DE69232682T2

DE69232682T2 - Verfahren zur selektiven vermehrung von cd34 positiven zellen

Info

Publication number: DE69232682T2
Application number: DE69232682T
Authority: DE
Inventors: J. Berenson; Ruigao Fei; A. Goffe; Shelly Heimfeld; R. Peterson; H. Porter
Original assignee: Nexell Therapeutics Inc
Current assignee: Nexell Therapeutics Inc
Priority date: 1991-10-23
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 2003-03-13
Anticipated expiration: 2012-10-23
Also published as: WO1993008268A1; DK0614485T3; EP0614485A1; ES2180539T3; ATE220715T1; JPH07503127A; EP0614485B1; CA2122141C; DE69232682D1; CA2122141A1

Description

Diese Anmeldung ist eine "Continuation-in-part" der anhängigen U. S. Anmeldung mit der Serien-Nr. 07/513,543, die am 23. April 1990 eingereicht wurde (US Patent Nr. 5,635,387).

Technisches Feld

Betrifft im allgemeinen Zellen, die Knochenmark bilden und spezifische Verfahren, die verwendet werden können, um selektiv die Anzahl der CD34-positiven Zellen zu expandieren.

Hinterrund der Erfindung

Krebs ist für ein Fünftel der Gesamtsterblichkeit in den Vereinigten Staaten verantwortlich und ist der zweit häufigste Todesgrund. Die häufigsten Krebsarten beim Mann sind Lungen-, Prostata- und kolorektaler Krebs und für Frauen Brust-, Lungen- und kolorektaler Krebs. Gegenwärtig werden die meisten Krebse mit einer Kombination von Therapien, umfassend Chirurgie und Chemotherapie und/oder Bestrahlungstherapie behandelt.
Eine Schwierigkeit bei der Chemotherapie und der Bestrahlungstherapie ist jedoch, daß sie auch das Immunsystem des Individuums sowie die Stammzellen, die Vorläuferzellen des Immunsystems, zerstört. Um das Immunsysytem wiederherzustellen, wird der Patient einer Knochenmarktransplantation im Allgemeinen mit entweder allogenen oder autologen Knochenmark unterzogen. Viele Individuen sterben jedoch, da ihr eigenes Knochenmark am Krebs beteiligt ist, oder ein histokompatibler Spender nicht gefunden werden kann.
Ein Verfahren, das vorgeschlagen wurde, um diese Schwierigkeit auszuräumen, ist die Verwendung von Langzeitknochenmarkskulturen, die das Überleben der eingepflanzten Zellen verlängern. Beispielsweise beschreibt Dexter et al. (J. Cell. Phys. 91: 335, 1976) Bedingungen für die Proliferation von Stammzellen in vitro (im folgenden als "Dexter-Kulturen" bezeichnet). In Kürze umfaßt dieses Verfahren die Etablierung einer adherenten Einzelschicht von Stromazellen, die die Überlebensfähigkeit von Stamm- und frühen Vorläuferzellen unterstützen. Dexter-Kulturen sind jedoch letztendlich nachteilig, da sie nur die Sterberate der Stamm- und Vorläuferzellen verlangsamen und nicht das gewünschte Ergebnis der Erhöhung der Zahlen dieser Zellen erreichen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur selektiven Expansion von CD34&spplus;-Zellen zur Verfügung. Diese Verfahren räumen Nachteile vorheriger Verfahren aus und stellen andere weitere damit verbundene Vorteile zur Verfügung.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz gesagt ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur selektiven Expansion von CD34&spplus;-Zellen gerichtet. Innerhalb eines Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur selektiven Expansion von CD34&spplus;-Zellen bereitgestellt, umfassend die Schritte (a) Abtrennen von Stammzellen von anderen Zellen, und (b) Inkubieren der abgetrennten CD34- positiven Zellen in einem ausgewählten Medium, das Stammzellwachstumsfaktor, Mastzellwachstumsfaktor, Interleukin-1, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Interleukin-7, G- CSF, GM-CSF, M-CSF, TGF-β, TNF-α, α-INF, FGF, PDGF, IGF-1 oder IGF-2 enthält, so daß CD34-positiven Zellen selektiv in ihrer Zahl zunehmen. Innerhalb einer Ausführungsform werden die CD34-positiven Zellen periodisch von den reifen Zellen abgetrennt.
