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Diese Erfindung bezieht sich auf monoklonale Antikörper
und ihre Verwendung.
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Ein Hauptziel in der Immunologie ist es, Mittel zum
selektiven Aufheben des Potentials von Individuen im
Hinblick auf die Errichtung einer Immunantwort auf
bestimmte Antigene unter Bewahrung der Empfänglichkeit
gegenüber anderen zur Verfügung zu stellen. Die
Möglichkeit, derartige spezifische immunologische
Unempfänglichkeit in einem Erwachsenen zu induzieren,
würde größere Folgen im Hinblick auf
Gewebetransplantation, Allergiekontrolle und Behandlung
von Autoimmunerkrankung haben.
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Es ist gezeigt worden, daß Immununterdrückungssysteme,
wie beispielsweise Bestrahlung, Ahtilymphocytenglobulin
oder Toraxkanaldrainage den Toleranzbeginn erleichtern
können. In diesem Zusammenhang wird auf die
Veröffentlichungen von W.O. Wiegle, Adv. immun., 16,
61-121 (1973) und von G.R. Shellam, Immunology, 17,
267-270 (1969) Bezug genommen.
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Über die Herstellung monoklonaler Ratten-Antikörper, die
als YTS 191.1 bezeichnet werden, die gegen das L3T4
(CD4)-Molekül auf T-Helferzellen von Mäusen gerichtet
sind, ist von S.P. Cobbold et al, Nature, 312, 548-551
(1984) berichtet worden. Darüber hinaus haben
D.P. Dialynas et al die Eigenschaft monoklonaler Ratten-
Antikörper, die als GK 1.5 bezeichnet sind, die auch gegen
das L3T4-Molekül auf T-Helferzellen gerichtet sind, in J.
Immun., 131, 2445-2451 (1983) und in Immun. Rev. 47, 29-56
(1983) beschrieben. L3T4-Molekül ist die dem Maus-CD4-
Molekül gegebene Bezeichnung. Es gibt ein Molekül der CD4-
Art auf T-Helferzellen in allen Säugerarten. Die
Behandlung von Mäusen mit derartigen monoklonalen
Antikörpern führt zu einer raschen Verminderung der T-
Helferzellen aus dem Blut und lymphoiden Geweben mit
anschließender Immununterdrückung eines Bereiches von
Immunfunktionen. Über diese zuletzt genannte Arbeit ist
von S.P. Cobbold et al, loc cit, und D.C. Wofsy et al,
J. Immun., 135, 1698-1701 (1985) berichtet worden. In
dieser veröffentlichten Arbeit sind die Langzeitwirkungen
derartiger monoklonaler Antikörper untersucht worden.
D.C. Wofsy et al, loc cit, haben weiterhin berichtet, daß
Tiere mit vermindertem L3T4 darin versagen, auf eine
Immunisierung mit Proteinantigenen zu reagieren.
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Ranges et al, J. Exp. Med., 162, 1105-1110 (1985),
berichteten von Experimenten, wobei festgestellt wurde,
daß die Behandlung mit einem Anti-L3T4-monoklonalen
Antikörper das Vorkommen von Typ II-Kollagen-induzierter
Arthritis in Mäusen beträchtlich verringerte und den
Beginn von Typ II-Kollagen-induzierter Arthritis in Mäusen
verzögerte. Diese Wirkung scheint aus dem induzierten
Verlust des Immunsystems (Immununterdrückung) zu
resultieren.
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Waldor et al, Science, 227, 415-417 (1985), offenbart,
daß die Verabreichung eines Anti-L3T4-monoklonalen
Antikörpers die Entwicklung allergischer Encephalomyelitis
in Mäusen verhinderte. Wiederum scheint es sich bei dieser
Wirkung um einen allgemeinen Immununterdrückungseffekt zu
handeln.
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EP-A-0 118 794 (Ortho) bezieht sich auf die Herstellung
eines Hybridoms, welches monoklonale Antikörper gegen
OKT4-Antigen auf normalen peripheralen Helfer-T-Ze1len
ausscheidet. Es wird unter anderem vorgeschlagen, daß der
monoklonale Antikörper für die Behandlung von
Autoimmunkrankheit, welche durch überschüssige Helfer-T-
Zellen erzeugt ist, verwendet werden kann. Wiederum
handelt es sich bei diesem Effekt deutlich um einen
Immununterdrückungseffekt, der durch Eliminierung von
Helfer-T-Zellen erzeugt ist.
