３２）優先口　１９９１年８月５日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定−ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，ＮＯ，ＳＵ ＦＩ （７２）発明者　パルソン、バーンハード　オー７アメリカ合衆国　４８１０５ 　ミシガン、アンアーバー、ビレッジ　グリーン　３７８゜アプト、２０４ （７２）発明者　シュワルツ、リチャード　エム。

アメリカ合衆国　４８１０５　ミシガン、アンアーバー、ポルゴス　サークル　 ３１８０

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト幹細胞を含有する細胞組成物を、約２４〜約４８時間当たり１ｍｌ培地 ／ｍｌ培養の速度で連続的又は周期的に交換される液体培養培地内で培養し、該 培養を生理学上許容しうる条件下に保持しながら代謝産生物を除去し、消費した 栄養素を補給することを特徴とするエクスビボでヒト幹細胞部を得るための培養 方法。
2. ２．培地が連続的に交換される、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．培地の交替が、新鮮培地をヒト幹細胞塊の少なくとも一部を通じて潅流され ることからなる、請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．培地が周期的に交換される、請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．培地の交替が、新鮮培地をヒト幹細胞塊の少なくとも一部を通じて潅流する ことにより行われる請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．培地が造血培養培地であり、ヒト末梢血単核細胞、ヒト骨髄細胞、ヒト胎児 肝細胞及びヒト臍帯血細胞から選ばれる少なくとも一つが培養される、請求の範 囲第１項記載の方法。
7. ７．パッキングに付着している血管間質細胞と幹細胞を含有するヒト造血細胞と を反応容器内で混合し、そこにおいて該間質細胞の少なくとも一部は形質転換さ れて、当該造血細胞の増殖、分化、あるいはその両者を制御する成長因子の少な くとも一つを分泌することができ；該反応容器を生理学上許容可能な条件下に保 持したまま、代謝産生物を除去し消費栄養素を補給しながら実質上連続的に該細 胞を栄養培地とともに該反応容器に潅流し；さらに 造血細胞を該反応器から採取するが、該反応容器内に接種された該ヒト造血細胞 が悪性細胞からなる疑いがある場合には、該潅流が、該間質細胞に対する悪性細 胞の親和力よりも大きくかつ正常造血細胞の親和力よりも小さな力を与えるよう な速度で行なわれることからなる、請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．造血細胞表面の剪断応力が約１．０ｄｙｎｅ／ｃｍ２より大きくなるような 潅流速度を用いることからなる、請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．遺伝子伝達ベクター存在下で細胞組成物を培養すること、及び安定かつ遺伝 学的に形質転換された幹細胞を得ることからなる、請求の範囲第１項記載の方法 。
10. １０．培地が連続的に交換される、請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．培地の交替がヒト幹細胞の塊の少なくとも一部を通して新鮮培地を潅流す ることからなる、請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．培地が周期的に交換されることからなる、請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．培地の交換がヒト幹細胞の塊の少なくとも一部を通して新鮮培地を潅流す ることからなる、請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．培地が造血培養培地であり、ヒト末梢血単核細胞、ヒト骨髄細胞、ヒト胎 児肝細胞、胎児性幹細胞及びヒト臍帯血細胞から選ばれる少なくとも一つが培養 される、請求の範囲第１項記載の方法。
15. １５．細胞組成物が幹細胞に関して濃縮されている、請求の範囲第９項記載の方 法。
16. １６．培養ヒト幹細胞が、安定かつ遺伝学的に形質転換されたヒト前駆細胞を産 生する、請求の範囲第９項記載の方法。
17. １７．培養ヒト幹細胞が、安定かつ遺伝学的に形質転換されたヒト造血前駆細胞 を産生する、請求の範囲第９項記載の方法。
18. １８．ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦを、各々０．１〜１００ｎｇ・ｍｌ−１・日− １の速度で培地に連続的に添加する、請求の範囲第９項記載の方法。
19. １９．マスト細胞成長因子が１〜１００ｎｇ・ｍｌ−１，日−１の速度で培地に 添加されるか、又はＩＬ−１αが３〜５日間に１０〜１００Ｕ・ｍｌ−１の速度 で培地に添加される、請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．マスト細胞成長因子が培地に添加される、請求の範囲第１項記載の方法。
21. ２１．ＩＬ−１αが培地に添加される、請求の範囲第１９項記載の方法。
22. ２２．マスト細胞成長因子及びＩＬ−αの両者が培地に添加される、請求の範囲 第１９項記載の方法。
23. ２３．培地が動物の血清又は血漿を含む、請求の範囲第９項記載の方法。