Innerhalb anderer Ausführungsformen werden die CD34&spplus;-Zellen auf einer Affinitätssäule oder durch Flußzytometrie abgetrennt. Innerhalb weiterer Ausführungsformen werden die abgetrennten CD34&spplus;-Zellen in einer Petrischale, in einem sterilen Beutel oder in hohlen Fasern inkubiert.
Innerhalb einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Verfahren zur selektiven Expansion von CD34&spplus;-Zellen bereitgestellt, umfassend die Schritte (a) Abtrennen von CD34&spplus;-Zellen von anderen Zellen auf einer Affinitätssäule und (b) Inkubieren der abgetrennten CD34&spplus;-Zellen in einem sterilen Beutel mit einem Medium enthaltend Stammzellwachstumsfaktor.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch den Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angefügten Zeichnungen offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Kurve, die den Effekt des Abtrennens von Stammzellen auf die Stammzellvermehrung hin, durch das Ansteigen der Gesamtzellzahl bestimmt, darstellt.
Fig. 2 ist eine Kurve, die den Effekt des Abtrennens von Stammzellen auf die Stammzellexpansion, durch das Anwachsen von CFCs bestimmt, darstellt.
Fig. 3 ist eine Kurve, die den Effekt verschiedener Wachstumsfaktoren auf die Gesamtzellzahl darstellt.
Fig. 4 ist eine Kurve, die den Effekt verschiedener Wachstumsfaktoren auf die Anzahl von CFCs darstellt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur selektiven Expansion CD34&spplus;-Zellen zur Verfügung. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "CD34&spplus;- Zellen" auf totipotente hematopoietische Stammzellen sowie auf frühe Vorläuferzellen, wie Kolonie-bildende Zellen (CFCs = "colony-forming cells"). Diese Zellen können von anderen Zellen durch die Gegenwart von CD34-Rezeptoren unterschieden werden.
Wie vorangehend bemerkt, werden innerhalb eines Aspekts der vorliegenden Erfindung Verfahren für die selektive Expansion von CD34&spplus;-Zellen zur Verfügung gestellt, enthaltend die Schritte (a) Abtrennen von CD34&spplus;-Zellen von anderen Zellen und (b) Inkubieren der abgetrennten CD34&spplus;-Zellen in einem ausgewählten Medium, das in der Lage ist, Stammzellen zu expandieren.
Unter Verwendung der Vorrichtung und Verfahren, die im größeren Detail unten beschrieben sind, können Stammzellen von verschiedenen Blutprodukten, umfassend beispielsweise peripheres Blut und Gesamtknochenmark, separiert werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Stammzellen als abgetrennt angesehen, wenn zumindest 20% der abgetrennten Zellen CD34&spplus;-Zellen sind. Vorzugsweise sollten die CD34&spplus;-positiven Zellen abgetrennt werden, um eine Reinheit, größer als 90% bereitzustellen. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, die Gesamtzahl der Blutplättchen, der Granulozyten und der roten Blutzellen so niedrig wie möglich zu halten, um Verklumpung zu verhindern und die Freisetzung von abbauenden Enzymen, welche die Wiedergewinnung und Lebensfähigkeit der eingepflanzten Zellen verringert. Insbesondere kann es wünschenswert sein, daß die Stammzellen weniger als etwa 1% Blutplättchen, weniger als 50% und bevorzugt weniger als 25% Granulozyten und weniger als 10% und bevorzugt weniger als 1% rote Blutkörperchen enthalten.
