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DE69329023T2 - T-peptid und damit verwandte peptide in der behandlung von entzündungen einschliesslich der multiplen sklerose - Google Patents

T-peptid und damit verwandte peptide in der behandlung von entzündungen einschliesslich der multiplen sklerose

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DE69329023T2
DE69329023T2 DE69329023T DE69329023T DE69329023T2 DE 69329023 T2 DE69329023 T2 DE 69329023T2 DE 69329023 T DE69329023 T DE 69329023T DE 69329023 T DE69329023 T DE 69329023T DE 69329023 T2 DE69329023 T2 DE 69329023T2
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peptide
ser
tyr
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Roger Aston
Louis Carlen
Reed Doob
Kevin Macfadden
James Phipps
Deborah Rathjen
Fred Widmer
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Advanced Immuni T Inc
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung oder Vorbeugung von entzündlichen Darmerkrankungen, die entweder von Bakterien, Viren und/oder anderen infektiösen Agentien, opportunistischen Infektionen (die auf einen immunodepressiven Zustand folgen können, z. B. infolge einer Krebstherapie, und insbesondere einer cytotoxischen Arzneimitteltherapie oder Radiotherapie), einer Autoimmunität oder von anderen Ursachen verursacht werden. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die zu solch einer Behandlung und/oder Vorbeugung und für bestimmte aktive Peptide als solche geeignet sind.
  • Eine entzündliche Darmerkrankung (IBD)ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die die meisten Kriterien einer Autoimmunerkrankung zeigt (Snook, Gut 31. 961-963 (1990)). Die Entzündung und die Gewebeschäden betreffen die Wiederherstellung und Aktivierung neutrophiler Makrophagen und Lymphozyten (MacDermott et al., Adv. Immunol. 42 285-328 (1998)), die Zytokine und proinflammatorische Moleküle, wie z. B. Prostaglandine und Leukotriene bilden (MacDermott, Mt. Sinai J. Med. 57 273-278 (1990)). Als Ergebnis einer chronischen Aktivierung von immunokompetenten Zellen, sind IL-I, IL-6 (Starter, Immunol. Res. 10 465-471 (1991); Fiocchi, Immunol. Res. 10 239-246 (1991)) und TNF- (MacDermott, Mt. Sinai J. Med. 57 273-278 (1990)) bei IBD- Patienten alle erhöht.
  • Arzneimittel, die zur Behandlung von IBD verwendet werden, umfassen antiinflammatorische Mittel, wie z. B. Sulfasalazin (5-ASA), Corticosteroide, Cyclosporin A und Azathioprin (Hanauer, Scon. J. Gostroenterol. 25 (Suppl. 175) 97- 106 (1990); Peppercorn, Annal. Intern. Med. 112 50-60 (1990)). Experimentell wurden anti-CD4 monoklonale Antikörper verwendet, um Colitis ulcerosa erfolgreich zu behandeln (Emmrich et al., Loncet 338 570-571 (1991).
  • Marcusson und Wetterberg (1989), Acta Derm. Venereol., 69(1), 86-8 beschreiben die Verwendung von Peptid T bei der Behandlung von Psoriasis und psoriatischer Arthritis.
  • WO-A-89/12067 beschreibt, dass Peptide, die das Binden von Human Immunodeficiency Virus (HIV) an die Rezeptorstelle einer Zelloberfläche inhibieren, sich als geeignete Mittel zur Behandlung von Psoriasis und neuropsychiatrischen Erkrankungen, einschließlich von Gedächtnisausfall und Gemütserkrankungen, als geeignet erwiesen haben.
  • Die FR-A-2603107 beschreibt Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Dosis eines monoklonalen Antikörpers enthalten, der mit einem oder mehreren neutralisierenden Bereichen von HIV reagiert, oder eine Mehrzahl von blockierenden Peptiden, die dazu fähig sind, die HIV-Infektion zu attenuieren und/oder monoklonale Antikörper, die mit den Epitopen solcher Peptide reagieren, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Zusammensetzungen können zur Behandlung von HIV-Infektion verwendet werden.
  • Die WO-A-92/19257 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von chronischer Müdigkeit, die nicht mit einer HIV-Infektion assoziiert ist. In dem Verfahren wird den Patienten ein pharmazeutisch annehmbarer Träger zusammen mit (1) einer neuropsychiatrisch wirksamen Menge eines linearen Peptids der Formel (1): Ra-Ser-Thr- Thr-Thr-Asn-Tyr-R&sup6; verabreicht, worin Ra Ala, D-Ala oder Cys-Ala- ist, und R&sup6; Thr, Thr-Amid, Thr-Cys oder Thr-Cys-Amid oder ein Derivat des Peptids oder ein physiologisch annehmbares Salz davon ist; oder (2) einer neuropsychiatrisch wirksamen Menge eines linearen Peptids der Formel (II): R¹-R²-R³-R&sup4;-R&sup5;, wori n R¹ X-Y oder Y ist, wenn Y Thr-, Ser-, Asn-, Leu-, Iie- Arg-, Glu- ist und X Cys ist; R² Thr-, Ser- oder Asp ist; R³ Thr, Slr, Asn, Arg, Gln, Lys oder Trp ist; R&sup4; Tyr ist und R&sup5; Z-X oder Z ist, worin Z eine Aminosäure ist und X Cys oder ein Derivat des Peptids oder ein physiologisch annehmbares Salz davon ist; oder (3) einer neuropsychiatrisch wirksamen Menge eines linearen Peptids der Formel (III): Rx-R²-R³-R&sup4;-Rx, worin Rx Ala-R¹, D-Ala-R¹ oder X-Ala-R¹ ist, wori n X, R¹, R², R³, R&sup4; wie oben definiert sind, und Ry Thr, Thr- Amid oder Thr-Cys oder ein Derivat des Peptids oder ein physiologisch annehmbares Salz davon ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung einer Gruppe von Peptiden, die die inflammatorische Antwort bei inflammatorischen Darmerkrankungen lindert. Peptide, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, treten nicht notwendigerweise direkt mit den pathogenen Mechanismen der die Krankheit verursachenden Komponente in Wechselwirkung. Wie es nachstehend im experimentellen Teil beschrieben wird, ist der Mechanismus, wodurch diese Peptide die Symptome dieser Erkrankungen lindern können, von ihrer Fähigkeit zur Modulierung der Produktion und der Wirkung der Cytokine, die durch die aktivierten Zellen des Immunsystems gebildet werden, abhängig. Die Modulation der Cytokine muss nicht auf TNF begrenzt sein, sondern kann auch für den gesamten Bereich der Interleukine gelten, z.B für Interleukin-1 bis Interleukin-10. Die angegebenen Daten sind zur Zeit kein direkter Nachweis, aber ein starkes indirektes Modell dafür. So verwendet das Modell eine der stärksten inflammatorisch wirksamen bekannten Verbindungen, LPS, die sich an Rezeptoren, an Neutrophile, Monozyten und Makrophagen bindet; diese Zellen werden dadurch aktiviert und starten die Produktion von IL-1 und TNF zusammen mit anderen Cytokinen, wodurch die inflammatorisch Kaskade gestartet wird. Ein Parameter, der zur Messung der Wirkung von LPS verwendet wird, ist die Konzentration an Blutglukose, die normalerweise bei der Einwirkung von TNF oder LPS sinkt. Von dem, was aus der Literatur über den Mechanismus von Peptid T auf Zellebene bekannt ist, ist es deshalb sehr überraschend, dass Peptid T und seine Analoge dazu fähig sind, im wesentlichen die negativen Wirkungen von LPS zu verringern. LPS kombiniert normalerweise mit LPSbindenden Proteinen (LBP) und übt seine dramatischen Wirkungen über den CD14-Rezeptor aus. In der neueren Literatur wurden die in dieser Erfindung brauchbaren Peptide nur mit dem CD4-Rezeptor in Verbindung gebracht, von dem nicht angenommen wird, dass er an der primären inflammatorischen Antwort, die mit Cytokinen, wie z. B. TNF, oder LPS verbunden ist, teilnimmt.
  • Wesentlich ist es, dass bestimmte Verbindungen aufgefunden wurden, die zur Behandlung von inflammatorischen Darmerkrankungen geeignet sind, wobei angenommen wird, dass diese Verbindungen in gewisser Weise mit CD4-Rezeptoren der Immunsystemzellen in Wechselwirkung treten. Diese Verbindungen beziehen sich, wie dies vorstehend angegeben wurde, auf Peptid T und seine verschiedenen Derivate. Es wurde ursprünglich angenommen, dass solche Verbindungen keine Wirkung auf das Immunsystem besitzen, und dass sie nur sehr gut geeignet sind, um das Anhaften von HIV-Virus an CD4-Rezeptorzellen zu blockieren (Ruffet al., IV International Conference on AIDS, Stockholm, Juni 1988).
  • Ursprünglich wurden viele der erfindungsgemäß geeigneten Peptide als zur Vorbeugung von Infektionen und zur Replikation von HIV in vitro beschrieben; siehe EP-A-0249390, EP-A-0249394 und WO-A-8809338. Alle Verbindungen, die in diesen Schriften beschrieben werden, sind für die vorliegende Erfindung brauchbar. Das ursprüngliche Peptid hat seinen Basisursprungspunkt im Oktapeptid Ala-Ser-Thr-Thr- Thr-Asn-Tyr-Thr. Es wird Peptid T genannt, weil 50% der Aminosäurereste Threonine sind. Dieses Peptid wurde aus einer Unterregion des menschlichen Immune Deficiency Virus (HIV) außerhalb des Glycoproteinmoelküls gp120 identifiziert, das für die Anbindung an eine Zelle, die das CD4-Molekül trägt, und insbesondere Helfer- Lymphozyten, mikrogliale Zellen im ZNS, Monozyten und dendritische Zellen, verantwortlich ist. Das Anbinden erfolgt über eine spezifische Anbindung von gp120 an das CD4-Molekül. Die Behandlung von mit HIV infizierten Individuen mit diesem Peptid und seinen Derivaten, die nachfolgend beschrieben wird, besitzt deshalb die Wirkung, dass sie die Bindung des gesamten Virus oder des neurotoxischen gp120-Moleküls an den Zellrezeptor CD4 potentiell inhibiert. Auf diese Weise wird die Zelle vor der Infektion geschützt, und so der Virus, der nun nicht dazu fähig ist, zu replizieren, durch die Immunabwehr zerstört.
  • In einem ersten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines linearen oder zyklischen Peptids der Allgemeinen Formel 1:
  • I-A-B-C-D-E-F-G-H-II (Allgemeine Formel 1, SEQ ID NR 1)
  • bereitgestellt, worin
  • A Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
  • B Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
  • C Ser, Thr ist oder fehlt,
  • D Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, Ile, Leu ist oder fehlt,
  • E Ser, Thr, Asp ist oder fehlt,
  • F Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys, Trp ist oder fehlt,
  • G Tyr ist oder fehlt,
  • H Thr, Arg, Gly, Met, Met(O), Cys, Thr, Gly ist oder fehlt, und
  • I Cys ist oder fehlt,
  • II Cys, eine Amidgruppe, eine substituierte Amidgruppe, eine Estergruppe ist oder fehlt, und
  • worin das Peptid die Aminosäuresequenz
  • -Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr- besitzt (SEQ ID NR 3);
  • eine oder mehrere der Aminosäuren durch ein monomeres oder polymeres Kohlehydrat oder Derivat davon substituiert ist, wobei eine solche Substitution durch Hydroxyl- und/oder Amino- und/oder Amidogruppen der Aminosäuren bewirkt wird;
  • oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von inflammatorischen Darmerkrankungen.
  • Jede der in der Allgemeinen Formel 1 angegebenen Aminosäuren kann in der L- oder D-stereoisomeren Konfiguration vorliegen und Kandidaten für H können esterifiziert oder amidiert sein.
  • Es wird angenommen, dass Peptide an beiden Enden der Kernsequenz Thr-Thr-Asn- Tyr-Thr zusätzliche Aminosäurereste besitzen können, von denen einige durch die Allgemeine Formel 2:
  • X-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Y (Allgemeine Formel 2)
  • repräsentiert sind, worin X ein Aminsoäure-terminaler Rest ist, ausgewählt aus Ala und D-Ala, und Y ein Carboxy-terminaler Rest ist, ausgewählt aus Thr und Thr-Amid.
  • Der Ausdruck Peptid T wird in dieser Beschreibung verwendet, um, wenn der Zusammenhang nichts anderes ergibt, Peptide der Allgemeinen Formel 2 anzuzeigen. Es ist deshalb beabsichtigt, dass Peptid T alle Verbindungen der Allgemeinen Formel 2 umfasst, wobei verstanden wird, dass alle diese Verbindungen der Formel 2, von denen angenommen wird, dass alle diese Verbindungen Varianten des normal verstandenen Oktapeptids T sind, sich auch auf den Prototyp Peptid T der besonderen Form D-Ala-Ser- Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-Amid beziehen.
