DE69511245T2

DE69511245T2 - Zusammensetzung und verfahren zur verhinderung und behandlung von entzündung mit immunoglobin a

Info

Publication number: DE69511245T2
Application number: DE69511245T
Authority: DE
Inventors: Martha Eibl; Heinz Leibl; Yendra Linnau; Josef W. Mannhalter; Herrmann Wolf
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-16
Publication date: 1999-12-16
Anticipated expiration: 2015-02-17
Also published as: US5833984A; EP0744957A1; DE69511245D1; GR3031691T3; CA2183566A1; WO1995022350A1; DK0744957T3; DE19505287A1; ITTO950112A1; AU1809495A; JPH09509164A; ITTO950112A0; ATE182793T1; EP0744957B1; IT1281188B1; ATA29495A; AT402790B; ES2135703T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prävention und Behandlung von sowohl akuten als auch chronischen Entzündungsreaktionen durch Verabreichung eines pharmazeutischen Präparats mit Immunglobulin A ("IgA"). Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines pharmazeutischen Präparats mit multimerem IgA zur Behandlung, Abwendung oder Verbesserung solcher Entzündungsreaktionen, auch im Verlauf einer Impfung. Ferner betrifft die Erfindung einen in vitro Test zur Untersuchung der antientzündlichen und immunmodulierenden Aktivität einer Substanz.
Gesundheitsschädliche entzündliche Vorfälle können im ganzen Körper auftreten. Zum Beispiel können Vorfälle an den Schleimhäuten auftreten, wie z. B. eine Entzündung der oberen Atemwege und eine Stomatitis Aphtosa. Entzündungen können auch überall in den Atemwegen sowie im Gastrointestinal- Trakt vorkommen. Einige Entzündungen der Schleimhäute werden nicht direkt durch ein infektiöses Agens vermittelt, sondern entstehen durch Überreaktion des Immunsystems bei der Reaktion auf eine mikrobielle Infektion. Beispielhafte Krankheiten sind die akute obstruktive Bronchitis und durch Asthma verschärfte Infektionen der Atemwege.
Eine gesundheitsschädliche Entzündung kann an anderen Orten als den Schleimhäuten auftreten. Erkrankungen solcher nicht-mukosaler Stellen umfassen die rheumatische Arthritis (systemische juvenile rheumatoide Arthritis und Schuppenflechten-Arthritis), Reiters Syndrom, die ankylosierende Spondylitis, Crohns und Whipples Krankheit mit Arthritis und systemische Lupus Erythematosus.
Eine gesundheitsschädliche Entzündung ist im allgemeinen das Ergebnis unkontrollierter Reaktionen des Immunsystems. Bestimmte Antigene spielen im Entzündungsprozeß eine Rolle und verursachen dadurch Schäden. Zum Beispiel werden die meisten toxischen Wirkungen einer systemischen Gram-negativen Infektion und Endotoxämie durch die Wechselwirkung mit Zellen des Immunsystems, insbesondere Makrophagen, vermittelt. Zellen der Monocyten/Macrophagen-Linie sind die Hauptquelle für entzündliche Cytokine wie z. B. Tumor-Nekrose-Faktor-alpha ("TNF-α") und Interleukin 6 ("IL-6").
Die entzündlichen Cytokine werden als Reaktion auf eine Vielzahl von biologischen Reizen erzeugt, wie z. B. Lipopolysaccharide ("LPS") aus Gramnegativen Bakterien. TNF-α und IL-6 spielen eine zentrale Rolle bei vielen Effektor-Funktionen und zellulären Wechselwirkungen, die notwendig sind, um eine wirksame Antwort des Wirts während der Entzündung und Immunantwort auszulösen. Eine unkontrollierte Erzeugung von entzündlichen Cytokinen ist jedoch schädlich für den Wirt. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß eine unkontrollierte, LPS-induzierte Freisetzung von TNF-α ein zentraler Vermittler der LPS-induzierten Toxizität, einschließlich des Gram-negativen endotoxischen Schocks, ist.
Die Injektion hoher Dosen von TNF-α in Ratten oder Mäuse erzeugt die Symptome und Letalität des septischen Schocks. Darüber hinaus korrelieren hohe TNF-α-Spiegel im Serum mit der Mortalität von Personen mit Meningokokken oder septischem Schock. Hohe Spiegel an TNF-α wurden auch in Neugeborenen mit nekrotisierender Enterocolitis gefunden, so daß angenommen wird, daß TNF-α an der Pathogenese dieser Krankheit beteiligt ist. Tatsächlich lösen die Gabe von Endotoxin und die Verabreichung von TNF-α in einem experimentellen Modell der nekrotisierenden Neugeborenen-Enterocolitis eine Darm-Nekrose aus. Erhöhte Spiegel an IL-6 wurden in einer Vielzahl klinischer Zustände gefunden, einschließlich der bakteriellen und viralen Meningitis und HIV-Infektion. Es ist bekannt, daß Endotoxine die Synthese von IL-6 auslösen, und daß der IL-6-Spiegel im Serum bei Zuständen erhöht ist, die mit Endotoxämie verbunden sind, wie z. B. einer thermischen Verletzung. Die schädlichen Wirkungen bakterieller Toxine sind verbunden mit der übersteigerten und selbstverstärkenden Freisetzung dieser Verbindungen, die eine Entzündung, oft mit tödlichem Ausgang, auslösen. Die Letalität der Gram-negativen Bakteriämie oder Endotoxämie kann durch Verabreichung spezifischer Anti-TNF-Antikörper verhindert werden.
Die verschiedenen Komponenten des Immunsystems sind an entzündlichen Erscheinungen beteiligt. Zu den Hauptkomponenten des Immunsystems gehören die Immunglobuline. Pharmazeutische Präparate mit Immunglobulinen wurden bereits früher zur Prophylaxe und Behandlung von bakteriellen und viralen Infektionen angewendet. Zum Beispiel wurde in US-Patent Nr. 4,335,099 ein orales Präparat mit IgA und Immunglobulin G ("IgG") zur Behandlung von Darminfektionen verwendet. Außerdem können Präparate mit 73% IgA und 26% IgG, bezogen auf den Gesamtgehalt an Immunglobulin, das Auftreten einer nekrotisierenden Enterocolitis einschränken, wenn sie Säuglingen mit geringem Geburtsgewicht prophylaktisch verabreicht werden. Siehe hierzu Eibl et al., J. Clin. Imm. 10(6): 72S-79S (1990). Man nimmt an, daß dieser Effekt auf der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes beruht, die durch den hohen Gehalt an Antikörpern gegen eine Vielzahl potentieller Pathogene und ihrer Toxine verursacht wird. Diese Pathogene umfassen Bakterien, die Pertussis, Tetanus und Diphtherie auslösen, und Viren, wie z. B. Poliovirus, Coxsackie-Virus, Rotavirus und Echovirus.
Es wurde gezeigt, daß IgA, IgG und Transferrin synergistisch gegen bakterielles Wachstum wirken (siehe EP 0 506 651). Die Anteile der aktiven Komponenten liegen zwischen 0,40 und 0,80 Gew. Teilen IgG und 0,15 bis 0,45 Gew. Teilen Transferrin pro Gew. Teil IgA.
Es wurde gezeigt, daß IgG, IgA und IgM synergistisch wirken mit anderen pharmakologisch aktiven Verbindungen, wie z. B. Antibiotika. Wahrscheinlich binden diese Immunglobuline an die entzündlichen Mikroorganismen, was zur Agglutination und Auslösung der Phagocytose führt. Siehe hierzu EP 0 168 830.
Es ist daher wohlbekannt, daß Immunglobuline nützlich sein können, weil ein spezifischer Antikörper ein spezifisches Antigen erkennt und bindet, um dieses Antigen zu neutralisieren.
Man dachte jedoch, daß bestimmte Immunkomplexe eine Rolle bei bestimmten Entzündungsprozessen spielen. Zum Beispiel wurde die Entdeckung von IgA-Immunkomplexen in Personen beschrieben, die unter entzündlichen Darmerkrankungen und ankylosierender Spondylitis leiden. Die unter diesen Krankheiten leidenden Personen hatten hohe Konzentrationen an Serum-IgA und an zirkulierenden IgA-Immunkomplexen. Siehe hierzu Peeters et al., Ann Rheumat. Dis. 49: 630-640 (1990).
Es wurde gefunden, daß Präparate mit bestimmten IgG-Antikörpern vor einer durch eine Staphylokokken-Infektion ausgelösten systemischen Krankheit schützen, indem sie die durch die bakteriellen Toxine (Superantigene) ausgelöste T-Zell-Aktivierung hemmen. Siehe hierzu Takei et al., J. Clin. Invest. 91: 602-607 (1993). Diese schützende Wirkung der IgG-Präparate kann durch neutralisierende Antikörper abgeschwächt werden. Diese Antikörper wirken wahrscheinlich durch Hemmung der Aktivierung der T-Zelle durch das bakterielle Superantigen, das sonst zur Ausbreitung und Verstärkung einer systemischen Entzündungsreaktion führen könnte. Nach der Anti-Superantigen- Hypothese kann es somit möglich sein, bestimmte IgG-Antikörper gegen verschiedene immunologische Krankheiten zu verwenden, die keine Antikörper- Mangel-Störungen sind. Siehe hierzu Rich, J. Clin. Invest. 91: 378 (1993).