Die Abtrennung von CD34&spplus;-Zellen kann durch die Verwendung eines Liganden erreicht werden, der spezifisch die Antigene auf diesen Zellen erkennt. Beispielsweise können in den unten beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren Antikörper verwendet werden, die spezifisch das CD34-Antigen erkennen, um die Stammzellen abzutrennen. Charakteristische Beispielantikörper, die spezifisch das CD34-Antigen erkennen, enthalten My-10 und HPCA2 (Becton- Dickinson, Mountain View, Kalif.) und 12.8 (CellPro®, Bothell, Wash.).
Verschiedene Methoden und Vorrichtungen können verwendet werden, um CD34&spplus;-Zellen abzutrennen, umfassend die Verwendung von magnetischen Perlen, Schwänken und Flußzytometrie (Fluorescense-aktivierte Zellsortierung FACS" = "Fluorescence Activated Cell Sorting) (siehe beispielsweise US Patent Nr. 4,714,680 und 4,965,204. Besonders bevorzugte Verfahren und Vorrichtungen sind Immunoaffinitätssäulen, wie die, die in WO-A-91/16116 mit dem Titel "Immunoselection Device and Method" beschrieben sind. In Kürze beschreibt diese Anmeldung Verfahren und Vorrichtungen für die Isolierung oder Abtrennung von Zielteilchen, wie Stammzellen aus einem Gemisch von nicht-Ziel- und Zielteilchen. In dieser Anmeldung ist eine Diskussion der Vorrichtungen und Verfahren umfaßt, bei denen die Zielteilchen in einem direkten Verfahren durch das Durchleiten der Teilchen durch eine Säule, enthaltend ein Bett aus porösem Material mit niedriger unspezifischer Bindung, das einen Liganden besitzt, der zur spezifischen Bindung an die Zielteilchen in der Lage ist, abgetrennt werden. Innerhalb eines Aspekts der Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt, die im allgemeinen (a) eine Säule, die an ihrem proximalen Ende ein Einlaßkanal besitzt, durch die Flüssigkeit in die Säule eintreten kann und an einem distalen Ende ein Auslaßkanal durch die Flüssigkeit aus der Säule austreten kann, (b) innerhalb der Säule ein Bett mit porösem Material niedriger unspezifischer Bindung, wobei das poröse Material eine Biotin-bindende Gruppe auf ihrer Oberfläche immobilisiert, besitzt, wobei die Poren des porösen Materials von einer ausreichenden Größe sind, um die Biotin-absorbierende Gruppe in die Poren eindringen zu lassen, aber nicht so groß, um ein Kollabieren des Bettes zu erlauben und wobei die Zwischenräume des Betts von einer Größe sind, die ausreicht, den Teilchen zu erlauben durch das Bett zu fließen, umfaßt. Die Vorrichtung kann des weiteren ein Mittel umfassen, das innerhalb der Säule für die Bewegung des porösen Materials auf die Anlegung einer äußeren Kraft hin angeordnet ist, so daß die gebundenen Zielteilchen von dem porösen Material freigesetzt werden. Innerhalb eines Aspekts dieser Anwendung werden die Zielteilchen entweder durch eine Ein-Schritt- oder eine Zwei-Schrittmethode unter Verwendung von Avidin und Biotin abgetrennt. Es sollte jedoch auch bemerkt werden, daß für den Zweck der vorliegenden Erfindung andere Materialien innerhalb der Immunaffinitätssäule verwendet werden könnten, umfassend beispielsweise nicht-poröse Materialien.