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Wir haben jetzt überraschenderweise festgestellt, daß
bestimmte Autoimmunkrankheiten in Säugern günstig auf
Kurzzeitbehandlung mit monoklonalen Antikörpern zu dem
CD4-Molekül auf Helfer-T-Zellen reagieren.
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Darüber hinaus haben wir überraschenderweise festgestellt,
daß bestimmte Klassen monoklonaler Antikörper Toleranz
gegenüber einem primären Antigen erzeugen können. Wenn
Säuger, wie beispielsweise Mäuse, einem Primärantigen-
Aussetzungstest während oder kurz vor einer kurzen Dauer
einer Anti-CD4-Therapie ausgesetzt werden, dann entwickelt
das behandelte Subjekt Toleranz gegenüber dem primären
Antigen, nachdem die Anti-CD4-Therapie beendet worden ist,
wenn der Expositionstest mit dem primären Antigen
wiederholt wird.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung
eines monoklonalen Antikörpers, der gegen das CD4-Antigen
auf T-Helfer-Lymphocyten gerichtet ist, für die
Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines
Säugers für die Induzierung von Toleranz in dem Säuger
gegenüber einem primären Antigen, wobei die Behandlung
umfaßt: Verabreichen einer ausreichenden Menge des
Medikaments an den Säuger, wodurch die Population der T-
Helfer-Lymphocyten in dem Säuger beträchtlich verringert
wird, Exposition des Säugers mit dem primären Antigen und
Ermöglichen, daß die Population der T-Helfer-Lymphocyten
in dem Säuger sich selbst in Anwesenheit des primären
Antigens erneuert, so daß Toleranz gegenüber dem primären
Antigen erzielt wird.
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Die Dauer zwischen der Exposition mit dem Antigen und dem
Beginn der Antikörperbehandlung sollte nicht derart sein,
daß dem Säuger ermöglicht wird, eine starke Immunantwort
zu entwickeln, und sollte vorzugsweise 5 Tage nicht
überschreiten.
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Als Beispiele von Säugern können Mäuse, Katzen, Hunde,
Pferde, Kühe und der Mensch genannt werden.
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Die Menge der verabreichten Anti-CD4-monoklonalen
Antikörper sollte ausreichend für eine signifikante
Verminderung der Säuger-Helfer-T-Zellen-Population sein.
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Bei der Behandlung eines Säugers mit Anti-CD4-monoklonalem
Antikörper wird die Behandlung üblicherweise so
ausgeführt, daß die Population der Helfer-T-Lymphocyten
auf weniger als etwa 20%, und vorzugsweise auf weniger
als etwa 10% ihres normalen Niveaus verringert wird. Bei
Mäusen kann eine derartige Verminderung der Population der
Helfer-T-Lymphocyten beispielsweise durch Verabreichung
der Antikörper in einer Dosierungsserie, von denen jede
etwa die Größenordnung von etwa 20 mg Antikörper pro kg
Körpergewicht aufweist, erzielt werden. Die Verabreichung
des Antikörpers kann durch intravenöse oder
intraperitoneale Injektion in einer oder mehreren
Dosierungen durchgeführt werden.
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Eine ausreichende Menge an Antikörper wird in einer oder
mehreren Dosierungen dem Säuger verabreicht, wodurch
bewirkt wird, daß dessen Population an Helfer-T-
Lymphocyten während einer begrenzten Dauer vermindert
wird. Allgemein ausgedrückt bedeutet dies, daß diese
begrenzte Dauer mindestens 1 Tag sein sollte, aber etwa 14
Tage nicht überschreiten sollte. Es reicht normalerweise
aus, so scheinen es unsere Experimente zu ergeben, den
Antikörper während einer Dauer von 1 bis etwa 7 Tagen,
beispielsweise 3 Tagen, zu verabreichen.