  • Die Erfindung kann sowohl in der klinischen (menschlichen) als auch der Veterinärmedizin geeignet sein. Die Erfindung findet deshalb Anwendung zur Behandlung oder Vorbeugung von entzündlichen Darmerkrankungen durch Verabreichung eines Peptids der Allgemeinen Formel 1 an einen Menschen oder ein Tier, z. B. auf wiederholter Basis. Das Peptid wird im Allgemeinen in einer wirksamen, nicht-toxischen Menge oder in einer solchen Menge verabreicht, die ein annehmbares Gleichgewicht zwischen der Wirksamkeit und der Toxizität der Gifte trifft, wobei die Umstände des Falles zu berücksichtigen sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines linearen oder zyklischen Peptids bereit, das ist:
  • 1. D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-NH&sub2;;
  • 2. Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr (SEQ ID NR 5);
  • 3. D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr;
  • 4. D-Ala-Ala-Ser-Ser-Ser-Asn-Tyr-Met;
  • 5. Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr (SEQ ID NR 6);
  • 6. Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr (SEQ ID NR 7);
  • 7. Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr (SEQ ID NR 8);
  • 8. D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr;
  • 9. D-Ala-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Asn-Tyr-D-Thr-NH&sub2;; oder
  • 10. D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH&sub2;;
  • oder eines Derivates oder Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Darmerkrankungen.
  • Bei dieser Verwendung kann das Peptid insbesondere D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn- Tyr-Thr-NH&sub2; oder ein Derivat oder Salz davon sein.
  • Oft kann es einen Vorteil darstellen, dass die Amino-terminale Aminosäure ein D-Stereoisomer ist, um das Molekül vor einem Abbau durch Aminopeptidasen zu schützen; alternativ oder zusätzlich kann die Carboxy-terminale Aminosäure ein Aminosäureamid sein, um das Molekül vor einem Abbau durch Carboxypeptidasen zu schützen. In diesem Zusammenhang umfassen die vorstehend aufgeführten Verbindungen 5, 6 und 7 Analoge mit D-Thr als Amino-terminalem Rest und/oder ein Amidderivat als Carboxyl-Terminal.
  • Typischerweise ist im Peptid eine der beiden Aminosäuren eine substituierte N- Alkylaminosäure. Geeignete Alkyle umfassen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, z. B. Methyl oder Ethyl. Typischerweise ist im Peptid mindestens eine der Hydroxylgruppen an einem Ser-, Thr- oder Tyr-Rest in einen Ester oder eine Etherverbindung derivatisiert.
  • Irgendein (gegebenenfalls substituierter) Alkylester oder -ether kann gebildet werden, wie z. B. (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, -Aryl oder Aryl (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylester, Ether, Thioester und Thioether, z. B. Phenylester, Benzylether oder Thiophenolethylester. Bevorzugte Ether sind Methyl-, Etbyl- und Propylether, und bevorzugte Ester sind Methyl-, Ethyl- und Propylester.
  • Die Hydroxyl-Seitenketten der Aminosäuren Ser, Thr und/oder Tyr und die Amidogruppen der Amidosäuren Asn und/oder Gln können mit verschiedenen Kohlehydraten oder Kohlehydratderivaten substituiert sein.
  • In einer Ausführungsform ist im Peptid mindestens eine der Aminosäuren mit einem monomeren oder polymeren Kohlehydrat oder einem Derivat davon substituiert, wobei die Substitution(en) über Hydroxyl- und/oder Amino- und/oder Amidogruppen der Aminosäuren bewirkt werden.
  • Lineare Peptide, die erfindungsgemäß geeignet sind, können nach irgendeinem geeigneten Verfahren hergestellt werden, wie z. B. nach einer konventionellen Festphasen-Peptidsynthesetechnik; siehe "Solid Phase Peptide Synthetic Techniques", 2. Ausg., J. M. Stewart, J. D. Young, Pierce Chemical Company, 1844, ISBN: 0-935940-03- 0. Ein häufig verwendetes Festphasenverfahren ist die Merrifield-Technik. Eine andere Möglichkeit sind Lösungsphasentechniken. Das bevorzugte Peptid, der Prototyp Peptid T, ist leicht von Carlbiotech A/S, Copenhagen, Dänemark, erhältlich.
  • Zyklische Peptide, die für die Erfindung geeignet sind, können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z. B. beschrieben bei Y. Hamada in Tetrohedron Letters, 26 5155 (1985). Zyklische Peptide können in Form eine Disulfidbrücke zwischen zwei Cys-Resten und/oder durch Umsetzung des Carboxy-terminalen Aminosäurerests mit dem Amino-terminalen Rest und/durch Umsetzen des Amino-terminalen Rests mit z. B. der -Carboxylgruppe von Glu ausgebildet werden, wenn Glu sich an Position D befindet.
  • Kohlehydratderivate können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Erfindung stellt auch irgendeines der vorstehend genannten Peptide bereit, die mit einem Peptidprotein oder einem anderen geeigneten Träger und/oder Excipienten konjugiert sind.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein lineares oder zyklisches Peptid der Allgemeinen Formel 1 bereit:
  • I-A-B-C-D-E-F-G-H-II (Allgemeine Formel 1, SEQ ID NR 1)
  • worin
  • A Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
  • B Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
  • C Ser, Thr ist oder fehlt,
  • D Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, Ile, Leu ist oder fehlt,
  • E Ser, Thr, Asp ist oder fehlt,
  • F Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys, Trp ist oder fehlt,
  • G Tyr ist oder fehlt,
  • H Thr, Arg, Gly, Met, Met(O), Cys, Thr, Gly ist oder fehlt,
  • I Cys ist oder fehlt,
  • II Cys ist oder fehlt,
  • und worin das Peptid die Aminosäuresequenz
  • -Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr- umfasst (SEQ ID NR 3);
  • eine oder mehrere der Aminosäuren durch ein monomeres oder polymeres Kohlehydrat oder ein Derivat davon substituiert sein können, wobei eine solche Substitution über Hydroxyl und/oder Amino und/oder Amidogruppen der Aminosäuren bewirkt werden kann; mit der Maßgabe, dass das Peptid nicht glycosyliertes Prototyp-Peptid T, Thr-Thr- Asn(GlcNAc)-Tyr-Thr oder Thr(GalNAc)-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr- ist;
  • oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
  • Glycosyliertes Peptid T wird in Urge et al., Biochem. Biophys. Res. Comms. 184 (2) 1125-1132 (1992), veröffentlicht am 30. April 1992, beschrieben, zur erfindungsgemäßen Verwendung findet sich jedoch keine Aussage oder auch nur eine Anregung dazu.
  • Bevorzugte Merkmale dieses erfindungsgemäßen Aspekts sind die gleichen wie für den ersten Aspekt.
  • Peptide, die für die Erfindung geeignet sind, können als Zusammensetzung in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht werden.
  • Auf diese Weise können die Peptide in pharmazeutischen Zusammensetzungen und Zusammensetzungen zur Behandlung und Vorbeugung von inflammatorischen Darmerkrankungen verwendet werden.
  • Die Peptide oder Peptidformulierungen können allein oder in Kombination mit irgendeiner anderen pharmazeutisch wirksamen Verbindung, wie z. B. einem antiinfektiösen Mittel, z. B. einem Antibiotikum und/oder antiviralen Mittel und/oder Antipilzmittel und einer anderen pharmazeutisch wirksamen Verbindung, wie z. B einem anti-neoplastischen Mittel verwendet werden.
  • Die Peptide können oral, bukkal, parenteral, topisch, rektal, vaginal, durch intranasales Inhalationsspray, durch intrapulmonare Inhalation oder auf andere Weise verabreicht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere zur topischen Verwendung, zur Inhalation mittels eines Sprays oder Pulvers, zur Injektion (z.B subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraartikuläre oder intercisternale Injektion), zur Infusion oder zur oralen Verabreichung formuliert sein, und können in Einheitsdosis-Form in Ampullen oder Tabletten oder in Multidosis-Phiolen oder anderen Behältern mit einem zugegebenen Konservierungsmittel vorliegen. Die Zusammensetzungen können die Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen oder Gelen in öligen oder wässrigen Trägern annehmen, und können Formulierungsmittel, wie z. B. Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ kann der wirksame Bestandteil in Pulverform und/oder in lyophilisierter Form zur direkten Verabreichung oder zur Rekonstitution mit einem geeigneten Träger (z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, normaler Kochsalzlösung oder 5%-iger Dextrose) vor der Verwendung vorliegen. Die Peptid(e) enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch andere aktive Wirkstoffe enthalten, wie z. B. antimikrobielle Mittel oder Konservierungsmittel.
  • Die Zusammensetzungen können 0,001 bis 99% (Gew./Vol. oder vorzugsweise Gew./Gew.) des aktiven Materials enthalten. Peptid T, das von Carlbiotech A/S erhältlich ist, wird üblicherweise in einer 5%-igen Dextroselösung in Multidosis- Phiolen formuliert und auf sterile Weise verpackt. Es ist ersichtlich, dass das Peptid auch mit anderen Trägern verpackt werden kann, wie z. B. Kochsalzlösung. Vorzugsweise liegt die Konzentration des Peptids bei jeder Dosierungseinheit in der Größenordnung von 8,5 mg/ml für eine Subkutaninjektion bei einer 1 ml-Dosierung.
  • Die Zusammensetzungen werden in therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Dosen verabreicht, d. h. 0,05 bis 10000 mg Peptid pro Tag, und insbesondere 5 bis 1000 mg pro Tag. Sehr hohe Dosen können verwendet werden, wenn das erfindungsgemäße Peptid nicht toxisch ist. Normalerweise ist dies jedoch nicht erforderlich. Die verabreichte tägliche Dosis hängt natürlich vom Grad der Entzündung und der Antwort darauf ab.
  • Zur Verabreichung der Zusammensetzung durch Injektion oder Infusion liegt die tägliche Dosis, die zur Behandlung von Erwachsenen mit einem Körpergewicht von ca. 70 kg verwendet wird, oft im Bereich von 0,2 mg bis 20 mg aktivem Material, das in Form von 1 bis 4 Dosen über den Tag verteilt verabreicht werden kann, wobei solche Dosisbereiche vom Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten abhängen.
  • Zusammensetzungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, können durch Mischen oder in Kontakt Bringen der Bestandteile auf andere Weise hergestellt werden.
  • Es wird angenommen, dass die wirksamen Ergebnisse bei der Verwendung der vorstehenden Verbindungen, ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, auf den immunosuppressiven Wirkungen dieser Verbindungen in chronisch inflammatorischen Zuständen beruhen.
  • Um eine Richtlinie für die Verabreichung und ein Verständnis für die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide und der Formulierung der Zusammensetzung zu erhalten, werden die folgenden Darstellungen als Richtlinie angegeben, die auf einer ausgedehnten Arbeit basiert, die bereits bei der Verwendung von Peptid T zur Behandlung von HIV-Infektion durchgeführt wurden.
  • Peptid T ist ein Oktapeptid-Homolog einer Region von gp120, eines HIV- Hüllenglycoproteins und eines menschlichen vasoaktiven Intestinalpeptids (VIP). Es wurde ursprünglich von Pert et al. (EP-A-0249394) entwickelt, um die Bindung von gp120 (ein HIV-Hüllenglycoprotein) zu blockieren und so ebenfalls die Bindung von HIV an CD4, den spezifischen Membran-gebundenen lebensfähigen Rezeptor, zu blockieren, wobei die Internalisierung des Virus in die Zelle blockiert wird - ein Verfahren, das zur viralen Replikation notwendig ist. Das zum Eindringen eines HIV in Zellen notwendige CD4-Molekül wurde an der Oberfläche der Lymphozyten, Makrophagen, mikroglialen Zellen, Neuronen und zahlreichen anderen Zellen lokalisiert. Die Bindung von NIV zum CD4-Rezeptor zeigte, dass ein virales Eindringen stattfand; und die Bindung von freiem (nicht viralem) gp120 ergab eine neuronale Toxizität sowohl in vitro- als auch in vivo-Untersuchungen.
  • Die Wirksamkeit von Peptid T zur Umkehr der Anzeichen von HIV-induzierter Demenz wurde sowohl beim Peptid T Phase I-klinischen Versuch an der University of Southern California in Los Angeles als auch im Phase II-klinischen Versuch an der Fenway Clinic in Boston gezeigt. Beide Untersuchungen zeigten Verbesserungen in der HIV-induzierten neurokognitiven Beeinträchtigung bei Patienten mit AIDS.
  • Zur Zeit wurde die Peptid T/gp120/VIP-Homologie verwendet, um mindestens zwei mögliche Mechanismen der Wirkung von Peptid T zu erklären. Erstens, dass es kompetitiv an CD4 (den bekannten Rezeptor für HIV) an menschlichen Zelloberflächen bindet und mit sowohl HIV als auch gp120 um die Bindungsstellen in Wettstreit steht.
  • Das Binden des Peptids T und seiner Analogen der Allgemeinen Formel 1 oder insbesondere der Allgemeinen Formel 2 and CD4 könnte eine blockierende Wirkung hervorrufen, um das Binden anderer Moleküle, die zur Bindung an diesen Rezeptor fähig sind, zu verhindern; alternativ oder zusätzlich könnte das Binden von Peptid T an CD4 eine Reaktion induzieren, die ähnlich der ist, die durch einen endogenen Liganden verursacht wird.
