DE69032662T2

DE69032662T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur verbesserung der symptome von sepsis

Info

Publication number: DE69032662T2
Application number: DE69032662T
Authority: DE
Inventors: John D. San Diego Ca 92124 Mathison; Peter Encinitas Ca 92024 Tobias; Richard Del Mar Ca 92014 Ulevitch; Samuel D. New York Ny 10021 Wright
Original assignee: Rockefeller University; Scripps Research Institute
Current assignee: Rockefeller University; Scripps Research Institute
Priority date: 1989-08-01
Filing date: 1990-07-30
Publication date: 1999-03-11
Anticipated expiration: 2010-07-31
Also published as: IE902770A1; GR900100582A; JPH05501399A; AU6146190A; FI920450A7; EP0485430A1; EP0485430A4; US5730980A; ES2120948T3; US6297049B1; GR1003164B; US20020034509A1; CA2022429C; DK0485430T3; US6495332B2; PT94869B; CA2022429A1; ATE171042T1; AU645515B2; EP0485430B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Verhinderung oder zur Behandlung der Sepsis. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Moleküle, welche das CD14 Monozyten-Differenzierungsantigen oder LPS-LBP Komplexe binden, wodurch das Binden der LPS-LBP Komplexe durch die CD14-exprimierenden Zellen gehemmt wird.
Sepsis ist ein krankhafter Zustand, der durch ein Toxin induziert wird, dessen Einführung oder Akkumulierung hauptsächlich durch eine Infektion oder eine Wunde hervorgerufen wird. Die anfänglichen Symptome der Sepsis umfassen Schüttelfrost, sehr starke Schweißbildung, irregulär abklingendes Fieber, Prostration und ähnliches, gefolgt von persistentem Fieber, Hypotonie, die zu einem Schock führt, Neutropenie, Leukopenie, disseminierte intravaskuläre Koagulation, adultes Atemnot-Syndrom und multiples Organversagen.
Sepsis-induzierende Toxine wurden in Zusammenhang mit pathogenen Bakterien, Viren, Pflanzen und Giften gefunden. Unter den gut beschriebenen bakteriellen Toxinen befinden sich die Endotoxine oder Lipopolysaccharide (LPS) der gramnegativen Bakterien. Diese Moleküle sind Glycolipide, die ubiquitär in der äußeren Membran aller gramnegativer Bakterien vorhanden sind. Während die chemische Struktur der meisten der LPS-Moleküle komplex und unterschiedlich ist, liegt ein gemeinsames Merkmal in der Lipid A-Region von LPS [Rietschel, E. Th. et al., in Handbook of Endotoxins, 1: 187-214, Hrsg. R. A. Proctor und E. Th. Rietschel, Elsevier, Amsterdam (1984)]. Die Erkennung von Lipid A in biologischen Systemen initiiert viele, wenn nicht alle, der pathophysiologischen Veränderungen der Sepsis. Da die Lipid A-Struktur bei allen Typen der gramnegativen Organismen in hohem Maße konserviert ist, charakterisieren gemeinsame pathophysiologische Veränderungen die gramnegative Sepsis.
Gegenwärtige Konzepte unterstützen die Behauptung, daß die primäre Reaktion des Wirtes auf LPS (einschließlich dem Menschen) die Erkennung von LPS durch Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie beinhaltet, wobei anschließend eine schnelle Verbreitung einer Vielzahl von Zellprodukten erfolgt, einschließlich der allgemeinen Gruppe, die als Cytokine bekannt sind. Andere Zelltypen, von denen angenommen wird, daß sie bei der Sepsis und insbesondere bei der Reaktion auf LPS beteiligt sind, sind polymorphonukleäre Leukozyten und Endothelzellen. Jeder von diesen Zelltypen ist bei der Reaktion auf LPS auch in der Lage, potentielle inflammatorische Substanzen herzustellen.
Von LPS wird angenommen, daß dies die primäre Ursache für den Tod bei Menschen während einer gramnegativen Sepsis ist, insbesondere wenn die Symptome das adulte Atemnot-Syndrom (ARDS) umfassen (von Deventer et al., Lancet, 1: 605 (1988); Ziegler et al., J. Infect. Dis., 136: 19-28 (1987)). Von einem bestimmten Cytokin, dem Tumornekrosefaktor Alpha/Kachectin (TNF), wurde beispielsweise vor kurzem berichtet, daß er der primäre Mediator für den septischen Schock ist (Beutler et al., N. Eng. J. Med., 316: 379 (1987)). Eine intravenöse Injektion von LPS-Endotoxin aus Bakterien in Versuchstiere sowie beim Menschen ruft eine schnelle, transiente Freisetzung von TNF hervor (Beutler et. al., J. Immunol., 135: 3972 (1985); Mathison et al., J. Clin. Invest., 81: 1925 (1988)). Der Hinweis, daß TNF ein kritischer Mediator des septischen Schocks ist, kommt primär von Experimenten, bei denen eine Vorbehandlung mit anti-TNF Antikörpern die Sterblichkeit bei Tieren herabsetzt (Beutler et al., Science, 229: 869, (1985); Mathison et al., J. Clin. Invest. 81: 1925 (1988)). Diese Berichte lassen vermuten, daß die Unterbrechung der Sekretion von TNF, die durch LPS oder andere Faktoren hervorgerufen wird, die oft lethalen Symptome der Sepsis verbessern würde.
Nach Einführung von LPS in Blut kann dieses an ein Protein binden, welches Lipopolysaccharid-Bindeproteine (LBP) genannt wird. LBP ist ein 60 kD Glycoprotein, welches in dem Serum von gesunden Tieren und Menschen in Konzentrationen von weniger als 100 ng/ml vorhanden ist. Während der akuten Phase wird LBP von Leberzellen hergestellt und erreicht im Serum Konzentrationen von 30-50 ug/ml. Während der akuten Phase kann LBP aus menschlichem Serum und aus Kaninchenserum gereinigt werden (Tobias et al., J. Exp. Med., 164: 777-793 (1986)). LBP erkennt die Lipid A-Region von LPS und bildet 1 : 1 stöchiometrische Komplexe mit hoher Affinität sowohl mit der rauhen als auch mit der glatten Form von LPS (Tobias et al., J. Biol. Chem., 264: 10867-10871 (1989)). LBP trägt N-terminal eine Sequenzhomologie mit dem LPS-Bindeprotein, welches als bakterizider, die Permeabilität erhöhender Faktor (BPI) bekannt ist. (Tobias et al., J. Biol. Chem., 263: 13479-13481 (1988)). BPI wird in spezifischen Körnchen von PMN [Weiss et al., Blood, 69: 652-659, (1987)] gespeichert und tötet durch Bindung von LPS und Unterbrechung der Permeabilitätsbarriere gramnegative Bakterien ab (Weiss, et al., J. Immunol., 132: 3109-3115, (1984)). Im Gegensatz zu BPI ist LBP nicht direkt zytotoxisch für gramnegative Bakterien [Tobias et al., J. Biol. Chem., 263: 13479-13481, (1988)], wobei dessen präzise biologische Funktion unklar ist.
Die Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie leisten diverse Immunfunktionen einschließlich der Phagozytose von Mikroorganismen, der Aufnahme von antigenischem Material und dessen Darstellung in einer Form, die auf Helfer T-zellen stimulierend wirkt. Sie sind wahrscheinlich auch an der Immunüberwachung von Tumoren beteiligt und sekretieren einige Komplementkomponenten und Cytokine. Oberflächenmembran-Antigene spielen eine kritische Rolle bei der Regulierung dieser Aktivitäten. Verschiedene Monozyten/Makrophagen-Oberflächenantigene wurden identifiziert und ihre Molekulargewichte bestimmt. Ein solches Antigen, CD14, ist ein 55 kD Glycoprotein, welches von Monozyten, Makrophagen und aktivierten Granulozyten exprimiert wird. Es wird von einer Reihe von monoklonalen Antikörpern (mAbs), einschließlich MO2, MY4, 3C10 und LEUM3, erkannt. Obwohl bisher keine biologische Funktion für CD14 beschrieben ist, läßt die beschränkte Expression bei reifen Zellen eine wichtige Effektorfunktion vermuten. Die Nukleotidsequenz des Gens, welches das monozytische Zelloberflächen-Differenzierungsantigen CD14 codiert, wurde bestimmt und daraus wurde die Aminosäuresequenz von CD14 abgeleitet (Ferrero et al., Nucleic Acids Research Vol. 16: 4173 (1988)).
Bogman et al., The Lancet, 29. Juli 1989, Seite 235, offenbart die Verwendung eines monoklonalen anti-CD14 Antikörpers für ein in vitro immunhistologisches Färbeverfahren für die Diagnose einer allogenen Nierenabstoßung.
Basis der vorliegenden Erfindung war die Entdeckung, daß ein primärer Regulator der Cytokinproduktion und Freisetzung der CD14-Rezeptor ist, insbesondere in Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie. In dem Maße, wie die Cytokinsekretion eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Symptome der Sepsis spielt, erwägt die vorliegende Erfindung Verfahren und Mittel für die Hemmung der Sekretion der Cytokine, insbesondere von TNF.
Gemäß einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung vor, einem Patienten mit Risiko an oder leidend an den Symptomen einer Sepsis eine therapeutisch wirksame Menge eines anti-CD14 Antikörpers, eines anti-LBP Antikörpers, eines LBP- Peptidanalogons oder einer Subkombination oder eine Kombination davon zu verabreichen, insbesondere intravenös. Das Verfahren kann allein oder in Kombination mit der im wesentlichen gleichzeitigen Verabreichung von anderen therapeutischen Möglichkeiten praktiziert werden, die zur Verhinderung oder Verbesserung der Symptome der Sepsis bekannt sind, einschließlich der Behandlung mit einem oder mehreren von Antibiotika, Steroiden, anti-TNF Antikörper, TNF-Antagonist und ähnlichem.
Ferner stellt die Erfindung therapeutische Zusammensetzungen bereit, typischerweise in Einheitsdosisform, die für die Verhinderung oder Verbesserung der Symptome der Sepsis nützlich sind. Die Zusammensetzungen umfassen einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, der als Wirkstoff einen oder mehrere anti-CD14 Antikörper, anti-LBP Antikörper und LBP-Peptidanaloge, welches als ein LBP-Antagonist wirkt, enthält. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen enthält die therapeutische Zusammensetzung nach der Erfindung ferner als Wirkstoff ein Mittel, das zur Verhinderung oder zur Verbesserung der Symptome der Sepsis bekannt ist, wie ein Antibiotikum, Steroid, anti-TNF Antikörper, ein TNF-Antagonist, lösliches CD14 und ähnliches, entweder allein oder in Subkombination oder in Kombination.
Die beiliegenden Abbildungen stellen einen Teil der Offenbarung der Erfindung dar: Abb. 1 zeigt, daß LBP die Interaktion von ELPS mit MO verstärkt. Monoschichten von MO wurden mit E oder ELPSIo in Gegenwart von verschiedenen Dosen von LBP inkubiert, und der Anhaftungsindex wurde bestimmt. Ein Kontrollprotein der akuten Phase, Mannose-Bindeprotein (MBP) (5 ug/ml) rief keine Steigerung der Verbindung von ELPSIo hervor (Anhaftungsindex 4,9). Die Ergebnisse von vier verschiedenen Experimente sind dargestellt.
Abb. 2 zeigt die LBP-abhängige Bindung von ELPS an MO in Abhängigkeit von der Dichte von LPS in der E-Membran. ELPS wurde mit verschiedenen Dosen von LPS hergestellt und dann mit Monoschichten von MO in Gegenwart oder in Abwesenheit von 5 ug/ml LBP inkubiert. Die Ergebnisse von vier verschiedenen Experimenten sind dargestellt.
Abb. 3 zeigt, daß MO LBP in Abwesenheit von LPS nicht erkennt. E beschichtet mit Biotin und Streptavidin allein (EBAV) wurden mit biotinylierten LBP inkubiert, um ELBP zu erzielen. ELBP sowie EBAV wurden mit abgestuften Dosen von LPS für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert, gewaschen und die Bindung an Einzelschichten von MO wurde bestimmt. Abb. 4 zeigt, daß LBP die Fc-vermittelte Phagocytose verstärkt. Einzelschichten von MO (5 Tage Kultur) wurden für 45 Minuten mit E, ELBP oder EC3bi in Gegenwart von verschiedenen Verdünnungen von anti-E-IgG inkubiert. Die Phagocytose von E wurde, wie in Materialien und Methoden beschrieben, bestimmt. ELBP wurden durch Zusatz von 1 ug/ml LBP zu ELPSIo (0,3 ug LPS/3 · 10&sup7;E) während der Inkubation mit MO erzielt. Anhaftung von diesen E in Abwesenheit von anti-E-IgG war wie folgt: E, Anhaftungsindex (AI)-O; EC3bi, Al-417; ELBP, Al-404. Die Ergebnisse sind von sechs verschiedenen Experimenten sind dargestellt.
Abb. 5 zeigt die Sekretion von Wasserstoffperoxid während der Ausbreitung von MO auf den Liganden-beschichteten Oberflächen. 3 · 10&sup4; MO (Tag 3 der Kultur) wurden zu beschichteten Mikrotitervertiefungen zugefügt. In Intervallen wurde die Entstehung von Wasserstoffperoxid gemessen. Es trat eine lebhafte Herstellung von Peroxid während des Ausbreitens auf den Immunkomplexen (HSA-anti-HSA, geschlossene Kreise) oder in Reaktion auf den löslichen Agonisten, PMA (geschlossene Rauten), auf. Eine geringe, aber reproduzierbare Peroxidfreisetzung wurde während der Interaktion mit LPS- beschichteten Oberflächen (offene Dreiecke) beobachtet. Eine Ausbreitung auf LBP- beschichteten Oberflächen (offene Quadrate) führte jedoch zu keiner Freisetzung. Eine Beschichtung der LPS-beschichteten Oberflächen mit LBP (offene Rauten) verhinderte die LBP-induzierte Erzeugung von Peroxid. LBP beeinflußte nicht die Herstellung oder die Messung von Peroxid, da MO in den LBP-beschichteten Vertiefungen eine normale Peroxidentstehung in Reaktion auf PMA zeigte.
Abb. 6 die Hemmung der LPS-LBP-Komplexbindung durch monoklonale anti-CD14 Antikörper. Einzelschichten von menschlichen MO wurden für 15 Minuten bei 0ºC mit den angezeigten Konzentrationen der monoklonalen Antikörper inkubiert. Erythrozyten, die nacheinander mit LPS und LBP beschichtet wurden, wurden zugesetzt und die Anhaftung wurde gemessen. Die Ergebnisse sind für drei verschiedene Dosisreaktions-Experimente sowie für zehn Experimente, die mit einer bestimmten Konzentration an Antikörper durchgeführt wurden, repräsentativ. Hohe Konzentrationen eines großen Feldes an mAbs, die gegen andere Determinanten auf den Makrophagen gerichtet waren, hatten keinen Effekt auf die Bindungs-ELBP.
Abb. 7 zeigt, daß die oberflächengebundenen anti-CD-14 Mabs die Bindung der LBP-LPS Komplexe nach unten modulieren. Einzelschichten von menschlichen Makrophagen wurden auf Substraten etabliert, die mit 25 ug/ml der angezeigten, monoklonalen Antikörper beschichtet waren. Die Zellen wurden gewaschen, ELPS¹&sup0; wurden zugefügt, und die Anhaftung wurde bestimmt.
Abb. 8 zeigt, daß natives LBP für LPS erforderlich ist, um die TNF-Produktion zu induzieren. Peritoneale Exsudatmakrophagen (PEM) vom Kaninchen wurden mit LPS in Gegenwart der angezeigten Konzentrationen von aktivem LBP (LBP), erhitztem (denaturiertem) LBP, Rinderserumalbumin (BSA) oder fötalem Kälberserum (FCS) gereizt. Die Menge an produziertem TNF durch die gereizten PEM wurden dann bestimmt.
Abb. 9 zeigt die Empfindlichkeit von LBP gegenüber einer tryptischen Aufspaltung in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Liganden, an den es bindet, d. h. Re595 LPS. Molekulargewichtsmarker (Pharmacia, Piscataway, N. J.; Katalog Nr. 17-0446-01; Phophorylase B bei 94 Kilodaltons (kD), Rinderserumalbumin bei 67 kD, Ovalbumin bei 43 kDa, Carboanhydrase bei 30 kD, Sojabohnentrypsininhibitor bei 20,1 kD und alpha Lactalbumin bei 14,4 kD.) erscheinen in den Zeilen, die benachbart zu denen sind, die LBP enthalten. Die Ergebnisse lassen vermuten, daß die LBP-Bindung an LPS zu einem Konformationswechsel in LBP führt, was zu der Fähigkeit zur Bindung an CD14 nur dann zählen kann, wenn präsent als Teil eines LPS-LBP-Komplexes.

