DE69329340T2

DE69329340T2 - Aufbewahren von stammzellen

Info

Publication number: DE69329340T2
Application number: DE69329340T
Authority: DE
Inventors: Bernhard M. Babior; David Scheer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-06-25
Filing date: 1993-06-25
Publication date: 2001-02-01
Anticipated expiration: 2013-06-26
Also published as: FI946077L; EP1002538A2; JPH08500819A; EP1002538A3; AU4651993A; ATE195872T1; US5912174A; EP0647267B1; EP0647267A1; WO1994000567A1; DE69329340D1; CA2139103A1; DK0647267T3; AU668582B2; FI946077A0; EP0647267A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Lagerung von Stammzellen ohne unannehmbaren Verlust der Zellfunktion.
Bei Stammzellen handelt es sich um undifferenzierte Zellen, die pluripotent sind, das heißt, die sich in Zellen mit diversen funktionellen Merkmalen differenzieren können. Sie sind nicht vollständig differenziert, und ihre Fähigkeit zur Teilung bleibt erhalten. Von besonderem Interesse sind lymphohämatopoetische Stammzellen, die sich in lymphoide und in myeloide Zellen differenzieren. Zu den lymphohämatopoetischen Stammzellen zählen, neben vielen anderen, folgende Zellen: a) Zellen, die Kolonien von Granulozyten/Monozyten bilden (CFC- GM); b) Zellen, die Kolonien von Erythrozyten bilden (BFU-E); c) Zellen, die Kolonien von Eosinophilen bilden (CFC-Eo); d) Zellen, die Kolonien von multipotenten Zellen bilden (CFC- GEMM); e) unreife lymphoide Vorläufer-Zellen, darunter Vorläufer von B-Zellen und T-Zellen; und f) pluripotente Stammzellen. Fig. 1 zeigt eine im Handel erhältliche Übersicht, in der die verschiedenen an der Hämatopoese beteiligten Zellen, einschließlich der Stammzellen, abgebildet sind.
Stammzellen sind von wesentlicher Bedeutung für Transplantationen, zum Beispiel für die Transplantation von Knochenmark. In der Regel schließt eine Knochenmarktransplantation die Entnahme von Markzellen, deren Auswaschen mit einer Pufferlösung zur Abscheidung unerwünschten Zellmaterials (z. B. von T-Zellen und/oder malignen Zellen) und Aufschwemmen in einem geeigneten Nährmdedium (z. B. RPMI, autogenes Serum und DMSO) ein. Das entstehende Material wird entweder sofort dem Empfänger verabreicht oder zur späteren Verwendung kältekonserviert (deutlich unter 0ºC eingefroren). Diese Kältekonservierung für Zellen, insbesondere Blutzellen, Gameten und Embryos, ist in FR-A-2 600 671 beschrieben.
Auch Peripherblutstammzellen finden für die Knochenmarktransplantation Verwendung. Die Stammzellen werden dabei durch Leukozytenentzug aus dem Peripherblut gewonnen und anschließend ähnlich behandelt.
Von Civin wird in den US-Patenten 4.714.680, 4.965.204 und 5.035.9994 ein monoklonaler Antikörper beschrieben, der für ein Antigen an menschlichen pluripotenten lymphohämatopoetischen Stammzellen, nicht jedoch für Antigene an normalen, reifen menschlichen Lymphoid- und Myeloidzellen spezifisch ist. Tsukamoto et al., US-Patent 5.061.620, beschreiben menschliche hämatopoetische Stammzellen, ihre Trennung, Charakterisierung und Verwendung. Diese und andere sich rasant entwickelnden Technologien könnten Knochenmarktransplantationen und sonstige medizinische Verfahren einem weitaus breiteren Patientenkreis als dem, der gegenwärtig eine solche Behandlung erfährt, zugänglich machen.