  • CD4 ist das Differentiations-Antigen, das die T-Lyphozyten-Untergruppe von Helfer/Inducer-Zellen definiert, ist aber auch in einer Vielzahl von Zellen vorhanden, die Neuronen, aktivierte Makrophagen und B-Zellen einschließen. CD4 ist der prädominante Rezeptor für HIV und es wurde ursprünglich angenommen, dass er für die Zellinfektion notwendig ist. Unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers OKT4 zeigten Pert et al., (Proc. Notl. Sci., USA, 83 9254-9258 (1986); Pert et al. (Clin. Neurophormocol. 9(4) 598 (1986))die Gegenwart dieses Antigens im menschlichen CNS und zeigten, dass es mit höchster Konzentration im Dentat-Gyrus, Hippocampus, der Amygdala und der tiefen Cortex vorhanden ist. Es wurde gefunden, dass diese Verteilung ähnlich der ist, die bei anderen höheren Säugern gefunden wird. Es wurde gefunden, dass Peptid 4 und andere Analoge die Bindung von radiomarkiertem gp120 an Rattenhippocampus-Membranen inhibieren und zwar in Konzentrationen von 0,1 nM.
  • Unter Verwendung von Peptid T und den gleichen Analogen konnten Pert et al., (Proc. Notl. Sci., USA 83 9254-9258 (1986)); Pert et al. (Clin. Neuropharmacol. 9(4) S198 (1986)) eine Verringerung der bestimmbaren Mengen an HIV-reverser Transciptase zeigen, wenn diese Peptide in einem Assay auf HIV-Infektivität vorhanden waren. Eine neunfache Verringerung der reversen Transcriptase fand bei Konzentrationen an Peptid T von 100 nM statt.
  • Da gp120 nicht in allen isolierten Stämmen von HIV identisch ist, wurde ein Vergleich mit neun verschiedenen HIV-Isolaten durchgeführt; Pert et al (Clin. Neurophormocol. 9(4) 5198 (1986)). Zwischen den untersuchten Isolaten und Peptid T wurde eine signifikante Homologie gefunden, wenn der Vergleich mit den Kernpentapeptiden durchgeführt wurde (Ruffet al., FEBS Lett. 211 17-22 (1987); Brenneman et al., Nature, 335 639-642 (1988); Brenneman et al., Drug Dev. Res. 15 361-369 (1988); Komisaruk et al., Annals of the NY Acod. Sci., 527, 650-654 (1988); Buzy et al., The Lancet 22. July, 226-227 (1989)). Dieser Vergleich wurde nun auf über 20 Isolate ausgedehnt.
  • Die Inhibierung von gp120- und HIV-Bindung an CD4 sowie das Anzeichen einer verringerten Infektivität von HIV in Gegenwart von Peptid T und seinen Analogen stellt einen möglichen Mechanismus der Wirkung zur Erklärung der klinischen Wirkungen von Peptid T dar. In dieser Hinsicht kann Peptid T in ausreichender Konzentration neue Zellinfektionen mit HIV verhindern. Anfängliche Untersuchungen auf diesem Gebiet konzentrierten sich aus zwei Gründen auf das ZNS: eine hohe Konzentration an CD4- Molekülen wurde an Neuronen gefunden, und einer der Haupteffekte der HIV-Infektion ist die Entwicklung neurokognitiver Disfunktionen. Diese Tatsachen sind insbesondere dann wichtig, wenn das Peptid T vom Blut zum Gehirn mittels eines aktiven gesättigten Transportsystems transportiert wird, während es nur durch Diffusion austritt (Barrera et al., Brain Res., Bull. 19 629-633 (1987)).
  • Obwohl es allgemein akzeptiert ist, dass HIV nicht nur Lymphozyten, sondern auch Neuronen infizieren kann, ist es schwierig, die bei HIU-Patienten beobachtete neurologische Disfunktion einer aktiven ZNS-HIV-Infektion zuzuschreiben, weil nur ein kleiner Teil der Neuronen aktiv infiziert ist. Es wurde vorgeschlagen, dass die neurologischen Defizite, die bei einer HIV-Infektion beobachtet werden, nicht nur als Ergebnis einer Infektion auftreten können, sondern auch als Ergebnis eines viralen "Toxins", wie z. B. gp120. Brenneman et al., Nature 335 639-642 (1988)) fanden, dass gereinigtes gp120 aus zwei Isolaten sowie ein rekombinantes gp120 einen beträchtlichen Neuronenzelltod in Kulturen von Mäusefetus-Hippocampusneuronen verursachte. Die Neurotoxizität konnte durch Vorbehandlung mit einem Antikörper gegen CD4 verringert werden und wurde durch VIP vollständig eliminiert. Da Mäuseneuronen mit HIU nicht infiziert werden können, ist es klar, dass die Neurotoxizität gp120- induziert ist, und nicht ein Ergebnis eines viralen Eindringens oder einer Replikation ist.
  • VIP (66, 67, 68, 69: TDNYT) und das Kernpeptid (61-65: TTNYT) teilen die homologe Sequenz, die CD4 bindet, und die ebenfalls in Isolaten des viel größeren gp120 gefunden wird. Peptid T, wenn es im gleichen Mäuschippocampus-neuronalen Kultursystem verwendet wird, antagonisiert die gp120-induzierte Neurotoxizität vollständig, Brenneman et al., Drug Dev. Res. 15 361-369 (1988)). Zusätzlich ruft CSF eines Patienten mit AIDS-Demenz im wesentlichen in diesem System Neurotoxizität hervor (44 bis 49% Abtötung bei einer Verdünnung von 1 : 100000). Diese Wirkung wurde durch das Peptid T inhibiert; Buzy et al., The Lancet, 22. Juli, S. 226-227, (1989)). Normalerweise wird gp120 in einem großen Überschuß, der für eine virale Replikation erforderlich ist, produziert; dieser gp120-Überschuß kann einen neurotoxischen Effekt hervorrufen, der weit außerhalb der Zahl der mikroglialen Zellen oder Neuronen, die mit HIV aktiv infiziert sind, liegt.
  • Das Peptid T kann zusätzlich zu oder sogar in Abwesenheit seiner neuroprotektiven Wirkungen gegen virale Infektionen und Neurotoxizität als Agonist wirken. Eine direkte Agonistaktivität wurde auf zwei Wegen gezeigt. Ruffet al., (FEBS Lett. 211, 17-22 (1987)) zeigten, dass Peptid T und zwei Analoge potente Agonisten von menschlicher Monozyten-Chemotaxis waren. Ihre Rangordnung der Potenz als chemotaktische Mittel entsprach ihrer relativen Fähigkeit, sowohl eine Bindung von gp120 als auch eine HIV-T-Zellen-Infektivität zu inhibieren.
  • Als weiterer Beweis der agonistischen Wirksamkeit des Peptids T zeigten sowohl Peptid T als auch VIP ihre zellularen Wirkungen über die Regulierung der Proteinkinase C: Zorn et al., The Endoc. Society, Abstract (1989)). Die agonistische Wirksamkeit von Peptid T wird so durch die Produktion eines Transmembran-Signals, das die Regulierung der Proteinkinase C beeinflussen kann, impliziert. In sechs individuellen Experimenten als Teil der vorliegenden Erfindung wurde ebenfalls gezeigt, dass Peptid T das Enzym p56lck, eine Tyrosinkinase, gebunden an den zytoplastischen Teil von membrangebundenem CD4, erniedrigen kann, was impliziert, dass die Bindung des Peptids T an das CD4-Molekül ein Transmembran-Signal bilden kann.
  • Ein weiterer Nachweis der potentiellen VIP-ähnlichen agonistischen Wirkung von Peptid T wird durch Ergebnisse aus experimentellen Studien der Hypothese von Komisaruk et al., Annuis of the NY Acdod. Sci. 527 650-654 (1988)) bereitgestellt, wobei von Becken-Nervenenden in das Rückenmark freigesetztes VIP Analgesie hervorrufen kann. Bei Kenntnis, dass Naloxon-unabhängige Analgesie durch Verabreichung von VIP an die periaqueduktale graue Materie in Ratten festgestellt wurde, haben die Forscher VIP direkt in das Rattenrückenmark eingeführt und die Schmerzschwelle zur distalen schädlichen Stimulierung gemessen, um die Hypothese zu testen. Die spinale Verabreichung von VIP rief Analgesie hervor, gemessen durch die latente Schwanzflatter-Antwort und den Schwanzschock-induzierten Vokalisierungstest durch Wirkung bei sowohl durch Opiat als auch durch Nicht-Opiat modulierten Schmerzverläufen; Komisaruk et al., Annols of NY Acad. Sci. 527 650-654 (1988)).
  • Das Vorhandensein eines klinischen Nutzens durch Verabreichung des Peptids T an Menschen wurde in allen bisherigen Untersuchungen vermutet: Bei der HIV-Erkrankung, bei der schwedischen Pilotuntersuchung, in den USC Phase I- und den Fenway/CRI- Untersuchungen und im Toronto Western Hospital Compassionate Use Program, das 51 Patienten umfasste; bei Psoriasis und anderen medizinischen Zuständen, bei Fallstudien aus Schweden (Marcussion, Lazega et al., 1989-9 und Marcusson und Wetterberg, 189-10) und bei 8 Patienten mit Psoriasis und anderen Zuständen in Toronto.
  • Die bei HIV-positiven Patienten gefundene neurokognitive Verbesserung und Verbesserung in den konstitutionellen Symptomen sowohl bei HIV-positiven als auch HIV-negativen Patienten kann leicht in erster Linie von den VIP-ähnlichen neurotrophischen und agonistischen Wirkungen des Peptids T abhängen, sowie von den nachstehend diskutierten antiinflammatorischen und Anti-TNF-Wirkungen.
  • Peptid T scheint als Agonist und als Blocker von CD4-vermittelter Immunfunktion eher als antivirales Mittel zu wirken.
  • Ohne auf eine bestimmte Theorie im Hinblick auf die Verwendung der Peptide zur Behandlung von Symptomen und Erkrankungen, die mit einer chronischen Immunaktivierung verbunden sind, gebunden sein zu wollen und im Hinblick auf die vorstehend angegebenen Richtlinien und Erörterungen im Zusammenhang mit der Verwendung verschiedener Peptide der allgemeinen Formel 2 und ihren Analogen bei der Behandlung von HIV, wird angenommen, dass eine immunomodulatorische Wirkung der Peptid T-Bindung an CD4 existiert. Eine solche Wirkung wird in den nachstehenden Beispielen gezeigt, in denen gefunden wurde, dass Peptid T eine Mitogen-induzierte Proliferation peripherer mononuklearer Blutzellen (PBMC) bei picomolaren und niedrigeren Konzentrationen induziert. Es wurde gefunden, dass Peptid T es ermöglicht, PBMC als Antwort auf Mitogen zu proliferieren, aber in einem geringeren Ausmaß im Vergleich zum Wachstum von PBMC bei seiner Abwesenheit. Eine Präinkubierung von PBMC mit Peptid T für weniger als 30 Minuten hatte keine Wirkung auf die Mitogen-Stimulierung. Ein Aussetzen von PBMC gegenüber Peptid T während 2 Stunden und nachfolgendes Waschen der Zellen vor dem Aussetzen gegenüber dem Mitogen ergab eine Inhibierung der Ptoliferation ähnlich zu der, die festgestellt wurde, wenn Zellen in Gegenwart von sowohl Peptid T und Mitogen inkubiert werden. Es wurde gefunden, dass Peptid T das in Abwesenheit von Mitogen kultivierte Wachstum von PBMC nicht wesentlich beeinträchtigte. Es wird deshalb angenommen, dass Peptid T dazu fähig ist, die normale proliferative Antwort von PBMC gegenüber nicht-CD4-assoziierten Proliferationssignalen zu unterdrücken.
  • Nachdem nun die Wirksamkeit der Peptide der allgemeinen Formel 1 und insbesondere der der allgemeinen Formel 2 zur Behandlung von Symptomen und Erkrankungen, die mit chronischen Immunaktivierungen oder chronischen Entzündungen verbunden sind, entdeckt wurde, wird folgendes als Hypothese für den Mechanismus der Wirkung von Peptid T vorgeschlagen, und somit, warum die erfindungsgemäß Verbindungen wirksam sind.
  • Peptid T bindet an CD4. In den folgenden Tests wurde festgestellt, dass Peptid T Mitogen- und MLR-induzierte Lymphozytenproliferation inhibiert. Es wird deshalb angenommen, dass Peptid T als immunomodulatorisches Mittel dienen kann, das die verstärkte Immunantwort, die bei einem chronischen Vorhandensein eines Antigens oder aus anderen Gründen auftritt, abschwächt, und damit die chronische Entzündung verringert.
  • Gemäß verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen und im Hinblick auf die vorstehend genannten Richtlinien, die aus der Verwendung der Peptide der allgemeinen Formel 1 erhalten wurden, insbesondere aus denen der allgemeinen Formel 2 bei der Behandlung von HIV, können ähnliche Dosen an Peptid T und seinen Analogen an Menschen oder andere Tiere zum Zwecke der Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen verabreicht werden.
  • Die Erfindung wird nun durch die nachstehenden nicht einschränkenden Beispiele erläutert. Die Beispiele beziehen sich auf die anliegenden Zeichnungen, in denen bedeuten:
  • Fig. 1 wird in Beispiel 1 beschrieben und zeigt die Wirkung von Peptid T auf die TNF-induzierte Gewebsfaktor-Expression an menschlichen umbilikalen endotheliellen Blutgefäßzellen.