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Zweckdienlicherweise werden die Antikörperdosierungen so
ausgewählt, daß die gewünschte Verringerung der Helfer-T-
Lymphocyten durch tägliche Injektionen erhalten wird.
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Während eine spezifische Population von T-Lymphocyten in
dem Säuger als Ergebnis der Verabreichung des Anti-CD4-
Antikörpers verringert wird, kann ein Antigen dem Säuger
verabreicht werden. Ein derartiges Antigen kann mittels
Injektion, Inhalation, Einnahme, Transplantation oder
Implantation verabreicht werden. Es kann beispielsweise
ein Immunglobulin umfassen.
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In unseren Experimenten haben wir gezeigt, daß Mäuse,
denen ein Antigen unter dem Schutz eines Anti-L3T4 (CD4)-
Antikörpers injiziert worden ist, eine Höchstleistung der
sich als Toleranz zeigenden Wirkung beibehalten, und es
ist uns auch möglich gewesen, Toleranz in normalen
erwachsenen Mäusen mit einer immunogenen Form eines
Antigens zu induzieren.
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Im Unterschied zu anderen monoklonalen Ratten-IgG2b-
Antikörpern, die Lymphocytenpopulationen verringern,
bewirken Anti-L3T4 (CD4), wie beispielsweise YTS 191.1 und
GK1.5, welche beide monoklonale IgG2b-Ratten-Antikörper
sind, keine Antiglobulin-Antworten in vivo gemäß
S.P. Cobbold et al, Nature, 312, 548-551 (1984),
D.C. Wofsy et al, J. Immun. 135, 1698-1701 (1985) und
D. Wofsy et al, J. Exp. Med., 161, 378-391 (1985) wie auch
S.P. Cobbold et al, Adv. Exp. Med. Bio. 186, 789-795
(1985).
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Die Toleranzeigenschaften des Anti-CD4-Antikörpers haben
wichtige Bedeutungen im Hinblick auf die Serumtherapie mit
monoklonalen Antikörpern. Es wird durch die Behandlung von
Patienten mit geeigneten Anti-L3T4 (CD4)-monoklonalen
Antikörpern am Beginn einer derartigen Serumtherapie
möglich, die Antiglobulinwirkung, die üblicherweise von
dem Patientenkörper gegenüber den monoklonalen
Antikörpern, die bei einer derartigen Serumtherapie
verwendet werden, gezeigt werden, im wesentlichen zu
verringern und in einigen Fällen gänzlich zu unterdrücken.
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Wir haben auch gezeigt, daß Anti-CD4-monoklonale
Antikörper eine wichtige Rolle bei der Korrektur der
anormalen Immunantwort, die mit vielen Formen von
Autoimmunkrankheit verbunden ist, spielen. Obwohl in den
zuvor beschriebenen Arbeiten die
Immununterdrückungswirkungen von Anti-L3T4-monoklonalen
Antikörpern untersucht worden sind, wie von D. Wofsy et
al, J. Exp. Med., 161, 378-391 (1985), von M.K. Waldor et
al, Science, 227, 415-417 (1985), von G.E. Ranges et al,
J. Exp. Med., 162, 1105-1110 (1985) und von S.W. Brostoff
et al, J. Immun, 133, 1938-1942 (1985), berichtet worden
ist, und obwohl der Wert der Anti-L3T4 (CD4)-monoklonalen
Antikörper im Hinblick auf eine Verbesserung der
Autoimmunkrankheiten in Mäusen und Ratten gezeigt worden
ist, ist es überraschend, daß ein Kurzausbruch der Anti-
L3T4 (CD4)-Therapie unter Verwendung von Anti-CD4-
monoklonalen Antikörpern günstige. Langzeitwirkungen bei
der Behandlung von Autoimmunkrankheiten erzeugen kann.