Das andere vorherrschende Immunglobulin, IgA, spielt ebenfalls eine wichtige Rolle im Immunsystem. Zum Beispiel spielt sekretorisches IgA ("SIgA") eine Hauptrolle beim Schutz des Wirts vor Infektionen mit pathogenen Organismen, die durch die Schleimhäute der Atemwege, des Gastrointestinal- und des Urogenital-Trakts eindringen. IgA-Antikörper nehmen teil an der Beseitigung von pathogenen bakteriellen, viralen oder parasitären Organismen und von vielen verschluckten oder inhalierten Antigenen aus den Schleimhäuten, indem sie Toxine und virale Teilchen neutralisieren, die Anhaftung baktiereller Pathogene hemmen und die Kolonisierung und Durchdringung der Schleimhäute durch pathogene Mikroorganismen verhindern.
Die antiinfektiösen Wirkungen von Präparaten mit IgA, die praktisch kein IgG enthalten, wurden offenbart in den japanischen Patentveröffentlichungen Sho 56-53622 und Sho 57-59815. Diese Präparate enthalten 92% IgA und 6% IgG. Diese Präparate senken die durch Pseudomonas aeruginosa verursachte Sterblichkeit von Mäusen. Diese Präparate enthalten monomeres IgA und haben eine neutralisierende Wirkung auf Rotavirus, Escherichia coli und Salmonella typhi. Untersuchungen mit verschiedenen Präparaten zeigten, daß ein insgesamt niedriger IgG-Gehalt im allgemeinen mit stärkeren antiinfektiösen Effekten korreliert.
Verfahren zum Erhalt Von IgA sind wohlbekannt. Zum Beispiel wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulin-Präparats mit mehr als 10% IgA durch Ionenaustausch-Chromatographie in DE 39 27 111 C2 offenbart. Wenn die Elutionsbedingungen so gewählt sind, daß IgM ausgeschlossen wird, kann man ein Produkt mit 30-60 % IgA und 70-40% IgG erhalten. Die antikomplementäre Aktivität dieses Präparats ist relativ gering.
Frühere Verfahren zum Erhalt von IgA aus Serum waren auf die Vermeidung einer Polymerisation des Immunglobulins gerichtet, um die Bildung von multimerem IgA zu verhindern. Selbst bei der Isolierung von SIgA, das dimer vorliegt, wird eine Polymerisation von IgA normalerweise vermieden. Die monomere Fraktion von SIgA wurde bisher als die wertvollste betrachtet. Ein Verfahren zur Herstellung eines SIgA-Präparats ist in EP 0 479 597 A2 beschrieben.
Stabilisatoren wurden verwendet, um monomeres IgA in Ausbeuten von ca. 80% zu erhalten. Immunglobulin-Polymere wurden dann durch fraktionierte Fällung mit Polyethylenglycol abgetrennt. Die Vermeidung von multimerem IgA im bisherigen Stand der Technik hat jedoch die klinische Anwendung von IgA begrenzt. Diese begrenzte Anwendung ist das Ergebnis von konkurrierenden Erwägungen zur viralen Inaktivierung und Vermeidung der Polymerisation.
Zum Beispiel wird ein IgA-Präparat normalerweise auf ca. 60ºC erhitzt, um kontaminierende Viren zu inaktivieren. Dieses Erhitzen verursacht auch eine Denaturierung des Immunglobulins und eine anschließende Polymerisation unter Bildung von IgA-Multimeren. Um die Polymerisation während der viralen Inaktivierung zu vermeiden, wurden der Immunglobulin-haltigen Lösung Stabilisatoren zugesetzt. Die Stabilisatoren stabilisieren jedoch auch die kontaminierenden Viren und schützen sie hierdurch vor Inaktivierung.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Präparats umfassend IgA zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Verhinderung, Behandlung oder Verbesserung von Entzündungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das besagte Präparat im wesentlichen kein IgG oder polymeres IgG. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das besagte IgA multimeres IgA.
Das oben genannte Präparat umfaßt bevorzugt auch eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antibiotika, antiphlogistischen Mitteln und Mitteln gegen Magensäure. Die Erfindung betrifft auch ein antientzündliches Kit, welches umfaßt: ein Präparat umfassend IgA in einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Anweisungen für die Verabreichung von IgA zur Verhinderung oder Behandlung von Entzündungen. Die Anweisungen können auch Dosierungen und Verabreichungswege enthalten. Das besagte IgA umfaßt bevorzugt multimeres IgA. Außerdem kann das antientzündliche Kit auch eine Verbindung enthalten, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antibiotika, antiphlogistischen Mitteln und Mitteln gegen Magensäure. Das Präparat des antientzündlichen Kits ist bevorzugt virussicher. Kontaminierende Viren werden bevorzugt durch Hitzebehandlung inaktiviert.
Die Erfindung betrifft auch ein antientzündliches Präparat umfassend multimeres IgA, das im wesentlichen kein IgG enthält.
Die Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Untersuchung der antientzündlichen Aktivität eines Immunglobulins bereit, welches die Schritte umfaßt: Inkubation in vitro von Cytokin-produzierenden Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monocyten, Lymphocyten und Granulocyten, in Gegenwart eines Entzündungsreizes, wie z. B. eines Antigens aus inaktivierten Bakterien (Haemophilus influenzae), und des besagten Immunglobulins in einem serumfreien Medium; und Untersuchung der Zellen aus dem Inkubationsschritt in Bezug auf die Erzeugung von entzündlichen Cytokinen.
Die untersuchten Cytokine umfassen bevorzugt TNF-α, TNF-β, IL-1 oder IL-6. Bevorzugt werden die Ergebnisse verglichen mit der Cytokin-Erzeugung einer Kontrolle, wie z. B. Monocyten, die dem Entzündungsreiz, nicht aber der Testsubstanz ausgesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von IgA und einem Antigen zur Herstellung eines Impfstoffs. Die Verabreichung kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Bevorzugt umfaßt der Impfstoff auch ein Adjuvans. Das IgA kann multimeres IgA umfassen. Bevorzugt enthält das Präparat, das IgA umfaßt, im wesentlichen kein IgG.
Zusätzlich stellt die Erfindung ein Präparat zur Impfung bereit, das ein Antigen und IgA umfaßt. Das IgA umfaßt bevorzugt multimeres IgA. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Präparat im wesentlichen kein IgG. Das Präparat zur Impfung kann außerdem ein Adjuvans umfassen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Präparats, das IgA umfaßt, zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Immunmodulation. Das IgA umfaßt bevorzugt multimeres IgA. Schließlich stellt die Erfindung ein Immunmodulations-Kit bereit, das ein IgA umfassendes Präparat in einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Anleitungen zur Verabreichung von IgA für die Immunmodulation umfaßt. Das IgA umfaßt bevorzugt multimeres IgA.
Alle Komponenten oder Präparate sollten behandelt werden, um potentiell kontaminierende pathogene Mikroben, wie z. B. Viren im Blut, zu entfernen oder zu inaktivieren. Andere Gegenstände, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden offensichtlich aus der folgenden Beschreibung, den Tabellen und Abbildungen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt in graphischer Form, daß humanes Serum-IgA die Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus humanen Monocyten, die mit Haemophilus influenza Typ B aktiviert wurden, herunterreguliert.
Fig. 2 zeigt in graphischer Form, daß humanes Serum-IgA die Hib-induzierte Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus humanen Monocyten herunterreguliert, wohingegen die Erzeugung von GM-CSF nach Hib-Stimulation unverändert bleibt.
Fig. 3 zeigt in graphischer Form den Einfluß von humanem Serum-IgA auf die Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus Monocyten, die mit gereinigtem LPS stimuliert wurden.
Fig. 4 zeigt in graphischer Form den Einfluß von multimerem (hitzeaggregiertem) und monomerem IgA auf die Freisetzung von Cytokinen.
