DE69233136T2

DE69233136T2 - Ein selectin ligand

Info

Publication number: DE69233136T2
Application number: DE69233136T
Authority: DE
Inventors: A. Laurence LASKY; Yasuyuki Imai; D. Steven ROSEN; S. Mark SINGER
Original assignee: Genentech Inc; University of California; University of California Berkeley
Current assignee: Genentech Inc; University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1991-05-06
Filing date: 1992-05-06
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2012-05-07
Also published as: DK0584229T3; IE921450A1; CA2108029A1; JPH07507679A; JP3691467B2; DE69233136D1; AU1993792A; JP3859697B2; US5484891A; EP0584229B1; ATE245696T1; ES2201049T3; EP0584229A1; JP2003144181A; AU660995B2; WO1992019735A1

Description

I. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft endotheliale Selectin-Liganden. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren und Mittel zur Herstellung dieser Liganden sowie dafür kodierende Nucleinsäuren.
II. Beschreibung des Stands der Technik
Lymphozyten sind Mediatoren normaler Gewebeentzündungen sowie pathologischer Gewebeschädigungen, die bei rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen auftreten. Um das antigene Repertoire des Immunsystems voll auszunützen, haben Wirbeltiere einen Mechanismus zur Verteilung von Lymphozyten mit unterschiedlichen antigenen Spezifitäten auf räumlich verschiedene Regionen des Organismus entwickelt (E. C. Butcher, Curr. Top. Micro. Immunol., Bd. 128 (1986), S. 85; Gallatin et al., Cell, Bd. 44 (1986), S. 673; Woodruff et al., Immunol. Today, Bd. 10 (1989), S. 23; Yednock et al., Adv. Immunol., Bd. 44 (1989), S. 313).
Dieser Mechanismus beinhaltet die kontinuierliche Kreislaufführung der Lymphozyten zwischen dem Blut, wo die Zellen den höchsten Beweglichkeitsgrad haben, und den lymphoiden Organen, wo die Lymphozyten auf sequestrierte und prozessierte Antigene treffen.
Man weiß seit einiger Zeit, dass die Wanderung von Lymphozyten aus dem Blut in sekundäre lymphoide Organe, wie Lymphknoten (LN) und Peyer-Plaques am Darm (PP) durch eine adhäsive Wechselwirkung mit den spezialisierten Endothelzellen von hohen Endothelvenolen ("high endothelial venules", HEV) eingeleitet wird (Berg et al., Immunol. Rev., Bd. 108 (1989), S. 5; Duijvestijn und Hamann, Immunol. Today, Bd. 10 (1989), S. 23; Woodruff et al., Annu. Rev. Immunol., Bd. 5 (1987), S. 201; Yednock und Rosen, Adv. Immunol., Bd. 44 (1989), S. 313; Stoolman, Cell, Bd. 56 (1989), S. 907). Es gibt deutliche Anzeichen dafür, dass die Lymphoidorgan-selektive Wanderung oder "Heimkehr" von Lymphozyten großenteils durch eine organspezifische Bindung von Lymphozyten an HEV festgelegt wird (Butcher (1986), a.a.O.). Ihrer Funktion nach werden die mit Lymphozyten assoziierten Moleküle, die der organselektiven Wechselwirkung mit HEV unterliegen, als "Heimkehr-Rezeptoren" ("homing receptors") bezeichnet, während die verwandten Endothelmoleküle als "HEV-Liganden" bekannt sind (Gallatin et al., (1986), a.a.O.; Rosen, Curr. Opin. Cell. Biol., Bd. 1 (1989), S. 913). Für die endothelialen HEV-Liganden wird angenommen, dass sie für die verschiedenen Lymphoidorgane unterschiedlich sind. Man nimmt an, dass sie als solche für die Regulierung der Lymphozytenpopulationen, die in jede Klasse von Lymphoidorganen gelangen, verantwortlich sind (Butcher, Am. J. Pathol., Bd. 136 (1990), S. 3). Eine Charakterisierung der detaillierten molekularen Mechanismen, die der Lymphozytenwanderung zugrunde liegen, ist sowohl vom wissenschaftlichen als auch vom klinischen Standpunkt aus von Interesse, da ähnliche Adhäsionsvorgänge sowohl bei normalen als auch bei pathogenen Formen von Leukozytenentzündungen beteiligt sein können (Watson et al., Nature, Bd. 349 (1991), S. 164–167).
Unter den Homing-Rezeptoren am gründlichsten untersucht ist ein Rezeptor, der ursprünglich als peripherer Lymphknoten-Homing-Rezeptor (pnHR) bezeichnet wurde. Dieser Rezeptor wurde zunächst im murinen System durch den monoklonalen MEL-14-Antikörper (mAb) definiert, einen Antikörper, von dem festgestellt wurde, dass er ein Leukozyten-Oberflächenantigen von etwa 90 kD (als gpgO^MEL bezeichnet) erkennt (Gallatin et al., Nature, Bd. 303 (1983), S. 30). Es wurde festgestellt, dass dieser Antikörper die Lymphozyten-Adhäsion an HEV von peripheren und mesenterischen Lymphknoten beim in vitro-Haftungstest gemäß Stamper-Woodruff blockiert und in vivo die Wanderung in Lymphknoten verhindert. Eine Heimkehrfunktion von gp90^MEL wurde zweifelsfrei dadurch nachgewiesen, dass mit einem Detergens solubilisierte und lösliche rekombinante Formen des Rezeptors selektiv adhäsive Stellen von Lymphozyten an LN, aber nicht die an PP-HEV blockieren können (Geoffroy und Rosen, J. Cell. Biol., Bd. 109 (1989), S. 2463).
Durch molekulares Klonieren von cDNAs, die für murine und humane gp90^MEL-Rezeptoren kodieren, ergab sich ein Transmembranprotein mit einer Lectin-Domäne vom Calciumtyp (C-Typ) an seinem extrazellulären Aminoterminus, gefolgt von einem EGF-Motiv, zwei regulatorischen Komplementmotiven (verwandt mit den in Proteinen gefundenen Motiven mit Komplementbindungsaktivität), einer Transmembran-Domäne und einem kurzen Zytosolschwanz (Lasky et al., Cell, Bd. 56 (1989), S. 1045; Siegelman et al., Science (Washington, D. C.), Bd. 243 (1989), S. 1165; Siegelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 5562; Tedder et al., J. Exp. Med., Bd. 170(1) (1989), S. 123; Tedder et al., J. Immunol., Bd. 144 (1989), S. 532; Bowen et al., J. Cell. Biol., Bd. 109 (1989), S. 421; Camerini et al., Nature, Bd. 342 (6245) (1989), S. 78; US-SN 315 015, Anmeldetag 23. Februar 1989; WO-91/08298, veröffentlicht am 13. Juni 1991).
Andere Arbeitsgruppen identifizierten ein weiteres Molekül in Verbindung mit der Neutrophilenadhäsion. Es wurde vorgeschlagen, dass dieses Molekül mit der Bezeichnung endotheliales Leukozyten-Adhäsionsmolekül ELAM-1, ein induzierbares Adhäsionsmolekül darstellt, dessen Rolle darin besteht, die Haftung von Neutrophilen an venolären Endothelzellen neben Entzündungsstellen zu vermitteln (Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84, (1989), S. 9238; Hession et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87(5) (1990), S. 1673).
Untersuchungen der in den alpha-Körnchen von Blutplättchen enthaltenen Proteine führten zur Entdeckung eines weiteren Haftungsmoleküls mit den unterschiedlichen Bezeichnungen granuläres Membranprotein 140 (GMP-140), von der Blutplättchenaktivierung abhängiges, granuläres, externes Membranprotein (PADGEM) oder CD62 (McEver et al., J. Biol. Chem., Bd. 259 (1984), S. 9799; Bonfanti et al., Blood, Bd. 73 (1989), S. 1109; Hattori et al., J. Biol. Chem., Bd. 264 (14) (1989), S. 7768). Die cDNA-Sequenz, die für diesen Rezeptor kodiert, wurde von Johnston et al. bestimmt (Cell, Bd. 56 (1989), S. 1033).
Ein Vergleich ihrer Aminosäuresequenzen ergab, dass diese drei Haftmoleküle in sehr auffälliger und zwingender Weise miteinander verwandt sind. Ihre gemeinsame Mosaikstruktur besteht aus einem calciumabhängigen Lectin- oder Kohlenhydrat-bindenden Motiv, einem epidermalen, Wachstumsfaktor-ähnlichen (EGF) Motiv und einer unterschiedlichen Anzahl eines regulatorischen Komplement-Motivs (CR). Die geordnete Verbindung dieser Motive hat zu der Bezeichnung LEC-CAM (Lectin Egf Complement Regulatory-Cell Adhesion Molecule) für diese neue Familie von endothelialen Leukozyten-Zellhaftmolekülen geführt (Stoolman, Cell, Bd. 56 (1989), S. 907). Alternativ wurde diese Familie mit der Bezeichnung "Selectin" bezeichnet (Bevilacqua et al., Science, Bd. 243 (1989), S. 1160; Geng et al., Nature, Bd. 343 (1990), S. 757).
Die drei Mitglieder der LEC-CAM- oder Selectin-Familie von Zellhaftmolekülen sind: L-Selectin (auch bekannt als peripherer Lymphknoten-Homing-Rezeptor (pnHR), LEC-CAM-1, LAM-1, gp90^MEL, gp100^MEL gp110^MEL, MEL-14-Antigen, Leu-8-Antigen, TQ-1-Antigen, DREG-Antigen), E-Selectin (LEC-CAM-2, LECAM-2, ELAM-1) und P-Selectin (LEC-CAM-3, LECAM-3, GMP-140, PADGEM). Diese Rezeptoren werden nachstehend als "Selectine" bezeichnet. Die Strukturen der Mitglieder der Selectinfamilie und die dafür kodierenden Gene sind in den 1 bzw. 2 dargestellt. Der Befund, dass einfache monomere Zucker, wie Mannose-6-phosphat (M6P) und Fructose-1-phosphat, die Wechselwirkungen von murinen und humanen Lymphozyten mit HEV von peripheren Lymphknoten (pln) blockieren können (Stoolman et al., J. Cell Biol., Bd. 96 (1983), S. 722; Stoolman et al., J. Cell Biol., Bd. 99 (1984), S. 1535; Stoolman et al., Blood, Bd. 70 (1987), S. 1842), ließen darauf schließen, dass der durch L-Selectin erkannte endotheliale Ligand eine Kohlenhydratbasis aufweist. In einer Reihe von Versuchen zeigten Rosen et al., dass die Homing-Rezeptor-abhängige Bindung von Lymphozyten an pln-HEV durch in vitro- oder in vivo-Behandlung mit Sialidasen von breitem Wirkungsspektrum beseitigt wurde (Rosen et al., Science (Washington, D. C.), Bd. 228 (1985), S. 1005; Rosen et al., J. Immunol., Bd. 142 (1989), S. 1895). Da dieses Enzym selektiv terminale Sialinsäurereste von Oligosacchariden entfernt, deuteten diese Ergebnisse stark darauf hin, dass Sialinsäure ein kritisches Element für die Erkennung darstellt.
Die Natur der endothelialen Moleküle, die von L-Selectin erkannt werden, wurde anschließend mit einer besonderen rekombinanten Chimäre, die aus der extrazellulären Domäne von L-Selectin in Verbindung mit den CH2- und CH3-Gelenkregionen der schweren humanen IgG1-Kette besteht, sondiert (vergl. WO 91/08298, veröffentlicht am 13. Juni 1991 für die Chimäre und Watson et al., .J. Cell Biol., Bd. 110 (1990), S. 2221, für die Verwendung als Sonde für adhäsive Liganden von hohen endothelialen Lymphknoten-Venolen). Ursprüngliche Untersuchungen mit dieser sogenannten Rezeptor-Immunoglobulin-Chimäre zeigten, dass sie sich bei Zellblockierungsversuchen und immunohistochemischen Versuchen an peripheren und mesenterischen Lymphknoten-spezifischen HEV-Liganden anhaften konnte (Watson et al., (1990), a.a.O.). Die immunohistochemische Erkennung dieses HEV-Liganden wurde durch Behandlung von Lymplhknotenschnitten mit Sialidase beseitigt, was darauf schließen lässt, dass eine Komponente des durch L-Selectin erkannten Kohlenhydrats eine sialinsäureartige Beschaffenheit aufwies und die Bedeutung der Lectin-Domäne in der durch L-Selectin vermittelten Haftung weiter unterstrich (Rosen et al., Science (Washington, D. C.), Bd. 228 (1985), S. 1005–1007; Rosen et al., (1989), a.a.O.; und True et al., J. Cell Biol., Bd. 11 (1990), S. 2757-2764). Diese Ergebnisse belegten die Spezifität der L-Selectin-Immunoglobulin-Chimäre für den pln-HEV-Liganden und bestätigten, dass der Ligand Kohlenhydratreste exprimiert, die für die durch den Homing-Rezeptor vermittelte Zellhaftung wesentlich sind.
Eine neue Reihe von Untersuchungen bestätigte, dass der E-Selectin-Ligand ebenfalls einen Kohlenhydratcharakter aufweist. Mehrere Laboratorien, die sehr unterschiedlich vorgingen, kamen zu dem Schluss, dass ein E-Selectin-Ligand ein Kohlenhydrat darstellt, das als Sialyl-Lewis^X (sLex) bekannt ist, oder eine eng verwandte Struktur aufweist, die als CD65 oder VIM-2 bekannt ist (NeuAca2-3Galb-1-4(Fuca1-3)GlcNAcb1). Lowe et al. (Cell, Bd. 63 (1990), S. 475) transfizierten nichtmyeloide Zellen mit einer 1,3/4-Fucosyltransferase und erzeugten eine Ligandenaktivität für E-Selectin, die mit der Expression der Slex-Determinante in Wechselbeziehung stand. Goeltz et al. (Cell, Bd. 63 (6) (1990), S. 1349 identifizierte und klonierte eine 1,3-Fucosyltransferase, die an der Synthese des tatsächlichen ELAM-1-Liganden in myeloiden Zellen beteiligt war. In direkterer Vorgehensweise konnten Philips et al. (Science, Bd. 250 (4984) (1990), S. 1130 und Walz et al. (Science, Bd. 250 (4984) (1990), S. 1132 eine Hemmung der von E-Selectin abhängigen Haftung entweder mit Slex enthaltenden Glycokonjugaten oder mit Antikörpern gegen Slex zeigen. Die kritische Beteiligung sowohl von Sialinsäure- als auch von Fucoseresten an der Ligandenaktivität wurde in diesen Untersuchungen gezeigt. Schließlich reinigten Tiemeyer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)) mehrere myeloid-abgeleitete Glycolipide, die in einem Festphasentest eine Ligandenaktivität für mit E-Selectin transfizierte Zellen aufwiesen. Eine massenspektroskopische Analyse von gereinigtem, E-Selectin bindendem Glycolipid ergab, dass die für die Aktivität erforderliche Mindeststruktur ein sialyliertes Lactosamin mit einer zweiten internen N-Acetyllactosamin-Einheit mit einem Gehalt an einer 1,3-verknüpften Fucose am N-Acetylglucosamin (CD65) war. Wie bei der Slex-Determinanten waren sowohl die Sialinsäure als auch die Fucose für die Bindungsaktivität des mutmaßlichen Liganden wesentlich.
Fortschritte wurden auch bezüglich der Identifizierung von Liganden für P-Selectin gemacht. Larsen et al. (Cell, Bd. 63 (1990), S. 467) haben die Lex-Determinante (Galb1-4(a1-3Fuc)GlcNAc) als wichtiges Element des P-Selectin-Liganden an myeloiden Zellen ins Spiel gebracht. Jedoch ist auch Sialinsäure für die volle Ligandenaktivität erforderlich, vermutlich in einer 2,3-Verknüpfung (Corall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 172 (1990), S. 1349; Moore et al., J. Cell Biol., Bd. 112 (1991), S. 491). Es besteht die Möglichkeit, dass der Ligand für P-Selectin gleich oder sehr ähnlich wie der Ligand für E-Selectin ist, da insbesondere beide Selectine an ein sehr ähnliches Spektrum von Zelltypen binden (Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), S. 6224).
Die bemerkenswerte Homologie in den Selectinstrukturen sowie die bereits nachgewiesenen Ähnlichkeiten in den Liganden lassen darauf schließen, dass sie ligandenverwandte Strukturen aufweisen, zwischen denen aber doch feine Unterschiede bestehen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Reinigung eines Selectin-Liganden bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von gereinigten Selectin-Liganden und insbesondere von L-Selectin-Liganden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Nucleinsäuresequenzen bereitzustellen, die für Selectin-Glycoproteinliganden kodieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bestimmung der Aminosäuresequenzen der Selectin-Liganden und in der Identifizierung der (O- und N-verknüpften) Glycosylierungsstellen an diesen Liganden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Herstellung einer Aminosäuresequenz und/oder von Glycosylierungsvarianten von Selectin-Liganden, die ansonsten in der Natur nicht auftreten, zu ermöglichen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Konstruktion von Selectin-Inhibitoren, die auf Kohlenhydraten beruhende Determinanten der Selectin-Liganden nachahmen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Unsere anfängliche Analyse des HEV-assoziierten Liganden hat einen besonderen Aspekt des HEV-Metabolismus ausgenützt. Frühe Arbeiten von Andrews et al. (J. Cell Sci., Bd. 57 (1982), S. 277) hat gezeigt, dass HEV in situ insofern besondere Eigenschaften aufwiesen, als sie große Mengen an anorganischem Sulfat in Makromoleküle einbauten. Wir haben daher die Fähigkeit von L-Selectin-IgG-Chimären zur Fällung von mit anorganischem Sulfat markiertem Material aus Lymphknoten unter Markierung mit ³⁵S-Sulfat in Organkulturen analysiert. Eine überwiegende 50 kD-Komponente und ein schwächeres 90 kD-Molekül (Sgp⁵⁰ und Sgp⁹⁰) wurden aus Lymphknoten gefällt, waren aber in keinen anderen getesteten Organen vorhanden. Die Fällung dieser Komponenten mit der L-Selectin-IgG-Chimären erwies sich auch als calciumabhängig und empfindlich gegenüber MEL-14-mAb und spezifischen Kohlenhydraten. Diese Reaktion konnte durch Behandlung der mit Sulfat markierten Proteine mit Sialidase oder durch Teilnahme des Kohlenhydrat-Polymeren Fucoidin bei der Umsetzung beseitigt werden. Schließlich fällte ein monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung MECA-79, der selektiv mit sogenannten "vaskulären Addressinen" von pln-HEV reagiert und die Adhäsivität für Lymphozyten blockiert (Streeter et al., J. Cell Biol., Bd. 107 (1988), S. 1853), beide Komponenten. Eine vorläufige biochemische Analyse ergab, dass die ~50 kD- und ~90 kD-L-Selectin-Liganden trypsinempfindliche Glycoproteine sind, die vorwiegend O-verknüpfte Ketten enthalten (vergl. Imai et al., J. Cell Biol., Bd. 113 (1991), S. 1213). Das Auffinden von O-verknüpften Ketten ist von Interesse im Hinblick auf Belege dafür, dass O-verknüpfte Regionen Zelloberflächen-Glycoproteine zur Bildung von hochgradig ausgedehnten und starren Strukturen veranlassen (Jentoft et al., Trends in Biochem. Sci., Bd. 15 (1990), S. 291) und somit in idealer Weise zur Ausführung von Erkennungsfunktionen positioniert sind.
Fucose, Sulfat und Sialinsäure wurden in den O-verknüpften Ketten dieser Moleküle gefunden. Es wird angenommen, dass Fucose, ähnlich wie Sialinsäure, für die vollständige Ligandenaktivität erforderlich ist.
Um die Natur des endothelialen Liganden, der durch L-Selectin erkannt wird, weiter zu charakterisieren, haben wir einen neuen Weg der Affinitätsreinigung des sulfatierten ~50 kD-HEV-Glycoproteins mit der L-Selectin-IgG-Chimären eingeschlagen. Das gereinigte Glycoprotein wurde einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterzogen. Diese Sequenzinformation wurde zur Klonierung einer cDNA, die für die Proteinkomponente dieses L-Selectin-Liganden kodiert, ausgenützt. Es wurde festgestellt, dass die cDNA für ein neues, hochgradig O-verknüpftes (mucinartiges) Glycoprotein kodiert, das offensichtlich die Funktion eines Gerüstes ausübt, das der Lectin-Domäne von L-Selectin Kohlenhydrate präsentiert. Einzelheiten der experimentellen Arbeiten zusammen mit den Befunden und ihrer Interpretation finden sich in den Beispielen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein isoliertes Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, das eine für einen Selectin-Liganden kodierende Nucleotidsequenz umfasst.