Eine besonders bevorzugte Immunaffinitätssäule ist ein "Zellabtrenner", umfassend eine Säulenanordnung für das Abtrennen von Zielzellen von einer Probenflüssigkeit, wobei die Säulenanordnung eine Säule, einen Probenflüssigkeitsversorgungsbeutel und ein Flüssigkeitssammelbeutel umfaßt, wobei die Säule für das Aufnehmen der Probeflüssigkeit aus dem Probeflüssigkeitsversorgungsbeutel und für das Abtrennen der Zielzellen von der Probenflüssigkeit und für das Zurückhalten der Zielzellen eingerichtet ist und wobei der Flüssigkeitssammelbeutel für das Aufnehmen der Zielzellen nach ihrer Freisetzung von der Säule eingerichtet ist, der Zellabtrenner ein Bewegungsmittel für das Bewegen des Inhalts der Säule umfaßt, um das Freisetzen der in der Säule zurückgehaltenen Probenzellen zu unterstützen, wobei das Bewegungsmittel auf ein Antriebssignal zur Variation des Bewegungsumfangs des Inhalts der Säule reagiert, um die Rate, mit der die Probenzellen freigesetzt werden zu verändern, ein Säulensensormittel für die Bereitstellung eines Säulensignals, das die optische Dichte der Flüssigkeit, die aus der Säule heraus und in den Flüssigkeitsauffangbeutel fließt anzuzeigen, ein Säulenventilmittel, das auf ein Säulenventilkontrollsignal reagiert, um es der Flüssigkeit, die aus der Säule heraus kommt zu erlauben, selektiv in den Flüssigkeitsauffangbeutel zu fließen und ein Datenprozessormittel für die Kontrolle des Betriebs des Zellseparators, wobei das Datenprozessormittel auf das Säulensignal reagiert, um das Antriebssignal und das Säulenventilkontrollsignal bereit zu stellen, um zu verhindern, daß eine ungeeignete Zielzellkonzentration gesammelt wird. Eine Ausführungsform dieser Offenbarung ist das CEPRATE LCTM- Zellabtrennungssystem, das von CellPro® (Bothell, Wash.) erhältlich ist.
Die abgetrennten CD34-positiven Zellen werden dann in einem ausgewählten Medium inkubiert, so daß die Stammzellen selektiv expandiert werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden CD34&spplus;-Zellen "selektiv expandiert", wenn CD34&spplus;-Zellen in ihrer Anzahl stärker anwachsen, als die anderen Zelltypen in ihrer Gesamtheit. In Kürze: das Medium sollte eine Nährstoffbasis umfassen, die die Zelllebensfähigkeit erhält sowie Faktoren, die die Anzahl der CD34&spplus;-Zellen expandiert. Charakteristische Beispiele von Nährstoffbasen umfassen RPMI, TC 199 oder Iscoves-DMEM, die mit einem Protein, wie fötalem Kälberserum ergänzt worden sind. Alternativ kann die Nährstoffbasis ein definiertes Medium, wie Ex Vivo sein. Verschiedene Bestandteile können verwendet werden, um selektiv die CD34&spplus;- Zellen zu expandieren. Charakteristische Faktoren umfassen Interleukin-1, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Interleukin-7, SCF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TGF-β, TNF-α, α- INF, FGF, PDGF, IGF-1 und IGF-2. Besonders bevorzugte Faktoren enthalten Stammzellwachstumsfaktor (Amgen, Thousand Oaks, Kalif), Interleukin-3, Granulozyten- Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (Immunex, Seatlle, Wash.), Granulozyten- Kolonie-stimulierender Faktor, Interleukin-6 (Amgen, Thousand Oaks, Kalifornien) und Mastzellwachstumsfaktor (Immunex, Seattle, Wash.).
Man kann ohne weiteres durch das Reinigen von CD34&spplus;-Zellen, wie oben beschrieben und das Inkubieren dieser in einem ausgewählten Medium, wie unten beschrieben bestimmen, ob ein Medium selektiv CD34&spplus;-Zellen expandiert. Die Anzahl der CD34&spplus;-Zellen und anderer Zellen werden vor und nach der Inkubation gezählt. Wie oben bemerkt, sind CD34&spplus;-Zellen selektiv expandiert worden, wenn ihre Zahl anwächst, während die anderer Zellen dies nicht tut. Die Gesamtzahl der Zellen kann durch Standardtechniken (z. B. ein Hemazytometer) gezählt werden und die CD34&spplus;-Zellzahlen können durch Flußzytometrie (d. h. die Zellen, die mit einem Fluoreszenz-konjugierten anti-CD34-Antikörper markiert sind, können mit dem FACS gezählt werden) oder wie unten im Beispiel 3 beschrieben gezählt werden.
