DE3852374T2

DE3852374T2 - Verwendung von ICAM-1 oder ihre funktionelle Derivate zur Behandlung unspezifischer Entzündungen.

Info

Publication number: DE3852374T2
Application number: DE3852374T
Authority: DE
Inventors: Donald Carroll Anderson; Randall Wilbur Barton; Robert Rothlein; Clinton Wayne Smith
Original assignee: Baylor College of Medicine; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Baylor College of Medicine; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1987-11-02
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2008-04-30
Also published as: DK175491B1; CA1331132C; ATE114972T1; DK239388A; DK239388D0; AU1550988A; AU2633388A; GR3015298T3; EP0314863A2; JP2710627B2; JPH01135724A; EP0314863B1; ES2064327T3; ZA883160B; DE3852374D1; EP0314863A3; AU622120B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von interzellulären Adhäsions-Molekülen wie ICAM-1, Antagonisten, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, oder ICAM-1-abgeleitete Antagonisten, die zur Bindung an den natürlichen Bindungspartner des ICAM-1 befähigt sind, um die interzelluläre Adhäsion von Zellen der Granulozyten- oder Makrophagen-Linie zu inhibieren.
Granulozyten müssen in der Lage sein, sich an zelluläre Substrate anzuheften, damit eine entzündliche Antwort erfolgt. Diese Tatsache folgte aus zwei konvergierenden Forschungsrichtungen.
Zu der ersten Forschungsrichtung zählen Untersuchungen von Leukozyten-Membranproteinen (Wallis, W.J., et al., J. Immunol. 135 : 2323-2330 (1985); Mentzer, S.J., et al., J. Cell. Physiol. 126 : 285-290 (1986); Haskard, D.O., et al., J. Immunol. 137 : 2901-2906 (1986); Harlan, J.M., et al . . Blood 66 : 167-178 (1985)). Besonders wichtig für den zellulären Adhäsionsprozeß ist eine Familie von Leukozyten-Membranproteinen, die als "CD18"-Familie oder -Komplex bekannt sind. Diese Familie besteht aus drei Heterodimeren (bekannt als "Mac-1", "LFA-1 und "P150,90"), die alle eine gemeinsame Untereinheit (bekannt als die β-Untereinheit) und eine einzigartige Untereinheit (bekannt als die α-Untereinheit) besitzen (Springer, T.A., et al. Immunol. Rev. 68 : 111-135 (1982); Springer, T., et al., Fed. Proc. 44 : 2660-2663 (1985); Keizer, G., et al., Eur. J. Immunol. 15 : 1142-1147 (1985); Sanchez-Madrid, F., et al., J. Exper. Med. 158 : 1785-1803 (1983)). MAC-1 ist auf Makrophagen, Granulozyten und anderen Leukozyten vorhanden.
Monoklonale Antikörper gegen die CD18-Familie der Leukozyten- Membranproteine inhibieren eine Vielzahl von Leukozyten- Adhäsions-abhängigen Vorgängen in vitro, indem sie als Antagonisten dieser Proteine wirken. Dazu zählen die Fähigkeit der Granulozyten, als Antwort auf geeignete stimuli zu aggregieren, die Fähigkeit der Granulozyten, sich an mit Protein überzogenem Kunststoff anzuheften, die Fähigkeit der Granulozyten, in 2-dimensionalen Agarose-Assays zu wandern und die Fähigkeit der Granulozyten, sich an endotheliale Zellen anzuheften.
Die zweite Forschungsrichtung resultiert aus Untersuchungen an Individuen, die aufgrund eines vererbten Fehlers in dem Gen, das für die gemeinsame Untereinheit der CD18-Familie der Leukozyten-Adhäsionsmoleküle codiert, nicht in der Lage sind, eines dieser Adhäsionsmoleküle auf den Oberflächen ihrer Zellen zu exprimieren. Man sagt, daß diese Individuen an "Leukocyte Adherence Deficiency Disease" ("LAD") leiden (Anderson, D.C. et al, Fed. Proc. 44 : 2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152 : 668-689 (1985)). Zu charakteristischen Merkmalen von LAD-Patienten zählen nekrotische Läsionen des weichen Gewebes, eine verminderte Eiterbildung und Wundheilung sowie Abnormalitäten der Adhäsions-abhängigen Leukozytenfunktionen in vitro. Granulozyten dieser LAD-Patienten verhalten sich genauso fehlerhaft in vitro wie deren normale Gegenstücke in Gegenwart von anti-CD18 monoklonalen Antikörpern. D.h., sie sind nicht in der Lage, Adhäsions-bezogene Funktionen, wie eine Aggregation oder eine Anheftung an Endothelzellen, durchzuführen. Wichtiger ist jedoch die Beobachtung, daß diese Patienten aufgrund der Unfähigkeit ihrer Granulozyten, sich an zelluläre Substrate anzuheften, nicht in der Lage sind, eine normale entzündliche Reaktion zu entwickeln. Sehr bemerkenswert ist die Beobachtung, daß Granulozyten dieser LAD-Patienten aufgrund ihrer Unfähigkeit, sich an die Endothelzellen in den Blutgefäßen in der Nähe der entzündeten Läsionen anzuheften, nicht in der Lage sind, zu den Entzündungsorten zu gelangen. Solch eine Anheftung ist ein notwendiger Schritt zur Extravasation.
Die Moleküle auf dem Endothel, an die sich die Adhäsionsmoleküle der Granulozyten anheften, sind bisher nicht identifiziert worden. Der Wert einer Identifizierung des natürlichen Liganden des MAC-1 wird klar, wenn man bedenkt, daß das Molekül selbst oder ein Antagonist eines solchen Moleküls die Wechselwirkung von Granulozyten mit dem Endothel inhibiert und somit die LAD- Patienten nachahmen kann, was in den Fällen eine wünschenswerte Eigenschaft darstellt, bei denen die entzündliche Reaktion zum Wachteil des Individuums erfolgt.
Zusammengefaßt erfordert die Fähigkeit der Granulozyten, die Gesundheit und Lebensfähigkeit von Mensch und Tier (Animal) aufrechtzuerhalten, daß sie zur Anhaftung an andere Zellen (wie Endothelzellen) befähigt sind. Man hat festgestellt, daß die Granulozyten-Endothelzell-Adhärenz Zell-Zell-Kontakte erfordert, woran spezifische Rezeptormoleküle, die auf der Oberfläche der Granulozytenzelle vorhanden sind, beteiligt sind. Diese Rezeptoren ermöglichen es dem Leukozyten, sich an andere Leukozyten oder an Endothel- und andere nicht-vaskuläre Zellen anzuheften. Der natürliche Bindungspartner dieser Rezeptormoleküle ist unbekannt.
Man hat festgestellt, daß die Zelloberflächen-Rezeptormoleküle der Leukozyten stark miteinander verwandt sind. Menschen, deren Leukozyten diese Zelloberflächen-Rezeptormoleküle fehlen, zeigen chronische und wiederkehrende Infektionen sowie andere klinische Symptome. Entzündliche Reaktionen werden gemildert, wenn Leukozyten nicht in der Lage sind, sich auf normale Weise anzuheften, weil ihnen die funktionellen Adhäsionsmoleküle des CD18-Komplexes fehlen. Da die Leukozyten-Adhäsion an dem Prozeß beteiligt ist, durch den eine Gewebeentzündung entsteht, besitzt ein Verständnis des Prozesses der Leukozytenadhäsion einen beträchtlichen Wert, um eine Behandlung für eine unspezifische Entzündung zu definieren.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von ICAM-1 oder eines funktionellen Derivates davon zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung einer Entzündung, die aus einer Reaktion des unspezifischen Abwehrsystems in einem Säuger resultiert. Diese Entzündung ist mit einem Zustand verbunden, der aus folgender Gruppe ausgewählt ist: dem adulten Atemnot-Syndrom; dem multiplen Organverletzungssyndrom als Folge einer Sepsis; dem multiplen Organverletzungssyndrom als Folge eines Traumas; der Reperfusionsverletzung der Myokard- oder anderer Gewebe; der akuten Glumerulonephritis; der reaktiven Arthritis; der Dermatose mit akuten entzündlichen Komponenten; der akuten eitrigen Meningitis oder anderen entzündlichen Erkrankungen des zentralen Nervensystems; einer thermischen Verletzung; der Hämodialyse; der Leukapherese; der ulzerativen Colitis; der Crohn-Krankheit; der nekrotisierenden Enterokolitis; dem Granulozyten-Transfusion-assoziierten Syndrom; und der Zytokininduzierten Toxizität.
Fig. 1 zeigt die Wirkungen von Interleukin-1 (IL-1) und f-metleu-phe (fMLP) auf die Adhärenz von humanen peripheren polymorphonukleären Blutlymphozyten (PMNL) an humane Nabelschnurvenen- Endothelzellen (HUVEC). Die Wirkung des IL-1 wurde folgendermaßen beurteilt. HUVEC wurden vier Stunden bei 37ºC in Gegenwart der angezeigten Konzentration an IL-1 inkubiert und danach gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschte Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) getaucht wurden. Die Adhärenz der nicht-stimulierten PMNL, die in PBS suspendiert waren, wurde sodann unter Verwendung eines visuellen Assays bestimmt, der bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Die Wirkung des fMLP wurde bestimmt, indem man PMNL in den dargestellten Konzentrationen von fMLP suspendierte und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubierte, bevor die Adhärenz an nicht-stimulierte HUVEC unter Verwendung eines visuellen Assays, der bei Rauintemperatur durchgeführt wurde, bestimmt wurde. Fehlerbalken, ±s.d.; n, 4; p< 0,01 für alle Punkte unterhalb von 0,05 nM fMLP und 0,01 U/ml IL-1.
Fig. 2 zeigt einen Vergleich der zeitlichen Verläufe der IL-1- und LPS-Stimulation des HUVEC-Adhäsionsvermögens. HUVEC-Monoschichten wurden bei 37ºC entweder in Gegenwart von LPS (10 ng/ml) oder von IL-1 (0,05 (U/ml) inkubiert und danach gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht wurden. Die Adhärenz der nicht-stimulierten PMNL, die in PBS suspendiert waren, wurde unter Verwendung eines visuellen Assays beurteilt. Jeder Punkt steht für den Mittelwert von drei Bestimmungen. Eine Standardabweichung an jedem Punkt betrug nicht mehr als 10% des Mittelwertes.
Fig. 3 zeigt die Wirkungen von monoklonalen Antikörpern auf die Adhärenz von humanen PMNL an nicht-stimulierte HUVEC-Monoschichten. PMNL wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur in PBS (grob-schraffierte Balken) mit und ohne die angegebenen monoklonalen Antikörper oder in 0,5 nM fMLP (fein-schraffierte Balken) mit und ohne die angegebenen monoklonalen Antikörper vorinkubiert, bevor die Adhärenz an nicht-stimulierte HUVEC-Monoschichten unter Verwendung eines visuellen Adhärenz-Assays, der bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, beurteilt wurde. TS1/18, 1 : 400-Verdünnung von Ascites; R6-5-D6, 1 : 400-Verdünnung von Aszites; fNLP, 0,5 nM; OKM1, 1 : 200-Verdünnung von Aszites; TS1/22, 1 : 200-Verdünnung von Ascites. ( ), Anzahl der einzelnen Experimente; Fehlerbalken, ± s.d.; *, p< 0,01; **, p< 0,001.
Fig. 4 zeigt die Wirkungen von monoklonalen Antikörpern auf die Adhärenz von humanen PMNL an Lipopolysaccharide (LPS) und an IL-1-stimulierte HUVEC-Monoschichten. PMNL wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur in den angegebenen Reagentien vorinkubiert, bevor die Adhärenz an HUVEC-Monoschichten unter Verwendung eines visuellen Adhärenz-Assays, der bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, beurteilt wurde. HUVEC wurden ohne (offene Balken) oder mit 10 ng/ml LPS (grob-schraffierte Balken) oder 0,5 U/ml IL-1 (fein-schraffierte Balken) vier Stunden bei 37ºC vor der Verwendung in dem Adhärenz-Assay inkubiert. TS1/18, 1 : 400-Verdünnung von Aszites; R6-5-D6, 1 : 200-Verdünnung von Aszites; fMLP, 0,5 nM; OKM1, 1 : 200-Verdünnung von Ascites; TS1/22, 1 : 200-Verdünnung von Ascites. ( ), Anzahl der einzelnen Experimente; Fehlerbalken, ± s.d.; **, p< 0,001.
Fig. 5 zeigt die Wirkungen von monoklonalen Antikörpern auf das mit IL-1 und LPS verstärkte HUVEC-Adhäsionsvermögen. HUVEC wurden vier Stunden bei 37ºC in Gegenwart von 0,5 U/ml IL-1 (feinschraffierte Balken) oder 10 ng/ml LPS (grob-schraffierte Balken) inkubiert, gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht wurden, und danach den angegebenen monoklonalen Antikörpern 15 Minuten bei 37ºC ausgesetzt, wiederum gewaschen und in Adhärenz-Kammern eingesetzt. Die Adhärenz der nicht-stimulierten humanen PMNL wurde unter Verwendung eines visuellen Assays, der bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, beurteilt. TS1/18, 1 : 400-Verdünnung von Aszites R6-5-D6, 1 : 400-Verdünnung von Aszites; OKM1, 1 : 200-Verdünnung von Aszites; W6/32, 1 : 200-Verdünnung von Aszites. ( ), Anzahl der einzelnen Experimente; Fehlerbalken ± 1 s.d.; **, p< 0,001.
Fig. 6 zeigt die Wirkungen des monoklonalen Antikörpers R6-5-D6 auf die fMLP-verstärkte Adhärenz von PMNL an HUVEC. HUVEC wurden ohne (offene Balken) oder mit 10 ng/ml LPS (grob-schraffierte Balken) oder 0,5 U/ml IL-1 (fein-schraffierte Balken) vier Stunden bei 37ºC inkubiert, gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht wurden, und sodann R6- 5-D6 (1 : 400-Verdünnung von Aszites) 15 Minuten bei 37ºC ausgesetzt. Nach dem Waschen wurde die Adhärenz der mit fMLP (0,5 nM) präinkubierten (15 min., Raumtemperatur) PMNL unter Verwendung eines visuellen Adhärenz-Assays, der bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, beurteilt. R6-5-D6, 1 : 400-Verdünnung von Aszites; fMLP, 0,5 nM; ( ) Anzahl der einzelnen Experimente; Fehlerbalken, ± s.d.; p< 0,001.
Fig. 7 zeigt die Adhärenz von CD18-defizienten PMNL an HUVEC und die Wirkungen der monoklonalen Antikörper R6-5-D6 und TS1/18. HUVEC wurden mit und ohne IL-1 (0,5 U/ml) vier Stunden bei 37ºC inkubiert, gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht wurden, und danach R6-5-D6 (1 : 400- Verdünnung von Aszites) 15 Minuten bei 37ºC ausgesetzt. Nach dem Waschen wurde die Adhärenz von normalen (Balken mit grobem Gitter) oder defizienten PMNL (Balken mit feinem Gitter), die in PBS oder mit TS1/18 (1 : 400-Verdünnung von Aszites) vorbehandelt worden waren, unter Verwendung eines visuellen Adhärenz- Assays, der bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, beurteilt.
Die Ergebnisse von vier einzelnen Experimenten mit PMNL von zwei LAD-Patienten sind dargestellt. Fehlerbalken, ± 1 s.d.
Fig. 8 zeigt die zeitlichen Änderungen der R6-5-D6-Bindung und der Adhärenz der PMNL an HUVEC-Monoschichten. HUVEC-Monoschichten wurden LPS (10 ng/ml) für die angegebenen Zeiten ausgesetzt und danach gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht wurden. Die Adhärenz der PMNL, die in TS1/18 (1 : 200-Verdünnung von Aszites) oder PBS vorinkubiert worden waren (15 min., bei Raumtemperatur), wurde unter Verwendung eines visuellen Assays bei Raumtemperatur beurteilt. Die R6-5-D6-Bindung wurde unter Verwendung eines EIA-Verfahrens beurteilt (die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes sind dargestellt). Fehlerbalken, ± 1 s.d.; n, 4. Offene Balken sowie die Balken mit feinem Gitter zeigen die Adhärenz der PMNL, die in PBS suspendiert waren, an; die Balken mit feinem Gitter zeigen die Adhärenz an, die nach Vorinkubation der PMNL in TS1/18 übrig bleibt. TS1/18 verblieb bei den Zellen während das Adhäsions-Assays.
