DE69527640T2

DE69527640T2 - Zusammensetzungen die gemischte transferrine als wirkstoff für induktion von immunotoleranz gegen antigen enthalten

Info

Publication number: DE69527640T2
Application number: DE69527640T
Authority: DE
Inventors: Walter Pierpaoli
Original assignee: CELLENA AG EBMATINGEN; ISI SpA
Current assignee: CELLENA AG EBMATINGEN; ISI SpA
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 2003-04-24
Anticipated expiration: 2015-11-04
Also published as: WO1996014862A1; DE69527640D1; US6255278B1; AU3980595A; EP0790834A1; ATE221388T1; EP0790834B1

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Zusammensetzungen, insbesondere pharmazeutischen Zusammensetzungen, enthaltend einen Wirkstoff bzw. ein aktives Prinzip, fähig zur Regulierung der Immunreaktionen eines Wirts gegen allogene Zellen oder Gewebe oder immunkompetenter Zellen gegen einen immuninkompetenten oder immununterdrückten Wirt, insbesondere diejenigen Immunreaktionen, welche in der sogenannten Wirt gegen- Transplantat-Reaktion (HvGR, host-versus-graft-reaction) und der sogenannten Transplantat- gegen-Wirt-Reaktion (GvHR) oder Transplantatgegen-Wirt-Erkrankung (GvHD, graft- versus-host-disease) beteiligt sind, sowie Immunreaktionen, welche bei der Knochenmarkstransplantation (BMT) ins Spiel gebracht werden, d. h. wenn der Wirt mit allogenem oder xenogenem inkompatiblen Knochenmark transplantiert wird.
Vom Erfinder wurden 1978 Untersuchungsreihen begonnen, welche die Knochenmarksverpflanzungs-fördernde Aktivität von aus Knochenmark abgeleiteten Faktoren betrafen (Pierpaoli, W., et al., Transplantation 1978; 26: 456-458, und Pierpaoli W. et al., J. Clin. and Lab. Immunol. 1985; 16: 115-124). Die anfängliche Beobachtung war, daß der Überstand einer Lösung, in welcher die Knochenmarkszellen suspendiert worden waren (Knochenmarküberstand: BM-SN) eine die Verpflanzung fördernde Aktivität vorsah (Pierpaoli W., et al., Cell Immunol. 1980; 52: 62-72). Dies zeigte die Gegenwart von Faktoren, fähig zur Modifizierung des Vermögens des Knochenmarks, zur Induktion eines permanenten allogenen oder xenogenen Chimerismus in einen bestrahlten Wirt verpflanzt zu werden.
Eine umfangreiche Reihe von Experimenten zeigte ferner, daß hochmolekulargewichtige Fraktionen, die durch Ultrafiltration des aus Kaninchenmark abgeleiteten nativen BM-SM durch poröse Membranen erhalten worden waren, Mark-Regulationsfaktoren (MRF) enthielten, welche fähig waren, die gleiche Wirkung auszuüben, d. h. einen blutbildenden bzw. hämopoietischen Chimerismus quer über die H-2-Barriere im Mausmodell herbeizuführen (Pierpaoli, W., et al., Cell Immunol 1981; 57: 219-228). Allerdings werden die erhaltenen Ergebnisse nicht einfach reproduziert, zumindest quantitativ; es besteht eine beträchtliche Variabilität in den Ergebnissen, und das Vorkommen einer Sekundär-Erkrankung ist hoch. Weiterhin wurde eine Induktion von Chimerismus nicht in allen getesteten murinen H-2- Kombinationen erzielt (Pierpaoli W., et al., J. Lab. Clin. Immunol. 1985; 16: 115-124).
Noch kürzlicher ist die Abtrennung und Charakterisierung einer spezifischen Komponente aus Kaninchen-Knochenmark abgeleiteten Fraktionen, nämlich Transferrin, berichtet worden. Man geht jetzt davon aus, daß es verantwortlich für die Erleichterung von allogener und xenogener Knochenmarksverpflanzung ist, welche früher mit Kaninchen- und Rindermark abgeleiteten Fraktionen erzielt worden war (EP-A-0426924, Pierpaoli, W. et al., Cell. Immunoi 1981; 57: 219-228; und Pierpaoli, W. et al., J. Lab. Clin. Immunol. 1985; 16: 115-124). Die Behandlung von letal bestrahlten C57BL/6-Mäusen, welche mit Knochenmark aus BALB/c- Spendern transplantiert waren, mit Eisen-gesättigtem humanen Transferrin und Conalbumin führte zu einer bemerkenswert stabilen Einpflanzung, der Vermeidung von GvHD und einem dauerhaften Chimerismus in der Mehrzahl der Versuchstiere (Pierpaoli, W., et al., Cell Immunol. 1991; 134 : 225-234). Wiederum waren jedoch zusätzliche Arbeiten, die danach strebten, die Einpflanzungs-fördernde Aktivität von menschlichem Transferrin in anderen H2- inkompatiblen Mauskombinationen auszuwerten, nicht in allen Zellen ebenso erfolgreich.
Es wurde kein Effekt von humanem Transferrin in C57BL/6-Mäusen beobachtet, welche mit Mark aus C3H/He-Spendern transplantiert waren, und bei welchen Mark aus C57BL/6- Mäusen in C3H/He-Mäuse transplantiert wurde. Folglich erschien es so, daß die fördernden Effekte von Transferrin gemäß der verwendeten histogenetischen H-2-Typ-Kombination ziemlich schwankend waren, wobei der fördernde Effekt in C57BL/6-Mäusen (H-2b), transplantiert mit BALB/c (H-2d)-Mark, maximal war und in C57BL/6-Mäusen, transplantiert mit C3H/HE (H-Mark, abwesend war (Pierpaoli, W. Nat. Immun. 1992; 11: 356-365).