24. ２４．培地がコルチコステロイドを含む、請求の範囲第９項記載の方法。
25. ２５．培地中のグルコース濃度が５〜２０ｍＭの範囲内に、培地中の乳酸塩濃度 が約３５ｍＭ以下に、培地中のグルタミン濃度が１〜３ｍＭの範囲内に、かつ培 地中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ以下に保持されることからなる、請求の範囲 第９項記載の方法。
26. ２６．培養が１０−３〜１０−１（間質細胞／全細胞）のヒト間質細胞を含む条 件で行われる請求の範囲第１４項記載の方法。
27. ２７．遺伝子伝達ベクターがレトロウイルスである、請求の範囲第９項記載の方 法。
28. ２８．ヒト血清幹細胞をレトロウイルスバッケージング細胞系上清の存在下で培 養することからなる、請求の範囲第９項記載の方法。
29. ２９．ヒト幹細胞をレトロウイルスバツケージング細胞系の存在下で培養するこ とからなる、請求の範囲第９項記載の方法。
30. ３０．安定で遺伝学的に形質転換されたヒト幹細胞。
31. ３１．細胞がヒト骨髄で見いだされたヒト幹細胞である、請求の範囲第３０項記 載の安定で遺伝的に形質転換されたヒト幹細胞。
32. ３２．細胞がヒト造血幹細胞である、請求の範囲第３０項記載の安定で遺伝学的 に形質転換されたヒト幹細胞。
33. ３３．ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦが各々０．１〜１００ｎｇ・ｍｌ−１・日−１ の速度で連続的に培地に添加される、請求の範囲第１項記載の方法。
34. ３４．Ｅｐｏが培地に０．００１〜１０Ｕ・ｍｌ−１・日−１の速度で添加され るか、マスト細胞成長因子が培地に１〜１００ｎｇ・Ｕ・ｍｌ−１・日−１の速 度で添加されるか、又はＩＬ−１（α又はβ）が培地に３〜５日間当たり１０〜 １００Ｕｍｌ−１の速度で添加される、請求の範囲第３３項記載の方法。
35. ３５．Ｅｐｏが培地に０．００１〜１０Ｕ・ｍｌ−１・日−１の速度で添加され る、請求の範囲第３３項記載の方法。
36. ３６．Ｇ−ＣＳＦ、塩基性線維芽細胞成長因子、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８ 、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＰＤＧＦ及びＥＧＦから選ばれる少なく とも一つが培地に添加される、請求の範囲第３４項記載の方法。
37. ３７．培地が動物の血清又は血漿を含む、請求の範囲第１項記載の方法。
38. ３８．培地が、コルチコステロイドからなる、請求の範囲第１項記載の方法。
39. ３９．培地中のグルコース濃度が５〜２０ｍＭの範囲内に、培地中の乳酸塩濃度 が約３５ｍＭ以下に、培地中のグルタミン濃度が１〜３ｍＭの範囲内に、かつ培 地中のアンモニア濃度が２．５ｍＭ以下に保持されることからなる、請求の範囲 第１項記載の方法。
40. ４０．培養が１０−３〜１０−１（間質細胞／全細胞）のヒト間質細胞を含む条 件で行われる、請求の範囲第６項記載の方法。
41. ４１．膨張ヒト幹細胞ブールを得ることからなる、請求の範囲第１項記載の方法 。
42. ４２．膨張ヒト造血幹細胞ブールを得ることからなる、請求の範囲第４１項記載 の方法。
43. ４３．ヒト造血前駆細胞を培養することからなる、請求の範囲第１項記載の方法 。
44. ４４．細胞組成物がヒト造血前駆細胞に関して濃縮されている、請求の範囲第４ ３項記載の方法。
45. ４５．ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦが各々０．１〜１００ｎｇ・ｍｌ−１・日−１ の速度で連続的に培地に添加される、請求の範囲第４３項記載の方法。
46. ４６．Ｅｐｏが培地に０．００１〜１０・ｍｌ−１・日−１の速度で添加される か、マスト細胞成長因子が培地に１〜１００ｎｇ・ｍｌ−１・日−１の速度で添 加されるか、又はＩＬ−１（α又はβ）が培地に３〜５日間当たり１０〜１００ Ｕｍｌ−１の速度で添加される、請求の範囲第４５項記載の方法。
47. ４７．赤血球を含有する細胞培養が得られる、請求の範囲第６項記載の方法。
48. ４８．顆粒球を含有する細胞培養が得られる、請求の範囲第６項記載の方法。
49. ４９．ヒト間質細胞の代謝、ＧＭ−ＣＳＦ分泌又はＩＬ−６分泌が増加する、請 求の範囲第４０項記載の方法。
50. ５０．ヒト間質細胞がヒト骨髄間質細胞である、請求の範囲第４９項記載の方法 。
51. ５１．リアクターチャンバー；並びに 栄養培地を該リアクターチャンバーから導入及び除去するための手段及び当該リ アクターチャンバーからの溶出物をモニターするための手段を有し；該リアクタ ーチャンバーにおいて、間質細胞が幹細胞を含むヒト造血細胞とともにバツキン グに付着しており、間質細胞の少なくとも一部が形質転換され、幹細胞の増殖、 分化、又はその両者を制御する成長因子のうち少なくとも一つを分泌できるバイ オリアクター。
52. ５２．分泌可能な形態で少なくとも一つのヒト成長因子を発現できるＤＮＡ発現 構築物を含み、該成長因子が造血前駆細胞の増殖、分化、又はその両肴を制御す るものである形質転換線維芽細胞。
53. ５３．間質細胞の移動性が有限であり、該造血細胞が該間質細胞と接触するよう に、造血細胞の細胞集団と間質細胞を混合し、；該造血細胞を、少なくとも正常 細胞を著しく除去せず、悪性細胞を該間質細胞との接触部から除去するに十分な 力を生ずる流体流動に供することを特徴とする、造血悪性細胞を正常細胞から分 離する方法。
54. ５４．成熟細胞を培養から除去する、請求の範囲第１項記載の方法。
55. ５５．成熟細胞を培養から除去する、請求の範囲第４２項記載の方法。