-
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von N-Phenyl-N-
methyl-1,2-hydro-4-hydroxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-carboxamid oder eines pharmazeutisch zulässigen Derivats hiervon
für die Herstellung eines Medikaments mit der moglichen
Verwendbarkeit in der Behandlung von Retrovirus-Infektionen,
insbesondere HIV-Infektionen, und von Patienten, welche am
erworbenen Immundef izienzsyndrom (AIDS) und AIDS-verwandten.
Komplex leiden.
Hintergrund
-
Das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) ist als eine
tödliche menschliche Krankheit von wachsender globaler
Wichtigkeit aufgetreten. Da zur Behandlung von AIDS keine
wirksame Therapie bekannt ist, sind neue Therapiemethoden
dringend nötig und es werden zur Entwicklung von Arzneimitteln
und Impfstoffen zur AIDS-Bekämpfung große Anstrengungen
gemacht.
-
Das AIDS-Virus, das 1983 zum ersten Mal identifiziert
wurde, wurde unter einigen Namen beschrieben. Es ist das
dritte bekannte T-Lymphocytenvirus (HTLV-III) und hat die
Fähigkeit, sich in Zellen des Immunsystems zu vermehren und
auf diese Weise zu einer tiefgehenden Zerstörung von T4 T-
Zellen (oder CD4-Zellen) zu fuhren. Siehe z.B. Gallo et al.,
Science 224, 500-503 (1984), und Popovic et al., Ibid., 497-
500 (1984). Dieses Retrovirus war als
Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV) oder AIDS-verwandtes Virus (ARV) und,
kurzlichst, als menschliches Immundefizienzvirus (HIV)
bekannt. Es wurden zwei verschiedene AIDS-Viren, HIV-1 und HIV-
2 beschrieben. HIV-1 ist das 1983 von Montagnier-und
Mitarbeitern am Pasteur-Institut in Paris ursprünglich
identifizierte Virus [Ann. Virol. Inst. Pasteur 135 E, 119-134
(1984)] während HIV-2 später im Jahr 1986 von Montagnier und
seinen Mitarbeitern isoliert wurde [Nature 326, 662 (1987)].
So wie hierin verwendet, bezieht sich HIV auf diese Viren im
Allgemeinen.
-
Obgleich die Molekularbiologie von AIDS aufgedeckt und
definiert zu werden beginnt, ist es notwendig, viel mehr über
diese Krankheit zu lernen und zu verstehen. In der
Zwischenzeit wurden zahlreiche Versuche in die Suche nach möglichen
anti-Aids-Arzneimitteln und -Impfstoffen investiert. Die
Entwicklung eines AIDS-Impfstoffs wird durch fehlendes
Verständnis der Mechanismen von Schutzimmunität gegen HIV, durch die
große genetische Vielfalt des Virus und das Fehlen von
effektiven Tiermodellen für die HIV-Infektion verhindert. Siehe
z.B. Koff und Hoth, Science 241, 426-432 (1988).
-
Das erste von der US Food and Drug Administration (FDA)
anerkannte Arzneimittel zur Behandlung von AIDS war
Zidovudin, besser unter seinem früheren Namen Azidothymidin (AZT)
bekannt. Chemisch ist dieses Arzneimittel
3'-Azido-3-deoxythymidin. Dieses Arzneimittel wurde ursprünglich als
potentielle Waffe gegen AIDS ausgewählt, da es eine Hemmung der
Vermehrung des Virus in vitro zeigte. Ein ernster Nachteil
von AZT sind jedoch seine toxische Nebenwirkungen. Zusätzlich
zu AZT wurden andere antivirale Mittel, wie Anasamycin,
Ribovirin, Dideoxycytidin und Foscarnet entwickelt. Bislang
scheinen diese Mittel jedoch nicht von größerem Vorteil als
AZT zu sein. Es wurden auch immunostimul ierende oder
immunoadoptive Behandlungen mit IFNs oder IL2, Thymushormonen und
-Faktoren, Transferfaktor und Behandlungen mit sogenannten
immunostimulierenden Arzneimitteln, z.B. Isoprinosin,
Azimexon, Tuftsin, Bestatin, Cimetidin, Thymustransplantaten und
HLA angepaßen Lymphocytentransfusionen oder
Knochenmarkstransplantaten von Geschwistern oder identischen Zwillingen
getestet, scheinen jedoch versagt zu haben, wie in zwei
kürzlichen Rezensionen (Gottlieb MS et al, Immunotherapie of the
acquired immune deficiency syndrome, In: Gallin JI, Fauci AS,
eds. Advances in hos defense mechanisms. New York: Raven
Press, 1985;5:149-70, und Lotze MT. Treatment of immunologic
disorders in AIDS. In De Vita VT, Hellmam S, Rosenberg SA
eds. Aids etiology, diagnosis, treatment, and prevention. New
York: Lippincott Je company, 1985:235-63) hervorgehoben wird.