  • Fig. 2a, 2b und 2c beziehen sich auf das Beispiel 8 und zeigen, dass Peptid T dazu fähig ist, die Lymphoproliferation als Antwort auf Mitogene zu inhibieren. 10&sup5; PBMC wurden in Gegenwart von PWM (2a), Con A (2b) oder PHA (2c) mit den folgenden Peptid T-Verdünnungen kultiviert: A: kein Peptid T; B: 10&supmin;&sup5; M; C: 10&supmin;&sup7; M; D: 10&supmin;&sup9; M; E: 10&supmin;¹¹ M; F: 10&supmin;¹³ M; G: 10&supmin;¹&sup5; M; H: 10&supmin;¹&sup7; M. Die Kulturen wurden 5 Tage lang inkubiert, mit ³H-Thymidin gepulst und die Menge der eingebauten Radioaktivität, wie im Beispiel 17 beschrieben, in den Proliferationsindex überführt. Ein Sternchen (*) zeigt die Differenz in der Proliferation an; z ist statistisch bedeutungslos (p > 0,05).
  • Fig. 3 betrifft das Beispiel 8 und zeigt, dass Con A-induzierte Lymphozytenproliferation in Gegenwart von Peptid T parallel verläuft, aber mit verringerter Wachstumsrate in Abwesenheit von Con A. 10&sup5; PBMC wurden in Gegenwart von Con A 8 Tage lang kultiviert. Die Kulturen wurden gepulst und täglich geerntet und der Grad der Lymphoproliferation als Zählungen pro Minuten (CPM) von eingebautem ³H-Thymidin ausgedrückt. Peptid T (PT, 10&supmin;&sup9; M) wurde gleichzeitig mit Con A zugegeben.
  • Fig. 4 bezieht sich auf das Beispiel 9. In Gegenwart von nicht-mitogenen Stimulationen, wie z. B. wachgerufenen Antigenen (Masern-, Mumps-, Rubella-Vaccine: MMR), Superantigenen, wie z. B. Staphylococcal Enterotoxinen SEB und TSST-1 und Antikörpern gegenüber CD3 (Anti-CD3) proliferiert PBMC wie angegeben mit einem Proliferationsindex von mehr als 1 (-Peptid T). Die Gegenwart von Peptid T (+peptid T), die am ersten Tag dieser 6 Tage-Kultur zugegeben wurde, zeigte keine Wirkung auf das Wachstum von PBMC als Antwort auf diese Stimulantien.
  • Fig. 5 betrifft ebenfalls Beispiel 9. Wenn PBMC von einer Person (A) in Gegenwart von PBMC einer anderen Person (B) kultiviert werden, proliferieren sie [(A+B(P-PT)] als Ergebnis der Erkennung der fremden Antigene (Alloantigene) an der Zelloberfläche. In Gegenwart von Peptid T [A+B(+PT)] sind alloresponsive Zellen immer noch zur Proliferation fähig.
  • Fig. 6 bezieht sich ebenfalls auf das Beispiel 9. Molt-4 ist eine spontan wachsende menschliche maligne. T-Zellenlinie. In Gegenwart von PBMC wird das Wachstum aufgrund der Abtötung von Molt-4 durch PBMC (PBMC/Molt-4-PT) inhibiert. In Gegenwart von am ersten Tag einer 4 Tage-Kultur zugegebenem Peptid T verblieb eine PBMCvermittelte Abtötung von Molt-4 unverändert (PBMC/Molt-4+PT).
  • Fig. 7 betrifft Beispiel 10, in dem die Sequenz der Stufen angegeben ist, die in diesem Cytotoxizitäts-Assay verwendet werden. Aktivierte Makrophagen sind dazu fähig, K562-Zielzellen in Abwesenheit von Peptid T (kein PT) abzutöten. Wenn Peptid T zu makrophagen Kulturen gleichzeitig mit den Aktivatoren (Ptstepl) zugegeben wird, ist es nicht dazu fähig, eine Cytotoxizität zu bewirken. Wenn Peptid T zu aktivierten makrophagen Kulturen gleichzeitig mit den Zielzellen (PTstep2) zugegeben wird, wird die Cytotoxizität inhibiert. Eine Veränderung des Timings der Zugabe von Peptid T verändert die Peptid T-vermittelte Inhibierung der Makrophagen-vermittelten Cytotoxizität nicht.
  • Fig. 8, die ebenfalls das Beispiel 10 betrifft, zeigt, dass der Überstand der makrophagen Kulturen, die mit LPS stimuliert sind, cytolytische Substanzen enthalten, die dazu fähig sind, K562-Zielzellen abzutöten. Zielzellen werden mit intrazellularer Radioaktivität markiert, die beim Zelltod freigesetzt wird. Mehr Radioaktivitäts- Freisetzung (gemessen als Zählungen pro Minute, cpm) zeigt eine größere Abtötung). In Abwesenheit von Peptid T (A) trat mehr Abtötung auf als in seiner Gegenwart (B bis F). Wenn die Konzentrationen von Peptid T unter eine cytolytische Aktivität von 1 · 10&supmin;&sup5; M abfiel, kehrte der Grad der Cytotoxizität zu den Werten der Kontrolle (A) zurück. Die Peptid T-Konzentrationen waren die folgenden:
  • A: kein Peptid T
  • B: Pepti d T, 10&supmin;&sup5; M
  • C: Pepti d T, 10&supmin;&sup7; M
  • D: Pepti d T, 10&supmin;&sup9; M
  • E: Pepti d T, 10&supmin;¹¹ M
  • F: Pepti d T, 10&supmin;¹³ M
  • G: Pepti d T, 10&supmin;¹&sup5; M
  • Fig. 9 wird in Beispiel 11 behandelt und zeigt, dass das Peptid T eine ähnliche Wirkung gegenüber Anti-TNF bei der Inhibierung der Wirkungen von TNF besitzt.
  • Fig. 10 wird in Beispiel 12 behandelt und zeigt, dass das Peptid T Serum TNF- Spiegel in HIV-Patienten herabsetzt.
  • Fig. 11 wird in Beispiel 14 behandelt und zeigt, dass Peptid T-Analog 623 das Überleben von sensibilisierten Mäusen, denen eine letale Dosis von LPS verabreicht wurde, verlängert.
  • Fig. 12 wird in Beispiel 15 behandelt und zeigt, dass Peptid T die Aktivierung menschlicher Neutrophiler durch TNF inhibiert.
  • Fig. 13 wird ebenfalls in Beispiel 15 beschrieben und zeigt, dass das Peptid T-Analoge 505 das TNF-Primen und die Aktivierung menschlicher Neutrophile inhibiert.
  • Fig. 14 wird ebenfalls in Beispiel 15 beschrieben und zeigt, dass das Peptid T-Analoge 505 die LPS-Aktivierung menschlicher Neutrophiler inhibiert.
  • Fig. 15 wird im Beispiel 17 beschrieben und zeigt, dass Peptid T die TNFinduzierte Expression von Gewebsfaktor in HUVECs verringert.
    • BEISPIEL 1 - LPS-INDUZIERTE ENTZÜNDUNG
  • Normalen balb/c-Mäusen (weiblich, 12 Wochen) wurde LPS (250 ug, E. coli K-235, Sigma Kat.-Nr. L-2018) zur Zeit 0 verabreicht. Eine Gruppe der Mäuse (50 Tiere) wurde dann in 30-minütigen Intervallen durch i.p.-Injektionen von Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma Kat.-Nr. 6793), gelöst in pyrogenfreiem sterilem isotonischem Wasser (2,5 mg BSA pro Tier pro Injektion, wobei jede Injektion 100 pl enthielt) behandelt.
  • Die zweite Gruppe der Mäuse (50 Tiere) wurde in 30-minütigen Intervallen durch i.p.-Injektionen von Peptid T (Carlbiotech A/S Batch 190401), gelöst in pyrogenfreiem sterilem isotonischem Wasser (2,5 mg Peptid T pro Tier pro Injektion, wobei jede Injektion 100 ul entsprach) behandelt.
  • An Blutproben wurden nach 3 Stunden die Glucosespiegel bestimmt. Subjektive Parameter, wie die Sekretion aus dem Auge, Diarrhöe und allgemeines Wohlbefinden wurden auf einer Skala von (-) bis (+++) angegeben.
  • Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ist die Differenz der Glucosespiegel zwischen Peptid T-behandelten Tieren und BSA (Placebo)-behandelten Tieren beträchtlich. Die subjektiven Parameter Weise n ebenfalls auf einen im allgemeinen wesentlich höheren Index an Wohlbefinden der mit Peptid T behandelten Tiere hin. TABELLE I
  • t-Test = 98
  • p < 0,001 für Peptid T-behandelte Gruppen vs. Kontrollgruppe (BSA-behandelte Gruppe)
    • BEISPIEL 2 - PEPTIO T-ANTAGONISIERENDES TNF
  • Die Stimulierung von Endothelzellen mit TNF ergibt eine Induktion einer prokoagulierenden Aktivität durch die Expression einer Gewebefaktoraktivität und einer gleichzeitigen Reduktion des antikoagulierenden Potentials von Zellen durch die verringerte Expression von Thrombomodulin (Bevilacqua et al., Nawroth und Stern, J. Exp. Med. 163 740 (1986)). Der septische Schock wird häufig von disseminierter intravasculärer Koagulation (DIC, Semeraro Acta Clinica Belgica 31 377 (1976)) begleitet, und es gibt einen starken Hinweis darauf, dass der Gewebefaktor ein wesentliches Erfordernis für DIC ist, um durch Endotoxin (LPS) induziert zu werden. Ein monoklonaler Antikörper gegen Gewebefaktor zeigte eine Inhibierung von durch die Verabreichung eines Endotoxins induziertem DIC (Warr et al., Blood 75 1481 (1990)).
  • Menschliche umbilikale Blutgefäß-Endothelzellen wurden in M199-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, endothelem Zellwachstumsfaktor, Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin in Schalen mit 96 Vertiefungen unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Bevilaqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 4533 (1986)) kultiviert. Die TNF-Behandlung der Kulturen (100 Einheiten. ml) betrug 4 Stunden bei 37ºC in Gegenwart des Wachstumsmediums, und danach wurden die Zellen gewaschen und fixiert. Die Kulturen wurden auch mit Peptid T + TNF oder Peptid T allein behandelt. In diesen Kulturen lag die Konzentration an Peptid T im Bereich von 0,5 bis 100 gg/ml. Gewebefaktor-Expression durch die mit TNF behandelten Endothelialzellen mit oder ohne Peptid T wurde an einem ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers bestimmt, der die Aktivität von menschlichem Gewebefaktor (Carbiochem A/S) neutralisiert. Gebundener Antigewebefaktor-Antikörper wurde unter Verwendung der Oxidase-konjugierten Kaninchen Anti-Maus Ig und dem Substrat ABST bestimmt. Die Farbintensität wurde durch die optische Dichte jeder Vertiefung bei 405 nm bestimmt.
  • Die aus Dreifachkulturen erhaltenen Daten zeigten, dass Peptid T die Expression des Gewebefaktors an durch 100 Einheiten/ml menschlichem rekombinantem TNF stimulierten Endothelialzellen inhibierte, und sind in Fig. 1 angegeben.
    • BEISPIEL 3 - PEPTID T VERANLASST LPS-INDUZIERTE STERBLICHKEIT
  • Mäuse, die Meth A-Ascitestumore trugen, wurden 100 mg LPS subkutan entweder mit Rinderserum Albumin (BSA) oder mit Peptid T-Analog (504 oder 505, 1 mg) verabreicht. Die Zahl der Tiere, die Anzeichen von LPS-Toxizität (Diarrhöe, Exudat aus den Augen und einen allgemeinen Aktivitätszustand zeigten, wurden in jeder Gruppe 19, 24 und 41 Stunden nach Injektion bestimmt. Nach Vervollständigung des Experiments wurde die Zahl der überlebenden Tiere bestimmt (siehe die nachstehende Tabelle II) und die überlebenden zur späteren Bestimmung von TNF IL-1, IL-6 und RNI-Gehalten ausgeblutet.
  • Die Sequenz des wirksamsten Analogs (505) ist:
  • H-D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH&sub2;
  • und die Sequenz des 504 ist:
  • H-D-Ala-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Asn-Tyr-D-Thr-NH&sub2;. TABELLE II
  • Die Beispiele 4 bis 7 zeigen die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Peptide in Bezug auf verschiedene Symptome, die mit chronische Entzündung verbunden sind.