Zur Lymphozytenfamilie zählen sowohl lymphoide Stammzellen als auch die daraus hervorgehenden differenzierten Zellen (T-Zellen, B-Zellen und Plasmazellen), siehe Fig. 1. In verschiedenen Situationen ist es wünschenswert, mit bestimmten Lymphozyten angereicherte und/oder mit anderen Lymphozyten geringer besetzte Zellpopulationen zu erhalten. Zum Beispiel könnte es erwünscht sein, eine bestimmte Population maligner oder infizierter Lymphozyten zu zerstören. Im umgekehrten Falle könnte es wünschenswert sein, Lymphozyten eines Patienten außerhalb des Körpers zu aktivieren (z. B. mittels IL-2) und ihm daraufhin wieder zuzuführen. Kurz gesagt, sind verschiedene Technologien zur Behandlung und/oder technischen Manipulation von Stammzellen bzw. Lymphozyten außerhalb des Körpers und zur Rückführung der behandelten Zellen in den Körper bekannt. Schlussendlich kann sich bei Patienten an abgelegenen Orten die Notwendigkeit ergeben, Lymphozyten zum Zwecke der Gewebeverträglichkeitsprüfung in Vorbereitung einer Transplantation über weite Strecken zu versenden, weshalb sich eine Lagerung während des Transports notwendig macht.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen sind noch verschiedene andere Technologien zur Abscheidung bzw. selektiven Anreicherung oder Zerstörung von lymphozyten- bzw. Stammzellenpopulationen bekannt. Zu solchen anderen Methoden zählen zum Beispiel der von Celf Pro, Inc. aus Seattle im US-Staat Washington vertriebene Stammzellenkonzentrator CEPRATE'M, das Panning-Verfahren, die Zellsortierung (z. B. Immunfluoreszenzzellsortierung (FACS)) und der Einsatz von Magnetperlen.
Es besteht besonderer Bedarf an einem praktischen und wirksamen Verfahren für die Lagerung von Stammzellen nach deren Gewinnung (z. B. in der von Tsukamoto et al. beschriebenen Weise) und bis zu deren Verwendung.
Entsprechend einem Aspekt der vorliegenden Erfindung legen wir ein Verfahren für die Lagerung von Stammzellen zur Aufrechterhaltung ihrer Funktion vor, wobei das Verfahren die Aufbewahrung der Stammzellen bei Temperaturen zwischen 0 und 25ºC in einem wäßrigen, Gelatine enthaltenden Gemisch umfasst.
In bevorzugten Ausführungformen werden die Zellen über einen Zeitraum von mehr als 24 (vorzugsweise von mehr als 36, 48, 60 oder sogar 72) Stunden in diesem Gemisch suspendiert. Bevorzugt wird modifizierte Flüssiggelatine, jedoch kann auch unmodifizierte Gelatine verwendet werden. Mit diesem Verfahren läßt sich jede Art von Stammzellen lagern, wobei die Lagerungsmethode für die oben genannten lymphohämatopoetischen Zellen (insbesondere pluripotente Stammzellen) ganz speziell geeignet ist. Das bevorzugte Medium enthält Gelatine in einer Konzentration, die gewährleistet, daß das zu lagernde Gemisch (einschließlich der Zellen) bei Temperaturen unter 40ºC nicht geliert (z. B. 6 bis 25 Masseprozent modifizierte Flüssiggelatine) und daß die Stammzellen während der Lagerung enthalten sind. Vorzugsweise enthält das Gemisch ein Standardnährmedium für die Zellgewebevermehrung. Wie nachstehend beschrieben ist das Gemisch in bevorzugten Ausführungsformen pharmazeutisch für die Anwendung am Menschen geeignet. Ein Plasma ist optional, und die Erfindung könnte mit einem Gemisch Anwendung finden, das im wesentlichen kein Plasma enthält und sogar im Wesentlichen aus Nährmedium für die Zellgewebevermehrung oder aus Gelatine als Puffer besteht und in dem die Zellen gelagert werden. Ein Plasma könnte allerdings von Vorteil sein, da es z. B. als eine Option möglich ist, die Erfindung unter Verwendung eines Gemischs, das 10 bis 75 Masseprozent Plasma enthält, zu praktizieren. Die darin suspendierten Zellen könnten gegenüber der ursprünglichen Probe mit einer gewünschten Zellsubpopulation z. B. aus Knochenmark oder durch Leukozytenentzug angereichert werden.
Sonstige Merkmale und Vorteile werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen deutlich.
Die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung soll die Erfindung veranschaulichen, nicht jedoch eingrenzen.