Fig. 5 zeigt in graphischer Form, daß humanes Serum-IgA die Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus humanen Monocyten herunterreguliert, wohingegen humanes Serum-IgG keinen Einfluß hat.
Fig. 6 zeigt in graphischer Form die Bindung von IgA- und IgG-Antikörpern an Haemophilus influenza Typ B.
Fig. 7 zeigt in graphischer Form den Einfluß von humanem Serum-IgA auf die Induktion und Freisetzung von Cytokinen in/aus Monocyten, die mit Hib stimuliert wurden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Angesichts der Konsequenzen von gesundheitsschädlichen Entzündungen werden Mechanismen gebraucht, um die lokalen und systemischen schädlichen Folgen, die mit akuten chronischen Entzündungen verbunden sind, herunterzuregulieren. Die vorliegende Erfindung macht sich eine vorteilhafte und bisher unbekannte Eigenschaft von IgA zu Nutze, um gesundheitsschädliche Entzündungsreaktionen zu verhindern oder zu behandeln. Diese Eigenschaft unterscheidet sich von dem wohlbekannten Modell der Antikörper-Neutralisierung spezifischer fremder Antigene. Die Existenz dieser Eigenschaft und die Nützlichkeit von IgA als einer antientzündlichen Substanz waren überraschend im Hinblick auf die Entdeckungen von Peeters et al., loc. cit. und anderen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Zusammensetzungen und die Methodologie zur Verhinderung oder Behandlung von akuten und chronischen Entzündungsreaktionen, wie z. B. generalisierter oder lokalisierter Entzündungsreaktionen, mit einer wirksamen Menge von IgA.
Immunglobulin A kann prophylaktisch Personen verabreicht werden, bei denen sich eine Entzündung auszubilden droht. Diese Personen schließen diejenigen ein, die geimpft werden sollen oder kürzlich geimpft wurden oder auf andere Art Entzündungsreizen oder Cytokinen ausgesetzt waren. Die prophylaktische Gabe von IgA sollte dem Beginn der schädlichen Entzündungsreaktionen entgegenarbeiten oder ihn verringern.
Bei der prophylaktischen Anwendung sollten die Personen das IgA vor der Exposition des Entzündungsreizes oder unmittelbar nach dessen Exposition erhalten. Im Fall von allergischen Erkrankungen wie Rhinitis allergica sollten die Personen z. B. behandelt werden, bevor sie den Allergenen, wie z. B. Pollen, ausgesetzt werden. Außerdem sollten Personen, denen Infektionen der oberen Atemwege mit begleitender Entzündung drohen, während der allgemeinen Erkältungszeit wiederholt IgA bekommen.
Immunglobulin A kann auch Personen verabreicht werden, die bereits unter gesundheitsschädlichen Entzündungsreaktionen leiden. Entzündungsreaktionen können auftreten bei Personen, die von Bienen gestochen wurden oder auf andere Weise Entzündungsreizen ausgesetzt waren. In diesem Zusam menhang sollte IgA die ablaufenden Entzündungsreaktionen heilen, verbessern oder minimieren.
Die Verabreichung von IgA kann auf lokalen, oralen oder systemischen Wegen erfolgen. Es wird bevorzugt, IgA in einem pharmazeutischen Präparat zu verwenden, das im wesentlichen kein IgG enthält. Bevorzugt wird auch die Verwendung eines Präparats, das multimeres IgA enthält. Die Gegenwart von IgM sollte ebenfalls minimiert oder ganz ausgeschlossen werden.
Die Dosierung ist abhängig vom Weg und von der Frequenz der Verabreichung sowie vom Ausmaß und von der Ursache der Entzündung. Wenn hohe Gesamtdosen von IgA verabreicht werden sollen, wird oft bevorzugt, das IgA im Verlauf des Tages in mehreren kleinen Mengen zu verabreichen. Diese Überlegungen zur Dosierung und zum Verabreichungsweg können vom Fachmann leicht angestellt werden.
Zum Beispiel kann IgA oral verabreicht werden (normalerweise 1 bis 10 g/Tag oder in schweren Fällen mehr), bevorzugt in 3 oder mehr Dosen, die in Begleitung eines Mittels gegen Magensäure gegeben werden.
Außerdem kann IgA auf Wegen wie z. B. der intravenösen Injektionen systemisch verabreicht werden (per Bolus, kontinuierlicher Infusion oder beidem). Normalerweise werden 50 bis 2.000 mg IgA/kg/Tag verabreicht. In seltenen Fällen können intramuskuläre Verabreichungen erfolgen, normalerweise in einer Dosierung von ca. 50 bis 100 mg IgA/kg/Tag.
Immunglobulin A kann auch lokal auf Verabreichungswegen wie z. B. der Inhalation (bis zu 10 ml/Tag, 10 bis 100 mg IgA/ml; nasal: 50 bis 200 mg/ml mit Sprays oder Tropfen) oder der intraartikulären Injektion (je nach Bedarf 1-5 ml mit 10 bis 100 mg IgA/ml) verabreicht werden. Andere Verabreichungswege schließen Zäpfchen (100 bis 1.000 mg IgA/Dosis) und transdermale Pflaster ein. Transdermale Pflaster können auch verwendet werden, um Hautentzündungen zu behandeln (Psoriasis oder Akne).
Bisher nahm man an, daß die Wirkung von IgA gegen Pathogene nur durch spezifische Antikörper vermittelt wird. Zum Beispiel war bekannt, daß Antikörper an der Hemmung der mikrobiellen Anhaftung und an der Neutralisierung von bakteriellen Toxinen und Viruspartikeln beteiligt sind. Die Entdeckung einer allgemeinen antientzündlichen und immunmodulierenden Wirkung von IgA war daher überraschend. Im Gegensatz zu der bisherigen Hypothese bezüglich der Anti-Superantigen-Wirkung bestimmter IgG-Antikörper hat IgG in parallelen Versuchen keine dem IgA vergleichbare Wirkung. Vielmehr scheint IgG die entzündliche Wirkung zu verstärken, was unerwünscht ist. Bevorzugt wird daher die Verwendung von IgA, das im wesentlichen kein IgG enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Prophylaxe und Therapie von Entzündungsreaktionen, daß IgA einer bedürftigen Person verabreicht wird. Eine solche Person ist diejenige, die zu Entzündungen neigt oder bereits schädliche Entzündungsvorgänge erduldet. Einer solcher Person kann auch ein geeignetes Antibiotikum und/oder Antiphlogistikum verabreicht werden. In einigen Situationen kann auch ein Mittel gegen Magensäure einbezogen werden. Eine oder mehrere dieser Komponenten können zusammen mit geeigneten Anweisungen verpackt werden, die Dosierungen und Verabreichungsvorschriften angeben können. Bevorzugt enthält jede dieser Komponenten im wesentlichen kein IgG.
Der Ausdruck "im wesentlichen kein IgG" bedeutet ein Maximum von 20% IgG bezogen auf die Summe der Immunglobuline, bevorzugt nicht mehr als 10% IgG. Es wird auch bevorzugt, daß die Immunglobulin-Fraktion im wesentlichen kein IgM enthält (nicht mehr als 5%, bevorzugt nicht mehr als 3%). Demgemäß wird bevorzugt, die Gegenwart von IgG und IgM bei der Durchführung der Erfindung zu verringern oder zu beseitigen.
Die erfindungsgemäße Methodologie und der entsprechende Kit sind auch in Kombination mit Adjuvanzien nützlich. Adjuvanzien sind normalerweise inaktivierte Mikroorganismen oder Toxine, die verwendet werden, um die immunologische Antwort auf ein zur Impfung verwendetes Antigen zu verstärken. Die Verabreichung von IgA zusammen mit dem Adjuvans stellt sicher, daß die durch das Adjuvans ausgelöste unverwünschte Entzündung verringert oder ganz beseitigt wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung enthält ein pharmazeutisches Präparat, das mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, multimeres IgA enthält. Dieses Präparat sollte im wesentlichen kein polymeres IgG enthalten. "Im wesentlichen kein polymeres IgG" bezieht sich auf ein Maximum von 10% polymerem IgG, bezogen auf die Summe der Immunglobuline. Bevorzugt enthält die Gesamtmenge der Immunglobuline nicht mehr als 5% polymeres IgG. Es wird auch bevorzugt, daß das Immunglobulin-Präparat, das multimeres IgA enthält, im wesentlichen kein IgM enthält.
Die Erwünschtheit des multimeren IgA beruht auf der überraschenden Entdeckung, daß selbst ein geringes Ausmaß an IgA-Polymerisation (z. B. durch Hitzeaggregation) die antientzündliche Wirkung von IgA verstärkt. Diese Wirkung des multimeren IgA ist unerwartet im Hinblick auf die bekannten gefährlichen Wirkungen von polymerem IgG, das für eine unspezifische und übermäßige Antikomplement-Aktivität verantwortlich ist. Das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat umfaßt bevorzugt IgA als Hauptbestandteil, der wahlweise zumindest im wesentlichen kein IgG enthält. Es wird bevorzugt, die Gegenwart von IgG und IgM in ihren verschiedenen Formen zu verringern oder zu beseitigen.