Wenn Knochenmark oder Plasma-abgeleitete Transferrine (Tf) tiefgreifend die Einpflanzung von allogenem oder xenogenem Knochenmark in letal bestrahlte Mäuse beeinflussen und einen dauerhaften Chimerismus hervorrufen, geht man daher jetzt davon aus, daß der beobachtete Effekt nicht von Spiegeln oder Konzentrationen von Tf und von seiner Sättigung mit Eisen abhängt, sondern vielmehr vom Zusammenpassen von Spender-Tf und Gewebe- Antigenen im immunsupprimierten und transplantierten Wirt. Die gleichzeitige Präsentation von Tf und Antigenen aus einem genetisch spezifischen Spender (Maus, Ratte, Mensch) im Verlauf der Immunrekonstitution führt in der Tat zu einem Zustand der Spender-spezifischen Unresponsivität bzw. Nicht-Antwortfähigkeit oder Toleranz, wie gezeigt durch die erworbene Unfähigkeit, eine Immunreaktion gegen das gleiche Antigen - und Tf-Spender - hervorzurufen und, nach Knochenmarktransplantation, eine Transplantat-Wirt-Konflikt-Reaktion zu initiieren. Der Anmelder geht somit gegenwärtig davon aus, daß Tf die einzigartige Fähigkeit besitzt, spezifische Allo- und Xeno-Toleranz spezifisch durch einen Mechanismus zu induzieren, welcher gegenwärtig untersucht wird. Somit würde es so scheinen, daß Tf ein Hauptelement der Selbst-Erkennung und von Immunmechanismen ist, und daß es zur Entwicklung und Beibehaltung von Selbst-Tolerenz während der Ontogenese und des Erwachsenseins beiträgt.
Und tatsächlich kann man davon ausgehen, daß der genetische Polymorphismus und die Heterogenität von humanem Serum-Transferrin möglicherweise direkt die "Immunpersönlichkeit" eines menschlichen Individuums nachahmen: siehe den Artikel mit dem Titel "The Biology of transferrin" von de Jong, G., Dijk, J. P., und Van Ejk, H. C., Clinica Chimica AC- TA, 1990, 1-46, Bd. 190.
Das EP 0 696 455 offenbart eine Transferrine enthaltende eutrophische Arznei Stoffzusammensetzung, welche zuläßt, daß die toxischen Effekte von cytotoxischen Arzneistoffen, wie Cyclosporin, gelindert oder unterdrückt werden.
Dies macht die Erfindung um so bemerkenswerter, zumal die "Despezifizierung" der Immunspezifität der Transferrine zur Verwendung bei der Induktion von Immuntoleranz in einem Empfänger-Wirt hinsichtlich Antigenen, z. B. Organen oder Knochenmark von allogener oder xenogener Natur, in einer bei weitem leichteren Weise erzielt werden kann, als es Anschein gescheint hatte. Insbesondere ist festgestellt worden, daß Transferrine, insbesondere menschliche Transferrine, welche aus Plasmagemischen erhalten wurden, die aus der Vereinigung von aus ziemlich begrenzten Individuen-Zahlen erhaltenen Plasmen resultierten, alles enthielten, was benötigt wird, um die erforderliche Toleranz in den meisten, wenn nicht allen Menschen sicherzustellen.
Gemäß der Erfindung bestehen die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Transferrine aus einem Gemisch oder "Pool" von Transferrinen (hierin nachstehend bezeichnet als "vereinigte Transferrine (pooled transferrins)" oder p-Tf), erhalten aus einer ausreichenden Anzahl von Spendern, um zu gestatten, daß die Mischung genug Vielfalt an Transferrinen enthält, welche zulassen wird, daß der Pool alle phänotypische Information enthält, welche erforderlich ist, um eine Induktion von Toleranz gegen Antigene in einem immununterdrückten Wirt zu gewährleisten, welcher eine Transplantation mit den Antigenen erhalten hat, nachdem diesem Wirt eine Menge derartiger vereinigter Transferrine verabreicht worden ist, welche effektiv zur Induzierung der Toleranz ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform hiervon, umfaßt die Erfindung die Herstellung einer biologisch aktiven Zusammensetzung, wirksam zur Regulierung der Immunreaktion eines Wirts gegen antigenische Zellen oder Gewebe eines Spenders, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Wirkstoffs, bestehend aus vereinigten bzw. gepoolten Transferrinen, erhalten aus einer ausreichenden Anzahl von Spendern, um zu erlauben, daß die vereinigten Transferrine alle phänotypische Information enthalten, welche erforderlich ist, um eine nichtspezifische Induktion von Immuntoleranz gegen Antigene eines bestimmten allogenischen Spenders in einem immununterdrückten Wirt zu gewährleisten, welcher eine Transplantation mit den Antigenen erhalten hat, nachdem diesem Wirt eine Menge von derartigen vereinigten Transferrinen verabreicht worden war, welche wirksam ist, um die immunspezifische Toleranz zu induzieren.
Mit "nicht-spezifischer Induktion" ist die Fähigkeit der vereinigten Transferrine gemeint, die immunspezifische Toleranz in unterschiedlichen Wirten zu induzieren, da es vorkommen kann, daß diese vereinigten Transferrine Transferrine des Spenders des Antigens oder eines phänotypisch hinsichtlich seiner eigenen Transferrine ähnlichen Spenders enthalten.
Wie es hierin nachstehend ersichtlich werden wird, kann die Immununterdrückung durch eine Verabreichung eines immunsuppressiven Arzneimittels an den Wirt, z. B. Cyclosporin, Prednisolon, Cyclosphosphamid, etc. . . ., oder durch Bestrahlung, erreicht werden.
Es ist festgestellt worden, daß die vollständige Zerstörung des natürlichen Immunsystems des Wirts, beispielsweise bei von Leukämie betroffenen Patienten, welche einer Knochenmark-Transplantation unterzogen werden, nicht notwendig sein muß, um die Leukämie zu heilen. Die Verwendung von chemischen Immunsuppressiva, in Verbindung mit den vereinig ten Transferrinen, in den angemessenen Verabreichungsabfolgen, wie hierin nachstehend erörtert, kann somit gegenüber einer letalen Bestrahlung zu bevorzugen sein. Bei Krebspatienten, welche bereits einer immununterdrückenden Chemotherapie unterzogen werden, muß die (allogene oder besser xenogene) Knochenmarkeinpflanzung, wo sie für passend gehalten wird, sogar nicht länger eine besondere Verabreichung eines Immunsuppressivums im Zusammenhang mit sowohl der Verabreichung der vereinigten Transferrine als auch der Transplantationsoperation der Antigene oder Gewebe erfordern. Eine teilweise oder vollständige Knochenmark-Bestrahlung, wie bevorzugt vorgeschlagen in den Transplantationsprotokollen, welche von dem Anmelder in seinen früheren Veröffentlichungen oder Patenten vorgeschlagen wurden, muß nicht länger erforderlich sein.
