DE69733694T2

DE69733694T2 - Verwendung von proteinen aus der mk familie als hämatopoietischer faktor

Info

Publication number: DE69733694T2
Application number: DE69733694T
Authority: DE
Inventors: Makoto Kitakyusyu-shi KIKUCHI; Shinya Odawara-shi IKEMATSU; Munehiro Odawara-shi ODA; Sadatoshi Odawara-shi SAKUMA; Takashi Nagoya-shi MURAMATSU
Original assignee: Muramatsu Takashi Nagoya
Current assignee: MURAMATSU, TAKASHI, NAGOYA, AICHI, JP
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-07-10
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2017-07-11
Also published as: US20020132984A1; EP0937461B1; ATE299030T1; EP0937461A4; AU733451B2; DE69733694D1; WO1998001151A1; AU3459397A; US6939669B2; CA2260014A1; EP0937461A1; US6383480B1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft die neuartige Verwendung von MK zur Förderung der Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen in hämatopoetischen Geweben, peripherem Blut oder Nabelschnurblut in Synergie mit anderen hämatopoetischen Faktoren.
Stand der Technik
Im Blut gibt es verschiedene Blutzellen, welche verschiedene Formen und Funktionen haben und Erythrocyten, Leukocyten und Blutplättchen einschließen, und bei der Erhaltung der Homöostasis des lebenden Körpers wichtige Rollen spielen. Diese gereiften Blutzellen haben ihre eigenen Lebensspannen. Um die Zellzahlen der Blutzellen auf einem gleichbleibenden Niveau zu halten, müssen ununterbrochen Blutzellen produziert werden, um die Zahl der Blutzellen aufzuwiegen, die aufgrund des Ablaufs ihrer Lebensspannen verloren gehen.
Es wird angenommen, dass im normalen, gesunden Individuum die tägliche Produktion von Blutzellen soviel wie 2 × 10¹¹ Erythrocyten, 10¹¹ Leukocyten und 1 bis 2 × 10¹¹ Blutplättchen erreicht. Hämatopoetische Stammzellen spielen zentrale Rollen in diesem System, um eine solch enorme Zahl von Blutzellen über einen langen Zeitraum zu produzieren ohne erschöpft zu werden. Die Zellen haben nicht nur die Fähigkeit sich selbst zu erneuern, sondern auch ein vielfältiges Potential sich in verschiedene reife Blutzellen, einschließlich Erythrocyten, Granulocyten, Blutplättchen und Lymphocyten zu differenzieren. Hämatopoetische Stammzellen (multipotente Stammzellen) verlieren ihre Fähigkeit sich selbst zu erneuern, wenn sie proliferieren, um hämatopoetische Vorläuferzellen zu werden (festgelegte Stammzellen), welche bestimmt sind, sich zu bestimmten Blutzellen zu differenzieren. Hämatopoetische Vorläuferzellen differenzieren dann zu reifen peripheren Blutzellen
Es ist bekannt, dass eine Reihe von Cytokinen jeden Schritt des hämatopoetischen Systems zur Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu verschiedenen Blutzellen über hämatopoetische Vorläuferzellen reguliert. Wenigstens 20 Arten dieser Cytokine, die am hämatopoetischen System beteiligt sind, wurden bis jetzt gefunden (Masami Bessho: Igaku no Ayumi 180 (13) (1997); 802–806). Ihre Gene wurden alle cloniert, was ihre Herstellung in großem Maßstab durch genetische Manipulationstechniken erlaubt. Der Stammzellfaktor (SCF) und der flk-2-Ligand sind die bemerkenswertesten Cytokine, die als Faktoren hauptsächlich auf die hämatopoetischen Stammzellen im frühen Stadium der Blutbildung wirken. SCF wirkt auf die undifferenziertesten hämatopoetischen Stammzellen. Sowohl in Mäusen als auch in Menschen fördert er in außerordentlicher Weise die Bildung von Blasten-Kolonien bildenden Einheiten (CFU-BL), gemischte Kolonien bildenden Einheiten (CFU-Mix); Erythrocyten-Burst bildenden Einheiten (BFU-e), Granulocyten/Makrophagen-Kolonien bildenden Einheiten (CFU-GM), Eosinophilen-Kolonien bildenden Einheiten (CFU-Eo) und Megakaryocyten-Kolonien bildenden Einheiten (CFU-Meg) und zeigt eine synergistische Wirkung mit verschiedenen Cytokinen wie IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-11, G-CSF, GM-CSF und EPO. Es wurde berichtet, dass SCF alleine eine schwache, Kolonien-stimulierende Wirkung hat (Tsuji, K. et al., Blood 78 (1991), 1223; Shioharu, M. et al., Blood 81 (1993), 1453; Kubo, T. und Nakahata, T., Int. Hematol. 58 (1993), 153). Nichtsdestoweniger denkt man zur Zeit, dass SCF das wichtigste Cytokin für die Vervielfältigung von hämatopoetischen Stammzellen in vitro ist.
Das Gen für den flk-2-Ligand wurde erst kürzlich cloniert und seine biologische Aktivität wurde nicht vollständig aufgeklärt. Da er synergistische Wirkungen mit vielen Cytokinen aufweist, wie dies SCF tut, wird erwartet, dass er ein wichtiger Faktor für die Vervielfältigung von menschlichen hämatopoetischen Stammzellen in vitro ist.
Einige dieser hämatopoetischen Faktoren wurden klinisch angewendet. Zum Beispiel wird Erythropoetin (EPO), welches die Bildung von Erythrocyten fördert, zur Behandlung der renalen Anämie verwendet und der Granulocyten-Kolonien stimulierende Faktor (G-CSF), welcher die Bildung von Neutrophilen fördert, wird zur Behandlung von Neutropenien, die durch die Chemotherapie von Krebs verursacht werden, verwendet. Diese tragen zur Verbesserung der Lebensqualität von Patienten bei. Kürzlich wurde die klinische Anwendung von Thrombopoetin (TPO) zur Behandlung von Thrombocytopenien untersucht, weil es die Bildung von Blutplättchen fördert.