Zusammenfassung der Erfindung
-
Gemäb der vorliegenden Erfindung hat sich jetzt
erstaunlicherweise gezeigt, dab N-Phenyl-N-methyl-1,2-dihydro-4-
hydroxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-carboxamid Eigenschaften
besitzt, welche zur Behandlung von Retrovirus-Infektionen, wie
HIV-Infektionen von Säugetieren, einschlieblich dem Menschen,
und von Patienten, welche an AIDS und ARC leiden, brauchbar
sind.
N-Phenyl-N-methyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-1-methyl-2-oxochinol in-3-carboxaiuid ist auch unter dem Namen Linomid und
dem Gattungsnamen Roquinimex bekannt. Die Erfindung betrifft
auch die Verwendung von Linomid oder eines pharmazeutisch
zulässigen Salzes hiervon, wie dem Na- oder Ca-Salz, zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Retrovirus-
Infektionen, insbesondere HIV-Infektionen, und von Patienten,
welche an AIDS oder AIDS-verwandtem Komplex leiden. Linomid
wurde zuerst im US-Patent 4,547,511 als immunostimulierendes
Mittel beschrieben.
-
Die wissenschaftliche Experimentation mit Linomid
zeigte, daß Linomid vielfaltige immunologische Aktivitäten hat.
Es wurde dabei herausgefunden, daß Linomid die proliferative
Antwort auf T- und B-Zellmitogene vermehrt [Larsson, E.L.
Joiki, A.L. und Stålhandske, T.: Mechanism of action of the
new immunomodulator LS 2616, Int. J. Immunopharmacol. 9:425,
1987), die Antikörperbildung fördert (Carlsten, H.,
Tarkowski, A., und Nilsson, L-Å: The effect of immunomodulating
treatment on cutaneous delayed hypersensitivity in MRL
(1pr/1pr) mice, APMIS 97:728, 1989] und die NK-Zellaktivität
steigert [Kalland, T., Alm, G., und Stålhandske, T: Augmentation
of mouse natural killer cell aktivity by LS 2616, a new
immunomodulator, J. Immunol. 134:3956, 1985), (Kalland, T.:
Regulation of NK progenitors: Studies with a novel immunmodulator
with distinct effects at the precursor level, J. Immunol.
144:4472-6, 1990,].
-
In Hinblick auf die Tatsache, daß sich erwiesen hat, daß
Linomid die T-Lymphozyten stimuliert und die Bildung von IL-
2 steigert, konnte nicht erwartet werden, daß Linomid eine
Wirkung auf Retrovirus-Infektionen zeigt, da Versuche, HIV
infizierte Patienten mit dem T-Zell-Wachstumshormon IL-2 zu
behandeln, die Krankheit beschleunigt haben. Zweifelsohne
kann gesagt werden, daß die Stimulierung von T-Lymphozyten
bei Patienten mit HIV-Infektionen ein zweischneidiges Schwert
sein kann. T-Helferzellen sind bei der Bildung einer
Immunantwort von zentraler Bedeutung, jedoch auch das Reservoir
fur das sich vermehrende HIV-Virus. Auch in Hinblick auf die
Tatsache, daß die vorangehenden Versuche mit
immunostimulierenden Mitteln nicht erfolgreich waren, ist es interessant,
die vielversprechenden Ergebnisse von Linomid zu sehen.