    • BEISPIEL 4 - INHIBIERUNG VON MITOGEN-INDUZIERTER PROLIFERATION VON PBMC
  • PBMC (105) wurden in 200 ul RPMI, das 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Gentamycin 100 ug/ml enthielt, kultiviert und Mitogen und Peptid T wurden am ersten Tag der Kultur zugegeben. Das Wachstum wurde dreifach durch ³H-Thymidin-Aufnahme nach dem 6. Tag der Inkubierung bewertet und als Proliferationsindex ausgedrückt (cpm in Gegenwart von Mitogen ± Peptid T + cpm in Abwesenheit von Stimulierung). Ein Proliferationsindex > 1,000 zeigt ein Wachstum an, das unterhalb desjenigen des Mediums allein ist. Bei physiologisch erhältlichen Konzentrationen inhibiert Peptid T die Proliferation von normalen (HIV-seronegativen) peripheren Blut mononuklearen Zellen (PBMC) ohne eine signifikante Cytotoxizität, wie in Tabelle 3 angegeben, zu verursachen. Diese Wirkung ist insofern langzeitig, weil das am ersten Tag einer 6-tägigen Kultur zugegebene Peptid T die Mitogen-induzierte Proliferation inhibiert. Tabelle III
  • 1. SD- Standardabweichung
  • 2. Konzentration von Peptid T in Mol/l
  • 3. Wachstum in Abwesenheit von Mitogenen
  • 4. Pokeweed-Mitogen (PWM), Concanavalin A (Con A) und Phytohemagglutinin (PHA) wurden mit 25 ug/ml verwendet
  • 5. ND - nicht durchgeführt
    • BEISPIEL 5 - INNIBIERUNG VON MLR
  • Unter Verwendung von 10&sup5; allogenem PBMC (cpm von A = 142 ± 86, B = 148 ± 84) wurde eine Zweiwege-MLR in Cokultur in 200 ul Medium, wie in Tabelle 3 beschrieben, durchgeführt.
  • Das am ersten Tag einer MLR zugegebene Peptid T inhibiert die Allogeninduzierte Proliferation von PBMC (Tabelle IV).
    • TABELLE IV Inhibierung von MLR Peptid T¹ cpm ± SD²
  • 0 1365 ± 335
  • 10&supmin;&sup5; 649 ± 263
  • 10&supmin;&sup7; 534 ±77
  • 10&supmin;&sup9; 764 ± 77
  • 10&supmin;¹¹ 681 ± 222
  • 10&supmin;¹³ 235 ± 4
  • 10&supmin;¹&sup5; ± 117
  • 10&supmin;¹&sup7; 672 ± 261
  • 1. Konzentration von Peptid T in Mol/l
  • 2. Zählungen pro Minute ± Standardabweichung
    • BEISPIEL 6 - WIRKUNG VON PEPTID T AUF DIE AKTIVITÄT VON p56lck IN PBL-BLASTEN
  • PBL (periphere Blutleukozyten)-Blasten wurden hergestellt durch Inkubieren von PBMC bei 37ºC mit PHA (10 mg/l) in RPMI + 10% FBS während 48 Stunden und nachfolgender Zugabe von Interleukin-2 und Inkubieren während weiterer 96 Stunden. Die Zellen wurden IL-2-frei gewaschen und 24 Stunden inkubiert, dann FBS-frei gewaschen und 24 Stunden lang inkubiert. Zurückbleibende PBL-Blasten wurden entweder stimuliert oder mit OKT4A (Anti-CD4) mit 10 ug/ml 1 Stunde lang behandelt, und danach mit Ratten Anti-Mäuse-Ig mit 5 ug/ml während 5 Minuten, um die Lck-Aktivität zu erhöhen. PBL-Blasten wurden mit Peptid T (10&supmin;&sup9; M) 2 Stunden lang vorbehandelt, dann ausgiebig vor einer Anti-CD4-Stimulierung gewaschen. Nachfolgende Immunopräzipitation mit Anti-lck-Protein-A-Konjugaten und Inkubierung (37ºC, 10 Minuten) mit ³²P-ATP, wurde durch Autoradiographie die p56lck-Autophosphorylierung bestimmt und als Maß für die p56lck-Aktivität verwendet.
  • Das Peptid T inhibiert die PHA-induzierte Aktivierung und die Anti-CD4- abhängige Erhöhung der p56lck-Aktivität, wie wir dies durch einen lck-spezifischen Tyrosinkinase-Assay (Tabelle V) bestimmt haben. p56lck ist eine CD4-assoziierte Tyrosinkinase, die bei der T-Zellenaktivierung und Transmembran-Signalisierung eine Rolle spielt (Janeway C. A., Ann. Rev. Immunol. 10 645-674 (1992)). Anstelle eines T- Zellenrezeptor-assoziierten Signals inhibiert die Vernetzung von CD4 durch monoklonalen Anti-CD4 die T-Zellenaktivierung (Burgess et al., Eur. J. Immunol. 21 1663-1668 (1991)), möglicherweise durch Aktivierung von p56lck, die die Autophosphorylierung des inhibitorischen Tyr 505 (Abraham et al., Nature 350 62-66 (1991); Abraham et al., Cancer Invest. 9 455-463 (1991)) einschließt. Peptid ist dazu fähig, die p56lck-Aktivierung (Tabelle V) zu inhibieren, wodurch das gleiche Ergebnis wie mit Anti-CD4 (Inhibierung der T-Zellenaktivierung) erreicht wird, allerdings nach einem verschiedenen Mechanismus. TABELLE V
  • 1 - P. T. bedeutet Peptid T
  • 2 - ++++ hochaktiv
  • + gering aktiv
  • Es ist bekannt, dass Anti-CD4-Antikörper eine Mitogen-induzierte sowie eine Antigen-induzierte in vitro-Proliferation von PBMC, Lymphokin-Freisetzung, T- Helferfunktion und MLR inhibieren (Bank et al., J. Exp. Med. 162 1294-1303 (1985)). Es gibt zwei mögliche Mechanismen der Anti-CD4-Inhibierung der T-Zellenfunktion.
  • 1. Anti-CD4-Antikörper verursachen eine sterische Hinderung der CD4/MHC II- Wechselwirkung, die während der T-Zellenaktivierung auftritt. Peptid C würde wahrscheinlich diesen Effekt nicht teilen, da es sich einer Sequenz von gp120 ableitet, von der bekannt ist, dass sie an CD4 bindet, und die Bindungsstelle von gp120 am CD4-Molekül von der MHC II-Bindungsstelle entfernt ist (Fleury et al. (1991)).
  • 2. Vernetzung von CD4 durch mehrwertige Anti-CD4-Antikörper anstelle einer TcR/CD3-Stimulierung sendet ein negatives Signal an die T-Zelle ab (Bank et al., J. Exp. Med. 162 1294-1303 (1985)). Peptid T ist einwertig, und kann deshalb CD4-Rezeptoren nicht vernetzen; sein Mechanismus der Inhibierung der T- Zellenaktivierung muss deshalb verschieden sein von dem von Anti-CD4. Die Behandlung von inflammatorischen Zuständen mit Mäuse-Anti-CD4 hat eine Anzahl von unerwünschten Nebenwirkungen ergeben, einschließlich von Urticaria, Schüttelfrost, Fieber und Zittern, die gelegentlich eine medizinische Maßnahme erfordern. Zusätzlich wurde nach Verabreichung von Anti-CD4 eine Verringerung in der CD4-Zellzahl berichtet, eine Verringerung in der Proliferation von Mitogenen und Antigenen und eine Verringerung von verzögerten Hypersensitivitäts-Reaktionen, die ein Maß für eine zellvermittelte Immunfunktion sind (Norneffet al., Cytokine 3 266-267 (1991); Horneffet al., Arth. Rheum. 34 129-140 (1991): Wofsey et al., Semin. Immuno. 2 419-425 (1990)). Die Verabreichung von Anti-CD4 gleichzeitig mit Antigen kann sowohl primäre und sekundäre Immunantworten inhibieren (Waldor N. K., Immunol. Ser. 45 573-586 (1990)). Zusätzlich ist die Verwendung von xenogenen (nichtmenschlichen) Proteinen als therapeutische Mittel aufgrund der potentiellen Bildung von Antikörpern, die gegen das Fremdprotein gerichtet sind, und Schock- und Typ III-Hypersensitivitätsreaktionen bei einer wiederholten Verabreichung hervorrufen können, eingeschränkt.
    • BEISPIEL 7 - WIRKUNG VON PEPTID T AUF ANTIGEN-INDUZIERTE PBMC-PROLIFERATION
  • PBMC wurde wie im Zusammenhang mit Tabelle III im Beispiel 4 beschrieben, in Gegenwart von lebenden, attenuierten Masern-, Mumps- und Rubella-Vaccine (Merck Sharp und Dohme, Kanada) bei einer Endverdünnung von 1 : 20 inkubiert. Peptid T wurde entweder am Tag 1 der Inkubierung oder täglich zugegeben. Die Ergebnisse sind als Proliferationsindex ± Standardabweichung angegeben. TABELLE VI
  • Obwohl Peptid T die Antigen-induzierte Proliferation von PBMC inhibieren kann, wenn es in vitro täglich verabreicht wird, nehmen wir nicht an, dass dies irgendeinen signifikanten Effekt auf die normale Immunantwort besitzt, wenn die Verabreichung in vivo erfolgt (wie von Goodman et al., V. International Conf. Aids, Montreal, Juli 1989, Abstract #WBP286, demonstriert). Es gibt zwei mögliche Erklärungen dafür, die sich nicht gegenseitig ausschließen.
  • 1. Erstens, Makrophagen können gegenüber Peptid T sensitiver sein als T-Zellen, weil T-Zellen viel mehr potentielle Aktivierungssignale als die CD4-MHC II- Wechselwirkung empfangen. Makrophagen können deshalb durch die Verabreichung von Peptid T am ersten Tag in in vitro-Kultur verringert werden, was ihre Fähigkeit, Mitogene und Antigene gegenüber T-Zellen zu präsentieren, inhibiert. B-Zellen können als APC anstelle von Makrophagen wirken, wenn sie ein Antigen präsentieren, aber nicht, wenn sie Mitogene präsentieren, die Antigen-nichtspezifisch sind (was die Ergebnisse der Tabelle III erklärt). Ruhende B-Zellen sind gegenüber Peptid T resistent, weil sie CD4-negativ sind. In Gegenwart einer einzigen Dosis von Peptid T können sie antigen gegenüber T-Zellen präsentieren, wodurch eine Proliferation von PBMC als Antwort auf das Antigen möglich wird. Wenn Peptid T auf täglicher Basis in kultivierten T-Zellen abgegeben wird, die weniger empfindlich gegenüber den Effekten von Peptid T sind, dann können Makrophagen inhibiert werden. Dies würde die in Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse erklären. Eine tägliche Verabreichung von Peptid T in vivo kann nicht so funktionieren, wie dies bei einer täglichen Verabreichung in vitro der Fall ist, da das Halbwertsleben von Peptid T in vivo kürzer als in vitro ist. In vitro sind Serumsupplemente hitzeinaktiviert, um proteolytische Enzyme zu zerstören, die Peptid T in vivo aktiv abbauen. Eine tägliche Verabreichung von Peptid T in vivo würde deshalb eine Inhibierung der Makrophagenaktivität ergeben, aber nicht der T-Zellenaktivität und würde die kontinuierliche Expression von durch Immunantworten verursachtem Antigen ermöglichen. Dies würde die Wirksamkeit von Peptid T bei chronisch entzündlichen Zuständen, wie z. B. rheumatoider Arthritis (siehe nachstehend) erklären, bei denen die charakteristische inflammatorische Zelle der Makrophag ist. Eine akute Entzündung ist durch neutrophile (CD4-negative) Infiltrate charakterisiert und würde durch Peptid T-Verabreichung nicht beeinträchtigt werden. Das Erfordernis für eine Antigen-Präsentation (Phagocytose, Abbau und Präsentation) in einer Antigen-verursachten Immunantwort ergibt eine Verzögerung im T-Zellensignal. Ein am ersten Tag in einer in vitro-Kultur vorhandenes Peptid C wird deshalb ein T-Zellensignal an nachfolgenden Tagen nicht beeinträchtigen. Mitogen-Stimulierung von PBMC-Proliferation (Tabelle III) ist eine Zwischenstufe, die keine Antigen-Verarbeitung erfordert und auf Langzeitbasis durch konkurrierende Peptid-T-Verabreichung inhibiert werden kann. Peptid T muss nicht gleichzeitig mit einem aktivierenden Signal vorhanden sein, um seine immundepressiven Wirkungen zu manifestieren. Während einer chronischen Entzündung oder Immunaktivierung werden alle ansprechenden Zellen zu jeder Zeit Proliferationssignale erhalten. Eine tägliche Peptid T-Verabreichung in vivo inhibiert eine chronische Immunaktivierung. Da die Halbwertszeit von Peptid T < 1 Stunde ist (Ruffet al., Prog. Neuro-Psychopharmocol. & Biol. Psychiat., Bd. 15, S. 791-801 (1991)), werden solche Proliferationssignale, die während der ersten Stunde nach Peptid T- Verabreichung aktiv sind, inhibiert. Da alle Zellen, die auf chronische Aktivierungssignale ansprechen, zu jeder Zeit ansprechen, werden sie während dieses Zeitraums von 1 Stunde verringet und verbleiben während eines längeren Zeitraums verringert. Aufgrund des diskreten Timings der Antigenpräsentation und der Tatsache, dass nicht alle Epitope des Antigens gleichzeitig vorhanden sind (und deshalb nicht alle T-Zellen, die zur Antwort fähig sind, gleichzeitig aktiviert werden), existieren 23 Stunden vor der nächsten Injektion von Peptid T, in denen Antigen-spezifische Immunantworten auftreten werden. Obwohl einige Antigen-spezifische Immunantworten während der 30 Minuten nach Peptid T-Verabreichung inhibiert werden können, wird die Mehrzahl, die zu diskreten Zeiten auftritt, weiter fortbestehen. In dieser Form ist Peptid T dazu fähig, eine chronische Immunaktivierung und Entzündung zu inhibieren, während es die Expression von Antigen-spezifischen Immunantworten ermöglicht.