Fig. 9 zeigt die Wirkungen von IL-1 und fMLP auf die Wanderung von PMNL durch HUVEC-Monoschichten. Die Wirkung des IL-1 wurde folgendermaßen bestimmt: HUVEC-Monoschichten wurden vier Stunden bei 37ºC in Gegenwart der angegebenen Konzentration an IL-1 inkubiert und danach gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht wurden. Der Prozentwert der Zellen, die durch die Monoschicht und zwischen die Endothelzellen und die Unterschicht wanderten, wurde bei Raumtemperatur 1000 Sekunden, nachdem man die nicht-stimulierten PMNL sich auf die Monoschicht absetzen ließ, bestimmt. Die Wirkung des fMLP auf die Wanderung durch nicht-stimulierte HUVEC wurde nach einer 15-minütigen Vorinkubation der PMNL mit der angegebenen Konzentration < n fMLP bei Raumtemperatur bestimmt.
Fig. 10 zeigt die Inhibition der PMNL-Wanderung durch LPS-stimulierte HUVEC durch R6-5-D6-IgG- und -Fab-Präparate und einen Vergleich mit CD18-defizienten PMNL. HUVEC wurden vier Stunden bei 37ºC mit 10 ng/ml LPS und 15 Minuten mit dem monoklonalen Antikörper oder mit PBS vor dem Waschen inkubiert und in die Adhärenz-Kammer eingebracht. R6-5-D6-IgG und -Fab wurden in der Konzentration, die bei der Vorinkubation verwendet wurde (8 ug/ml bzw. 48 ug/ml) vor der Injektion in die Kammer zu der Leukozyten-Suspension gegeben. Das gesamte Adhärenzverfahren wurde bei 37ºC oder bei Raumtemperatur (Rm-Temp) durchgeführt. p< 0,01 (n=4) bei jeder Versuchsbedingung im Vergleich zu normalen, adulten Zellen ohne monoklonalen Antikörper. %-Wanderung ± 1 s.d. der gesamten Zellen, die ursprünglich in Kontakt mit der Monoschicht kamen, die zwischen die Endothelzellen und die Unterschicht wandern. %-Adhärenz ± 1 s.d.; offene Balken, adulte PMNL ohne monoklonalen Antikörper; grobes Gitter, Fab- Präparat; feines Gitter, IgG-Präparat; schraffierte Balken, CD18-defiziente PMNL. *, keine Wanderung zu beobachten.
Fig. 11 zeigt die Wirkung eines anti-ICAM-Antikörpers auf den Zustrom von Neutrophilen in entzündete Kaninchenlungen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die zelluläre Leukozyten-Adhäsion resultiert aus der Wechselwirkung von Zelloberflächen-Glycoproteinen des CD18-Komplexes. Solche Moleküle umfassen Glycoproteine wie Mac-1, LFA-1 und p150,95. Das Schlüsselmerkmal solcher Glycoproteine besteht darin, daß diese Moleküle eine Rolle bei der zellulären Adhäsion spielen. Auf solche Glycoproteine wird hier gleichermaßen als "Angehörige des CD18-Komplexes" oder als "Angehörige der CD18-Molekülfamilie" Bezug genommen. Die vorliegende Erfindung ist aus dem Befund abgeleitet, daß das ICAM-1 auf Endothelzellen an die Angehörigen der CD18-Molekülfamilie auf Granulozyten, die für die Vermittlung der Granulozyten-Endothelzellen- Adhäsion verantwortlich sind, bindet, und daß Antagonisten des ICAM-1 in der Lage sind, solch eine Adhäsion zu inhibieren. Eine solche Inhibition stellt ein Mittel zur Behandlung einer allgemeinen, nicht-gewebespezifischen Entzündung dar.
Die vorliegende Erfindung leitet sich teilweise von dem Befund ab, daß die Granulozyten-Endothelzell-Adhärenz aus der Wechselwirkung von Glycoproteinen der CD18-Familie mit dem ICAM-1 resultiert. Da eine zelluläre Adhäsion erforderlich ist, damit Leukozyten zu den Entzündungsorten wandern und/oder verschiedene Effektorfunktionen, die zu der Entzündung beitragen, durchführen können, werden Agenzien, die die zelluläre Adhäsion inhibieren, eine Entzündung abschwächen oder verhindern. Eine "unspezifische Reaktion des Abwehrsystems" ist eine Antwort, die von Leukozyten vermittelt wird, die kein immunologisches Gedächtnis besitzen. Zu solchen Zellen zählen Granulozyten und Makrophagen. Eine hier gemeinte Entzündung soll aus einer Antwort des unspezifischen Abwehrsystems resultieren,das durch eine Reaktion des unspezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wird oder damit assoziiert ist. Zu Beispielen einer Entzündung, die wenigstens teilweise aus einer Reaktion des unspezifischen Abwehrsystems resultieren, zählen Entzündungen, die mit Zuständen assoziiert sind wie: adultes Atemnot-Syndrom (ARDS) oder multiple Organverletzungssyndrome als Folge einer Sepsis oder eines Traumas; eine Reperfusionsverletzung der Myokard- oder anderer Gewebe; akute Glumerolonephritits; reaktive Arthritis; Dermatosen mit akuten entzündlichen Komponenten; akute eitrige Menengitis oder andere entzündliche Erkrankungen des zentralen Nervensystems; thermische Verletzung; Hämodialyse; Leukapherese; ulzerative Colitis; die Crohn-Krankheit; nekrotisierende Enterokolitis; Granulozyten-Transfusion-assoziierte Syndrome; und eine Zytokin-induzierte Toxizität.
Die erfindungsgemäßen anti-entzündlichen Mittel sind Verbindungen, die in der Lage sind, spezifisch der Wechselwirkung des CD18-Komplexes auf Granulozyten mit dem ICAM-1 auf Endothelzellen entgegenzuwirken. Solche Antagonisten umfassen: ICAM-1; ein funktionelles Derivat des ICAM-1; einen nicht-Immunoglobolin- Antagonisten des ICAM-1; einen Antikörper, der in der Lage ist, an das ICAM-1 zu binden; und ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, an das ICAM-1 zu binden.
Der natürliche Bindungsligand der vorliegenden Erfindung ist als interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 ("ICAM-1") bekannt. ICAM-1 ist ein 76-96 Kd Glykoprotein. ICAM-1 ist kein Heterodimer. Die vorliegende Erfindung betrifft ICAM-1 und dessen "funktionelle Derivate". Ein "funktionelles Derivat" des ICAM-1 ist eine Verbindung, die eine biologische Aktivität besitzt (entweder funktionell oder strukturell), die im wesentlichen der biologischen Aktivität des ICAM-1 entspricht. Da ICAM-1 und dessen funktionelle Äquivalente in der Lage sind, an Angehörige des CD18-Komplexes zu binden, können sie als die erfindungsgemäßen anti-entzündlichen Agenzien angewendet werden. Es ist beabsichtigt, daß der Ausdruck "funktionelle Derivate" die "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemische Derivate" des Moleküls beinhalten soll. Ein "Fragment" eines Moleküls wie ICAM-1 soll sich auf einen Polypeptid-Teil des Moleküls beziehen. Eine "Variante" eines Moleküls wie ICAM-1 soll sich auf ein Molekül beziehen, das im wesentlichen der Struktur und der Funktion entweder des ganzen Moleküls oder eines Fragmentes davon ähnelt. Man sagt, daß ein Molekül einem anderen Molekül "im wesentlichen ähnlich" ist, wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen besitzen oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Vorausgesetzt, daß zwei Moleküle eine ähnliche Aktivität besitzen, werden sie mit dem hier verwendeten Ausdruck Varianten bezeichnet, sogar wenn eines der Moleküle zusätzliche Aminosäurereste, die man nicht bei dem anderen findet, enthält, oder wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist. Ein "Analog" eines Moleküls wie ICAM-1 soll sich auf ein Molekül beziehen, das eine im wesentlichen ähnliche Funktion wie entweder das gesamte Molekül oder ein Fragment davon besitzt. Wie hier verwendet, stellt ein Molekül ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls dar, wenn es zusätzliche chemische Einheiten enthält, die normalerweise keinen Teil des Moleküls bilden. Solche Einheiten können die Solubilität, die Absorption, die biologische Halbwertzeit usw. des Moleküls verbessern. Die Einheiten können alternativ die Toxizität des Moleküls herabsetzen, unerwünschte Nebeneffekte des Moleküls eliminieren oder abschwächen, usw. Einheiten, die in der Lage sind, solche Effekte zu vermitteln, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. "Toxin-derivatisierte" Moleküle bilden eine spezielle Klasse der "chemischen Derivate". Ein "Toxin-derivatisiertes" Molekül ist ein Molekül (wie ICAM-1 oder ein Antikörper), das eine Toxin-Einheit enthält. Die Bindung eines solchen Moleküls an eine Zelle bringt die Toxin-Einheit in nächste Nähe zu der Zelle und fördert dadurch den Zelltod. Es kann irgendeine geeignete Toxin-Einheit angewendet werden; es wird jedoch bevorzugt, Toxine wie z. B. das Ricin-Toxin, das Diphterie-Toxin, radioisotopische Toxine, Membrankanal-bildende Toxine usw. anzuwenden. Verfahren zur Kopplung solcher Einheiten an ein Molekül gehören zum Stand der Technik.
Da die Granulozyten-Endothelzellen-Adhäsion sowohl das ICAM-1 als auch den CD18-Komplex erfordert, können Antikörper (oder deren Fragmente), die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden, als anti-entzündliche Agenzien erfindungsgemäß verwendet werden. Da das ICAM-1 auf der Oberfläche einiger Zellen natürlich exprimiert wird, resultiert die Einführung solcher Zellen in ein geeignetes Lebewesen, wie durch intraperitoneale Injektion usw., in der Produktion von Antikörpern, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden. Falls gewünscht, kann das Serum eines solchen Lebewesens entnommen und als Quelle für polyklonale Antikörper verwendet werden, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden. Es wird jedoch bevorzugt, solchen Lebewesen Splenozyten zu entnehmen, solche Nierenzellen mit einer Myelom-Zellinie zu fusionieren und solche Fusionszellen eine Hybridomzelle bilden zu lassen, die monoklonale Antikörper sekretiert, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden.
Die Hybridomzellen, die auf die oben beschriebene Weise erhalten werden, können mit einer Vielzahl von Verfahren untersucht werden, um die gewünschten Hybridomzellen zu identifizieren, die Antikörper sekretieren, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden. In einem bevorzugten Untersuchungsverfahren werden solche Moleküle aufgrund ihrer Fähigkeit, die Aggregation von Epstein-Barr-Virus-transformierten Zellen zu inhibieren, identifiziert. Antikörper, die in der Lage sind, eine solche Aggregation zu inhibieren, werden dann weiter untersucht, um festzustellen, ob sie eine solche Aggregation inhibieren, indem sie an das ICAM-1 oder an einen Angehörigen des CD18-Komplexes binden. Es können alle Mittel, die in der Lage sind, das ICAM-1 von Angehörigen des CD18-Komplexes zu unterscheiden, bei einer solchen Untersuchung verwendet werden. So kann z. B. das von dem Antikörper gebundene Antigen durch Immunopräzipitation und Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden. Wenn das gebundene Antigen einen Angehörigen des CD18-Komplexes darstellt, wird man feststellen, daß das immunopräzipitierte Antigen ein Dimer ist, während eine Spezies mit einem einzigen Molekulargewicht immunopräzipitiert wird, wenn das gebundene Antigen das ICAM-1 ist. Alternativ ist es möglich, diejenigen Antikörper, die an Angehörige der CT18- Molekülfamilie binden, von denjenigen zu unterscheiden, die das ICAM-1 binden, indem man die Fähigkeit des Antikörpers untersucht, an Zellen wie Granulozyten, die LFA-1, aber nicht das ICAM-1, exprimieren, zu binden. Die Fähigkeit eines Antikörpers (von dem bekannt ist, daß er eine zelluläre Aggregation inhibiert) an Granulozyten zu binden, zeigt an, daß der Antikörper in der Lage ist, LFA-1 zu binden. Das Fehlen einer solchen Bindung weist auf einen Antikörper hin, der in der Lage ist, das ICAM-1 zu erkennen. Die Fähigkeit eines Antikörpers, an eine Zelle, wie einen Granulozyten, zu binden, kann durch Mittel detektiert werden, die üblicherweise vom Fachmann verwendet werden. Zu solchen Mitteln zählen Immunoassays, zelluläre Agglutination, Filterbindungsuntersuchungen, Antikörperpräzipitation usw.
Die erfindungsgemäßen anti-Aggregations-Antikörper können alternativ identifiziert werden, indem man ihre Fähigkeit, differentiell an Zellen zu binden, die das ICAM-1 exprimieren, (wie aktivierte Endothelzellen), und ihr Unvermögen mißt, an Zellen zu binden, die das ICAM-1 nicht exprimieren (wie Granulozyten). Wie vom Fachmann leicht einzusehen ist, können die obigen Assays modifiziert oder in einer anderen Reihenfolge durchgeführt werden, wodurch man eine Vielzahl möglicher Untersuchungsassays erhält, von denen jedes in der Lage ist, Antikörper, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden, zu identifizieren und von solchen, die an den CD18-Komplex binden, zu unterscheiden.
Die anti-entzündlichen Agenzien der vorliegenden Erfindung kann man durch natürliche Verfahren (wie z. B. durch die Induktion von Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien usw., um einen nicht- Immunoglobulin-Antagonisten des ICAM-1 zu produzieren, oder durch Induktion eines Tieres, um polyklonale Antikörper zu produzieren, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden); durch synthetische Verfahren (wie z. B. unter Verwendung des Merrifield-Verfahrens zur Synthese von Polypeptiden um das ICAM-1, funktionelle Derivate des ICAM-1 oder Protein-Antagonisten des ICAM-1 (entweder ein Immunoglobulin oder ein nicht-Immunoglobulin) zu synthetisieren); durch Hybridom-Technologie (wie z. B. die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden); oder durch rekombinante Technologie erhalten (wie z. B. die Produktion der erfindungsgemäßen anti-entzündlichen Agenzien in verschiedenen Wirten (z. B. Hefe, Bakterien, Pilze, kultivierte Säugerzellen usw.), oder aus rekombinanten Plasmiden oder viralen Vektoren).
Die Auswahl des anzuwendenden Verfahrens hängt von Faktoren wie Bequemlichkeit, gewünschte Ausbeute usw. ab. Es ist nicht notwendig, nur eine(s) der oben beschriebenen Verfahren, Prozesse oder Technologien zu verwenden, um ein bestimmtes anti-entzündliches Agens zu produzieren; die oben beschriebenen Prozesse, Verfahren und Technologien können kombiniert werden, um ein bestimmtes, anti-entzündliches Agens zu erhalten.

A. Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)

Das neue Interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 wurde gemäß dem Verfahren von Rothlein, R. et al. (J. Immunol. 137 : 1270-1274 (1986)), worauf hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird, zuerst identifiziert und partiell charakterisiert. Um das ICAM- 1-Molekül zu detektieren, wurden monoklonale Antikörper aus Nierenzellen von Mäusen, die mit Zellen von Individuen immunisiert worden waren, denen die LFA-1-Expression genetisch fehlte, hergestellt. Die erhaltenen Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Aggregation von LFA-1-exprimierenden Zellen zu inhibieren.
Insbesondere wurden Mäuse mit EBV-transformierten B-Zellen von LAD-Patienten immunisiert, die das LFA-1-Antigen nicht exprimierten. Die Nierenzellen dieser Tiere wurden danach entfernt, mit Myelomzellen fusioniert, und man ließ sie zu Hybridomzellen werden, die monoklonale Antikörper produzierten. EBV-transformierte B-Zellen von normalen Individuen, die LFA-1 exprimieren, wurden danach in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers der Hybridomzelle inkubiert, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der in der Lage war, die Phorbolester-vermittelte, LFA-1-abhängige, spontane Aggregation der EBV-transformierten B-Zellen zu inhibieren. Da die Hybridomzellen von Zellen stammten, die niemals dem LFA-1- Antigen ausgesetzt gewesen waren, wurde kein monoklonaler Antikörper gegen LFA-1 produziert. Somit mußte jeder Antikörper, von dem man feststellte, daß er eine Aggregation inhibierte, in der Lage sein, an ein Antigen zu binden, das, obwohl es nicht LFA-1 war, an dem LFA-1-Adhäsionsprozeß beteiligt war. Obwohl jedes Verfahren, um solche monoklonalen Antikörper zu erhalten, verwendet werden kann, erhält man vorzugsweise ICAM-1-bindende monoklonale Antikörper, indem man BALB/C-Mäuse unter Verwendung der von Rothlein, R. et al. (J. Immunol. 137 : 1270-1274 (1986) beschriebenen Wege und Schemata mit Epstein-Barr-Virus-transformierten peripheren, mononukleären Blutzellen eines LFA-1-defizienten Individuums immunisiert. Solche Zellen sind von Springer, T.A., et al., (J. Exper. Med. 160 : 1901-1918 (1984)) offenbart worden.
In einer bevorzugten Ausführungsform zur Erzeugung und Detektion von Antikörpern, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden, werden Mäuse entweder mit EBV-transformierten B-Zellen, die sowohl ICAM-1 als auch LFA-1 exprimieren, oder bevorzugter mit TNF-aktivierten Endothelzellen, die ICAM-1, aber nicht LFA-1, exprimieren, immunisiert. Solche Zellen können nach dem Verfahren von Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160 : 1901- 1918 (1984) hergestellt werden, worauf hier voll inhaltlich Bezug genommen wird. Obwohl eine solche Zelle erfindungsgemäß verwendet werden kann, bevorzugt man die Verwendung von Zellen der JY-Zellinie (Terhorst, C.T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 73 : 910 (1976)). In einem am meisten bevorzugten Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellen, die anti-ICAM-1-Antikörper produzieren, wurde eine Balb/C-Maus nacheinander mit der Epstein-Barr-Virus-transformierten Zellinie JY (Terhorst, C.T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 73 : 910 (1976)) und der differenzierten Zellinie U937 (ATCC CRL-1593; American Type Culture Collection, Rockville, Md., U.S.A.) immunisiert. Die Zellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden; es wird jedoch am meisten bevorzugt, die Zellen in RPMI 1640 Kulturmedium zu kultivieren, das mit 10% fötalem Kälberserum und 50 ug/ml Gentamicin (Gibco Laboratories, NY) ergänzt worden ist. Die Zellen sollen unter Bedingungen kultiviert werden, die zur Proliferation von Säugerzellen geeignet sind (d. h. bei einer Temperatur von im allgemeinen 37ºC, in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2;, bei einer relativen Feuchtigkeit von 95%, usw.).
Man entfernt die Nierenzellen der immunisierten Tiere, fusioniert sie mit Myelomzellen und läßt sie sich zu Antikörper-produzierenden Hybridomzellen entwickeln. Die Antikörper werden auf ihre Fähigkeit untersucht, die LFA-1-abhängige, Phorbolesterinduzierte Aggregation einer EBV-transformierten Zellinie, wie JY-Zellen, die sowohl den LFA-1-Rezeptor als auch das ICAM-1 exprimiert, zu inhibieren. Wie von Rothlein, R., et al. (J. Immunol. 137 : 1270-1274 (1986)) gezeigt worden ist, werden danach Antikörper, die in der Lage sind, eine solche Aggregation zu inhibieren, auf ihre Fähigkeit untersucht, die Phorbolester-induzierte Aggregation einer Zellinie, wie SKW3 (Dustin, M. et al., J. Exper. Med. 165 : 672-692 (1987)) zu inhibieren, deren Fähigkeit, spontan in Gegenwart eines Phorbolesters zu aggregieren, durch einen Antikörper inhibiert wird, der in der Lage ist, LFA-1 zu binden, aber nicht durch anti-ICAM-1-Antikörper inhibiert wird. Antikörper, die in der Lage sind, die Phorbolester-induzierte Aggregation von Zellen wie JY-Zellen zu inhibieren, aber die nicht in der Lage sind, die Phorbolesterinduzierte Aggregation von Zellen wie SKW3-Zellen zu inhibieren, sind wahrscheinlich anti-ICAM-1-Antikörper. Alternativ können Antikörper, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden, durch die Suche nach Antikörpern identifiziert werden, die in der Lage sind, die LFA-1-abhängige Aggregation von LFA-exprimierenden Zellen (wie JY-Zellen) zu inhibieren, aber die nicht in der Lage sind, an Zellen zu binden, die LFA-1 zusammen mit wenig oder keinem ICAM-1 exprimieren (wie normale Granulozyten), oder die in der Lage sind, an Zellen zu binden, die ICAM-1, aber nicht LFA-1 exprimieren (wie TNF-aktivierte Endothelzellen). Eine weitere Alternative besteht in der Immunopräzipitation von Zellen, die ICAM-1, LFA-1 oder beide exprimieren, unter Verwendung von Antikörpern, die die LFA-1-abhängige Aggregation von Zellen, wie JY-Zellen, inhibieren, und darin, durch SDS-PAGE oder einem äquivalenten Verfahren einige molekulare Merkmale des durch den Antikörper przipitierten Moleküls zu bestimmen. Wenn das Merkmal mit dem des ICAM-1 übereinstimmt, kann man annehmen, daß es sich bei dem Antikörper um einen anti-ICAM-Antikörper handelt.
Unter Verwendung des oben beschriebenen, am meisten bevorzugten Verfahrens zur Erzeugung von Hybridomzellinien, die monoklonale Antikörper produzieren, die in der Lage sind, an ICAM-1 zu binden, wurde eine Hybridomzellinie isoliert, die einen bevorzugten IgG2a anti-ICAM-1-Antikörper produzierte. Dieser Antikörper wurde als "R6·5·D6·E9·B2" bezeichnet (im folgenden als "R6-5-D6" bezeichnet). Die Hybridomzellinie, die den Antikörper R6-5-D6 produzierte, wurde als "R6·5·D6·E9·B2" bezeichnet. Diese Zellinie wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, Md., U.S.A.) am 30. Oktober 1988 hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer HB 9580 bezeichnet. Die Hinterlegung erfolgte nach dem Budapester Vertrag.