Vorteilhafterweise werden vereinigte Transferrine aus humanen Plasma-Pools erhalten, welche in der Blutprodukt-Industrie hergestellt werden. Derartige Plasma-Pools stammen häufig von mehreren hundert bis mehreren tausend Spendern. Vorteilhafterweise resultieren die Transferrine zur Verwendung in dieser Erfindung aus dem Aufreinigungsprodukt, welches aus Blut von mindestens 1000 Spendern erhalten wird. Somit sind Transferrin-Pools ohne weiteres verfügbar. Und tatsächlich bestehen heutzutage vereinigte Transferrine aus Blut-Derivaten, von denen angenommen wird, keine therapeutischen oder klinischen Verwendungen zu besitzen. Diese werden lediglich verworfen.
Die obenstehende Clinica Chimica Acta-Veröffentlichung sollte auch als Bezugsstelle für die Definition von Transferrinen verwendet werden. Dieser Ausdruck soll im weitem Sinne interpretiert werden. Es wird davon ausgegangen, daß Transferrine aus allen Molekülen bestehen, welche, wie tatsächlich in diesem Artikel angegeben, in derjenigen Klasse von Verbindungen eingeschlossen sind, welche insgesamt als Transferrine bezeichnet wird. Sie schließen die sogenannten apo-Transferrine, gesättigten Transferrine, Ferro-Transferrine etc. . . . ein.
Obwohl bislang keine Beziehung zwischen der genetischen Diversität der Transferrine und dem Haupt-Histokompatibilitäts-System im Menschen wirklich festgestellt worden ist, sieht der serologische Nachweis einer ausreichenden Anzahl der dominanten HLA-Antigene nichtsdestoweniger ein angemessenes Verifikationssystem dahingehend vor, ob die Plasma- Pools, aus denen die entsprechenden vereinigten Transferrine erhalten werden sollen, aus einer hinreichenden Anzahl von Spendern stammen. Zum Beispiel sollte es sich erweisen, daß ein Ausgangs-Plasma-Pool mindestens 4 serologisch bestimmbare Antigene von jeder der sogenannten HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-, HLA-D- und HLA-DR-Serien enthält. Es wird z. B. Bezug auf die Fig. 3.1, Seite 70 des Buches mit dem Titel "Medical Immunology", herausgegeben 1979 von James Irvine, Teviot Scientific Publications, Ediburgh, Großbritannien, genommen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Kombination der vereinigten Transferrine, wie obenstehend erwähnt, und mindestens eines immunsuppressiven Arzneimittels, z. B. Prednisolon, Cyclophosphamid, Cyclosporin, FK-506 oder Methotrexat, insbesondere zur Herstellung einer Assoziation von Arzneimitteln zur Verwendung in einem menschlichem Wirt unter der geeigneten Abfolge von Verabreichungen, um Immuntoleranz in dem Wirt gegen in den Wirt zu transplantierende allogene Antigene zu induzieren.
Im Falle von Organtransplantation können die anfänglichen Spender-Antigene aus dem "buffy coat" oder Leukozyten aus dem peripheren Blut des Spenders nach der Zentrifugation bestehen, enthaltend Granulozyten und Lymphozyten mit HLA-spezifischen antigenischen Markem des individuellen Spenders. Am stärksten bevorzugt erfolgt die Präsentation, d. h. Injektion der Antigene, nach einer chemischen Immununterdrückung an der Bodenlinie der endogenen Suppression von Knochenmark- und Immunzellen und Lymphozyten, und bevor die endogene Rekonstitution beginnt. Der Zustand der Immununterdrückung kann in Menschen oder Tieren durch Leukozyten-Zählungen im peripheren Blut ausgewertet werden. Offenbar werden die besten Ergebnisse erhalten, wenn die Transferrin-Verabreichung und Antigen-Präsentation gerade zu Beginn der endogenen Rekonstitution stattfinden, welche sich an die chemische Immununterdrückung anschließt. Die frühe Präsentation des Antigen-"buffy- coat" [z. B. am Tag 3 im Mausmodell der hierin nachstehend berichteten Fig. 1] zusammen mit Spender-Typ- oder Pool-Tf wird Toleranz in dem Mensch-gegen-Maus-Modell hervorrufen. Deshalb umfassen wichtige Elemente dieser Erfindung die Verwendung von vereinigten Transferrinen, erhalten aus entsprechenden Plasma-Pools, und die zeitgerechte Injektion der Spender-Antigene, was möglicherweise eine Selektion oder Deletion von reaktiven Zellen [scheinbar eine Proliferation spezifischer Suppressorzellen im Thymus] und somit spezifische Spender-Toleranz induzieren wird.
Dieselben Überlegungen treffen selbstverständlich auch auf andere Arten von Antigenen zu. Unnötig zu erwähnen, daß die Verabreichungsabfolge in jedem Fall untersuchen werden muß. Das zu verpflanzende Antigen sollte nicht zu spät nach der Immununterdrückung verabreicht werden, insbesondere wenn Antigen-reaktive Zellen bereits erneut durch den Empfanger-Wirts-Organismus hergestellt worden sind. In einem derartigen Fall wird der Empfängerwirtsorganismus nicht länger tolerant werden, sondern gegen das Antigen immunisiert werden.
Die Erfindung ist nicht auf menschliche vereinigte Transferrine beschränkt, insbesondere für die obenstehend erwähnten Anwendungen. Sie erstreckt sich auch auf vereinigte Transferrine von tierischem Ursprung, insbesondere zur Verwendung im Zusammenhang mit der Verpflanzung von xenogenen Antigenen oder Geweben, erhalten aus der gleichen Tierspezies wie die vereinigten Transferrine, sogar in den Menschen.
Extraktions-Vorgehensweisen von Transferrinen sind gutbekannt. Einige von ihnen werden im früheren Patent des Anmelders EP 0426924 oder in der hierin obenstehend bereits zitierten Clinica Chimica Acta-Publikation in Erinnerung gerufen.
Menschliche vereinigte Transferrine können z. B. erhalten werden, wie hierin nachstehend offenbart.