1. Stammzellen

Die Fachleute auf diesem Gebiet werden wissen, daß Verfahren bekannt sind, mit denen sich Stammzellen gewinnen lassen, die für eine spätere Verwendung geeignet gelagert werden können. Die Stammzellen lassen sich entweder aus Knochenmark oder aus Peripherblut gewinnen. Die Stammzellen können durch bekannte Techniken, wozu zum Beispiel die im Patent von Tsukamoto et al. oder in den Patenten von Civin offengelegte Methode zählt, gereinigt werden. Andere geeignete Methoden sind weiter oben ebenfalls angeführt. Unsere Verfahren lassen sich einsetzen, um Mischpräparate von Stammzellen wie zum Beispiel Präparate aus unmodifiziertem Knochenmark oder durch Leukozytenentzug veränderte Präparate zu lagern. Ebenso können wir Präparate lagern, die durch selektive Stammzellenanreicherung oder andere Verfahren der Zellenanreicherung aus unmodifiziertem Knochenmark oder aus durch Leukozytenentzug hergestellten Präparaten abgeleitet wurden, z.B unter Anwendung oben beschriebener Methoden wie dem CEPRATE'M-System von CellPro, Inc., aus Seattle, Washington, bei dem es sich um ein Immunoaffinitäts-Trennsystem handelt.
Obwohl es bei der obigen Besprechung im allgemeinen um lympbohämatopoetische Stammzellen und insbesondere pluripotente Stammzellen geht, können mit unseren Verfahren auch andere Arten von Stammzellen gelagert werden, darunter Nervenstammzellen, Epithelstammzellen und andere. Die einschlägigen Fachleute werden in der Lage sein, diese Zellen mit bekannten Verfahren zu gewinnen.