Somit haben wir gezeigt, das bei sogenannten "Lupus-
Mäusen", d. h. Mäusen, die an einer Autoimmunkrankheit
leiden, die viele gleiche Symptome wie Lupus erythematodes
beim Menschen aufweist, die Symptome durch 1-wöchige
Injektion im Alter von 4 Monaten mit täglichen Dosierungen
von zwei Anti-L3T4 (CD4)-monoklonalen Antikörpern,
YTS 191.1 und YTA 3.1 (äquivalent zu 0,4 mg monoklonalem
Antikörper pro Dosis) verbessert werden. Es gab innerhalb
von 6 Monaten danach keine Todesfälle bei der behandelten
Gruppe, obwohl keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen
getroffen wurden (beispielsweise Verabreichung von
Antikörpern oder Sterilisation ihrer Umgebung), wohingegen
mindestens 80% der Kontrolltiere während dieser Zeit
gestorben waren.
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In einer anderen Serie von Experimenten haben wir gezeigt,
daß die Immunantwort von Säugern auf ein primäres Antigen
durch eine Kurzbehandlung mit Injektionen mit Anti-CD4-
monoklonalen Antikörpern, die kurz nach der ersten
Exposition mit dem Antigen begonnen worden ist,
modifiziert werden kann. Somit entwickeln Mäuse, denen
Human-γ-globulin als Primärantigen verabreicht worden ist,
Toleranz diesem gegenüber, wenn anschließend, bis zu 5
Tage später, eine Kurzzeitbehandlung mit monoklonalen
Antikörpern gegenüber dem L3T4-Molekül auf Mäuse-Helfer-T-
Lymphocyten verabreicht wird. Eine derartige
Kurzzeitbehandlung kann beispielsweise tägliche
Dosierungen während 3 bis 7 Tagen umfassen.
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Allergiereaktionen sind die Hauptbeschränkungen bei
Organtransplantaten. Diese zeigen sich als Abstoßung des
transplantierten Gewebes und auch im Falle der
Knochenmarktransplantation, Übertragung-gegen-Wirt-
Krankheit. Unter Verwendung einer kombinierten Therapie
mit CD4-Monoklonalen und CD8-Monoklonalen ist es uns
möglich geworden, Langzeittoleranz gegenüber
Hautübertragungen, die sich durch vielfache geringfügige
Transplantations-Antigene unterscheiden, zu erzeugen.
Unsere Experimente zeigen, daß die Anti-L3T4 (CD4)-
Therapie eine verlängerte Transplantat-Überlebensdauer
ergab, aber zeigten auch, daß beliebige
Toleranzinduzierung durch Anti-L3T4 (CD4) manchmal die
Hinzugabe anderer Immununterdrückungsagentien erfordert.
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Eine Vielzahl von Experimenten hat gezeigt, daß es
manchmal Situationen gibt, in denen es ungenügend ist,
monoklonale Antikörper gegen L3T4 (CD4) alleine zu
verwenden, um vollständige Immuntoleranz zu induzieren.
Dies beruht darauf, daß die L3T4 (CD4)-positiven T-Zellen
allein dafür verantwortlich sind, den B-Zellen zu helfen,
Antikörper zu erzeugen, aber andere T-Zellen, die L3T4
(CD4)-negativ sind, sind getrennt in unterschiedliche
Arten von Immunantworten verwickelt. Diese anderen T-
Zellen exprimieren auch spezifische Moleküle auf ihren
Zelloberflächen, die durch monoklonale Antikörper erkannt
werden können, insbesondere Lyt-2 (CD8) und der IL-2-
Rezeptor (CD25). Wir haben in einer Vielzahl von
Experimenten in Maus-Modellen gezeigt, daß monoklonale
Antikörper gegen Lyt-2 oder den IL-2-Rezeptor dazu
verwendet werden können, Toleranz gegenüber Protein-
Antigenen und selbst gegenüber fehlangepaßten
Gewebetransplantaten bei Verwendung in Kombination mit den
L3T4 (CD4)-monoklonalen Antikörpern zu induzieren.
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Die Erfindung wird weiterhin anhand der nachfolgenden
Beispiele beschrieben.
BEISPIEL 1
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Dieses Beispiel zeigt die Rückbildung der Immunkompetenz
nach YTS 191.1 (Anti-L3T4 (ein CD4))-Behandlung von
euthymischen Mäusen.