B. Verwendung von Assays der LFA-1-abhängigen Aggregation

Die oben beschriebenen Assays, die in der Lage sind, die CD18- Komplex-abhängige Aggregation oder Adhäsion zu messen, können verwendet werden, um Agenzien zu identifizieren, die als Antagonisten wirken, um das Ausmaß der zellulären Aggregation oder Adhäsion zu inhibieren. Solche Antagonisten können wirken, indem sie die Fähigkeit des ICAM-1, eine Aggregation oder Adhäsion zu vermitteln, verringern. Somit zählen zu solchen Agenzien Immunoglobuline, wie ein Antikörper, der in der Lage ist, an das ICAM-1 zu binden. Zusätzlich können nicht- Immunglobulin-Agenzien (ICAM-1, funktionelle Derivate des ICAM- 1, oder chemische Substanzen, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden) unter Verwendung der oben beschriebenen Assays untersucht werden, um zu bestimmen, ob sie Antagonisten der CD18-ICAM-1-Wechselwirkungen darstellen. Solche Agenzien können sodann unter Verwendung eines geeigneten Assays, wie dem folgenden Granulozyten-Endothelzellen-Adhäsions-Assay, auf ihre Fähigkeit untersucht werden, die Granulozyten-Endothelzellen- Adhäsion zu inhibieren.
Auf diese Weise identifizierte Antagonisten können für die gleichen Zwecke wie Antikörper gegen das ICAM-1 verwendet werden. Alle diese Antagonisten können als erfindungsgemäßes antientzündliches Agens verwendet werden.

C. Granulozyten-Endothelzellen-Adhäsionsassay

Die Fähigkeit von polymorphonukleären Leukozyten (PMNL), sich an humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) anzuheften, liefert einen visuellen Adhärenzassay, der verwendet werden kann, um die zelluläre Adhäsion gemäß der vorliegenden Erfindung zu messen. Vorzugsweise wird ein solcher Assay unter Verwendung des Verfahrens von Smith, C.W., et al. (J. Clin. Invest. 63 : 221-229 (1979)) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Adhärenz an HUVEC-Monoschichten anstelle der Adhärenz an Protein-beschichtetem Glas beurteilt wird. In einem bevorzugten Assay werden HUVEC-Monoschichten vorzugsweise auf 25 mm runden Deckgläsern präpariert und sofort in Adhärenzkammern eingefügt, die insbesondere zur Verwendung mit einem Umkehrmikroskop und Phasenkontrastoptiken hergestellt sind. Solche Kammern bestehen vorzugsweise aus zwei Metallplatten, die so angeordnet sind, daß sie zwei 25 mm runde Deckgläser, die durch einen Sykes- Moore-Kammer O-Ring (Bellco) getrennt sind, halten. PNNL werden so in die Kammer eingeführt, daß ein Kontakt mit der HUVEC-Monoschicht möglich ist. Die Anzahl der PMNL in Kontakt mit der Monoschicht kann durch eine mikroskopische Untersuchung bestimmt werden. Der Prozentwert der Zellen, die nach dem Waschen in Kontakt mit der Monoschicht bleiben, stellt ein Maß für die zelluläre Adhärenz dar. Zusätzlich ist es möglich, die Wanderung von adhärenten PMNL durch die HUVEC-Monoschicht zu überwachen.
Um zu bestimmen, ob ein Agens eine mögliche anti-entzündliche Verbindung darstellt, können HUVEC und/ oder PMNL mit dem Agens, vorzugsweise zwischen 1 und 60 Minuten, vorbehandelt werden und der Grad der zellulären Adhärenz gemessen werden. Agenzien, die in der Lage sind, eine Entzündung zu inhibieren, werden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, die zelluläre Adhäsion in einem solchen Assay zu blockieren.

D. Verwendungen des Interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)

ICAM-1 stellt einen Bindungspartner für die Angehörigen des CD18-Komplexes dar. Somit kann das ICAM-1 oder dessen funktionelles Derivat verwendet werden, um Endothelzellen an der Anheftung an Granulozyten zu hindern, indem sie an die CD18-Moleküle an der Oberfläche eines Granulozyten binden und dadurch die CD18-Moleküle des Granulozyten an der Bindung an das ICAM-1 von Endothelzellen hindern.
ICAM-1 oder dessen funktionelle Derivate sind sehr geeignete anti-entzündliche Agenzien in einem Säuger. Im wesentlichen unterscheiden sich solche Agenzien von üblichen antientzündlichen Agenzien dadurch, daß sie keine Nebenwirkungen wie eine Nephrotoxizität besitzen, die man bei üblichen Agenzien findet.

E. Verwendungen von Antagonisten des ICAM-1

Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper) oder Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten des ICAM-1 können verwendet werden, um zu verhindern, daß sich Granulozyten an Endothelzellen heften, indem sie an das ICAM-1 von Endothelzellen binden und somit verhindern, daß das ICAM-1 der Endothelzellen an die CD18- Moleküle auf der Oberfläche der Granulozyten bindet. Mac-1 und LFA-1 sind in der Lage, an das ICAM-1 zu binden. Somit stellen diese Moleküle Beispiele für Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten des ICAM-1 dar. Durch die Verwendung der oben beschriebenen Assays können zusätzliche Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten der ICAM-1-abhängigen Granulozyten-Adhäsion identifiziert werden.
Da Granulozyten bei der Vermittlung einer Gewebezerstörung bei entzündlichen Zuständen, die durch das unspezifische Abwehrsystem vermittelt werden (wie das adulte Atemnot-Syndrom usw.) beteiligt sind und da Granulozyten sich an Endothelzellen anheften müssen, um zum Ort der Entzündung zu wandern, kann die Blockierung der Granulozyten-Endothelzellen-Adhäsion durch einen anti-ICAM-1-Antikörper oder durch einen nicht-immunologischen Antagonisten des ICAM-1 eine Granulozyten-induzierte Gewebezerstörung verhindern.
Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper) oder Nicht- Immunoglobulin-Antagonisten des ICAM-1, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden, stellen sehr geeignete anti-entzündliche Agenzien bei einem Säuger dar. Im wesentlichen unterscheiden sich solche Agenzien von üblichen antientzündlichen Agenzien dadurch, daß sie keine weiteren Nebeneffekte, wie eine Nephrotoxizität, besitzen, die man bei üblichen Agenzien findet.