Da einerseits hämatopoetische Stammzellen fähig sind, alle Arten von Zellen im hämatopoetischen System zu rekonstituieren, wurde bei hämatopoetischen Tumoren verbreitet die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen durchgeführt. Kürzlich kam es schnell zu einer weiten Verbreitung der Transplantation von peripheren Blut-Stammzellen und diese gewann Aufmerksamkeit als eine leistungsfähige, grundlegende Therapie von gegenüber Chemotherapie sensitiven, bösartigen Tumoren, einschließlich der Tumore hämatopoetischer Organe. Des weiteren wird als Zukunftsperspektive erwartet, dass die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen in viele der zellbasierten Therapien und Gentherapien eingeführt wird. Zu diesem Zweck ist es notwendig ein Verfahren zur Vervielfältigung von hämatopoetischen Stammzellen in vitro zu etablieren. Selbst jetzt wurden jedoch menschliche hämatopoetische Stammzellen weder isoliert noch wurde geklärt, in welchem Umfang sie eine Selbsterneuerung wiederholen können.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine neues Cytokin bereit zu stellen, das fähig ist, die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen oder hämatopoetischen Vorläuferzellen in Kombination mit bekannten Cytokinen synergistisch zu fördern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Cytokin bereit zu stellen, das fähig ist, die Proliferation und Differenzierung von Granulocyten/Monocyten-Vorläuferzellen zu fördern.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Cytokin bereit zu stellen, das fähig ist, die Proliferation und Differenzierung von Erythroblasten-Vorläuferzellen in Kombination mit bekannten Cytokinen zu fördern.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass die alleinige Verwendung eines neuen Wachstumsfaktors, der Midkin (MK) oder Pleiotrophin (PTN) genannt wird, die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen (auch hämatopoetische Zellen genannt) von Säugern wie Mäusen und Menschen in vitro fördert. MK hat auch eine extrem außerordentliche, synergistische Wirkung zur Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Zellen, wenn es zusammen mit SCF, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-3 und IL-6 verwendet wird. Weiterhin haben die Erfinder herausgefunden, dass MK oder PTN die schnelle Erholung von Neutrophilen bei Neutropenie von Säugern fördert.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend detailliert beschrieben.
MK wurde als das Produkt eines Gens isoliert, welches im frühen Stadium der Differenzierung von embryonalen Tumorzellen der Maus durch die Induktion durch Retinsäure exprimiert wird (Kadomatsu, K., et al., Biochem. Biophy. Res. Commun. 115 (1988), 1312–1318). PTN wurde als ein Heparin-bindendes Protein mit der Fähigkeit zum Auswachsen von Neuriten im Gehirn neugeborener Ratten gefunden (Rauvaa, H., EMBO J. 8 (1989), 2933–2941). MK und PTN gehören zu einer neuen Klasse von Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren, die miteinander eine Homologie von 45% (in der Aminosäuresequenz) teilen und als MK-Familie bezeichnet werden. MK bzw. PTN zeigen charakteristische Expressionsmuster im Entwicklungsprozess, was andeutet, dass sie wichtige physiologische Aktivitäten bei der Ausprägung der Differenzierung haben.
Unter Berücksichtigung solcher biologischer Aktivitäten der MK-Familie untersuchten die hier genannten Erfinder deren Aktivitäten als hämatopoetische Faktoren die Proliferation und Differenzierung von myeloiden Zellen und peripheren Blut-Stammzellen von Säugern zu bewirken. Im Allgemeinen kann durch die Züchtung einer bestimmten Zahl von Myelocyten in einem halb-festen Medium in der Anwesenheit von diesen hämatopoetischen Faktoren, die Selektion von Zellen, welche die gebildeten Kolonien bilden, und die Zählung der Zahl der Kolonien untersucht werden, in welchem Stadium des Proliferations-/Differenzierungsprozesses der hämatopoetischen Stammzellen und der hämatopoetischen Vorläuferzellen myeloische, hämatopoetische Faktoren teilhaben und wirken. In solchen Koloniebildungsverfahren konnte durch eine Reihe von direkten und indirekten Verfahren bewiesen werden, dass eine einzelne hämatopoetische Vorläuferzelle unter Bildung einer einzelnen Kolonie, die viele reife Blutzellen umfasst, proliferiert, sich teilt und reift. Es gibt Verfahren für Koloniebildungs-Versuche, die spezifisch für die Zellen eines jeden hämatopoetischen Systems, einschließlich Granulocyten/Makrophagen, Erythroblasten und Megakaryocyten sind, und es werden für jedes hämatopoetische System spezifische Stimulatoren verwendet.
Vorläuferzellen des Granulocyten/Makrophagen-Systems, CFU-GM, differenzieren zu Vorläuferzellen des Neutrophilen-Systems, CFU-G, und Vorläuferzellen der Monocyten, CFU-M. Zu diesem Zweck müssen Koloniestimulierende Faktoren (CSF), die spezifisch für jede Vorläuferzelle sind, anwesend sein. Genauer gesagt wird GM-CSF für CFU-GM, G-CSF für CFU-G und M-CSF für CFU-M benötigt. Einige dieser CSFs bewirken nicht nur die Differenzierung von Vorläuferzellen zu reifen Zellen, sondern aktivieren auch die Funktion der gereiften Blutzellen.
CFU-GM kann entweder durch das Weich-Agar-Verfahren oder das Methylcellulose-Verfahren unter Verwendung von kernhaltigen Zellen des Knochenmarks gezüchtet werden. Da die bei beiden Verfahren gebildeten Kolonien aus einer Zellpopulation von Granulocyten und Makrophagen in verschiedenen Entwicklungsstadien bestehen, müssen Vorläuferzellen untersucht werden, die einen Schritt weiter von den hämatopoetischen Stammzellen differenziert sind. Aufnahme und Färbung dieser Kolonien zeigten das vorliegen von aus Granulocyten bestehenden G-Kolonien, aus Makrophagen bestehenden M-Kolonien und aus der Mischung von beiden bestehenden GM-Kolonien. Bei Menschen sind die Kolonien eher klein und in eine als Kolonie bezeichnete Gruppe von 40 oder mehr Zellen oder in eine als Cluster bezeichnete Gruppe mit einer kleineren Ansammlung von Zellen als die Kolonie klassifiziert.
Um zu untersuchen, ob MK die Aktivität besitzt, die Proliferation von Myelocyten zu bewirken, wurde die Proliferation von Myelocyten aus der Maus durch das MTT-Verfahren untersucht, was eine Verstärkung der Proliferation um das 1,6- bis 2-fache in dem mit MK in den Konzentrationen von 5,50,500 und 5000 ng/ml ergänzten System im Vergleich zu dem System ohne MK ergab. Eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Aktivität wurde im Bereich von 5 bis 500 ng/ml MK beobachtet.