A. Definitionen

Aminosäurerest: Die hier beschriebenen Aminosäurereste stellen bevorzugt die "L" isomere Form dar. Reste in der "D" isomeren Form können jedoch anstelle jedes L- Aminosäurerestes eingesetzt werden, soweit die gewünschte funktionale Eigenschaft der Immunglobulinbindung durch das Polypeptid erhalten bleibt. NH2 bezieht sich auf die freie Aminosäure, die andern Aminoterminus eines Polypeptides vorhanden ist. COOH bezieht sich auf die freie Carboxylgruppe, die an dem Carboxyterminu eines Polypeptides vorhanden ist. Unter Beibehaltung der Standard-Polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969), sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste in der folgenden Zuordnungstabelle gezeigt: Zuordnungstabelle
Es sei erwähnt, daß alle Aminosäurerestsequenzen hier durch Formeln dargestellt sind, deren linke und rechte Orientierung der konventionellen Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus entspricht. Es sei ferner angemerkt, daß ein Strich am Beginn oder Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz von einem oder mehreren Aminosäureresten anzeigt.
Der Ausdruck "Antikörper" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die Immunglobulinmoleküle und/oder immunologisch aktive Abschnitte von Immunglobulinmolekülen enthält, d. h. Moleküle, die eine Antikörper- Kombinationstelle oder ein Paratop enthalten. Aus einer bevorzugten Ausführungsform wurden die hier verwendeten Antikörper affinitätsgereinigt.
Eine "Antikörper-Kombinationsstelle" stellt den strukturellen Abschnitt eines Antikörpermoleküls dar, der variable und hypervariable Regionen der schweren und leichten Kette umfaßt und der spezifisch an ein Antigen bindet.
Der Ausdruck "Antikörpermolekül" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein intaktes Immunglobulinmolekül sowie auf einen immunologisch aktiven Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls.
Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, im wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle sowie solche Abschnitte eines Immunglobulinmoleküls, die das Paratop enthalten, einschließlich den Abschnitten, die im Stand der Technik als Fab, Fab', F(ab')&sub2; und F(v) bekannt sind, wobei diese Abschnitte zur Verwendung bei den hier beschriebenen, therapeutischen Verfahren bevorzugt sind.
Fab und F(ab')&sub2;-Abschnitte der Antikörpermoleküle werden durch die proteolytische Reaktion von Papin bzw. Pepsin auf im wesentlichen intakte Antikörpermoleküle hergestellt, wobei die Verfahren gut bekannt sind, wie beispielsweise US-Patent Nr. 4 342 566 von Theofilopolous et al. (die Offenbarungen des hier zitierten Standes der Technik sind hiermit durch Verweis eingeführt). Die Fab'-Antikörpermolekül-Abschnitte sind auch gut bekannt und werden von F(ab')&sub2;-Abschnitten mit anschließender Reduktion der Disulfidbindungen, welche die zwei schweren Kettenabschnitte verbinden, durch Mercaptoethanol sowie anschließender Alkylierung des erzielten Proteinmercaptans mit einem Reagenz, wie Iodacetamid, hergestellt. Ein Antikörper, der intakte Antikörpermoleküle enthält, ist bevorzugt und wird in der vorliegenden Beschreibung verwendet.
Der Ausdruck "monoklonale Antikörper" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf einen Antikörper, der nur eine Spezies an Antikörper- Kombinationsstellen, die zur Immunreaktion mit einem bestimmten Antigen in der Lage ist, enthält. Ein monoklonaler Antikörper zeigt so in typischer Weise eine einzelne Bindungsaffinität für jedes Antigen, mit dem er eine Immunreaktion eingeht. Ein monoklonaler Antikörper kann somit ein Antikörpermolekül enthalten, das mehrere Antikörper-Kombinationsstellen aufweist, wobei jede dieser Stellen immunspezifisch für ein unterschiedliches Antigen ist, z. B. ein bispezifischer (chimärischer), monoklonaler Antikörper.
Der Ausdruck "im wesentlichen gleichzeitig" wird hier verwendet, um einen Zeitraum zu bezeichnen, der für die Erzielung von gleichzeitigen Ergebnissen ausreichend ist, z. B. eine bakterielle Lyse als Ergebnis einer antibiotischen Verabreichung und Verbesserung oder Verhinderung der Symptome der Sepsis, was auftreten kann als Ergebnis von dieser Lyse durch die Verabreichung eines anti-CD14 Antikörpers, anti-LBP Antikörpers, LBP Peptidanalogons oder einer Subkombination oder Kombination davon, wie hierin beschrieben.
Der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die physiologisch tolerierbar sind und die typischerweise keine allergische oder eine ähnliche bedauerliche Reaktion ergeben, wie Magenverstimmung, Schwindelgefühl und ähnliches, wenn sie einem Menschen verabreicht werden.