Die abgetrennten CD34&spplus;-Zellen können in einer Vielzahl von Behältern inkubiert werden. Besonders bevorzugte Behälter umfassen Petrischalen (Corning Glass Works, Corning, N. Y.), 6-Vertiefungsplatten (Costar), Gas-durchlässige sterile Beutel, wie Stericell (Terumo, Elkton, Md.) und Lifecell (Baxter, Deerfield, Ill.) und hohle Fasern, wie CellPhar2 (Unisyn Fibertec, San Diego, Kalif.), Accusys (Endotronics, Minneapolis, Mmn.) oder Vitafiber (Amicon, Danvers, Mass.). Vorzugsweise sollten die Zellen in einer Atmosphäre von 5% bis 10% CO&sub2; bei einer Temperatur von 37ºC inkubiert werden.
Innerhalb einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren für die selektive Expansion von CD34&spplus;-Zellen bereitgestellt, umfassend die Schritte (a) periodisches Abtrennen von CD34&spplus;-Zellen von reifen Zellen und (b) inkubieren der abgetrennten CD34&spplus;- Zellen in einem ausgewählten Medium, so daß die CD34&spplus;-Zellen selektiv expandiert werden. In Kürze: es wird angenommen, daß reife Zellen (welche nicht nur ausdifferenzierte Blutzellen, sondern auch Zellen der Zwischenlinien umfassen) die Expansion und Differenzierung von Stammzellen über ein Rückkopplungsmechanismus verhindern. Die Entfernung der reifen Zellen aus einer Kultur erlaubt daher die Expansion von Stammzellen zu einer Vielzahl ihrer ursprünglichen Zahl. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet periodisches Abtrennen das Abtrennen der reifen Zellen, zumindest alle 10 Tage.
Verschiedene Methoden können verwendet werden, um periodisch CD34&spplus;-Zellen abzutrennen. Beispielsweise werden innerhalb einer Ausführungsform die Zellen auf eine Affinitätssäule, wie oben beschrieben abgetrennt, in einem ausgewählten Medium unter Verwendung eines der oben diskutierten Behälter inkubiert und dann anschließend wieder abgetrennt, um die CD34&spplus;-Zellen von den neu differenzierten reifen Zellen abzutrennen.
Die CD34-positiven Zellen können beständig abgetrennt werden, während sie mit einem ausgewählten Medium perfundiert werden, so daß die CD34&spplus;-Zellen selektiv expandiert werden. In Kürze: dies kann durch die kontinuierliche Perfusion eines ausgewählten Mediums durch eine Abtrennungsvorrichtung (wie die oben diskutierte Affinitätssäule) erreicht werden. Die CD34&spplus;-Zellen werden in der Abtrennungsvorrichtung zurückgehalten, während die reifen Zellen (die keine CD34-Antigene besitzen) durch die Vorrichtung hindurchfließen. Während die CD34&spplus;-Zellen wachsen und in ihrer Zahl expandieren, binden die neuen CD34&spplus;-Zellen gleichermaßen an die Abtrennungsvorrichtung, während die neu differenzierten Zellen ohne CD34-Antigene durch die Vorrichtung durchfließen.
CD34-positive Zellen können auch kontinuierlich in einer Perfusionsvorrichtung durch das Hindurchführen von Perlen durch die Perfusionskammer, die mit immobilisierten Liganden für Oberflächenantigene, welche auf reifen Zellen gefunden werden, beschichtet sind, so daß die reifen Zellen gebunden werden und durch die Perlen aus der Perfusionskammer getragen werden, abgetrennt werden. Die folgenden Beispiele werden nur zum Zwecke der Illustration und nicht zum Zwecke der Limitierung angeboten.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Herstellung eines avidinierten Biogels