F. Verabreichung der erfindungsgemäßen anti-entzündlichen Agenzien

Die anti-entzündlichen Effekte des ICAM-1 können erreicht werden, indem man einem Patienten das vollständige ICAM-1-Molekül oder irgendein therapeutisch aktives Peptidfragment davon verabreicht.
ICAM-1 und dessen funktionelle Derivate sind entweder synthetisch, unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie oder durch Proteolyse erhältlich. Die therapeutischen Vorteile des ICAM-1 können durch die Verwendung von funktionellen Derivaten des ICAM-1-Moleküls, die zusätzliche Aminosäurereste besitzen, die zugefügt worden sind, um die Kopplung an einen Träger zu verbessern oder um die Aktivität des ICAM-1 zu verstärken, vergrößert werden. Zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sollen weiterhin funktionelle Derivate des ICAM-1 zählen, denen bestimmte Aminosäurereste fehlen, oder die geänderte Aminosäurereste enthalten, soweit solche Derivate die Fähigkeit aufweisen, eine zelluläre Adhäsion zu bewirken.
Sowohl die erfindungsgemäßen Antikörper als auch die hier offenbarten ICAM-1-Moleküle werden als "im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminationen" bezeichnet, wenn Präparate, die diese enthalten, im wesentlichen frei von Substanzen sind, mit denen diese Produkte normalerweise und natürlich zusammen vorkommen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Antikörper und biologisch aktive Fragment davon (polyklonal oder monoklonal), die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden. Solche Antikörer können entweder von einem Lebewesen oder durch Gewebekultur oder durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden.
Bei der Verabreichung von Antikörpern oder Fragmenten davon, die in der Lage sind, an das ICAM-1 zu binden, an einen Patienten, oder wenn man ICAM-1 (oder ein funktionelles Derivat davon) an einen Empfängerpatienten verabreicht, kann die Dosierung des verabreichten Agens aufgrund von Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand, der vorherigen Krankengeschichte usw. des Patienten variieren. Im allgemeinen ist es wünschenswert, dem Empfänger eine Dosis an Antikörpern zu verabreichen, die in dem Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge des Agens/Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann. Wenn ICAM-1-Moleküle oder deren funktionelle Derivate an einen Patienten verabreicht werden, verabreicht man vorzugsweise solche Moleküle in einer Dosierung, die auch in dem Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge des Agens/Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.
Die erfindungsgemäßen anti-entzündlichen Agenzien sollen einem Empfänger in einer Menge verabreicht werden, die ausreichend ist, um eine Entzündung zu unterdrücken. Eine Menge wird als ausreichend bezeichnet, um eine Entzündung zu "unterdrücken", wenn die Dosis, der Verabreichungsweg usw. des Agens ausreichend sind, eine Entzündung abzuschwächen oder zu verhindern.
Die erfindungsgemäßen anti-entzündlichen Agenzien können entweder vor dem Ausbruch einer Entzündung (um eine erwartete Entzündung zu unterdrücken) oder nach dem Beginn der Entzündung verabreicht werden.
Sowohl der gewünschte Antikörper als auch das ICAM-1 selbst können dem Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Wenn der Antikörper oder das ICAM-1 durch eine Injektion verabreicht werden, kann die Verabreichung durch eine Dauerinfusion oder durch einen einzelnen Bolus oder mehrere erfolgen.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmakologisch akzeptabel" bezeichnet, wenn deren Verabreichung von dem Empfängerpatienten tolieriert wird. Solch ein Agens wird als in einer "therapeutisch wirksamen Menge" zu verabreichend bezeichnet, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Agens ist physiologisch signifikant, wenn dessen Vorkommen zu einer detektierbaren Änderung der Physiologie eines Empfängerpatienten führt.
Der Antikörper und die ICAM-1-Moleküle der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen herzustellen, wobei diese Substanzen oder deren funktionelle Derivate in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger-Vehikel kombiniert werden. Geeignete Vehikel und deren Formulierung, einschließlich von anderen humanen Proteinen, z. B. von humanem Serumalbumin, sind z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences" (16. Ausgabe, Osol, A., Ed., Nack, Easton PA (1980)) beschrieben worden. Um eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung zu bilden, die für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, können solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge eines Antikörpers oder des ICAM-1-Moleküls oder deren funktionelle Derivate zusammen mit einer geeigneten Menge eines Träger-Vehikels enthalten.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können verwendet werden, um die Wirkungsdauer zu kontrollieren. Präparate zur kontrollierten Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren erhalten werden, um den Antikörper oder das ICAM-1 oder deren funktionelle Derivate zu komplexieren oder zu absorbieren. Die kontrollierte Freisetzung kann durch die Auswahl geeigneter Makromoleküle (z . B. Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat) und durch die Konzentration von Makromolekülen sowie durch die Inkorporationsverfahren erreicht werden, um die Freisetzung zu kontrollieren. Ein weiteres, mögliches Verfahren zur Kontrolle der Wirkungsdauer durch Präparate zur kontrollierten Freisetzung besteht darin, Antikörper- oder ICAM-1-Moleküle oder deren funktionelle Derivate in Partikel aus einem polymeren Material, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly(Milchsäure) oder Ethylen-Vinylacetat-Kopolymere aufzunehmen. Alternativ ist es möglich, anstatt diese Mittel in polymere Partikel aufzunehmen, diese Substanzen in Mikrokapseln einzuschließen, die z. B. durch Koacervationsverfahren oder durch interfaciale Polymerisation hergestellt werden, z. B. Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(Methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidale Arzneimittelzuführungssysteme, z. B. Liposomen, Albumin-Mikrosphären, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird sie leichter aufgrund der folgenden Beispiele zu verstehen sein, die zu Illustrationszwecken dargestellt werden, und wobei nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung zu beschränken, wenn es nicht anders angegeben ist. Die in den folgenden Beispielen dargestellten Ergebnisse werden als Mittelwerte ± 1 Standardabweichung dargestellt, und N steht für die Anzahl der einzelnen Experimente. Statistische Beurteilungen wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse und Dunnett's t-Test oder Student's t-Test durchgeführt.

BEISPIEL 1

Adhärenz von PMNL an HUVEC

Isolierung von polymorphonukleären Leukozyten (PMNL). PMNL, die von gesunden, erwachsenen Individuen und von zwei Patienten mit einer ernsten Form einer CD18-Defizienz (Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152 : 668-689 (1985)) erhalten wurden, wurden aus Citrat-antikoagulierten, Dextran-sedimentierten venösen Blutproben über Ficoll-Hypaque-Gradienten gereinigt und in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; GIBCO, Grand Island, NY), pH-Wert 7,4, die, wie beschrieben (Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 143 : 447-459 (1981)), 0,2% Dextrose enthielt, suspendiert. Die PMNL wurden in PBS bei 4ºC vier Stunden bei einer Konzentration von 10&sup7;/ml gehalten.
Monoklonale Antikörper. Zu gegen den CD18-Komplex gerichteten monoklonalen Antikörpern, die bei diesen Untersuchungen verwendet wurden, zählten Verdünnungen von Aszites-Flüssigkeit oder Kulturüberstände und Präparate von IgG- und F(ab)-Fragmenten.
Präparation von humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC). HUVEC wurden geerntet (Gimbrone, M.A., Prog. Hemostas. Thromb. 3 : 1-28 (1976)) und in Hinsicht auf ihre Bindung an acetylierte Lipoproteine mit niedriger Dichte (acLDL) (Voyta, J.C., et al., J. Cell. Biol. 99 : 2034-2040 (1984)) und die Faktor-VIII-Expression (Jaffe, E.A., al., J. Clin. Invest. 52 : 2745-2757 (1973)) charakterisiert. Die Zellen von 5-10 Nabelschnüren wurden vereinigt, in RPMI 1640, das 20% fötales Kälberserum (FCS), Antibiotika, Heparin (0,1 mg/ml) und den Endothelzellen-Wachstumsfaktor (0,05 mg/ml) enthielt, ausplattiert und drei bis vier Tage bei 37ºCin einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; gehalten. Visuell konfluente Monoschichten auf Gelatine- (0,1%) und Fibronectin- (5 ug/cm²) -beschichteten 25 mm runden Deckgläsern wurden aus einer ersten Passage von Zellen hergestellt, die mit 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA in PBS geerntet worden waren. Monoschichten wurden in Fibronectin (5 ug/cm²) -beschichteten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen aus Zellen der ersten und der zweiten Passage hergestellt und bis zur Konfluenz wachsen gelassen (1-3 Tage). HUVEC wurden mit verschiedenen Konzentrationen an LPS (Sigma, E. coli 026:B6) oder IL-1 (Genzym, von Zellen stammend) verschieden lang vorbehandelt.
Adhärenz-Assay. Es wurde ein visueller Adhärenz-Assay, wie von Smith, C.W. (J. Clin. Invest. 63 : 231-229 (1979)) beschrieben, verwendet, mit der Ausnahme, daß die Adhärenz an HUVEC-Monoschichten anstelle der Adhärenz an Protein-beschichtetem Glas beurteilt wurde. HUVEC-Monoschichten auf 25 mm runden Deckgläsern wurden gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht und sofort in die Adhärenz-Kammern eingesetzt wurden, die insbesondere zur Verwendung mit einem Umkehrmikroskop und Phasenkontrastoptiken hergestellt worden waren. Die Kammern bestanden aus zwei Metallplatten, die so angeordnet waren, um zwei 25 mm runde Deckgläser, die von einem Sykes-Moore-Kammer O-Ring (Bellco) getrennt wurden, zu halten. In dem geschlossenen Fach konnten PMNL beobachtet werden, wie sie mit der HUVEC-Monoschicht in Berührung kamen. PMNL, die in PBS bei einer Konzentration von 106 Zellen/ml suspendiert worden waren, wurden in die Kammer injiziert und auf der Monoschicht für eine Dauer von 500 Sekunden absetzen gelassen. Die Anzahl der PMNL in Kontakt mit der Monoschicht wurde bestimmt, indem wenigstens 10 mikroskopische Felder (50x- Objektiv) gezählt wurden und die Kammer für weitere 500 Sekunden invertiert wurde. Der Prozentwert der Zellen, die in Kontakt mit der Monoschicht blieben, wurde bestimmt und bei den Ergebnissen als %-Wert der Adhärenz ausgedrückt. Der %-Wert der Zellen, die durch die Monoschicht wanderten (eine Untergruppe der adhärenten Zellen) wurde ebenfalls bestimmt. Bei Blockierungsversuchen wurden HUVEC und/oder PMNL mit monoklonalen Antikörpern 15 Minuten vorbehandelt und danach vor der Bestimmung der Adhärenz gewaschen. Bei einigen Versuchen wurden monoklonale Antikörper während des Adhärenz-Assays bei den Zellen zurückbehalten.
Bestimmung der Bindung von monoklonalen Antikörpern an Zellen. Eine Immunofluoreszenz-Duchflußzytometrie wurde, wie von Anderson, D.C., et al. (J. Clin. Invest. 74 : 536-551 (1984)) beschrieben, unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern und einem Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Antikörpers gegen Maus-IgG durchgeführt. Oberflächen-gefärbte Zellen wurden in 1% Paraformaldehyd fixiert und in einem Durchflußzytometer (Ortho, Cytofluorograph) analysiert. Die Hintergrund-Fluoreszenz wurde nach Inkubation entweder mit nicht-immunem Aszites oder einem X63 IgG1-Kontrollantikörper bestimmt.
Eine Fluoreszenzmikroskopie wurde mit Paraformaldehyd-fixierten Zellen (1%, 15 Minuten, Raumtemperatur), die in PBS gewaschen und 30 Minuten in PBS, das 2% humanes Serumalbumin (HSA) und 1% Glycin enthielt, inkubiert worden waren, durchgeführt. Die Bindung der monoklonalen Antikörper wurde unter Verwendung eines zweiten Antikörpers gegen Maus-IgG, der mit FITC oder Rhodamin- Isothiocyanat (RITC) konjugiert worden war, detektiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Leitz Diaplan-Fluoreszenzmikroskops untersucht. Die Hintergrund-Fluoreszenz wurde nach Inkubation der Zellen entweder mit nicht-immunem Aszites oder mit einem X63 IgG1-Kontrollantikörper bestimmt.
Ein Enzym-Immunoassay (EIA) wurde verwendet, um die Bindung der monoklonalen Antikörper an die Zell-Monoschichten zu beurteilen. Konfluente HUVEC, die in Fibronectin-beschichteten (5 ug/mm²) Platten mit 96 Vertiefungen gewachsen waren, wurden durch Zugabe von 1% paraformaldehyd in PBS 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS gewaschen und 30 Minuten in 2% Rinder-Serumalbumin (BSA) inkubiert. Nach Entfernung des BSA wurde der monoklonale Antikörper zugegeben und bei 37ºC eine Stunde inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und sodann eine Stunde mit Ziege-anti-Maus IgG, IgM, IgA (Zymed), konjugiert mit Alkalischer Phosphatase (Verdünnung 1 : 500), inkubiert. Nach dem Waschen wurde das Substrat (p-Nitrophenyl-dinatrium-phosphat, 1 mg/ml, in Puffer, pH 9,8) zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden in einem Titertek (Flow)-Lesegerät bei 405 nm gelesen.