B. Therapeutische Verfahren

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Behandlung und/oder Verhinderung von einem oder mehreren Symptomen der Sepsis, insbesondere von solchen, die mit einem transienten Anstieg von TNF in Blut assoziiert sind, wie Fieber, Hypotonie, Neurotropenie, Leukopenie, Thrombocytopenie, Schock und multiples Organversagen. Patienten, die einer solcher Behandlung bedürfen, umfassen solche mit Risiko für oder leidend an Toxämie, wie Endotoxämie, die sich aus einer gramnegativen bakteriellen Infektion ergibt, Vergiftung durch Schlangengift, Leberversagen und ähnliches. Ferner zeigen einige Patienten mit einer grampositiven bakteriellen, viralen oder pilzlichen Infektion die Symptome der Sepsis und können von dem therapeutischen Verfahren nach der Erfindung profitieren. Patienten, die insbesondere von der vorliegenden Erfindung profitieren können, sind solche, die an einer Infektion durch E.coli, Haemophilus influenza B, Neisseria meningitides, Staphylococci oder Pneumococci leiden. Patienten mit Risiko für die Sepsis umfassen solche, die an Verbrennungen, Schußwunden, Nieren- oder Leberversagen aufgrund einer chemischen Vergiftung oder Mißbrauch und ähnliches leiden. Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Verbesserung von einem oder mehreren Symptomen der Sepsis bereit, wobei einem Patienten, der solch einer Therapie bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge eines anti-CD14 Antikörpers verabreicht wird.
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" wird hier verwendet, um eine Menge zu kennzeichnen, die ausreichend ist, um einen klinisch signifikanten Anstieg in dem Plasmaniveau von TNF zu verhindern und vorzugsweise um wenigstens etwa 30% zu reduzieren, insbesondere um wenigstens 50%, wobei wenigstens 90% am bevorzugtesten sind. Bevorzugte therapeutisch wirksame Mengen für die hier verwendeten Mittel als aktive Wirkstoffe umfassen solche, die im Abschnitt C beschrieben sind. Ein klinisch signifikanter Anstieg in dem Plasmaniveau von TNF ist ein Anstieg von wenigstens etwa 25 pg/ml. Verfahren zur Bestimmung der Plasmaniveaus von TNF sind im Stand der Technik gut bekannt, wobei besonders bevorzugte Verfahren hier beschrieben sind.
Es sei angemerkt, daß die Niveaus von TNF in normal gesunden Menschen oder in Versuchstieren schätzungsweise nicht mehr als etwa 10 pg/ml betragen, wobei dieser Wert die Nachweisgrenze von den sensitivsten Nachweisverfahren für TNF darstellt (Michie et al., New Eng. J. Med. 318: 1481-1486 (1988); Mathison et al., J. Clin. Invest. 81: 1925 (188) und Waage et al., nce, 1: 355-357 (1987)). Nach Einwirkung von LPS steigen die Niveaus von TNF, wie gezeigt werden konnte, um das 10-20 fache auf Niveaus von bis zu 400 pg/ml (vide supra) an. Vor kurzem wurde eine gute Korrelation zwischen den Serumniveaus und dem tödlichen Ausgang bei einer Infektion mit gramnegativen, LPS-enthaltenen Meningokokken-Bakterien gezeigt (Waage et al., Lancet, 1: 355-357 (1987)). In Tiermodellen der Sepsis mit nicht menschlichen Primaten wurden ähnliche Zuwächse an TNF bemerkt und diese Veränderungen waren direkt mit der Lethalität verbunden (Tracey et al., Nature, 330: 662-664, (1987)).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksame Menge eines anti-CD14 Antikörpers für einen Patienten, der einer Behandlung der Sepsis bedarf oder ein Risiko für die Sepsis aufweist, wobei vorzugsweise eine Menge verwendet wird, die ausreichend ist, um die LPS-induzierte TNF-Sekretion in vivo durch Zellen zu verhindern, wie Zellen der Monozyten/Makrophagenlinie, vorzugsweise Makrophagen, die von Monozyten abstammen.
Vorzugsweise ist der in einem therapeutischen Verfahren nach der Erfindung verwendete anti-CD14 Antikörper ein affinititätsgereinigter, polyklonaler Antikörper. Bevorzugter stellt der Antikörper einen monoklonalen Antikörper (mAb) dar. Für die anti-CD14 Antikörpermoleküle, die hier verwendet werden, ist es ferner bevorzugt, daß sie in der Form von Fab, Fab', F(ab')&sub2; oder F(v)-Abschnitte von ganzen Antikörpermolekülen vorliegen.
Bevorzugte, monoklonale Antikörper, die in der Praxis nach der Erfindung nützlich sind, sind solche, die von einem Hybridom produziert werden können, wie 60b, beschrieben in Ashman et al., Blood, 69: 886-892, 1987, und insbesondere durch 3C10 (Hinterlegungsnummer TIB228 bei American Type Culture Collection Rockville, MD), beschrieben in Van Voorhis et al., J. Exp. Med., 158: 126-145, 1983, und ähnliche. Während mAbs 60b und 3C10 durch Hybridomkultur hergestellt werden können, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Beabsichtigt ist auch die Verwendung von mAbs, die durch eine anti-CD14 Immunglobulin-exprimierende Nukleinsäure hergestellt werden, die von einem Hybridom, wie 60b und/oder 3C10, kloniert ist, d. h. die Nukleinsäure, welche die anti-CD14 Antikörpermoleküle exprimiert, die von dem Hybridom 3C10 oder ähnlichem segregiert werden, kann in eine andere Zellinie übertragen werden, um einen Transformanten herzustellen. Der Transformant ist genotypisch verschieden von dem Ursprungshybridom und kann aber auch anti-CD14 Antikörpermoleküle herstellen, einschließlich immunologisch aktive Fragmente von ganzen Antikörpermolekülen, gemäß denen, die von dem Hybridom segregiert werden. Siehe hiertz beispielsweise das amerikanische Patent Nr. 4 642 334 von Reading; PCT Veröffentlichung Nr. WO 890099 von Robinson et al.; europäische Patentveröffentlichungen Nr. 0239400 von Winter et al. und Nr. 0125023 von Cabilly et al.
Bevorzugte monoklonale Antikörper zeigen eine Immunreaktivität für CD14, die ähnlich derjenigen ist, die von den oben beschriebenen Hybridomen sind. Der Ausdruck "Immunreaktivität" in seinen verschiedenen grammatischen Formen, so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Konzentration des Antigens, welche erforderlich ist, um eine 50% Hemmung der Immunreaktion zwischen einer gegebenen Menge des Antikörpers und einer gegebenen Menge des CD14-Antigens zu erzielen, d. h. die Immunreaktivität ist die Konzentration des Antigens, die erforderlich ist, um einen B/B&sub0;- Wert von 0,5 zu erzielen, wobei B&sub0; die maximale Menge des Antikörpers ist, der in Abwesenheit des konkurrierenden Antigens gebunden wird, und wobei B die Menge des Antikörpers ist, der in Gegenwart des konkurrierenden Antikörpers gebunden wird. Sowohl B&sub0; als auch B wurden für den Hintergrund eingestellt (siehe Robard, Clin. Chem., 20: 1255-1270 (1974)).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt das therapeutische Verfahren nach der Erfindung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines anti-LBP Antikörpers, vorzugsweise eines affinitätsgereinigten, polyklonalen Antikörpers und insbesondere ein mAb. Bezüglich der anti-LBP Antikörpermoleküle, die hier verwendet werden, ist ferner bevorzugt, daß sie in der Form von Fab, Fab', F(ab')&sub2; oder F(v)- Abschnitten der gesamten Antikörpermoleküle vorliegen. Vorzugsweise ist die verabreichte Menge der anti-LBP Antikörper ausreichend, um einen LBP-LPS Komplex, der einen klinisch signifikanten Anstieg in dem Blutniveau an TNF in einem Patienten induziert, um wenigstens 30%, vorzugsweise um wenigstens 80% zu reduzieren, wobei der Patient wenigstens ein Symptom von Sepsis aufweist. Wie oben diskutiert, umfassen die Patienten, die von den Vorteilen von diesem Verfahren profitieren können, solche, die als Ergebnis einer gramnegativen Bakterieninfektion an Endotoxämie leiden. Verfahren für die Isolierung von LBP und induzierenden anti-LBP Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Tobias et al., J. Exp. Med., 164: 777-793 (1986)). Verfahren zur Bestimmung und Optimierung der Fähigkeit eines anti-LBP Antikörpers zur Hemmung der Bindung von LBP-LPS Komplexen an CD14 und somit zur Hemmung der LBP-induzierten TNF-Sekretion sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein anti-LBP Antikörper kann beispielsweise durch den anti-CD14 Antikörper in dem Nachweisverfahren, das in dem Beispiel 16 beschrieben ist, ersetzt werden.
Bevorzugte anti-LBP Antikörper, die für die Praxis der Erfindung nützlich sind, kreuzreagieren immunologisch mit einem Peptidanalogon von LBP. Ein "LBP Peptidanalogon" ist ein Polypeptid, welches zur kompetitiven Hemmung der Bindung von LPS-LBP Komplexen an CD14, exprimiert auf der Oberfläche von Makrophagen, die von Monozyten abstammen, in der Lage ist. Bevorzugte LBP Peptidanaloga sind solche, die in der Tabelle 1 gezeigt sind.

Tabelle 1

Bezeichnung Aminosäurerestsequenz
C16Y CNRLNRAPQPDELY
Y16C YTTPEPSELDDEDFRC
K16C KRVDADADPRQYADTC
Verfahren zur Herstellung von polyklonalen anti-Polypeptid-Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe US-Patent Nr. 4 493 795 von Nestor et al.). Ein monoklonaler Antikörper, der typischerweise Fab und/oder F(ab')&sub2;-Abschnitte von nützlichen Antikörpermolekülen enthält, kann unter Verwendung der Hybridom-Technologie hergestellt werden, die beschrieben ist in Antibodies A Laboratory Manual, Harlow und Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), die hier durch Verweis eingeführt ist. Um die Hybridomzelle, von der die monoklonale Antikörperzusammensetzung hergestellt wird, zu bilden, wird ein Myelom oder eine andere, sich selbst erhaltende Zellinie mit Lymphozyten fusioniert, die aus der Milz eines Säugetiers erzielt werden, welches mit CD14 oder eines LBP-bindenden Abschnittes davon oder mit LBP oder eines CD14-bindenden Abschnittes davon hyperimmunisiert wurde.
Es ist bevorzugt, daß die Myelomzellinie von der gleichen Art abstammt, wie die Lymphozyten. In typischer Weise ist eine Maus des Stammes 129 GLX&spplus; das bevorzugte Säugetier. Geeignete Mausmyelomas zur Verwendung nach der Erfindung umfassen die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-sensitiven (HAT) Zellinien P3X63-Ag8.653 sowie Sp2/0-Ag14, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD unter den Bezeichnungen CRL 1580 und CRL 1581 erhältlich sind.
Splenozyten werden in typischer Weise mit Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) 6000 fusioniert. Fusionierte Hybride werden bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber HAT selektiert. Hybridomzellen, die einen für die Ausführung dieser Erfindung nützlichen, monoklonalen Antikörper herstellen, werden anhand ihrer Fähigkeit zur Immunreaktion mit CD14 oder LBP identifiziert sowie hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Hemmung der LPS-induzierten TNF-Sekretion, wobei das in dem Beispiel 16 beschriebene Verfahren verwendet wird.
Ein monoklonaler Antikörper, der für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich ist, kann durch Start einer monoklonalen Hybridomkultur hergestellt werden, die ein Nährmedium umfaßt, welches ein Hybridom enthält, das Antikörpermoleküle einer geeigneten Antigenspezifität segregiert. Die Kultur wird unter solchen Bedingungen und für solch einen Zeitraum aufrechterhalten, der für das Hybridom ausreichend ist, um die Antikörpermoleküle in das Medium abzugeben. Das Antikörper-haltige Medium wird dann gesammelt. Die Antikörpermoleküle können dann mittels bekannter Techniken isoliert werden.
Medien, die für die Herstellung von diesen Zusammensetzungen nützlich sind, sind im Stand der Technik gut bekannt und kommerziell verfügbar und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzuchtmäuse und ähnliches. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbecco's essentielles Minimalmedium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8: 396 (1959)), ergänzt mit 4,5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin und 20% fötales Kälberserum. Ein beispielhafter Inzuchtmaus-Stamm ist Balb/c.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen anti-Polypeptid-Antikörpern sind auch im Stand der Technik bekannt (siehe Niman, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4949-4953 (1983)). Ein oder mehrere LBP-Peptidanaloga werden entweder allein oder konjugiert mit einem immunogenen Träger, wie das Immunogen in dem oben beschriebenen Verfahren für die Herstellung der monoklonalen anti-CD14 Antikörper, verwendet. Die Hybridomzellen werden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Herstellung eines Antikörpers getestet, der mit dem LBP-Peptidanalogon und mit LBP immunreagiert. Die Fähigkeit zur Hemmung der Bindung des LPS-LBP Komplexes zu CD14 durch mAbs, was die geeignete immunologische Kreuzreaktion anzeigt, wird durch das Nachweisverfahren nach Beispiel 16 bestätigt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform beinhaltet ein therapeutisches Verfahren nach der Erfindung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines LBP Peptidanalogons, vorzugsweise ein Analogon mit der Sequenz nach Tabelle 1.
Patienten mit Risiko für oder die Symptome der Sepsis bereits zeigend können von der Verabreichung von therapeutischen Modalitäten profitieren, die im Stand der Technik zur Verhinderung oder zur Verbesserung dieser Symptome bekannt sind. Die vorliegende Erfindung umfaßt somit die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines anti-CD14 Antikörpers, eines anti-LBP Antikörpers, eines LBP Peptidanalogons, einer Subkombination oder einer Kombination davon und zwar im wesentlichen gleichzeitig mit der therapeutischen Verabreichung einer Modalität, die zur Verhinderung oder zur Behandlung der Symptome der Sepsis bekannt ist. Beispielsweise kann eine direkte oder indirekte Intervention in die Funktion von TNF bei der Sepsis, wie durch die Verwendung eines anti-TNF Antikörpers oder eines TNF-Antagonisten, die Symptome der Sepsis verhindern oder verbessern. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines anti-TNF Antikörpers als aktiven Wirkstoff, wie ein monoklonaler Antikörper mit einer immunologischen Spezifität für TNF gemäß dem Antikörper, der beschrieben ist durch Tracey et al., Nature, 330: 662-664 (1987).
In ähnlicher Weise kann ein therapeutisches Verfahren nach der Erfindung auch eine im wesentlichen gleichzeitige Behandlung mit einem Steroid umfassen, wie Cortisol, Hydrocortison und ähnliches.
Ein Patient, der die Symptome der Sepsis zeigt, wird normalerweise mit einem Antibiotikum behandelt, typischerweise ein Aminoglycosid, wie Gentamycin, oder ein Beta-Lactam, wie Penicillin, Cephalosporin und ähnliches. Ein bevorzugtes therapeutisches Verfahren umfaßt somit die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines anti-CD14 Antikörpers, eines anti-LBP Antikörpers, eines LBP Peptidanalogons, einer Subkombination oder einer Kombination davon, wie hier beschrieben, mit einer im wesentlichen gleichzeitigen Verabreichung einer bakteriziden Menge eines Antibiotikums. Der Ausdruck "bakterizide Menge" bedeutet hier eine Menge, die zur Erzielung einer Bakterien-abtötenden Blutkonzentration in dem Patienten, der die Behandlung empfängt, ausreicht. Die bakterizide Menge der Antibiotika, die im allgemeinen als sicher für die Verabreichung bei Menschen erkannt ist, ist eine gut bekannte Menge im Stand der Technik und variiert, wie auch gut bekannt, mit dem Antibiotikum und dem Typ der bakteriellen Infektion, die zu behandeln ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen wird ein anti-CD14 Antikörper, ein anti-LBP Antikörper, ein LBP Peptidanalogon oder eine Kombination davon, wie hier beschrieben, innerhalb von 48 Stunden, vorzugsweise innerhalb von 12-36 Stunden und weiter bevorzugt innerhalb von 2-8 Stunden und am bevorzugtesten im wesentlichen gleichzeitig mit der Verabreichung des Antibiotikums verabreicht.
Nützliche Antibiotika bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung umfassen solche Antibiotika, antibakterielle und antiseptische Mittel mit Formulierungen, die beschrieben sind in Physicians' Desk Reference, Huff, B. B. ed., Medical Economics Company, Inc., Oradell, N. J. (1989). In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von CD14, vorzugsweise eines löslichen Abschnittes davon, der die LPS-LBP Komplexe bindet, allein oder in Subkombination oder Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines anti- TNF Antikörpers, eines anti-LBP Antikörpers und eines Antibiotikums. Die cDNA, die für CD14 codiert, sowie ihre abgeleitete Aminosäurerestsequenz sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe Goyert et al., Science, 239: 497-500 (1988), Ferrero et al., Nuc. Acids Res., 16: 4173 (1988), und Bazil et al., Eur. J. Immunol., 16: 1583-1589 (1986).