Ein derartiges Nucleinsäuremolekül umfasst eine Nucleotidsequenz, die zur Hybridisierung mit dem Komplement einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß 4 kodiert, befähigt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz, die für ein Selectin-Ligandenprotein mit einer Aminosäuresequenz, die zu mehr als etwa 40% homolog mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz ist, kodiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Nucleinsäuremolekül aus folgender Gruppe ausgewählt:

(a) ein cDNA-Klon mit einer Nucleotidsequenz, die von der kodierenden Region eines nativen Selectin-Liganden-Gens abgeleitet ist;
(b) eine DNA-Sequenz, die zur Hybridisierung zu einem Klon von (a) unter wenig stringenten Bedingungen befähigt ist; und
(c) eine genetische Variante von einer der DNA-Sequenzen gemäß (a) und (b), die für ein Glycoprotein kodiert, das eine biologische Eigenschaft eines natürlich vorkommenden Liganden eines Selectinmoleküls aufweist.

Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül kann ferner eine Nucleotidsequenz umfassen, die für eine konstante Immunoglobulin-Domäne kodiert. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Expressionsvehikel, das eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 umfasst und funktionell mit Kontrollsequenzen, die von einer mit dem Vehikel transformierten Wirtszelle erkannt werden, verknüpft ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die mit dem vorstehend beschriebenen Expressionsvehikel transformiert ist, sowie Verfahren zur Züchtung von derart transformierten Wirtszellen zur Expression eines Selectin-Liganden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes L-Selectin-Liganden-Polypeptid nach Anspruch 16. Ein derartiges Polypeptid kann die extrazelluläre Region eines endothelialen Zelloberflächen-Glycoproteins umfassen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Polypeptid um Sgp50 oder Sgp90.
Das erfindungsgemäße Polypeptid umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz mit einer sterischen Struktur, die die Präsentation eines L-Selectin bindenden Restes an seinen Rezeptor ermöglicht.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform umfasst das vorstehende Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die durch Nucleinsäure kodiert wird, die unter wenig stringenten Bedingungen zur Hybridisierung mit dem Komplement einer Nucleotidsequenz befähigt ist, die für das Protein mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert.
Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform handelt es sich beim vorstehend beschriebenen Polypeptid um einen nativen Selectin-Liganden, der im wesentlichen frei von anderen Proteinen der gleichen tierischen Spezies, in dem es normalerweise vorkommt, ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Polypeptid gemäß der vorstehenden Definition, das zusätzlich eine konstante Immunoglobulin-Domänensequenz umfasst.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die eine Menge eines L-Selectin-Liganden-Polypeptids gemäß der vorstehenden Definition umfasst, die eine Blockierung der Bindung eines entsprechenden Selectin-Rezeptors an seinen nativen Liganden bewirkt, im Gemisch mit einem nicht toxischen, pharmazeutisch verträglichen Exzipiens.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des L-Selectin-Liganden-Polypeptids bei der Behandlung eines Symptoms oder Zustands, der mit einer übermäßigen Bindung von zirkulierenden Leukozyten an Endothelzellen in Verbindung steht.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Antikörper, der mit dem Proteinteil des L-Selectin-Liganden-Polypeptids immunoreaktiv ist. Bevorzugte Antikörper binden den entsprechenden Selectin-Liganden, gehen aber im wesentlichen keine Kreuzreaktion mit anderen bekannten Liganden ein und hindern Selectin-Liganden daran, eine Bindung mit ihren Rezeptoren einzugehen. Die anti-Selectin-Liganden-Antikörper können immobilisiert sein. In dieser Form eignen sie sich beispielsweise zum Nachweis oder zur Reinigung der erfindungsgemäßen Selectin-Liganden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit eines Nucleotids, das für das L-Selectin-Liganden-Polypeptid kodiert, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Hybridisieren einer Nucleinsäure, die für das Protein mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, mit einer Testprobe einer Nucleinsäure; und
(b) Nachweisen einer Hybridisierung zur Feststellung der Anwesenheit des Nucleotids in der Probe.

Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Reinigung des L-Selectin-Liganden-Polypeptids bereitgestellt, das die Absorption des Liganden an einer Chimäre umfasst, die das entsprechende L-Selectin und eine schwere Immunoglobulin-Kettensequenz umfasst.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Präsentieren eines L-Selectin-Bindungsrestes gegenüber einem entsprechenden L-Selectin, das die Bindung des Restes an das L-Selectin-Liganden-Polypeptid umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Strukturen der Mitglieder der Selectin (LEC-CAM)-Familie gemäß Bestimmung durch cDNA-Klonierung. Dargestellt sind die Strukturen für L-Selectin, E-Selectin und P-Selectin. Das Lectin, der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und mehrfache kurze Konsensus-Wiederholungen (SCRs) sind mit hypothetischen Disulfidbindungsstrukturen gemäß dem ursprünglichen Vorschlag für GMP-140 von Johnston et al., Cell, Bd. 56 (1989), S. 1033, dargestellt. Ferner sind eine N-terminale Sequenz (anschließend im reifen Protein abgespalten) sowie ein hydrophober Transmembran-Spannanker (TM) und cytoplasmatischer Schwanz dargestellt. Ferner sind zwei weitere Formen von P-Selectin dargestellt, eines mit einer deletierten scr-7-Domäne und ein anderes mit einem deletierten Membran-Spannanker.
2 zeigt die Struktur der Gene, die für die Mitglieder der Selectin-Familie kodieren. Dargestellt sind die genomischen Strukturen, die für humanes und murines L-Selectin, humanes E-Selectin und humanes P-Selectin kodieren. Die schwarzen Kästchen zeigen Exons, die für die verschiedenen strukturellen Motive kodieren, einschließlich das Startcodon für das murine Gen (ATG), die Signalsequenz (SS), das Lectin (LEC), den epidermalen Wachstumsfaktor (E), kurze Konsensus-Wiederholungssequenzen (SCR), den Transmembrananker (TM) und cytoplasmatische Domänen (CD) sowie die dazwischen liegenden Regionen, die für die Introns kodieren, die diese Protein-Kodierungsdomänen trennen. Beim Menschen liegen alle diese drei Selectin-Gene innerhalb von 200 Kilobasen am langen Arm von Chromosom 1 in der Nähe eines Locus, der für eine Familie von Proteinen kodiert, die alle eine variable Anzahl des kurzen SCR-Exons enthalten. Das murine L-Selectin wird ebenfalls am murinen Chromosom 1 in einer Region kodiert, die syntonisch mit der im humanen Chromosom 1-Homologen gefundenen Region ist.
3A erläutert die Reinigung und N-terminale Aminosäuresequenz des ~50 kD-L-Selectin-Liganden. Die Reinigung des Liganden aus konditioniertem Medium wurde durch Verfolgen von zugesetztem ³⁵S-markiertem Liganden überwacht. Bahn A: Konditioniertes Ausgangsmedium. Bahn B: Wässrige Phase nach Ausschütteln mit Chloroform/Methanol. Bahn C: LEC-IgG-gebundenes Material, wobei der eingeklammerte Bereich für die Gasphasen-Proteinsequenzierung ausgeschnitten wurde. Die Bahnen A-C stellen eine mit Coomassie R-250 gefärbte ProBlott-Membran dar. Die Bahn D stellt ein Autoradiogramm der Bahn C dar.
3B zeigt die N-terminate Aminosäuresequenz.
3C: Die 21-C-terminalen Aminosäuren wurden mit dem Wheel-Programm analysiert. Dieses Programm stellt eine nach unten gerichtete Ansicht des Zylinders einer helikalen Region dar und zeigt die die Helix umgebenden Aminosäurereste. Apolare Aminosäuren sind in hellen Kästchen und polare Aminosäuren in dunklen Kästchen dargestellt.
3D zeigt ein von der in A vorhergesagten Aminosäuresequenz abgeleitetes Hydropathie-Diagramm. Die schwarzen Kügelchen entsprechen Serin- oder Threoniniesten, während das helle Kügelchen das ASN der einzigen potenziellen, N-verknüpften Glycosylierungsstelle zeigt. Die vorhergesagte Domänenstruktur des ~50 kD-Liganden ist darüber dargestellt: Signalsequenz (SS), O-verknüpfte Regionen I und II und die C-terminale, amphipathische, helikale Region.
4 zeigt die Nucleotidsequenz und die kodierte Aminosäuresequenz des Kernproteins eines endothelialen Liganden für L-Selectin. Die hellen Kästchen zeigen eine Kozak-Translationsinitiationsstelle, die das erste Methionin-Codon umgibt. Die unterbrochen unterstrichene Aminosäuresequenz, die am Rest 20 beginnt, entspricht der Aminosäuresequenz, die durch N-terminale Sequenzierung des gereinigten L-Selectin-Liganden bestimmt wurde (3B), mit Ausnahme eines THR in Position 34 (ein MET in der N-terminalen Sequenz). Die Serin- und Threoninreste in der vorhergesagten Aminosäuresequenz sind in dunklen Kästchen dargestellt.
5A und 5B zeigen die Immunopräzipitation des gereinigten ~50 kD-L-Selectin-Liganden durch Peptid-Antikörper. Die Abkürzungen in der Legende der 5A und 5B haben folgende Bedeutungen:
P1 = Präimmun-CAM01 – Kügelchen
P_S1 = Präimmun-CAM01 – nach der Immunopräzipitation verbleibender Überstand
I1 = Immun-CAM01 – Kügelchen
I_S1 = Immun-CAM01 – nach der Immunopräzipitation verbleibender Überstand
P_S2 = Präimmun-CAM02 – nach der Immunopräzipitation , verbleibender Überstand
I_S2 = Immun-CAM02 – nach der Immunopräzipitation verbleibender Überstand
I2 = Immun-CAM02 – Kügelchen
PEP = freies Peptid
6 zeigt die Northern-Blot-Analyse der Expression der mRNA, die für den ~50 kD-L-Selectin-Liganden kodiert. A: Gesamte (a) oder Poly-A + (b, c) RNA wurde aus normalen (a, b) oder entzündeten (c) peripheren Lymphknoten isoliert, auf Formaldehydgelen laufen gelassen und durch Northern-Blot-Analyse mit der in 4 dargestellten cDNA analysiert. B: Poly-A + RNA wurde aus a) brachialen, b) axillaren, c) zervikalen, d) poplitealen und e) gesamten peripheren Lymphknoten isoliert und an Northern-Blots mit der in A, C und D beschriebenen Liganden-cDNA hybridisiert. Poly-A + RNA wurde aus a) peripheren Lymphknoten, b) Leber, c) Peyer-Plaques, d) Thymus, e) Skelettmuskel, f) mesenterischen Lymphknoten, g) Testes, h) Lunge, i) Herz, j) Milz, k) Hirn und I) Niere isoliert und an Northern-Blots mit C. der cDNA, die dem L-Selectin-Liganden entspricht, oder mit D. einer Hühner-beta-Actin-cDNA hybridisiert.
7 zeigt die in situ-Hybridisierungsanalyse der Expression der mRNA, die für den ~50 kD-L-Selectin-Liganden kodiert. Schnitte von peripheren Lymphknoten wurden entweder mit einer antisense-Hybridisierungssonde (A) oder einer sense-Hybridisierungssonde (B), die der L-Selectin-Liganden-cDNA entsprechen, hybridisiert, gewaschen, 6 Wochen einer Emulsion ausgesetzt und entwickelt. Die Morphologie der HEV ist mit einer punktierten Linie, die die Venole umgibt, dargestellt.
8 zeigt ein Modell der Struktur des ~50 kD-Selectin-Liganden. Es ist ein mögliches Modell für die Struktur des ~50 kD-L-Selectin-Liganden an der luminalen Oberfläche der peripheren Lymphknoten-HEV dargestellt. Die bürstenartigen Erweiterungsbereiche entsprechen O-verknüpften Regionen I und II in einem hochgradig O-glycosylierten Zustand. Die weniger ausgedehnten Regionen entsprechen den N-terminalen und zentralen, an Serin/Threonin armen Domänen. In diesem Modell wird die Haftung an der Membran durch Oligomerisierung der C-terminalen, amphipathischen, helikalen Regionen und durch Insertion dieser Regionen in die Membranen erreicht, so dass die polaren Regionen miteinander unter Bildung eines Oligomeren in Wechselwirkung treten und die apolaren Flächen der Helices mit der Lipid-Doppelschicht in Wechselwirkung treten. Wie im Text beschrieben, ist eine Anzahl von anderen Modellen ebenfalls gleichermaßen wahrscheinlich.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Der Ausdruck "Selectin-Ligand" und seine grammatikalischen Varianten werden zur Bezeichnung eines Polypeptids verwendet, das mit einem natürlich vorkommenden Liganden eines Selectin-Moleküls eine qualitative biologische Eigenschaft gemeinsam hat.
Unter "biologischer Eigenschaft" ist in diesem Zusammenhang eine in vivo-Effektor- oder antigene Funktion oder Aktivität zu verstehen, die direkt oder indirekt durch einen natürlich vorkommenden Liganden eines Selectin-Moleküls oder durch ein beliebiges Nachfolgeprodukt davon ausgeübt wird. Zu Effektorfunktionen gehören die Rezeptorbindung, beliebige enzymatische Aktivitäten oder enzymmodulatorische Aktivitäten, beliebige Trägerbindungsaktivitäten, beliebige hormonelle Aktivitäten, beliebige Aktivitäten in Bezug auf eine Förderung oder Hemmung der Haftung von Zellen an einer extrazellulären Matrix oder an Zelloberflächenmolekülen oder beliebige strukturelle Rollen. Die antigenen Funktionen bedeuten im wesentlichen das Vorliegen eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die zur Vernetzung mit Antikörpern gegen einen natürlich vorkommenden Liganden eines Selectin-Moleküls befähigt sind.
"Biologisch aktive" Selectin-Liganden haben eine Effektorfunktion eines natürlich vorkommenden Liganden eines Selectin-Moleküls gemeinsam, der (nicht notwendigerweise) ferner eine antigene Funktion besitzen kann.
Der Selectin-Ligand gemäß der Definition für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise eine Sequenz, die die qualitative Fähigkeit zur Bindung an ein Selectin aufweist und eine hochgradig O-verknüpfte, stabartige Struktur vom Mucin-Typ besitzt, die es ermöglicht, die Kohlenhydrate der Lectin-Domäne eines Selectins zu präsentieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Selectin-Ligand eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, die zur Hybridisierung (unter wenig stringenten Bedingungen) mit dem Komplement einer Nucleotidsequenz, die für das Protein mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, befähigt ist.
Die Aminosäuresequenz des Proteinkerns des Selectin-Liganden weist vorzugsweise eine Homologie von mehr als etwa 40%, insbesondere von mehr als etwa 60%, ganz besonders von mehr als etwa 70%, noch mehr bevorzugt von mehr als etwa 80% und ganz besonders bevorzugt von mindestens etwa 90% mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz auf.
Als "homolog" ist der prozentuale Anteil von Resten der als Kandidat in Frage kommenden Aminosäuresequenz zu verstehen, die identisch mit den Resten der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz sind, und zwar gegebenenfalls nach Ausrichtung der Sequenzen und Einführung von Lücken, um eine maximale prozentuale Homologie zu erreichen.
Der Ausdruck "Selectin-Ligand" umfasst speziell Aminosäure- und Glycosylierungsvarianten von nativen Selectin-Liganden sowie deren Derivate, wie sie beispielsweise durch kovalente Modifikationen erhalten worden sind, vorausgesetzt, dass sie qualitativ eine biologische Eigenschaft, die ein natürlich vorkommender Ligand eines Selectin-Moleküls besitzt, und vorzugsweise die qualitative Fähigkeit zur Bindung an deren Rezeptoren behalten.
Der Ausdruck umfasst speziell Glycoproteine mit einer Aminosäuresequenz, die mit einem natürlich vorkommenden Liganden eines Selectins, das mit einem stabilen Plasmaprotein fusioniert ist, eine biologische Eigenschaft gemeinsam haben.
"Stabile Plasmaproteine" sind Proteine mit typischerweise etwa 30 bis etwa 2 000 Resten, die in ihrer nativen Umgebung eine verlängerte Halbwertszeit im Kreislauf aufweisen, d. h. eine Halbwertszeit von mehr als etwa 20 Stunden. Zu Beispielen für geeignete stabile Plasmaproteine gehören Immunoglobuline, Albumin, Lipoproteine, Apolipoproteine und Transferrin. Die Aminosäuresequenz, die mit einem natürlich vorkommenden Selectin-Liganden eine qualitative biologische Eigenschaft gemeinsam hat, wird im allgemeinen C-terminal in einer stabilen Plasmaproteinsequenz fusioniert, z. B. mit einer Sequenz der konstanten Domäne eines Immunoglobulins.
Der Ausdruck "Immunoglobulin" bezeichnet allgemein Polypeptide, die eine leichte oder schwere Kette umfassen, die üblicherweise in der nativen "Y"-Konfiguration beide durch Disulfidbindungen gebunden sind, obgleich auch andere Verknüpfungen umfasst werden, wie Tetramere oder Aggregate davon.
Immunoglobuline (Ig) und bestimmte Varianten davon sind bekannt und wurden zahlreich in rekombinanter Zellkultur hergestellt; vergl. beispielsweise US-4 745 055; EP-256 654; Faulkner et al., Nature, Bd. 298 (1982), S. 286; EP-120 694; EP-125 023; Morrison, J. Immun., Bd. 123 (1979), S. 793; Köhler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 2197; Raso et al., Cancer Res., Bd. 41 (1981), S. 2073; Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 2 (1984), S. 239; Morrison, Science, Bd. 229 (1985), S. 1202; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 6851; EP-255 694; EP-266 663; und WO-88/03559. Es sind auch reassortierte Immunoglobulinketten bekannt; vergl. beispielsweise US-4 444 878; WO-88/03565; und EP-68 763 sowie die darin genannten Literaturstellen. Stabile Chimäre aus Ligandenbindungsproteinen und Plasmaproteinen und insbesondere L-Selectin-Immunoglobulin-Chimäre sind beispielsweise in WO-91/08298 (veröffentlicht am 13. Juni 1991) beschrieben. Der Immunoglobulinrest in der erfindungsgemäßen Chimäre kann aus LgG1-, IgG2-,. IgG3- oder IgG4-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM und vorzugsweise aus IgG1 oder IgG3 erhalten werden.
Eine Selectin-Bindung, z. B. eine L-Selectin-Bindung, kann beispielsweise getestet werden, indem man die Bindung von radioaktiv markierten (z. B. ³⁵S-markierten) Liganden an eine immobilisierte Rezeptor-Immunoglobulin-Chimäre in Gegenwart oder Abwesenheit von löslichen Inhibitoren im wesentlichen gemäß den Angaben von Imai et al., J. Cell Biol., Bd. 113 (1991), S. 1213, bestimmt. Alternativ oder zusätzlich kann die Haftung an Zellen, die den entsprechenden Rezeptor exprimieren, zum Test der Ligandenbindung herangezogen werden. Beispielsweise ist von EL-4-Zellen (ATCC TIB39) bekannt, dass sie an ihren Oberflächen hohe Konzentrationen an L-Selectin exprimieren und daher bei Zellhaftungstests auf L-Selectin-Liganden verwendet werden können. Haftende Zellen können quantitativ durch ihre Lactat-dehydrogenase-Aktivität bestimmt werden (Bradley et al., J. Cell Biol., Bd. 105 (1987), S. 991).
Die Ausdrücke "Nucleinsäuremolekül, kodierend für", "DNA-Sequenz, kodierend für" und "DNA, kodierend für" beziehen sich auf die Reihenfolge oder Sequenz von Desoxyribonucleotiden entlang eines Stranges einer Desoxyribonucleinsäure. Die Reihenfolge dieser Desoxyribonucleotide legt die Reihenfolge der Aminosäuren entlang der Polypeptidkette fest. Die DNA-Sequenz kodiert somit für die Aminosäuresequenz.
Der Ausdruck "isoliert" bezieht sich bei Verwendung im Zusammenhang mit einer Nucleinsäure oder einem Protein auf eine Nucleinsäure oder ein Protein, die aus einer Ansammlung von Nucleinsäuren oder Proteinen, die üblicherweise in der natürlichen Umgebung damit assoziiert sind, identifiziert und abgetrennt worden sind. Isolierte Nucleinsäuren oder Proteine sind somit in einer Form oder einem Zustand vorhanden, der sich von der in der Natur auftretenden Situation unterscheidet. Jedoch umfasst eine isolierte Nucleinsäure, die für einen Selectin-Liganden kodiert, eine derartige Nucleinsäure in Zellen, die üblicherweise Selectin-Liganden exprimieren, wobei sich die Nucleinsäure in einer chromosomalen Position, die sich von der von natürlichen Zellen unterscheidet, befindet oder anderweitig durch eine andere DNA-Sequenz, als sie in der Natur gefunden wird, flankiert ist.
"Wenig stringente Bedingungen" bedeuten eine Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung mit folgenden Bestandteilen: 20% Formamid, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,6, 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, einer Scherbehandlung unterzogene Lachssperma-DNA; und anschließendes Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 50°C.
Eine Nucleinsäure ist "funktionell verknüpft", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht worden ist. Beispielsweise ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader funktionell mit einer DNA, die für ein Polypeptid kodiert, verknüpft, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt. Ein Promotor oder Verstärker ist funktionell mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist funktionell mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im allgemeinen bedeutet der Ausdruck "funktionell verknüpft", dass die zu verknüpfenden DNA-Sequenzen benachbart sind und im Fall eines sekretorischen Leaders sich in Nachbarstellung und in der Lesephase befinden. Jedoch müssen Verstärker nicht benachbart sein. Eine Verknüpfung wird durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen erreicht.