Beispiel 2

Effekt des fMLP auf die Adhäsion

Es ist feststellt worden, daß fMLP (f-Met-Leu-Phe) in Konzentrationen zwischen 0,5 und 2,0 mM die zelluläre Adhäsion reduziert (Charo, I.F., et al., J. Immunol. 136 : 3412-3419 (1986); Tonnesen, M.G., et al., J. Clin. Invest. 74 : 1581-1592 (1984)).
Es ist feststellt worden, daß chemotaktische Faktoren (CF) in der Lage sind, die PMNL-Adhärenz auf Protein-beschichtetem Glas oder Kunststoff zu verstärken oder abzuschwächen (Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 143 : 447-459 (1981)); Smith, C.W., et al., J. Clin. Invest. 65 : 804-812 (1980); Anderson, D.C., et al. J. Lab. Clin. Med. 101 : 881-895 (1983); Anderson, D.C. et al., J. Clin. Invest. 68 : 863-874 (1981)). Die beobachteten Effekte der CF hängen von der Konzentration der CF und von einer vorherigen Exposition von Leukozyten gegenüber CF ab. fMLP-Konzentrationen (0,5-2,0 nM) zur Induktion einer Formänderung können die Adhärenz an Protein-beschichtetes Glas verringern, wenn die Zellen vorher einer niedrigeren Konzentration des chemotaktischen Faktors ausgesetzt worden sind. Solch ein "Priming" kann bei so niedrigen Konzentrationen wie 0,01 nM fMLP erfolgen (Smith, C.W., et al. J. Clin. Invest. 65 : 804-812 (1980)) und führt zu einer Umverteilung der "Adhäsions-Stellen" der Zellen bei einer nachfolgenden chemotaktischen Exposition. Es muß eine große Sorgfalt aufgewendet werden, um eine Aktivierung oder ein Priming während der Isolierung zu vermeiden (Haslett, C., et al., Amer. J. Pathol. 119 : 101-110 (1985)). Zusätzlich zur physiologischen Antwort der PMNL auf eine chemotaktische Stimulation findet man einen weiteren Faktor in dem Adhärenz-Assay, der möglicherweise den Adhärenz-Grad beeinflußt. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Verfahren verwendet keine Scherbeanspruchung. Statt dessen beurteilt es einfach die Anheftung. Während eine Scherbeanspruchung offensichtlich in vivo wichtig ist (Schmid-Schoenbein, G.W., et al., Circ. Res. 36 : 173-181 (1975); Schmid-Schoenbein, G.W., et al., Microvas. Res. 19 : 45-58 (1980)), muß deren Einbezug in einen Adhärenz- Assay in vivo sorgfältig kontrolliert werden (Forrester, J.V. et al., J. Cell. Sci. 70 : 93-105 (1985)), was einen Umstand darstellt, der mit einfachen Waschprozeduren nicht möglich ist. Somit wurde bei den vorliegenden Assays die Wichtigkeit des CD18-Glykoprotein-Komplexes in Hinsicht auf eine Anheftung der PMNL an HUVEC beurteilt, und es wurden keine Untersuchungen durchgeführt, um die Rolle des CD18-Komplexes beim Widerstand von angehefteten PMNL gegenüber einer sorgfältig kontrollierten Scherbeanspruchung zu bestimmen (Gallik, S., et al., Fed. Proc. 46 : 1043a (1987)).
Im Gegensatz zu den Befunden von Charo, I.F., et al. (J. Immunol. 136 : 3412-3419 (1986)) und Tonneson, M.G., et al. (J. Clin. Invest. 74 : 1581-1592 (1984)) stellt einen erfindungsgemäßen Aspekt der Befund dar, daß sehr niedrige Konzentrationen von fMLP in der Lage sind, die Adhärenz von Neutrophilen an HUVEC zu verstärken.

Beispiel 3

Zeit- und Dosis-abhängige Zunahme der Adhärenz durch Entzündungsmediatoren

Die Grund-Adhärenz der PMNL an HUVEC variierte mit jedem HUVEC- Präparat von einem niedrigen Wert von 3,5 ± 1,0% bis zu einem hohen Wert von 35,5 ± 1,0% der PMNL-Adhärenz an die Monoschicht. Der Mittelwert ± 1s.d. bei 24 HUVEC-Präparaten betrug 16,9 ± 7,5%. Die Adhärenz wurde signifikant nach Stimulation der PMNL durch fMLP verstärkt (Fig. 1). Man erhielt statistisch signifikante Verstärkungen bei 0,1 nM fMLP (Fig. 1), und man näherte sich einer maximalen Adhärenz (62,5 ± 5,3%; n, 8; 10 nM fMLP) bei einer Konzentration von 0,5 nM (53,8 ± 9,8%; n, 23) an. Eine IL-1-Stimulation der HUVEC erhöhte signifikant die Adhärenz der PMNL bei 0,05 U/ml, wobei eine nahezu maximale Adhärenz bei einer Konzentration von 0,5 U/ml (Fig. 1; 81,2 ± 7,4%; n, 21) erreicht wurde. Eine nahezu maximale Adhärenz wurde mit 10 ng/ml LPS (80,1 ± 7,6%; n, 25) erzielt. Jede der letztgenannten zwei Stimuli förderte eine 100%ige Adhärenz nach einer vierstündigen Inkubation mit den HUVEC, vorausgesetzt, daß die Konzentrationen 2 U/ml IL-1 oder 30 ng/ml LPS überschritten. Die Kinetiken der Effekte von IL-1 und LPS auf die HUVEC-vermittelte Adhärenz waren sehr ähnlich (Fig. 2), wobei der jeweilige Peak bei 3,5-4 Stunden auftrat und eine ungefähr 50%ige Verringerung bei 7 Stunden erfolgte.

Beispiel 4

Bindung der monoklonalen Antikörper an PMNL und HUVEC - Effekte einer fMLP-, IL-1- und LPS-Stimulation

Die TS1/18 (anti-gemeinsame (beta) Untereinheit des CD18-Moleküls), TS1/22 (anti-LFA-1 alpha-Untereinheit) (Sanchez-Madrid, F., et al., J. Exper. Med. 158 : 586-602 (1983)), OKM1 (anti-Mac- 1 alpha-Untereinheit; Ortho Diagnostics) und W6/32 (anti-HLA- Struktur-Antikörper, hergestellt von dem American Type Culture Collection Stamm HB95, ATCC, Rockville, Md., U.S.A.) banden alle an periphere mononukleäre Lymphozyten (PMNL). Eine Durchflußzytometrie unter Verwendung eines anti-Maus-Antikörpers, der mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) markiert worden war, ergab, daß die monoklonalen Antikörper, die mit den α-Mac-1- und β-Untereinheiten reagierten, eine 3-5fach verstärkte Bindung nach einer Stimulation der PMNL mit 10 nM f-met-leu-phe (fMLP) zeigten. Eine Bindung der monoklonalen Antikörper, die mit der αLFA-1-Untereinheit und mit dem Klasse I MHC-Antigen reagierten, erhöhte sich nicht nach einer chemotaktischen Stimulation (Anderson, D.C., et al., J. Immunol. 137 : 15-27 (1986)). R6-5-D6 und W6/32 banden an HUVEC. Ein Enzym-Immunoassay (EIA) (unter Verwendung eines mit Alkalischer Phosphatase markierten anti-Maus-Antikörpers) ergab, daß eine Exposition der HUVEC gegenüber 20 ng/ml LPS in einer 4-5fachen Verstärkung nach vierstündiger und einer 5-7fachen Verstärkung nach siebenstündiger Bindung des R6-5-D6 resultierte. Die W6/32- Bindung wurde nach vier Stunden nicht verstärkt und wurde um weniger als 20% nach einer 24-stündigen Stimulierung mit LPS verstärkt.
Eine Immunofluoreszenz (IF)-Mikroskopie zeigte eine einheitliche Verteilung des R6-5-D6 auf der Oberfläche von jeder Endothelzelle nach einer Paraformaldehyd-Fixierung. In der nichtstimulierten Monoschicht zeigten alle Zellen eine Fluoreszenz mit einer um offensichtlich 20% helleren Färbung als bei einer Durchschnittszelle. Nach einer 4-stündigen Stimulation mit IL-1 (0,5 U/ml) oder LPS (10 ng/ml) erhöhte sich die gesamte Färbungsintensität auf allen Zellen, und etwa 50% waren ausgesprochen hell. Bei maximaler Auflösung (1200fache Vergrößerung) zeigte sich die Fluoreszenz punktförmig mit einem gleichmäßigen Abstand von weniger als 0,5 um. Eine IF-Mikroskopie von Monoschichten mit angehefteten PMNL zeigte keine Färbung der PMNL und eine ungefärbte Fläche auf der Ober-fläche der Endothelzelle, die von dem Neutrophilen okkupiert wurde. Das Fehlen einer Bindung an die PMNL wurde durch eine Durchflußzytometrie dadurch bestätigt, daß die Fluoreszenz-Intensität nicht oberhalb der nicht-immunen Aszites-Kontrolle lag. In deutlichem Kontrast wurde die Verteilung des TS1/18 ohne Färbung der HUVEC auf die angehefteten PMNL begrenzt.

Beispiel 5

Effekte der monoklonalen Antikörper auf die Adhärenz - Vorbehandlung der PMNL

Eine Vorbehandlung der PMNL mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern ergab einen starken Effekt des TS1/18. Eine maximale Inhibition der Adhärenz durch den TS1/18 wurde bei einer 1 : 800-Verdünnung der Aszitesflüssigkeit und bei 5 ug/ml des IgG1-Präparates erreicht. Wie in Fig. 3 dargestellt ist, reduziert dieser monoklonale Antikörper signifikant die Basislinien-Adhärenz und blockiert vollständig die Verstärkung, die durch eine fMLP-Stimulation der PMNL verursacht wird. Im Gegensatz dazu war der OKM1 teilweise wirksam bei der Blockierung der fMLP-verstärkten Adhärenz, und sowohl der TS1/22 als auch der R6-5-D6 übten keinen Effekt auf die Basislinie oder auf die fMLP-verstärkte Adhärenz aus. Versuche, bei denen LPS- und IL-1-stimulierte HUVEC (Fig. 4) verwendet wurden, ergaben, daß eine Vorbehandlung der PMNL mit den verschiedenen monoklonalen Antikörpern quantitativ unterschiedliche Resultate ergab. Der TS1/18 inhibierte die LPS- und IL-1-verstärkte Adhärenz um etwa 50%. Wie bei nichtstimulierten HUVEC blockierte eine TS1/18-Vorbehandlung der PNNL vollständig die fMLP-verstärkte PMNL-Adhärenz bei LPS-Stimulationsversuchen, und Kombinationen des jeweiligen monoklonalen Antikörpers mit dem TS1/18 reduzierte die Adhärenz nicht weiter unterhalb des Wertes, der durch den TS1/18 alleine verursacht wurde. Eine Erhöhung der Konzentration des TS1/18 entweder als Aszites-Flüssigkeit oder als isolierter IgG1 reduzierte die LPS-stimulierte Adhärenz nicht weiter.

Beispiel 6

Effekte der monoklonalen Antikörper auf die Adhärenz - Vorbehandlung der HUVEC

Eine Vorinkubation der HUVEC mit den verschiedenen monoklonalen Antikörpern ergab qualitativ unterschiedliche Ergebnisse. Wie in Fig. 5 gezeigt ist, war der R6-5-D6 der einzige monoklonale Antikörper, der bei der Reduzierung der durch eine IL-1- oder LPS-Stimulation hervorgerufenen Verstärkung wirksam war. In den in dieser Figur dargestellten Versuchen war die Inhibition nicht vollständig und betrug durchschnittlich 73%. Dieser Effekt des R6-5-D6 war bei einer 1 : 800-Verdünnung der Aszites- Flüssigkeit und bei 4 ug/ml IgG2a-Fraktion des Aszites maximal (prozentuale Inhibition bei 12 ug/ml, 59,2, n, 3; bei 4 ug/ml, 60,1, n, 6; und bei 2 ug/ml, 38,3, n, 3). F(ab)-Fragmente waren maximal aktiv bei 48 ug/ml (prozentuale Inhibition bei 48 ug/ml, 56,6, n, 3; bei 24 ug/ml, 34,0, n, 3). Wenn fMLP-aktivierte PMNL verwendet wurden (Fig. 6) war der R6-5-D6 so wirksam wie der TS1/18 bei der Blockierung der durch eine chemotaktische Stimulation verursachten Adhärenz-Zunahme. Weiterhin blockierte er die fMLP-Zunahme der PMNL-Adhärenz an IL-1- und LPS-stimulierte HUVEC.