C. Therapeutische Zusammensetzung

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner therapeutische Zusammensetzungen, die für die Durchführung der therapeutischen Verfahren nach der Erfindung nützlich sind. Eine therapeutische Zusammensetzung umfaßt als Beimischung einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger (Träger) sowie als aktiven Wirkstoff einen oder mehrere anti-CD14 Antikörper, anti-LBP Antikörper und LBP Polypeptid-Analogons, wie hierin beschrieben. Bei bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Zusammensetzung ein anti- CD14 mAb, fähig zur Hemmung der Bindung der LPS-LBP Komplexe an CD14. Ein bevorzugter mAb ist 60b und weiter bevorzugter ist 3C10.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen einen anti-LBP Antikörper, vorzugsweise einen mAb, welcher die Bindung der LPS-LBP Komplexe an CD14 hemmt. Insbesondere bevorzugt sind Zusammensetzungen, worin der anti-LBP Antikörper mit einem LBP Peptidanalogon mit einer Sequenz, die in Tabelle 1 gezeigt ist, immun reagiert.
Eine bevorzugte Zusammensetzung umfaßt ein LBP Peptidanalogon, das als ein Antagonist zu den LPS-LBP Komplexen bezüglich der Bindung zu CD14 fungiert. Bevorzugte LBP Peptidanaloga zur Verwendung in den Zusammensetzungen nach der Erfindung sind solche, welche eine Sequenz gemäß Tabelle 1 aufweisen.
Bevorzugte therapeutische Zusammensetzungen umfassen ferner eine wirksame Menge von einem oder von mehreren der folgenden aktiven Wirkstoffen: ein Antibiotikum, ein Steroid, ein anti-TNF Antikörper und ein TNF-Antagonist. Exemplarische Formulierungen sind unten angegeben: Formulierung A Formulierung B Formulierung C
Gemäß einer anderen Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung, die bei der Behandlung von Sepsis nützlich ist und die CD14 oder einen LBP-bindenden, löslichen Abschnitt davon in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt. Vorzugsweise umfaßt die Zusammensetzung ferner eine therapeutisch wirksame Konzentration von einem oder mehreren anti-TNF Antikörpern, anti-LBP-Antikörpern und von Antibiotika.
Die Herstellung der therapeutischen Zusammensetzungen, die Polypeptide oder Antikörpermoleküle als aktive Wirkstoffe enthalten, ist im Stand der Technik gut bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen hergestellt als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, wobei jedoch auch feste Formen hergestellt werden können, die vor einer Injektion in einer Flüssigkeit gelöst oder suspendiert werden. Die Präparation kann auch emulgiert werden. Der therapeutisch wirksame Inhaltsstoff wird oft mit Arzneimittelträgern gemischt, die pharmazeutisch akzeptabel und mit dem aktiven Wirkstoff kompatibel sind. Geeignete Arzneimittelträger sind beispielsweise Wasser, Salz, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliches sowie Kombinationen davon. Falls gewünscht, kann die Zusammensetzung ferner geringe Mengen von Hilfssubstanzen enthalten, wie Benetzungsmittel oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel, welche die Effektivität des aktiven Wirkstoffes verstärken.
Ein Polypeptid oder ein Antikörper können in die therapeutische Zusammensetzung als neutralisierte, pharmazeutisch akzeptable Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen Säureadditionsalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptides oder des Antikörpermoleküls) und die mit anorganischen Säuren hergestellt sind, wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäuren, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und ähnliches. Salze, die aus den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen abgeleitet werden, wie beispielsweise Natrium-, Kalium, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxyde, sowie von organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2- Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnliches.
Die therapeutischen Polypeptid- oder Antikörper-haltige Zusammensetzungen werden konventionell intravenös verabreicht, wie beispielsweise durch eine Injektion einer Einheitsdosis. Der Ausdruck "Einheitsdosis" bedeutet, wenn er unter bezug auf eine therapeutische Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine physikalisch diskrete Einheit, die als Einzeldosis beim Menschen verwendbar ist, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge eines aktiven Materials enthält, die berechnet ist, um den gewünschten therapeutischen Effekt in Zusammenhang mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder Vehikel, herzustellen.
Die Zusammensetzungen werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosisformulierung kompatibel ist, sowie mit einer therapeutisch wirksamen Menge. Die zu verabreichende Menge hängt von der zu behandelnden Person ab, der Kapazität des Immunsystems dieser Person bezüglich der Verwendung des aktiven Wirkstoffes sowie von dem Maß der Hemmung oder Neutralisierung der gewünschten CD14- oder LPS- LBP-Komplexbindungskapazität. Präzise Mengen des für die Verabreichung erforderlichen aktiven Wirkstoffes hängen von der Beurteilung des Arztes ab und sind spezifisch für jedes Individuum. Geeignete Dosen erstrecken sich jedoch in der Größenordnung von 0,1 bis 20, vorzugsweise von 0,5 bis etwa 10 und ferner insbesondere von 1 bis 7 mg aktiven Wirkstoff pro Tag pro kg der Person, wobei dies auch von der Art der Verabreichung abhängt. Geeignete Systeme für die anfängliche Verabreichung und die Booster-Schüsse sind auch variabel, wobei aber eine Anfangsverabreichung gefolgt von wiederholten Dosen in ein- oder mehrstündigen Intervallen durch eine nachfolgende Injektion oder eine andere Administration typisch ist. Alternativ kann eine kontinuierliche intravenöse Infusion durchgeführt werden, die ausreichend ist, um die Blutkonzentration auf 10 nanomolar bis 10 mikromolar aufrechtzuerhalten.
Gemäß der hier vorliegenden Beschreibung bedeutet "pg" Picogramm, "ng" Nanogramm, "ug" Mikrogramm, "mg" Milligramm, "ul" Mikroliter, "ml" Milliliter und "I" bedeutet hier Liter.

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, aber nicht der Begrenzung der vorliegenden Erfindung.
Die Beispiele 1-11 zeigen Studien, die belegen, daß menschliche Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie LPS-LBP Komplexe über einen Zelloberflächenrezeptor binden, der in der Ebene der Membran mobil ist.
Beispiel 12 zeigt, daß anti-CD14 Antikörper die Bindung des LPS-LBP Komplexes zu CD14 spezifisch hemmt.
Die Beispiele 13-15 zeigen, daß CD14 spezifisch LPS-LBP Komplexe bindet und daß diese Bindung die TNF-Sekretion von MO induziert.
Beispiel 16 zeigt, daß anti-CD14 mAbs den LPS-LBP Komplex hemmt, der die TNF- Sekretion im menschlichen Blut induziert.
Beispiel 17 ist eine Übersicht sowie eine Diskussion der Ergebnisse der Beispiele 1-16.

1. Reagentien

LBP wurde aus der akuten Phase von Kaninchenserum gereinigt (Tobias, et al., J. Exp. Med., 164: 777-793 (1986)) und erscheint auf Silber-gefärbten Gelen homogen. Anti- Kaninchen LBP wurde in Ziegen herangezogen. MBP wurde von Dr. R. A. B. Ezekowitz (Boston, MA) erhalten. Der bakterizide, permeabilitätsinduzierende Faktor (BPI) wurde von Dr. J. Gabay (New York, NY) erhalten. LPS aus Salmonella minnesota (Re595 oder Wildtyp) wurde aus List Biological (Campbell, CA) erhalten. Die monoklonalen Antikörper (mAbs) IB4 gegen CD18 und 3G8 gegen FcyRIII (CD16) wurden beschrieben in Wrigth, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 5699-5703, (1983). mAb543 gegen CR1 wurde erhalten von Dr. R. Schreiber (St. Louis, MO) und mAbs 22 und IV.3 gegen FcyRI und FcyRII wurden erhalten von Dr. M. Fanger (Hannover, NH). Pyrogen-freies, menschliches Serumalbumin (HSA) war von Armour Pharmaceuticals und Pyrogen-freies PBS und DGVB++ waren von Whitaker MA Bioproducts. NHS-Biotin, Sulfo-NHS-Biotin und Streptavidin waren von Pierce Chemical.

2. Oberflächen

Die Kunststoffoberflächen bei der Gewebekultur waren durch Inkubation mit 25 ug/ml Protein (Antikörper, LBP oder HSA) oder mit 1 (ug/ml) pro Mikrogramm/Milliliter LPS für 1 Stunde bei 20ºC beschichtet worden. Um Immunkomplexe zu bilden, wurden HSA- beschichtete Oberflächen mit anti-HSA Antiserum (1 : 50) für weitere 30 Minuten inkubiert. In einigen Fällen wurden die LPS-beschichteten Oberflächen anschließend mit 10 ug/ml LBP für 30 Minuten bei 20ºC behandelt. Für Nachweistests der Wasserstoffperoxidproduktion wurden alle beschichteten Oberflächen mit 1 Milligramm pro Milliliter (mg/ml) HSA für 1 Stunde vor der Zugabe der Phagozyten behandelt. Beschichtete Oberflächen wurden vorsichtig mit Pyrogen-freiem PBS vor dem Nachweistest gewaschen.

3. Zellen

Von Monozyten abgeleitete Makrophagen (MO) wurden durch Kultur von gereinigten menschlichen Monozyten in Teflonbechern für 3-10 Tage erzielt, wie dies beschrieben ist von Wright et al., J. Exla. Med., 156: 1149-1164, (1982). Einzelschichten von frischen Monozyten wurden durch Anhaftung von peripheren mononukleären Blutzellen an Proteinbeschichteten Kunststoff für 45 Minuten bei 37ºC erzielt. PMN wurde aus frischem Blut gemäß dem Verfahren von English et al., J. Immunol. Methods, 5: 249, (1974) gereinigt. T- Zellen, die durch ein Rosetting mit Erythrozyten gereinigt wurden, wurden von J. Ming (Rockefeller U.) erhalten. Menschliche Endothelzell-Einzelschichten der Nabelvene (Lo et al., J. Exp. Med., 169: 1779-1793, (1989) wurden von Dr. S. K. Lo (Rockefeller, U.) erhalten.
Schaferythrozyten (E) wurden mit IgG (EIgG) oder IgM (EIgM) beschichtet, wie dies beschrieben wurde von Wrigth et al., J. Exp Med., 156: 1149-1164, (1982).
C3bi wurde auf EiGM durch Inkubation von 2-10 · 10&sup8; EIgM in 1 ml von 10% C5- defizientem menschlichen Serum (Sigma) für 30 Minuten bei 37ºC abgelagert. Die Erythrozyten wurden dann gewaschen und für 10 Minuten bei 0ºC in einem Puffer mit 2,5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) inkubiert. Erzielte Ec3bi trugen keine C3b, wie dies mit dem EDTA-resistentem Rosettentests mit MO überprüft wurde.
E wurde mit LPS gemäß der Beschreibung von Wright et al., J. Exp. Med., 164: 1876- 1888, (1986) beschichtet. Die verwendete Menge von LPS in der Präparation variierte, um ELPShi (1-10 ug/4 · 10&sup7;E) oder ELPSIo (0,2-1 ug/4 · 10&sup7;E) zu erzielen. ELPSIo wurden mit LBP durch Inkubation von gleichen Volumina von ELPSIo (10&sup8;/ml) und LBP (10 ug/ml) für 20 Minuten bei 37ºC beschichtet. Die erzielten LBP-beschichteten ELPS (Ligandenbeschichtete E) wurden gewaschen und direkt verwendet.
Für einige Studien wurden E auch mit LBP durch ein alternatives Verfahren beschichtet. E wurden zunächst biotinyliert durch Inkubation von 5 · 10&sup8; E mit 250 ug Sulfo-NHS-Biotin für 20 Minuten bei 5ºC in 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,2, und LBP wurde biotihyliert durch Inkubation von 50 ug LBP mit 5 ug Sulfo-NHS-Biotin und mittels einer Dialyse gegen PBS.
Das biotinylierte Protein wurde dann mit dem biotinylierten E über eine Streptavidin- Brücke verbunden. 10&sup8; gewaschene, biotinylierte (E) (EB) wurden mit 10 ug Streptavidin für 30 Minuten bei 20ºC inkubiert, um Avidin-beschichtete Erythrozyten zu erzielen (EBAV). Vorläuferexperimente mit fluoreszierendem Streptavidin zeigten, daß die EBAV einheitlich und intensiv fluoreszierend waren. Es konnte keine Agglutination beobachtet werden. 2,5 · 10&sup7; gewaschene EBAV wurden mit 2,5 ug biotinyliertem LBP für 30 Minuten bei 20ºC inkubiert, um EBAV-LBP zu erzielen.
Salmonella typhimurium LT2 Gal E wurde in Gegenwart oder in Abwesenheit von Galaktose herangezogen, um Zellen mit vollständigem oder verkürztem LPS zu erzielen (Wright, et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888, (1986)). Exponentiell wachsende Kulturen wurden gewaschen, mit Fluoreszein markiert und auf 2 · 10&sup8; Mikroliter (ul) in PBS, wie oben beschrieben, eingestellt (Wright et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888, (1986).