Wenn derartige Stellen nicht existieren, so werden synthetische Oligonucleotid-Adaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Die Ausdrücke "replizierbares Expressionsvehikel" und "Expressionsvehikel" beziehen sich auf ein Stück einer DNA (üblicherweise doppelsträngig), die möglicherweise in ein Stück einer fremden DNA inseriert worden ist. Fremde DNA ist als heterologe DNA definiert, d. h. DNA, die in der Wirtszelle natürlicherweise nicht gefunden wird. Das Vehikel wird zum Transport der fremden oder heterologen DNA in eine geeignete Wirtszelle verwendet. Nachdem sich das Vehikel in der Wirtszelle befindet, kann es unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA replizieren und es können mehrere Kopien des Vehikels und seiner inserierten (fremden) DNA erzeugt werden. Außerdem enthält das Vehikel die erforderlichen Elemente, die eine Translation der fremden DNA in ein Polypeptid ermöglichen. Zahlreiche Moleküle des Polypeptids, die durch die fremde DNA kodiert werden, können auf diese Weise rasch synthetisiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" in austauschbarer Weise verwendet. Alle diese Ausdrücke umfassen auch die Nachkommenschaft. Ferner ist darauf hinzuweisen, dass jegliche Nachkommen möglicherweise nicht genau den identischen DNA-Gehalt aufweisen, was auf beabsichtigte oder unbeabsichtigte Mutationen zurückzuführen ist. Mutante Nachkommen, die die gleichen Funktionen oder biologischen Eigenschaften, wie sie bei der ursprünglich transformierten Zelle ermittelt worden sind, aufweisen, fallen ebenfalls unter diese Ausdrücke.
Die Ausdrücke "transformierte Wirtszelle" und "transformiert" beziehen sich auf die Einführung von DNA in eine Zelle. Die Zelle wird als "Wirtszelle" bezeichnet. Es kann sich um eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle handeln. Zu typischen prokaryontischen Wirtszellen gehören verschiedene Stämme von E. coli. Typische eukaryontische Wirtszellen sind Säugetierzellen, wie Ovarialzellen des chinesischen Hamsters oder humane, embryonale Nieren-293-Zellen. Die eingeführte DNA liegt üblicherweise in Form eines Vektors vor, der ein inseriertes DNA-Stück enthält. Die eingeführte DNA-Sequenz kann aus der gleichen Spezies wie die Wirtszelle oder aus einer von der Wirtszelle unterschiedlichen Spezies stammen oder es kann sich um eine hybride DNA-Sequenz handeln, die einen gewissen Anteil an fremder und einen gewissen Anteil an homologer DNA enthält.
"Ligation" bezieht sich auf ein Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nucleinsäurefragmenten. Zur gegenseitigen Verknüpfung von zwei DNA-Fragmenten müssen ihre Enden kompatibel sein. In den meisten Fällen sind die Enden nach dem Endonuclease-Verdau direkt kompatibel. Es kann jedoch erforderlich sein, zunächst die versetzt angeordneten Enden, die üblicherweise nach dem Endonuclease-Verdau gebildet werden, in stumpfe Enden umzuwandeln, um sie für die Ligation kompatibel zu machen. Um die Enden abzustumpfen, wird die DNA in einem geeigneten Puffer mindestens 15 Minuten bei 15°C mit etwa 10 Einheiten Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxyribonucleotidtriphosphate behandelt. Anschließend wird die DNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die DNA-Fragmente, die miteinander zu verknüpfen sind, werden in etwa äquimolaren Mengen in Lösung gebracht. Die Lösung enthält ferner ATP, Ligase-Puffer und eine Ligase, wie T4-DNA-Ligase in einer Menge von etwa 10 Einheiten pro 0,5 μg DNA. Wenn die DNA in einen Vektor einzubinden ist, wird der Vektor zunächst durch Verdau mit einer oder mehreren geeigneten Restriktionsendonucleasen linearisiert. Das linearisierte Fragment wird sodann mit bakterieller alkalischer Phosphatase oder Kalbsdarm-Phosphatase behandelt, um während der Ligationsstufe eine Selbstligation zu verhindern.
Die Ausdrücke "Aminosäure" und "Aminosäuren" beziehen sich auf sämtliche natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. Diese Definition soll Norleucin, Ornithin und Homocystein umfassen. Die Aminosäuren werden mit dem Einbuchstabencode oder Dreibuchstabencode bezeichnet:
Diese Aminosäuren lassen sich je nach der chemischen Zusammensetzung und den Eigenschaften ihrer Seitenkette einteilen. Sie werden breit in zwei Gruppen eingeteilt, nämlich geladene und ungeladene Aminosäuren. Jede dieser Gruppen wird in Untergruppen eingeteilt, um die Aminosäuren noch genauer zu klassifizieren.

I. Geladene Aminosäuren Saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure Basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin
II. Ungeladene Aminosäuren Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin Unpolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

Die Ausdrücke "Abänderung", "Aminosäuresequenz-Abänderung", "Variante" und "Aminosäuresequenz-Variante" beziehen sich auf Moleküle mit einigen Unterschieden in ihren Aminosäuresequenzen, verglichen mit der nativen Sequenz eines Selectin-Liganden, z. B. eines L-Selectin-Liganden. Üblicherweise besitzen die Varianten eine Homologie von mindestens 70% mit einem nativen Selectin-Liganden und vorzugsweise von mindestens etwa 80% und insbesondere von mindestens etwa 90% mit einem nativen Selectin-Liganden. Die unter die Erfindung fallenden Aminosäuresequenz-Varianten besitzen Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen an bestimmten Stellen innerhalb der Aminosäuresequenz eines nativen Selectin-Liganden. Bei Substitutionsvarianten handelt es sich um Produkte, bei denen mindestens ein Aminosäurerest in einer nativen Sequenz entfernt und eine andere Aminosäure an der gleichen Position an deren Stelle inseriert worden ist. Es kann sich um eine einfache Substitution handeln, bei der nur eine einzige Aminosäure im Molekül substituiert worden ist, oder es kann sich um Mehrfachsubstitutionen handeln, bei denen zwei oder mehr Aminosäuren im gleichen Molekül substituiert worden sind.
Substanzielle Veränderungen der Eigenschaften des Liganden lassen sich erreichen, indem man eine Substitution mit einer Aminosäure mit einer Seitenkette vornimmt, deren Ladung und/oder Struktur sich erheblich von der Beschaffenheit der nativen Aminosäure unterscheidet. Es ist zu erwarten, dass diese Art von Substitution die Struktur des Polypeptidgerüstes und/oder die Ladung oder Hydrophibizität des Moleküls im Substitutionsbereich beeinflusst.
Mäßige Veränderungen in den Ligandeneigenschaften lassen sich erwarten, wenn man eine Substitution mit einer Aminosäure mit einer Seitenkette vornimmt, die in Bezug auf Ladung und/oder Struktur ähnlich wie im nativen Molekül ist. Dieser Substitutionstyp, der als konservative Substitution bezeichnet wird, lässt keine wesentlichen Veränderungen der Struktur des Polypeptidgerüstes oder der Ladung oder der Hydrophobizität des Moleküls im Substitutionsbereich erwarten.
Bei Insertionsvarianten handelt es sich um Varianten, bei der eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar neben einer Aminosäure in einer bestimmten Position in einer nativen Selectin-Liganden-Sequenz inseriert sind. Unter dem Ausdruck "unmittelbar neben einer Aminosäure" ist zu verstehen, dass eine Verbindung entweder mit der funktionellen α-Carboxygruppe oder der funktionellen α-Aminogruppe der Aminosäure vorliegt. Die Insertion kann aus einer oder mehreren Aminosäuren bestehen. Üblicherweise besteht die Insertion aus einer oder zwei konservativen Aminosäuren. Aminosäuren mit ähnlicher Ladung und/oder Struktur wie die Aminosäuren neben der Insertionsstelle werden als konservativ definiert. Alternativ umfasst die Erfindung die Insertion einer Aminosäure mit einer Ladung und/oder Struktur, die sich von der Beschaffenheit der Aminosäuren neben der Insertionsstelle erheblich unterscheiden.
Bei Deletionsvarianten handelt es sich um Varianten, bei der eine oder mehrere Aminosäuren in der nativen Selectin-Liganden-Aminosäuresequenz entfernt worden sind. Üblicherweise sind bei Deletionsvarianten eine oder zwei Aminosäuren in einer bestimmten Region des Moleküls deletiert.
Eine wesentliche Rolle des Proteinkerns der vorliegenden Selectin-Liganden, besteht darin, dass sie die spezielle Kohlenhydratstruktur, die von einem Selectin-Rezeptor erkannt wird, dem entsprechenden Rezeptor präsentieren.
Demzufolge ist von beliebigen Abänderungen innerhalb der beiden, in starkem Umfang O-glycosylierten, an Serin und Threonin reichen Regionen (Aminosäuren 42-63 und Aminosäuren 93–122 in 4) der L-Selectin-Liganden-Aminosäuresequenz zu erwarten, dass sie einen stärkeren Einfluss auf die Lymphozyten-HEV-Wechselwirkungen als Veränderungen in anderen Regionen des Proteins ausübt. Wie. nachstehend dargelegt, sind die hochgradig O-glycosylierten Regionen wesentlich, um eine starre, inflexible "Flaschenbürsten"-Struktur bereitzustellen, die es erlaubt, dass eine große Anzahl von O-verknüpften Kohlenhydratliganden an die Serin- und Threoninreste gebunden wird, um sie in geeigneter Weise den an der Leukozytenoberfläche lokalisierten L-Selectin-Lectin-Domänen zu präsentieren, um dadurch die kohlenhydratabhängige Haftwechselwirkung zu vermitteln. Von Abänderungen innerhalb dieser Regionen ist zu erwarten, dass sie zu Molekülen führen, deren Rezeptorbindungsaktivitäten sich deutlich von denen des entsprechenden nativen Liganden unterscheiden.
Die erfindungsgemäßen Glycoprotein-Liganden umfassen Fucose, Sialinsäure und eine anionische Komponente, vorzugsweise Sulfatester von O-verknüpften Kohlenhydratkomponenten. Es wird angenommen, dass Fucose gleichermaßen wie Sialinsäure und Sulfat für die volle Ligandenaktivität erforderlich sind.
Beispiele für spezielle Kohlenhydratkomponenten der erfindungsgemäßen Glycoprotein-Liganden lassen sich folgendermaßen wiedergeben:
NeuNAca2-3Galβ1-4(Fuca1-3)GlcNAc
NeuNAcA2-3Galβ1-4GlcNAcB1-3GalB1-4(FucA1-4)(FucA1-3)GlcNAc.
Die "Northern-Blot-Analyse" stellt ein Verfahren zur Identifizierung von RNA-Sequenzen dar, die mit einer bekannten Sonde, wie Oligonucleotiden, DNA-Fragmenten, cDNA oder Fragmenten davon oder RNA-Fragmenten, hybridisieren. Die Sonde wird mit einem Radioisotop, wie ³²P, oder durch Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise elektrophoretisch an einem Agarose- oder Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine Nitrocellulose-, Nylon- oder eine andere geeignete Membran übertragen und mit der Sonde hybridisiert, wobei man sich üblicher Techniken bedient, die aus dem Stand der Technik bekannt sind; vergl. beispielsweise die Abschnitte 7.39–7.52 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
"Oligonucleotide" sind kurze, einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die chemisch durch bekannte Verfahren synthetisiert werden (z. B. durch das Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Verfahren, unter Anwendung von Festphasentechniken, z. B. gemäß EP-266 032 (veröffentlicht am 4. Mai 1988), oder über Desoxynucleosid-H-phosphanat-Zwischenprodukte (vergl. beispielsweise Froehler et al., Nucl. Acids Res., Bd. 14 (1986), S. 5399). Anschließend werden sie an Polyacrylamidgelen gereinigt.
Die hier angewandte Technik der "Polymerase-Kettenreaktion" oder "PCR" bezieht sich allgemein auf ein Verfahren, bei dem winzige Mengen eines bestimmten Stückes von Nucleinsäuren, RNA und/oder DNA amplifiziert werden; vergl. US-4 683 195 (Ausgabetag 28. Juli 1987) und Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Bd. 2 (1991), Kapitel 15.
Der Ausdruck "Transformation" bedeutet die Einführung von DNA in einen Organismus, so dass die DNA replizierbar ist, und zwar als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration.
Der Ausdruck "Transfektion" bedeutet die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob Kodierungssequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht.
Die Ausdrücke "Behandlung", "Behandeln" und grammatikalische Varianten davon bedeuten und umfassen im breitesten Sinn die Verhinderung und Besserung bestimmter unerwünschter Symptome oder Zustände.
Eine "Gasphasen-Mikrosequenzierung" wurde auf der Grundlage folgender Verfahren erreicht. Das gereinigte Protein wurde entweder direkt durch automatisierten Edman-Abbau mit dem Gasphasen-Sequenziergerät Modell 470A (Applied Biosystems), der mit einem 120A PTH-Aminosäure-Analysiergerät ausgerüstet war, sequenziert oder erst nach Abbau mit verschiedenen Chemikalien oder Enzymen sequenziert. PTH-Aminosäuren wurden unter Einsatz eines ChromPerfect-Datensystems (Justice Innovations, Palo Alto, CA) integriert. Die Sequenzinterpretation wurde mit einem VAX 11/785 Digital Equipment Corporation-Rechner gemäß den Angaben von Henzel et al., J. Chromatography, Bd. 404 (1987), S. 41, durchgeführt. In einigen Fällen wurden Aliquotanteile der HPLC-Fraktionen an 5–20%-SDS-Polyacnlamidgelen der Elektrophorese unterzogen, auf elektrischem Wege auf eine PVDF-Membran (ProBlott, ABI, Foster City, CA) übertragen und mit Coomassie-Brillantblau gefärbt (P. Matsudaira, J. Biol. Chem., Bd. 262 (1987), S. 10035). Das spezielle Protein wurde aus dem Blot für die N-terminale Sequenzierung ausgeschnitten. Zur Bestimmung interner Proteinsequenzen wurden HPLC-Fraktionen unter Vakuum (SpeedVac) getrocknet, in geeigneten Puffern resuspendiert und mit Bromcyan, dem lysinspezifischen Enzym Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) oder Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) verdaut. Nach dem Verdau wurden die erhaltenen Peptide in Form eines Gemisches auf die vorstehend angegebene Weise sequenziert oder vor der Sequenzierung durch HPLC an einer C4-Säule unter Verwendung eines Propanolgradienten in 0,1% TFA als Laufmittel aufgetrennt.
Der hier verwendete Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten worden ist, d. h. die individuellen Antikörper, die die Population ausmachen, sind identisch, ausgenommen natürlich auftretende Mutationen, die in untergeordneten Anteilen vorliegen können. Somit bedeutet das Attribut "monoklonal" den Charakter des Antikörpers, d. h. dass es sich nicht um ein Gemisch von diskreten Antikörpern handelt.
Die unter den Umfang der Erfindung fallenden monoklonalen Antikörper umfassen hybride und rekombinante Antikörper, die hergestellt worden sind durch Spleißen einer variablen (einschließlich hypervariablen) Domäne eines anti-Selectin-Liganden-Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z. B. "humanisierte" Antikörper), wovon nur einer gegen einen Selectin-Liganden gerichtet ist, oder einer leichten Kette mit einer schweren Kette oder einer Kette aus einer Spezies mit einer Kette einer anderen Spezies oder Fusionen mit heterologen Proteinen, unabhängig von der Herkunftsspezies oder der Immunoglobulin-Klassen- oder Unterklassenbezeichnung, sowie Antikörper-Fragmente (z. B. Fab, F(ab')₂ und Fv); Cabilly et al., US-Patent 4 816 567; Mage & Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, S. 79–97.
Somit bedeutet das Attribut "monoklonal" den Charakter des Antikörpers, wie er aus einer derartigen, im wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten worden ist. Der Ausdruck ist nicht so auszulegen, dass die Herstellung des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren notwendig ist.
II. Allgemeine Verfahren
A. Herstellen einer für einen Selectin-Liganden kodierenden DNA
Die für einen Selectin-Liganden kodierende DNA lässt sich aus einer beliebigen cDNA-Bank erhalten, die aus Gewebe hergestellt worden ist, von dem man annimmt, dass es eine mRNA für den Selectin-Liganden aufweist und diesen in einer nachweisbaren Konzentration exprimiert. Ein L-Selectin-Liganden-Gen lässt sich somit aus einer cDNA-Bank, die aus (mesenterischen oder peripheren) Lymphknoten hergestellt worden ist, erhalten. Gene die für die anderen Selectin-Liganden kodieren, lassen sich auf analoge Weise aus anderen cDNA-Banken herstellen.
Die Banken werden mit Sonden abgesucht, die zur Identifizierung des infrage stehenden Gens oder des durch dieses Gen kodierten Proteins konstruiert sind. Für cDNA-Expressionsbanken umfassen geeignete Sonden üblicherweise mono- und polyklonale Antikörper, die das gewünschte Protein erkennen und spezifisch daran binden; Oligonucleotide mit einer Länge von etwa 20 bis 80 Basen, die für bekannte oder vermutete Bereiche der Selectin-Liganden-cDNA aus der gleichen oder aus unterschiedlichen Spezies kodieren; und/oder komplementäre oder homologe cDNAs oder deren Fragmente, die für das gleiche oder ein ähnliches Gen kodieren.
Eine alternative Maßnahme zur Isolierung des für einen Selectin-Liganden, z. B. einen L-Selectin-Liganden, kodierenden Gens besteht in der Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gemäß Abschnitt 14 von Sambrook et al. (a.a.O.) oder in Kapitel 15 von "Current Protocols in Molecular Biology (a.a.O.).
Eine weitere Alternative besteht in einer chemischen Synthese des für den gewünschten Selectin-Liganden kodierenden Gens unter Anwendung eines der von Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Bd. 28 (1989), S. 716, beschriebenen Verfahren. Diese Verfahren umfassen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren, PCR und andere Autoprimer-Verfahren und Oligonucleotid-Synthesen an festen Trägern. Diese Verfahren können herangezogen werden, wenn die gesamte Nucleinsäuresequenz des Gens bekannt ist oder die Sequenz der Nucleinsäure, die zum Kodieren als Strang komplementär ist, verfügbar ist, oder alternativ, wenn die Ziel-Aminosäuresequenz bekannt ist, kann man potenzielle Nucleinsäuresequenzen ableiten, wobei man bekannte und bevorzugte Kodierungsreste für jeden einzelnen Aminosäurerest verwendet.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Ausführung der Erfindung besteht in der Verwendung von sorgfältig ausgewählten Oligonucleotidsequenzen zum Absuchen von cDNA-Banken aus verschiedenen Geweben, vorzugsweise Säugetier-Lymphknoten mit hohen endothelialen Venolen (L-Selectin-Ligand) oder Myeloidzellen (E-Selectin- und P-Selectin-Liganden). Zu den bevorzugten Säugetieren gehören Menschen und jeder der folgenden Ordnungen: Rinder, Schafe, Pferde, Mäuse und Nagetiere.
Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollen ausreichend lang und ausreichend eindeutig sein, so dass falsche positive Ergebnisse auf ein Minimum begrenzt werden. Die aktuelle(n) Nucleotidsequenz(en) basieren auf konservierten oder hochgradig homologen Nucleotidsequenzen oder Regionen eines Selectin-Liganden, z. B. dessen L-Selectin-Liganden.
Die in 4 dargestellte DNA kann zur Isolierung von DNA, die für andere Selectin-Liganden kodiert, oder zur Isolierung von DNA, die für einen L-Selectin- Liganden einer anderen Tierspezies kodiert, durch Hybridisierung unter Anwendung der vorstehend erörterten Verfahren herangezogen werden. Bei den bevorzugten Tieren handelt es sich um Säugetiere, insbesondere Menschen, Rinder, Schafe, Pferde, Katzen, Kaninchen und Nagetiere und insbesondere um Menschen, Rinder, Ratten und Kaninchen.
B. Konstruktion von Aminosäure-Sequenzvarianten
Die Aminosäure-Sequenzvarianten der erfindungsgemäßen Selectin-Liganden werden vorzugsweise konstruiert, indem man die DNA-Sequenz, die für den Proteinkern eines Wildtyp-Selectins, z. B. für den L-Selectin-Liganden, kodiert, mutiert. Im allgemeinen werden spezielle Regionen oder Stellen der DNA einer zielgerichteten Mutagenese unterzogen. Die allgemeine Methodik, die zur Erreichung dieses Ziels verwendet wird, wird als ortsgerichtete Mutagenese bezeichnet. Die Mutationen werden unter Verwendung von DNA-modifizierenden Enzymen, wie Restriktionsendonucleasen (die DNA an bestimmten Stellen spalten), Nucleasen (die DNA abbauen) und/oder Polymerasen (die DNA synthetisieren) vorgenommen.