Im Kolonie-Versuch auf menschliche mononucleäre Zellen des peripheren Blutes in der Anwesenheit verschiedener Cytokine, wie in 1 gezeigt, wurden in dem System ohne Cytokine gar keine Kolonien gebildet, bildeten sich aber in dem mit MK ergänzten System ähnlich wie mit GM-CSF und IL-3. Die Koloniegröße neigt dazu in dem System mit zugesetztem MK größer zu sein als in dem System mit zugesetzten Cytokinen wie G-CSF, GM-CSF und IL-3. Diese Ergebnisse deuten an, dass MK alleine die Aktivität besitzt die Lebensfähigkeit von menschlichen peripheren Blut-Stammzellen oder hämatopoetischen Vorläuferzellen zu erhalten oder deren Proliferation zu fördern. Weiterhin fördert die kombinierte Verwendung von MK mit anderen Cytokinen wie M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-3 und IL-6 synergistisch die Fähigkeit Kolonien zu bilden. Zum Beispiel erhöhte sich die Zahl von Kolonien um das 7- bis 9-fache in den Fällen der kombinierten Verwendung von MK mit G-CSF, GM-CSF oder IL-3 im Vergleich zu denen der alleinigen Verwendung von MK, G-CSF, GM-CSF oder IL-3. Auch erhöhte die Kombination von MK + GM-CSF + IL-3 + IL-6 außerordentlich die Zahl der gebildeten Kolonien im Vergleich zu der von GM-CSF + IL-3 + IL-6 und die Kombination von MK + G-CSF + IL-6 erhöhte die Zahl der Kolonien signifikant im Vergleich zu der von G-CSF + IL-6. In ähnlicher Weise wurden, wenn der Kolonie-Versuch mit von den in 1 verwendeten verschiedenen menschlichen mononucleären Zellen des peripheren Blutes in der Anwesenheit verschiedener Cytokine durchgeführt wurde und Zellen, welche Kolonien bildeten, morphologisch, wie in 2 gezeigt, beobachtet wurden, GM- Kolonien mit der einzelnen Verwendung von MK, GM-CSF oder IL-3 gebildet und G-Kolonien hauptsächlich alleine mit G-CSF gebildet. Die Kombination von MK + G-CSF + GM-CSF oder die von MK + G-CSF erhöhte im Vergleich mit der alleinigen Verwendung von G-CSF wesentlich die Zahl der G-Kolonien. Das heißt, dass von MK angenommen wird, dass es die Proliferation, Differenzierung und Reifung von CFU-GM durch G-CSF synergistisch fördert, wodurch die Zahl von Neutrophilen im peripheren Blut erhöht wird.
Wenn Zellen nach 2-wöchiger flüssiger Züchtung von menschlichen Stammzellen des peripheren Blutes in der Anwesenheit verschiedener Cytokine durch spezifische Färbung untersucht wurden, wurden, wie in 3 gezeigt, vorwiegend viele Granulocyten (Neutrophile) in dem mit MK ergänzten System beobachtet, was klar die Wirkung von MK auf die Proliferation von Neutrophilen aufzeigt. Insbesondere im Fall der Kombination von MK + G-CSF + GM-CSF + SCF + IL-3 + IL-6 wurde eine extrem außerordentliche Förderung der Proliferation und Differenzierung von Neutrophilen beobachtet.
Auch steigerte sich in der nach der vorstehend beschriebenen flüssigen Züchtung in dem mit MK ergänzten System die Anhaftung der Zellen an eine Kulturschale im Vergleich mit dem ohne MK, was aufzeigt, dass MK auch die Proliferation des interstitiellen Zellsystems (Stromazellsystem) fördert. In Fall von alleinigem IL-6 bestanden die gebildeten Kolonien aus Makrophagen und im Fall von MK + IL-6 bestand die Hälfte der gebildeten Kolonien aus Granulocyten. Diese Ergebnisse zeigen die Beteiligung von MK an der Förderung der Proliferation und Differenzierung von Granulocyten auf.
Ob eine solch außerordentliche Förderung der Bildung von Neutrophilen durch MK sich in vivo zeigt, kann durch die Verabreichung von MK an eine Maus, deren hämatopoetisches System durch die Verabreichung eines gegen Krebs gerichteten Arzneistoffs oder durch die Exposition mit Strahlung geschädigt worden ist, und die Untersuchung des Erholungszustandes der Neutrophilen untersucht werden. MK wurde einer Maus täglich über 13 aufeinanderfolgende Tage verabreicht und am fünften Tag nach dem Beginn der Verabreichung wurde der Maus ein gegen Krebs gerichteter Arzneistoff, Cyclophosphamid (CY) verabreicht. Die Untersuchung der Blutzellen im in angemessenen Abständen entnommenen Blut der Maus zeigte, wie erwartet, eine außerordentliche Förderung der Erholung der Zahl der Neutrophilen (Tabelle 1).
Tabelle 1
Die Wirkung von MK auf hämatopoetische Zellen unter der in vivo-Situation näheren Bedingungen kann zum Beispiel durch den Kolonie-Versuch unter Verwendung eines Methylcellulose-Mediums, welches EPO, IL-3, IL-6 und SCF enthält [MethoCult GF M3434 (Stern Cell Technologies, Inc.)] untersucht werden. Dieses Medium (hiernach als M3434-Medium bezeichnet) kann die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen von Erythrocyten, Leukocyten und Blutplättchen bewirken.