-
Linomid hat die folgende Strukturformel
-
Linomid kann als solches oder als Salz eines
pharmazeutisch zulässigen Kations verwendet werden. Weiters kann
Linomid in Kombination mit anderen anti-AIDS-Mitteln verwendet
werden.
-
Ein denkbarer Dosierungsbereich von Linomid in der
AIDS-Behandlung wäre von etwa 0,1 bis etwa 100 mg täglich
oder, abhängig von dem besonderen zu behandelnden Zustand,
dem Alter und Gewicht des spezifischen Patienten und der
speziellen Antwort des Patienten auf die Medikation
möglicherweise höher. Die genaue individuelle Dosierung, sowie die
Tagesdosis, wird gemäß medizinischen Standardgrundsätze unter
ärztlicher Aufsicht festgelegt.
-
Formulierungen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden könnten, sind im US-Patent Nr. 4,547,511
Kol. 11 geoffenbart
-
Wie oben angeführt, ist Linomid ein kräftiger
Stimulator von T-Lymphozyten und steigert die IL-2-Bildung. Das
immunpharmakologische Profil wird jedoch von einer
tiefgreifenden Zunahme der Aktivität naturlicher Killer (NK) Zellen mit
geringerer Wirkung auf die T-Zell-Aktivität in vivo
beherrscht (Kalland, T.: Effekts of the immunomodulator LS 2616
on growth and metastasis of the murine B16-F10 melanoma,
Cancer Res. 46:3018, 1986]. Insbesondere wird die Häufigkeit von
CD4 ausschüttenden Zellen während der Behandlung von Mäusen
mit Linomid nicht erhöht (Beispiel 2). Diese Entdeckung in
Verbindung mit vielversprechenden Ergebnissen bei Retrovirus
infizierten Affen macht Linomid in der Behandlung von
Retrovirus-, einschließlich HIV-Infektionen, AIDS und ARC, trotz
möglicher Gefahren im Zusammenhang mit den T-Zell
stimulierenden Eigenschaften von Linomid , potentiell verwendbar.
-
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
erläutert.
Beispiel 1
-
Wirkung von Linomid auf die NK-Aktivität
-
* Verhältnis Effektorzelle:Zielzelle
-
Linomid (160 mg/kg/Tag) wurde im Trinkwasser während
vier Tagen gegeben und die NK-Aktivität der Milz gegen YAC-1-
Zellen nach einem herkömmlichen &sup5;¹Cr-Freisetzungsversuch, wie
beschrieben, bestimmt [Kalland, T., Alm, G., und Stålhandske,
T.: Augmentation of mouse natural killer cell activity by LS
2616, a new immunomodulator, J. Immunol. 134:3956, 1985]. Das
Ergebnis aus einem Versuch mit 3 C57B1/6 Mäusen pro
Behandlungsgruppe ist gezeigt und gibt an, daß Linomid die NK-
Aktivität in bedeutsamer Weise steigert.
Beispiel 2
-
Wirkung der Behandlung mit Linomid&sup8; auf Subpopulationen
von T-Lymphozyten der Milz
-
C57B1/6-Mäusen wurde Linomid (160 mg/kg/Tag) während 4
Tagen im Trinkwasser gegeben. Kontrol 1 tieren wurde normales
Trinkwasser gegeben. Mi lzzel len wurden wie beschrieben
präpariert [Kalland, T., Alm, G., und Stålhandske, T.:
Augmentation
of mouse natural killer cell activity by LS 2616, a
new immunomodulator, J. Immunol. 134:3956, 1985] und durch
direkte Immunofluoreszenz auf die Ausschuttung von
Zelloberflächenmarker untersucht. Die folgenden FITC-markierten
monoklonalen Antikörper wurden verwendet: HO-134 (Thy 1,2), GK
1,5 (CD4) und 19,178c (CD8) [Als Literaturhinweis auf
Antikörper siehe Kalland, T.: Regulation of NK progenitors:
-
Studies with a novel immunmodulator with distinct effects at
the precursor level, J. Immunol. 144:4472-6, 1990]. Die
Anzahl positiver Zellen wurde durch Abzählen von 400 Zellen in
einem mit Epifluoreszenz ausgestatteten Leitz-Mikroskop
bestimmt. Die Werte repräsentieren den Mittelwert ± SD von drei
Mäusen. Die Daten legen nahe, daß Linomid die Verteilung von
T-Lymphozytensubpopulationen nicht signifikant verändern.