  • Peptid T scheint als antiinflammatorisches Mittel zu wirken. Peptid T würde deshalb eine neues nicht-steroidales antiinflammatorisches Mittel (NSAIO) sein. Traditionelle NSAIDs, wie z.B Aspirin und Ibuprofen, haben zwei potentielle Wirkmechanismen: Inhibierung von Cyclooxygenase, die die Prostaglandin-Produktion verringert, und die Inhibierung der neutrophilen Funktion (Altman R. D. Arth. Rheum. 19 (Suppl. 2) 1-5, (1990); Vane et al., Postgrod. Med. J. 66 (Suppl. 4) 52-S17 (1990)). Es wurde berichtet, dass die Inhibierung von Cyclooxygenase eine durch Mitogen verursachte PBMC-Proliferation erhöht (und nicht unterdrückt) (Vane et all, Int. J. Immunophormocol. 5 107-114 (19983)) und Neutrophile (CD4-negativ) gegenüber Peptid T resistent sein würden; Peptid T kann deshalb einen unikalen Mechanismus einer antiinflammatorischen Wirkung aufweisen.
  • Das antiinflammatorische Azathioprin inhibiert die Lymphozytenproliferation, indem sie die DNA- und RNA-Synthese inhibiert. Die Proliferation von B- und T- Lymphozyten wird durch die Wirkung von Azathioprin inhibiert (Briggs J. D., Immunol. Lett. 29 89-94 (1991)). Da B-Zellen die CD4-negativ sind und als APC in Gegenwart des Peptids T (siehe vorstehend) wirken können, muss Peptid T einen Wirkungsmechanismus aufweisen, der von dem von Azathioprin verschieden ist.
  • Cyclosporin ist ein antiinflammatorisches Arzneimittel, das die Lymphozytenproliferation durch Inhibierung von IL-2 und IFN -Gentranskription durch Binden an das und Inaktivieren des Cyclophilins, einer Isomerase, die zur Signaltransduktion erforderlich ist, inhibiert (Halloran et al., Clin. Biochem. 24 3- 7 (1991)). Obwohl Peptid T auch die Signaltransduktion (Tabelle 3) beeinträchtigen kann, hat es nicht die schweren Nebenwirkungen, die mit der Cyclosporin-Therapie verbunden sind. Cyclosporin-induzierte Nebenwirkungen umfassen Nierentubulus-Atrophie, Nephrotoxizität, Hypertension, Hirsutismus, gingivale Hypertrophie, Zittern, Krämpfe und Parästhesie (Briggs J. D., Immunol. Lett. 29 89-93 (1991)). Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass keine signifikanten Nebenwirkungen der Peptid T-Therapie zuzuordnen sind.
    • BEISPIEL 8 - PEPTID T INHIBIERT MITOGEN-INDUZIERTE LYMPHOPROLIFERATION
  • Concavalin A (Con A), Pokeweed-Mitogen, (PWM) und Phytohämagglutin-P (PHA-P) wurden von Sigma Chemical Co. (St., Louis, MO, USA). Peptid T wurde von Carlbiotech Ltd. (Kopenhagen, Dänemark) synthetisiert und als Chloridsalz mit 8,5 mg/ml in 0,9% Benzylalkohol als Konservierungsmittel geliefert und bei 4ºC gelagert. Peptid T wurde zu Arbeitslösungen für das Kulturmedium (RPMI) verdünnt. Die verdünnten Lösungen von Peptid T wurden aus Peptid T-Vorratslösung für jedes Experiment frisch hergestellt. ³H-Thymidin (5 Ci/mMol) wurde von Amersham erhalten.
  • Isolierung von PBMC: Vollblut von gesunden, erwachsenen Freiwilligen wurde in Heparin eingezogen und periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) durch Dichtegradienten-Zentrifugation an HISTOPAQUE (Sigma Chemical Co.) isoliert. PBMC wurde aus der Grenzfläche entfernt, dreimal in RPMI-enthaltendem Gentamycin (100 pg/ml) gewaschen und auf 1 · 10&sup6; PBMC/ml in RPMI, das 10% fetales Rinderserum und Gentamycin enthält, resuspendiert. 10&sup5; PBMC wurden in Gegenwart von 100 ul Mitogensuspension in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in Gegenwart von 100 ul Mitogensuspension kultiviert. Die Endkonzentration an Mitogen war: PWM 25 pg/ml; PHA 12,5 pg/ml und Con A 6,25 ug/mi. 10 ul Peptid T-Arbeitslösung (oder RPMI als negative Kontrolle) wurden zugegeben und Zellkulturen während einer Gesamtzeit von 5 Tagen in einer feuchten Atmosphäre, 5% CO&sub2;. 37ºC, inkubiert. Die Kulturen wurden mit ³H- Thymidin (in RPMI) 18-24 Stunden vor dem Ernten gepulst. Die Menge an eingebautem ³H- Thymidin wurde unter Verwendung eines BECKMAN LS8000 Flüssigkeits- Scintillationszählers bestimmt und die Proliferation entweder als Zählungen pro Minuten (cpm) oder als Proliferationsindex (PI) ausgedrückt.
  • PI = cpm von (PSMC + Mitogen)/cpm von (PBMC + Medium)
  • Ein PI von 2 zeigt an, dass Zellen auf das Zweifache ihrer ruhenden (unstimulierten) Zahl gewachsen waren.
  • Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die angegebenen Ergebnisse sind Werte der wiederholten Experimente.
  • Produktion von Tumornekrosefaktor (TNF): 5 · 10&sup6; PBMC/ml wurden in Gegenwart von Con A (6,25 ug/ml) 48 Stunden in einer feuchten Atmosphäre, 5% CO&sub2;, 37ºC, inkubiert. Peptid T (10&supmin;&sup9; M) wurde bei t = 0 und 24 Stunden zugegeben. Am Ende der Inkubierung wurde SEPHADEX G25 (Pharmacia) zugegeben (10 mg/ml) und 10 Minuten inkubiert, um Mitogen zu entfernen. PBMC und SEPHADEX wurden durch Zentrifugieren pelletisiert und der Überstand auf einen Gehalt an TNF unter Verwendung eines TNF - Radioimmun-Assaykits von Amersham getestet. Die Proben wurden zweifach analysiert.
  • Statistische Analysen: Die Daten wurden durch einen Zweiproben-ANOVA-Test unter Verwendung einer 95%-Vertrauensgrenze analysiert, wodurch ein Wert von p &le; 5 als signifikante Differenz betrachtet wurde. TABELLE VII 1 · 10&sup5; PBMC wurden in Gegenwart von Mitogenen mit Peptid T (1 · 10&supmin;&sup9; M), das gleichzeitig mit Mitogenen (Tag 1) oder an folgenden Tagen, wie angegeben, zugegeben wurde, kultiviert. Die Zellen wurden während einer Gesamtdauer von 6 Tagen kultiviert. Die Ergebnisse sind als Proliferationsindex ± Standardabweichung angegeben
    • Ergebnisse
  • Bei Zugabe am ersten Tag der Kultur war das Peptid T dazu fähig, eine Lymphoproliferation als Antwort auf PWM (Fig. 2a), Con A (Fig. 2b) und PHA (Fig. 2c) zu inhibieren. Peptid B war dazu fähig, PHA-stimulierte PBMC-Kulturen bei einer Konzentration von 1 · 10&supmin;¹³ M zu inhibieren. Kulturen, die mit Con A oder PWM stimuliert waren, wurden durch eine so geringe Menge wie 1 · 10&supmin;¹&sup5; M Peptid T inhibiert. Peptid T erreichte Peak-Plasmakonzentrationen von 5,5 · 10&supmin;&sup8; M nach Verabreichung in vivo; deshalb würde eine Peptid T-vermittelte Immunomodulation bei Konzentrationen des Arzneimittels wirksam sein, die im Plasma und CSF leicht erreichbar sind. Das Kulturmedium, in dem Peptid T verwendet wurde, besitzt keine Wirkung auf die Lymphoproliferation. Bei der wirksamsten Konzentration von dem verwendeten Peptid T wurde die Lymphoproliferation in Antwort auf PHA um 26% inhibiert, PWM um 38 und Con A um 36%.
  • Die Inhibierung von Lymphoproliferation könnte ein Ergebnis der Cytotoxizität, einer Verzögerung in der Initiierung der Proliferation, einer Verringerung in der Wachstumsrate oder irgendeiner Kombination der vorstehenden Erscheinungen sein.
  • Wenn die Con A-induzierte Proliferation von PBMC täglich gemessen wurde, trat während der Wachstumsperiode (Tag 2 bis 4) eine Lymphozytenproliferation in Gegenwart von Peptid T parallel dazu auf, aber mit einer verringerten Wachstumsrate in Abwesenheit des Arzneimittels (Fig. 3). In Abwesenheit von Mitogen zeigte Peptid T vernachlässigbare Wirkungen auf PBMC. Peptid T war deshalb auf Lymphozyten nicht toxisch und verzögerte auch den Beginn ihrer Proliferation nicht. Peptid T ermöglichte ein Zellwachstum, aber mit verringerter Rate.
  • Peptid T war dazu fähig, Mitogen-induzierte Lymphoproliferation zu inhibieren, wenn es zu PBMC zugegeben wurde, nachdem dieses Mitogenen ausgesetzt worden war (Tabelle VII). Dieser Effekt war sogar dann vorhanden, wenn Peptid T drei Tage nach dem Aussetzen von PBMC gegenüber Mitogen zugegeben wurde. Eine Peptid T-vermittelte Inhibierung der Lymphoproliferation wurde am meisten unterstrichen, wenn es zu Kulturen zugegeben wurde, die mit Con A stimuliert worden waren.
  • Zusätzlich zur Inhibierung der Lymphoproliferation verringerte die Gegenwart von Peptid T die Menge von an den Überstand (SN) abgegebenem TNF einer 48-stündigen Con A-stimulierten Kultur von PBMC (Tabelle VIII). Weder Peptid T noch RPMI besaßen eine Reaktivität im RIA für TNF. In Abwesenheit von Con A wurde kein TNF im Kulturüberstand bestimmt.
    • TABELLE VIII PBMC (5 · 106 PBMC/ml) wurden 48 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit von Con A (6,25 ug/ml) ± Peptid T (10&supmin;&sup9; M, gleichzeitig mit Mitogen zugegeben) kultiviert. Die Gehalte an TNF in den Kulturüberständen wurden wie beschrieben bestimmt.
  • TNF (fMol/100u1)
  • RPMI + Peptid T < 1
  • PBMC + RPMI + Peptid T < 1
  • PBMC + Con A 69,0 ± 6,9
  • PBMC + Con A + Peptid T 47,0 ± 0,1
    • BEISPIEL 9 - PEPTID T INHIBIERT DIE NICHT-MITOGEN-INDUZIERTE LYMPHOPROLIFERATION
  • Im Gegensatz zu Mitogenen, die Lymphozytenproliferations-Signale induzieren, indem sie MO/MAC- und T-Zellen über Kohlehydrateinheiten auf einer Vielzahl von Zelloberflächenrezeptoren ligieren, tritt eine nicht-Mitogen-stimulierte Lymphoproliferation, die durch ins Gedächtnis zurückgerufene Antigene, Superantigene, Antikörper gegen CD3 (Anti-CD3) und allogene MHC-Moleküle vermittelt werden, nur mit den T-Zellen Antigen-Rezeptor/CD3-Komplex (TcR/CD3) in Wechselwirkung. In dieser Hinsicht sind nicht-mitogene Stimulantien spezifischer als Mitogene.
  • Nur die Lymphozyten mit TcR, die mit Antigenepitopen komplementär sind, werden veranlasst werden, die Antigene wieder ins Gedächtnis zu rufen. Typischerweise wird dies durch einen geringen Bruchteil des gesamten Lymphozyt-Pools repräsentiert. Die Reaktionen gegenüber allogenem MHC, die durch die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) charakterisiert sind, werden durch Erkennen von fremden MHC Klasse II-Molkülen durch die TCR der Antwortzellen vermittelt (Advanced Immunol. 31 271 (1981)). Ca. 10% der T-Zellen sind alloreaktiv (Lancet 339 824 (1992)). Superantigene, wie z. B. Staphylococcal-Enterotoxine A und B (SEA und SEB) und toxisches Schocksyndrom-Toxin-1 (TSST-1) stimulieren das Wachstum von ca. 20% des T-Zellen-Pools (Sci. Am. 266 92 (1992)) durch Wechselwirkung mit definierten V -Segmenten des TcR (Science 244 811 (1989)). Anti-CD3 ist dazu fähig, das Wachstum von 100% der T-Zellen unabhängig von der akzessorischen Zellfunktion durch direktes Ligieren von TcR/CD3-Komplexen zu stimulieren.