Ergebnisse des Kolonie-Versuchs mit Milzzellen der Maus im System des M3434-Mediums, ergänzt mit MK, werden in den 4 und 5 gezeigt. Die 4 veranschaulicht die Zahl der CFU-GM-Kolonien oder CFU-G-Kolonien. Obwohl CFU-GM-Kolonien oder CFU-G-Kolonien alleine mit dem M3434-Medium erzeugt werden können, nimmt die Zahl der Kolonien im Allgemeinen in dem mit dem MK ergänzten System im Vergleich mit dem alleinigen M3434-Medium zu. Insbesondere wenn MK in einer Konzentration von 1 bis 10 ng/ml zugesetzt wird, nahm die Zahl der Kolonien am achten und zehnten Tag des Versuchs außerordentlich um das 2- bis 3-fache zu. Die 5 stellt die Zahl der gemischte Kolonien bildenden Einheiten (CFU-Mix) dar. CFU-Mix sind multipotente Stammzellen in einem leicht differenzierten Stadium, welche ein geringeres, sich selbst erneuerndes Potential haben als Blasten-Kolonien bildende Einheiten (CFU-BL), welche die am meisten undifferenzierten, durch den in vitro Kolonie-Versuch identifizierbaren Zellen sind und von denen angenommen wird, dass sie Zellen enthalten, die fähig sind zu Erythrocyten, Leukocyten und Blutplättchen zu differenzieren. In dem mit MK ergänzten System nahmen die CFU-Mix-Kolonien zahlenmäßig bedeutend zu. Das heißt, dass von MK, wenigstens bei seiner kombinierten Verwendung mit IL-3, IL-6, SCF und EPO, angenommen wird, dass es die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen oder unreifen hämatopoetischen Zellen, die diesen nahe stehen, wesentlich fördert. Von diesen Wirkungen wird angenommen, dass sie sehr nützlich für die Vermehrung von hämatopoetischen Stammzellen in vitro zur Transplantation von Knochenmark oder von peripheren Blut-Stammzellen oder für den Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen sind.
Bei den hämatopoetischen Zellen sind die reiferen Zellen des peripheren Blutes die sensitiveren gegenüber gegen Krebs gerichteten Arzneistoffen. Unter Nutzung dieser Eigenschaft versuchten die hier genannten Erfinder hämatopoetische Stammzellen oder hämatopoetische Vorläuferzellen durch einen gegen Krebs gerichteten Arzneistoff anzureichern. Es wurde nämlich der Kolonie-Versuch unter Verwendung von Milzzellen einer Maus, welcher Cyclophosphamid verabreicht worden war, durchgeführt. Die Ergebnisse werden in den 6 und 7 gezeigt. Die 6 zeigt, dass die Zahl von CFU-Mix- und CFU-G-Kolonien in dem mit MK ergänzten System im Vergleich mit dem System ohne MK um das 2-fache oder mehr zunahm. Dieses Experiment zeigt auch auf, dass MK die Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen fördert.
Die Wirkung von MK wurde unter Verwendung von peripheren Blutzellen eines Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom und einem MethoCult H4230-Medium [bestehend aus Methylcellulose (0,9%), 2-Mercaptoethanol (10 bis 4 M), L-Glutamin (2mM), fötales Rinderserum (30%) und Rinderserumalbumin (1%) und weder CSF noch EPO enthaltend; Stem Cell Technologies, Inc.] untersucht. Ein Kolonie-Versuch wurde unter Verwendung folgender Kombinationen durchgeführt: MethoCult- H4230 alleine, H4230 + MK, H4230 + G-CSF und H4230 + MK + G-CSF. Das Verhältnis von CD34 positiven Zellen unter den peripheren Stammzellen des Patienten war 1,4%. Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt. Obwohl mit MK alleine überhaupt keine Kolonien gebildet wurden, wurde eine außerordentliche Kolonien bildende Fähigkeit im Fall von MK + G-CSF offenbar und die Zahl von Kolonien war eindeutig zweimal oder mehr so groß wie jene im Fall von G-CSF alleine. Am und nach dem zehnten Tag nach Beginn des Versuchs neigt die Zunahme der Zahl der Kolonien in der MK + G-CSF-Gruppe im Vergleich mit der Gruppe mit G-CSF alleine dazu abzunehmen. Die mikroskopische Betrachtung der Kolonien am und nach dem zehnten Tag enthüllte die Tendenz, dass die Reifung der Kolonien in der MK + G-CSF-Gruppe im Vergleich mit der Gruppe mit G-CSF alleine beschleunigt war. Deshalb ist die Verzögerung der Zunahme der Zahl der Kolonien in der MK + G-CSF-Gruppe im Vergleich mit der Gruppe mit G-CSF alleine wahrscheinlich der beschleunigten Reifung der Kolonien zuzuschreiben.
Es ist bemerkenswert, dass in dem vorstehend beschriebenen Kolonie-Versuch die Größe jeder der gebildeten Kolonien in den mit MK ergänzten Gruppen immer größer war als in den Gruppen, denen kein MK zugesetzt wurde. Um diese Tatsache quantitativ zu untersuchen, wurden jeweils drei große Kolonien, die sich am 14. Tag in der Anwesenheit von MK alleine, G-CSF alleine und MK + G-CSF in dem Kolonie-Versuch mit peripheren Blut-Stammzellen des vorstehend beschriebenen Patienten ausgewählt und unter einem Mikroskop aufgesaugt und bezüglich der sie bildenden Zellen mit einer Zellzählkammer ausgezählt, um Mittelwerte zu berechnen. Die Ergebnisse werden in 9 gezeigt. Es ist offensichtlich, dass Kolonien, die mit MK + G-CSF gebildet werden, mehr sie bildende Zellen enthalten, als jene die mit G-CSF alleine gebildet wurden. Dass die Größe einer Kolonie groß ist, bedeutet, dass die Zahl der sie bildenden Zellen ebenfalls groß ist. Aus diesen Ergebnissen wird offensichtlich, dass MK auf die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen wirkt.
Der Kolonie-Versuch wurde ähnlich mit dem peripheren Blut eines gesunden, normalen Individuums durchgeführt. Der Anteil CD34 positiver Zellen im peripheren Blut dieses Probanden war 0,4%. Die Ergebnisse werden in 10 gezeigt. Kolonien wurden mit MK alleine gebildet. Am zehnten und vierzehnten Tag nahm die Zahl der Kolonien abhängig von der MK-Konzentration zu. Das MK + G-CSF-System bildete auf dem Höhepunkt zweimal oder mehr so viele Kolonien wie das System mit G-CSF alleine. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass, wenn MK zugesetzt wurde, die gleiche Tendenz erhalten wurde, unabhängig davon, ob die Zellen von einem gesunden, normalen Individuum oder einem Patienten gewonnen wurden.