II. Gemische für die Lagerung

Die für die Lagerung bevorzugten Gemische enthalten modifizierte Flüssiggelatine wie allgemein durch Bablor, US-Patent 4.923.797, beschrieben. Modifizierte Flüssiggelatine hat als Plasmaersatzstöffbzw. -expander klinische Verwendung gefunden und ist unter verschiedensten Handelsnamen wie PlasmaGel, Haemaccel, Leukogel, Gelofusine usw. weit verbreitet erhältlich. Im allgemeinen handelt es sich bei diesen Stoffen um teilhydrolysierte Gelatinen mit einer relativen Molekülmasse von 15 000 bis 40 000 Dalton, die wäßrige Lösungen mit einer geringeren Viskosität als derjenigen einer Gelatinelösung gleicher Konzentration bilden. In einigen Fällen sind sie succinyliert oder wurden zur Bildung von z. B. Harnstoffbindungen zur Reaktion gebracht oder auch vernetzt. Die im Handel erhältlichen Stoffe liegen in der Regel in Form einer Lösung der modifizierten Gelatine in einem Puffer mit verschiedenen Salzen und anderen Inhaltsstoffen vor. Der Begriff "modifizierte Flüssiggelatine" im Sinne dieser Erfindung bezeichnet die teilhydrolysierte Gelatinekomponente als solche, ob durch weitere Reaktion verändert oder nicht. In einigen Fällen lassen sich die Lösungen wie im Handel erhältlich verwenden, vorzugsweise jedoch wird die teilhydrolysierte Gelatinekomponente durch Abscheidung der übrigen Inhaltsstoffe des handelsüblichen Produkts gereinigt.
Zu den bevorzugten Gemischen zählen Standardnährmedien für die Gewebezellvermehrung wie RMPI- oder Eagle-Nährmdedien. Möglich ist auch die Verwendung von herkömmlichen Pufferlösungen, die in den Gemischen für die vorliegende Erfindung isotonische Verhältnisse herstellen, zum Beispiel gewöhnliche Puffersubstanzen wie die ausgewogene Salzlösung von Hank. Optional ließe sich dem Gemisch für die Lagerung eine heterozyklische Base hinzugeben wie durch Bablor, US-Patent 4.923.797, beschrieben.
Als weitere Option kann dem Gemisch ein Plasma zugegeben (oder aus der ursprünglichen Probe des Patienten genommen) werden. Das Plasma kann normales menschliches, mit den zu lagernden Zellen entweder autogenes oder heterogenes Plasma sein, vorzugsweise jedoch autogenes. Wird Plasma verwendet, kann die im Gemisch enthaltene Plasmamenge 10 bis 75 Masseprozent, bezogen auf das Gesamtgemisch ohne Zellen, betragen.
Der Anteil der modifizierten Flüssiggelatine am Gemisch kann beträchtlich variieren, und zwar von 4 Masseprozent bezögen auf das Gesamtgemisch ohne die zu lagernden Zellen bis zu der Menge, die bei 40ºC zum Gelieren des Gemischs führt. Die zum Erreichen optimaler Ergebnisse erforderlichen Mengen sind je nach Herkunft der modifizierten Flüssiggelatine unterschiedlich, lassen sich im gegebenen Fall jedoch durch einen einfachen Test umgehend bestimmen.
Als weitere Option können je nach Bedarf zellspezifische Wachstumsfaktoren zugegeben werden, um abhängig vom gewünschten Zelltyp die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
Die Stammzellen können in geeigneten Mengen im Gemisch verteilt werden. Das Stammzellen enthaltende Gemisch wird während der Lagerung vorzugsweise auf einer Temperatur unter 8ºC gehalten, obgleich für relativ kurze Zeiträume auch Temperaturen bis zu 25ºC toleriert werden. Für eine optimale Aufbewahrungsdauer sollte die Lagertemperatur bei 4 00 oder niedriger liegen, nicht jedoch unter dem Gefrierpunkt.
Anschließend an die Lagerung kann das die Stammzellen enthaltende Gemisch nach Erwärmung ohne weitere Behandlung verabreicht werden bzw. können die Stammzellen, falls gewünscht, durch Waschen oder Zentrifugieren abgeschieden werden, um die Dispersion der Zellen in jeglichem anderen gewünschten Medium zu erlauben.
Wir denken daran, Blutbanken, Laboratorien bzw. anderen Einrichtungen eine Vorratslösung bereitzustellen, die für das Mischen mit einer Suspension zu lagernder Zellen geeignet ist, begleitet von Anweisungen zum Herstellen des richtigen Mischungsverhältnisses von Vorratslösung und Suspension. Eine solche Vorratslösung umfaßt ein Nährmedium für die Gewebevermehrung oder eine sonstige Pufferlösung wie oben beschrieben, worin modifizierte Flüssiggelatine in einer Menge von etwa 4-8 Masseprozent bis zu der Menge, die zum Gelierendes Gemischs bei Zimmertemperatur führt, vorzugsweise 20 bis 40 Masseprozent, enthalten ist. Weitere optionale Inhaltsstoffe, wie oben beschrieben, können eingeschlossen sein.
Ein alternatives Lagermedium verwendet Gelatine wie allgemein durch Bablor, US- Patent 4.639.373, beschrieben, wobei der verwendete Puffer jedes herkömmliche Gewebenährmedium oder ein nichttoxischer Puffer, wie oben beschrieben, sein kann. Beste Ergebnisse lassen sich erzielen, wenn die Zellen in der Gelatine enthaltenden Pufferlösung bei niedrigen Temperaturen, z. B. unter 8ºC, gelagert werden, wenngleich auch eine Lagerung bei höheren Temperaturen bis zu etwa 25ºC über einen Zeitraum von zumindest 12 Stunden zu befriedigenden Ergebnissen führt.
Zur praktischen Anwendung unserer Verfahren läßt sich Gelatine aus jeder handelsüblichen Quelle nutzen. Die Menge Gelatine kann über einen breiten Bereich variieren, was zum Teil von der gewünschten Lagerungsdauer abhängt. Für die verwendete Menge gibt es keine kritische Obergrenze mit der Ausnahme, daß die Menge gering genug ist, damit das Gemisch bei einer Temperatur von bis zu 40ºC flüssig bleibt und nicht geliert, so daß die Gelatine im Anschluß an die Lagerung einfacher entfernt werden kann.
Wird ein Plasma verwendet, kann es sich um normales menschliches Plasma bzw. autogenes Plasma handeln. Die Menge Plasma kann von 10 Masseprozent am Gesamtgemisch bis zu 75 Masseprozent variieren.