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In männlichen CBA/Ca-Mäusen im Alter von 8 bis 12 Wochen
wurden L3T4-positive T-Zellen durch tägliche Injektionen
an den Tagen 0 (intravenös (i.v.)), 1 und 2
(intraperitoneal (i.p.)) von YTS 191.1 als 0,2 ml
Bauchwasserflüssigkeit von (DA·LOU) F&sub1; Ratten, welche im
Hinblick auf Immunglobulin durch Fällung mit 50%-igem
gesättigten Ammoniumsulfat angereichert worden war, und
wobei dieses 0,4 mg aktivem monoklonalen Antikörper pro
Dosis entsprach, vermindert. Die Kontrollen erhielten
physiologische Kochsalzlösung gemäß dem gleichen
Protokoll. Es wurden Gruppen aus 4 Mäusen zufällig an
verschiedenen Tagen im Anschluß an die Behandlung
ausgewählt und mit 0,5 mg hitzeaggregiertem HGG iv.
immunisiert, welches aus Gruppe 0 Rhesus-positivem Serum
mittels Ammoniumsulfatfällung mit anschließender Elution
durch eine Ionenaustauschchromatografiesäule (DES 2,
Whatman) in 0,01 Natriumphosphatpuffer mit pH 8,0
gereinigt worden war, in phosphatgepufferter
physiologischer Kochsalzlösung (PBS) bei 10 mg m1R-1F
dialysiert worden war, und anschließend durch
25-minütiges Erwärmen auf 63ºC aggregiert worden war,
woran sich über Nacht Inkubation auf Eis anschloß (siehe
W.O. Weigle, Adv. Immun., 16, 61-121 (1973)). Man entnahm
den Mäusen 11 Tage nach der Immunisierung Blut aus ihren
Schwanzvenen, und die Seren wurden bei -20ºC gelagert.
Serum-Anti-HGG-Antikörper-Titer wurden mittels eines
Assays bezüglich enzymgebundenem Immunsorbens (ELISA)
folgendermaßen gemessen.
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Polyvinyl-Mikrotitrationsschalen wurden mit gereinigtem
HGG mittels 60-minütiger Inkubation von 50 ul 20 ug ml&supmin;¹
HGG in PBS pro Vertiefung bei 370 überzogen, dreimal in
PBS/0,05% (V/V) Tween 20 (Sigma) gewaschen und
anschließend über Nacht mit 1% (G/V) Rinderserumalbumin
(BSA) in PBS/0,02% (G/V) Natriumazid blockiert. Die
Schalen wurden anschließend gewaschen und verdoppelnde
Verdünnungen der Testseren in 0,1% BSA/PBS wurden zu
jeder Schale mit 50 ul pro Vertiefung gegeben und während
60 Minuten bei 20ºC inkubiert. Eine positive Kontrolle von
Peroxidase-gebundenem Kaninchen-Anti-Human-Immunglobulin
(Dako) wurde auf jede Schale titriert. Auf die Testproben
folgten mit abwechselndem Waschen artenspezifisches
biotinyliertes Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin (Amersham)
und anschließend biotinylierter Streptavidin-Meerrettich-
Peroxidase-Komplex (Amersham), beide mit einer 1 : 1000-
Verdünnung in PBS/0,1% BSA, und diese wurden mit 50 ul
pro Vertiefung 35 Minuten bei 20ºC inkubiert. Die Schalen
wurden anschließend gewaschen und 5 Minuten mit o-
Phenylendiamin (100 l pro Vertiefung) entwickelt, und die
Reaktion wurde mit 50 ul 0,5 M H&sub2;SO&sub4; pro Vertiefung
beendet. Die Absorption wurde bei 490 nm abgelesen, die
Ergebnisse wurden grafisch aufgetragen, und die Titer
wurden relativ zur positiven Kontrolle gelesen. Die Daten
sind geometrische Durchschnittswerte ± Standardabweichung
der Antikörpertiter von 4 Mäusen. Die Ergebnisse sind in
Fig. 1 zusammengefaßt. Sie zeigen, daß Mäuse, die 2 Tage
nach L3T4-Schwund hitzeaggregiertem Human-γ-Globulin (HGG)
ausgesetzt worden waren, wie erwartet, keine Primär-
Antikörperreaktion erzeugten. Jedoch zeigte die Exposition
am Tag 12 eine starke Anti-HGG-Wirkung, und am Tag 42
entsprach diese Reaktion derjenigen der unbehandelten
Kontrollen.