4. Nachweistests

Die Agglutination von LPS-beschichteten Erythrozyten (Beispiel 3) wurde durch Schütteln von 10&sup6; ELPShi in 10 Mikroliter von verdünntem LBP für 30 Minuten bei 21ºC in einer Mikrotestplatte mit rundem Boden gemessen. Die Agglutination wurde aus dem Sedimentationsmuster abgelesen.
Die Bindung von Liganden-beschichteten E (Beispiel 3) zu MO wurde gemessen gemäß der Beschreibung von Wright, et al., J. Exp. Med., 156: 1149-1164, (1982). Terasaki- Gewebekulturplatten wurden mit HSA oder mit anderen Proteinen (Beispiel 2) beschichtet. Einzelschichten von MO wurden durch Inkubation von 5 ul der Zellen /0,5 · 10&sup6;/ml in PBS, enthaltend 3 mM Glukose, 0,5 mg/ml HSA und 0,3 u/ml Aprotinin (Sigma), für 45 Minuten bei 37ºC etabliert. Liganden-beschichtete E und die angezeigten Proteine wurden den Einzelschichten zugesetzt. E konnte sich über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 0ºC absetzen, wobei dann die Platten für 15 Minuten auf 37ºC erwärmt wurden. Nicht- angeheftete E wurden durch Waschen entfernt, und die Anhaftung wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop überprüft. Die Bindung von fluoreszierenden Salmonella wurde durch ein ähnliches Verfahren unter Anwendung einer 15 minütigen Inkubation bei 37ºC getestet, wie dies von Wrigth, et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888, (1986) beschrieben wurde. Die Ergebnise werden als Anhaftungsindex angegeben, wobei dies die Zahl von E oder der Bakterien pro 100 MO ist. Die Phagocytose von Liganden-beschichteten E wurde mit ähnlichen Verfahren bestimmt (Wright et al., J. Exp. Med., 156: 1149-1164, (1982), wobei die Ausnahme darin besteht, daß die Inkubation von MO mit E für 45 Minuten bei 37ºC durchgeführt wurde. Nicht-aufgenommene E wurden durch kurze Exposition in einem hypotonischen Medium lysiert, bevor die Vertiefungen überprüft wurden.

5. LBP bindet an LPS das in Erythozyten-Membranen eingesetzt wurde

Die Zugabe von so wenig wie 0,5 ug/ml LBP zu ELPShi rief eine Agglutination hervor. Da LPS sich in der Membran von E durch hydrophobe Interaktion mit Phospholipiden aufteilt, läßt diese Beobachtung vermuten, daß LBP den exponierten, hydrophilen Abschnitt von dem Lipid A erkennt und daß LBP das Potential zur Bildung von Multimeren hat. Die ELPS waren nicht stark agglutiniert und konnten durch vorsichtiges Pipetieren gelöst werden.

6. LBP fördert die Bindung von ELPS und von Salmonella an Makrohagen

Gramnegative Bakterien und LPS-beschichtete Erythrozyten binden an MO über eine Interaktion von LPS mit Mitgliedern des CD18 Komplexes von Rezeptoren an Leukozyten (Wright et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888, (1986)). Die Fähigkeit von LBP, diese Interaktion zu stören, wurde somit überprüft. Bei anfänglichen Studien wurden E verwendet, die mit hohen Levels an LPS hergestellt wurden. Diese ELPShi binden sehr stark an MO und die Zugabe von LBP fördert etwas die Bindung. Um die Natur dieser Förderung zu bestimmen, wurden E mit niedrigen Levels an ELPS hergestellt.
Einzelschichten von MO wurden mit ELPSIo in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 Microgramm (ug) pro Milliliter (ml) LBP inkubiert. ELPSIo wurden durch MO nur schwach gebunden, wobei die Zugabe von LBP aber eine dramatische Verstärkung der Bindung hervorrief (Abb. 1). Die verstärkte Bindung war dosisabhängig mit einem maximalen Effekt bei 1 ug/ml LBP. Die Spezifität dieses Effektes wird durch die Beobachtung angezeigt, daß ein anderes Reaktionsmittel der akuten Phase, das Mannose-bindende Protein, die Bindung von ELPSIo an MO (Abb. 1) bei Konzentrationen so hoch wie 100 ug/ml nicht beeinflußt. Ein anderes LPS-bindendes Protein, BPI, beeinflußt die Bindung bei Konzentrationen so hoch wie 10 ug/ml nicht. Ein polyklonales anti-LBP Antiserum (1 : 200) rief eine 20-fache Reduktion bei dem Rosetten der ELPSIo ,hervorgerufen durch LBP, hervor.
Die Kapazität von LBP zur Förderung der Interaktion von ELPS mit MO war auch abhängig von der Menge von LPS in der Erythrozyten-Membran (Abb. 2). LBP konnte effektiv die Bindung von E vermitteln, die mit 20-100 fachen geringeren Mengen von LPS hergestellt wurden, als die erforderliche Menge, die zur Aufrechterhaltung einer direkten Interaktion zwischen ELPS und MO notwendig ist.
Stämme von gramnegativen Bakterien, die ein verkürztes LPS (rauhe Stämme) exprimieren, werden durch MO sehr stark gebunden, während glatte Stämme, die ein komplettes LPS aufweisen, nur schwach gebunden werden (Wrigth et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888, (1986)). Da LBP gleich gut an glattem wie an rauhem LPS bindet [Tobias et al., J. Biol. Chem., 264: 10867-10871, (1989)], wurde die Fähigkeit von LBP glatte Salmonella zu opsonieren, bestimmt. Gemäß den Daten in der Tabelle II ruft die Zugabe von LBP eine dramatische Steigerung der Bindung von glatten Salmonella an MO hervor.

Tabelle II

LBP steigert die Bindung von Salmonella an MO¹
Anhaftungsindex
glatte S. typhimurium rauhe S. typhimurium
¹Die glatten und rauhen Formen der Präparationen von S. typhimurium LT2 wurden erzielt durch Wachstum von GaIE-Mutanten von diesem Stamm in Gegenwart und Abwesenheit von Galactose gemäß der Beschreibung von Wright, et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888, (1986). Das Binden der Bakterien an die Makrophagen-Einzelschichten wurde dann in Gegenwart oder Abwesenheit von 2,5 ug/ml LBP gemessen. Die Zugabe von LBP rief eine 5,9 ± 1,9 (n-4)-fache Verstärkung der Bindung der glatten Bakterien an MO hervor.
Die Tabelle II zeigt, daß die Zugabe von LBP auch die Bindung der rauhen Salmonella fördert, wobei aber der Effekt aufgrund der starken Bindung der nicht-opsonierten Bakterien weniger stark ist, als mit den glatten S. typhimurium. LBP kann somit die Interaktion von lebenden, intakten Bakterien mit MO fördern.

7. MO erkennt Komplexe von LBP mit LPS

In Beispiel 6 wurde LBP zusammen mit MO und ELPS zugesetzt. Für die Bestimmung, ob LBP an MO oder ELPS bindet, wurden die Zellen getrennt mit LBP inkubiert (behandelt), gewaschen und dann kombiniert. Die Ergebnisse von dieser Studie sind in der Tabelle III gezeigt. Tabelle III Vorbehandlung von ELPS, aber nicht von MO, mit LBP steigert ihre Interaktion¹ Anhaftungsindex
¹Bindung von ELPSIo (0,2 ug/4 · 10&sup8; E) an Einzelschichten von MO wurde gemessen gemäß der Beschreibung von Beispiel 4.
ELPSIo oder MO wurden bei 37ºC mit 5 ug/ml für 20 Minuten vorbehandelt und vor dem Nachweistest gewaschen. Alternativ wurden während dem Anhaftungstest 5 ug/ml LBP zugesetzt.
Die Vorbehandlung von ELPSIo mit LBP führte zu einer starken Erhöhung der Bindung an MO (Tabelle III) mit einer Dosis-Reaktionskurve, die identisch zu der ist, die in den Coinkubationsexperimenten (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurden. Dieses Ergebnis führt zu der Vermutung, daß LBP stabil mit ELPS assoziiert und daß Oberflächengebundenes LBP durch MO erkannt wird. Die Vorbehandlung von MO berührt andererseits nicht die nachfolgende Bindung von ELPS (Tabelle II).
LBP auf der Oberfläche von ELPS ist mit LPS komplexiert. Um zu bestimmen, ob MO an LBP in Abwesenheit von LPS bindet, wurde LBP biotinyliert und an Streptavidinbeschichtete Erythrozyten angeheftet. Die erzielten EBAV-LBP wurden nicht durch MO (Abb. 3) gebunden, während die Zugabe von LPS zu einer starken Anhaftung von ELBP an MO führte. LPS schien die Anhaftung von EBAV-LBP durch Bindung an LBP zu fördern, da die Menge des notwendigen LPS zur Hervorrufung der Anhaftung von ELBP um das 50-fache niedriger war, als zur Hervorrufung der Anhaftung von B, denen LBP fehlt (Abb. 3), notwendig ist. Ferner binden LPS-behandelte ELBP sehr stark an CD18-defiziente MO, die kein ELPS binden. Somit muß LP mit LPS komplexiert werden, um durch MO erkannt zu werden.

8. LBP wird durch einen mobilen Rezeptor erkannt, der auf mononukläre Phagozyten beschränkt ist

LBP-behandelte ELPS binden zu praktisch 100% an Monozyten und MO, was zu der Vermutung führt, daß die Bindungsaktivität auf allen Mitgliedern dieser Populationen vorhanden ist. Um zu bestimmen, ob LBP mit anderen Zelltypen interagiert, wurden Einzelschichten von PMN, T-Zellen und Endothelzellen der Nabelvene mit LBP- behandelten ELPSIo inkubiert. Es wurde keine Bindung beobachtet. In ähnlicher Weise wurde niemals beobachtet, daß Lymphozyten, die gelegentlich MO-Präparate kontaminieren, an LBP beschichtete E binden. Die Kapazität zur Bindung von LBP- beschichteten Partikeln scheint somit eine Fähigkeit zu sein, die auf mononukläre Phagozyten beschränkt ist.
Die Existenz eines spezifischen Rezeptors für LBP wurde demonstriert durch Ausbreitung von MO auf Oberflächen, die mit Komplexen von LPS und LBP beschichtet waren. Die Tabelle IV zeigt, daß oberflächengebundenes LBP zu einer starken Herabsetzung der Bindung von LBP-behandelten ELPS führt, während dies keinen Effekt auf die Bindung von EIgG oder EC3bi hatte. Tabelle IV Rezeptoren für LBP sind mobil in der Ebene der Membran¹
¹Kunststoffoberflächen wurden beschichtet mit HSA (500 ug/ml), mAb IB4 (25 ug/ml) oder mit LPS (1 ug/ml) für 2 Stunden bei 21ºC und gründlich gewaschen. Wo angezeigt, wurde anti-HSA (1 : 40 Verdünnung von Kaninchen-anti-HSA-Antiserum) oder LBP zugesetzt und für 30 Minuten bei 20ºC inkubiert. MO wurde auf den gewaschenen, beschichteten Oberflächen für 45 Minuten bei 37ºC aufgetragen und nach einem zusätzlichen Waschschritt wurden die Liganden-beschichteten Erythrozyten zugesetzt. ELPShi wurden mit 3 ug LPS/4 · 10&sup7;E hergestellt. ELPSIo wurden mit 0,3 ug LPS/4 · 10&sup7;E hergestellt und anschließend mit 5 ug/ml LBP, wie in den Beispiel 3 beschrieben, behandelt. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für vier getrennte Experimente.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß LBP von einem Molekül erkannt wird, das in der Ebene der Membran mobil ist. Die Ergebnisse lassen vermuten, daß dieser Rezeptor von CR3 und FcR verschieden ist.