A. Carboxylierung eines Polyakrylamidgels

Siebzehn Gramm trocknes Biogel P-60TM (50-100 Maschenweite (naß), rauhe Perlen) (BIORAD, Katalog Nr. 150, 1630, Richmond, Kalif) werden zu 1,5 l 0,5 M Na HCO&sub3;/0,5 M Na&sub2;CO&sub3; hinzugefügt. Der pH wird mit NaOH auf 10,5 eingestellt und vorsichtig für etwa 20 bis 30 Minuten mit einem Rührer (RZR1, Carfamo, Wiarton, Ontario, Kanada) gerührt, um die Perlen nicht zu beschädigen. Das Gemisch wird dann in einem 60ºC Wasserbad plaziert. Nachdem das Gemisch eine Temperatur von 60ºC erreicht hat, wird es für weitere 2 Stunden (bei 60ºC) mit gelegentlichem Rühren inkubiert. Das Gemisch wird dann aus dem Wasserbad entfernt und in einem Eisbad plaziert, um die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur herunterzubringen.
Die Perlen werden dann mehrmals mit destilliertem oder deionisiertem Wasser gewaschen gefolgt von mehreren Wäschen mit PBS unter Verwendung eines groben mit einem Vakuum verbundenen Glasfilters. Das carboxylierte Gel kann dann bei 4ºC in PBS aufbewahrt werden und ist, wenn es stabilisiert oder mit einem Konservierungsmittel aufbewahrt wird, für bis zu einem Jahr stabil.

B. Avidin Konjugation carboxylierten Biogels

Zuerst wird von einer abgemessenen Menge carboxylierten Biogels PBS durch die Filtration mit einem groben an ein Vakuum angeschlossenen Glasfilter abgetrennt. Das Gel wird dann in destilliertem oder deionisiertem Wasser für 15 bis 30 Minuten equilibriert. Die Equilibrierung in Wasser löst eine Ausdehnung des Gels auf ein Volumen von etwa dem 4fachen seines vorhergehend gemessenen Volumens aus. Das Gel wird dann für jeden ml des Gels (wie ursprünglich in PBS gemessen) in 10 ml destilliertem oder deionisiertem Wasser resuspendiert.
Dreißig mg 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)karbodiimid (EDC-HCl) (Sigma Chemical Co., Katalog Nr. E7750, St. Louis, Mo.) wird für jeden ml des Gels, wie ursprünglich gemessen, zugesetzt. Der pH wird durch die tropfenweise Hinzufügung von HCl schnell auf 5,5 angepaßt. Es wird dafür Sorge getragen, den pH bei 5,5 zu halten; pHs von weniger als 5,0 oder größer als 6,0 führen zu einer deutlich niedrigeren Aktivierung des Biogels. Das Gemisch wird für 5 Minuten gerührt.
Avidin (International Enzymes, Inc., Fallbrook, Kalif) wird mit einer Konzentration zwischen 10 und 100 mg/ml in deionisiertem Wasser gelöst. Als nächstes wird 1 mg Avidin rasch für jeden ml des Gels (wie ursprünglich in PBS gemessen) zugesetzt. Das Gemisch wird für 1,5 Stunden gerührt. Als nächstes werden 2 M Glycin zugesetzt, um zu einer Endkonzentration von 0,2 M Glycin in dem Gemisch zu führen und für eine weitere Stunde gerührt.
Das Gel wird mit mehreren Volumina PBS unter Verwendung eines groben Glasfilters und Vakuums gewaschen und im PBS bei 4ºC aufbewahrt. Das Gel ist für etwa ein Jahr stabil.

BEISPIEL 2

Isolierung von Transplantationszellen

A. Herstellung von Leukozytenfilmzellen (Buffy Coat Cells)

Eine Knochenmarkprobe wird bei 240 · g für 15 Minuten zentrifugiert. Das Plasma wird entfernt (und wird für spätere Verwendung aufbewahrt) und die zurückbleibenden Leukozytenfilmzellen werden noch einmal bei 240 · g für 15 Minuten zentrifugiert, um rote Blutzellen zu entfernen. Die Leukozytenfilmzellen werden zweimal mit RPMI durch Zentrifugation bei 180 · g für 10 Minuten gewaschen. Die Zellen werden dann mit einer Endkonzentration von 1 · 10&sup8; weißen Zellen/ml in RPMI zuzüglich 1% BSA ("Bovine Serum Albumin" = Rinderserumalbumin) resuspendiert.