BEISPIEL 2
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Dieses Beispiel zeigt, daß YTS 191.1 (Anti-L3T4 (ein CD4))
keine Reaktion auf seine eigenen IgG2b-Epitope und
gleichzeitig verabreichtes hitzeaggregiertes HGG
induziert.
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Erwachsene männliche CBA/Ca-Mäuse in Gruppen von 5 wurden
mit 3 Injektionen von YTS 191.1 wie in Beispiel 1 (Gruppen
1, 4, 5) vorbehandelt oder empfingen als Kontrolle
irrelevanten IgG2b-monoklonalen Antikörper (YTH 65.3.3,
Anti-Human T200, welches mittels des Verfahrens von
C. Bindon et al, Transplantation, 40, 538-543 (1985))
erhalten worden war (Gruppen 2, 6) oder physiologische
Kochsalzlösung (Gruppen 3, 7, 8) gemäß dem gleichen
Protokoll. Den Gruppen 5, 6 und 7 wurden anschließend
i.p. an den Tagen 2 und 3 0,5 mg-Dosierungen von
hitzeaggregiertem HGG, welches wie in Beispiel 1
hergestellt worden war, injiziert. Im Anschluß an diese
Vorbehandlung wurden die Mäuse auf Antibiotika
(Oxytetracyclin 50 mgl&supmin;¹, Terramycin; Pfizer) gehalten und
waren frei von irgendeiner offenkundigen Krankheit. Am
Tage 12 wurde allen Mäusen Blut abgenommen, und die
Wirksamkeit der Anti-L3T4-Behandlung wurde durch das
Fehlen einer Antikörperwirkung gegenüber HGG bei der
Gruppe 5 im Vergleich zu den starken primären Reaktionen
in den Gruppen 6 und 7, welche mittels eines ELISA
gemessen wurden, bestätigt. An den Tagen 42 und 52 wurden
die Mäuse i.p. mit 0,5 mg der hitzeaggregierten Form von
YTH 3.2.6 (Anti-CD7-IgG2b), YTH 53.1.4 (rote Anti-Human-
Blutzelle, IgG2b) oder HGG immunisiert. YTH 3.2.6 wurde
mittels des von H. Waldmann et al, Adv. Exp. Med. Biol.,
186, 869-875 (1985) beschriebenen Verfahrens hergestellt.
YTH 3.2.6 und YTH 53.1.4 wurden aus (DA·LOUOF&sub1;) Ratten-
Bauchwasserflüssigkeit mit Hilfe von Ammoniumsulfatfällung
mit anschließender Ionenaustauschchromatografie in 0,01 M
Natriumphosphatpuffer mit pH 8,0 (DE 52, Whatman)
gereinigt und anschließend, wie zuvor beschrieben,
hitzeaggregiert. Man entnahm den Schwanzvenen der Mäuse am
Tage 58 Blut, und ihre Seren wurden bei 2000 gelagert.
Die Serumtiter des Antikörpers gegenüber dem
entsprechenden immunisierenden Ag (YTH 3.2.6, YTH 53.1.4
oder HGG) wurden mit Hilfe von ELISA wie in Beispiel 1
bestimmt. Eine Mischung aus monoklonalen Maus-Antikörpern
gegen Ratten-Immunglobulin (Norig 7.16.2, Norig 1.1.6,
beide Anti-Ratten-IgG2b, erhalten wie von N.M. Agel et al,
J. Immun. Meth., 69, 207-214 (1984) beschrieben) und
mar 18.5 (leichte Anti-Ratten-Kette, erhalten wie von
L.L. Lanier et al, Hybridoma, 1, 125-130 (1982)
beschrieben) wurde als positive Vergleichskontrolle für
die Messung der Anti-Ratten-IgG2b-Antikörperreaktionen
verwendet. Die Daten sind geometrische Durchschnittswerte
± Standardabweichung der Antikörpertiter von 5 Mäusen. Die
Ergebnisse sind in den Fig. 2(a) und (b) dargestellt. Wie
in Fig. 2(a) dargestellt, konnten bei Vorbehandlung der
Mäuse mit YTS 191.1 oder einem irrelevanten monoklonalen
Antikörper oder physiologischer Kochsalzlösung und
anschließender 42 Tage später erfolgter Immunisierung mit
jedem von zwei unterschiedlichen hitzeaggregierten IgG2b-
Monoklonalen, welche keine Bindungsaktivität im Hinblick
auf Mäusezellen aufweisen (YTH 3.2.6 und YTH 53.1.4),
keine Antiglobulinreaktionen in Anti-L3T4-behandelten
Mäusen (Gruppe 1) im Vergleich zu den Kontrollen (Gruppen
2 und 3) festgestellt werden. In ähnlicher Weise führt die
Verabreichung von HGG unter dem Schutz von Anti-L3T4 zu
späterer Unempfindlichkeit gegenüber der erneuten
Exposition mit diesem Antigen (Gruppe 5 in Fig. 2 (b)).