9. LBP interagiert nicht mit CR3 oder FcR

Da von LPS bekannt ist, daß es von CR3 und anderen Mitgliedern des CD18 Komplexes (LFA-1 und p150,95) erkannt wird (Wright, et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888, (1986)), scheint es möglich, daß LBP die Bindung von ELPS durch Erleichterung der Interaktion einer geringen Menge von LPS mit diesen Rezeptoren fördert. Verschiedene Beobachtungen widerlegen jedoch diese Möglichkeit. Die in der Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse deuten daraufhin, daß LBP eine starke Bindung von ELPS an Monozyten hervorruft, die aus zwei Patienten mit einer angeborenen Defizienz an CD18 isoliert wurden. Die CD18-defizienten Zellen zeigten eine vernachlässigbare Bindung von ELPShi oder EC3bi in parallelen Nachweisverfahren. Tabelle V LBP vermittelt Bindung von ELPSIo an Monozyten von CD18 defizienten Patienten¹ Anhaftungsindex
¹Einzelschichten von Monozyten aus zwei CD18-defizienten Patienten (CD18-defiziente Leukozyten reagieren auf LPS in vitro) und aus zwei gesunden Erwachsenen als Kontrollen wurden mit EC3bi, ELPShi (3 ug/4 · 10&sup8;E), ELPSIo (1 ug/4 · 10&sup8;E) inkubiert. Der Anhaftungsindex wurde bestimmt. Wo angezeigt, wurden 2,5 ug/ml LBP mit den ELPSIo zugesetzt.
Ein weiterer Hinweis gegen die Beteiligung der CD18-Moleküle bei der Erkennung von LBP-behandelten ELPSIo kommt von Experimenten, bei denen CD18-Moleküle von der apikalen Oberfläche von MO verringert wurden, indem ihnen erlaubt wurde, sich auf Oberflächen auszubreiten, die mit anti-DC18 mAbs beschichtet waren. Ma IB4 modulierte CD18-Moleküle herab, wie dies durch die reduzierte Bindung von EC3bi und ELPShi gezeigt ist, während LBP-behandelte ELPSIo normal an diese Zellen (Tabelle IV) banden. Schließlich blockiert die Verringerung von Ca++ und Mg++ komplett die Bindung von C3bi und LPS an den CD18 Komplex [Wrigth et al., J. Exp. Med., 156 : 1149-1164 (1982) und Wright et al., J. Exp. Med., 164: 1876-1888 (1986)], während die Bindung von LBP- behandelten ELPSIo in den EDTA-aufweisenden Puffern äquivalent war.
Die Beteiligung von Fc-Rezeptoren in der Erkennung von LBP wurde auch ausgeschlossen. Die Verbreitung von Zellen auf einer Oberfläche, die mit einem Immunkomplex beschichtet war, modulierte die Fc-Rezeptoren sehr stark herab, wie dies durch Bindung von EIgG nachgewiesen wurde. Die Bindung von LBP-beschichteten ELPSIo wurde dagegen nicht beeinflußt (Tabelle IV). Ähnliche Studien zeigten, daß oberflächengebundenes Mannosebindungsprotein und oberflächengebundene mAbs gegen FcRI, FcRII, FcRIII und CR1 keinen Effekt auf die Bindung von LBP zu MO zeigten. Diese Daten lassen vermuten, daß LBP nicht von CR1, CR3, FcR oder von den Mannosebindungsprotein-Rezeptoren erkannt wird.

10. Rezeptoren für LBP fördern die Fc-vermittelte Phagozytose

Die Zugabe von anti-E IgG führte dazu, daß LBP beschichtete ELPSIo sehr stark von MO (Abb. 4) phagozytiert wurden. Die Dosis an anti-E IgG, die für eine halbmaximale Phagozytose notwendig war, war um das 5-fache geringer, als die Dosis, die für die Induktion der Phagozytose von nicht-beschichteten E (Abb. 4) notwendig war. LBP scheint somit synergistisch mit IgG zu wirken, um eine phagozytische Reaktion zu induzieren. Gemäß früheren Berichten [Ehlenberger et al., J. Exp. Med., 145: 357-371, (1977)] förderte die Ablagerung von C3bi auf E auch die Phagozytose, die durch IgG vermittelt wird. Das Ausmaß von dieser Förderung war ähnlich der, die durch LBP hervorgerufen wurde (Abb. 4).
Die allein durch LBP vermittelte Phagozytose wurde auch bestimmt. Obgleich LBP- beschichtete ELPS floride Rosetten mit MO bildete, wurde keine der gebundenen E durch (Abb. 4) Fibronectin- oder durch PMA-stimulierte MO phagozytiert. Parallele Studien zeigten eine starke Fibronectin und PMA-stimulierte Phagozytose von EC3bi. Eine mögliche Erklärung für die Abwesenheit der LBP-vermittelten Phagozytose ist die hohe laterale Mobilität von LPS auf der Oberfläche eines Erythrozyten. LPS könnte eine "Kappe" auf dem Pol von E, die an MO angeheftet sind, bilden, was auf dem Umfang von E einen unzureichenden Liganden zurückläßt, um ein fortschreitendes Pseudopodium zu führen. Um solch eine Abdeckung zu verhindern, wurde biotinyliertes LBP mit biotinylierten E-Proteinen, wie oben in der Abb. 4 beschrieben, verbunden. Wieder wurde keines der auf diesem Weg gebundenen E phagozytiert durch unbeschichtete E oder durch PMA-bistimulierte MO (phagozytischer Index = 0). Parallele Studien zeigten, daß mit F (ab)&sub2;-biotinylierte anti-CD18 mAb (IB4) vollständig phagozytiert wurden (phagozytischer Index = 482). Die Rezeptoren für LBP können somit nicht selbst die Phagozytose eines beschichteten Erythrozyten initiieren.

11. Rezeptoren für LBP initiieren keinen oxidativen Aufbruch

Um zu bestimmen, ob die Interaktion von LBP mit dem Rezeptor eine zytotoxische Reaktion von MO initiiert, wurde die Produktion von Wasserstoffperoxid während der Interaktion von MO mit den beschichteten Oberflächen gemessen.
Die Freisetzung von Wasserstoffperoxid während des Ausbreitens von MO auf beschichteten Oberflächen wurde bestimmt gemäß der Beschreibung von delaHarpe et al., J. Immunol. Methods, 78: 323-336, (1985). 3-4 · 10&sup4; MO (Tag 3 oder 4) wurden zu Proteinbeschichteten Gewebekulturvertiefungen zugesetzt, die Meerrettichperoxidase und 2,4 nMole von Scopoletin enthielten. Die Platte wurde bei 37ºC inkubiert. Der Verbrauch an Scopoletin wurde in Intervallen und unter Verwendung eines automatischen Fluoreszenzplattenlesers gemessen. Die Ergebnisse von drei Vertiefungen wurden gemittelt und sind als nMole Peroxid produziert pro Vertiefung dargestellt. Der Zusatz einer Kontrollstimulanz, PMA (100 ng/ml), ergab eine schnelle Entwicklung von Peroxid, die bezüglich der Rate und des Ausmaßes für alle getesteten, beschichteten Oberflächen identisch war.
Abb. 5 zeigt, daß die MO-Bindung zu den LPS-beschichteten Oberflächen eine kleine Freisetzung von Peroxid (12% im Vergleich zu dem, was durch die Immunkomplexe oder durch PMA stimuliert wird) hervorrief. Mit LBP beschichtete Oberflächen bewirkten jedoch keine Freisetzung von Peroxid über die obige Grundlinie hinaus. Ferner blockte der Zusatz von LBP zu den LPS-beschichteten Oberflächen die durch LPS hervorgerufene Freisetzung, womit bestätigt wurde, daß LBP in diesem Experiment wirksam mit LPS interagierte. Parallele Experimente zeigten, daß die Ausbreitung von MO auf LBP oder LPS-LBP-beschichteten Oberflächen eine Herabsenkung der Bindung von LBP-behandelten ELPSIo bewirkte. Dies bestätigt, daß eine Ligation der LBP-Rezeptoren stattgefunden hat. Die LBP-Rezeptoren erscheinen somit nicht in der Lage, einen oxidativen Ausbruch zu bewirken.

12. Hemmung der LPS-LBP Komplexbindung zu MO durch anti-CD14 Antikörper

Die Fähigkeit von drei anti-CD14 mAbs zur Hemmung der Bindung von LPS-LBP Komplexen zu MO wurde untersucht. Einzelschichten von menschlichen MO wurden für 15 Minuten bei 0ºC mit mAb 3C10, 60b oder 26ic mit Konzentrationen von 0 ug/ml, 0,15 ug/ml, 0,5 ug/ml, 1,5 ug/ml, 5 ug/ml und 15 ug/ml inkubiert. Die Fähigkeit der Einzelschichten zur Bindung LBP-behandelten ELPSIo (Beispiel 3) wurde gemäß der Beschreibung von Beispiel 4 bestimmt.
Die Ergebnisse von dieser Studie sind in der Abb. 6 dargestellt und zeigen, daß mAbs 3C10 und 60b einen Anheftungsindex bewirkten, der mit zunehmender Konzentration von verwendeten mAb abnahm, während mAb 26ic, die ein Epitop erkennen, welches von dem verschieden ist, was durch mAbs 3C10 und 60b erkannt wird, nicht bewirkte, daß der Index unter die Konzentrationen reduziert wurde, die bei der Kon trollkonzentration von mAb (0 ug/ml) erzielt wurde, d. h. keine Hemmung der Bindung. mAbs 3C10 und 60b haben somit die Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von LPS-LBP Komplexen an MO. Die Spezifität der Hemmung wird durch Beobachtung belegt, daß mAbs gegen CD11b, CD18, CD16 und HLA die Bindung nicht hemmen (Daten nicht gezeigt).
Im Gegensatz dazu zeigt die Abb. 7, daß mAbs 26ic, 3C10 und 60b alle in Lage sind, die Bindung von LPS-LBP Komplexen zu MO herabzumodulieren. Monoklonale Antikörper wurden vor Etablierung der MO-Einzelschichten an die Gewebekulturplatten angeheftet. Dies wurde durch Beimischung von mAb in eine Platte mit einer Konzentration von 25 ug Protein/ml durchgeführt, wobei die mAb in den Platten für 60 Minuten bei 20ºC gehalten wurden. Anschließend wurden die nicht-gebundenen mAb von der Platte vor der Zugabe von MO gespült. MO, die mit anti-CD14 mAbs oberflächenbeschichtet und so angeheftet waren, aber nicht mit anderen mAbs, zeigten eine abnehmende Bindung der Erythrozyten, die mit LPS-LBP Komplexen beschichtet waren. CD14, der an der Basaloberfläche der angehefteten Makrophagen wiederverteilt wird, ist somit für das Binden der LPS-LBP Komplexe notwendig. Dieses Ergebnis bestätigt die Aussage von Abb. 6, daß CD14 als ein Rezeptor für die LPS-LBP Komplexe dient.