Weiterhin wurde der Kolonie-Versuch ähnlich unter Verwendung des peripheren Blutes des vorstehend beschriebenen gesunden, normalen Individuums in der Anwesenheit von Pleiotrophin (PTN), welches ein anderes Mitglied der MK-Familie ist, durchgeführt. Das hier verwendete PTN war ein rekombinantes PTN [rekombinantes menschliches Pleiotrophin (aus SF21 gewonnen); Charge GH055011) (R & D Systems)]. Die Ergebnisse werden in 11 gezeigt. PTN alleine zeigt eine Kolonien bildende Fähigkeit wie MK und die Zahl der gebildeten Kolonien war ausgesprochen hoch. Eine synergistische Wirkung von PTN mit G-CSF zur Förderung der Bildung von Kolonien wurde ähnlich wie im Fall von MK beobachtet. Ausgehend von diesen Ergebnissen fördert PTN wie MK offensichtlich die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen.
Als nächstes wurde unter Verwendung eines Mediums vom Kompletttyp für Versuche mit hämatopoetischen Stammzellen (Chargennummer 96101601; Kyokuto Seiyaku Kogyo), welches IL-3, SCF, G-CSF und EPO enthielt, der Kolonie-Versuch mit Zellen des peripheren Blutes von einem gesunden, normalen Individuum durchgeführt. Von diesem Versuch wird angenommen, dass er unter Bedingungen durchgeführt wird, die näher an der in vivo-Situation sind. Ergebnisse mit MK werden in den 12 und 13 gezeigt und die mit PTN in den 14 und 15. Es wurde mit keiner Kombination, einschließlich MK + IL-3, MK + SCF und MK + G-CSF, eine Vermehrung von BFU-E beobachtet. Von den Kombinationen MK + EPO und PTN + EPO wurde jedoch angenommen, dass sie BFU-E vermehren. Vorläuferzellen von Erythroblasten, BFU-E, wurden am 14. Tag der Kultur gebildet und von ihnen ist bekannt, dass sie undifferenzierter sind als die am fünften bis siebten Tag gebildeten CFU-E. Zugabe von MK oder PTN zu einem Kyokuto-Vollmedium führten am Höhepunkt am zwölften Tag nach Beginn der Kultur zu einer Bildung von zweimal oder mehr so vielen BFU-E wie das Vollmedium alleine. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass wenigstens die Zugabe von MK zum Vollmedium auch zu einer Förderung der Proliferation von Erythroblasten führt.
Wie vorstehend beschrieben, ist es offensichtlich, dass die MK-Familie fähig ist, auf hämatopoetische Stammzellen und hämatopoetische Vorläuferzellen in den hämatopoetischen Geweben von Säugern einzuwirken, um diese zu erhalten, ihre Proliferation und Differenzierung zu bewirken und die vorstehend beschriebenen Funktionen synergistisch oder additiv durch die kombinierte Verwendung mit verschiedenen Cytokinen wie SCF, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-3 und IL-6 zu verstärken. Insbesondere fördert die MK-Familie unter den der in vivo-Situation näheren Bedingungen außerordentlich die Proliferation von CFU-Mix, welche sehr nahe an den multipotentiellen Stammzellen ist. Die MK-Familie fördert auch die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen der Granulocyten/Makrophagen und übt eine außerordentliche, die Neutrophilen vermehrende Wirkung in einem in vivo-Neutropenie-Modell aus. Die MK-Familie kann alleine oder in Kombination mit mehr als einer Art von Cytokinen, einschließlich SCF, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-3 und IL-6, klinisch angewendet werden und insbesondere für die ex vivo-Vermehrung von hämatopoetischen Stammzellen bei der Transplantation von Knochenmark oder von Stammzellen, welche aus dem peripheren Blut oder Nabelschnurblut gewonnen wurden, verwendet werden. Zusätzlich wird von der MK-Familie erwartet, dass sie für die Behandlung und Vorbeugung bei Patienten mit Neutropenie, aplastischer Anämie und Leukämie, verursacht durch gegen Krebs gerichtete Chemotherapie, verwendet werden wird. Weiterhin würde die MK-Familie in der Zukunft verwendet werden, um die Proliferation von Stammzellen für die auf hämatopoetische Stammzellen abzielende Gentherapie zu bewirken. Insbesondere ist es sehr vielversprechend, die Dosisdichte in der Chemotherapie bei Krebs durch die kombinierte Verwendung von MK mit G-CSF zu erhöhen und dadurch die Wirkung der Chemotherapie durch Erhöhung der Dosis von gegen Tumoren gerichteten Arzneistoffen oder Verkürzung der Verabreichungsphase zu verbessern.
MK und PTN können bei erfindungsgemäßer Verwendung entweder ein natürliches oder ein rekombinantes Produkt sein. Die rekombinante MK-Familie umfasst eine Substanz, die stark homolog mit dem natürlichen MK oder PTN ist und eine mit diesen gleichwertige biologische Aktivität hat. Solches MK oder PTN schließt deren Derivate und Analoga ein. Das aufgereinigte MK oder PTN von Säugern umfasst solches, welches von Mäusen oder Menschen, jedoch nicht darauf beschränkt, gewonnen wurde. Erfindungsgemäßes MK oder PTN schließt auch glycosyliertes und nicht-glycosyliertes MK oder PTN ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 veranschaulicht die Wirkung der alleinigen oder kombinierten Verwendung von MK, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3 und IL-6 auf die Kolonien bildende Fähigkeit von menschlichen mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut.
Die 2 veranschaulicht die Wirkung der alleinigen oder kombinierten Verwendung von MK, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3, IL-6 und SCF auf die G-Kolonien, GM-Kolonien und M-Kolonien bildenden Fähigkeiten von mononucleären Zellen aus dem menschlichen peripheren Blut, welches von dem, das in dem Experiment in 1 verwendet wurde, verschieden ist.
Die 3 veranschaulicht die Zahlen von Granulocyten, Monocyten oder Macrophagen und anderen Zellen, die durch die Esterase-Doppelfärbung von menschlichen mononucleären Zellen des peripheren Blutes nach einer Flüssigkultur über zwei Wochen in der Gegenwart von MK, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6 und SCF alleine oder in Kombination gezählt wurden.
Die 4 veranschaulicht die Wirkungen von MK auf die Kolonien bildende Fähigkeit von Milzzellen aus der Maus, welche, um die die Proliferation fördernde Wirkung von MK auf hämatopoetische Zellen unter den der in vivo-Situation näheren Bedingungen zu untersuchen, für zwölf Tage in einem vollständigen Methylcellulose-Medium gezüchtet wurden, welches EPO, IL-3, IL-6 und SCF (MethoCult GF M3434) enthielt und mit MK ergänzt wurde.
Die 5 veranschaulicht die Wirkung von MK auf die CFU-Mix-Kolonien bildende Fähigkeit in einem dem in 4 ähnlichen Experiment.