  • Da Mitogene eine künstliche nicht-spezifische Form einer Lymphozytenaktivierung sind, wurde die Wirkung von Peptid T auf die Lymphoproliferation als Antwort auf das ins Gedächtnis rufen von Antigenen, Anti-CD3, Superantigenen und MLR bewertet. Zusätzlich wurden T-Zellen-Effektorfunktionen und das Wachstum spontaner proliferierender maligner Zell-Linien in Gegenwart von Peptid T untersucht.
  • Wenn nicht anders angegeben, sind die experimentellen Bedingungen im allgemeinen die, wie sie in Beispiel 8 beschrieben sind.
    • Peptid T inhibiert nicht nicht-Mitogen-induzierte Lymphoproliferotion
  • Bei der Zugabe am ersten Tag einer 6 Tage-Kultur war Peptid T dazu fähig, Con A-induzierte Lymphoproliferation zu inhibieren, hatte aber vernachlässigbare Wirkungen auf die Lymphozyten, die auf wieder ins Gedächtnis gerufene Antigene ansprachen (Masern-, Mumps-, Rubella-Vaccine, MMR), Antikörper gegenüber CD3 oder die Superantigene SEB und TSST-1 (Fig. 4). Auf ähnliche Weise beeinträchtigte Peptid T nicht das Wachstum von Lymphozyten in einer gemischten Lymphozytenreaktion (Fig. 5).
  • Molt-4 ist eine menschliche T-Lymphomazell-Linie, p56lck-negativ, und Jurkat ist eine menschliche T-Zell-Linie, p56lck-positiv, die spontan in Abwesenheit exogener Stimulantien wachsen. Die Ergebnisse der Tabelle IX zeigen, dass Peptid T das Wachstum von Molt-4- oder Jurkat-Zell-Linien nicht wesentlich beeinflusste. TABELLE IX Wirkung von Peptid T auf das Wachstum von Zell-Linien Zwei spontan wachsende menschliche maligne T-Zell-Linien (Jurkat und Mol-4) wurden in Abwesenheit (Medium - P. T.) oder Anwesenheit (Medium + P. T.) von zugegebenem Peptid T am ersten Tag der Kultur wachsen gelassen. Das Wachstum wurde durch Messung des eingebauten ³H-Thymidins bestimmt; Zählungen pro Minute (cpm) wurden nicht in einen Proliferationsindex überführt. Ein höherer cpm-Wert stellt ein größeres Zellwachstum dar.
    • Peptid T inhibiert nicht ein PBMC-vermitteltes Abtöten von Molt-4-Zellen.
  • Wenn PBMC mit allogenen Molt-4-Zellen gemischt wird, wird das Wachstum von Molt-4 inhibiert (Fig. 6). Alloreaktive PBMC erkennen Molt-4 als fremd und bilden cytotoxische Effektorzellen, die Molt-4 abtöten. Molt-4 ist keine cytotoxische Zell- Linie und kann keine alloreaktiven Effektorzellen bilden. Wenn Peptid T zu dieser Reaktionsmischung zugeben wird, bleibt die PBMC-vermittelte Inhibierung der Molt-4- Proliferation unbeeinträchtigt (Fig. 6), was zur Annahme führt, dass Peptid T die Bildung von cytotoxischen Effektorfunktionen nicht beeinflusst. Es ist nicht möglich, Wachstum von alloreaktiven T-Zellen von Wachstum von überlebenden Molt-4-Zellen zu unterscheiden, da weder das Wachstum der alloreaktiven T-Zellen (Fig. 5) noch das Wachstum der Molt-4 (Tabelle IX) durch Peptid T beeinträchtigt würde.
    • BEISPIEL 10 - WIRKUNG VON PEPTID T AUF MAKROPHAGE UND DIE TNF-FUNKTION
  • Zellen einer Monocyt/Makrophag-Linie (MO/MAC) sind langlebige, nichtproliferierende Zellen, die chronische entzündliche Reaktionen charakterisieren. MO/MAC fungieren als nicht-spezifische Phagocyten, Antigen-repräsentierende Zellen (die Antigen-spezifische Immunantworten initiieren) als immunoregulatorische Zellen und cytotoxische Effektorzellen. MO/MAC bilden eine Vielzahl von intrazellulären und extrazellulären cytotoxischen Effektormolekülen einschließlich reaktiver Sauerstoff- Zwischenprodukte, von lysosomalen Enzymen und Tumornekrosefaktor alpha (TNF) aus.
  • MO/MAC wurden bei der Pathogenese der HIV-Erkrankung in Verbindung gebracht. Alle MO/MAC exprimieren CD4 (J. Immuno t. Med. 135 59 (1990)) und sind deshalb dazu fähig, mit HIV infiziert zu werden. Es wurde sogar vorgeschlagen, dass MO/MAC vielleicht die ersten Zellen sind, die während des Infektionsprozesses mit HIV infiziert werden (Annal. N. Y. Acad. Sci. 616 1 (1990)). O/MAC sind gegenüber cytopathischen Effekten von HIV nicht so empfänglich wie CD4-positive T-Zellen (TIPS 12 28 (1991)) und könnten für die Schaffung einer persistenten oder latenten HIV- Infektion verantwortlich sein. MO/MAC können für die Übertragung von HIV in das ZNS verantwortlich sein, wenn dieses den mit HIV infizierten primären Zelltyp umfasst (Compr. Ther. 17, 57 (1991)). Im ZNS kann MO/MAC einen neurologischen Schaden durch Freisetzung von neurotoxischem gp120 (Science 248 364 (1990)), tat (J. Virol. 65 961 (1991)) oder MO/MAC-abgeleiteten Neurotoxinen (Science 250 1593 (1990)) vermitteln. Es ist interessant festzustellen, dass aktiviertes MO/MAC ebenfalls in der Pathogenese anderer neurologischer Erkrankungen, wie z. B. multipler Sklerose, verwickelt sein kann (Acta. Neuropatholl. 80 208 (1990); Pothol. Immunopathol. Res. 6 241 (1987); Ann. Rev. Immunol. 10 153 (1992)) und Alzheimer-Erkrankung (Eur. Neurol. 28 30 (1988)).
  • HIV-infiziertes MG/MAC zeigt eine akzessorische Zelldisfunktion (din. Immunol. Immunopothol. 59 436 (1991); J. Immunol. 146 2297 (1991)). Zusätzlich induziert HIV eine MO/MAC-Aktivierung, wie dies durch erhöhte Gehalte an Neopterin, einem Marker für die T-Zellen-abhängige MO/MAC-Aktivierung, und erhöhte Gehalte an Monokinen (TNF, IL-1 und IL-2) angezeigt wird.
  • In vitro kann MO/MAC durch IFN- und Lipopolysaccaride (LPS) aktiviert werden, die mindestens 4 verschiedene intrazelluläre Signale initiieren, die einen Calciumfluss umfassen (Immunol. Today 10 33 (1989)). Die Produktion von TNF kann durch IFN-Aktivierung von MO/MAC initiiert werden, erfordert aber LPS, um seine Freisetzung auszulösen (J. Exp. Med. 175 405 (1992)).
  • Eine Rolle für TNF bei der HIV-Erkrankung wurde auf der Basis der Beobachtung vorgeschlagen, dass Makrophagen von AIDS-Patienten größere Mengen an TNF freisetzen als solche von normalen Kontrollpersonen (Am. Rev. Respir. Dis. 144 195 (1991)) und erhöhte Gehalte an TNF wurden mit dem Fortschreiten einer latenten HIV-Infektion zu AIDS in Verbindung gebracht (Am. J. Med. 85 289 (1988)). Potentielle Effekte von TNF, die zur HIV-Pathogenese beitragen, umfassen TNF-vermittelte Cachexie (New Engl HJ. Med. 327 329 (1992); J. Nutr. 122 749 (1992)), Autokrin/Parakrin-Erhöhung von HIV- Replikation (Immunol. Today, 11 176 (1990)), Hyperaktivierung des Immunsystems (Biotherapie 3 127 (1999)), Inhibierung von Zidovudin (AZT), ddl und ddC (VIII Int. Conf. AIDS Abst. #PoA 2326 (1992); J, Intern. Med. 228 549 (1990)), die Expansion von autoreaktiver CD4-spezifischer CTL (VIII Int. Conf. AIDS Abst. #PoA 2365 (1992)), die Beschädigung von Myelin und Oligodendrozyten (AIDS 5 1405 (1991)), Cytopenie (Am. Rev. Respir. Dis. 144 195 (1991)) und Apoptosis (Immunol. Ser. 56 315 (1992)).
  • TNF wurde auch mit der Pathogenese von multipler Sklerose in Verbindung gebracht. TNF ist für Myelin-erzeugende Oligodendrozyten cytotoxisch (Ann. Rev. Immunol. 10 153 (1992)) und kann eine direkten Myelinschaden verursachen, indem es eine Blasenbildung und ein Anschwellen der Myelinhülle verursacht (Annal. Neurol. 23 339 (1988)).
    • Methoden Makrophagen-Cytotoxizitöts-Assay
  • Der MO/MAC-Cytotoxizitäts-Assay ist ein zweistufiger Assay. Nach Isolierung anhaftender Zellen (hauptsächlich MO/MAC) von PBMC wird MO/MAC durch Lymphokine (einschließlich IFN gamma und LPS) aktiviert. Nach dem Waschen, das die Aktivatoren entfernt, werden ³H-Thymidin-markierte K562-Zielzellen zu aktiviertem MO/MAC zugegeben und 3 Tage lang inkubiert. Der Grad der Cytotoxizität war proportional zur Menge des in den Kulturüberstand freigesetzten radioaktiven Markers, wie dies im folgenden Schema gezeigt wird:
  • PBMC
  • Anhaftende Zellen (1 Stunde, 37ºC an Kunststoff)
  • Stufe 1: Aktivierung (8 Stunden): Cytokine LPS (1 ug/ml)
  • Stufe 2: Effektor (3 Tage): ³H-T K562
  • Freisetzung von ³H-T
    • MO/MAC-Überstands-Cytotoxizität
  • Der Überstand (SN) von aktiviertem MO/MAC wurde von den Monoschi chten der von den anhaftenden Zellen, die 23 Stunden lang LPS ausgesetzt waren, gesammelt. Dieser Überstand wurde auf die cytolytische Aktivität gegenüber ³H-Thymidin-markierten K562- Zellen in einem 48-ständigen Cytotoxizitäts-Assay bei 37ºC getestet. Vor der Verwendung wurde SN über Nacht bei 4ºC oder bei -20ºC während längerer Zeiten gelagert.
    • Ergebnisse Peptid T-inhibierte MO/MAC-vermittelte Cytotoxizität
  • Die Gegenwart von Peptid T an verschiedenen Stufen des Cytotoxizitäts-Assays zeigte, dass, obwohl Peptid T die Fähigkeit einer Aktivierung ruhender MO/MAC nicht beeinträchtigte, es dazu fähig war, die Cytotoxizität von aktiviertem MO/MAC zu inhibieren (Fig. 7). Ob Peptid T gleichzeitig mit den Zielzellen oder jeden Tag der Kultur zugegeben wurde, beeinträchtigte die Aktivität des Arzneimittels nicht.
    • Peptid T-Behandlung verringert Neopterin-Gehalte, aber ein Peptid T-abhängiger Abfall im Serum-Neopterin wurde nicht mit dem Ansteigen von Serum IL-1 in Verbindung gebracht.
  • Wenn Seren von Patienten mit Peptid T-abhängigem Abfall bei erhöhtem Neopterin- Gehalten auf IL-1 getestet wurden, konnte keine Beziehung zwischen diesen beiden gezeigt werden. (Tabelle X). Die Neopterin-Gehalte waren jedoch vor der Peptid T- Verabreichung erhöht, während die Serum IL-1-Gehalte normal waren. Tabelle X Serum IL-1- und Neopterin-Konzentration Serum wurde von Patienten mit HIV-Erkrankung gesammelt und bei -20ºC gelagert. Neopterin- und IL-1-Konzentrationen wurden mittels RIA bestimmt. Prä- und Post-Peptid T-Werte von IL-1 und Neopterin wurden für die gleichen Serumproben bestimmt.
    • Peptid T inhibiert die Cytotoxizitöt von MO/MAC-Kulturüberständen
  • Die Fähigkeit von MO/MAC-Kulturüberständen zur Lyse von Ziel-K562-Zellen wurde in Gegenwart von Peptid T bestimmt. MO/MAC-Kulturüberstand wurde in einer Endverdünnung von 1 : 6 in der Kulturvertiefung verwendet. Wie in Fig. 8 gezeigt, war Peptid T dazu fähig, MO/MAC-Überstand-vermittelte Lyse von K562 sogar bei einem Zusatz von
  • 1 · 10&supmin;¹³ M zu blockieren.
    • Beispiel 11 - Peptid T besitzt eine ähnliche Wirkung auf Anti-Tine bei der Inhibierung der Wirkung von TNF
  • 10&sup5; PBMC wurden in Gegenwart von PWM, Con A oder PHA (siehe Beispiel 8) kultiviert. Peptid T (10&supmin;&sup9; M), Anti-TNF MoAb #47 bei einer Verdünnung von 1 : 200 (Anti- TNF) oder eine Kombination beider wurden gleichzeitig mit Mitogenen zu Kulturen zugegeben. Nach einer 5-tägigen Inkubation wurden die Kulturen mit ³H-Thymidin 18 bis 24 Stunden lang vor der Ernte gepulst. Der Einbau von ³H-Thymidin wurde in einen Proliferationsindex überführt (siehe Beispiel 17). Die Daten wurden durch zwei Proben ANOVA unter Verwendung einer 95%-igen Vertrauensgrenze analysiert.