13. CD14 bindet spezifisch die LPS-LBP LPS-LBP Komplexe

Die Fähigkeit von gereinigten CD14 zur spezifischen Bindung von LPS-LBP Komplexen wurde bestimmt. CD14 wurde an Oberflächen immobilisiert, indem sie zunächst mit anti- CD14 mAbs und anschließend mit einem Triton X-100 Extrakt von Monozyten beschichtet wurden. 108 Monozyten wurden in 1% Triton in PBS suspendiert, für 15 Minuten bei 0ºC inkubiert, und das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Der Extrakt, der CD14 enthielt, wurde auf die Antikörper-beschichteten Oberflächen aufgetragen. Dieses Verfahren führte zu Oberflächen, die mit CD14 beschichtet waren. Bei den Kontrollen trugen die Vertiefungen Antikörper gegen solche Antigene, die von CD14 verschieden waren. Dieses Verfahren führte zu Oberflächen, die mit Proteinen beschichtet waren, die keine CD14 waren. Nach gründlichem Waschen wurden die mit den LPS-LBP Komplexen beschichteten Erythrozyten zu den beschichteten Vertiefungen zugefügt. Die Anheftung der Erythrozyten (ELPSIo) wurde durch Fotografie dokumentiert. CD14 adsorbierte an die Oberfläche über mAb 26ic, ein Antikörper zu CD14, der die Bindungsstelle für die LPS- LBP Bindungsstellen nicht blockiert, und band die beschichteten Erythrozyten sehr stark. Die mit anderen Antigenen beschichteten Oberflächen zeigten nicht diese Aktivität. Gereinigte CD14 Moleküle haben somit die Fähigkeit zur Bindung von LPS-LBP Komplexen. Diese Beobachtung bestätigt, daß CD14 als ein Rezeptor für LPS-LBP Komplexe dient.

14. LPS-LBP Komplexe induzieren die TNF-Sekretion in MO

Die Fähigkeit von LPS in Gegenwart von LBP, hitzebehandeltem LBP, Rinderserumalbumin (BSA) oder fötalem Kälberserum (FCS) zur Induktion der TNF- Sekretion in peritonealen Exsudat-Makrophagen (PEM) wurde überprüft.
Um Kaninchen PEM herzustellen, wurden NZW Kaninchen (2-2,5 kg) eine intraperitoneale Injektion von 35 Mineralöl (Drakeol 6VRm Pennreco, Butler, PA) gegeben, das 10 ug Zellwandpräparation von BCG (BCG Cell Walls, R-200, Ribi Immunochem Research, Inc. Hamilton, MT) enthielt. Drei Tage später wurde eine i. v. Bolus-Injektion von 120 mg Natriumpentobarbital (Western Medical Supply Inc., Arcadia, CA) hergestellt. Es folgte eine aseptische Spülung des Peritoneums mit 500 ml eiskalter RPMI-1640, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 50 U/50 ug Penicillin/Streptomycin pro ml, 10 mM Hepes, 2% fötales Rinderserum und 5 U/ml Herapin. Die geernteten Zellen wurden zentrifugiert (1000 · G, 10 Minuten, 4ºC) und resuspendiert in dem obigen Medium ohne FBS (serumfreies Medium). Nach einem zusätzlichen Schleudern und Resuspendieren in serumfreiem Medium wurden die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt und in 150 cm² Flaschen mit einer Dichte von 8-10 · 10&sup7; Magrophagen/Flasche plattiert. Nach 2 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, wurden nicht-angeheftete Zellen durch gründliches Waschen und Ergänzung mit 20 ml serumfreiem Medium aus den Flaschen entfernt. Die Mineralöl-induzierten, peritonealen Exsudat-Zellen enthielten bei Überprüfung mit Wright's gefärbten Cytocentrifugen-Präparationen etwa 60% Makrophagen, 35% Neutrophile und 5% Lymphozyten. Nach Plattierung und Waschen waren die angehefteten Zellen zu mehr als 90% Makrophagen. Die so hergestellten Kaninchen-PEM wurden mit LPS, isoliert aus Salmonella minesota Re595 (100 pg/ml), in Gegenwart und Abwesenheit der oben bezeichneten Proteine für 12 Stunden behandelt. Der zellfreie Überstand wurde, wie oben beschrieben, auf TNF überprüft, wobei eine Modifikation des L929-Nachweistests von Ruff et al., Lymphokines, 2: 235-242, (1981) wie beschrieben in Mathison et al., J. Clin. Inves., 81: 1925 (1988), verwendet wurde.
L929-Zellen (CCL 1, American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden in RPMI 1640 aufbewahrt, welches mit 10 mM Hepes und mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war (Hyclone, Rehatuin F. S., Reheis Chemical Co., Phoenix, AZ). Zusammenfließende Kulturen (3-4 · 10&sup7; Zellen/75 cm Flaschen) wurden mit 0,5% Trypsin (TRL3, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ) in physiologischer Salzlösung kurz gespült, die 5 mM EDTA und 10 mM Hepes enthielt, pH 7,4, in frischem Medium, das Actinomycin D (1 ug/ml) enthielt, resuspendiert und zu Platten mit 96 Vertiefungen zugegeben (5-7 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung). Nach zweistündiger Kultur wurden stufenweise verdünnte Proben den Vertiefungen zugesetzt und die Platten wurden über Nacht (5% CO&sub2;, 37ºC) inkubiert. Nach einer mikroskopischen Überprüfung wurde das Medium abgegossen und die Vertiefungen wurden mit einer Lösung von 0,2% Kristallviolett, 10% Formalin, 0,01 Phosphat, pH 7-7,5 für 5 Minuten gefüllt, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Maß der Lyse wurde spektrofotometrisch (550 nm) unter Verwendung eines Bio-Tek Modell EL310 Plattenlesers (Bio-Tek Instruments, Inc., Burlington, VT), verbunden mit einem IBM-PC Computer, quantitativ bestimmt. Die Nachweisergebnisse wurden als U/ml ausgedrückt, wobei eine Einheit (U) als die Menge von TNF definiert ist, die zu einer 50%-igen Lyse der Zellen führt.
Routinemäßig wurden 8-12 Platten pro Nachweis getestet. Jede Platte enthielt zwei Laborstandards und zwar konditioniertes Medium von Re595 LPS-behandelten RAW 264.7 Zellen (6 · 10³ U/min) und konditioniertes Medium von Re595 LPS-behandelten Kaninchen-PEN (1,3 · 10³ U/ml). Diese Standards wurden ihrerseits gegen menschliches rekombinantes TNF kalibriert (Cetus Corportaion, Emeryville, CA, 2 · 10&sup7; U/mg). Die Nachweisergebnisse wurden demgemäß normalisiert. Die Proben wurden vierfach getestet und ein Variationskoeffizient (SD/Mittel) von 0,12 ± 0,08 (SD) wurde beobachtet. Unter Verwendung dieses Nachweises konnten so wenig wie 10 pg/ml Kaninchenmakrophagen-abstammendes TNF (spezifische Aktivität 1 · 10&sup8; U/mg) nachgewiesen werden. Da jedoch Serumkonzentrationen von mehr als 10% ein nichtspezifisches Abrunden und Verlust der Anhaftung der L929-Zellen verursachte, war die untere Grenze des Nachweises des Kaninchen-TNF im Serum 20 U/ml (entsprechend zu 0,2 ng TNF/ml).
Die Ergebnisse von dieser Studie, die in der Abb. 8 dargestellt sind, zeigen, daß TNF nur hergestellt wird, wenn sowohl LPS und aktives LBP vorhanden sind. Re595 LPS stammt von einem rauhen Stamm von Salmonella ab. Identische Ergebnisse wurden erzielt, wenn aus einem glatten Stammorganismus isoliertes LPS verwendet wurde, wie LPS aus E. coli 0111:B4, was die Allgemeingültigkeit der hier beobachteten Effekte anzeigt.

15. Bindung von LPS zu LBP schützt LBP vor einer Trypsinspaltung

Es wurden Proben hergestellt, die LBP mit einer Endkonzentration von 0,3 mg/ml in einem Puffer enthielten, der 50 mM HEPES, 10 mM EDTA, pH 7,4, enthielt. Zu einer Probe wurde LP5 bis zu einer Endkonzentration von 0,125 mg/ml zugemischt. Zu einer zweiten Probe wurde Dextransulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,125 mg/ml zugemischt. Anschließend wurde Trypsin zu allen drei Proben bis zu einer Endkonzentration von 2 ug/ml zugemischt. Aliquots wurden aus den mit Trypsin behandelten Proben nach 5, 25, 60 und 120 Minuten entfernt, wobei die Proben auf 37ºC gehalten wurden. Die Aliquots wurden dann mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelectrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung von 12% Gelen analysiert. Die Ergebnisse dieser Studie sind in der Abb. 9 gezeigt und belegen, daß die Bindung von LPS durch LBP dieses LBP vor einem enzymatischen Abbau schützt. LPS kann LBP entweder durch Induktion eines Konformationswechsels in LBP schützen, was eine Spaltung verhindert, oder durch einen sterisch behinderten Zugang zu der Spaltstelle.

16. anti-CD14 monoklonale Antikörper hemmen den LPS-LBP Komplex, der die TNF- Produktion im gesamten menschlichen Blut induziert

Die Fähigkeit von anti-CD14 mAbs zur Hemmung der TNF-Sekretion durch MO im menschlichen Blut wurde getestet unter Verwendung des TNF-induzierten, cytotoxischen Aktvitiätsnachweises gemäß der Beschreibung von Espevik et al., J. Immunol. Meth., 95: 99-105, (1986). Menschliches Gesamtblut, nicht-koaguliert mit Heparin, wurde hergestellt und inkubiert mit mAb 3C10, 60b oder IB4 mit einer Endkonzentration von 1 ug/ml bei 37ºC für 30 Minuten. Anschließend wurden die Zellen mit Re595 LPS mit einer Endkonzentration von 0, 0,01, 0,1 oder 1,0 ng/ml bei 37ºC für 12 Stunden in einem befeuchteten Inkubator, 10% CO&sub2;, inkubiert. Das Plasma wurde dann von jeder Probe gesammelt und auf Anwesenheit von TNF überprüft.
Für diese Studien war es nicht notwendig, zusätzliches LBP hinzuzufügen, da konstitutive Konzentrationen von LBP im Blut von gesunden Personen auf 100-250 ng/ml geprüft wurden. (Tobias et al., J. Exp. Med. 164: 777 (1986) und Tobias et al., Infect. Immun. 50: 73-76 (1985)). Basierend auf der Abschätzung der Affinität von LPS für LBP (Tobias et al., J. Biol. Chem. 264: 10867-10871 (1989)) waren die konstitutiven Konzentrationen von LBP mehr als ausreichend, um all das hinzugefügte LPS zu binden.
WEHI Klon 13-Zellen wurden von T. Ezpevik an der Universität von Trondheim, Norwegen, erhalten und in RPMI 1640 Kulturmedium (Gibco) kultiviert, welches 10% FCS, 0,1 mM Glutamin und 30 ug/ml Gentamicin enthielt. Diese Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 2 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung in 100 Mikroliter (ul) des RPMI 1640 Kulturmediums gegeben. Proben von 5 bis 50 Mikroliter (ul) des MO- Kulturüberstandes wurde dann den WEHI Klon 13-Zellwachstumsmedien zugemischt und für 20 Stunden bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden 10 ul von MTT Tetrazolium (M- 2128 Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) mit einer Konzentration von 5 mg/ml in PBS zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zugesetzt und die Vertiefungen wurden weiter für 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach Absaugen von 100 ul des Überstandes aus den Vertiefungen wurde zu jeder Vertiefung 100 ul Isopropanol mit 0,04 N HCL zugesetzt. Nach Lösen der dunkelblauen Formazan-Kristalle wurden die Platten auf einem Mikrotiterplatten-Leser abgelesen, wobei eine Testwellenlänge von 570 nm und eine Referenzwellenlänge von 630 nm verwendet wurde.
Der Prozensatz der toten Zielzellen wurde wie folgt bestimmt:
= 100 - (optische Dichte in Vertiefungen mit CF/TN/optische Dichte in Kontrollvertiefungen) · 100.
Der Prozentsatz der toten Zellen, die in den experimentellen Kulturen beobachtet wurde, wurde dann mit dem Prozentsatz verglichen, der sich aus den verschiedenen bekannten Verdünnungen von TNF ergab, um die entsprechende TNF-Konzentration von jeder Experimentalkultur zu bestimmen. Die Ergebnisse von dieser Studie sind in der Tabelle VI dargestellt. Tabelle VI Wirkung von monoklonalen Antikörpern auf die LPS-induzierte TNF-Produktion im menschlichen Gesamtblut
¹Alle monoklonalen Antikörper wurden mit einer Endkonzentration von 1 ug/ml zugesetzt.
²TNF-Nachweisreaktionen wurden mit dem WEHI Klon 13-Nachweis durchgeführt unter Verwendung von rekombinantem TNF mit einer spezifischen Aktivität von 2 · 10&sup7; Einheiten (U) pro mg als Standard.
³Ein anti-CD18 mAB.
Aus der Tabelle VI ist zu erkennen, daß die LPS-induzierte TNF-Produktion im menschlichen Gesamtblut mit zunehmender Konzentration von LPS zunimmt. Zusätzlich ist erkennbar, daß die LPS-LBP komplex-induzierte TNF-Produktion signifikant durch die anti-CD14 monoklonalen Antikörper 3C10 und 60b gehemmt wurde, während der anti- CD18 IB4 monoklonale Antikörper keine signifikante Hemmung der TNF-Produktion ergab. Ähnliche Experimente wurden durchgeführt mit LPS, das aus der glatten Form des Bakteriums E. coli 0111:B4 isoliert wurde, was die Allgemeinheit des Effektes auf LPS- Präparationen mit variierendem Kohlenhydratgehalt, die aber konservierte Lipid A- Strukturen enthalten, anzeigt.
Die TNF-Spezifität der cytotoxischen Aktivität, die im Gesamtblut gefunden wurde, wurde etabliert unter Verwendung eines polyklonalen Ziegen-anti-Mensch TNF IgG Antikörpers gemäß der Beschreibung von Mathison et al., J. Clin. Invest., 81: 1925 (1988). Dieser Antikörper neutralisiert komplett die gesamte cytotoxische Aktivität, die in den Proben des LPS-behandelten Gesamtblutes gefunden wurde.