Die 6 veranschaulicht die Wirkung von MK auf die CFU-G-Kolonien bildende Fähigkeit, wenn ein gegen Krebs gerichteter Arzneistoff, Cyclophosphamid, einer Maus verabreicht wurde und Myelocyten am vierten Tag nach Verabreichung des Arzneistoffs gewonnen wurden und über 14 Tage in einem vollständigen Methylcellulose-Medium, welches EPO, IL-3, IL-6 und SCF (MethoCult GF M3434) ergänzt mit MK enthielt, gezüchtet wurden.
Die 7 veranschaulicht die Wirkung von MK auf die CFU-Mix-Kolonien bildende Fähigkeit in einem dem in 6 ähnlichen Experiment.
Die 8 veranschaulicht Wirkungen von MK auf die Kolonien bildende Fähigkeit, wenn peripheres Blut von einem Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom über 14 Tage in einem Methylcellulose-Medium für den Kolonie-Versuch (MethoCult GF 4230), ergänzt mit MK, G-CSF oder MK + G-CSF, gezüchtet wurde.
Die 9 veranschaulicht die Zahl der die Kolonien bildenden Zellen am 14. Tag in einem dem in 8 ähnlichen Experiment, wo das Medium alleine und jenes, das mit G-CSF oder MK + G-CSF ergänzt wurde, verwendet wurden.
Die 10 veranschaulicht die Wirkung von MK und G-CSF auf die Kolonien bildende Fähigkeit, wenn das periphere Blut eines gesunden, normalen Individuums für den Kolonie-Versuch in einem Methylcellulose-Medium (MethoCult GF H4230), ergänzt mit MK, G-CSF oder MK + G-CSF, gezüchtet wurde.
Die 11 veranschaulicht die Ergebnisse eines dem in 10 ähnlichen Experiments wo PTN statt MK verwendet wurde.
Die 12 veranschaulicht die Wirkungen von MK auf die Fähigkeit CFU-E-Kolonien zu bilden, wenn das gleiche menschliche periphere Blut, wie es in dem Experiment von 10 verwendet wurde, in einem Medium für den Blut-Stammzellversuch, welches EPO, IL-3, G-CSF und SCF enthält und mit MK ergänzt ist, gezüchtet wurde.
Die 13 veranschaulicht in einem dem in 12 ähnlichen Experiment die Wirkungen von MK auf die Kolonien bildende Fähigkeit bei BFU-E, welche undifferenzierter als CFU-E ist.
Die 14 veranschaulicht die Wirkungen von PTN auf die Fähigkeit CFU-E-Kolonien zu bilden, wenn das periphere Blut desselben gesunden, normalen Individuums, wie es im Experiment der 10 verwendet wurde, in dem gleichen Medium, wie es im Experiment der 10 verwendet wurde, welches mit PTN statt mit MK ergänzt ist, gezüchtet wurde.
Die 15 veranschaulicht in einem dem in 14 ähnlichen Experiment die Wirkungen von PTN auf die Fähigkeit BFU-E-Kolonien zu bilden.
Bestes Verfahren um die Erfindung auszuführen
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Bezugnahme auf Beispiele beschrieben, ist aber nicht als darauf begrenzt aufzufassen. Das hier verwendete MK ist menschliches MK, welches in SEQ ID Nr. 3 in der japanischen Patentanmeldung Nr. Hei 7-255354 beschrieben ist.
Beispiel 1: Wirkung von MK auf die Förderung der Erholung der Neutrophilen in einem Neutropenie-Modell
Die Neutropenie ist eine Erkrankung, bei der die Neutrophilen, welche die wichtigste Rolle bei der Verhinderung einer Infektion spielen, selektiv verloren gehen oder in ihrer Zahl wesentlich vermindert sind. Im Folgenden wird ein Beispiel dargestellt, worin MK einem Neutropenie-Modell verabreicht wurde, welches durch die Verabreichung eines gegen Tumoren gerichteten Arzneistoffs an normale Mäuse erzeugt wurde, und auf seine Wirkung auf die Förderung der Erholung der Neutrophilen hin untersucht wurde.
Die Mäuse des Neutropenie-Modells wurden durch Verabreichung eines gegen Tumoren gerichteten Arzneistoffs, Cyclophosphamid (CY), an 12 Wochen alte ICR-Mäuse (männlich) erzeugt. Die Mäuse wurden in die folgenden Gruppen aufgeteilt, so dass jede Gruppe fünf Mäuse hatte, (1) unbehandelte Gruppe (Kontrollgruppe), (2) CY-verabreichte Gruppe, (3) CY + MK-verabreichte Gruppe und (4) MK alleine verabreichte Gruppe. MK wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt und den Mäusen täglich mit einer Dosis von 0,1 ml/Tier und 300 μg/kg über 13 aufeinanderfolgende Tage intraperitoneal verabreicht. Sechs Stunden nach der Verabreichung am fünften Tag der aufeinandertolgenden Verabreichung wurde den Mäusen CY in einer Dosis von 266 mg/kg, entsprechend 2/3 des LD₅₀-Wertes, verabreicht. Der Tag der Verabreichung von CY wurde als Tag 0 betrachtet und es wurde insgesamt 5 mal Blut gewonnen, nämlich an Tag 0, Tag 2, Tag 4, Tag 7, Tag 9, und bezüglich Leukocyten, Neutrophilen, Lymphocyten und Erythrocyten gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Zahl der Lymphocyten erreichte in der CY-verabreichten Gruppe und der Cy + MK-verabreichten Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe den niedrigsten Wert an Tag 2 und erholten sich nicht bis Tag 9. Die Zahl der Neutrophilen erreichte ihren niedrigsten Wert an Tag 4, stieg aber an Tag 7 bis zu 2,8 mal so hoch wie die der Kontrollgruppe.