-
Die Ergebnisse, welche mit Linomid erhalten wurden und
in den Beispielen 1 und 2 dargestellt sind, zeigen, daß
Linomid bei der Behandlung von HIV-Infektionen potentiell zu
verwenden ist.
Beispiel 3
-
Die folgenden Versuche mit dem SIV-Virus untermauern die
obigen in vitro Ergebnisse.
Hintergrund des Testmodells
-
Da die HIV-Viren die am gebräuchlichsten verwendeten
Versuchstiere, wie Ratten und Mäuse, nicht infizieren, mussen
andere Modelle verwendet werden, um die Wirkung möglicher
Arzneimittel in vivo zu untersuchen. Es können zwei
prinzipiell unterschiedliche Annäherungen unternommen werden. Scid-
Mäuse wurden erfolgreich mit menschlichen hämatopoetischen
Zellen wieder aufgebaut und es wurde gefunden, daß sie die
Fähigkeit besaßen, HIV-Virus infizierte Lymphozyten zu tragen
(Namikawa, R. , Kaneshima, H. , Lieberman, M. , Weissman, I.L.,
McCune, J.M.: Infection of the SCID-hu mouse by HIV-1.
Science 242:1684-6, 1988). Die Relevanz dieses Modells ist
jedoch einigermaßen fragwürdig, insbesondere fur die
Untersuchung von Arzneimitteln, welche nicht direkt die
Virusvermehrung stören, sondern nur auf Wirtszellen einwirken. Es wurden
verschiedene Affenarten als Träger fur unterschiedliche
HIV- oder SIV-Viren getestet. Die SIV-Infektion von Cynomolgus-
Affen fuhrt zu einer Infektion mit vielen Ahnlichkeiten zu
der von AIDS beim Menschen (Putkonen, P., Warstedt, K.
Thorstensson, R., Benthin, R., Albert, J., Lundgren, B.,
Öberg, B., Norby, E., Biberfeld, G., Experimental infection
of cynomolgus monkeys (Macaca Fascicularis) with simian
immunodeficiency virus (SIVsm). J.AIDS Res. 2:359-365, 1989). Das
Virus kann aus Lymphoidzellen und Lymphknoten an bestimmten
Stadien der Infektion isoliert werden und Antikörper von SIV
sind leicht bestimmbar. Daruberhinaus wird eine tiefgreifende
Abnahme der absoluten und relativen Zahl an CD4&spplus; T-Zellen
fortlaufend beobachtet. Die Tiere entwickeln eine klinische
Erkrankung, die durch vergrößerte Lymphknoten,
opportunistische Infektionen, Gewichtsverlust und Kachexie gekennzeichnet
ist. Dieses Modell ist wahrscheinlich eines der rel evantesten
fur den in vivo Test von Impfstoffen und Arzneimitteln, die
zur Behandlung von HIV-Infektionen beim Menschen entworfen
sind.