III. Verwendung der gelagerten Zellen

Im Anschluß an die Lagerung können die Stammzellen ohne weitere Behandlung transfundiert werden, abgesehen von einer Erwärmung auf eine Temperatur von bis zu 40ºC; um etwa noch vorhandenes Gel zu verflüssigen; oder die Zellen können für eine spätere Verwendung tauglich gemacht werden, indem einfach die Gelatine und das Plasma (falls vorhanden) mit dem Puffer, der mit dem zur Lagerung verwendeten Puffer identisch oder von diesem verschieden sein kann, ausgewaschen werden bzw. indem der gelatinehaltige Puffer durch Zentrifugieren entfernt wird, gefolgt vom Wiederaufschwemmen der Stammzellen in einer gewünschten Pufferlösung oder einem Medium.

(Fig. 1)

1. Pluripotente Stammzellen
2 Myeloide Stammzellen.
3 Lymphoide Stammzellen
4 Prä-B-Zellen
5 Prothymozyten
6 Megakaryoblasten
7 Myeloblasten
8 Monoblasten
9 B-Lymphoblasten
10 T-Lympüoblasten
11 Proerythroblasten
12 Megakaryozyten
13 Neutrophile Myelozyten
14 Promonozyten
15 Eosinophile Myelozyten
16 Basophile Myelozyten
17 antigen-aktiviert
18 Erythrozyten
19 Thrombozyten
20 Polymorphkernige Neutrophilen
21 Monozyten
22 Eosinophilen
23 Basophilen
24 B-Zellen
25 T-Zellen
26 Makrophagen
27 Mastzellen
28 Plasmazellen

Claims

1. Verfahren für die Lagerung von Stammzellen zur Aufrechterhaltung ihrer Funktion, wobei das Verfahren die Aufbewahrung der Stammzellen bei Temperaturen zwischen 0 und 25ºC in einem wäßrigen, Gelatine enthaltenden Gemisch umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen über einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden in einem wäßrigen, Gelatine enthaltenden Gemisch aufbewahrt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch modifizierte Flüssiggelatine enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch ein Nährmedium für die Gewebevermehrung enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen pluripotente Stammzellen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch ein Plasma, vorzugsweise 10 bis 75 Masse% Plasma, umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Gelatine in einer geringeren als der Menge eingesetzt wird, die bei 40ºC zum Gelieren des Gemischs (einschließlich der Zellen) führt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem auf Gelatine ein Anteil von mindestens 1 Masse% am gesamten die Zeilen enthaltenden Gemisch entfällt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Gemisch pharmazeutisch für die Anwendung am Menschen geeignet ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zellen für eine gewünschte Zellsubpopulation angereichert und dann in dem wäßrigen Gemisch suspendiert werden.