Beispiel 2: Die Bildung von Kolonien fördernde Wirkung von MK und anderen Cytokinen auf menschliche, mononucleäre Zellen des peripheren Blutes
Zur Gewinnung von menschlichen peripheren Blut-Stammzellen (PBSC) ist es notwendig diese aus dem Knochenmark in das periphere Blut wandern zu lassen. Ein hämatopoetischer Faktor, G-CSF, wurde einem Individuum verabreicht, welches in einem hämatologisch stabilen Zustand ist, um die Wanderung von PBSC in das periphere Blut zu bewirken und das Blut wurde mit einer heparinisierten Spritze gewonnen. Das periphere Blut wurde unter Verwendung eines Separationsmediums aufgetrennt. Die so aufgetrennte Schicht mononucleärer Zellen wurde mit einem Phosphatpuffer (PBS) gemischt und bei 4°C und 1500 Upm über 5 Min. zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und die Zellen wurden durch mehrmalige Wiederholung dieses Vorgehens gewaschen. Die Zellen wurden in einem Medium aufgenommen, welches 10% FBS enthielt, und mit der Zellzählkammer K-8000 gezählt. Schließlich wurde die Zellkonzentration mit einem Medium, welches 10% FBS enthielt, auf 1 × 10⁶/ml eingestellt.
Verwendete Testsubstanzen waren MK, 50 μg/ml; G-CSF, 10 ng/ml; GM-CSF, 10 ng/ml; M-CSF, 50 ng/ml; IL-3, 10 ng/ml; IL-6, 100 ng/ml; und SCF, 10 ng/ml. Diese Substanzen wurden darauf eingestellt, die vorstehenden Konzentrationen zu haben, in dem jede Lösung mit der 10-fachen Konzentration der Endkonzentration unter Verwendung von Iscove's modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) hergestellt wurde und in einer Menge von 10% des gesamten Volumen des Systems zu einem Versuchssystem, zugegeben wurde.
Ein FBS enthaltendes Methylcellulose-Medium wurde für den Kolonie-Versuch verwendet. Eine Methylcellulose-Lösung wurde durch Zugabe von Methylcellulose-Pulver (3500 bis 5600 cps, Tokyo Kasei Kogyo) auf 2% zu dem Medium hergestellt.
Die nötige Menge von jeder Lösung, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, wurde in ein einzelnes Röhrchen gegeben. In jedem Röhrchen wurden nämlich die Lösungen gemischt, um Endkonzentrationen von 1 × 10⁵/ml für Zellen, 20% für FBS, 20% für das Medium, welches 10% FBS enthielt, und 0,8% für Methylcellulose zu ergeben. Die Testsubstanzen wurden dann jeweils dieser Mischung zugesetzt, um die vorstehend beschriebenen Konzentrationen zu ergeben. Nachdem die sich ergebende Mischung gründlich verwirbelt war, wurde unter Verwendung einer Spritze mit einer #18-Nadel eine Kulturschale aus Plastik (Falcon 1008) damit angeimpft und es erfolgte in einem Brutschrank mit 5% Kohlendioxid bei einer Luftfeuchtigkeit von 100% und 37°C eine Züchtung über 2 Wochen. Nach zwei Wochen wurde die Zahl der gebildeten Kolonien unter Verwendung eines Umkehrmikroskops gezählt. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt.
Der Kolonien-Versuch von mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut von einem anderen gesunden, normalen Individuum unter Verwendung von G-CSF, GM-CSF und M-CSF wurde mit einem ähnlichen Verfahren, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
Beispiel 3: Flüssigkultur von menschlichen mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut in der Anwesenheit von MK und anderen Cytokinen
Menschliche mononucleäre Zellen aus dem peripheren Blut und Testsubstanzen wurden ähnlich wie in Beispiel 2 hergestellt. Die Testsubstanzen wurden jeweils der Mischung, welche 1,5 × 10⁵/ml Zellen, 30% FBS und 10% des Mediums, welches 10% BSA enthielt, zugesetzt, um die vorstehend beschriebenen Konzentrationen zu ergeben. Die sich ergebende Mischung wurde auf eine Kulturschale aus Plastik (Falcon, 1008) verteilt und in einem Brutschrank bei 5% Kohlendioxid bei 100% Luftfeuchtigkeit und 37°C über 2 Wochen gezüchtet.
Nach 2 Wochen wurden alle Zellen von jeder Kulturschale gewonnen. An der Kulturschale haftende Zellen wurden dadurch gewonnen, dass sie mit 0,25% Trypsin/EDTA behandelt wurden. Die Zellen wurden in Röhrchen übertragen und einmal bei 4°C und 800 Upm zentrifugiert. Die so gewonnenen Zellen wurden dann im gleichen Volumen des Kulturmediums aufgenommen und mit einer Zellzählkammer gezählt.
Die für die Zählung gewonnenen Zellen wurden mit einem Cytospin (Cytospin 2, SHANDON) auf einen Objektträger aufgebracht und einer Esterase-Doppelfärbung unterzogen (ein Esterasefärbungs-Kit und Esterase-AS-D-Färbungs-Kit, Muto Kagaku Yakuhin). Unter Veränderung des Gesichtsfeldes wurden die Zellen abhängig von ihrer Anfärbbarkeit in Granulocyten, Monocyten, Makrophagen und andere unterschieden. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
Beispiel 4: Die Hämatopoese fördernde Wirkung von MK unter der in vivo-Situation näheren Bedingungen
Die Milz einer 8 Wochen alten BDF1-Maus (weiblich) wurde aseptisch in einer Sterilbank herausgeschnitten und die Zellen wurden durch Verwendung einer Nadel [Therumo, 22G × 1¼'' (0,70 × 32 mm)] in IMDM (GIBCO BRL) in einer Petrischale gepresst. Die Zellen der Milz wurden in IMDM (10 ml) in einem Röhrchen gesammelt, durch Pipetieren gründlich gemischt und durch ein Zellsieb passiert (FALCON 2350, 70 μm). Die mononucleären Zellen wurden mit einer Zellzählkammer gezählt und auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml mit IMDM eingestellt, um als Zellsuspension zu dienen. Testlösungen, die MK mit 100 ng/ml, 1 mg/ml und 10 mg/ml in IMDM enthielten, wurden ähnlich hergestellt.
Das verwendete Methylcellulose-Medium war ein Vollmedium, MethoCult GF M3434 (0,9% Methylcellulose, 10 bis 4 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, FBS, 1% BSA, EPO, Insulin, Transferrin, IL-3, IL-6 und SCF enthaltend; Stem Cell Technologies, Inc.) Dem Medium wurden die vorstehend beschriebenen Zellen zu 1 × 10⁵/ml und MK zu einer Endkonzentration von 1,10, oder 100 ng/ml zugesetzt. Der Kolonie-Versuch wurde dann mit einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die Ergebnisse werden in den 4 und 5 gezeigt.