Die antientzündliche Potenz einer Substanz kann mit Hilfe eines neuen und zuverlässigen Tests bestimmt werden. Der erfindungsgemäße Test enthält die Inkubation von Monocyten (Cytokin-produzierende Zellen) in einem serumfreien Medium in Gegenwart einer zu testenden Substanz. Die Monocyten werden dann einem Entzündungsreiz ausgesetzt, der normalerweise die Expression entzündlicher Cytokine durch die Monocyten verursachen würde. Die Menge der exprimierten Cytokine, wie z. B. TNF-α, TNF-β, IL-1 und IL-6 wird dann bestimmt. Durch Vergleich der Cytokin-Menge, die in den mit der Testsubstanz inkubierten Monocyten exprimiert wird, mit einer Kontrolle, die in Abwesenheit einer Testsubstanz durchgeführt wird, erhält man genaue Hinweise auf die antientzündliche Wirkung der Testsubstanz. Lymphocyten und Granulocyten können in diesem Test ebenfalls verwendet werden.
Der Entzündungsreiz, der in dem erfindungsgemäßen Test verwendet wird, ist bevorzugt ein inaktiviertes Bakterium, wie z. B. Haemophilus influenza, oder ein Bestandteil davon. Andere geeignete Stimuli schließen E. coli LPS oder Meningokokken-Polysaccharide mit ein.
Der oben beschriebene neue Test hat gezeigt, daß IgA eine allgemeine antientzündliche Wirkung besitzt. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von dem wohlbekannten Modell der Antikörper-Funktion. Diese antientzündliche Wirkung kann auch gezeigt werden durch die Hemmung der Freisetzung von Sauerstoffradikalen aus Monocyten und Granulocyten. Die Freisetzung dieser Radikale bei einer entzündlichen Reaktion führt zu einer signifikanten Schädigung des Gewebes am Ort der Entzündung. Dieses Phänomen ist bekannt als "respiratorischer Burst" und kann mit Hilfe eines in vitro Modells gemessen werden, das auf der Inkubation von Hib in Gegenwart neutrophiler Granulocyten basiert. Die antientzündliche Aktivität kann auch bestimmt werden durch die Hemmung der Aktivierung von T-Lymphocyten als Reaktion auf ein Superantigen (wie z. B. Staphylokokken-Enterotoxine, toxisches Schocksyndrom-Toxin 1) und Recall-Antigen (z. B. Tetanus-Toxoid).
Die antientzündliche Wirkung von IgA beruht nicht nur auf der Gegenwart von spezifischen neutralisierenden Antikörpern. Dies wurde gezeigt mit Hilfe einer Durchfluß-zytometrischen Analyse mit indirekter Immunfluoreszenz. Dieses Analyse zeigt, daß IgA- und IgG-Präparate vergleichbare Mengen von Antikörpern enthalten, die Hib binden, daß aber nur IgA das Ausmaß der Erzeugung von TNF-α und IL-6 absenkt. Die in parallelen Experimenten in gleicher Konzentration untersuchten IgG-Präparate haben keine absenkende Wirkung auf die Hib-induzierte Cytokin-Freisetzung.
Die mangelnde Verläßlichkeit von IgA bei der spezifischen neutralisierenden Wirkung wird weiterhin deutlich in Studien, in denen IgA-Antikörper mit Hib inkubiert werden, bevor die Mischung zu den Monocyten gegeben wird. Diese Inkubation sollte die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen erlauben. Die Inkubation von Hib mit IgA verstärkt jedoch die Hemmung der Freisetzung von entzündlichen Cytokinen nicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung hemmt humanes Serum-IgA, das überwiegend monomer vorliegt, die Freisetzung von Cytokinen aus Monocyten. Eine Hitzeaggregation, die IgA-Multimere bildet, verstärkt die hemmende Wirkung von IgA auf die TNF-α-Freisetzung. Ein erfindungsgemäßes pharmazeutisches Präparat enthält bevorzugt multimeres IgA, das durch Erhitzen eines Präparats erhalten werden kann, das mindestens 80%, und bevorzugt mindestens 90%, IgA in löslicher oder lyophilisierter Form enthält. Das Präparat sollte im wesentlichen kein IgG und kein detektierbares IgM enthalten. IgG und IgM können durch radiale Immundiffusion ("RID") detektiert werden.
Bevorzugt wird eine Plasmafraktion als Quelle für IgA verwendet. Eine IgA-Fraktion kann z. B. erhalten werden durch Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, hydrophile Chromatographie oder Affinitäts-Chromatographie einer Plasmafraktion, wie z. B. Cohn-Fraktion III. Dieses Verfahren unterstützt auch die Reduktion einer möglichen viralen Infektiösität, weil Viren durch Cohn-Fraktionierung inaktiviert und/oder entfernt werden.
Das Erhitzen kann bei 40ºC bis 70ºC, bevorzugt bei 60ºC bis 65ºC, für mehrere Minuten bis 24 Stunden, bevorzugt für 1-10 Stunden durchgeführt werden. Zur Entfernung makroskopischer Aggregate kann die Fraktion dann zentrifugiert werden. Danach kann das Ausmaß der Multimerisierung durch Gelpermeations-Chromatographie oder andere gebräuchliche Verfahren bestimmt werden. Der relative Anteil des IgA-Multimers kann durch Wahl einer geeigneten Temperatur und Zeit für den Heizprozeß reguliert werden.
Das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat sollte keine Antikomplement-Aktivität besitzen. Dies wird erreicht durch Verminderung des Gehalts an polymerem IgG. Die Antikomplement-Aktivität einer Zusammensetzung kann gemessen werden mit den Verfahren gemäß Kabat und Mayer, Experimental Immunochemistry (Thomas, Springfield 1961) und Public Health Monograph Nr. 74: Standardized Diagnostic Complement Fixation Method and Adoption to Microtest (Washington, 1965) (Kap. 4, Complement and Complement Fixation) und kann berechnet werden, um einem Wert zu entsprechen, nach dem mindestens 10 mg Protein zur Neutralisierung einer Einheit C'H&sub5;&sub0; notwendig sind (die 50% hämolytische Einheit, definiert als die Menge an Komplement, die für eine 50%ige Lyse notwendig ist). Bevorzugt werden mindestens 35 mg Protein zur Neutralisierung einer C'H&sub5;&sub0;-Einheit benötigt.
Weil das verabreichte IgA normalerweise aus Blut oder verschiedenen Fraktionen davon erhalten wird, sollte es behandelt werden, um potentiell kontaminierende Pathogene, wie z. B. Viren, zu verringern oder zu inaktivieren. Verfahren zur Inaktivierung von Viren in Blutprodukten sind in EP 0 159 311 offenbart. Andere Verfahren zur viralen Inaktivierung können auch angewendet werden. Die virale Inaktivierung macht die IgA-Präparate virussicher.
Wie bereits erläutert, können die erfindungsgemäßen IgA-Präparate lokal oder systemisch verabreicht werden. Das IgA-haltige Präparat kann somit verabreicht werden auf oralem, nasalem, intravenösem, intraarteriellem, intrakavitärem, intramuskulärem, subkutanem, transdermalem, rektalem Weg oder auf anderen Wegen, die dem Fachmann bekannt sind.
Normalerweise wird das IgA mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert. Solche Träger umfassen wäßrige Lösungen, nichttoxische Bindemittel, einschließlich Salzen, Konservierungsmitteln, Puffern und ähnlichem, wie beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Aufl., Easton: Mack Publishing Co., S. 1405-1412 und 1461-1487 (1975) und The National Formulary XIV., 14. Aufl. Washington: American Pharmaceutical Association (1975). Beispiele für nichtwäßrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester wie z. B. Ethyloleat. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch/wäßrige Lösungen, Salzlösungen, parenterale Vehikel wie z. B. Natriumchlorid, Ringers Dextrose, etc.. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstoff-Nachfüllösungen. Konservierungsmittel umfassen Antimikrobiotika, Antioxidanzien, Komplexbildner und Inertgase. Der pH-Wert und die genaue Konzentration der verschiedenen Komponenten der Zusammensetzung werden nach Routineverfahren eingestellt. Siehe hierzu Goodman und Gilmans "The Pharmacological Basis for Therapeutics" (7. Aufl.).
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weitergehend erklären und begrenzen die Erfindung auf keine Weise.