B. Inkubation der Leukozytenfilmzellen mit Antikörper

Die Leukozytenfilmzellsuspension wird mit einer Endkonzentration von 20 ug/ml biotinylierten anti-CD34-Antikörper (CellPro®, Bothell, Wash.) für 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Antikörperzellgemisch wird dann zweimal mit PBS durch Zentrifugation bei 180 · g für 10 Minuten gewaschen. Die Zellen werden dann mit einer Konzentration von 1 · 10&sup8; weißen Zellen/ml in PBS resuspendiert.

C. Säulenbetrieb und Ergebnisse

Ein CEPRATE LCTM (CellPro®, Bothell, Wash.) Abtrennungssystem wurde im wesentlichen gemäß den Herstellerinstruktionen verwendet. In Kürze: das Instrument wurde aufgestellt, die Schläuche verbunden, die Reagenzien wurden geladen und der Verfahrensablauf wurde mit den Antikörper-behandelten Zellen begonnen. Die Zellen wurden durch die Säule gepumpt, die Säule wurde mit PBS gewaschen, die absorbierten Zellen wurden durch das magnetisch betriebene Flügelrad freigesetzt. Die absorbierten Zellen wurden in einem Sammelbeutel angereichert.

D. Ergebnisse

Zehn Milliarden Knochenmarkszellen wurden durch die Säule hindurchgegeben; 200 Millionen dieser Zellen wurden an die Säule gebunden und in dem Sammelbeutel wiedergewonnen. Die durch Trypanblau-Ausschluß gemessene Lebensfähigkeit der gesammelten Zellen betrug 91%. Die gesammelten Zellen waren, wie die durch FACS-Analyse gemessen, zu 75% CD34&spplus;.

BEISPIEL 3

Bestimmung der CFC-Lebensfähigkeit und der Ausbeute

Ein ml Iscoves Methylzellulose (Terry Fox Laboratories, Vancouver, Britisch Kolumbien, Kanada), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 50 ng/ml Gentamicin pro 35 mm Platte, wurde auf 37ºC erwärmt. Die Zellen wurden dreifach mit einer 3-fach-Verdünnung plattiert, um die Genauigkeit des Assays zu verbessern. Die höchste plattierte Zellzahl war 10&sup5;/Platte mit Ausnahme von Säulen-gereinigten Zellen, die mit 3 · 10³ und weniger plattiert wurden. Die Zellen wurden gleichmäßig über die Oberfläche jeder Platte verteilt und dann in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO&sub2; in der Luft für 10 bis 14 Tage inkubiert. Die Kolonien wurden gezählt, wenn sie mehr als 50 Zellen enthielten und als CFU-GM, BFU-E oder andere (z. B. CFU-GEMM) gewertet. Die Zahl der verschiedenen Kolonietypen wurde summiert, um die Gesamtzahl der Kolonie-bildenden Zellen (CFCs) zu ergeben.

BEISPIEL 4

Stammzellexpansion

A. Vergleich der Expansion von abgetrennten Stammzellen gegenüber Stammzellen im Gesamtknochenmark

Stammzellen, die wie oben in Beispiel 2 beschrieben gereinigt wurden, wurden in einer Lösung, enthaltend RPMI 1640, 10% fötales Kälberserum HYCLONE®, Logan, Utah), 50 ng/ml Stammzellwachstumsfaktor, 50 ng/ml Interleukin-3, 20 ng/ml Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierender-Faktor und 20 mg/ml ml Granulozyten-Kolonie-stimulierender-Faktor wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit 10&sup6; pro Platte in 1 ml Medium plattiert. An den Tagen 7, 14 und 21 wurden Zellen entnommen und für den in Beispiel 3 beschriebenen CFC- Essay replatiert. Lebensfähige Zellen wurden unter Verwendung von Trypanblau mit dem Hemazytometer gezählt.
Wie durch die Gesamtzellzahl in Fig. 1 dargestellt und die Zahl der CFCs in Fig. 2, verbesserte die Stammzellabtrennung vor der Kultivierung der Zellen dramatisch das Stammzellwachstum und die Expansion.