1. Einfache Deletionen und Insertionen
Ein Restriktionsendonuclease-Verdau von DNA unter anschließender Ligation kann zur Erzeugung von Deletionen gemäß dem Abschnitt 15.3 von Sambrook et al., a.a.O., herangezogen werden. Zur Durchführung dieses Verfahrens ist es bevorzugt, dass die fremde DNA in einen Plasmidvektor inseriert ist. Eine Restriktionskarte sowohl der fremden (inserierten) DNA als auch der Vektor-DNA muss verfügbar sein oder die Sequenz der fremden DNA und der Vektor-DNA muss bekannt sein. Die fremde DNA muss besondere Restriktionsstellen aufweisen, die im Vektor nicht vorhanden sind. Sodann werden Deletionen in der fremden DNA durchgeführt, indem man sie zwischen diesen besonderen Restriktionsstellen verdaut, wobei man sich entsprechender Restriktionsendonucleasen unter den vom Hersteller der Enzyme empfohlenen Bedingungen bedient. Wenn die verwendeten Restriktionsenzyme stumpfe Enden oder kompatible Enden erzeugen, können die Enden direkt miteinander unter Verwendung einer Ligase, wie Bakteriophagen-T4-DNA-Ligase, und durch 1- bis 4-stündige Inkubation des Gemisches bei 16°C in Gegenwart von ATP und Ligase-Puffer gemäß dem Abschnitt 1.68 von Sambrook et al., a.a.O. verknüpft werden. Wenn die Enden nicht kompatibel sind, müssen sie zunächst unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I oder Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht werden, wobei in beiden Fällen die vier Desoxyribonucleotidtriphosphate zum Auffüllen der überhängenden, einzelsträngigen Enden der verdauten DNA erforderlich sind. Alternativ können die Enden unter Verwendung einer Nuclease, wie Nuclease S1 oder Mungobohnen-Nuclease, die beide ein Zurückschneiden der überhängenden, einzelsträngigen DNA bewirken, stumpfendig gemacht werden. Die DNA wird sodann unter Verwendung einer Ligase religiert. Beim erhaltenen Molekül handelt es sich um eine Deletionsvariante.
Eine ähnliche Strategie kann zur Konstruktion von Insertionsvarianten gemäß den Angaben im Abschnitt 15.3 von Sambrook et al., a.a.O., herangezogen werden. Nach Verdau der fremden DNA an der oder den besonderen Restriktionsstellen wird ein Oligonucleotid in die Stelle, wo die fremde DNA ausgeschnitten worden ist, ligiert. Das Oligonucleotid ist so konstruiert, dass es für die erwünschten Aminosäuren, die zu inserieren sind, kodiert und zusätzlich 5'- und 3'-Enden aufweist, die mit den Enden der fremden DNA, die verdaut worden ist, kompatibel sind, so dass eine direkte Ligation möglich ist.
2. Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese
Eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese stellt das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Substitutionsvarianten dar. Es kann auch dazu verwendet werden, in zweckmäßiger Weise die erfindungsgemäßen Deletions- und Insertionsvarianten herzustellen. Diese Technik wird in der Literatur von Adelman et al. beschrieben (DNA, Bd. 2 (1983), S. 183).
Im allgemeinen werden Oligonucleotide mit einer Länge von mindestens 25 Nucleotiden zur Insertion, Deletion oder Substitution von zwei oder mehr Nucleotiden im t-PA-Molekül verwendet. Ein optimales Oligonucleotid weist 12 bis 15 perfekt passende Nucleotide an beiden Seiten der Nucleotide, die für die Mutation kodieren, auf. Dies gewährleistet, dass das Oligonucleotid einwandfrei mit dem einzelsträngigen DNA-Matrizenmolekül hybridisiert. Die Oligonucleotide lassen sich leicht unter Anwendung bekannter Techniken herstellen; vergl. beispielsweise Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 5765).
Beim DNA-Matrizenmolekül handelt es sich um die einzelsträngige Form des Vektors mit seinem Wildtyp cDNA-t-PA-Insert. Die einzelsträngige Matrize kann nur von solchen Vektoren erzeugt werden, die entweder von Bakteriophagen-M13-Vektoren (die handelsüblichen M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind geeignet) oder von Vektoren, die eine einzelsträngige Phagen-Replikationsursprungsstelle (gemäß Veira et al., Meth. Enzymol., Bd. 153 (1987), S. 3) enthalten, abgeleitet sind. Somit muss die t-PA-cDNA, die zu mutieren ist, in eine dieser Vektoren eingeführt werden, um eine einzelsträngige Matrize zu erzeugen. Die Herstellung der einzelsträngigen Matrize wird in den Abschnitten 4.21 bis 4.41 von Sambrook et al., a.a.O., beschrieben.
Zur Mutagenisierung der nativen Selectin-Liganden-Sequenz wird das Oligonucleotid einem Annealing mit dem einzelsträngigen DNA-Matrizenmolekül unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen unterworfen. Ein DNA-Polymerisationsenzym, üblicherweise das Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, wird sodann zugesetzt. Dieses Enzym bedient sich des Oligonucleotids als Primer, um die Synthese des die Mutation tragenden DNA-Stranges zu beenden. Somit wird ein Heteroduplex-Molekül in der Weise gebildet, dass ein DNA-Strang für den in den Vektor inserierten nativen Selectin-Liganden kodiert und der zweite DNA-Strang für die mutierte Form des in den gleichen Vektor inserierten Selectin-Liganden kodiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird sodann in eine geeignete Wirtszelle transformiert, üblicherweise einen Prokaryonten, wie E. coli JM101. Nach Züchtung der Zellen werden sie auf Agaroseplatten ausgestrichen und unter Verwendung des radioaktiv mit 32-P markierten Oligonucleotid-Primers abgesucht, um die Kolonien zu identifizieren, die den im Proteinkern mutierten Selectin-Liganden enthalten. Diese Kolonien werden selektiert und die DNA wird sequenziert, um das Vorliegen von Mutationen im Proteinkern des Moleküls zu bestätigen.
Mutanten, bei denen mehr als eine Aminosäure substituiert ist, lassen sich auf verschiedenen Wegen erzeugen. Wenn die Aminosäuren sich in der Polypeptidkette nahe beieinander befinden, können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonucleotids mutiert werden, das für sämtliche erwünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Befinden sich jedoch die Aminosäuren in einem gewissen Abstand voneinander (beispielsweise um mehr als 10 Aminosäuren getrennt), so ist es schwieriger, ein einziges Oligonucleotid, das für sämtliche erwünschten Veränderungen kodiert, zu erzeugen. Statt dessen kann eines von zwei alternativen Verfahren angewandt werden. Beim ersten Verfahren werden getrennte Oligonucleotide für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonucleotide werden sodann gleichzeitig einem Annealing mit der einzelsträngigen Matrizen-DNA unterzogen und der zweite DNA-Strang, der aus der Matrize synthetisiert wird, kodiert für sämtliche erwünschten Aminosäuresubstitutionen. Das alternative Verfahren beinhaltet zwei oder mehr Runden der Mutagenese zur Erzeugung der gewünschten Mutante. Die erste Runde entspricht den Angaben für die einzelnen Mutanten: DNA, die für den Proteinkern eines nativen Selectin-Liganden kodiert, wird für die Matrize verwendet, ein Oligonucleotid, das für die erste erwünschte Aminosäuresubstitution oder -substitutionen kodiert, wird einem Annealing mit dieser Matrize unterzogen, und anschließend wird das Heteroduplex-DNA-Molekül erzeugt. Die zweite Runde der Mutagenese bedient sich der in der ersten Mutageneserunde erzeugten mutierten DNA als Matrize. Somit enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutationen. Das Oligonucleotid, das für die zusätzliche(n) erwünschte(n) Aminosäuresubstitutionen) kodiert, wird einem Annealing mit dieser Matrize unterzogen, und der erhaltene DNA-Strang kodiert nunmehr für Mutationen aus der ersten und zweiten Runde der Mutagenese. Die erhaltene DNA kann als Matrize in einer dritten Mutageneserunde verwendet werden und so weiter.
3. PCR-Mutagenese
Die PCR-Mutagenese eignet sich auch zur Herstellung von Aminosäurevarianten der erfindungsgemäßen Selectin-Liganden. Während sich die vorstehende Erörterung auf DNA bezieht, ist darauf hinzuweisen, dass diese Technik auch bei RNA Anwendung finden kann. Die PCR-Technik bezieht sich allgemein auf das folgende Verfahren. Wenn geringe Mengen einer Matrizen-DNA als Ausgangsmaterial bei einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich in ihrer Sequenz geringfügig von der entsprechenden Region in einer Matrizen-DNA unterscheiden, verwendet werden, um relativ große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, das sich von der Matrizensequenz nur an den Positionen unterscheidet, an denen sich die Primer von der Matrize unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so konstruiert, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält. Die Sequenz des anderen Primers muss mit einer Sequenzfolge des entgegengesetzten Plasmidstranges identisch sein, jedoch kann sich diese Sequenz an einer beliebigen Stelle entlang der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb einer Entfernung von 200 Nucleotiden vom ersten Primer befindet, so dass das Ende der gesamten amplifizierten DNA-Region, die durch die Primer gebunden wird, leicht sequenziert werden kann. Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars, das den vorstehend beschriebenen Angaben entspricht, führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der Mutation, die durch den Primer angegeben wird, und möglicherweise an anderen Positionen unterscheidet, da das Matrizen-Kopierverfahren einer gewissen Fehleranfälligkeit unterliegt.
Wenn das Verhältnis von Matrize zu Produktmaterial äußerst gering ist, so wird der weit überwiegende Teil der Produkt-DNA-Fragmente die gewünschte(n) Mutationen) beinhalten. Dieses Produktmaterial wird zum Ersatz der entsprechenden Region im Plasmid, das als PCR-Matrize diente, gemäß üblicher DNA-Technik verwendet. Mutationen an getrennten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden, indem man entweder einen zweiten mutanten Primer verwendet oder eine zweite PCR mit verschiedenen mutanten Primern durchführt und die beiden erhaltenen PCR-Fragmente gleichzeitig in einer dreiteiligen (oder mehrteiligen) Ligation mit dem Vektorfragment verknüpft.
C. Insertion von DNA in einen replizierbaren Vektor
Die cDNA oder genomische DNA, die für (native oder variante) Selectin-Liganden der Erfindung kodiert, wird zur weiteren Klonierung oder Expression in einen replizierbaren Vektor inseriert. Es stehen zahlreiche Vektoren zur Verfügung. Die Auswahl des geeigneten Vektors hängt von folgenden Punkten ab: 1) von der Frage, ob der Vektor für eine DNA-Amplifikation (Klonierung) oder für eine Expression zu verwenden ist; 2) von der Größe der in den Vektor zu inserierenden DNA; und 3) von der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält in Abhängigkeit von seiner Funktion und von der Wirtszelle, mit er kompatibel ist, verschiedene Komponenten. Die Vektorkomponenten umfassen im allgemeinen (ohne Beschränkung hierauf) einen oder mehrere der folgenden Bestandteile: eine Signalsequenz, eine Replikationsursprungsstelle, ein oder mehr Markergene, ein Verstärkerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminatorsequenz. Spezifische Vektoren werden nachstehend in Verbindung mit den Wirtszellen, mit denen sie verträglich sind, erörtert.
Geeignete Vektoren werden unter Anwendung üblicher rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt. Isolierte Plasmide und DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in einer bestimmten Reihenfolge miteinander verknüpft, um die gewünschten Vektoren zu erzeugen.
Die DNA wird unter Verwendung des oder der entsprechenden Restriktionsenzyme in einem geeigneten Puffer gespalten. Im allgemeinen werden etwa 0,2 bis 1 μg Plasmid oder DNA-Fragmente mit etwa 1 bis 2 Einheiten der entsprechenden Restriktionsenzyme in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. (Geeignete Puffer, DNA-Konzentrationen und Inkubationszeiten und -temperaturen werden von den Herstellern der Restriktionsenzyme angegeben.) Im allgemeinen sind Inkubationszeiten von etwa 1 oder 2 Stunden bei 37°C angemessen, obgleich mehrere Enzyme höhere Temperaturen erfordern. Nach der Inkubation werden die Enzyme und andere Verunreinigungen durch Extraktion der Verdauungslösung mit einem Gemisch aus Phenol und Chloroform entfernt. Die DNA wird aus der wässrigen Fraktion durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Zur Verknüpfung der DNA-Fragmente miteinander unter Bildung eines funktionellen Vektors müssen die Enden der DNA-Fragmente miteinander kompatibel sein. In einigen Fällen sind die Enden nach Endonuclease-Verdau direkt kompatibel. Jedoch kann es erforderlich sein, zunächst die klebrigen Enden, die üblicherweise durch einen Endonuclease-Verdau erzeugt werden, in stumpfe Enden umzuwandeln, um sie für die Ligation kompatibel zu machen. Um die Enden stumpfendig zu machen, wird die DNA in einem geeigneten Puffer mindestens 15 Minuten bei 15°C mit 10 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate behandelt. Sodann wird sie durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt.
Die gespaltenen DNA-Fragmente können durch DNA-Gelelektrophorese einer Trennung nach ihrer Größe und einer Selektion unterworfen werden. Die DNA kann entweder an einer Agarose- oder einer Polyacrylamid-Matrix der Elektrophorese unterworfen werden. Die Selektion der Matrix hängt von der Größe der zu trennenden DNA-Fragmente ab. Nach der Elektrophorese wird die DNA aus der Matrix durch Elektroelution extrahiert oder, sofern niedrigschmelzende Agarose als Matrix verwendet worden ist, indem man die Agarose schmilzt und die DNA daraus gemäß den Angaben in den Abschnitten 6.30 bis 6.33 von Sambrook et al., a.a.O., extrahiert.
Die DNA-Fragmente, die miteinander zu verknüpfen sind (vorher mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut, so dass die Enden der einzelnen, zu verknüpfenden Fragmente miteinander kompatibel sind), liegen in der Lösung in etwa äquimolaren Mengen vor. Die Lösung enthält auch ATP, Ligase-Puffer und eine Ligase, wie T4-DNA-Ligase in einer Menge von etwa 10 Einheiten pro 0,5 μg DNA. Wenn das DNA-Fragment einer Ligation in einen Vektor zu unterwerfen ist, muss der Vektor zunächst durch Schneiden mit dem oder den entsprechenden Restriktionsendonucleasen linearisiert und anschließend entweder mit bakterieller alkalischer Phosphatase oder alkalischer Kälberdarm-Phosphatase phosphatiert werden. Dadurch wird eine Selbstligation des Vektors während der Ligationsstufe verhindert.
Nach der Ligation wird der Vektor mit dem nunmehr inserierten fremden Gen in eine geeignete Wirtszelle transformiert. Die transformierten Zellen werden aufgrund ihres Wachstums auf einem Antibiotikum, üblicherweise Tetracyclin (tet) oder Ampicillin (amp), gegenüber denen sie aufgrund der Anwesenheit von tet- und/oder amp-Resistenzgenen im Vektor resistent geworden sind, selektiert, Wenn das Ligationsgemisch in eine eukaryontische Wirtszelle transformiert worden ist, können die transformierten Zellen durch das vorstehend beschriebene DHFR/MTX-System selektiert werden. Die transformierten Zellen werden in Kultur gezüchtet, und die Plasmid-DNA (der Ausdruck Plasmid bezieht sich auf den Vektor, der mit dem fremden Gen von Interesse verknüpft worden ist) wird sodann isoliert. Diese Plasmid-DNA wird sodann durch Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung analysiert. Die DNA-Sequenzierung wird im allgemeinen entweder gemäß dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309, oder gemäß dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology, Bd. 65 (1980), S. 499, durchgeführt.
D. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Die Kohlenhydratkomponente der erfindungsgemäßen Glycoprotein-Liganden ist für die Rezeptorerkennung und Rezeptorbindung wesentlich. Demzufolge werden eukaryontische Wirtszellen, die Proteine in einer glycosylierten Form exprimieren, für die Expression der Liganden hier bevorzugt. Jedoch ist auch eine Expression in Prokaryonten, die Proteine nicht glycosylieren, wie E. coli, möglich. Das unglycosylierte Protein kann anschließend glycosyliert werden, z. B. gemäß den nachstehend erläuterten chemischen und/oder enzymatischen Verfahren.
1. Eukaryontische multizelluläre Organismen
Multizelluläre Organismen werden als Wirte zur Ausführung der Erfindung bevorzugt. Obgleich sowohl Zellkulturen von wirbellosen Tieren und von Wirbeltieren akzeptabel sind, werden Wirbeltier-Zellkulturen und insbesondere Säugetier-Zellkulturen bevorzugt. Zu Beispielen für geeignete Zelllinien gehören: die Affennieren-CVI-Linie transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humane, embryonale Nieren-Zelllinie 293S (Graham et al., J. Gen. Virol., Bd. 36 (1977), S. 59); Babyhamster-Nierenzellen BHK, ATCC CCL 10); Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (Urlab und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci USA, Bd. 77 (1980), S. 4216; Sertoli-Mäusezellen (TM4, Mather, Biol. Reprod., Bd. 23 (1980), S. 243; Affennierenzellen (CVI-76, ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane zervikale Karzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Leberzellen der Büffelratte (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Mammakarzinomzellen (MMT 060562, ATCC CCL 51); Ratten-Hepatomzellen (HTC, MI.54, Baumann et al., J. Cell Biol., Bd. 85 (1980), S. 1; und TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., Bd. 383 (1982), S. 44). Expressionsvektoren für diese Zellen umfassen üblicherweise (sofern erforderlich) DNA-Sequenzen für eine Replikationsursprungsstelle, einen Promotor vor dem zu exprimierenden Gen, eine Ribosomenbindungsstelle, eine RNA-Spleißstelle, eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptionsterminationsstelle.
Promotoren, die in Säugetier-Expressionsvektoren verwendet werden, sind häufig viralen Ursprungs. Diese viralen Promotoren werden üblicherweise von Polyoma-Virus, Adenovirus 2 und am häufigsten von Simianvirus 40 (SV40) abgeleitet. Das SV40-Virus enthält zwei Promotoren mit der Bezeichnung früher und später Promotor. Diese Promotoren sind besonders geeignet, da sie leicht aus dem Virus als ein einziges DNA-Fragment erhalten werden können, das auch die virale Replikationsursprungsstelle enthält (Fiers et al., Nature, Bd. 273 (1978), S. 113). Es können auch kleinere oder größere SV40-DNA-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die Sequenz mit annähernd 250 bp, die sich von der HindIII-Stelle zur BglI-Stelle in der viralen Replikationsursprungsstelle erstreckt.
Alternativ können Promotoren, die natürlicherweise mit dem fremden Gen assoziiert sind (homologe Promotoren) verwendet werden, vorausgesetzt sie sind mit der für die Transformation ausgewählten Wirtszelllinie kompatibel.
Eine Replikationsursprungsstelle lässt sich aus einer exogenen Quelle, wie SV40 oder einem anderen Virus (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV), erhalten und in den Klonierungsvektor inserieren. Alternativ kann die Replikationsursprungsstelle durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der das fremde Gen enthaltende Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, reicht das letztgenannte Produkt häufig aus.
Zufriedenstellende Mengen des Selectin-Liganden lassen sich durch transformierte Zellkulturen erzeugen. Jedoch kann die Verwendung einer sekundären DNA-Kodierungssequenz die Produktionsmengen erhöhen. Die sekundäre Kodierungssequenz umfasst typischerweise das Enzym Dihydrofolatreduktase (DHFR). Die Wildtypform von DHFR wird normalerweise durch die chemische Verbindung Methotrexat (MTX) gehemmt. Der Grad der DHFR-Expression in einer Zelle variiert je nach der Menge an MTX, die den gezüchteten Wirtszellen zugesetzt wird. Ein weiteres Merkmal von DHFR, das für eine sekundäre Frequenz besonders wertvoll ist, besteht darin, dass sie als Selektionsmarker zur Identifikation von transformierten Zellen verwendet werden kann.
Zwei Formen von DHFR stehen zur Verwendung als sekundäre Sequenz zur Verfügung, nämlich Wildtyp-DHFR und MTX-resistente DHFR. Der Typ der verwendeten DHFR in einer bestimmten Wirtszelle hängt davon ab, ob die Wirtszelle einen DHFR-Mangel aufweist (so dass sie endogen entweder nur sehr geringe Konzentrationen an DHFR bildet oder überhaupt keine funktionelle DHFR erzeugt). Zelllinien mit einem DHFR-Mangel, wie die CHO-Zelllinie (vergl. Urlaub und Chasin (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 77 (1980), S. 4216)) werden durch Wildtyp-DHFR-Kodierungssequenzen transformiert. Nach der Transformation exprimieren die Zelllinien mit DHFR-Mangel funktionelle DHFR und sind zum Wachstum in einem Kulturmedium, dem die Nährstoffe Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlen, befähigt. Nicht-transformierte Zellen überleben in diesem Medium nicht.