[A] Herstellung von Transferrin (Tf)

Ein Pool von menschlichem Plasma, eisengesättigt mit Fe³&spplus; nach Bates, G. W., et al., J. Biol. Chem. 1973, 248: 3228-32, wurde in Phosphatpuffer verdünnt und auf Hohlfasern mit einem Ausschluß von 30 000 diafiltriert, um überschüssiges Fe³&spplus; zu entfernen, eine Nacht lang bei 4ºC aufbewahrt und auf sterilen 0,45-um-Membranen filtriert. Das Reinigungsvorgehen besteht aus zwei Chromatographieschritten auf Ionenaustauschern unter Verwendung von Puffern bei geeigneter Ionenstärke und pH, um Kontaminanten, wie Albumin und Immunoglobuline, selektiv zu entfernen und somit Tf mit einer Reinheit > 95% zu eluieren. Nach Diafiltration zur Wiederherstellung physiologischer Salzbedingungen wurde die Lösung von apo- oder gesättigtem Tf gefriergetrocknet.

[B] Induktion von Transplantations-Toleranz

Die experimentellen Protokolle, welche angewandt worden sind, werden hierin nachstehend kurz in Erinnerung gerufen, bevor sie anschließend auf eine ausführlichere Weise dargestellt werden.
Prednisolon (Pr) und Cyclosphosphamid (Cy) wurden als Immununterdrückungsmittel gewählt; ihre jeweiligen Dosierungen wurden in unterschiedlichen Mausstämmen gemäß Veränderungen in ihren immunologischen Parametern eingestellt. Unter Verwendung dieses Modells wurden die ersten Anzeichen der Toleranz-induzierenden Aktivität von Tf in einleitenden Untersuchungen an der Immunantwort gegen menschliche Erythrozyten beobachtet. Es wurde festgestellt, daß eine Tf-Behandlung in immununterdrückten und Antigen-behandelten [Mäusen] die primäre und die sekundäre Immunantwort gegen humane rote Blutzellen (HRBC) inhibiert (Tabelle 1).
Da Histokompatibilitäts-Antigene vorwiegend auf Leukozyten präsentiert werden, aber nicht auf Erythrozyten, war es wichtig, zu wissen, ob eine Tf-Behandlung eine spenderspezifische Transplantations-Toleranz in Mäusen induzieren kann, welche mit "buffy coat"- Leukozyten des peripheren Blutes immunisiert worden waren. Tatsächlich wurde die Aufhebung der zellvermittelten Immunantwort gegen die Tf-Spendergewebe-Antigene mit dem Kniekehlen-Lymphknoten-Assay in chemisch immununterdrückten Mäusen, behandelt mit Tf des Spenders, gezeigt (Tablette II).
Ebenfalls wurde die Abwesenheit von Spender-spezifischer Antikörper- und Komplement-vermittelter Cytotoxizität von Mausserum gegen menschliche Lymphozyten in chemisch immununterdrückten Mäusen, behandelt mit individuellem humanen Tf oder p-Tf, durch einen Trypan-Blau-Ausschluß-Assay bestätigt (Fig. 2 und Tabelle III).
Aus den hier präsentierten Daten ist es möglich, zu ersehen, daß auch die Verabreichung von Tf aus einem menschlichen Plasma-Pool, kombiniert mit der kritisch zeitbestimmten Präsentation von individuellen spezifischen Gewebe-Antigenen, einen Zustand der immunologischen Toleranz erzeugen kann. Neben Toleranz-induzierenden Eigenschaften besitzen menschliche vereinigte Transferrine auch eine bemerkenswerte immumprotektive Aktivität durch Verhindern von Thymus-Involution und Lymphopenie und durch Erhöhen der Überlebensrate von chemisch immununterdrückten Mäusen.
Das obenstehend erwähnte Mensch-gegen-Maus-Modell und die Ergebnisse deuten auf einen deutlich umrissenen toleranzinduzierenden Effekt von humanem Transferrin durch kombinierte Verabreichungen von vereinigtem Tf und Zell-Antigenen. Individuelles Tf allein ist nicht immunsuppressiv und ist nicht in der Lage, Toleranz gegenüber menschlichen Antigenen in der Maus zu erzeugen.
Die aus den offenbarten Modellen abgeleiteten Implikationen sind offensichtlich. Derartige Transplantationssysteme sollten auf kleinere Säuger und auf den Menschen übertragbar sein. Darüber hinaus verdient das Verständnis des Mechanismus, durch den p-Tf aus Plasma- Pools Toleranz erzeugt, sicherlich intensive Untersuchungen für eine mögliche Anpassung des Modells auf eine Reihe von pathologischen Befunden, wie Krebs, Autoimmunerkrankungen, Immunschwäche-Erkrankungen (AIDS), genetischen Fehlern oder Diabetes.
Die Beschreibung wird hierin nachstehend, ohne irgendeine einschränkende Absicht, z. B. unter Bezug auf die Zeichnungen erweitert werden, worin
die Fig. 1 eine Veranschaulichung des "Mensch-gegen-Maus-Modells" des Anmelders für die Induktion spezifischer Transplantations-Toleranz ist.
Die Fig. 2 liefert den graphischen Beweis der Toleranz durch die Feststellung der Abwesenheit von spezifischer Antikörper- und Komplement-vermittelter Cytotoxizität von "tolerantem" Maus-Serum gegen humane Lymphozyten aus dem Transferrin (Tf)-Spender: Trypan- Blau-Ausschluß-Assay. Im obenstehenden "Mensch-gegen-Maus-Modell" wird immunologische Toleranz gegen individuelle menschliche Antigene in chemisch immununterdrückten Mäusen mit Transferrinen (entweder einzeln oder vereinigte) und individuellen Spender- Leukozyten induziert.