Mäuse, die Anti-L3T4 aber keine Anfangs-"Aufnahme"-Dosis
von HGG erhielten (Gruppe 2) reagierten, wie auch die
Kontrollen (Gruppen 6 bis 8), auf die späte HGG-
Exposition.
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Ähnliche Ergebnisse wurden mit von einem unterschiedlichen
Donor abstammendem HGG erhalten. Spätere Blutabnahmen
zeigten keine Immunreaktionen in toleranten Mäusen.
BEISPIEL 3
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Dieses Beispiel zeigt die Spezifität der Nicht-
Ansprechbarkeit gegenüber Ratten-IgG2b und HGG.
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Erwachsene männliche CBA/Ca-Mäuse wurden unempfindlich
gegenüber Ratten-IgG2b mittels YTS 191.1 (Anti-L3T4-
Antikörper)-Vorbehandlung wie bei der Gruppe 1 in
Fig. 2(a) oder gegenüber HGG mit Hilfe von Vorbehandlung
mit YTS 191.1 plus aggregiertem HGG (Anti-L3T4-Antikörper
plus HGG) wie bei der Gruppe 5 in Fig. 2(b) gemacht. An
den Tagen 42 und 52 nach Induktion der Unempfindlichkeit
sind diese Mäuse altersgleiche Kontrollen und wurden mit
0,5 mg der hitzeaggregierten Form von HGG, CGG oder
YTH 3.2.6 (Ratten-IgG2b) i.p. immunisiert, und man nahm
ihnen anschließend am Tage 58 Blut ab. Kücken-γ-Globulin
wurde von Miles Laboratories erhalten und, wie zuvor
beschrieben, hitzeaggregiert. Die Seren wurden bei -20ºC
gelagert, und die Antikörpertiter wurden mit Hilfe von
ELISA bestimmt. Die Daten sind geometrische
Durchschnittswerte ± Standardabweichung der
Antikörpertiter von 5 Mäusen. Die Ergebnisse sind in
Fig. 3 dargestellt. Sie zeigen, daß Mäuse, die gegenüber
Ratten-IgG2b durch Verabreichung von Anti-L3T4
unempfindlich gemacht worden sind, voll reaktionsfähig
gegenüber HGG- oder Kücken-γ-Globulin (CGG) blieben. Auf
ähnliche Weise reagierten Mäuse, die gegenüber HGG
unempfindlich gemacht worden waren und denen CGG unter dem
Schutz von Anti-L3T4 verabreicht worden war, normal
gegenüber CGG. Somit scheint der Zustand der
Unempfindlichkeit echte Toleranz gegenüber den
verabreichten Antigenen zu sein.
BEISPIEL 4
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Dieses Beispiel zeigt die kombinierte Verwendung von L3T4
(CD4), Lyt-2 (CD8) und IL-2 (CD25) monoklonalen Rezeptor-
Antikörpern im Hinblick auf die Erzeugung von Toleranz
gegenüber fehlangepaßten Hauttransplantaten.