17. Diskussion der Ergebnisse der Beispiele 1-16

Die obige Beschreibung zeigt, daß LBP als ein Opsonin agiert, da es Bakterien bindet und ihre Bindung und Phagocytose durch Makrophagen erleichtert. Es wird angenommen, daß die Anheftung von LBP zu den Zellen durch eine Domäne vermittelt wird, die zu LBP einzigartig ist, da LBP LPS über eine Domäne bindet, die homolog mit der LPS-bindenden Domäne von BPI ist.
LBP auf der Oberfläche von LPS-beschichteten Partikeln wird von einem spezifischen Rezeptor, CD14, auf MO erkannt, der in der Ebene der Membran mobil ist. Die LBP- beschichteten Partikel binden an die CD14-exprimierenden Zellen, wie MO, aber nicht an andere Blutzellen. Diese Bindungsaktivität auf der apikalen Oberfläche von MO wird durch das Ausbreiten der Zellen auf Substraten, die mit LBP-LPS Komplexen beschichtet sind, reduziert. Der Rezeptor für LBP, CD14, ist von anderen obsonischen Rezeptoren verschieden, da die Oberflächen-gebundenen Antikörper zu CR1, CR3 und FcR die Bindung der LBP-beschichteten Partikel nicht reduzieren.
Als ein Opsonin fördert LBP die Beseitigung von Sepsis-induzierenden, infektiösen Mitteln, wie gramnegative Bakterien. Während der Sepsis kann jedoch eine Bakterienlyse auftreten und zwar entweder durch die Wirkung von endogenen, lytischen Mechanismen, einschließlich von Komplement- und Abbauenzymen, oder nach einer antibiotischen Behandlung. Die Lyse führt zu einer systemische Freisetzung von LPS, was ein Anstieg der LPS-Konzentrationen im Blut bewirkt. Da diese Konzentrationen auf 1-1000 pg LPS/ml geschätzt werden, liegt genügend LBP vor, um LPS-LBP Komplexe von hoher Affinität zu bilden (Sturk et al., in Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Amebocyte Lystate Test, Hrsg. Watson, S. W., Allan R. Liss, NY 1987: 371-385; von Deventer, S. J. H., Lancet 1: 605-608 (1988), et al.). LPS-LBP Komplexe binden an CD14 auf Zellen der Makrophagen/Monozyten-Linie und initiieren eine rasche Synthese und Freisetzung des Monokins, TNF, und beteiligen sich somit signifikant an der Entwicklung des voll ausgebildeten Sepsis-Syndroms.
Das klassische Opsonin, IgG, erleichtert die Bindung von IgG-beschichteten Partikeln, ihrer phagozytischen Umschließung und die Freisetzung von toxischen Verbindungen, wie Wasserstoffperoxid. Das andere klassische Opsonin, C3, erleichtert prinzipiell die Bindung der C3-beschichteten Partikel. Eine Phagocytose durch nicht-stimulierte MO wird nur beobachtet, wenn die C3-beschichteten Partikel auch IgG tragen (Ehlenberger et al., J. Exp. Med., 145: 357-371, (1977)). Die Evolution von Wasserstoffperoxid wird nicht initiiert (Wright, et al., J. Exp. Med., 158: 2016-2023, (1983)).
Die opsonische Aktivität von LBP ähnelt am stärksten der von C3. LBP beschichtete Partikel werden sehr stark durch MO gebunden, wobei dieses Binden keine Phagocytose oder eine Freisetzung von Wasserstoffperoxid (Abb. 5) initiiert. LBP wirkt ähnlich wie C3, da es die Phagocytose von Partikeln, die mit geringen Mengen von IgG beschichtet sind (Abb. 4), fördert. Der opsonische Effekt von LBP ist von dem von C3 in einem Aspekt unterschiedlich. Während die Komplementproteine die Phagocytose initiieren können, wenn MO mit einem Hilfsstimulus behandelt werden, wie PMA (Wright et al., J. Exp. Med. 156: 1149-1164 (1982)) oder Fibronectin (Wright, et al., J. Exp. Med. 158: 1338- 1343 (1983)), vermittelt LBP keine Phagocytose und zwar selbst in solch optimal stimulierten Zellen nicht.
Durch die Wirkung als ein Opsonin beschränkt LBP die Ausbreitung von gramnegativen Bakterien in einem Tier. Das Auftreten von LBP während der akuten Phase macht es sehr geeignet zur Bekämpfung der Infektion. Es wird somit angenommen, daß LBP einen Abwehrmechanismus gegen infektiöse Mittel, wie gramnegative Bakterien, darstellt. Die obige Beschreibung, einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und der Beispiele beabsichtigt nur eine Darstellung der vorliegenden Erfindung und kann nicht als eine Beschränkung verstanden werden. Zahlreiche andere Variationen und Modifikationen können durchgeführt werden, ohne daß dadurch der Umfang der Erfindung gemäß den beiliegenden Ansprüchen verlassen wird.

Claims

1. Therapeutische Zusammensetzung für die Verwendung zur Verbesserung der Sepsis oder der Symptome der Endotoxämie in einem Patienten, wobei die Zusammensetzung einen anti-CD14 Antikörper in einer Form umfaßt, die für eine intravenöse Verabreichung bei einem Menschen geeignet ist.

2. Therapeutische Zusammensetzung für die Verwendung zur Verbesserung der Sepsis oder der Symptome der Endotoxämie in einem Patienten, wobei die Zusammmensetzung einen anti-CD14 Antikörper in einer Einheitsdosisform umfaßt.

3. Therapeutische Zusammensetzung für die Verwendung zur Verbesserung der Sepsis oder der Symptome der Endotoxämie in einem Patienten, wobei die Zusammensetzung einen anti-CD14 Antikörper zusammen mit einem Antibiotikum, einem Steroid, einem anti- TNF Antikörper, einem TNF-Antagonisten, einem löslichen CD14 oder einer Mischung davon umfaßt.

4. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der anti-CD14 Antikörper die Bindung der Lipopolysaccharid-Lipopolysaccharid - Bindeproteinkomlexe zu CD14 hemmt.

5. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der anti- CD14 Antikörper durch das Hybridom ATCC TIB228 oder eine anti-CD14 Antikörpermolekül-exprimierende Nukleinsäure davon hergestellt wird.

6. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der anti- CD14 Antikörper F(ab')&sub2; -Abschnitte der anti-CD14 Antikörpermoleküle umfaßt.

7. Verwendung eines anti-CD14 Antikörpers bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung der Sepsis.

8. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 7, wobei das Verfahren zur Verbesserung der Sepsis die Verabreichung von 0,1 bis 20 Milligramm des Antikörpers pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag umfaßt.

9. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei das Verfahren zur Verbesserung der Sepsis ferner die im wesentlichen gleichzeitige Verabreichung einer bakteriziden Menge eines Antibiotikums an einen Patienten umfaßt.

10. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 9, wobei das Antibiotikum ein antibakterielles Mittel ist, das gegen gram-negative Bakterien wirksam ist.

11. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Sepsis durch eine Infektion mit gramnegativen Bakterien hervorgerufen wird.

12. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Sepsis durch eine Infektion mit einem Virus, einem grampositiven Bakterium oder einem Pilz hervorgerufen wird.

13. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 7, wobei das Verfahren ferner die im wesentlichen gleichzeitige Verabreichung einer die TNF-Blutkonzentration reduzierenden Menge eines anti-TNF Antikörpers an einen Patienten umfaßt.

14. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 13, wobei das Verfahren ferner die Verabreichung einer bakteriziden Menge eines Antibiotikums, im wesentlichen gleichzeitig mit dem anti-CD14 Antikörper, an den Patienten umfaßt.

15. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 7, wobei der Patient eines oder mehrere der folgenden Symptome zeigt: adultes Atemnot-Syndrom, disseminierte intravaskuläre Koagulation, Nierenversagen und Leberversagen.

16. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 7, wobei die Sepsis das Ergebnis eines chemischen oder physischen Traumas ist.

17. Verwendung eines anti-CD14 Antikörpers bei der Herstellung eines Medikamentes für die Verbesserung der Symptome von Endotoxämie in einem Patienten durch ein Verfahren, welches die Verabreichung einer Menge des Antikörpers an den Patienten umfaßt, die ausreicht, um in dem Patienten die Sekretion des Lipopolysaccharidinduzierten Tumor-Nekrosefaktors durch Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie zu hemmen.

18. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 7 bis 17, wobei der Antikörper die Bindung der Lipopolysaccharid-Lipopolysaccharid - Bindeproteinkomlexe zu CD14 hemmt.

19. Verwendung eines anti-CD14 Antikörpers nach Anspruch 18, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der die Bindung der Lipopolysaccharid-Lipopolysaccharid - Bindeproteinkomlexe zu CD14 kompetitiv hemmt.

20. Verwendung eines anti-CD14 Antikörpers nach einem der Ansprüche 7 bis 18, wobei der Antikörper durch das Hybridom ATCC TIB228 oder durch eine anti-CD14 Antikörpermolekül-exprimierende Nukleinsäure davon hergestellt wird.

21. Verwendung eines anti-CD14 Antikörpers nach einem der Ansprüche 7 bis 18, wobei der Antikörper F(ab')&sub2; -Abschnitte der anti-CD14 Antikörpermoleküle umfaßt.

22. Anti-Lipopolysaccharid-Bindeprotein-Antikörper, der wirksam ist, um die Bindung der Lipopolysaccharid-Lipopolysaccharid - Bindeproteinkomlexe zu CD14 zu hemmen, für die Verwendung zur Verbesserung von Sepsis bei einem Patienten.

23. Peptidanalogon zu dem Lipopolysaccharid-Bindeprotein, das wirksam ist, um die Bindung der Lipopolysaccharid-Lipopolysaccharid - Bindeproteinkomlexe zu CD14 zu hemmen, für die Verwendung zur Verbesserung von Sepsis bei einem Patienten.

24. Peptidanalogon nach Anspruch 23 mit einer Aminosäuresequenz, die durch die folgende Formel dargestellt ist: CNRCNRAPQPDELY; YTTPEPSELDDEDFRC oder KRVDADADPRQYADTC.

25. Therapeutische Zusammensetzung, die in einer Einheitsdosisform anti-CD14 Antikörpermoleküle in einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger, wobei die Antikörpermoleküle zur Hemmung der Bindung von LPS-LBP Komplexen zu CD14 in der Lage sind, in Kombination mit einer Einheitsdosis von anti-TNF Antikörpermolekülen umfaßt.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, die ferner eine bakterizide Menge eines Antibiotikums umfaßt.

27. Zusammensetzung, umfassend anti-CD14 Antikörpermoleküle, die zur Hemmung der Bindung von LPS-LBP Komplexen zu CD14 in der Lage sind, und ein Antibiotikum und/oder anti-TNF Antikörpermoleküle als Wirkstoffe in Konzentrationen, die zur Verabreichung für die Behandlung von Sepsis beim Menschen geeignet sind.