Die MTX-resistente Form von DHFR kann als Mittel zum Selektieren von transformierten Wirtszellen unter den Wirtszellen, die endogen normale Mengen an funktioneller DHFR, die MTX-empfindlich ist, bilden, verwendet werden. Die CHO-K1-Zelllinie (ATCC Nr. CL 61) besitzt diese Eigenschaften und stellt eine wertvolle Zelllinie für diesen Zweck dar. Die Zugabe vom MTX zum Zellkulturmedium ermöglicht nur den Zellen, die mit DNA, die für MTX-resistente DHFR kodiert, transformiert sind, das Wachstum. Die nicht-transformierten Zellen sind zum Überleben in diesem Medium nicht befähigt.
Die zur Bildung der erfindungsgemäßen Varianten verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in einer Reihe von Medien gezüchtet werden. Handelsübliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma), minimales essentielles Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco-modifiziertes Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) eignen sich für die Züchtung der Wirtszellen. Beliebige dieser Medien können je nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder epidermaler Wachstumsfaktor), Salzen (z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidine), Antibiotika, (wie Gentamycin), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Beliebige andere erforderliche Ergänzungsstoffe können in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachmann geläufig sind, enthalten sein.
2. Eukaryontische Mikroorganismen
Neben multizellulären Eukaryonten eignen sich auch eukanontische Mikroorganismen, wie filamentöse Pilze oder Hefen zur Ausführung der Erfindung. Saccharomyes cerevisiae oder übliche Bäckerhefe stellt den am häufigsten verwendeten niederen eukaryontischen Wirtsmikroorganismus dar. Jedoch sind eine Reihe von weiteren Gattungen, Spezies und Stämmen verfügbar und hier geeignet, z. B. Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature, Bd. 290 (1981), S. 140; EP-139 383, veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-4 943 529; Fleer et al., a.a.O.), wie K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., (1983), S. 737), K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178); K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906; Van den Berg et al., a.a.O.), K. thermotolerans und K. marxianus, varrowia (EP-402 226); Pichia pastoris (EP-183 070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., Bd. 28 (1988), S. 265–278); Candida; Trichoderma reesii (EP-244 234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 5259); Schwanniomyces, wie Schwanniomyces occidentalis (EP-394 538, veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und filamentöse Pilze, wie Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO-91/00357, veröffentlicht am 10. Januar 1991) und Aspergillus-Wirte, wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 112 (1983), S. 284; Tilburn et al., Gene, Bd. 26 (1983), S. 205; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 1470) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 475).
Zu geeigneten Promotorsequenzen in Hefevektoren gehören die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 2073) oder andere glycolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg., Bd. 7 (1968), S. 149; Holland et al., Biochemistry, Bd. 17 (1978), S. 4900), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion von geeigneten Expressionsplasmiden werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor in 3'-Stellung zur erwünschten, zu exprimierenden Sequenz ligiert, um für eine Polyadenylierung der mRNA und für eine Termination zu sorgen. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch die Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorregion für Alkohol-dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel verbundene abbauende Enzyme und die vorerwähnte Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase sowie Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortlich sind. Es sind beliebige Plasmidvektoren, die hefeverträgliche Promotoren, Replikationsursprungsstellen und Terminationssequenzen enthalten, geeignet.
3. Prokaryontische Zellen
Prokaryonten eignen sich in besonderer Weise zur raschen Bildung von großen Mengen an DNA zur Erzeugung von für die ortsspezifische Mutagenese verwendeten einzelsträngigen DNA-Matrizen, zum gleichzeitigen Screening zahlreicher Mutanten und zur DNA-Sequenzierung der erzeugten Mutanten. Zu geeigneten prokaryontischen Wirtszellen gehören E. coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31 446), E. coli Stamm W3110 (ATCC Nr. 27 325), E. coli X1776 (ATCC Nr. 31 537) und E. coli B. Jedoch können auch zahlreiche andere Stämme von E. coli, wie HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 und zahlreiche andere Spezies und Gattungen von Prokaryonten ebenfalls verwendet werden.
Prokaryonten können auch als Wirte zur Expression von DNA-Sequenzen verwendet werden. Die vorstehend aufgeführten E. coli-Stämme, Bazillen, wie Bacillus subtilis, andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens, und verschiedene Pseudomonas-Spezies können alle als Wirte verwendet werden.
Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die sich von mit der Wirtszelle verträglichen Spezies ableiten, können zusammen mit diesen Wirten verwendet werden. Der Vektor weist üblicherweise eine Replikationsstelle, Markergene, die eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen ermöglichen, einen oder mehrere Promotoren und eine Polylinkerregion, die einige Restriktionsstellen zur Insertion von fremder DNA enthält, auf. Zu Plasmiden, die typischerweise zur Transformation von E. coli verwendet werden, gehören pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 und Bluescript M13, die alle in den Abschnitten 1.12 bis 1.20 von Sambrook et al., a.a.O., beschrieben sind. Jedoch sind auch zahlreiche weitere geeignete Vektoren verfügbar. Diese Vektoren enthalten Gene, die für Ampicillin und/oder Tetracyclin-Resistenz kodieren, was es den mit diesen Vektoren transformierten Zellen ermöglicht, in Gegenwart dieser Antibiotika zu wachsen.
Zu den gebräuchlichsten Promotoren in prokaryontischen Vektoren gehören die β-Lactamase- (Penicillinase-) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, Bd. 375 (1978), S. 615; Itakura et al., Science, Bd. 198 (1977), S. 1056; Goeddel et al., Nature, Bd. 281 (1979), S. 544) und ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057; EP-36 776) und alkalische Phosphatase-Systeme. Obgleich es sich hierbei um die gebräuchlichsten Systeme handelt, wurden auch andere mikrobielle Promotoren verwendet. Einzelheiten bezüglich ihrer Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, die es dem Fachmann ermöglichen, sie funktionell in Plasmidvektoren einzubinden (vergl. Siebenlist et al., Cell, Bd. 20 (1980), S. 269.
4. Sekretionssysteme
Zahlreiche eukaryontische Proteine, die normalerweise aus der Zelle sezerniert werden, enthalten eine endogene Signalsequenz als Teil der Aminosäuresequenz. Diese Sequenz dirigiert das Protein zum Export aus der Zelle über das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat. Die Signalsequenz befindet sich typischerweise am Aminoterminus des Proteins und weist eine Länge im Bereich von etwa 13 bis etwa 36 Aminosäuren auf. Obgleich die tatsächliche Sequenz unter Proteinen variiert, enthalten sämtliche bekannten eukaryontischen Signalsequenzen mindestens einen positiv geladenen Rest und eine stark hydrophobe Folge von 10 bis 15 Aminosäuren (üblicherweise reich an den Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Alanin, Valin und Phenylalanin) in der Nähe des Zentrums der Signalsequenz. Die Signalsequenz fehlt üblicherweise in der sezernierten Form des Proteins, da sie durch eine Signal-peptidase, die sich auf dem endoplasmatischen Retikulum befindet, während der Translokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum abgespalten wird. Das Protein mit seiner noch daran haftenden Signalsequenz wird häufig als "Präprotein" oder unreife Form des Proteins bezeichnet.
Jedoch enthalten nicht alle sezernierten Proteine eine aminoterminale Signalsequenz, die abgespalten wird. Einige Proteine, wie Ovalbumin, enthalten eine Signalsequenz, die sich in einer inneren Region des Proteins befindet. Diese Sequenz wird normalerweise während der Translokation nicht abgespalten.
Normalerweise im Zytoplasma auftretende Proteine können für eine Sekretion durch Verknüpfung einer Signalsequenz mit dem Protein markiert werden. Dies wird in einfacher Weise erreicht, indem man für eine Signalsequenz kodierende DNA mit dem 5'-Ende der für das Protein kodierenden DNA verknüpft und anschließend dieses Fusionsprotein in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert. Die für die Signalsequenz kodierende DNA kann als ein Restriktionsfragment aus einem beliebigen Gen, das für ein Protein mit einer Signalsequenz kodiert, erhalten werden. Somit können hier je nach dem Typ der zur Ausführung der Erfindung verwendeten Wirtszelle Signalsequenzen von Prokaryonten, Hefen und Eukaryonten verwendet werden. Die für den Signalsequenzteil des Gens kodierende DNA wird unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten und sodann mit der für das zu sezernierende Protein kodierenden DNA verknüpft.
Die Auswahl einer funktionellen Signalsequenz macht es erforderlich, dass die Signalsequenz durch die Wirtszellen-Signal-peptidase erkannt wird, so dass es zu einer Spaltung dieser Signalsequenz und zu einer Sekretion des Proteins kommt. Die für den Signalsequenzbereich von mehreren eukaryontischen Genen kodierende DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz, z. B. menschliches Wachstumshormon, Proinsulin und Proalbumin, sind bekannt (vergl. Stryer, Biochemistry, W. N. Freeman and Company, New York (1988), S. 769) und können als Signalsequenzen in geeigneten eukaryontischen Wirtszellen verwendet werden. Hefe-Signalsequenzen, z. B. saure Phosphatase (Arima et al., Nuc. Acids Res., Bd. 11 (1983), S. 1657), alpha-Faktor, alkalische Phosphatase und Invertase können zum Dirigieren der Sekretion aus Hefe-Wirtszellen verwendet werden. Prokaryontische Signalsequenzen aus Genen, die beispielsweise für Lama oder OmpF (Wang et al., Gene, Bd. 68 (1988), S. 193, MalE, PhoA oder beta-Lactamase kodieren, sowie andere Gene können zur Abgabe von Proteinen aus prokaryontischen Zellen in das Kulturmedium verwendet werden.
Eine alternative Technik zur Bereitstellung eines Proteins von Interesse mit einer Signalsequenz, so dass es sezerniert werden kann, besteht in der chemischen Synthese der für die Signalsequenz kodierenden DNA. Bei diesem Verfahren werden beide Stränge eines Oligonucleotids, das für die gewählte Signalsequenz kodiert, chemisch synthetisiert und sodann miteinander unter Bildung eines Duplex verschmolzen. Das doppelsträngige Oligonucleotid wird sodann mit dem 5'-Ende der für das Protein kodierenden DNA verknüpft.
Das Konstrukt, das die DNA enthält, die für das Protein mit der damit verknüpften Signalsequenz kodiert, kann sodann einer Ligation in einen geeigneten Expressionsvektor unterzogen werden. Dieser Expressionsvektor wird in eine geeignete Wirtszelle transformiert. Das Protein von Interesse wird exprimiert und sezerniert.
E. Transformationsverfahren
Kulturen von Säugetier-Wirtszellen und anderen Wirtszellen, die keine starren Zellmembran-Barrieren aufweisen, werden üblicherweise unter Anwendung des Calciumphosphat-Verfahrens transformiert, das ursprünglich von Graham und Van der Eb (Virology, Bd. 52 (1978), S. 546) beschrieben wurde, wobei eine Modifikation gemäß den Abschnitten 16.32–16.37 von Sambrook et al. (a.a.O.) vorgenommen wird. Jedoch können auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie das Polybrene-Verfahren (Kawai und Nishizawa, Mol. Cell. Biol., Bd. 4 (1984), S. 1172), die Protoplastenfusion (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 2163), die Elektroporation (Neumann et al., EMBO J., Bd. 1 (1982), S. 841) und die direkte Mikroinjektion in Zellkerne (Capecchi, Cell, Bd. 22 (1980), S. 479) herangezogen werden.
Hefe-Wirtszellen werden üblicherweise mit dem Polyethylenglykol-Verfahren gemäß den Angaben von Hinnen (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, Bd. 75 (1978), S. 1929) transformiert.
F. Züchtung der Wirtszellen
Die zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Selectin-Liganden verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in verschiedenen Medien gezüchtet werden. Handelsübliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma), minimales essentielles Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) oder Dulbecco's-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, Sigma) eignen sich zur Züchtung der Wirtszellen. Ferner können beliebige der in den folgenden Literaturstellen beschriebenen Medien als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden: Ham und Wallace, Meth. Enz., Bd. 58 (1979), S. 44; Barnes und Sato, Anal. Biochem., Bd. 102 (1980), S. 255; US-4 767 704; US-4 657 866; US-4 927 762; US-4 560 655; WO-90/03430; WO-87/00195; US-Re-30 985. Beliebige dieser Medien können je nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z. B. Insulin, Transferrin und/oder epidermaler Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden, (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin^R), Spurenelementen (anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer gleichwertigen Energiequelle ergänzt werden. Beliebige weitere erforderliche Ergänzungsstoffe können in Konzentrationen, die dem Fachmann geläufig sind, zugesetzt werden. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und dergl., entsprechen den Bedingungen, wie sie vorstehend für die Wirtszelle, die für die Expression gewählt wird, herangezogen wurden. Diese Bedingungen sind dem Fachmann geläufig.
G. Glycosylierungsvarianten
Die Glycosylierung von Polypeptiden ist typischerweise N-verknüpft oder O-verknüpft. Die N-Verknüpfung bezieht sich auf die Bindung des Kohlenhydratrestes an die Seitenkette eines Asparaginrestes. Bei den Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, bei denen X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Prolin bedeutet, handelt es sich um Erkennungssequenzen für die enzymatische Bindung des Kohlenhydratrestes an die Asparagin-Seitenkette. Eine o-verknüpfte Glycosylierung bezieht sich auf die Bindung von einem der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obgleich auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin an der o-verknüpften Glycosylierung beteiligt sein können.
Die erfindungsgemäßen Selectin-Liganden sind durch überwiegende O-verknüpfte Glycosylierungsstellen gekennzeichnet. Diese können beispielsweise durch Hinzufügen oder Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste an die Aminosäuresequenz des Liganden modifiziert werden. Einfachheitshalber werden die Veränderungen üblicherweise auf dem DNA-Niveau vorgenommen, wobei man sich im wesentlichen der vorstehend bezüglich der Aminosäure-Sequenzvarianten erörterten Techniken bedient.
Eine chemische oder enzymatische Kupplung von Glycosiden an die erfindungsgemäßen Liganden kann auch dazu herangezogen werden, die Anzahl oder das Profil von Kohlenhydrat-Substituenten zu modifizieren oder zu erhöhen. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, da sie nicht der Herstellung des Polypeptids, das zu einer O-verknüpften (oder N-verknüpften) Glycosylierung befähigt ist, bedürfen. Je nach der verwendeten Kupplungsart können der oder die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Hydroxylgruppen, wie die von Cystein, (d) freie Sulfhydrylgruppen, wie die von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie die von Phenylalanin, Thyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren sind in WO-87/05330 (veröffentlicht am 11. September 1987) und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., (1981), S. 259–306, beschrieben.
An einem Selectin-Liganden vorhandene Kohlenhydratreste können auch chemisch oder enzymatisch entfernt werden. Eine chemische Deglycosylierung erfordert die Behandlung mit Trifluormethansulfonsäure oder einer gleichwertigen Verbindung. Diese Behandlung führt zur Spaltung der meisten oder sämtlicher Zucker, mit Ausnahme des verknüpfenden Zuckers, wobei das Polypeptid intakt bleibt. Eine chemische Deglycosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 259 (1987), S. 52 und von Edge et al., Anal. Biochem., Bd. 118 (1981), S. 131, beschrieben. Kohlenhydratreste lassen sich mit verschiedenen Endo- und Exoglycosidasen gemäß den Angaben von Thotakura et al., Meth. Enzymol., Bd. 138 (1987), S. 350, entfernen. Eine Glycosylierung wird durch Tunicamycin gemäß den Angaben von Duskin et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 3105, unterdrückt. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-glycosidase-Bindungen.
Glycosylierungsvarianten der hier beschriebenen Selectin-Liganden lassen sich auch durch Auswahl entsprechender Wirtszellen erzeugen. Hefe bewirkt beispielsweise eine Glycosylierung, die sich erheblich von der Glycosylierung von Säugetiersystemen unterscheidet. Gleichermaßen werden Säugetierzellen unterschiedlicher Spezies (z. B. Hamster, Maus, Insekten, Schwein, Rind oder Schaf) oder Gewebe (z. B. Lunge, Leber, lymphoide, mesenchymale oder epidermale Gewebe), deren Ursprung von der Quelle des Selectin-Liganden abweicht, routinemäßig auf die Einführung einer varianten Glycosylierung abgesucht, die beispielsweise durch erhöhte Konzentrationen an Mannose oder abgeänderten Anteilen an Mannose, Fucose, Sialinsäure und anderen Zuckern, die für die Selectin-Bindung wesentlich sind, charakterisiert sind.
H. Kovalente Modifikationen
Kovalente Modifikationen von natürlich vorkommenden Selectin-Liganden-Molekülen oder einer Sequenz, die mit einem derartigen Molekül eine biologische Eigenschaft gemeinsam hat, fallen unter den Umfang der Erfindung. Derartige Modifikationen werden herkömmlicherweise durch Umsetzung bestimmter Aminosäurereste des Selectin-Liganden-Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das zur Umsetzung mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten befähigt ist, oder durch "Harnessing"-Mechanismen von posttranslationalen Modifikationen, die in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen funktionieren, eingeführt. Die erhaltenen kovalenten Derivate eignen sich in Programmen, die, auf die Identifizierung von Resten abgestellt sind, die für die biologische Aktivität, für Immunoassays der Selectin-Liganden oder für die Herstellung von anti-Selectin-Liganden-Antikörpern für die Immunoaffinitätsreinigung des rekombinanten Glycoproteins von Bedeutung sind. Beispielsweise würde eine vollständige Inaktivierung der biologischen Aktivität des Proteins nach Umsetzung mit Ninhydrin darauf hinweisen, dass mindestens ein Arginyl- oder Lysylrest für die Aktivität kritisch ist, wonach die individuellen Reste, die unter den gewählten Bedingungen modifiziert worden sind, durch Isolierung eines Peptidfragments, das den modifizierten Aminosäurerest enthält, identifiziert werden. Derartige Modifikationen sind dem Fachmann geläufig und werden ohne unangemessene experimentelle Bemühungen vorgenommen.
Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln eignet sich zur Herstellung von intramolekularen Aggregaten des Selectin-Liganden-Glycoproteins mit Polypeptiden sowie zur Vernetzung des Selectin-Liganden-Glycoproteins mit einer in Wasser unlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung in Assays oder bei der Affinitätsreinigung. Zusätzlich liefert eine Untersuchung der Vernetzungen zwischen den Ketten direkte Informationen über die Konformationsstruktur. Zu üblicherweise verwendeten Vernetzungsmitteln gehören 1,1-Bis-(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionelle Imidoester und bifunktionelle Maleinimide. Derivatisierungsmittel, wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]-propioimidat, ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in Gegenwart von Licht zur Bildung von Vernetzungen befähigt sind. Alternativ werden reaktive, in Wasser unlösliche Matrices, wie mit Bromcyan aktivierte Kohlenhydrate und die in den US-Patenten 3 959 642, 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537, 4 055 635 und 4 330 440 beschriebenen Systeme mit reaktiven Substraten zur Protein-Immobilisierung und -Vernetzung verwendet.
Bestimmte posttranslationale Modifikationen sind das Ergebnis der Einwirkung von rekombinanten Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ können diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert werden. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Umfang der Erfindung.
Zu weiteren posttranslationalen Modifikationen gehören die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung der Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, (1983), S. 79–86).
Weitere Derivate umfassen die erfindungsgemäßen neuen Peptide unter kovalenter Bindung an ein nicht-proteinartiges Polymeres. Beim nicht-proteinartigen Polymeren handelt es sich üblicherweise um ein hydrophiles, synthetisches Polymeres, d. h. ein Polymeres, das ansonsten in der Natur nicht auftritt. Jedoch sind auch Polymere, die in der Natur vorkommen und durch rekombinante oder in vitro-Verfahren erzeugt werden, geeignet, sowie Polymere, die aus natürlichen Quellen isoliert werden. Hydrophile Polyvinyl-Polymere fallen unter den Umfang der Erfindung, z. B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders geeignet sind Polyvinylalkylenether, wie Polyethylenglykol und Polypropylenglykol.
Die Selectin-Liganden können mit verschiedenen nicht-proteinartigen Polymeren, wie Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, gemäß den Verfahren der US-Patente 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 oder 4 179 337 verknüpft werden.
Die Selectin-Liganden können in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt worden sind, in kolloidalen Arzneistoff-Abgabesystemen (z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen oder Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen werden. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflg., Hrsg. A. Osol (1980), beschrieben.