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Männliche CBA/Ca-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen
erhielten Schwanzhauttransplantate von nicht
zusammenpassenden BALB/c-Mäusen zusammen mit monoklonalen
Antikörperinjektionen dreimal die Woche 4 Wochen lang. Die
ersten fünf Injektionen wurden intravenös verabreicht,
wohingegen daran anschließende Injektionen
intraperitoneal verabreicht wurden. Fig. 4 zeigt die
folgenden Gruppen: Die Kontrollgruppe 1 erhielt keinen
Antikörper; die Gruppe 2 erhielt Lyt-2 (CD8)-Antikörper
(YTS 169.4.2 + YTS 156.7.7, 25 ug pro jeweiliger
Injektion); die Gruppe 3 erhielt L3T4 (CD4)-Antikörper
(YTS 191.1.2 + YTA 3.1, jeweils 25 ug pro Injektion); die
Gruppe 4 erhielt Anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper
(YCTLD 45.1, 200 ug pro Injektion). Es ist ersichtlich,
daß keiner der Antikörper allein dazu ausreichte,
Toleranz gegenüber den Hauttransplantaten zu erzeugen,
obwohl Anti-L3T4 eine beträchtliche Verlängerung im
Hinblick auf die Überlebensdauer des Transplantats ergab.
Fig. 4(b) zeigt, daß gemeinsame Zugabe von Anti-L3T4 und
Anti-Lyt-2 (Gruppe 5) oder Anti-L3T4 Anti-IL-2-Rezeptor-
Antikörpern (Gruppe 6) (in den gleichen Dosierungen wie
zuvor beschrieben) eine stark verbesserte Überlebensdauer
des Transplantats ergab. Nur die Kombination aller drei
Arten von monoklonalen Antikörpern ermöglichte es jeder
der Mäuse, die fehlangepaßten Hauttransplantate
unbegrenzt und ohne weitere Behandlung zu behalten (Gruppe
7). Dies zeigt, daß die optimale Toleranzinduzierung
durch Anti-L3T4 (CD4-Antikörper) manchmal die Zugabe
weiterer immununterdrückender Agentien, insbesondere
anderer monoklonaler Antikörper, erforderlich macht.
BEISPIEL 5
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Das folgende Beispiel zeigt eine typische pharmazeutische
Zubereitung für die Herstellung eines Toleranzimpfstoffes
unter Verwendung von monoklonalen Toleranz-Antikörpern.
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Der Toleranzimpfstoff ist steril, pyrogenfrei und frei von
anderer anormaler Toxizität und wird in lyophilisierter
Form in sterilen Phiolen angeboten.
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Jede Phiole enthält annähernd 5 mg sterile,
gefriergetrocknete, monoklonale Toleranz-Antikörper. Die
genaue Menge der Monoklonalen wird auf jeder Phiole
angegeben.
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Der Antikörper wird aus 2 ml einer Lösung, die
Natriumchlorid (0,2 M), L-Histidin (20 mM), Sorbit
(1% G/V) und Humanserumalbumin (1% G/V) enthält,
gefriergetrocknet. Deshalb enthält jede Phiole neben dem
monoklonalen Antikörper 23,4 mg Natriumchlorid, 6,2 mg
L-Histidin und 20 mg von jeweils Sorbit und
Humanserumalbumin.
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Die Phiolen sollten bei 2 bis 8ºC bis zur
Wiedereinsetzung in einem Kühlschrank gelagert werden.
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Sie sollten so bald wie möglich nach Wiederherstellung in
2 ml Wasser für Injektionen verwendet werden.
BEISPIEL 6
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Im nachfolgenden ist eine kombinierte pharmazeutische
Formulierung der vorliegenden Erfindung, welche einen
monoklonalen Toleranz-Antikörper und einen therapeutischen
monoklonalen Antikörper umfaßt, dargestellt.
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Die Formulierung ist steril, pyrogenfrei und frei von
anormaler Toxizität und wird in lyophilisierter Form in
sterilen Phiolen angeboten.
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Die Toleranz-Antikörper (beispielsweise Anti-CD4) und der
therapeutische Antikörper (beispielsweise Anti-CD8) werden
in einer Lösung, die Natriumchlorid (0,2 M), L-Histidin
(20 mM), Sorbit (1% G/V) und Humanserumalbumin (1% G/V)
enthält, gelöst. Die Lösung wird anschließend
gefriergetrocknet.