    • BEISPIEL 12 - PEPTID T VERRINGERT DEN SERUM-TNF-GEHALT IN HIV-PATIENTEN
  • Serumgehalte von TNF wurden bei Patienten mit Stufe IV-HIV-Erkrankung vor und nach Peptid-T-Behandlung bestimmt. Die Patienten erhielten das Arzneimittel zwei bis elf Wochen lang. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. Der Anstieg in den Serum TNF-Gehalten in Patienten BG wurde mit der Entwicklung einer opportunistischen Infektion in Verbindung gebracht.
    • BEISPIEL 13 - PEPTID T VERLÄNGERT DAS ÜBERLEBEN VON D-GALACTOSAMIN-SENSIBILISIERTEN MÄUSEN IN EINEM SEPTISCHEN SCHOCKMODELL
  • Fünfzig balb/c/Schweizer (1, Wurf) weibliche Mäuse mit einem Alter von ca. 8 Wochen wurden in 5 Gruppen aufgeteilt und wie folgt dosiert:
  • 1. 16 mg D-Galactosamin + 20 ug TNF + H&sub2;O
  • 2. 16 mg D-Galactosamin + 20 ug TNF + MAb 47
  • 3. 16 mg D-Galactosamin + 20 ug TNF + 100 ug Peptid T
  • 4. 16 mg D-Galactosamin + 20 ug TNF + 10 ug Peptid T
  • 5. 16 mg D-Galactosamin + 20 ug TNF + 1 ug Peptid T
  • D-Galactosamin sensibilisiert die Mäuse gegenüber den Wirkungen von TNF in diesem experimentellen septischen Schockmodell. MAb 47 ist eine Breitbandspektrum- AntiZ-TNF monoklonaler Antikörper, der von Peptide Technology Limited erhältlich ist.
  • Die schützende Wirkung von Peptid T wurde nach 12 Stunden bewertet. Es wurden die in der nachstehenden Tabelle 11 angegebenen Ergebnisse erhalten. TABELLE XI
  • Parameter: A Kalt
  • B Kühl
  • C Warm
  • D Gekräuselt
  • E Diarrhöe
  • F Ausfluss aus den Augen
  • G Berührungsempfindlich
  • H Aktivität
    • BEISPIEL 14- D-THR-THR-TYR-D-THR-NH&sub2; VERLÄNGERT DAS ÜBERLEBEN VON SENSIBILISIERTEN MÄUSEN, DENEN EINE LETALE DOSIS VON LPS VERABREICHT WURDE
  • Meth A-Ascites-Tumorzellen wurden in Mäuse injiziert (10&sup6; Zellen i.p.) und wachsen gelassen. Die Meth A Tumor-tragenden Mäuse wurden dann gegenüber den Wirkungen von TNF/LPS sensibilisiert. Den Mäusen wurden durch i.p.-Injektion 50 pg LPS, formuliert in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verabreicht und diese dann in drei Gruppen von je 10 geteilt. Die Behandlung jeder Gruppe war dann die folgende:
  • 1. Positive Kontrolle. 1 mg Polymyxin B (PMB) in PBS, i.p.-injiziert. (PMB ist eine Inhibitor der LPS-Aktivität)
  • 2. Negative Kontrolle. PBS, i.p.-injiziert
  • 3. Testverbindung. 1 mg Peptid T-Analoges 623 (D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH&sub2;) in PBS, i.p.-injiziert
  • Die Ergebnisse sind in der Fig. 11 dargestellt. Die Überlebensdauer der Mäuse der mit dem Analogen 632 behandelten Mäuse war mindestens so gut wie die der mit PMB behandelten Mäuse.
    • BEISPIEL 15 - PEPTID T INHIBIERT DIE AKTIVIERUNG VON MENSCHLICHEN NEUTROPHILEN DURCH TNF UND LPS.
  • Neutrophile. Neutrophile wurden aus Vollblut von gesunden Blutspendern isoliert. Die Trennung wurde durch eine rasche einstufige Methode durch Zentrifugieren von Vollblut an FICOLL-HYPAQUETM bewirkt. Diese waren > 99% lebensfähig und üblicherweise > 98% rein.
  • Peptide und TNF. TNF war ein in E. coli. hergestelltes rekombinantes Produkt. Peptid T und Analog 505 (D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr) wurde in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) resuspendiert.
  • Prüfung der Wirkung der T-Peptide und 505-Anoioge auf Stimulantien-induzierte Neutrophile (100 ug) mittels Chemilumineszenz. Zu 100 ug von 500 bis 1000 U/ml TNF wurden 10 pl Peptid zugegeben und nach 5 min 100 ul 1 · 10&sup7; Neutrophile/ml gegeben.
  • Die Zellen wurden dann bei 37ºC/20 min inkubiert und dann auf ihre Chemilumineszenz- Aktivität getestet. In einigen Fällen wurde ein Agonist, wie z. B. fMLP (10&supmin;&sup7; M) zugegeben. Die Chemilumineszenz wurde in einem Luminometer (LKB) gemessen. Die Ergebnisse für das Peptid T sind in Fig. 12 als Peakrate der CL-Freisetzung angeben. Es wurde die Lucigenin-abhängige Chemilumineszenz gemessen: Dies bedeutet eine Superoxid-Messung. In einem anderen Experimentansatz wurden die Wirkungen des Analogs 505 auf die LPS-induzierte neutrophile Chemilumineszenz geprüft. In diesem Fall wurde das LPS im wesentlichen für das TNF ersetzt. Die Konzentration an LPS betrug 0,005 pg/ml. Die Ergebnisse sind in den Fig. 13 und 14 angegeben, die zeigen, dass das Analoge 505 (a) das TNF-Primen und die Aktivierung von menschlichen Neutrophilen inhibiert und (b) LPS-Aktivierung menschlicher Neutrophile inhibiert.
    • BEISPIEL 16 - PEPTID T VERRINGERT DEN TNF-VERMITTELTEN PROTEOGLYCAN-ABBAU UND VERRINGERT DIE FÄHIGKEIT VON TNF ZUR STIMULIERUNG EINES NEUTROPHIL-VERMITTELTEN ABBAUS VON KNORPELGEWEBE
  • (a) In einer Experimentengruppe wurden verschiedene Konzentrationen Peptid T mit TNF gemischt und dann zu 35-markiertem Knorpelgewebe zugegeben. Das Knorpelgewebe wurde 3 Tage lang bei 37ºC kultiviert und an jedem Tag der Überstand entfernt, um die Menge des Abbaus zu bestimmen. Die Knorpelgewebekultur wurde täglich mit TNF oder Peptid T-TNF ergänzt.
  • (b) In einer anderen Gruppe von Experimenten wurden menschliche Neutrophile mit Peptid T-TNF behandelt und dann zum Knorpelgewebe gegeben. Es wurde der Neutrophil-vermittelte Knorpelgewebsabbau bestimmt. ERGEBNISSE 1. Wirkung von Peptid T auf TNF-induzierten Knorpelgewebeabbau Tabelle XII
  • *100 U TNF
    • 2. Wirkung von Peptid T auf TNF-geprimtes Neutrophil für einen Proteoglycan-Abbau
  • Peptid T verringerte die Fähigkeit von TNF zur Stimulierung eines Neutrophilvermittelten Abbaus des Knorpelgewebes (Tabelle XIII). Tabelle XIII
  • *100 U TNF
  • Dieses Beispiel liefert eine gute in vitro-Bestätigung des anekdotischen in den Beispielen 13 und 14 angegebenen klinischen Nachweises.
    • BEISPIEL 17 - PEPTID T VERRINGERT DIE DURCH TNF INDUZIERTE GEWEBSFAKTOR-EXPRESSION
  • In einer akuten systemischen Entzündung, z. B. in einem Patienten mit septischem Schock, kann eine disseminierte intravaskuläre Koagulation beobachtet werden. Während des Verlaufs der Koagulationsreaktion werden endotheliale Zellen als Mediatoren für die Zelladhäsion einbezogen. Ein Faktor, der ausgebildet wird, und der in die Koagulationskaskade verwickelt ist, ist der Gewebsfaktor, auch als endotheliale Zellprokoagulans-Aktivität bekannt; sie wird durch TNF induziert. In diesem Beispiel wird gezeigt, dass Peptid T die Gewebsfaktorexpression durch Endothelialzellen inhibiert, wodurch gezeigt wird, dass Peptid T einen Teil der mit akuten inflammatorischen Reaktionen verbundenen Pathologie inhibiert.
  • Methode. Menschliche Umbilikal-Blutgefäß-Endothelialzellen wurden im wesentlichen nach der Methode von Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acod. Sci., USA 83 4533-4537 (1986) kultiviert. Die Zellkulturen wurden mit TNF mit 3 mg/ml während 4 Stunden bei 37ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von Peptid T behandelt. Die Gewebsfaktoradhäsion wurde mittels ELISA bei der Expression von 450 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 angegeben, aus der es ersichtlich ist, dass steigende Konzentrationen an Peptid T die Gewebsfaktor-Expression in zunehmendem Masse verringert.

Claims (10)

1. Verwendung eines linearen oder cyclischen Peptids der allgemeinen Formel (1):
I-A-B-C-D-E-F-G-H-II (allgemeine Formel 1, SEQ ID NO 1)
worin A Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
B Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
C Ser, Thr ist oder fehlt,
D Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, Ile, Leu ist oder fehlt,
E Ser, Thr, Asp ist oder fehlt,
F Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys, Trp ist oder fehlt,
G Tyr ist oder fehlt,
H Thr, Arg, Gly, Met, Met(O), Cys, Thr, Gly ist oder
fehlt,
und I Cys ist oder fehlt II Cys, eine Amidogruppe, eine substituierte Amidogruppe oder eine Estergruppe ist oder fehlt, und worin das Peptid die Aminosäuresequenz -Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr- umfaßt (SEQ ID NO 3),
und eine oder mehrere der Aminosäuren gegebenenfalls durch ein monomeres oder polymeres Kohlenhydrat oder ein Derivat davon substituiert sind, wobei diese Substitution über Hydroxyl- und/oder Amino- und/oder Amidogruppen der Aminosäuren erreicht wird,
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder zur Verhinderung von entzündlichen Darmkrankheiten.
2. Verwendung eines linearen oder cyclischen Peptids, das ist:
1. D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-NH&sub2;;
2. Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr (SEQ ID NO 5);
3. D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr;
4. D-Ala-Ala-Ser-Ser-Ser-Asn-Tyr-Met;
5. Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr (SEQ ID NO 6);
6. Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr (SEQ ID NO 7);
7. Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr (SEQ ID NO 8);
8. D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr;
9. D-Ala-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Asn-Tyr-D-Thr-NH&sub2;; oder
10. D-Ser-Ser-D-Thr-Thr-D-Thr-Thr-Tyr-D-Thr-NH&sub2;;
oder eines Derivates oder Salzes davon zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Verhinderung entzündlicher Darmerkrankungen.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Hydroxylgruppen an Ser, Thr oder Tyr in ein Ester- oder Etherderivat überführt ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Aminosäuren eine substituierte N-Alkylaminosäure ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Aminosäuren durch ein monomeres oder polymeres Kohlenhydrat oder ein Derivat davon substituiert ist, wobei die Substitution(en) über Hydroxyl- und/oder Amino- und/oder Amidogruppen der Aminosäuren bewirkt werden.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn- Tyr-Thr-NH&sub2;, oder ein Derivat oder Salz davon ist.
7. Peptidkonjugat, das ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 an ein Peptid, Protein oder eine andere geeignete Trägersubstanz und/oder einen Arzneimittelträger konjugiert umfaßt.
8. Lineares oder cyclisches Peptid der allgemeinen Formel 1:
I-A-B-C-D-E-F-G-H-II (allgemeine Formel 1, SEQ ID NO 1)
worin
worin A Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
B Ala, Gly, Val, Ser, Thr ist oder fehlt,
C Ser, Thr ist oder fehlt,
D Ser, Thr, Asn, Glu, Arg, Ile, Leu ist oder fehlt,
E Ser, Thr, Asp ist oder fehlt,
F Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys, Trp ist oder fehlt,
G Tyr ist oder fehlt,
H Thr, Arg, Gly, Met, Met(O), Cys, Thr, Gly ist oder
fehlt,
I Cys ist oder fehlt,
II Cys ist oder fehlt,
und worin das Peptid die Aminosäuresequenz umfaßt -Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr (SEQ ID NO 3),
eine oder mehrere der Aminosäuren durch ein monomeres oder polymeres Kohlenhydrat oder ein Derivat davon substituiert sind, wobei die Substitution über Hydroxyl- und/oder Amino- und/oder Amidogruppen der Aminosäuren bewirkt wird,
mit der Maßgabe, daß das Peptid kein glycosyliertes Protoyp Peptid T, Thr-Thr-Asn(GlcNAc)-Tyr-Thr oder Thr(GalNAc)-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr ist;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid nach Anspruch 8 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
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