I. Selectin-Ligand – Stabile Plasmaprotein-Chimären
Eine Selectin-Liganden-Sequenz kann gemäß den vorstehenden Angaben mit einer stabilen Plasmaproteinsequenz verknüpft werden. Bei der stabilen Plasmaproteinsequenz kann es sich beispielsweise um die konstante Domäne einer Immunoglobulinsequenz handeln. Die erhaltenen Moleküle werden üblicherweise als Selectin-Liganden-Immunoglobulin-Chimären bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der C-Terminus einer Sequenz, die die Bindungsstelle(n) für ein Selectin enthält, mit dem N-Terminus des C-terminalen Bereiches eines Antikörpers (insbesondere der Fc-Domäne), der die Effektorfunktionen eines Immunoglobulins, z. B. von Immunoglobulin G₁, enthält, fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Region der schweren Kette mit der Sequenz, die die Selectin-Bindungsstelle(n) enthält, zu fusionieren. Jedoch wird insbesondere eine Sequenz, die mit dem Gelenkbereich unmittelbar stromaufwärts von der Papain-Spaltungsstelle (die IgG-Fc chemisch definiert; Rest 216, wobei man den ersten Rest der konstanten Region der schweren Kette als Rest Nr. 114 nimmt (Kobet et al., a.a.O.) oder analogen Stellen anderer Immunoglobuline) beginnt, bei der Fusion verwendet. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz, die die Selectin-Bindungsstelle(n) enthält, mit der Gelenkregion und C_H2 und C_H3 oder mit den C_H1-, Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen einer schweren IgG₁-, IgG₂- oder IgG₃-Kette fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion vorgenommen wird, ist nicht kritisch. Die optimale Stelle lässt sich durch routinemäßige Versuche ermitteln.
J. Reinigung der Selectin-Liganden
Der Selectin-Ligand kann aus rekombinanten Zellkulturen durch bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Hydroxylapatitchromatographie, Immunoaffinitätschromatographie und Lectinchromatographie. Weitere bekannte Reinigungsverfahren, die unter den Umfang der Erfindung fallen, bedienen sich der Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie unter Verwendung von anti-Selectin-Liganden-Antikörpern. Diese Verfahren eignen sich zur Reinigung der erfindungsgemäßen Liganden.
Ein besonders vorteilhaftes Reinigungsschema, das speziell für die Reinigung des L-Selectin-Liganden entwickelt wurde, ist in Beispiel 1 beschrieben. Dieses Verfahren nützt eine besondere Selectin-Rezeptor-Immunoglobulin-Chimäre (als L-Selectin-IgG bezeichnet), die durch rekombinante Verfahren hergestellt worden ist, aus. Diese Chimäre eignet sich zur Fällung des entsprechenden (mit Sulfat markierten) Liganden.
K. Therapeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Selectin-Liganden können zur Blockierung der Bindung eines entsprechenden Selectin-Rezeptors an seinen nativen Liganden verwendet werden. Beispielsweise blockiert der L-Selectin-Ligand in wirksamer Weise die Bindung eines L-Selectin-Rezeptors, der sich an einem zirkulierenden Leukozyten befindet, an dessen nativen Liganden, der sich an einer Endothelzelle befindet. Diese Eigenschaft eignet sich zur Behandlung eines Symptoms oder Zustands, der mit einer übermäßigen Bindung von zirkulierenden Leukozyten an Endothelzellen verbunden ist, z. B. einer mit rheumatoider Arthritis, Psoriasis, multipler Sklerose und dergl. verbundenen Entzündung.
Die erfindungsgemäßen Selectin-Liganden können nach bekannten Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch wertvollen Zusammensetzungen zubereitet werden, wobei der Ligand mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff kombiniert wird. Geeignete Träger und ihre Zubereitungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflg. (1980), Mack Publishing Co., Hrsg. Oslo et al., beschrieben. Diese Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine wirksame Menge des Liganden, z. B. in der Größenordnung von etwa 0,5 bis etwa 10 mg/ml zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, um pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen, die sich für eine wirksame Verabreichung an den Patienten eignen, herzustellen. Die Liganden können parenteral oder durch andere Verfahren, die eine Abgabe in den Blutkreislauf in wirksamer Form gewährleisten, verabreicht werden.
Zu Zusammensetzungen, die sich für die klinische Verabreichung der erfindungsgemäß verwendeten Liganden besonders gut eignen, gehören sterile wässrige Lösungen oder sterile hydratisierbare Pulver, z. B. ein lyophilisiertes Protein. Typischerweise wird auch eine geeignete Menge eines pharmazeutisch verträglichen Salzes in der Zubereitung verwendet, um diese isotonisch zu machen.
Die Dosierungen und erwünschten Arzneistoffkonzentrationen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können je nach dem vorgesehenen Anwendungszweck variieren.
K. Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d. h. die individuellen Antikörper der Population sind identisch, ausgenommen natürlich auftretende Mutationen, die in untergeordneten Anteilen vorliegen können. Somit bedeutet das Attribut "monoklonal", dass es sich beim Antikörper nicht um ein Gemisch von verschiedenen Antikörpern handelt.
Beispielsweise lassen sich die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper unter Anwendung des Hybridomverfahrens von Kohlen & Milstein, Nature, Bd. 256 (1975), S. 495, oder durch rekombinante DNA-Verfahren (Cabilly et al., US-4 816 567) herstellen.
Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, z. B. ein Hamster, mit dem Selectin-Ligandenprotein auf subkutanem, intraperitonealem oder intramuskulärem Weg immunisiert, um die Bildung von Lymphozyten anzuregen, die Antikörper bilden oder zu deren Bildung befähigt sind, die spezifisch an das für die Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden sodann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59–103, Academic Press (1986)).
Die auf diese Weise hergestellten Hybridomzellen werden auf ein geeignetes Kulturmedium überimpft und darin gezüchtet, wobei dieses Medium vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder das Überleben der unfusionierten, parentalen Myelomzellen hemmt. Wenn in den parentalen Myelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), wobei diese Substanzen das Wachstumm von Zellen mit HGPRT-Mangel verhindern.
Bei bevorzugten Myelomzellen handelt es sich um Zellen, die in wirksamer Weise fusionieren, eine stabile hochgradige Expression des Antikörpers durch die ausgewählten, antikörperbildenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium, z. B. einem HAT-Medium empfindlich sind. Unter diesen Myelom-Zelllinien werden Mäuse-Myelomlinien bevorzugt, die sich beispielsweise von MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren ableiten, erhältlich vom Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, Kalifornien, USA, sowie SP-2-Zellen, erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Humane Myelom-Zelllinien und Mäuse-Menschen-Heteromyelom-Zelllinien wurden ebenfalls für die Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor, J. Immunol., Bd. 133 (1984), S. 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
Das Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf die Bildung von monoklonalen Antikörpern gegen TNFR1 getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von durch die Hybridomzellen erzeugten monoklonalen Antikörpern durch Immunopräzipitation oder durch einen in vitro-Bindungstest, z. B. einen Radioimmunoassay (RIA) oder einen enzymgebundenen Immunosorbenstest (ELISA) bestimmt.
Die Affinität des monoklonalen Antikörpers zur Bindung des entsprechenden Liganden kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem., Bd. 107 (1980), S. 220, bestimmt werden.
Anschließend werden Hybridomzellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität, bilden, identifiziert. Die Klone können durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch übliche Verfahren gezüchtet werden; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59–104 (Academic Press, 1986). Zu geeigneten Kulturmedien für diesen Zweck gehören beispielsweise Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium oder RPMI-1640-Medium. Ferner können Hybridomzellen in vivo als Aszites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sezernierten monoklonalen Antikörper werden in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium, der Aszites-Flüssigkeit oder dem Serum durch herkömmliche Immunoglobulin-Reinigungsverfahren abgetrennt, beispielsweise durch Chromatographie an Protein A-Sepharose und Hydroxylapatit, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie.
Für die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kodierende DNA lässt sich leicht unter Anwendung herkömmlicher Verfahren isolieren und sequenzieren (z. B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene, die für die schweren und leichten Ketten von murinen Antikörpern kodieren, befähigt sind). Die erfindungsgemäßen Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle für eine derartige DNA. Nach der Isolierung kann die DNA in Expressionsvektoren eingebracht werden, die sodann in Wirtszellen, wie Affen-COS-Zellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder Myelomzellen, die ansonsten kein Immunoglobulinprotein erzeugen, transfiziert werden, wodurch man die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen erreicht. Die DNA kann beispielsweise auch durch Substitution der Kodierungssequenz für humane konstante Domänen von schweren und leichten Ketten anstelle der homologen murinen Sequenzen modifiziert werden (Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Bd. 81 (1984), S. 6851) oder indem man mit der Immunoglobulin-Kodierungssequenz die Gesamtheit oder einen Teil der der Kodierungssequenz für ein Nichtimmunoglobulin-Polypeptid verbindet. Auf diese Weise werden "chimäre" oder "hybride" Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines monoklonalen anti-Selectin-Liganden-Antikörpers gemäß der Erfindung aufweisen.
Typischerweise dienen derartige Nichtimmunoglobulin-Polypeptide als Ersatz für die konstanten Domänen eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder sie dienen als Ersatz für die variablen Domänen von einer einzigen Antigen-Kombinationsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers, um einen chimären, bivalenten Antikörper zu schaffen, der eine einzige Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für einen Selectin-Liganden und eine weitere Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für ein davon abweichendes Antigen aufweist.
Chimäre oder hybride Antikörper lassen sich auch in vitro unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie herstellen, einschließlich Verfahren unter Verwendung von Vernetzungsmitteln. Beispielsweise lassen sich Immunotoxine unter Anwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruieren. Zu Beispielen für geeignete Reagenzien für diesen Zweck gehören Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Für diagnostische Anwendungen werden die erfindungsgemäßen Antikörper typischerweise mit einem nachweisbaren Rest markiert. Beim nachweisbaren Rest kann es sich um einen beliebigen Rest handeln, der entweder direkt oder indirekt zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist. Beispielsweise kann es sich beim nachweisbaren Rest um ein Radioisotop, wie ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende, oder chemilumineszierende Verbindung, wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, radioaktive isotope Markierungen, wie ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C oder ³H, oder um ein Enzym, wie alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase oder Meerrettich-peroxidase, handeln.
Beliebige aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur getrennten Konjugation des Antikörpers mit dem nachweisbaren Rest können herangezogen werden, einschließlich der in folgenden Literaturstellen beschriebenen Verfahren: Hunter et al., Nature, Bd. 144 (1962), S. 945; David et al., Biochemistry, Bd. 13 (1974), S. 1014; Pain et al., J. Immunol. Meth., Bd. 40 (1981), S. 219; und Nygren, J. Histochem. and Cytochem., Bd. 30 (1982), S. 407.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können bei einem beliebigen Testverfahren herangezogen werden, z. B. bei kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunopräzipitationstests; Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147–158 (CRC Press, Inc., 1987).
Kompetitive Bindungstests stützen sich auf die Fähigkeit eines markierten Standards (bei dem es sich um einen Selectin-Liganden oder um einen immunologisch reaktiven Teil davon handeln kann) zur Konkurrenz mit dem Testproben-Analyten (Selectin-Liganden) bezüglich der Bindung mit einer begrenzten Menge an Antikörper. Die Menge des Selectin-Liganden in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge des Standards, der gebunden wird, zu erleichtern, werden die Antikörper vor oder nach der kompetitiven Reaktion im allgemeinen unlöslich gemacht, so dass der Standard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden werden, in zweckmäßigerweise vom Standard und dem Analyt, der in ungebundenem Zustand verbleibt, abgetrennt werden kann.
Bei Sandwich-Tests sind zwei Antikörper beteiligt, von denen jeder zur Bindung an einen unterschiedlichen immunogenen Bereich oder Epitop des nachzuweisenden Proteins befähigt ist. Bei einem Sandwich-Test wird der Testproben-Analyt durch einen ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger immobilisiert ist. Anschließend bindet ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex entsteht; David & Greene, US-4 376 110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einem nachweisbaren Rest markiert sein (direkte Sandwich-Tests) oder er kann unter Verwendung eines anti-Immunoglobulin-Antikörpers, der mit einem nachweisbaren Rest markiert ist, gemessen werden (indirekter Sandwich-Test). Beispielsweise handelt es sich bei einem Typ eines Sandwich-Tests um einen ELISA-Test, wobei es sich in diesem Fall beim nachweisbaren Rest um ein Enzym handelt.
Nachstehend wird die Erfindung durch die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele näher erläutert.
III. Beispiele
Beispiel 1
Identifizierung von Oberflächen-Glycoproteinen an durch L-Selectin erkannten Endothelzellen
Dieses Beispiel zeigt, dass rekombinantes L-Selectin in selektiver Weise an ³⁵SO₄-markierte Makromoleküle aus Lymphknoten bindet. Insbesondere wurden zwei sulfatierte, fucosylierte und sialylierte Glycoproteine identifiziert.
A. Metabolische Markierung von Organen mit ³⁵S-Sulfat
Mesenterische oder periphere (zervikale, brachiale, axillare) Lymphknoten wurden 8 bis 16 Wochen alten weiblichen ICR-Mäusen entnommen. Die Lymphknoten wurden mit einer Rasierklinge in Scheiben von 1 mm Dicke aufgeschnitten. Die Scheiben (typischerweise mit einem Feuchtgewicht von 0,2 g) wurden in 1 ml RPMI-1640 Medium mit einem Gehalt an 25 mM HEPES, 100 U/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycin und 200 μCi trägerfreiem [³⁵S]-Natriumsulfat (ICN Biochemicals Inc., Costa Mesa, CA) gemäß dem Verfahren von Ager, J. Cell Sci., Bd. 87 (1987), S. 133) suspendiert. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Scheiben gründlich mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Dulbecco, PBS) gewaschen und sodann in 1 ml Lysis-Puffer (2% Triton X-100 in PBS mit einem Gehalt an 1 mM PMSF, 1% (Vol./Vol.) Aprotinin, 10 μg/ml Pepstatin, 0,02% NaN³) auf Eis mit einem Potter-Elvehjem-Homogenisiergerät homogenisiert. Die Lysis wurde 1 Stunde bei 4°C auf einem Rüttelgerät fortgesetzt. Das Lysat wurde 1 Stunde bei 4°C mit 10 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit EDTA bis zu einer Endkonzentration von 2 mM versetzt. Anschließend wurde der Überstand durch Schütteln mit Affi-Gel Protein A (250 μl gepackte Kügelchen, BioRad Laboratories, Richmond, CA) über Nacht bei 4°C vorgeklärt.
B. Identifizierung der an den L-Selectin-IgG-Kügelchen adsorbierten Komponenten
Affi-Gel Protein A (10 μl gepackte Kügelchen) wurden mit 30 μg entweder an L-Selectin-IgG (WO-91/08298, veröffentlicht am 13. Juni 1991), CD4-IgG (hergestellt gemäß Capon et al., Nature, Bd. 337 (1989), S. 525) oder humanem IgG1 (Calbiochem, La Jolla, CA) in 1 ml PBS über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Die Kügelchen (als L-Selectin-IgG-Kügelchen, CD4-IgG-Kügelchen und HuIgG-Kügelchen bezeichnet) wurden 3-mal in PBS und 1-mal mit Lysispuffer gewaschen. Die CD4-IgG- und HuIgG-Kügelchen wurden als Kontrollen verwendet.
Das im vorstehenden Abschnitt A beschriebene vorgeklärte Lysat wurde 10 Sekunden mit 10 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM mit CaCl₂ versetzt. Sodann wurde der Überstand sofort entweder mit L-Selectin-IgG-Kügelchen, CD4-IgG-Kügelchen oder HuIgG-Kügelchen (typischerweise 200 μl vorgeklärtes Lysat pro 10 μl gepackte Kügelchen versetzt). Sodann wurde 4 Stunden bei 4°C auf einem Schüttelgerät inkubiert. Die Kügelchen wurden 6-mal mit Lysispuffer gewaschen, in ein neues Röhrchen übertragen und sodann noch einmal mit Lysispuffer gewaschen.
Die an die L-Selectin-IgG-Kügelchen gebundenen Materialien wurden durch Siedebehandlung in SDS in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol in Lösung gebracht und der Elektrophorese an SDS-Polyacrylamidgelen (9 oder 10%) und der Fluorographie mit ENTENSIFY oder EN³HANCE (NEN) unterworfen. Bei der Fluorographie war die 50 kD-Komponente tendenziell diffuser mit ENTENSIFY als mit EN³HANCE. Beim Repräzipitationsversuch wurde die mit SDS in Lösung gebrachte Probe der Elektrophorese an einem 7,5% SDS-Gel mit vorgefärbten Standards (BioRad, hoher Bereich) als Marken unterzogen. Der Bereich um 50 kD am Gel wurde unter Verwendung von vorgefärbtem Ovalbumin (49,5 kD) als Positionsmarker ausgeschnitten. Das Protein wurde durch Elektroelution (BioRad Modell 422) bei 60 mA über Nacht in Laemmli-Laufpuffer überführt. Das Eluat wurde eingeengt. Der Puffer wurde gegen 10 mM CAHPS in PBS an einer Centricon 30-Anlage (Amicon, Danvers, MA) ausgetauscht. Anschließend wurde eine Inkubation mit L-Selectin-IgG-Kügelchen, CD4-IgG-Kügelchen oder HuIgG-Kügelchen gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt. Für die Analyse des rohen Lysats wurden 200 μl des vorgeklärten Lysats mit kaltem Aceton (80% Vol./Vol.) gefällt und sodann der Elektrophorese auf die vorstehend angegebene Weise unterzogen.
L-Selectin-IgG-Kügelchen fällten eine diffuse 50 kD-Komponente (scheinbarer Molekulargewichtsbereich 50 kD bis 58 kD) aus mit [³⁵S]-Sulfat markierten mesenterischen Lymphknoten (MLN) oder peripheren Lymphknoten (PN). Eine Bande von ~90 kD (83 kD bis 102 kD) in Bezug auf den Sulfateinbau in einem untergeordneten Anteil) wurde bei den meisten Analysen ebenfalls beobachtet. Bei Kontrollfällungen erkannten CD4-IgG- und HuIgG-Kügelchen die 50 kD-Hauptkomponente oder die 90 kD-Komponente in den Lysaten nicht. Wenn rohe Lysate direkt analysiert wurden, stellte die 50 kD-Komponente neben mehreren anderen Banden den Hauptbestandteil dar. Die Gewebeverteilung der 50 kD-Komponente wurde ferner unter Anwendung der gleichen Verfahrensweise für die Markierung mit [³⁵S]-Sulfat und Fällung mit LHR-IgG auf eine Anzahl von Organen geprüft. Unter lymphoiden Geweben zeigten nur periphere Lymphknoten und mesenterische Lymphknoten die 50 kD- und 90 kD-Banden, wobei Peyer-Plaques, Milz und Thymus bei beiden negativ waren. Nicht-lymphoide Organe, wie Niere, Leber, Cerebrum und Cerebellum, waren ebenfalls vollständig negativ.
L-Selectin-IgG-Kügelchen fällten die 50 kD-Komponente, wenn Calcium vorhanden war, jedoch nicht in dessen Abwesenheit. Die Spezifität der Wechselwirkung wurde ferner unter Verwendung von MEL-14 mAb geprüft. Eine Vorinkubation von L-Selectin-IgG-Kügelchen mit diesem Antikörper blockierte die Bindung der 50 kD-Bande an die Kügelchen vollständig, während ein klassenmäßig angepasster Kontrollantikörper (anti-CD45) keine Wirkung zeigte. Fucoidin hemmte die Fällung der 50 kD-Komponente durch L-Selectin-IgG-Kügelchen vollständig, während Kontrollpolysaccharide (Chondroitinsulfat B, Chondroitinsulfat A, Keratansulfat) vollständig inaktiv waren. Ferner verringerte die Anwesenheit von PPME in signifikanter Weise die Intensität der 50 kD-Bande, obgleich eine relativ hohe Konzentration erforderlich war. Ein Kontroll-Hefe-Mannan (mnn 2) hatte bei der gleichen Konzentration keine Wirkung. Die Fällung der untergeordneten 90 kD-Bande durch L-Selectin-IgG-Kügelchen war ebenfalls von Calcium abhängig (durch MEL-14 mAb hemmbar) und wurde durch Fucoidin und PPME blockiert.
Schließlich wurde festgestellt, dass eine Behandlung der Glycoproteine mit Sialidase die Bindung durch L-Selectin-IgG hemmte. Somit ist Sialinsäure an den Glycoproteinen offensichtlich für die Bindung wesentlich. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Charakterisierungen der Wechselwirkungen zwischen Selectinen und ihren Liganden überein.
Beispiel 2
Reinigung des 50 kD-L-Selectin-Liganden für die Klonierung und Sequenzbestimmung
Die in Beispiel 1 beschriebenen Arbeiten bestätigten, dass die L-Selectin-IgG-Chimäre zur biochemischen Charakterisierung des sulfatierten, von peripheren und mesenterischen Lymphknoten gebildeten endothelialen Liganden mit ~50 kD verwendet werden kann. Weitere Arbeiten zeigten, dass dieser Ligand bereitwillig in das Medium abgegeben wird, wenn periphere Lymphknoten (PLN) in Organkultur gebracht werden (unveröffentlichte Feststellungen von S. Watson). Somit bestand die anfängliche Stufe der Reinigung des L-Selectin-Lliganden zur Sequenzbestimmung in der Erzeugung von großen Mengen an durch Mäuse-PLN konditioniertem Medium. Eine zweite Beobachtung, die eine erhebliche Reinigung zuließ, bestand darin, dass der sulfatierte L-Selectin-Ligand mit ~50 kD nach Behandlung von mit Chloroform/Methanol konditioniertem Medium löslich war. Diese Stufe führte zu einer >350-fachen Reinigung des sulfatierten Liganden. Die nächste Reinigungsstufe bestand in einer Weizenkeim-Agglutinin-Affinitätssäule, wobei man den offensichtlich hohen Kohlenhydratgehalt in diesen Liganden ausnützte. Bei der letzten Reinigungsstufe bediente man sich einer L-Selectin-IgG-Chimären-Affinitätssäule zur Reinigung des Liganden. Diese letzte Stufe gewährleistete, dass das enthaltene Material innerhalb der ~50 kD-Region einem Glycoprotein entsprach, das mit relativ hoher Affinität an L-Selectin bindet.