Beispiel 7

Effekte der monoklonalen Antikörper auf die Adhärenz von Paraformaldehyd-fixierten HUVEC

Die obigen Versuche beinhalteten eine 15-minütige Exposition bei 37ºC von lebensfähigen HUVEC-Monoschichten gegenüber den monoklonalen Antikörpern. Somit liegt eine Erklärung für die Ergebnisse der oben beschriebenen Versuche darin, daß der R6-5- D6 eine Antwort in den Endothelzellen induzierte, wodurch deren Adhäsionseigenschaften verändert wurden. Solch ein Schluß wird durch die Beobachtung (Tabelle 1) widerlegt, daß der R6-5-D6 in der Lage war, die Adhärenz der PMNL an Paraformaldehyd-fixierte HUVEC-Monoschichten in dem gleichen Ausmaß zu inhibieren, wie er die Adhärenz der PMNL an lebensfähige HUVEC-Monoschichten inhibierte. Es gab eine hohe Adhärenz der PMNL an LPS-stimulierte Endothelzellen, und eine fMLP-Stimulation der PMNL verstärkte diese Adhärenz. Der R6-5-D6 reduzierte die Adhärenz signifikant. Tabelle 1 Inhibition der PMNL-Adhärenz an paraformaldehyd-fixierte HUVEC durch den monoklonalen Antikörper R6-5-D6 Vorbehandlung der PMNL HUVEC % Adhärenz Kontrolle
HUVEC wurden ohne (Kontrolle) oder mit 10 ug/ml LPS vier Stunden bei 37ºC inkubiert, in PBS gewaschen und danach 15 Minuten bei Raumtemperatur in 1% Paraformaldehyd fixiert. Die Monoschichten wurden wiederum in PBS gewaschen und nach 15 Minuten in PBS, das 1% HSA (humanes Serumalbumin) und 1% Glycin enthielt, inkubiert. Die Monoschichten wurden wiederum gewaschen und 30 Minuten mit PBS, R6-5-D6 (1 : 400-Verdünnung des Aszites) oder W6/32 (1 : 200-Verdünnung des Aszites) inkubiert, wonach die Adhärenz der fMLP (0,5 nM)-aktivierten PMNL-Kontrolle bestimmt wurde. *, p< 0,01; p< 0,001, im Vergleich zu einer Versuchsbedingung ohne monoklonalen Antikörper. %-Adhärenz ± 1 s.d. Die Anzahl der einzelnen Tests ist durch "n" dargestellt.

Beispiel 8

Direkter Vergleich der inhibitorischen Effekte des TS1/18 und des R6-5-D6

Da der R6-5-D6 insoweit qualitativ ähnliche Resultate wie bei den TS1/18 ergab, daß er die durch eine fMLP-Stimulation der PMNL hervorgerufene Verstärkung vollständig blockierte, und die durch eine LPS- oder IL-1-Stimulation der HUVEC hervorgerufene Verstärkung teilweise blockierte, wurde ein direkter Vergleich dieser beiden monoklonalen Antikörper mit denselben PMNL- und HUVEC-Präparaten vorgenommen. Die Tabelle 2 zeigt, daß die beiden monoklonalen Antikörper fast identische Resultate ergaben. Weiterhin war bei Versuchen, in denen die PMNL mit dem TS1/18 und die HUVEC mit dem R6-5-D6 blockiert worden waren, die Inhibition der LPS-verstärkten Adhärenz nicht größer als mit jedem monoklonalen Antikörper alleine. Dieser Vergleich wurde weiter ausgedehnt auf die Verwendung der PMNL eines Patienten, dem der CD18-Komplex fehlte. Weder der TS1/18 noch der R6-5-D6 zeigten einen inhibitorischen Effekt n der IL-1-verstärkten Adhärenz der defizienten PMNL an normale HUVEC (Fig. 7). Den gleichen fehlenden Effekt konnte man bei der Adhärenz von CD18- defizienten PMNL an LPS-stimulierte HUVEC erkennen. Ein CD18- unabhängiger Bestandteil der LPS- und IL-1-Verstärkung wird klar durch den monoklonalen Antikörper und die CD18-defizienten Leukozyten gezeigt. Tabelle 2 Vergleich der inhibitorischen Aktivität der monoklonalen Antikörper R6-5-D6 und TS1/18 bei der PMNL-Adhärenz an HUVEC Vorbehandlung PMNL HUVEC % Adhärenz Kontrolle
HUVEC wurden ohne (Kontrolle) und mit IL-1 (0,5 U/ml) vier Stunden bei 37ºC inkubiert und danach dem R6-5-D6 (1 : 400-Verdünnung des Aszites) oder PBS 15 Minuten ausgesetzt. Die Monoschichten wurden danach gewaschen und die Adhärenz der PMNL, die entweder in PBS oder mit dem TS1/18 (1 : 400-Verdünnung des Aszites) vorinkubiert worden waren, wurde bestimmt. *, p< 0,01, verglichen mit Bedingungen ohne den monoklonalen Antikörper.
Die Anzahl der einzelnen Versuche ist durch "n" angegeben.

Beispiel 9

Kinetiken der CD18-abhängigen und der CD18-unabhängigen Adhärenz

Der zeitliche Verlauf der LPS- und IL-1-Effekte auf die R6-5- D6-Bindung an HUVEC wurde beurteilt. Die Menge des an HUVEC gebundenen R6-5-D6 erhöhte sich deutlich in den ersten drei Stunden und blieb in den acht Stunden der Beobachtung hoch, was mit dem EIA-Verfahren ermittelt wurde (Fig. 8). Dies stand im Gegensatz zu den Veränderungen, die man bei der Adhärenz von nicht-stimulierten PMNL in dem gleichen Zeitraum beobachtete (Fig. 2). Die verminderte Adhärenz, die nach einer 4-stündigen Stimulation der HUVEC mit IL-1 und LPS beobachtet wurde, konnte nicht durch Verringerungen der Menge des endothelialen Oberflächenfaktors, der von dem R6-5-D6 erkannt wurde, erklärt werden. Daher wurde der Beitrag der CD18-unabhängigen Determinanten der PMNL-Adhärenz beurteilt. Die Adhärenz der PMNL, die mit Sättigungskonzentrationen des TS1/18 vorbehandelt worden waren, an LPS- (Fig. 8) oder IL-1-stimulierte HUVEC ergab einen Peak bei vier Stunden und sank um 70% bei sechs Stunden und 79,8% bei acht Stunden. Der CD18-Beitrag zur Adhärenz in diesem Zeitraum, was sich in dem Unterschied zwischen der Adhärenz der TS1/18-behandelten und -unbehandelten PMNL widerspiegelte, fiel um 9,5% bei sechs Stunden und um 26,0% bei acht Stunden. Somit zeigte sich, daß der größte Beitrag zu den verringerten Adhärenzen nach vier Stunden ein CD18-unabhängiger Faktor oder Faktoren waren. Eine Vorbehandlung der stimulierten HUVEC mit CD18-defizienten PMNL und dem R6-5-D6 ergab zeitliche Adhärenz-Änderungen, die mit denen vergleichbar waren, die man bei einer TS1/18-Vorbehandlung der PXNL beobachtete (Tabelle 3). Tabelle 3 Zeitabhängige Änderungen der PMNL-Adhärenz an LPS-behandelte HUVEC-Monoschichten und die inhibitorische Aktivität der monoklonalen Antikörper TS1/18 und R6-5-D6 Vorbehandlung der PMNL HUVEC % Adhärenz
HUVEC wurden mit LPS (10 ng/ml) für den angegebenen Zeitraum inkubiert, gewaschen, indem sie dreimal in zweifach ausgetauschtes PBS getaucht wurden, und sodann PBS oder dem R6- 5-D6 IgG (12 ug/ml) 15 Minuten ausgesetzt. Die HUVEC- Monoschichten wurden wiederum gewaschen. Die Adhärenz der reifen PMNL, die in PBS oder TS1/18 < 1 : 400-Verdünnung des Aszites) suspendiert worden waren, oder der CD18-defizienten (CD18-Def.) PMNL wurde unter Verwendung eines visuellen Assays bei Raumtemperatur bestimmt. 5% Adhärenz ± 1.s.d. Die Anzahl der einzelnen Tests ist durch "n" angegeben.

Beispiel 10

Bedingungen für eine PMNL-Wanderung durch HUVEC-Monoschichten

Es ist beobachtet worden, daß sich ein Teil der PMNL, die sich an die HUVEC anheften, durch die Monoschicht bewegt und zwischen die HUVEC und die Unterschicht wandert, Tonnesen, M.G., et al., J. Clin. Invest. 74 : 1581-1592 (1984); Smedly, L.A., et al, Fed. Proc. 42 : 386a (1983); Gimbrone, M.A., et al., J. Clin. Invest. 74 : 1552-1555 (1984); Beesley, J.E. et al., J. Cell. Sci. 38 : 237-248 (1979); Armstrong, P.B., et al. J. Cell.
Biol. 65 : 439-462 (1975)). Diese Neutrophile setzten die bipolare Konfiguration voraus, die für bewegliche PMNL typisch ist, obwohl sie in diesem Raum sehr flach erschienen. Der prozentwert der PMNL, die dieses Verhalten zeigten, war sowohl unter Basislinien-Bedingungen (< 1%, n, 45) und wenn die PMNL dem fMLP ausgesetzt wurden, sehr niedrig (Fig. 9). Wenn die HUVEC jedoch mit IL-1 oder LPS stimulierten wurden, erhöhte sich der prozentuale Anteil, der durch die Monoschicht wanderte, signifikant (33,3 ± 10,3%; n, 25; 10 ng/ml LPS, Fig. 9). Wenn der Adhärenz-Assay bei 37ºC durchgeführt wurde, zeigten dieses Verhalten auf LPS-stimulierten Monoschichten ein signifikant größerer prozentualer Anteil der Zellen (78,4 ± 4,2%; n, 8; p< 0,01), obwohl die prozentuale Adhärenz sich durch diese Temperaturerhöhung etwas weniger erhöhte (Fig. 10). Der R6-5-D6 und der TS1/18 waren beide gleichermaßen wirksam bei der Blockierung der Wanderung der PMNL durch die HUVEC- Monoschicht. Bei einem bei Raumtemperatur durchgeführten Adhärenz-Assay betrug der Prozentwert der Zellen, die durch IL- 1- stimulierte (0,5 U/ml) Monoschichten wanderten, 30,6 ± 12,6% (n, 17) im Vergleich zu 1,6 ± 1,6% (n, 17; p< 0,01) oder 5,0 ± 1,2% (n, 3; p< 0,05), wenn die PMNL in TS1/18 (1 : 400-Verdünnung des Aszites) bzw. in OKM1 (1 : 200-Verdünnung des Aszites) vorinkubiert worden waren, oder 2,5 ± 1,7% (n, 6; p< 0,01), wenn die HUVEC-Monoschicht mit dem R6-5-D6 (1 : 400-Verdünnung des Aszites) vorinkubiert worden war. Der TS1/22 und der W6/32 besaßen keinen inhibitorischen Effekt (% wandernde Zellen, 36,0 ± 11,5%; n, 3; bzw. 32,2 ± 7,9%, n, 3). R6-5-D6-IgG und -F(ab)- Präparate wurden bei 37ºC untersucht. Beide verursachten sowohl bei 37ºC als auch bei Raumtemperatur eine signifikante Inhibition der Wanderung und der Adhärenz. Die prozentuale Inhibition der Adhärenz bei 37ºC durch die R6-5-D6-F(ab)- und - IgG-Präparate betrug 51 bzw. 60%, während die prozentuale Inhibition der Wanderung 81 bzw. 86% betrug. Bei Raumtemperatur betrug die prozentuale Inhibition der Adhärenz durch den R6-5- D6-IgG 59% und die prozentuale Inhibition der Wanderung 92%.
Die Wichtigkeit des CD18-Komplexes bei der transendothelialen Wanderung in vitro wurde ferner durch die Ergebnisse mit CD18- defizienten Zellen gezeigt. Wie in Fig. 10 dargestellt ist, wanderten sie nicht bei Raumtemperatur und sehr wenig bei 37ºC.