Materialien und Methoden
Tiere
-
Neun Cynomolgus-Affen (Macaca Fascicularis) wurden in
dieser Untersuchung verwendet. Das mittlere Körpergewicht war
2600 g und der Bereich war 2260 bis 2930 g. Die Affen wurden
in Einzelkäfigen in einer Einrichtung mit Biosicherheitsgrad
drei untergebracht. Vor der Verwendung wurden die Tiere durch
körperliche Untersuchung auf klinische Gesundheit geprüft und
durch ELISA wurde bestätigt, daß sie frei von SIV-Antikörpern
waren [Putkonen, P., Warstetd, K., Thorstensson, R., Benthin,
R., Albert, J., Lundgren, B., Öberg, B., Norrby, E.,
Biberfeld, G.: Experimental infection of cynomolgus monkeys
(Macaca Fascicularis) with simian Immunodef iciency virus (SIVsm),
J. AIDS 1989:2, 359-365]. Das Fehlen von vorher existierendem
Retrovirus wurde durch Cokultivierung von PBMC (=
mononukleare Zellen periphären Bluts) von Affen mit menschlichen PHA-
stimulierten PBMC und Testen des Kulturuberstandes auf
umgekehrte Transkriptaseaktivität weiter untersucht.
Virusquelle
-
Wie in vorangehenden Studien (Putkonen, P., Warstedt,
K. , Thorstensson, R., Benthin, R., Albert, J., Lundgren, B.,
Öberg, B., Norrby, E., Biberfeld, G.: Experimental infection
of cynomolgus monkeys (Makaka Fascicularis) with simian
Immunodeficiency virus (SIVsm), J. AIDS 1989:2, 359-365] haben
wir eine von einem auf natürliche Weise infizierten sooty
Mangabey-Affen isolierte SIV-Stamm verwendet (SIVsm). Ein
Stamm dieses Virus wurde vorher in Affen in vivo titriert.
Experimentelle Anordnung
-
Intraperitoneale Behandlung mit Linomid oder NaCl
begann vier Tage vor der Auseinandersetzung mit dem Lebendvirus
und daraufhin täglich (nicht während Wochenenden) subcutan
während der Zeit der Nachuntersuchung. Die Nachuntersuchung
ist 75 Tage nach der Auseinandersetzung mit dem Lebendvirus.
-
Affen L1-3 wurden mit einer geringen Dosis Linomid ,
-
0,3 mg/kg Kgew. x 2, behandelt
-
Affen L4-6 wurden mit einer hohen Dosis Linomid ,
-
3 mg/kg Kgew. x 2, behandelt
-
Affen L7-9 wurde Natriumchlorid x 2 gegeben
-
Alle Affen wurden mit 10-100 Tier ID&sub5;&sub0; an lebend-SIVsm
auseinandergesetzt. Die Tiere wurden getötet, als sie am
Sterben waren.
Virusisolierung und Bestimmung des viralen Antigens
-
Die Virusisolierungen wurden wie vorangehend beschrieben
[Putkonen, P., Warstedt, K., Thorstensson, R., Benthin, R.,
Albert, J., Lundgren, B., Öberg, B., Norrby, E., Biberfeld,
G.: Experimental infection of cynomolgus monkeys (Makaka
Fascicularis) with simian Immunodeficiency virus (SIVsm), J.
AIDS 1989:2, 359-365] mit einer wichtigen Vebesserung
durchgeführt. Die Kulturüberstände wurden durch einen
empfindlichen HIV-2/SIV-Antigen-Versuch geprüft [Thorstensson, R.,
Walther, L., Putkonen, P., Albert, J., Biberfeld, G.: A
capture immunoassay for detection of HIV-2/SIV antigen, J.
AIDS in press]. Das Vorliegen von viralem Antigen im Serum
wurde wie vorangehend beschrieben gezeigt [Thorstensson, R.
Walther, L., Putkonen, P., Albert, J., Biberfeld, G.: A
capture immunoassay for detection of HIV-2/SIV antigen, J.
AIDS in press].
Serologische Untersuchung
-
Soweit nicht gestestet.
Lymphozytenoberflächenmarker
-
T-Lymphozyten-Teilmenge in periphärem Blut wurde durch
Immunofluoreszenz, wie vorangehend beschrieben, bestimmt
[Putkonen, P. , Warstedt, K. g Thorstensson, R. , Benthin, R.,
Albert, J., Lundgren, B., Öberg, B., Norrby, E., Biberfeld,
G.: Experimental infection of cynomolgus monkeys (Makaka
Fascicularis) with simian Immunodeficiency virus (SIVsm), J.