Mesenterische oder periphere (zervikale, brachiale und axillare) Lymphknoten wurden aus weiblichen ICR-Mäusen mit einem Alter von 8 bis 16 Wochen gewonnen. Die Mäuse wurden getötet. Ihre mesenterischen Lymphknoten wurden entnommen. Typischerweise wurde ein einziger Ansatz mit konditioniertem Medium aus den mesenterischen Lympfknoten von 30 Mäusen hergestellt. Gelegentlich wurde ferner eine geringe Anzahl (etwa 5% des Gewichts der gesamten Lymphknoten) an peripheren Lymphknoten zugegeben. Die Knoten wurden mit einer Rasierklinge zu Scheiben mit einer Dicke von etwa 1 mm aufgeschnitten. Die Scheiben wurden in das übliche Zellkulturmedium RPMI-1640, das mit 25 mM HEPES-Puffer, 1 U/ml Penicillin und 1 μg/ml Streptomycin ergänzt war, in einer 100 ml fassenden Zellkulturflasche gegeben. Das Verhältnis des Mediums zu den Knoten betrug 6 ml/30 mesenterische Lymphknoten.
Die Kulturflasche wurde sodann in einen Inkubator von 37°C gegeben. Nach 4 Stunden wurde das Medium in ein 15 ml fassendes, konisches Röhrchen gegeben und 10 Minuten mit 500 × g zentrifugiert, um große Gewebebruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde erneut in einem 15 ml-Corex-Röhrchen 15 Minuten mit 20 000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde zunächst durch ein Nitex-Sieb gegossen, um Fettteilchen, die während der Zentrifugation nicht pelletisierten, zu entfernen, und anschließend mit flüssigem Stickstoff rasch eingefroren und bei –20°C gelagert.
Um das Protein-Reinigungsschema zu überwachen, wurde ³⁵SO₄-markiertes Sgp50 zu dem auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten konditionierten Medium gegeben. Dieses Material wurde hergestellt, indem 5 mesenterische Lymphknoten von Mäusen in 1 ml des vorstehend beschriebenen Kulturmediums mit 0,5_: mCi Na³⁵SO₄ (ICN) markiert wurden. Nach 4 Stunden wurde das konditionierte Zellkulturmedium entfernt und 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und durch Zugabe zu 100 μl gepackten Protein A-Agarose-Kügelchen (Zymed Corp.) vorgeklärt und über Nacht bei 4°C geschüttelt. Das vorgeklärte Medium wurde auf 3 ml einer kovalent vernetzten LEC-IgG-Protein A-Agarose (LEC × Protein A-Agarose)-Säule, die mit 10 mg L-Selectin-IgG pro 1 ml gepackter Protein A-Agarose (Zymed) gemäß dem auf den Seiten 522–523 von Antibodies, A Laboraton Manual (1988) Harlow and Lane, Gold Spring Harbor Laboraton, hergestellt worden war, gegeben. Nach Schütteln von 6 Stunden bis über Nacht mit L-Selectin × Protein A-Agarose wurde die Säule mit 10 Volumina phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Dulbecco, (PBS)) gewaschen. Das gereinigte Material (50 kD L-Selectin-Ligand, auch bezeichnet als GlyCAM) wurde mit 10 ml 4 mM EDTA in PBS eluiert. Dieses Material wurde mit einem Centricon 30-Gerät (Amicon Corp.) auf ein Endvolumen von etwa 100 μl eingeengt. Es wurden etwa 60 000 cpm Material erhalten.
Zur Herstellung von gereinigtem Protein für die Mikrosequenzierungsanalyse wurden vier Ansätze (etwa 120 Mäuse) von konditioniertem Medium (24 ml) aufgetaut. 50 μl ³⁵SO₄-markiertes Sgp50 (32 000 cpm) wurden zugegeben. 9 Volumenteile (216 ml) Chloroform : Methanol (2 : 1) wurden zugesetzt. Nach 30-minütigem Schütteln bei Raumtemperatur in 50 μl fassenden konischen Röhrchen wurde 20 Minuten bei 500 × g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde gesammelt. Die Grenzphase wurde erneut zentrifugiert, um einen möglichst großen Anteil der wässrigen Phase zu extrahieren. Die Chloroform/Methanol-Extraktion wurde wiederholt. Um eine wässrige Phase auftreten zu lassen, wurden etwa 20 ml PBS zugegeben. Die wässrige Phase wurde gewonnen. Restliches Chloroform/Methanol wurde durch 3-stündiges Rühren in einem 1 Liter fassenden Becherglas auf einem warmem Wasserbad unter dem Abzug abgedampft. Das Material, das nunmehr als <C : M ("nach Ausschütteln mit Chloroform/Methanol") bezeichnet wurde, wurde sodann 4 Stunden gegen PBS dialysiert. Bei einer ähnlichen Zubereitung wurde eine 1 385-fache Reinigung erzielt. Das dialysierte <C : M mit 19 200 cpm wurde über Nacht bei 4°C mit 4 ml Weizenkeim-Agglutinin (WGA)-Agarosegel (Vector Laboratories) geschüttelt. Das Gel wurde in einer Säule gesammelt, mit 40 ml PBS gewaschen und mit 0,2 M N-Acetylglucosamin in PBS eluiert. In einem ähnlichen Versuch wurde eine zusätzliche 4,4-fache Reinigung erzielt. Dieses Material mit einem Gehalt an etwa 15 000 cpm, das 60 Mäusen entspricht, wurde an einem Centricon 30-Gerät eingeengt und nach einem üblichen Laemmli-Verfahren auf 10% SDS-Gel laufen gelassen. Bei einem ähnlichen Versuch ergab eine endgültige Reinigung an LEC × Protein A-Agarose insgesamt eine 60 606-fache Reinigung. Sodann wurde das Protein einem Elektroblotting in einem BioRad-Miniblotter (250 mA, konstanter Strom für 2 Stunden) an einer ProBlott-Membran (Applied Biosystems Incorp.) unterzogen. Die Membran (Blot) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit Coomassie R-250 gefärbt und entfärbt. Der Blot wurde an der Luft getrocknet. Eine Autoradiographie wurde mit Kodak XAR-Film durchgeführt.
Das gereinigte Material wurde sodann einer Gasphasen-Mikrosequenzierung unterzogen.
Beispiel 3
Proteinsequenzbestimmung
Die Polypeptidsequenz wurde durch Gasphasen-Mikrosequenzierung des gemäß Beispiel 2 gereinigten Materials bestimmt. Das aus der L-Selectin-IgG-Affinitätssäule eluierte Protein wurde an einem 10% SDS-Gel laufen gelassen, an einer Problott-Membran (Applied Biosystems Inc.) einem Elektroblotting unterworfen, mit Coomassie R-250 gefärbt und entfärbt. Der Blot wurde an der Luft getrocknet und auf einen Kodak XAR-Film aufgelegt, um die Position des mit Sulfat markierten Liganden zu erfassen. Diese Region des Gels wurde ausgeschnitten und einer Gasphasen-Mikrosequenzierung unterworfen. Die Sequenzierung wurde im wesentlichen gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt.
Eine Polypeptid-Sequenzierung ergab eine unzweideutige Folge von 25 Aminosäuren auf einem Niveau von etwa 5 pM (3B).
Beispiel 4
cDNA-Klonierung und Sequenzanalyse des ~50 kD L-Selectin-Liganden
Eine murine periphere Lymphknoten-cDNA-Bank wurde unter Verwendung eines in vitro-Gen-cDNA-Bankkits und von poly A + RNA, die aus murinen peripheren Lymphknoten isoliert worden war, konstruiert. Ein redundanter Oligonucleotid-Sondenpool wurde von den Resten 9–17 der N-terminalen Sequenz (QMKTQPMDA) unter Verwendung von degenerierten Codons, die auf der Grundlage der Säugetier-Codon-Verwendungsregel ausgewählt wurde, abgeleitet. Bei den Codons handelte es sich um CAG, ATG, AAG, AAA, ACA, ACT, ACC, CCA, CCT, CCC, GAT oder GAC. Für das 5'-Ala-Codon wurde nur GC verwendet. Das 26-mere Oligonucleotid wurde unter Verwendung von Polynucleotid-kinase mit ³²P markiert und mit doppelten Nitrocellulosefiltern, abgeleitet von 20 Platten mit einem Gehalt an 1 Million gT10-Bakteriophagen in 20% Formamid, 5X SSC (150 mM CaCl₂, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,6), 5X Denhardt-Lösung, 10 Dextransulfat und pro ml 20 μg denaturierte, einer Scherbehandlung unterworfene Lachssperma-DNA, über Nacht bei 42°C hybridisiert. Die Filter wurden in 1X SSC, 0,1% SDS 2-mal 30 Minuten bei 42°C gewaschen und bei –70°C über Nacht der Autoradiographie unterworfen. Eine einzelne Duplikat-positive Phage wurde einer Plaquereinigung unterworfen. Das EcoRI-Insert wurde in den pGEM-Vektor subkloniert. Die gesamte Nucleotidsequenz beider Stränge wurde durch Supercoin-Sequenzierung mit dem Sequenase-Kit erhalten. Für die in situ-Hybridisierung und Northern-Blotanalyse wurde ein Polymerase-Kettenreaktion-Fragment, dem der poly A-Schwanz fehlte, synthetisiert und sodann in den pGEM-Vektor (PROMEGA) subkloniert. Die Nucleotidsequenz der kodierten cDNA ist in 4 dargestellt. Der Klon enthielt eine kurze (etwa 600 bp) cDNA mit einem einzigen offenen Leseraster von 151 Aminosäuren. Eine "Kozak-Box" (CCACCATGA) wurde in der Umgebung des ersten kodierten Methionins gefunden (M. Kozak, Cell Biology, Bd. 115 (1991), S. 887). Diesem Methionin folgte eine 19 Aminosäuren lange, stark hydrophobe Sequenz, die offensichtlich als Signalsequenz für die Translokation des Proteins in den Sekretionsweg dient. Dieser Region folgt eine Sequenz, die fast genau der durch N-terminale Sequenzierung des gebundenen L-Selectin-IgG-Materials bestimmten Sequenz entspricht. Das in Bezug auf die Signalsequenz prozessierte Protein mit 132 Aminosäuren ist äußerst reich an Serin und Threonin, wobei etwa 29% der kodierten Aminosäuren diesen Resten entsprechen.
Möglicherweise von größerem Interesse ist, dass diese Serin- und Threoninreste als Cluster in zwei Regionen des Glycoproteins vorlagen (3D). Für die Region I (Reste 42-63) wurde festgestellt, dass sie 12 Serin- oder Threoninreste (~55%) enthielt, während für die Region II (Reste 93–122) 14 Serin- oder Threoninreste (~48%) gefunden wurden. Innerhalb dieser Regionen wurden Serin- und Threoninreste im allgemeinen in Clustergruppen von zwei, drei oder vier Resten festgestellt. Dem Protein fehlten Cysteinreste, und es lag nur eine potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstelle vor (Reste 115–117). Das Fehlen von Cysteinresten stimmte mit früheren Daten überein, die belegten, dass die Beweglichkeit des mit Sulfat markierten Liganden an SDS-Polyacrylamidgelen bei Abwesenheit von Disulfid-Reduktionsmitteln nicht beeinflusst wurde (S. Imai und S. Rosen, unveröffentlichte Feststellungen). Ferner stimmte die einzige potenzielle N-verknüpfte Stelle mit der früher gemachten Feststellung überein, dass in Bezug auf N-Glycanase empfindliche Kohlenhydrat-Seitenketten am ~50 kD-Liganden nur in geringem Umfang vorhanden waren. Schließlich wurde für das Molekulargewicht des prozessierten Proteins ein Wert von 14154 kD festgestellt. Da das Molekulargewicht des isolierten L-Selectin-Liganden ~50 kD beträgt, lässt dieses Ergebnis darauf schließen, dass der Wert von ~70 kD der Glycoproteinmasse dem O-verknüpften Kohlenhydrat entspricht (Carraway und Hull, BioAssays, 10 (4) (1989), S. 117–121), ein Ergebnis, das mit der fehlenden Möglichkeit, das isolierte Glycoprotein mit Coomassie-Blau zu färben, übereinstimmt.
Eine Prüfung des C-Terminus des durch diese cDNA kodierten Proteins ergab eine schwach hydrophobe Domäne, aber kein offensichtliches Transmembran-Verankerungsmotiv. Obgleich es möglich ist, dass diese Region einem Signal entspricht, das die Addition eines Phosphatidylinosit (PI)-Schwanzes dirigiert, scheint eine Behandlung von Lymphknotenschnitten mit Phosphatidylinosit-phospholipase C (PIPLC) nicht den Liganden vom Endothel zu entfernen (M. Singer, S. Watson, R. Mebius, unveröffentlichte Feststellungen). Obgleich dieses Ergebnis nicht die Möglichkeit ausschließt, dass der ~50 kD-Ligand unter Einsatz eines PI-Schwanzes eine Assoziation mit der Zelloberfläche eingeht, wird der Schluss nahegelegt, dass sich dieses Glycoprotein anderer möglicher Verknüpfungen mit der Zelloberfläche bedient. Eine Überprüfung der C-terminalen 21 Aminosäuren durch ein Programm zum Absuchen auf amphipathische Helices ergibt, dass der C-Terminus dieses Glycoproteins für eine hochgradig signifikante amphipathische Helix kodiert (3C), wobei eine Seite dieser potentiell helikalen Region apolare Reste enthält, während die andere Seite polare Reste enthält (J. Mol. Biol., Bd. 81 (1984), S. 155).
Beispiel 5
Herstellung von Antikörpern gegen Peptide
Um einen letzten Nachweis zu erbringen, dass die isolierte cDNA für eine Sequenz kodiert, die dem Proteingerüst eines L-Selectin-Liganden entspricht, stellten wir Peptide her, die von der aus der Nucleotidsequenz der isolierten Liganden-cDNA vorhergesagten Aminosäuresequenz abgeleitet waren. Die Herstellung der Peptide erfolgte mit einem Applied Biosystems-Peptid-Synthesegerät. Peptide vom N-Terminus (CAM01 : LPSKDELQMKTC), der mittleren Region des Proteins (CAM02 : CKEPSIFREELISKD) und dem C-Terminus des Proteins (CAM05 : CIISGASRITKS) wurden mit Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin über die addierten, unterstrichenen Cysteinreste gekuppelt und nach einem üblichen Immunisierungsverfahren Kaninchen injiziert. Präimmunseren und Seren von geimpften, mit einem Booster versehenen Kaninchen wurden gewonnen (die polyklonalen Antipeptid-Kaninchenseren erhielten nunmehr die Bezeichnungen CAM01, CAM02, CAM05). Die einzelnen Seren wurden auf ihre Fähigkeit zur Immunopräzipitation des mit Sulfat markierten L-Selectin-Liganden, der durch Bindung an die L-Selectin-IgG-Chimäre auf die vorstehend beschriebene Weise gereinigt worden war, getestet.
Um zu bestätigen, dass das klonierte Protein identisch war mit dem ³⁵S-markierten Material, das aus konditioniertem Medium mit der L-Selectin-IgG-Chimäre gereinigt worden war, wurde eine Immunopräzipitation des mit L-Selectin-IgG gereinigten 35S-markierten Materials durchgeführt. Das folgende Verfahren wurde für zwei getrennte Versuche herangezogen. Für die Herstellung von Immunopräzipitationsperlen wurden 25 μl gepackte Protein A-Sepharose-Perlen (Zymed Laboratories) + 25 μl Kaninchenserum + 350 μl PBS miteinander 3 Stunden bei 4°C in einem Mikroröhrchen geschüttelt. Die einzelnen Röhrchen wurden 3-mal mit PBS gewaschen, um ungebundenes Immunoglobulin zu entfernen. Dabei blieben nur die 25 μl Perlen zurück. 60 μl PBS mit einem Gehalt an etwa 6 000 cpm mit L-Selectin-IgG gereinigtem, 35S-markiertem Material wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden auf Eis inkubiert, wobei das Röhrchen alle 15 Minuten aufgewirbelt wurde. Nach 3 Stunden wurde das Mikrozentrifugenröhrchen zur Pelletisierung der Perlen zentrifugiert. 45 μl Überstand wurden entnommen und mit 15 μl 4X Laemmli-Probenpuffer vermischt und für die SDS-PAGE-Analyse einer Siedebehandlung unterzogen. Die pelletisierten Perlen wurden 3-mal mit PBS gewaschen und in ein frisches Röhrchen übertragen. Nach Dekantieren des Überstands verblieben 45 μl Endvolumen im Röhrchen. 15 μl 4X Laemmli-Probenpuffer wurden zugegeben. Die Röhrchen wurden für die SDS-PAGE-Analyse einer Siedebehandlung unterworfen. Dieser SDS-Gelansatz wurde unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die schwere Immunoglobulinkette läuft unter reduzierenden Bedingungen mit 50 kD und die markierte Bande ist komprimiert. Bei diesem Versuch tritt keines der Präimmunseren in Wechselwirkung mit der Markierung, während CAM01 und CAM05 partiell Effekte zeigen und CAM02 die Bande vollständig immunopräzipitiert. Dieser Versuch wurde mit CAM02 mit folgenden Unterschieden wiederholt. Das Gel wurde unter nicht-reduzierenden Bedingungen eingesetzt, so dass die 50 kD-Bande nicht komprimiert wurde. (Wir hatten früher festgestellt, dass das mit L-Selectin-IgG gereinigte, ³⁵S-markierte Material seine Beweglichkeit in einem SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen nicht verändert.) Ferner wurden in einem Röhrchen die mit CAM02-Antikörper beschichteten Perlen 30 Minuten auf Eis mit 1 mg/ml CAM02-Peptid vorinkubiert, um die Spezifität der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung zu zeigen. Schließlich wurde ein irrelevantes Kontrollpeptid, der Antikörper gegen das C-Terminus-Peptid von L-Selectin (mit der Bezeichnung ROSY 1 B), hergestellt ebenfalls von Caltag nach einem ähnlichen Verfahren, getestet. Beide Gele wurden der Fluorographie mit Enhance (New England Nuclear) und der Autoradiographie mit einem Kodak Xar-Film unterzogen. CAM02 immunopräzipitiert vollständig das mit L-Selectin-IgG gereinigte ³⁵S-markierte Material, während CAM02 Präimmun und ROSY 1B keine Wirkung zeigen. Das freie CAM02-Peptid blockiert die spezifische Immunopräzipitation. Die Ergebnisse sind in den 5A und B dargestellt.
Beispiel 6
Expression des L-Selectin-Liganden
6 zeigt eine Northern-Blot-Analyse der für den ~50kD-L-Selectin-Liganden kodierenden mRNA. Wie aus 6A ersichtlich ist, wird die mRNA in der polyA + -Fraktion kodiert und entspricht einer diskreten Bande von ~0,7 kD. Die Schärfe der Bande spricht gegen einen erheblichen Grad von alternativem RNA-Spleißen. Ein erneutes Screening der murinen PLN-cDNA-Bank mit dem isolierten Ligandenklon ergab keine weiteren gespleißten Formen der Message. Eine Induktion einer entzündlichen Reaktion im Drainagebereich eines Lymphknoten zeigt eine relative Abnahme der Menge an mRNA, die für den Liganden kodiert, was vermutlich auf den großen Beitrag an poly A + mRNA aus frisch wandernden Lymphozyten zurückzuführen ist. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass der Ligand während der Entzündung nicht in erheblichem Maße im PLN-HEV induziert wird, obgleich es schwierig ist, aus diesem Versuch quantitative Schlüsse zu ziehen. Eine Prüfung der Expression dieser mRNA in verschiedenen regionalen Lymphknoten zeigt, dass sie in sämtlichen regionalen PLN, die wir untersuchten, exprimiert wird (6B).
Eine Analyse der Expression der für den L-Selectin-Liganden kodierenden mRNA in einer Anzahl von verschiedenen lymphoiden und nicht-lymphoiden Geweben zeigt, dass diese Sequenz in hochgradig gewebespezifischer Weise exprimiert wird. 6C zeigt, dass die dem Liganden entsprechende mRNA in starkem Maße sowohl in mesenterischen als auch in peripheren Lymphknoten exprimiert wird. Dies stimmt mit früheren Arbeiten überein, die zeigten, dass der mit Sulfat markierte Ligand nur in diesen beiden Organen exprimiert wird. Diese Message wird auch in signifikantem Ausmaß in der Lunge und in sehr geringem Ausmaß in den Peyer-Plaques exprimiert. Die mRNA ist in einer Anzahl von nichtlymphoiden Organen nicht nachweisbar und wird auch in zwei anderen lymphoiden Organen nicht gefunden: Milz und Thymus. Dieses letztgenannte Ergebnis lässt stark darauf schließen, dass der Ligand in signifikanter Weise nur in einer Untergruppe des Gefäßsystems exprimiert wird: d. h. in den in peripheren lymphoiden Geweben auftretenden HEV.