B. Faktoren, die die Stammzellexpansion auslösen

Um zu bestimmen, welche Wachstumsfaktoren für die Expansion der Stammzellen nützlich sind, wurde der folgende Essay durchgeführt. In Kürze: die Stammzellen, die wie oben beschrieben gereinigt wurden, wurden mit einer Dichte von 10&sup6; Zellen pro Platte in Corning 35 mm Platten plattiert: Die Zellen wurden mit einer Lösung, die RPMI 1640 mit 10% fötalen Kälberserum und mit verschiedenen Kombinationen der folgenden Wachstumsfaktoren ergänzt: (1) 50 ng/ml Stammzellwachstumsfaktor (Amgen, Thousand Oaks, Kalif.), (2) 50 ng/ml Interleukin-3, (3) 20 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender-Faktor (Immunex, Seatile, Wash.) und (4) Granulozyten-Kolonie-stimulierender-Faktor (Genzyme, Cambridge, Mass.) enthielt, gefüttert.
Wie in den Fig. 3 und 4 gezeigt, expandierten beide Medien, die SCF enthielten (durch das Anwachsen der CFC-Zahl bestimmt), Stammzellen.
Aus dem Vorangehenden ist erkennbar, daß obwohl spezifische erfindungsgmäße Ausführungsformen hierin für den Zweck der Darstellung beschrieben worden sind, daß verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne von dem Sinn und dem Umfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist die Erfindung nicht, außer durch die angefügten Ansprüche limitiert.

Claims

1. Verfahren zur selektiven Expansion von CD34 positiven Zellen, umfassend:

(a) Abtrennen von CD34 positiven Zellen von anderen Zellen; und

(b) Inkubieren der abgetrennten CD34 positiven Zellen in einem ausgewählten Medium, das Stammzellwachstumsfaktor, Mastzellwachstumsfaktor, Interleukin 1, Interleukin 3, Interleukin 4, Interleukin 6, Interleukin 7, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, TGF-β, TNF-α, α-INF, FGF, PDGF, IGF-1 oder IGF-2 enthält, so daß die CD34 positiven Zellen selektiv in ihrer Zahl zunehmen.

2. Verfahren, zur selektiven Expansion von CD34 positiven Zellen nach Anspruch 1, umfassend:

(a) periodisches Abtrennen von CD34 positiven Zellen von reifen Zellen; und

(b) Inkubieren der abgetrennten CD34 positiven Zellen in dem ausgewählten Medium, so daß die CD34 positiven Zellen selektiv in ihrer Zahl zunehmen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Medium Stammzellwachstumsfaktor enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Medium Interleukin-3 enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Medium Granulocyten- Macrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Medium Granulocyten-Koloniestimulierenden Faktor enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Medium Interleukin-6 enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Medium Mastzellwachstumsfaktor enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Medium Interleukin-1 enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die CD34 positiven Zellen durch Immunselektion abgetrennt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die CD34 positiven Zellen auf einer Affinitätssäule abgetrennt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die CD34 positiven Zellen durch Flußcytometrie abgetrennt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die CD34 positiven Zellen in einer Petrischale inkubiert werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, wobei die CD34 positiven Zellen in einem sterilen Beutel inkubiert werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, wobei die CD34 positiven Zellen in hohlen Fasern inkubiert werden.

16. Verfahren zur selektiven Expansion von CD34 positiven Zellen nach Anspruch 1, umfassend:

(a) Abtrennen von CD34 positiven Zellen von den anderen Zellen auf einer Affinitätssäule; und

(b) Inkubieren der abgetrennten CD34 positiven Zellen in einem sterilen Beutel mit einem Medium, das Stammzellwachstumsfaktor enthält.