Beispiel 11

Intrazelluläre Lage des Mac-1 und des P150,95

In normalen nicht- stimulierten PMNL und Monozyten sind der Mac-1 und der p150,95 in einem intrazellulären vesikulären Kompartment sowie auf der Zelloberfläche vorhanden (Jones, D.H., et al. Pedi. Res. 21 : 312a (1987); Miller, L.J., et al., J. Clin. Invest. 80 : 185-191 (1987)). Eine Exposition gegenüber chemotaktischen Stimuli (z. B. C5a und f-Met-Leu-Phe (fMLP), Phorbolmyristatacetat (PMA) oder Kalziumionophor (A23187)) ruft eine 5-10fache Verstärkung der Oberflächenbindung von monoklonalen Antikörpern, die gegen Mac-1 oder p150,95 gerichtet sind (Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152 : 668-689 (1985)) und eine 2-3fache Verstärkung des PMNL-Adhäsionsvermögens hervor (Anderson, D.C., et al., J. Clin. Invest. 74 : 536-551 (1984)). Diese Oberflächenprotein-"Hoch-Regulation" ist nach einer ungefähr 8-minütigen Inkubation bei 37ºC maximal und wird nicht durch Inhibitoren der Proteinsynthese verhindert. Diese Beobachtungen legen nahe, daß Mac-1 und p150,95 durch Entzündungsstimuli von einer latenten intrazellulären Ansammlung zur Zelloberfläche transloziert werden. LAD-Patienten zeigen nach einer Exposition gegenüber den chemotaktischen Faktoren PMA oder A23187 entweder keine erhöhte Bindung von monoklonalen Antikörpern, die gegen Untereinheiten des CD18-Komplexes gerichtet sind, oder keine erhöhte Adhärenz an künstliche Substrate oder das Endothel in vitro (Anderson, D.C., et al., J. Clin. Invest. 74 : 536-551 (1984)). Somit reflektiert die stark verminderte Infiltration der PMNL und der Monozyten in die entzündeten Gewebe von LAD-Patienten eine verminderte CDI8-Expression und den daraus folgenden Mangel einer erhöhten Adhärenz an das vaskuläre Endothel, was normalerweise durch Entzündungsstimuli induziert wird.

Beispiel 12

Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers R6-5-D6

Eine direkte, zuverlässige Dokumentation der CD18-abhängigen PMNL-Adhärenz an HUVEC ist in drei Versuchstypen klar gezeigt worden, die radioaktiv markierte humane Neutrophile und HUVEC (Harlan, J.M., et al., Blood 66 : 167-178 (1985); Pohlman, T.H., et al., J. Immunol. 136 : 4548-4553 (1986)) oder humanes mikrovaskuläres Endothel (Tonnesen, M.G., et al., Clin. Res. 34 : 419a (1986); Tonnesen, M.G., et al., Fed. Proc. 45 : 379a (1986)) verwenden:
1) Ein monoklonaler Antikörper, der mit CD18 reagiert (monoklonaler Antikörper 60.3) inhibiert teilweise die Adhärenz der humanen PMNL an nicht-stimulierte HUVEC und an HUVEC, die mit IL-1, LPS und rTNF-a stimuliert worden waren (Pohlman, T.H., et al., J. Immunol. 136 : 4548-4553 (1986)).
2) PMNL von Patienten mit einem Mangel an CD18 zeigten einen niedrigen Adhärenzgrad, und es trat keine Verstärkung nach einer Stimulation mit chemotaktischen Faktoren auf (Tonnesen, M.G., et al., Clin. Res. 34 : 419a (1986); Pohlman, T.H., et al., J. Immunol. 136 : 4548-4553 (1986)).
3) Die Adhärenzzunahme nach einer Exposition von normalen PMNL gegenüber einem sekretionsanregenden Mittel (Pohlman, T.H., et al., J. Immunol. 136 : 4548-4553 (1986)) oder gegenüber den chemotaktischen Faktoren C5a, fMLP, LTB&sub4; und PAF (Tonnesen, M.G., et al., Clin. Res. 34 : 419a (1986); Tonnesen, M.G., et al., Fed. Proc. 45 : 379a (1986)) wurde durch anti-β monoklonale Antikörper (60.3 und TS1/18) und durch 60.1, einem monoklonalen Antikörper, der mit CD11b reagiert (Wallis, W.J., et al., J. Immunol. 135 : 2323-2330 (1985); Pohlman, T.H., et al., J. Immunol. 136 : 4548-4553 (1986)), deutlich inhibiert.

Beispiel 13

CD18-abhängige Adhärenz der PMNL und der HUVEC

Eine Wanderung der PMNL unterhalb der Endothelzell-Monoschichten, die auf Protein-überzogenen Glas- oder Kunststoffunterschichten gewachsen waren, ist wiederholt beobachtet worden (Tonnesen, M.G., et al., J. Clin. Invest. 74 : 1581-1592; Smedly, L.A., et al., Fed. Proc. 42 : 386a (1983); Gimbrone, M.A., et al., J. Clin. Invest. J:1552-1555 (1984); Beesley, J.E., et al., J. Cell. Sci. 38 : 237-248 (1979); Armstrong, P.B., et al., J. Cell. Biol. 65 : 439-462 (1975)). Diese Wanderung erfolgt in Abwesenheit von zugefügten chemotaktischen Stimuli und kann nicht vom Standpunkt des relativen Adhäsionsvermögens des Endothels und der Unterschicht erklärt werden (Beesley, J.E., et al., J. Cell. Sci. 38 : 237-248 (1979)). Da der in der vorliegenden Erfindung verwendete Adhärenz-Assay eine direkte Bestimmung des Prozentwertes der wandernden PMNL erlaubte, konnte dieses Phänomen bei jedem experimentellen Verfahren überwacht werden. Eine Wanderung der nicht-stimulierten PMNL in eine Position zwischen der HUVEC-Monoschicht und der Unterschicht erfolgte in einem hohen prozentualen Anteil der PMNL nur, wenn die HUVEC- Monoschicht mit LPS oder IL-1 stimuliert worden war. Dieser prozentuale Anteil erhöhte sich im Vergleich zu den Ergebnissen bei Raumtemperatur wesentlich, wenn der Adhärenz-Assay bei 37ºC durchgeführt wurde. Ein chemokinetischer Stimulus (d. h. fMLP, das in gleichmäßiger Konzentration in der Adhärenz-Kammer vorhanden war) förderte dieses Verhalten bei den PMNL nicht. Die Wanderung von nicht-stimulierten normalen PMNL unterhalb von LPS- oder IL-1-stimulierten HUVEC-Monoschichten wurde in Gegenwart des TS1/18 an den Zellen während der Beobachtungsdauer deutlich inhibiert. Dieses Ergebnis sowie die Tatsache, daß CD18-defiziente PMNL einen extrem niedrigen Grad an transendothelialer Wanderung zeigen, impliziert einen CDl8-abhängigen Mechanismus. Diese Ergebnisse werden durch die extrem geringe Adhärenz-abhängige Wanderung der CD18-defizienten PMNL unterstützt (Anderson, D.C., et al., Ann. Rev. Med. 38 : 175-194 (1987)). Der R6-5-D6 war bei der Blockierung der PMNL-Wanderung unterhalb der stimulierten HUVEC-Monoschichten äquivalent zum TSI/18. Bei allen diesen Versuchsbedingungen rief eine monoklonale Antikörper-Kontrolle (W6/32) mit dem gleichen Isotyp wie R6-5-D6 keine Veränderung der Adhärenz oder der Wanderung der PMNL hervor, obwohl er an die HUVEC-Oberfläche in größeren Mengen als der R6-5-D6 gebunden hatte. Die oben dargelegten Beobachtungen zeigen, daß die Endothelzellen eine aktive Rolle bei der transendothelialen Wanderung der PMNL in vitro spielen, und daß die von dem R6-5-D6 erkannte Determinante für dieses Phänomen entscheidend ist.

Beispiel 14

Fähigkeit des anti-ICAM-1-Antikörpers. die Wanderung von Neutrophilen in entzündete Kaninchenlungen zu inhibieren

Die Fähigkeit des anti-ICAM-1-Antikörpers, die Wanderung von Neutrophilen in entzündete Kaninchenlungen zu inhibieren, wurde untersucht. Eine Stunde nach der i.v.-Injektion des anti-ICAM- 1-Antikörpers R6-5-D6 (mit 0,015 mg/kg, 0,15 mg/kg oder 1,5 mg/kg) wurde Kaninchen Phorbol-12-myristyl-13-acetat (PMA) (40 ug/kg) injiziert, wodurch eine akute Lungenentzündung als Reaktion induziert wurde, die ihren Höhepunkt nach 20-24 Stunden erreichte. Die Anzahl der zu diesem Zeitpunkt in bronchoalveolaren Spülungen vorhandenen Neutrophilen wurde unter Verwendung eines Coulter Counters quantifiziert und mit Kaninchen verglichen, die PMA, aber nicht anti-ICAM-1 erhielten. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der Fig. 11 dargestellt. Die Daten zeigen, daß der anti-ICAM-1 bei 1,5 mg/kg die Wanderung der Neutrophilen um 72% inhibierte.

Beispiel 15

Effekt des anti-ICAM-1-Antikörpers auf die Myokard-Reperfusion

Um die Effekte des anti-ICAM-1-Antikörpers R6-5-D6 auf eine Reperfusionsverletzung im Kaninchen-Myokard in vivo zu bestimmen, wurde der Antikörper (2,0 mg/kg in einem i.v.-Bolus) 15 Minuten vor einem 1-stündigen Verschluß der linken vorderen absteigenden Koronararterie verabreicht, wonach eine Reperfusion der gleichen Arterie erfolgte. Die Durchschnittsergebnisse von neun Versuchen sind in der Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Effekte des R-6-5-Antikörpers auf eine ischämische Schädigung im Kaninchen-Myokard in vivo Risikofläche % gegenüber der Kontrolle % des linken Ventrikels % der Infarktfläche Herzschlagfrequenz % der Kontrolle vor dem Verschluß bei Beendigung des Verschlusses bei Beendigung der Reperfusion systolischer Blutdruck des linken Vetrikels mm Hg linke ventrikuläre dp/dtmax mHg/sek diastolischer Blutdruck der Aorta mm Hg

Claims

1. Verwendung von ICAM-1 oder eines funktionellen Derivates davon zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung einer Entzündung, die aus einer Antwort des unspezifischen Abwehrsystems in einem Säuger resultiert, wobei das funktionelle Derivat:

ein Fragment ist, das einen Polypeptid-Teil von ICAM-1 darstellt, das zur Bindung an einen Liganden befähigt ist, der an ICAM-1 bindet, und/oder das nach Einführung in ein geeignetes Lebewesen zur Produktion von Antikörpern führt, die in der Lage sind, an ICAM-1 zu binden,

eine Variante von ICAM-1 ist, die ein Molekül darstellt, das im wesentlichen ähnliche Struktur und biologische Aktivität wie ICAM-1 oder das Fragment davon aufweist, oder

ein chemisches Derivat von einem dieser Moleküle ist.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei ICAM-1 verwendet wird.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei ein in Anspruch 1 beschriebenes funktionelles Derivat von ICAM-1 verwendet wird.

4. Verwendung eines Antikörpers, der in der Lage ist, an ICAM-1 zu binden, eines Fragmentes eines Antikörpers, wobei das Fragment in der Lage ist, an ICAM-1 zu binden; und eines Nicht-Immunglobulin-Antagonisten von ICAN-1 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung einer Entzündung, die aus einer Antwort des unspezifischen Abwehrsystems in einem Säuger resultiert.

5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei ein Antikörper verwendet wird, der in der Lage ist, an ICAM-1 zu binden.

6. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei ein Fragment eines Antikörpers verwendet wird, wobei das Fragment in der Lage ist, an ICAM-1 zu binden.

7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 5 und 6, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei der monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper R6-5-D6 ist.

9. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei ein Nicht- Immunglobulin-Antagonist von ICAM-1 verwendet wird.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei der Nicht- Immunglobulin-Antagonist von ICAM-1 ein anderer Nicht- Immunglobulin-Antagonist von ICAM-1 als LFA-1 ist.

11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Entzündung mit einem Zustand assoziiert ist, der ausgewählt ist unter: dem adulten Atemnot-Syndrom; dem multiplen Organverletzungs-Syndrom als Folge einer Sepsis; dem multiplen Organverletzungs-Syndrom als Folge eines Traumas; der Reperfusion bei einer Gewebeverletzung; der akuten Glomerulonephritis; der reaktiven Arthritis; der Dermatose mit akuten entzündlichen Komponenten; einer entzündlichen Erkrankung des zentralen Nervensystems; einer thermischen Verletzung; Hämodialyse; Leukapherese; ulzerativer Kolitis; der Crohn-Krankheit; nekrotisierender Enterokolitis; dem Granulozyten-Transfusion-assoziierten Syndrom; und der Zytokin-induzierten Toxizität.