Beispiel I Reinigung von humanem Serum-IgA

Präparate aus humanem gereinigtem Serum-IgA wurden durch Plasma-Fraktionierung hergestellt. Zuerst wurde IgA gemäß EP 0 506 651 aus der Cohn- Fraktion II von großen Plasma-Pools gereinigt. Das mit IgA angereicherte Präparat wurde dann weiter aufgereinigt, um ein IgA-Endprodukt zu erhalten, das mehr als 95% IgA und kein detektierbares IgG oder IgM enthielt, wie mit radialer Immundiffusion gezeigt wurde. Für Vergleichsstudien wurde ein IgG-Präparat auf ähnliche Weise aus Cohn-Fraktion II aus Serum isoliert (> 97% Reinheit).
Beide Immunglobulin-Präparate wurden in lyophilisierter Form bei 4ºC gelagert, und alle Experimente wurden mit einer Charge des IgA- oder IgG- Präparats durchgeführt. Unmittelbar vor der Verwendung in Zellkulturen wurden die Immunglobulin-Präparate in RPMI 1640-Medium (Flow Laboratories, Irvine, UK) gelöst, das mit Penicillin (100 IU/ml), Streptomycin (100 ug/ml) und Glutamin (2 mM, Gibco, Paisley, Schottland) ergänzt war (ergänztes RPMI) und 1% kommerziell erhältliches humanes Serumalbumin (Plasmaprotein-Fraktion human 3,5%, Immuno AG, Wien) enthielt. Dieses Medium ist bekannt unter dem Namen "RPMI-HSA".

Beispiel II Präparation von multimerem IgA

Humanes Serum-IgA wurde in einer Konzentration von 20 mg/ml in RPMI-HSA gelöst und durch Erhitzen auf 63ºC für 20 Minuten aggregiert. Die Präparation wurde dann bei 600 · g für 10 Minuten zentrifugiert, um makroskopische Aggregate zu entfernen.

Beispiel III Erzeugung von humanen Monocyten-Einzelschichten und Stimulation der Cytokin-Freisetzung

Humane mononukleäre Zellen ("MNC") wurden aus heparinisiertem periphären Blut (7,5 IU Heparin ohne Konservierungsmittel pro ml) von gesunden Freiwilligen durch Auftriebs-Dichtegradienten-Zentrifugation mit Lymphoprep® (Nyegaard & Co., Oslo, Norwegen), gemäß der Methode von Boyum A isoliert, Scan. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97): 77 (1968). Die Zellen aus der Zwischenphase wurden abgesaugt und dreimal mit 0,9% NaCl gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in einer Konzentration von 1 · 10&sup6;/ml resuspendiert in ergänztem RPMI, das 10% gepooltes, hitzeinaktiviertes (30 Minuten bei 56ºC) humanes AB-Serum oder 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FKS, Flow Laboratories) enthielt (komplettes Medium).
Zur Erzeugung der Monocyten-Einzelschichten wurden 1 ml Aliquots der MNC-Suspension in 24-Loch-Gewebekulturplatten mit flachem Boden pipettiert (Falcon 3047 Multiwell Tissue Culture Plate, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ). Nach einer 90-minütigen Inkubationsperiode bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator (5% CO&sub2; in befeuchteter Luft) wurden die adhärenten Monocyten-Einzelschichten dreimal mit Salzlösung gewaschen, um nichtadhärente Zellen zu entfernen. Die adhärenten Zellen wurden dann in komplettem Medium für weitere 24 Stunden inkubiert, um die unspezifische Hintergrunderzeugung von Cytokin abzusenken. Die Zellen wurden dann dreimal mit 0,15 M NaCl gewaschen und die Cytokin-Freisetzung wurde induziert durch Zugabe von hitzeinaktiviertem verkapseltem Hib-Stamm Eagan (Stammlösung 2 · 10&sup9; Bakterien/ml, Endkonzentration 1 · 10&sup6; Bakterien/ml) oder gereinigtem LPS (Lipopolysaccharid isoliert aus E. coli Serotyp Olll: B4 durch Extraktion mit Phenol, erhalten von Sigma Chemicals Co., Sigma Nr. L-2630, Endkonzentration 1 ng/ml) zu den Zellkulturen. 500 ul RPMI-HSA mit Hib, (2 · 10&sup6;/ml) oder LPS (2 ng/ml) wurden vermischt mit 0,5 ml IgA oder IgG in RPMI-HSA bei Verdünnungen im Bereich von 0,2 bis 20 mg/ml. 1 ml dieser Mischung wurde zu einem Loch der 24-Loch-Gewebekulturplatte aus Plastik mit den adhärenten Monocyten zugesetzt. In ausgewählten Versuchen wurde die Mischung aus Bakterien und Immunglobulin vor der Zugabe zu den Zellkulturen für 30 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Als Kontrollen dienten Monocytenkulturen, denen nur Hib, nur IgA oder IgG oder nur Medium zugesetzt wurde.
Nach Zugabe von Hib mit oder ohne Immunglobulin zu den Zellen wurden die adhärenten Monocyten-Einzelschichten für 24 Stunden bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Die Zellüberstände wurden dann abgesaugt und bei 9.000 · g für 3 Minuten zentrifugiert, um kontaminierendes Zellmaterial zu entfernen. Der Cytokin-Gehalt wurde bestimmt. Wenn die Bestimmung des Cytokin-Gehalts nicht am gleichen Tag durchgeführt werden konnte, wurden die Überstände in Aliquots verteilt, die bei -20ºC für maximal 3 Tage eingefroren wurden, bis die Konzentrationen von TNF-α und IL-6 gemessen wurden.
Um die Zahl der adhärenten Zellen pro Loch und die Reinheit der adhärenten Monocyten nach 24-stündiger Stimulation mit Hib zu bestimmen, wurden die adhärenten Zellen vorsichtig abgekratzt. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und die Zellzahl wurde mit einem Coulter-Zähler bestimmt. In vier Experimenten konnten 1,0 ± 0,3 · 10&sup5; Zellen pro Loch (Mittelwert ± SEM von 4 Bestimmungen) nach 24-stündiger Hib-Stimulation isoliert werden. Die Lebensfähigkeit der Zellen (bestimmt durch Trypanblau-Ausschluß) betrug 78 ± 5,5%. Die adhärenten Zellen enthielten 86 ± 4,9% Monocyten, wie durch Durchfluß-Cytometrie mit einem CD14-spezifischen monoklonalen Antikörper (M02, Coulter Immunology, Hialeah, FL) mit direkter Immunfluoreszenz gezeigt wurde.