AIDS 1989:2, 359-365]. Proben von periphärem Blut wurden mit
FITC-konjugierten anti-CD4 (OKT4, Ortho) und anti-CD8 (Leu2,
Becton Dickinson) inkubiert. Die Proben wurden in einem
Spectrum III Fließzytometer (Ortho Diagnostics) analysiert.
Ergebnisse
-
Alle neun Affen wurden, wie durch Virusisol ierung
bestimmt wurde, infiziert (Tabelle 1). Das Virus wurde von
allen Tieren am Tag 14, 28 und 62 isoliert. Das Vorliegen von
viralem Antigen im Serum wurde 14 Tage nach der
Auseinandersetzung in allen neun Affen aufgezeigt.
-
Die Affen L4, L6 und L9 wurden 70-82 Tage nach der
Auseinandersetzung auf Grund von ernstem Gewichtsverlust und
schneller Abnahme an CD4+ Zellen (AIDS-ähnliche Erkrankung)
getötet. Gegenwärtig ist der Affe L7 auch in einem schlechten
klinischen Zustand.
-
Eine Vergrößerung der periphären Lymphknoten wurde bei
den Affen L3 und L7 beobachtet.
-
Die Affen L1-3 blieben klinisch gesund.
-
Gewichtskurven, CD4-Zahl, %CD+ Zellen und CD4/8
Verhältnis sind in den Figuren 1-4 gezeigt.
-
Das Körpergewicht der Tiere ist in Figur 1 gezeigt. Bei
den Affen L1-3, die mit 0,6 mg/kg/Tag Linomid behandelt
wurden, zeigt sich nur ein geringer Gewichtsverlust. Im
Gegensatz dazu, zeigte ein Affe in jeder Kontrollgruppe (L9) und
einer in der Gruppe mit hoher Linomid -Dosis eine dramatische
Abnahme des Körpergewichts.
-
Die absolute Anzahl und der Prozentsatz von CD4+ T
Lymphozyten im periphären Blut wurde in regelmäßigen Intervallen
während des Experiments verfolgt. Die Anzahl an CD4+
Lymphozyten war in der Kontrollgruppe am Tag 75 stark vermindert
(0,33x10&sup9;/l, 28% des Ausgangswerts), in der mit niedriger
Linomid Dosis behandelten Gruppe jedoch nur leicht
vermindert (0,92x10&sup9;/l, 70% des Ausgangswerts) (Figur 2). In
gleicher Weise war der Prozentsatz von CD4&spplus; Zellen im periphären
Blut bei den Kontrol laffen verringert, jedoch wesentlich
unverändert bei den mit niedriger Linomid -Dosis behandelten
Affen (Figur 3). Die Behandlung mit hoher Linomid -Dosis hat
die Zahl der Häufigkeit von CD4 Zellen bei infizierten Affen
nicht wesentlich verändert. In einem qualitativen Versuch der
Virusisolierung konnte das Virus aus allen Affen 14 Tage nach
der Auseinandersetzung isoliert werden und virale Antigene
wurden bis zu 62 aufgezeigt, die späteste Zeit war für diesen
Test eingeschlossen.
-
Die Halbwertszeit von Linomid unterscheidet sich
deutlich zwischen den Gattungen. Sie ist zwei Stunden bei Mäusen,
sechs Stunden bei Cynomolgus-Affen, 24 Stunden bei Ratten und
etwa 48 Stunden bei Menschen. Die niedrigere Dosis von
Linomid in der vorliegenden Untersuchung (0,3 mg/kg x 2 täglich)
basiert auf Extrapolationen von Werten der Halbwertszeit und
optimaler immunomudulierenden Aktivität bei Mäusen, Ratten
und Menschen. Obgleich sich zeigte, daß die Dosis-Antwort-
Kurve von Linomid , gemeinsam mit vielen anderen
Modifikatoren biologischer Antwort, glockenförmig war, wurde auch eine
supra optimale Dosis (3 mg/kg x 2 täglich) miteinbezogen, um
mögliche direkte Auswirkungen von Linomid auf die virale
Vermehrung zu untersuchen.