1) Vergleich der Effekte von INDIVIDUELLEMo Tf und von vereinigten Tf auf die primäre und die sekundäre Immunantwort gegen menschliche rote Blutzellen (HRBC)o in chemisch immununterdrückten Mäusen (Ergebnisse aus acht ähnlichen Experimenten)

Sowohl die individuellen Tf als auch die HRBC stammten aus den gleichen menschlichen Spendern. Der Hämagglutinations-Test, der angewandt wurde, wird hier später beschrieben.
Die Grundregel besteht darin, daß spezifische zweiwertige Antikörper an Antigene binden, welche auf den im Test befindlichen roten Zellen vorhanden sind, wodurch verursacht wird, daß diese agglutinieren.
Die primäre Immunantwort (IR) gegen menschliche rote Blutzellen (HBRC) wurde 7 Tage nach der ersten Immunisierung mit (0,2 ml 10% roter Zell-Suspension oder 0,2 ml Vollblut aus Tfs-Spender, intraperitoneal) bestimmt; die zweite IR wurde 5 Tage nach der zweiten Immunisierung mit dem gleichen Antigen bestimmt.
Das Mäuseblut wurde getrennt aus jeder Maus unter Verwendung eines einzelnen Einstichs, der Mandibular-Vene oder nach Enthauptung aufgefangen. Das Blutserum wurde durch Zentrifugation (1 500 U/min, 10 min) aufgetrennt und bei -70ºC bis zum Assay aufbewahrt. Am Testtag wurde das Mausserum durch Erwärmen in einem Wasserbad (56ºC, 30 min) inaktiviert. Es wurden 96-Vertierungs-Gewebekulturplatten mit V-förmigen Boden zur Bestimmung des Serum-Antikörper-Titers gegen HRBC, welche zur Immunisierung der Mäuse verwendet wurden, benutzt.

Serum-Verdünnung

Kochsalzlösung wurde in die Vertiefungen der Platte (50 ul in jede Vertiefung) ausgeteilt. Für jede Probe wurden 50 ul des in Untersuchung befindlichen Serums in die erste Vertiefung zugesetzt und vermischt. 50 ul dieses Gemischs wurden in die zweite Vertiefung übertragen, vermischt und auf identische Weise in die nächsten Vertiefungen übertragen. So wurde das Serum jeder Probe um 2-, 4-, 8-, 16- . . . 4096-fache verdünnt. Die Serumverdünnungen wurden ausgedrückt als -log2 Antikörpertiter (1, 2, 3, 4, . . . 12).
Nach Zusetzen von 50 ul der 2%igen HRBC-Suspension in jede Vertiefung wurde die Mischung in einem Thermostat (37ºC, 1 Stunde) inkubiert; danach war die Platte bereit zur Ablesung. Für jedes individuelle Serum wurde das Ergebnis als die letzte maximale Verdünnung des Serums bestimmt, bei welcher HBRC-Agglutination beobachtet wurde.
Die Ergebnisse dieses Agglutinations-Test, wie angewandt auf die obenstehend erwähnten vergleichenden Daten, belegen, daß die vereinigten Transferrine im wesentlichen den gleichen Effekt wie die Individuellen ausübten.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle I wiedergegeben. Tabelle I Der Effekt von Tf (individuello oder vereinigt) auf die primäre und sekundäre Immunantwort gegen humane rote Blutzellen (HRBC)o in chemisch immununterdrückten Mäusen. Ergebnisse aus acht ähnlichen Experimenten
* p < 0,001 gegenüber Gr. 1, 2; ** p < 0,2 gegenüber Gr. 1, 2
IS - Immunsuppression, Tf - Transferrin;
n - Anzahl von Mäusen pro Gruppe, HSA - humanes Serumalbumin
o individuelles Tfund HRBC wurden aus derselben Person erhalten

2] Effekt von Tf (individuell oder vereinigt) auf die Hypersensitivitäts-Antwort vom verzögerten Typ in chemisch immununterdrückten Mäusen (Kniekehlen-Lymphknoten- Assay)

Allgemein ausgedrückt wurde die Hypersinsitivitäts-Antwort (spezifisch) vom verzögerten Typ durch den Kniekehlen- bzw. poplitealen Lymphknoten-Test (PLNT) wie folgend untersucht.
Der PLNT wird an Mäusen durchgeführt, welche zuvor mit Geweben-Antigenen des Tf- Spenders immunisiert wurden. Am Testtag erhalten alle Mäuse eine Injektion in den rechten hinteren Fußballen mit 5 · 10 "buffy-coaf"-Leukozyten aus einem Tf-Spender in 25 ul und die gleiche Anzahl von Leukozyten aus einem unverwandten Spender in den linken hinteren Fußballen. Die Mäuse wurden 8 Tage später getötet. Die poplitealen Lymphknoten wurden isoliert und ihr Naßgewicht wurde aufgezeichnet. Das Fehlen eines Anwachsens des rechten Lymphknotens in mit Transferrin behandelten Mäusen drückt die Aufhebung der zellvermittelten Immunantwort gegenüber Tf-Spender-Geweben-Antigenen, die zur Immunisierung verwendet wurden, aus.
Im Genaueren wurde der Test wie folgend durchgeführt.
Mäuse wurde chemisch immununterdrückt durch i. p. Injektion von 100 mg/kg Prednisolon (Pr) und 50 mg/kg Cyclophosphamid (Cy) am Tag 0. Am Tag 1 wurden 100 mg/kg Cy erneut i. p. injiziert. Drei Wochen nach der Behandlung wurden die Mäuse erneut gemäß dem gleichen Schema mit 75 mg/kg Pr und 50 mg/kg Cy und wiederum um 100 mg/kg Cy behandelt. 4 Wochen nach der zweiten immununterdrückenden Behandlung erhielten die Mäuse eine Injektion mit denselben Mengen an Pr und Cy wie in der zweiten Runde. Nach jeder immununterdrückenden Behandlung wurden die Mäuse der Gruppen 1 und 2 vom Tag 3 bis zum Tag 5 i. p. mit einer täglichen Injektion von spenderspezifischen V. L. oder Pool-Tf¹, 200 ug/0,5 ml in jede Maus, behandelt. Die Kontrollgruppe 3 erhielt eine Injektion mit der gleichen Menge an humanem Serumalbumin (HSA). Die Gruppe 4 (nur immununterdrückt) wurde ähnlich wie die Gruppe 5 (unversehrte Mäuse) ohne Behandlung gelassen. Am Tag 66 und 73 nach Beginn des Experimentes wurden alle Mäuse zweimal i. p. mit V. L.-Antigenen, nämlich 0,5 · 10&sup6; V. L.-buffy-coat-Leukozyten aus peripherem Blut in 0,3 ml und 0,2 ml V. L. 10% Erythrozyten-Suspension in Kochsalzlösung, immunisiert. Die Mäuse wurden erneut während drei Tagen nach der Immunisierung, bei der oben angegebenen täglichen Dosis, i. p. mit Tf oder HSA behandelt (oder unbehandelt gelassen, Gruppen 4 und 5). Der popliteale Lymphknoten-Test (PLNT) wurde am Tag 95 nach dem Beginn durchgeführt, indem alle Mäuse eine Injektion in den rechten hinteren Fußballen mit 5 · 10&sup5; V. L.-buffy-coat- Leukozyten in 25 ul und der gleichen Anzahl von Leukozyten aus einem unverwandten Spender in den linken hinteren Fußballen erhielten. Die Mäuse wurden acht Tage später getötet, und die Gewichte der poplitealen bzw. Kniekehlen-Lymphknoten wurden aufgezeichnet. Das Fehlen eines Anwachsens des rechten Lymphknotens in der Gruppe 1 (TfV. L.) und in Gruppe 2 (Tf-Pool) drückt die Aufhebung der zellvermittelten Immunantwort gegen V. L.-Gewebe- Antigene (Transplantations-Toleranz) aus. Es kann bemerkt werden, daß auch der Tf-Pool die Reaktion gegenüber einem Dritt-Partei-Antigen verringert (Gruppe 2, linker Kniekehlen- Lmyphknoten).
Die Ergebnisse sind in der Tabelle II präsentiert. Tabelle II Induktion von spenderspezifischer Transplantationstoleranz in chemisch immununterdrückten (IS) und Transferrin (Tf)-behandelten Mäusen (Kniekehlen-Lymphknoten- Test - PLNT)
* p < 0,02 gegenüber Gr. 2,4; p < 0,05 gegenüber Gr. 3
** p < 0,01 gegenüber Gr. 4