Um nachzuweisen, dass die Liganden-mRNA in den HEV exprimiert wird, wurde eine in situ-Hybridisierung durchgeführt. Gewebe wurden einer Ligandenexpression durch in situ-Hybridisierung unter Anwendung bekannter Verfahren (Wilcox et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 2839 analysiert. Periphere Lymphknoten und Dünndarmschnitte mit einem Peyer-Plaque wurden aus Mäusen gewonnen, in Paraformaldehyd fixiert und anschließend in Saccharose getaucht. Die Gewebe wurden in OCT-Masse (Miles Scientific) eingebettet, in Isopentan eingefroren und zu 8 μm-Schnitten geschnitten. Die Schnitte wurden auf mit Vectabond beschichteten Objektträgern (Vector Laboratories) unter Auftauen montiert. Mit 35S-markierte RNA-Sonden wurden in sense- und antisense-Orientierungen unter Anwendung früher beschriebener Verfahren (Melton et al., 1984) erzeugt. Für die Hybridisierung wurden Schnitte nacheinander mit 4% Paraformaldehyd (10 min) und Proteinase K (1 μg/ml, 10 min) behandelt. Daran schloss sich eine 2-stündige Vorhybridisierung bei 42°C mit 100 μl Hybridisierungspuffer an (50% Formamid, 0,03 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1 X Denhard-Lösung, 5% Dextransulfat, 10 mM Dithiothreit). Sonden wurden in einer Endkonzentration von 8 × 10⁶ cpm/ml zugegeben und sodann über Nacht bei 55°C inkubiert. Die Objektträger wurden mit 2X SSC mit einem Gehalt an 10 mM beta-Mercaptoethanol (BME) und 1 mM EDTA gewaschen und 30 Minuten behandelt (20 μg/ml für 30 Minuten). Ein hochgradig stringenter Waschvorgang mit 0,1X SSC mit einem Gehalt an EDTA und BME wurde 2 Stunden bei 55°C durchgeführt. Sodann wurden die Objektträger in 0,5X SSC gewaschen, mit steigenden Konzentrationen an Ethanol entwässert und unter Vakuum getrocknet. Hierauf wurden die Objektträger in NTB2-Nuklearemulsion (Kodak) getaucht und 5 Wochen belassen. Sodann wurden die Objektträger entwickelt und mit Hematoxylin und Eosin gegengefärbt. Negative Kontrollen bestanden in einer Hybridisierung von seriellen Schnitten mit sense-Sonden. Wie aus 7 ersichtlich ist, hybridisiert der antisense-Strang, der durch den isolierten Liganden-cDNA-Klon kodiert wird, in klarer Weise mit den HEV von peripherem, lymphoidem Gewebe, während der sense-Strang keine signifikante Hybridisierung zeigt. Dieses Ergebnis belegt klar, dass die der Liganden-cDNA entsprechende mRNA durch HEV-Zellen synthetisiert wird, was mit früheren immunohistochemischen Daten übereinstimmt, die zeigen, dass der L-Selectin-Ligand in dieser Region der mesenterischen und peripheren Lymphknoten lokalisiert ist.
Die hier vorgelegten Daten stimmen mit der Hypothese überein, dass es sich beim endothelialen Liganden für L-Selectin um ein besonderes Glycoprotein vom Mucin-Typ handelt. Mucine sind definitionsgemäß an Serin/Threonin reiche Proteine, deren Molekulargewicht vorwiegend auf O-verknüpfte Kohlenhydrat-Seitenketten zurückzuführen ist (Cyster et al., The Embo J., Bd. 10 (1991), S. 893; M. Fukuda, Glycobiology, Bd. 1 (1991), S. 347; Gendler et al., Am. Rev. Respir. Dis., Bd. 144 (1991), S. 42 ; Gum et al., The J. of Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 22733; Porchet et al., Am. Rev. Resp. Dis., Bd. 144 (1991), S. 15). Der hohe Serin- und Threoningehalt im hier beschriebenen L-Selectin-Liganden legt es in Verbindung mit dem hohen Glycosylierungsgrad des Proteins (~70%, bezogen auf das Molekulargewicht) nahe, dass die Masse der Kohlenhydrate am Liganden tatsächlich O-verknüpft ist, und bestätigt die früheren Experimente, die die N-Glycanase-Beständigkeit des sulfatierten ~50 kD-PLN-Liganden belegen. Die Tatsache, dass die O-verknüpften Kohlenhydrate offensichtlich direkt an den durch die L-Selectin-Lectin-Domäne vermittelten Haftwechselwirkungen beteiligt sind, lässt darauf schließen, dass die Rolle des hier beschriebenen Proteingerüstes offensichtlich in einer Gerüstfunktion für die Kohlenhydratpräsentation besteht. Dieses Protein stellt somit einen neuen Typ eines Zellhaftmoleküls dar, dessen Funktion darin besteht, Kohlenhydrate in gewebespezifischer Weise der Lectin-Domäne von L-Selectin zu präsentieren. Auf diese Weise kann die regionale Expression zu einem regionalen Transport von Lymphozyten-Populationen führen.
Die Verwendung eines mucinartigen Glycoproteins als Gerüst für die Kohlenhydrat-Präsentation für ein Selectin macht im Zusammenhang mit den derzeitigen Erkenntnissen über die Mucin-Struktur Sinn. Frühere Untersuchungen über die Strukturen von hochgradig O-verknüpften Glycoproteinen, wie Mucinen, haben ergeben, dass diese Moleküle tendenziell hochgradig gestreckte, etwas stabartige Moleküle darstellen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass das Leukozyten-Oberflächenmucin Leukosialin (Sialophorin, CD43) (Cyster et al., (1991), a.a.O.; Fukuda, (1991), a.a.O.) eine starre, stabartige Struktur bildet. Physikochemische Analysen anderer Mucine haben ähnliche stabartige Konformationen bewiesen, insbesondere in den hochgradig O-glycosylierten Regionen (S. E. Harding, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Bd. 47, Academic Press, Inc. (1989), S. 345; N. Jentoft, TIBS, Bd. 15 (1990), S. 291). Ferner enthalten andere Nichtmucin-Proteine, z. B. der abbaubeschleunigende Faktor (DAF) und der Rezeptor für Lipoprotein geringer Dichte (LDL) hochgradig O-verknüpfte Domänen nahe der Zelloberfläche, die offensichtlich stabartige Domänen bilden, die eine Erweiterung der Rezeptoren durch den Glycocalyx bewirken können (Jentoft, (1990), a.a.O.). Diese stabartige Struktur entspricht genau den Erwartungen für ein Molekül, dessen Rolle darin besteht, Kohlenhydrate der Lectin-Domäne eines Selectins zu präsentieren. Wie in dem in 6 dargestellten Modell gezeigt, kann man sich den L-Selectin-Liganden als "Flaschenbürste" vorstellen, der sich in das Lumen der HEV erstreckt. Dies würde es einer großen Anzahl an O-verknüpften Kohlenhydrat-Liganden (die Borsten an der Bürste) erlauben, sich der an der Lymphozytenoberfläche lokalisierten L-Selectin-Lectin-Domäne zu präsentieren und somit eine Haftung an das Endothel zu vermitteln. Die offensichtliche Clusterbildung dieser Kohlenhydrate unter Bildung von zwei Domänen am Liganden lässt darauf schließen, dass sie in polyvalenter Weise präsentiert werden können, um die Bindungsavidität der Lymphozyten-HEV-Haftwechselwirkung zu verstärken. Die mucinartige Natur des L-Selectin-Liganden kann somit bewirken, dass polyvalente Kohlenhydrat-Liganden der L-Selectin-Lectin-Domäne über eine erweiterte, stabartige Plattform präsentiert werden. Wenn diese Annahme zutreffend ist, würde dies einen neuartigen Mechanismus der Zellhaftung im Immunsystem definieren.
Die hier beschriebene Expressionsanalyse lässt darauf schließen, dass die Regulation des regionalen Lymphozyten-Verkehrs, die durch L-Selectin vermittelt wird, auf die gewebespezifische Expression der Liganden-mRNA zurückzuführen ist. Wir stellten fest, dass nur solche Gewebe, für die früher eine Vermittlung von Lymphozyten-HEV-Wechselwirkungen über L-Selectin angegeben wurde, hohe Konzentrationen der mRNA für den Liganden exprimierten, obgleich die äußerst geringe Konzentration an mRNA in Peyer-Plaques etwas überraschte (Gallatin, Cell, Bd. 44 (1986), S. 673; Butcher, Am. J. Pathol., Bd. 136 (1990), S. 3; Imai et al., J. Cell Biol., Bd. 113 (1991), S. 1213; Streeter et al., J. Cell Biol., Bd. 107 (1988b), S. 1853; Woodruff et al., Annu. Rev. Immunol., Bd. 5 (1987), S. 201). Diese Ergebnisse stimmen mit der Möglichkeit überein, dass ein regionaler Verkehr zumindest teilweise durch die transkriptionale Aktivierung der hier beschriebenen Liganden-mRNA gesteuert wird, und legen es nahe, dass exogene Faktoren möglicherweise die durch L-Selectin vermittelte Haftung durch eine Kontrolle der Transkription des Liganden-Gens regulieren. Selbstverständlich reicht das Proteingerüst des Liganden nicht zur Vermittlung der L-Selectin-Haftung aus. Es ist möglich, dass die Gene, die die Glycosyl-transferasen, die bei der Herstellung der an diesem Gerüst gefundenen Kohlenhydratliganden beteiligt sind, steuern, ebenfalls transkriptional reguliert werden können. Diese letztgenannte Möglichkeit kann nunmehr durch Überprüfung der Aktivität des Liganden-Glycoproteins, das durch die hier beschriebene Expression der cDNA in nicht-HEV-Zellen gebildet wird, getestet werden. An einem weiteren Regulationsniveau können die Mechanismen beteiligt sein, durch die der ~50 kD-Ligand die geeigneten, für L-Selectin spezifischen Kohlenhydrat-Seitenketten aufnimmt, während dies für andere O-verknüpfte Glycoproteine nicht der Fall ist. Die Möglichkeit, dass der hier beschriebene L-Selectin-Ligand ektopisch an chronischen oder akuten Entzündungsstellen exprimiert wird, um einen Transport von Lymphozyten oder Neutrophilen zu vermitteln, ist noch zu untersuchen (Watson et al., Nature, Bd. 349 (1991), S. 164). Es ist möglich, dass der äußerst geringe Grad der Liganden-mRNA-Expression, der im Peyer-Plaque nachgewiesen wurde, einen Hinweis auf eine derartige regulierbare ektopische Expression darstellt.
Obgleich es klar ist, dass der hier beschriebene ~50 kD-Ligand bereitwillig über Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen an L-Selectin haftet, muss der Mechanismus, durch den dieser Ligand eine Assoziation mit der endothelialen Zelloberfläche eingeht, erst noch ermittelt werden. Bei der hier festgestellten raschen Ablösung kann es sich um einen Artefakt einer Organkultur handeln, wobei aber andere Daten, die belegen, dass eine aktive Ablösung des Liganden aus Rinderserum (J. Gilbert, unveröffentlichte Feststellungen) oder Mäuseserum (S. Watson, unveröffentlichte Feststellungen) gereinigt werden kann, darauf schließen lassen, dass dieser Ligand in vivo abgelöst wird. Von einer Anzahl von weiteren Zelloberflächen-Haftmolekülen, einschließlich L- und P-Selectinen (Johnston et al., Cell, Bd. 56 (1989), S. 1033 und ICAM 1 (Rothlein et al., J. Immunol., Bd. 147 (1991), S. 3788) wurde festgestellt, dass sie abgelöst werden. Es hat den Anschein, dass die Ablösung von physiologischer Bedeutung ist. Die hier beschriebene rasche Ablösung lässt auf eine relative lose Assoziation mit der luminalen HEV-Oberfläche schließen. Eine derartige Assoziation könnte durch die vorstehend beschriebene und im Modell, das in 8 dargestellt ist, gezeigte amphipathische Helix vermittelt werden. Diese helikale Region könnte die Membran spannen und gleichzeitig eine Membranhaftung und die Bildung von oligomeren Formen des Liganden vermitteln. Die Tatsache, dass der Ligand zur Oligomerisierung befähigt ist, wurde bei Gelfiltrationsversuchen festgestellt (Y. Imai und S. Rosen, unveröffentlichte Feststellungen). Von einer Anzahl von weiteren Proteinen wurde festgestellt, dass sie amphipathische Helices für die Membranassoziation und Porenbildung verwenden (Haffar et al., J. Cell Biol., Bd. 107 (1988), S. 1677; Eisenberg et al., J. Mol. Biol., Bd. 179 (1984), S. 125; Finer-Moore und Stroud, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 155). Daher ist es möglich, dass diese Domäne auf ähnliche Weise wie der L-Selectin-Ligand wirkt. Eine alternative Hypothese besteht darin, dass die amphipathische Helix in schwache Wechselwirkung mit einem anderen Protein treten könnte, das fester mit der endothelialen Zelloberfläche assoziiert ist. Ferner ist es möglich, dass der Ligand in den Glycocalyx in einer gegenwärtig schlecht definierten Art und Weise eingebaut wird. Eine letzte Möglichkeit besteht darin, dass mehrere HEV-Liganden vorliegen, die an die L-Selectin-Lectin-Domäne binden, wobei einige fest mit der endothelialen Zelloberfläche assoziiert sind, wie der von Imai et al., (1991), a.a.O., beschriebene sulfatierte ~90 kD-Ligand oder die von Streeter et al., J. Cell Biol., Bd. 107 (1988b), S. 1853, beschriebenen PLN-Addressine und andere Produkte, wie der hier beschriebene ~50 kD-Ligand, die abgelöst werden.
Die Beziehung zwischen dem hier beschriebenen mucinartigen, endothelialen Liganden und der früher beschriebenen Gruppe von Proteinen, die durch den monoklonalen Antikörper MECA 79 definiert wird (die pln-"Addressine" (Streeter et al., Nature (London), Bd. 331, S. 41; J. Cell Biol., Bd. 107 (1988), S. 1853; Berg et al., Immunol. Rev., Bd. 108 (1991), S. 5) ist noch zu bestimmen. Imai et al. (1991), a.a.O., zeigten früher, dass der hier beschriebene Ligand durch den MECA 79-Antikörper (ein Antikörper, der an eine unbekannte Kohlenhydrat-Determinante bindet) erkannt wird, jedoch haben Streeter et al. (1988b), a.a.O.; und Berg et al. (1991), a.a.O., gezeigt, dass eine Anzahl von weiteren Glycoproteinen offensichtlich ebenfalls dieses kohlenhydratartige Epitop exprimiert. Es ist daher möglich, dass weitere endotheliale Glycoproteine existieren, die der L-Selectin-Lectin-Domäne ein Kohlenhydrat präsentieren. Die Entwicklung von monoklonalen Antikörper-Reagenzien, die für den hier beschriebenen mucinartigen Liganden spezifisch sind, wird daher von großer Bedeutung sein, da sie es ermöglichen, den relativen Beitrag dieses Glycoproteins (verglichen mit anderen haftenden Liganden) zum durch L-Selectin vermittelten Transport zu bestimmen.
Der ~50 kD L-Selectin-Ligand stellt den vierten Molekültyp dar, der an der Zellhaftung im Immunsystem beteiligt ist: 1) die Leukozyten-Integrine, 2) deren Liganden, die Mitglieder der Immunoglobulin (Ig)-Superfamilie, 3) die Selectine und 4) der ~50 kD L-Selectin-Ligand. Von den Integrinen, den Mitgliedern der Ig-Superfamilie und den Selectinen wurde durchweg festgestellt, dass sie Familien mit einer Reihe von verwandten Molekülen enthalten. Aufgrund der Eigenschaften des hier beschriebenen Liganden schlagen wir vor, die in der vorliegende Anmeldung verwendete umständliche Nomenklatur durch den stärker beschreibenden Ausdruck GLYCAM 1 (von der Glycosylierung abhängiges Zellhaftmolekül) zu ersetzen.

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit einer sterischen Struktur kodiert, die die Präsentation eines Selectin bindenden Restes mit der Fähigkeit zur Bindung eines L-Selectins ermöglicht, und wobei die Nucleotidsequenz zur Hybridisierung unter wenig stringenten Bedingungen an das Komplement einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz von 4 kodiert, befähigt ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Selectin-Liganden-Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zu mehr als etwa 40% homolog mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz ist, kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, bei dem es sich um einen cDNA-Klon handelt, der eine für die Aminosäuren 42 bis 63 oder 93 bis 122 der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz kodierende Nucleotidsequenz umfasst.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend eine für einen L-Selectin-Liganden kodierende Nucleotidsequenz.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, umfassend die kodierende Region der in 4 dargestellten Nucleotidsequenz.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das mit einer Nucleotidsequenz fusioniert ist, die für eine konstante Immunoglobulin-Domäne kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei es sich beim Immunoglobulin um IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD oder IgM handelt.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, ferner umfassend einen Promotor, der funktionell mit der Kodierungsregion der in 4 dargestellten Nucleotidsequenz verknüpft ist.
Expressionsvehikel, das eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 umfasst und zu deren Expression in einer rekombinanten Wirtszelle befähigt ist, in funktioneller Verknüpfung mit Kontrollsequenzen, die von einer mit dem Vehikel transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, transfomiert mit dem Expressionsvehikel nach Anspruch 9.
Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei es sich um eine eukaryontische Zelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei es sich um eine Säugetierzelle handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 12, die aus der humanen, embryonalen Nieren-Zelllinie 293S stammt.
Verfahren zur Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 10 in einem geeigneten Kulturmedium zur Expression eines L-Selectin-Liganden.
Verfahren nach Anspruch 14, ferner umfassend das Gewinnen des L-Selectin-Liganden aus der Kultur.
Isoliertes L-Selectin-Liganden-Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von 4.
L-Selectin-Liganden-Polypeptid nach Anspruch 16, bei dem es sich um ein Glycoprotein handelt.
Glycoprotein nach Anspruch 17 mit einem Molekulargewicht von etwa 50 kD.
Isoliertes L-Selectin-Liganden-Polypeptid tierischen Ursprungs, das aber nicht von der Maus stammt, oder eine Variante dieses Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nucleinsäure kodiert wird, die unter wenig stringenten Bedingungen zur Hybridisierung mit dem Komplement einer Nucleotidsequenz, die für das Protein mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, befähigt ist.
Polypeptid nach Anspruch 19, wobei es sich bei den wenig stringenten Bedingungen um eine Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung, die folgendes umfasst, handelt: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, einer Scherbehandlung unterworfene Lachssperma-DNA.
Polypeptid nach Anspruch 19, bei dem es sich um einen nativen L-Selectin-Liganden handelt, der im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen der gleichen Tierspezies, in der er natürlicherweise vorkommt.
Polypeptid nach Anspruch 19, ferner umfassend eine konstante Immunoglobulin-Domänensequenz.
Zusammensetzung, umfassend eine Menge eines L-Selectin-Liganden-Polypeptids nach Anspruch 19, das bei der Blockierung der Bindung eines entsprechenden L-Selectin-Rezeptors an seinen nativen Liganden an einer Endothelzelle wirksam ist, in Verbindung mit einem nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Excipienten.
Verwendung eines L-Selectin-Liganden-Polypeptids nach Anspruch 19 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Symptoms oder Zustands, der mit einer übermäßigen Bindung von zirkulierenden Leukozyten an Endothelzellen verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Polypeptid in einer Menge verabreicht wird, die eine Blockierung der Bindung von an einem zirkulierenden Leukozyten befindlichen L-Selectin an einen endothelialen Liganden von L-Selectin bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 25, ferner umfassend die Verabreichung eines entzündungshemmenden oder antineoplastischen Arzneistoffes.
Antikörper, der mit dem Proteinteil eines L-Selectin-Liganden-Polypeptids nach Anspruch 19 immunreaktiv ist.
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Nucleotidsequenz, die für ein L-Selectin-Liganden-Polypeptid nach Anspruch 19 kodiert, umfassend a) das Hybridisieren einer Nucleinsäure, die für das Protein mit der in 4 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert, mit einer Testprobe einer Nucleinsäure; und b) Nachweisen einer Hybridisierung zur Feststellung der Anwesenheit der Nucleotidsequenz in der Probe.
Verfahren zur Reinigung eines L-Selectin-Liganden-Polypeptids nach Anspruch 19, umfassend die Verwendung einer Chimäre, die das entsprechende L-Selectin und eine schwere Immunoglobulin-Kettensequenz umfasst.
Verfahren zum Präsentieren eines L-Selectin-Bindungsrestes gegenüber einem entsprechenden L-Selectin, das die Bindung des Restes an das L-Selectin-Liganden-Polypeptid nach Anspruch 19 umfasst.