Beispiel IV Untersuchung der Cytokin-Freisetzung in Monocyten, die mit Hib vorbehandelt wurden

Anstelle der oben beschriebenen 24-stündigen Stimulation der adhärenten Monocyten wurden die Zellen für 3 Stunden mit Hib in Gegenwart von IgA (10 mg/ml) oder nur mit Hib stimuliert. Die Monocyten-Einzelschichten wurden dann zweimal mit Salzlösung gewaschen, um freies Hib zu entfernen, und die Zellen wurden anschließend für 21 Stunden in frischem Medium mit IgA (10 mg/ml) oder nur in frischem RPMI-HSA (Medium-Kontrolle) kultiviert. Die Monocyten-Uberstände wurden dann wie oben beschrieben gesammelt und die Cytokin-Konzentrationen wurden mit ELISA bestimmt.

Beispiel V Messung von TNF-α, IL-6 und GM-CSF in Monocyten-Überständen

Mit Hilfe kommerziell erhältlicher ELISA-Kits (TNF-α-EASIA und IL-6- EASIA, Medgenix Diagnostics, Fleurus, Belgien und Quantikine Human GM-CSF Immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN) wurden die Konzentrationen von TNF-α, IL-6 und GM-CSF in den Monocyten-Uberständen bestimmt, die für TNF-α 1 : 30, für IL-6 1 : 5 und für GM-CSF 1 : 2 verdünnt worden waren. Die für die jeweiligen Cytokine spezifischen monoklonalen Antikörper, die in den TNF-α- und IL-6-Tests verwendet wurden, sind nichtneutralisierende Antikörper, die mit einem anderen Epitop des Cytokin-Moleküls reagieren als der Rezeptor- Bindungsstelle. Daher sollten die Ergebnisse dieser Bestimmungen nicht durch die Gegenwart löslicher Cytokin-Rezeptoren oder Inhibitoren beeinflußt werden. Die Ergebnisse sind dargestellt als pg/ml von IL-6, TNF-α oder GM-CSF und wurden berechnet aus einer Eichkurve, die durch lineare Regression der logarithmierten Konzentrationen der Cytokin-Standards des ELISA-Kits gegen die entsprechende logarithmierte optische Dichte des ELISAs erhalten wurde.
Um den Einfluß von IgA oder IgG auf die Cytokin-Freisetzung zu beurteilen, ist die Immunglobulin-induzierte Hemmung dargestellt als Prozentsatz der Kontrolle im Vergleich zur Cytokin-Freisetzung, die in Zellkulturen beobachtet wurde, welche nur mit Hib in Abwesenheit von Immunglobulin (die 100% Positivkontrolle) stimuliert wurden, oder als prozentuale Hemmung (d. h. 100 - Prozentsatz der Kontrolle). Der Prozentsatz der Kontrolle wurde nach folgender Formel berechnet:
% der Kontrolle = (X-I) / (C-B) · 100
wobei X die Cytokin-Konzentration der experimentellen Probe ist (Monocyten plus Immunglobulin plus Hib oder LPS), I die Cytokin-Konzentration im Überstand der Monocyten ist, die nur in Gegenwart von Immunglobulin inkubiert wurden, B die Hintergrund-Freisetzung von Cytokin ist (Kultur der Monocyten alleine) und C die Cytokin-Konzentration ist, die von Monocyten freigesetzt wird, welche in Gegenwart von Hib oder LPS ohne Immunglobulin inkubiert wurden (die 100% Kontrolle).

Beispiel VI Einfluß von IgA auf die Freisetzung von TNF-α und IL-6 in humanen Monocyten