Antikörper- und Komplement-vermittelter Zytotoxizitäts-Test auf Toleranz

Trypan-Blau-Ausschluß-Assay

Der Assay besteht aus dem Testen der Durchlässigkeit von Zellen nach ihrer Inkubation mit Antikörper und Komplement. Wenn zytotoxische Antikörper an die Membranen von Zielzellen binden, wird Komplement fixiert und die Zell-Permeabilität nimmt zu. Er wird angewandt, um die Zell-Permeabilität oder den "Tod" durch Zusetzen einer Lösung von Trypan- Blau zu untersuchen, welche in tote Zellen eindringt, aber lebensfähige Zellen ungefärbt läßt.
Humane Spender-Lymphozyten wurden unter Verwendung von Histopaque 1070 (Sigma, U. S. A.) isoliert und bei einer Konzentration von 6-8 · 10/ml resuspendiert.
Balb/c-Mäuse wurden durch i. p. 90 mg/kg Prednisolon (Pr) und 100 mg/kg Cyclophosphamid (Cy) am Tag 0 chemisch immununterdrückt. Am Tag 1 wurden erneut 100 mg/kg Cy i. p. injiziert, mit einer täglichen Injektion von W. P.-Tf (Gruppe 1) oder Tf aus menschli chem Plasma-Pool (Gruppe 2), und zwar 200 ul/0,5 ml in jede Maus. W. P. sind die Initialen des Namens und Vornamens der Personen, aus denen die Antigene und/oder individuelle spenderspezifische Tf abgeleitet werden.
Die Mäuse aller Gruppen wurden zweimal i. p. mit W. P.-Antigenen (Ag) immunisiert, nämlich 1,5 · 10 W. P.-"buffy coat"-Leukozyten des peripheren Blutes in 0,3 ml am Tag 3 und Tag 16. Die Mäuse wurde am Tage 31 des Experimentes getötet, das Serum aus allen Mäusen wurde aufgefangen, und der Trypen-Blau-Ausschluß-Assay wurde durchgeführt.
Am Tag des Assays wurde das Serum aus jeder Maus durch 30 Minuten langes Erhitzen auf 56ºC komplement-inaktiviert. Proben von Mausserum wurden in 25 ul Volumen ausgeteilt. Ein gleiches Volumen an humaner Lymphozyten-Suspension wurde in jedes Röhrchen zugesetzt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurden 50 ul Kaninchen-Komplement (Sigma, USA) zu jeder Probe zugesetzt, und die Inkubation wurde 10 Minuten lang bei 37ºC ausgeführt. Es wurden Kontrollen angesetzt, welche normales Mausserum oder Kochsalzlösung verwendeten, um sicherzustellen, daß das Komplement nicht-toxisch ist.
Nach Zentrifugation (2000 U/min, 5 min) wurde das Überstand-Fluid aus jedem Röhrchen entfernt, wobei die Zellen am Boden ungestört gelassen wurden, und die Röhrchen wurden in das Eis getaucht. 25 ul Trypan-Blau-Lösung (Sigma, USA) wurden in jedes Röhrchen zugesetzt, und der Anteil gefärbter Zellen wurde unter Anwendung von Lichtmikroskopie (Zeiss, Deutschland) und einer Gorjaev'schen Kammer (modifizierte Neubauer-Kammer) gezählt.
Die Ergebnisse sind in der hier folgenden Tabelle in angegeben. Sie werden ebenfalls graphisch in der Fig. 2 dargestellt. Tabelle III Komplement-vermittelte Zytotoxizität von Maus-Serum gegenüber menschlichen Lymphozyten in chemisch immunsupprimierten (IS) Mäusen, behandelt mit menschlichem individuellen oder vereinigten Transferrin (Tf) Trypan-Blau-Ausschluß-Assay
* -p < 0,05 geg. Gr. 3; ºp < 0,001 geg. Gr. 1 (Lymph. von Tf-Spender); oop < 0,01 geg. Gr. 3 n = 5 in jeder Gruppe

4] Modell für Knochenmark-Transplantation (BMT)