Beispiel 5: Die Hämatopoese fördernde Wirkung von MK unter der in vivo-Situation näheren Bedingungen (Konzentration der hämatopoetischen Stammzellen und der hämatopoetischen Vorläuferzellen)
Um die hämatopoetischen Vorläuferzellen in den Myelocyten aufzukonzentrieren, wurde fünf 8 Wochen alten BDF1-Mäusen (weiblich) Endoxan-Pulver [starker Arzneistoff gemäß der japanischen Pharmakopoe, Cyclophosphamid (CY)] in einer Dosis von 1 mg/Tier verabreicht. Vier Tage nach der Verabreichung wurden Zellen aus dem Knochenmark der Mäuse durch das übliche Verfahren präpariert und mit IMDM auf eine Konzentration von 2 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt. Der Kolonie-Versuch wurde dann in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die Ergebnisse werden in den 6 und 7 gezeigt.
Beispiel 6: Wirkungen von MK und anderen Cytokinen auf die Bildung von Kolonien aus mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut von einem Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom
Das verwendete Medium war ein Methylcellulose-Medium, MethoCult H4230 (eine Endkonzentration von 0,9% Methylcellulose, 10 bis 4 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 30% FBS und 1% Rinderserumalbumin enthaltend; Stem Cell Technologies, Inc.). Die Ergebnisse werden in den 8 und 9 gezeigt.
Beispiel 7: Wirkungen von MK und PTN auf die Bildung von Kolonien aus den mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut eines gesunden, normalen Individuums.
Der Kolonie-Versuch wurde unter Verwendung des gleichen Mediums wie in Beispiel 6 durchgeführt. Die Ergebnisse werden in den 10 und 11 gezeigt.
Beispiel 8: Wirkungen von MK und PTN auf die Bildung von Erythroblasten-Kolonien aus mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut eines gesunden, normalen Individuums
Der Kolonieversuch wurde unter Verwendung eines Mediums für Versuche mit hämatopoetischen Stammzellen (Kompletttyp, Kyokuto Seiyaku Kogyo, welches 30% FCS, 1% BSA, 10 bis 4 M 2-Mercaptoethanol, IMDM, PS-Lösung, 1,2% Methylcellulose, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml G-CSF, 2 U/ml EPO und 50 ng/ml SCF enthielt) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in den 12, 13, 14 und 15 gezeigt.
Industrielle Anwendbarkeit
Die MK-Familie wirkt auf hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen von verschiedenen Blutzellen aus hämatopoetischen Geweben von Säugern, um deren Erhaltung, Proliferation und Differenzierung zu bewirken. Weiterhin werden die vorstehend beschriebenen Funktionen synergistisch oder additiv durch die kombinierte Verwendung von MK mit anderen Cytokinen wie SCF, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-3 und IL-6 verstärkt. Die MK-Familie übt unter der in vivo-Situation nähren Bedingungen insbesondere außerordentliche, die Proliferation fördernde Wirkungen auf CFU-Mix aus, welche sehr nahe an multipotenten Stammzellen ist. Die MK-Familie fördert auch die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen der Granulocyten/Macrophagen und vermehrt außerordentlich die Neutrophilen bei Neutropenie in vivo. Das erfindungsgemäße Arzneimittel, welches alleine die MK-Familie enthält oder die MK-Familie in Kombination mit einem oder mehreren Cytokinen wie SCF, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, IL-3 und IL-6 enthält, kann klinisch insbesondere ex vivo bei der Expansion von Stammzellen bei der Transplantation von Knochenmark und der Stammzellen, die aus dem peripheren Blut oder dem Nabelschnurblut gewonnen wurden, angewendet werden. Von der MK-Familie wird auch erwartet, dass sie zur Behandlung und Vorbeugung von Neutropenie, aplastischer Anämie und Leukämie, verursacht durch gegen Krebs gerichtete Chemotherapie, zu verwenden ist. Weiterhin wird von der MK-Familie angenommen, dass sie zur Proliferation von Stammzellen für die auf hämatopoetische Stammzellen abzielende Gentherapie zu verwenden ist.

Claims

Agens zum Fördern von Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und/oder hämatopoetischen Vorläuferzellen von Säugern, umfassend ein Protein, das zu der MK-Familie gehört, und einen oder mehrere andere hämatopoetische Faktoren als Wirkstoffe.
Arzneimittel, umfassend ein Protein, das zu der MK-Familie gehört, und einen oder mehrere andere hämatopoetische Faktoren als Wirkstoffe.
Verwendung eines Proteins, das zu der MK-Familie gehört, und gegebenenfalls eines oder mehrerer anderer hämatopoetischer Faktoren für die Herstellung eines Arzneimittels zur Knochenmarkstransplantation und peripheren Blut-Stammzellentransplantation.
Verwendung eines Proteins, das zu der MK-Familie gehört, und eines oder mehrerer anderer hämatopoetischer Faktoren für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Neutropenie bei Säugern.
Verfahren zur ex vivo-Expansion von hämatopoetischen Stammzellen für die Transplantation von Knochenmark und peripheren Blut-Stammzellen, umfassend das Verabreichen eines Proteins, das zu der MK-Familie gehört, und gegebenenfalls eines oder mehrerer anderer hämatopoetischer Faktoren.
In vitro-Verfahren zum Fördern von Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen und/oder hämatopoetischen Vorläuferstammzellen, umfassend das Hinzufügen eines Proteins, das zu der MK-Familie gehört, und gegebenenfalls eines oder mehrerer anderer hämatopoetischer Faktoren zum Zellkulturmedium.
Verwendung eines Proteins, das zu der MK-Familie gehört, und eines oder mehrerer anderer hämatopoetischer Faktoren für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von aplastischer Anämie.
Verwendung eines Proteins, das zu der MK-Familie gehört, und eines oder mehrerer anderer hämatopoetischer Faktoren für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Leukämie.
Verwendung eines Proteins, das zu der MK-Familie gehört, und eines oder mehrerer anderer hämatopoetischer Faktoren für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln des Non-Hodgkin-Lymphoms.
Agens gemäß Anspruch 1 oder Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die hämatopoetischen Stammzellen ein CFU-Mix sind.
Agens gemäß Anspruch 1, Arzneimittel gemäß Anspruch 2, Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6 oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4 oder 7 bis 9, wobei die anderen hämatopoetischen Faktoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, SCF und EPO; oder einer beliebigen Kombination daraus.