Humane Monocyten setzen signifikante Mengen von entzündlichen Cytokinen frei, wenn sie durch Gram-negative Bakterien wie z. B. Hib stimuliert werden. Der Einfluß von IgA auf die Hib-induzierte Freisetzung von TNF-α und IL-6 wurde untersucht.
Zuerst wurden humane Monocyten durch Adhäsion an 24-Loch-Gewebekulturplatten aus Plastik (1 · 10&sup6; MNC/Loch/ml komplettes Medium) aus mononukleären Zellen aus periphärem Blut isoliert. Die adhärenten Monocyten wurden für 24 Stunden mit Hib (1 · 10&sup6; Bakterien/ml/Loch) in RPMI-HSA stimuliert, welches humanes Serum-IgA in den angegebenen Konzentrationen enthielt. Kontrollöcher enthielten Monocyten, die nur in Gegenwart von Hib kultiviert wurden. Nach der 24-stündigem Inkubationszeit wurden die Konzentrationen von TNF-α und IL-6 in zellfreien Überständen mittels ELISA bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als pg/ml (Mittelwert ± SEM von 8 verschiedenen Experimenten). Monocyten, die nur in Medium kultiviert wurden, setzten 18 ± 9 pg/ml TNF-α und 61 ± 50 pg/ml IL-6 frei. Die Hintergrund-Freisetzung der Cytokine betrug in Kulturen, die nur IgA enthielten, 31 ± 20 pg/ml (0,1 mg/ml) und 562 ± 263 pg/ml (10 mg/ml) an TNF-α und 255 ± 148 und 121 ± 82 pg/ml an IL-6.
Die in Fig. 1 dargestellten Daten zeigen, daß die Inkubation von Monocyten in Gegenwart von Hib (1 · 10&sup6; Bakterien/ml) unter serumfreien Bedingungen (in ergänztem RPMI mit 1% HSA) die Freisetzung signifikanter Mengen von TNF-α (43198 ± 6912 pg/ml) und IL-6 (10990 ± 669 pg/ml) auslöste. Der Stern ("*") kennzeichnet einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen IgA-behandelten und Kontrollzellen (p< 0,005, Mann-Whitney U-Test).
Die Zugabe von IgA in Endkonzentrationen zwischen 0,1 und 10 mg/ml zu den Kulturen aus Monocyten und Hib führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der Freisetzung beider Cytokine (Fig. 1). Die IgA-vermittelte Hemmung der TNF-α-Freisetzung war maximal bei 3 mg/ml (% Hemmung, Mittelwert ± SEM von 8 Versuchen: TNF-α 65 ± 5, signifikanter Unterschied im Vergleich zu Kulturen mit nur Hib betrug p = 0,001636 im Mann-Whitney U-Test) und ließ sich nicht weiter steigern durch Erhöhung der IgA-Konzentration auf 10 mg/ml.
Der Einfluß von IgA auf die IL-6-Freisetzung war maximal bei 10 mg/ml (81 ± 5% Hemmung, p = 0,000389), aber eine statistisch signifikante Hemmung um 59 ± 9% konnte auch bei 3 mg/ml beobachtet werden (p = 0,001161).
Die IgA-vermittelte Hemmung der Cytokin-Freisetzung beruhte nicht auf einer Abnahme der Monocyten-Zahl in den Kulturen oder einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen. Wie in Tabelle 1 ersichtlich, hat die Zugabe von IgA (10 mg/ml) zu den Kulturen keinen Einfluß auf die Zahl der Monocyten pro Loch. Die Lebensfähigkeit der Zellen (bestimmt durch Trypanblau-Ausschluß) war auch unverändert (Ergebnisse nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, daß IgA Einfluß hat auf die Erzeugung und/oder Freisetzung der bedeutenden Cytokine. Tabelle 1
Die Werte zeigen die Mittelwerte ± SEM von 4 Experimenten.
(1) Die Zellzahl wurde mit einem Coulter-Zähler bestimmt, nachdem die adhärenten Zellen mit einem Gummischaber abgelöst worden waren.
(2) Bestimmt durch Durchfluß-Cytometrie mit einem monoklonalen CD14-Antikörper mit direkter Immunfluoreszenz nach Abkratzen der adhärenten Zellen.
(3) Humanes Serum-IgA wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml verwendet.
(4) Signifikanter Unterschied im Vergleich zu Hib alleine (p = 0,0455, Friedmann Chi-Quadrat-Test für Klassen)
Fig. 2 zeigt, daß humanes Serum-IgA die Hib-induzierte Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus humanen Monocyten herunterreguliert, aber in diesem Modell keinen Einfluß auf die Erzeugung von GM-CSF nach Hib-Stimulation hat. Zuerst wurden adhärente Monocyten für 24 Stunden mit Hib in Gegenwart oder Abwesenheit von IgA (10 mg/ml) stimuliert, wie für das Experiment von Fig. 1 erklärt. Die Konzentrationen von TNF-α, IL-6 und GM-CSF wurden mittels ELISA bestimmt und die Ergebnisse sind in pg/ml angegeben (Mittelwert ± SEM für 8 verschiedene Experimente). Die Hintergrund-Freisetzung von TNF-α und IL-6 ist in der Diskussion zu Fig. 1 beschrieben. Nur mit Medium kultivierte Monocyten setzten keine detektierbaren Mengen an GM-CSF frei, und nur in 2 von 8 Experimenten wurde in Kulturen mit IgA (10 mg/ml) aber ohne Hib ein schwacher Hintergrund einer GM-CSF-Freisetzung (< 50 pg/ml) beobachtet. Der Stern "*" kennzeichnet einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen IgA-behandelten und Kontrollzellen (p< 0,005, Mann-Whitney U-Test).
Sogar hohe Konzentrationen an IgA (10 mg/ml) hatten keinen hemmenden Einfluß auf die Freisetzung von GM-CSF nach Hib-Stimulation, wohingegen die in den gleichen Überständen gemessene Freisetzung von TNF-α und IL-6 signifikant geringer war. Die Herabregulation der Freisetzung von TNF-α und IL-6 beruhte daher nicht auf einer allgemein verringerten Fähigkeit der Monocyten, Cytokine nach Stimulation mit Hib freizusetzen.
Die Abnahme der Konzentrationen von TNF-α und IL-6, die in den Überständen der Monocyten in Gegenwart von IgA gemessen wurde, beruhte auf einer echten Herabregulation der Freisetzung bestimmter Cytokine und nicht auf einer Hemmung der Cytokin-Detektion. Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von bis zu 25 mg/ml von humanem Serum-IgA oder -IgG zu dem Überstand der Hib-aktivierten Monocyten keinen signifikanten Einfluß auf die gemessene Menge an TNF-α oder IL-6 hatte, wodurch eine mögliche Beeinträchtigung der Messung dieser Cytokine in ELISA-Versuchen durch IgA- oder IgG-Antikörper ausgeschlossen wird. Tabelle 2
(1) In RPMI-HSA verdünntes IgG oder IgA oder nur RPMI-HSA wurden zu 24-Stunden-Überständen (1 : 3 verdünnt in RPMI-HSA) von Hib-stimulierten Monocyten gegeben.
(2) Die Werte zeigen Mittelwerte ± SEM von 3 verschiedenen Experimenten.
Darüber hinaus war die beobachtete IgA-vermittelte Absenkung der Freisetzung von TNF-α und IL-6 kein Artifakt, der auf den hohen Proteinkonzentrationen in den IgA-enthaltenden Kulturen beruhte. Die Zugabe von äquivalenten Mengen an humanem Serumalbumin (HSA) zu den Kulturen, die zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml HSA führte, hatte keinen Einfluß auf die Hibinduzierte Freisetzung dieser cytokine. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: TNF-α-Freisetzung, pg/ml [% der Kontrolle]: (i) HSA 10 mg/ml 18540 ± 5678, HSA 20 mg/ml 14922 ± 5040 [84 ± 8%] und (ii) IL-6-Freisetzung, pg/ml: HSA 10 mg/ml 2426 ± 687, HSA 20 mg/ml 2567 ± 766 [109 ± 10%] (Mittelwert ± SEM von 4 Experimenten).
Die IgA-vermittelte Hemmung der Hib-induzierten Freisetzung von TNF-α und IL-6 wurde nicht durch Erleichterung der Wechselwirkung zwischen IgA und Hib verstärkt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Vorinkubation von Hib mit IgA (10 mg/ml) die Wirkung nicht verstärkte (prozentuale Hemmung der Cytokin-Freisetzung, Mittelwert ± SEM: (1) IgA (10 mg/ml) und Hib wurden den Zellen ohne Vorinkubation zugesetzt (n = 8): TNF-α 63 ± 7, IL-6 73 ± 11 und (2) Hib wurde mit IgA für 30 Minuten bei 37ºC vorinkubiert, bevor Hib und IgA den Zellen zugesetzt wurden (n = 11): TNF-α 59 ± 9, IL-6 51 ± 18).
Die in Fig. 3 dargestellten Experimente zeigen, daß IgA die Freisetzung von TNF-α und IL-6 auch als Reaktion auf die Stimulation mit einem löslichen Stimulus, aus E. coli gereinigtes LPS, herunterreguliert. Zuerst wurden adhärente Monocyten für 24 Stunden mit LPS (1 ng/ml) in RPMI-HSA mit humanem Serum-IgA (0,1 mg/ml bis 10 mg/ml) stimuliert. Kontrollöcher enthielten Monocyten und LPS, Monocyten und IgA oder Monocyten, die nur in RPMI-HSA kultiviert wurden. Nach der 24-stündigen Inkubationszeit wurde die Freisetzung von TNF-α und IL-6 in dem zellfreien Überstand mittels ELISA bestimmt. Die in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse sind dargestellt als Prozentsatz der Kontroll-Freisetzung von Cytokin (Cytokin, das von Monocyten freigesetzt wird, die mit LPS aber ohne IgA stimuliert wurden), berechnet wie oben beschrieben (Mittelwert ± SEM für 6 Experimente). Mit LPS stimulierte Kontrollzellen setzten 16657 ± 5536 pg/ml TNF-α und 1110 ± 294 pg/ml IL-6 frei.
Der Wilcoxon-Test ergab für den Unterschied im Cytokin-Niveau (pg/ml) zwischen IgA-behandelten und Kontrollkulturen: p = 0,029586, **) p = 0,018016.
Die Ergebnisse in Fig. 3 zeigen, daß die Dosisantwort der IgA-vermittelten Hemmung für die Freisetzung von TNF-α und IL-6 vergleichbar war.

Beispiel VII Einfluß von multimerem IgA auf die Hib-induzierte Freisatzung von TNF-α und IL-6

Die Daten in Fig. 4 zeigen, daß der immunregulierende Einfluß von humanem Serum-IgA auf die Freisetzung von TNF-α signifikant erhöht ist, wenn IgA in multimerer Form vorliegt.
Humane Monocyten, die aus mononukleären Zellen aus periphärem Blut von gesunden erwachsenen Freiwilligen durch Adhäsion an Plastikoberflächen isoliert worden waren, wurden in 24-Loch-Gewebeplatten aus Plastik kultiviert. Adhärente Monocyten wurden in Gegenwart von Hib (1 · 10&sup6; Bakterien/ml/Loch) und monomerem oder hitzeaggregiertem IgA (Endkonzentration 10 mg/ml) inkubiert. Kontrollkulturen wurden nur mit Monocyten und Hib angesetzt. Nach 24 Stunden wurden die zellfreien Überstände gesammelt und die Konzentrationen von TNF-α und IL-6 mittels ELISA bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in pg/ml (Mittelwert ± SEM für 6 verschiedene Experimente).
In 6 Experimenten senkte monomeres IgA die Freisetzung von TNF-α um 48 ± 9%, wohingegen die Hemmung der Freisetzung von TNF-α, die parallel durch multimeres IgA (hitzeaggregiert) induziert wurde, 73 ± 5% betrug (Mittelwert ± SEM, n = 6, p = 0,018686, im Vergleich zur prozentualen Hemmung durch monomeres IgA, Mann-Whitney U-Test). Eine Hitzeaggregation senkte den hemmenden Effekt von IgA auf die IL-6-Freisetzung nur leicht (% Hemmung, Mittelwert ± SEM: monomeres IgA 78 ± 8%, polymeres IgA 89 ± 3%).