Die Einpflanzung von Ratten-Knochenmark (BM) und spenderspezifischer (Ratte) hämopoietischer Chimärismus werden in letal bestrahlten Mäusen durch die vereinigte Verabreichung von aus dem Spender abgeleitetem (Ratten) BM und Transferrin (Tf) erreicht.
Balb/c-Mäuse wurden mit 850 rad TBI; C57Bl/6-Mäuse mit 950 rad bestrahlt. Etwa 24 Stunden nach der TBI (Tag 1) und eine Stunde vor BM-Injektion erhielten die Mäuse eine i. v. oder i. p. Injektion mit 100 bis 200 ug Albumin (Kontrollen) oder eisengesättigtem menschlichen oder Ratten-Transferrin. Sie erhielten wiederum eine i. p. Injektion mit der gleichen Dosis am Tag 2 oder 3 nach der TBI. Alle Mäuse wurden eine Stunde nach der anfänglichen Transferrin-Behandlung mit 12 bis 15 Millionen Ratten-BM-Zellen inokuliert, abgeleitet aus dem ursprünglichen Suspensionsmedium und resuspendiert in 0,5 ml, 25 Stunden nach der TBI (total body irradiation) bzw. Gesamtkörperbestrahlung.
Ein permanenter und vollständiger Chimerismus wurde in allen überlebenden Mäusen durch das Vorhandensein von Alkalische-Phosphatase-positiven (Ratten)-Granulozyten in peripherem Blut, einer vollständigen Nicht-Antwortfähigkeit (keine Antikörperbildung) gegen Spender-Ratten-Erythrozyten (primäre und Gedächtnisantwort) und, in ausgewählten Gruppen, dem Unvermögen zur Abstoßung xenogener Hauttransplantate von den BM-(Ratten- )Spendern überprüft (Fig. 1).
* - eisengesättigt, Sigma, St. Louis, USA.
** - eisengesättigt, aus Plasma von BM-Ratten-Spendern (Inzucht) Rii/2., Sciavo Inc. Siena, Italien; HSA: Humanes Serumalbumin, SA: Ratten-Serum-Albumin.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV Modell für Knochenmarktransplantation (BMT) Einpflanzung von Ratten-Knochenmark (BM) und Spender-spezifischer (Ratte) hämopoietischer Chimerismus werden in letal bestrahlten Mäusen durch die kombinierte Verabreichung von Spender-abgeleiteten (Ratten-)BM und Transferrin (Tf) erzielt
a) Tf aus Plasma-Pool (Sigma)
b) Ratten-Tf aus Plasma des BM-Spenders (SCLAVO)
Die gemäß der Erfindung hergestellten Zusammensetzungen sind geeignet zur Anwendung auf vielen Gebieten, von denen einige bereits früher angegeben worden sind. Diese Zusammensetzungen sind insbesondere für die Behandlung der folgenden Erkrankungs-Klassen geeignet, bei denen sämtlich eine in vivo Knochenmark-Transplantation vorteilhaft wäre:
Aplastische Anämie; Agranulocystose; Thalassämie; Immunschwäche-Erkrankungen (AIDS, Agammaglobulinämie etc.); Leukämien (myeloblastische, lymphoblastische, erythroblastische, etc.); Myelome; feste Tumoren, Karzinome, Adenokarzinome; genetische Krankheiten;
Organtransplantation. Eine weitere große Gruppe von Therapien kann Nutzen aus der Erfindung ziehen, z. B.: aus Menschen oder Tieren (Schwein, Affe, etc.) (Akzeptanz von Leber, Herz, Nieren ohne Abstoßungsreaktion).
Langerhans-Inseln für die Behandlung von Diabetes.
Wann immer erforderlich, kann der Patient an die Immunakzeptanz eines Organs oder Gewebes aus einem anderen Wirt durch vorhergehende Transplantation von Knochenmark aus dem Wirt, aus dem auch das Organ oder Gewebe bereitgestellt werden soll, vorkonditioniert werden.
Siehe auch die allgemeinen Hinweise, angegeben von Gluckman, E., in seinem Artikel mit dem Titel "Bilan actuel de la greffe de moelle osseuse allogenique" (allgemeiner Überblick über die Transplantation von allogenem Knochenmark), veröffentlicht in Path. Biol. 1980, 28, Nr. 1, 5-7. Diese Hinweise sind auch hier anwendbar.
Die Erfindung findet vorzugsweise Anwendung bei der Transplantation von allogenem (histoinkompatiblem nicht-HLA-passendem) BMT, wodurch die mit dem Auffinden eines Spenders verbundenen Schwierigkeiten zu einem großen Ausmaß umgangen werden sollten. Die Erfindung ist nicht auf Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Transplantation von lediglich allogenem BMT beschränkt. Ihre Anwendung ist in jedem System in Betracht zu ziehen, das auf die Erleichterung der Verpflanzung eines jeden Typs von Knochenmark in irgendeinen Typ von Säuger, einschließlich Menschen, abzielt.
Obwohl der Weg der Verabreichung der Zusammensetzung der Erfindung und dessen Kopplung mit den Schritten, beteiligend Unterdrückung oder Suppression des endogenen Immunsystems im Wirt, der die Transplantation mit allogenen oder xenogenen Knochenmark erhalten soll, den Ärzten überlassen werden sollte, bleibt es nichtsdestoweniger zu bemerken, daß veranlaßt werden sollte, daß die obengenannte Unterdrückung oder Suppression normalerweise vor der Transplantation stattfindet.
Bemerkenswert ist die Tatsache, daß eine chemische Immunsuppression des Empfänger- Wirts vor der Transplantierung des Knochenmarks oder eines anderen Antigens oder Gewebes, das zu transplantieren ist, im allgemeinen genügend sein sollte. Was in den meisten Fällen erforderlich ist, ist die Induktion einer Toleranz gegen die allogenischen oder sogar xenogenischen Antigene. Eine vollständige vorausgehende Zerstörung des eigenen Immunsystems des Empfänger-Wirts erscheint nicht als notwendig. Die zur Induzierung von Immunsuppres sion in dem Wirt verwendeten Systeme können aber auch chemische Immunsuppression mit einer mehr oder weniger begrenzten Bestrahlung, z. B. lediglich der Lymphorgane, kombinieren, um große Strahlungsschäden (Lunge, Darm, etc.) zu vermeiden. Jedwedes cytostatische Arzneimittel oder immununterdrückende Arzneimittel, z. B. Cyclosporin, Prednisolon, FK-506, kann allein oder in Kombination mit einer Bestrahlung verabreicht werden, um den Empfänger für den Transfer von Knochenmark zu konditionieren.
Ebensowenig sind die Anwendungen der Zusammensetzungen der Erfindung auf die Transplantation nur von Knochenmark eingeschränkt. Sie werden anwendbar, wann immer ein Transfer eines neuen immunologischen Systems in den behandelten Wirt erforderlich ist, z. B. zur Induzierung der Abstoßung von Leukämiezellen, festen Tumoren durch den Wirt. Eine andere wichtige Anwendung der Erfindung besteht bei der xenogenen (Interspezies-)BMT, beispielsweise wenn der Spender des Knochenmarks und der Organe (Leber, Herz, Nieren) ein Schwein oder ein Primat (Affen) ist und der Empfänger ein Mensch ist.
Alternativen in den Zeitpunkten, zu welchen die Transferrin-Pools zu verabreichen sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Sie können auch an den Spender vor dem Transfer seines Knochenmarks an den Empfänger verabreicht werden. Wiederholte anschließende Verabreichungen der Transferrin-Pools begünstigen jedoch wahrscheinlich die Verpflanzungs- Kapazität des Knochenmarks oder anderer Organe oder Gewebe in den Empfänger, um die gegen das verpflanzte Knochenmark und Organe oder Gewebe von allogenem oder xenogenem Ursprung induzierte Toleranz zu verstärken.
Vereinigte Transferrine können auch zu Knochenmark-Kulturen zugesetzt werden, um das Spender-Knochenmark in vitro während variabler Zeitdauern (Stunden oder Tage) vor seiner Inokulation in den Empfänger zu präinkubieren. Diese Vorgehensweise kann die Verpflanzungs-Kapazität des Spender-Knochenmarks verändern und/oder verbessern und die Induktion von GvHD-freiem Chimerismus fördern.
Die gemäß der Erfindung hergestellten Zusammensetzungen können auf jedwedem Weg verabreicht werden, der normalerweise angewandt wird, um die Nicht-Antwortfähigkeit des Wirts gegenüber fremden (allogenen oder xenogenen) Knochenmark und/oder Organen zu verstärken. Obwohl orale oder rektale Wege in Betracht gezogen werden können, bleiben die bevorzugten Wege die parenteralen Wege (intravenöse oder intramuskuläre Injektionen).
Obwohl dies keinesfalls in irgendeiner einschränkenden Weise ausgelegt werden sollte, sollten die täglichen Dosierungen von vereinigten Transferrinen an den Wirt, nachdem die Verpflanzung von Knochenmark und/oder Organen, welche verpflanzt werden sollen, erreicht worden ist, normalerweise im Bereich von etwa 5 · 10&sup6; mM pro kg Körpergewicht des Wirtes liegen. Die Behandlungen dieses Typs sollten normalerweise 10 bis 30 Tage nach der Verpflanzung dauern.
Allerdings kann der Behandlung mit den vereinigten Transferrinen auch Tage, Wochen oder Monate nach der Transplantation von Knochenmark allein oder in Kombination mit immununterdrückenden Arzneimitteln, wie z. B. Cyclophosphamid, Cyclosporin, FK-506, Methotrexat, in all denjenigen Fällen nachgekommen werden, in denen das Transplantat- behandelte Individuum Zeichen oder Symptome eines schlecht-funktionierenden hämopietischen Systems (Anämie, Leukopenie, Thrombozytopenie oder Transplantat-Wirt-Konflikt- Erkrankung) und/oder immunologische Schwächen bzw. Mängel (parasitäre, virale oder bakterielle Infektionen) aufzeigt.
Es sollte letztlich betont werden, daß die Erfindung nicht auf die Anwendung zur Herstellung der obenstehend genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen aus den natürlichen vereinigten Transferrinen von natürlichem Ursprung, wie hier obenstehend im wesentlichen in Betracht gezogen, beschränkt ist.
Die Wirkstoffe dieser Zusammensetzungen können auch aus Mischungen oder, hinreichenderweise, einer Mischung von gentechnisch erzeugten Transferrinen bestehen, zum Beispiel den Expressionsprodukten in passenden Wirtszellen von einer Mischung der cDNAs (oder von Fragmenten der cDNAs), die erhalten werden aus entsprechenden Mischungen von RNAs, ihrerseits beispielsweise gewonnen aus natürlichen Lymphozyten, welche aus natürlichen Plasma-Pools erhalten wurden.

Claims

1. Verwendung von Transferrinen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche bei Verabreichung an einen immununterdrückten Empfänger-Säugerwirt, der eine Transplantation mit immunologisch unverwandten Antigenen erhalten soll, effektiv zur Induzierung einer immunspezifischen Toleranz in dem Empfängerwirt gegenüber den Antigenen sind, wobei die Antigene und die Transferrine aus untereinander allogenen Wirten stammen, und die Transferrine aus vereinigten Transferrinen bestehen, erhältlich aus einer ausreichenden Zahl von Spendern, damit ermöglicht wird, daß die vereinigten Transferrine die phänotypische Information des aus dem Spender der Antigene erhältlichen Transferrins enthalten, welche benötigt wird, um die Induktion einer immunspezifischen Toleranz gegen das antigene Gewebe in dem immununterdrückten Wirt bei Verabreichung an diesen sicherzustellen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die vereinigten Transferrine menschliche vereinigte Transferrine sind.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei Transferrine aus einem Plasma-Pool erhalten worden sind, enthaltend mindestens vier serologisch bestimmbare Antigene aus jeder der Serien HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D und HLA-DR.

4. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Empfängerwirt xenogen im Verhältnis zu den Spendern der vereinigten Transferrine und der Antigene ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verabreichung an einen immununterdrückten menschlichen Empfängerwirt, wobei die Transferrine und die Antigene von tierischer Herkunft sind.

6. Verwendung von vereinigten Transferrinen und eines immunsuppressiven Arzneimittels, wie Prednisolon, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Methotrexat oder FK-506, zur Herstellung einer Assoziation von Arzneimitteln zur Induzierung von Immuntoleranz in einem Wirt gegen allogene Antigene, die in den Wirt transplantiert werden sollen, wobei die vereinigten Transferrine erhältlich sind aus einer ausreichenden Zahl von Spendern, damit ermöglicht wird, daß die vereinigten Transferrine die phänotypische Information des aus dem Spender der Antigene erhältlichen Transferrins enthalten, welche benötigt wird, um die Induktion einer immunspezifischen Toleranz gegen das antigene Gewebe in einem immununterdrückten Wirt bei Verabreichung an diesen sicherzustellen.