Beispiel VIII Hemmungsstudien mit IgA und IgG

Fig. 5 zeigt, daß IgA die Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus adhärenten Monocyten nach Stimulation mit Hib signifikant absenkt, IgG in ähnlicher Konzentration jedoch keinen Einfluß auf das Ausmaß der cytokin-Freisetzung hat. Zuerst wurden humane Monocyten, die aus periphärem Blut von gesunden Freiwilligen durch Adhäsion an Plastik isoliert worden waren, in Gewebekulturplatten (ca. 1 · 10&sup5; adhärente Monocyten/Loch/ml) in Gegenwart von Hib (1 · 10&sup6; Bakterien/ml/Loch) und IgA oder IgG (Endkonzentration 10 mg/ml) für 24 Stunden kultiviert. Die Konzentrationen von TNF-α und IL-6 wurden dann in zellfreien Überständen mittels ELISA bestimmt. Die Ergebnisse stellen pg/ml dar (Mittelwert ± SEM von 8 verschiedenen Experimenten).
In Gegenwart von Hib aber ohne Immunglobulin kultivierte Monocyten dienten als Positivkontrolle, und nur in Medium aber ohne Hib kultivierte Zellen wurden untersucht, um die Hintergrund-Freisetzung von Cytokinen zu bestimmen (TNF-α 202 ± 123 pg/ml, IL-6 15 ± 8 pg/ml). Monocyten, die nur in Gegenwart von IgG (10 mg/ml) kultiviert wurden, setzten 449 ± 182 pg/ml TNF-α und 9 ± 5 pg/ml IL-6 frei; die Überstände der nur mit IgA (10 mg/ml) behandelten Zellen enthielten 721 ± 244 pg/ml TNF-α und 6 ± 2 pg/ml IL-6. Die statistische Bewertung des Unterschieds der Cytokin-Freisetzung in Gegenwart von IgA oder IgG im Vergleich zu Zellen, die nur in Gegenwart von Hib kultiviert wurden, wurde mit dem Mann-Whitney U-Test durchgeführt: * p = 0,004326, ** p = 0,001638.

Beispiel IX Bindung von IgA und IgG an Hib

Weil nur IgA, und nicht IgG, die Hib-induzierte Cytokin-Freisetzung herunterreguliert, wurde die Bindung von IgA- und IgG-Präparationen an Hib untersucht. Zuerst wurde Hib mit logarithmischen Verdünnungen von gereinigtem humanem Serum-IgA oder -IgG inkubiert und die Bindung von IgA- und IgG- Antikörpern wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz gemessen und mit einem Cytofluorographen untersucht. Die Mediumkontrolle zeigt die Anfärbung der Bakterien mit FITC-konjugiertem Anti-IgA- oder Anti-IgG-Reagens alleine.
Die in Fig. 6 dargestellten repräsentativen FACS-Histogramme zeigen, daß sowohl IgA- als auch IgG-Antikörper an Hib binden, und semiquantitative Untersuchungen zeigen, daß beide Präparationen vergleichbare Titer an Hib- spezifischen Antikörpern enthalten.

Beispiel X Einfluß von humanem Serum-IgA auf die Cytokin-Induktion und die Cytokin-Freisetzung aus Monocyten, die mit Hib stimuliert wurden

Es gibt mehrere mögliche Erklärungen für die hemmende Wirkung von IgA auf die Hib-induzierte Freisetzung von TNF-α und IL-6. Zum Beispiel könnte IgA die Hib-induzierte Stimulation der Cytokin-Freisetzung beeinträchtigen, indem es die Bindung von Hib an die Oberflächenmembran der Monocyten hemmen könnte. Dies würde schließlich zu einer geringeren Cytokin-Freisetzung führen. Die IgA-vermittelte Absenkung der Hib-induzierten Freisetzung von TNF-α und IL-6 könnte aber auch das Ergebnis einer echten Herunterregulation der Cytokin-Erzeugung und/oder Cytokin-Freisetzung aus Hib-stimulierten Monocyten sein.
Die folgende Studie wurde durchgeführt, um weitere Einsichten in die antientzündlichen Mechanismen von IgA zu erhalten. Humane Monocyten wurden aus mononukleären Zellen ("MNC") aus periphärem Blut durch Adhäsion an 24- Loch-Gewebeplatten aus Plastik isoliert (1 · 10&sup6; MNC/ml/Loch). Monocyten- Einzelschichten wurden für 3 Stunden mit Hib (1 · 10&sup6; Bakterien/ml/Loch) in RPMI-HSA mit 10 mg/ml IgA stimuliert. Die adhärenten Monocyten wurden dann zweimal gewaschen, um Hib zu entfernen, und wurden für weitere 21 Stunden in frischem Medium (RPMI-HSA) mit 10 mg/ml humanem Serum-IgA (Hib + IgA → IgA) oder nur in frischem RPMI-HSA (Hib + IgA → Med) inkubiert. Parallel hierzu wurden Kulturen für 3 Stunden mit Hib stimuliert, gewaschen und dann für die anschließende 21-stündige Inkubationsperiode mit 10 mg/ml IgA versetzt (Hib → IgA). Nach der 21-stündigen Inkubation, die auf die 3-stündige Hib-Stimulation folgte, wurden die zellfreien Überstände gesammelt und die Konzentrationen von TNF-α und IL-6 wurden mittels ELISA bestimmt. Kontrollzellen, die für 3 Stunden mit Hib stimuliert, gewaschen und dann für 21 Stunden in RPMI-HSA ohne IgA kultiviert wurden (Hib → Med), setzten 4939 ± 1588 pg/ml TNF-α und 1626 ± 728 pg/ml IL-6 frei. Die Cytokin-Freisetzung aus IgA-behandelten Zellen ist dargestellt als Prozentsatz dieser Kontroll-Freisetzung von Cytokinen, berechnet wie oben beschrieben (Mittelwert ± SEM von 4 verschiedenen Experimenten). Zusätzliche Löcher, die nicht mit Hib behandelt wurden, aber ähnliche Medienwechsel erhielten und mit IgA oder nur mit Medium versetzt wurden, enthielten zwischen 65 ± 54 (Med → IgA) und 113 ± 38 (IgA → IgA) pg/ml TNF-α und zwischen 8 ± 8 (IgA → Med) und 21 ± 14 (Med → IgA) pg/ml IL-6.
Die unmittelbar nach der 3-stündigen Stimulation mit Hib gesammelten Überstände enthielten nur sehr geringe Mengen von TNF-α (502 ± 178 pg/ml) und IL-6 (288 ± 124 pg/ml, Mittelwert ± SEM von 3 Experimenten), wohingegen die Überstände, die nach 3-stündiger Stimulation mit Hib und 21-stündiger Inkubation (nachdem der Stimulus durch gründliches Waschen entfernt worden war) gesammelt wurden, 3385 ± 463 pg/ml TNF-α und 1900 ± 953 pg/ml IL-6 enthielten, was darauf hindeutet, daß 88 ± 3% des gesamten TNF-α und 86 ± 3% des gesamten IL-6, das durch 3-stündige Stimulation mit Hib induziert wird, während der anschließenden 21-stündigen Stimulation freigesetzt werden. Eine kontinuierliche Stimulation für 24 Stunden mit Hib führte zu zwei- bis dreimal höheren Werten an TNF-α (12849 ± 2904 pg/ml) und IL-6 (4278 ± 766 pg/ml), verglichen mit den Konzentrationen dieser Cytokine in den 21-Stunden-Kulturen der Monocyten, die für 3 Stunden mit Hib vorbehandelt wurden.
Wie in Fig. 7 gezeigt, setzten Monocyten, die für 3 Stunden mit Hib stimuliert wurden, deutlich geringere Mengen von TNF-α und IL-6 frei, wenn IgA (10 mg/ml) dem System zugesetzt wurde während der Zeit der Cytokin- Freisetzung und nachdem Hib durch gründliches Waschen entfernt wurde (Hib → IgA). Darüber hinaus senkte IgA, das den Zellkulturen während der 3-stündigen Stimulation mit Hib zugesetzt wurde, die Freisetzung von TNF-α und IL-6 während der anschließenden 21-stündigen Stimulation herab, nachdem IgA und der Stimulus durch gründliches Waschen entfernt worden waren (Hib + IgA → Med).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß IgA sowohl die Induktion der Cytokin-Erzeugung als auch die Cytokin-Freisetzung herunterreguliert. Wenn IgA sowohl während der Cytokin-Induktion (die ersten 3 Stunden) als auch während der Cytokin-Freisetzung in Abwesenheit des Stimulus (die anschließenden 21 Stunden) vorhanden war, war die hemmende Wirkung auf die Freisetzung von TNF-α und IL-6 maximal (Hib + IgA → IgA).
Zusammenfassend kann man sagen, daß IgA die Freisetzung von TNF-α und IL-6 aus humanen Monocyten, die mit dem besonderen Stimulus Hib aktiviert wurden, herunterreguliert. Die Freisetzung von TNF-α und IL-6 ist herunterreguliert, wenn IgA während der Zeit der kontinuierlichen Stimulation der Monocyten mit Hib anwesend ist. IgA hemmt auch die Freisetzung von TNF-α und IL-6, wenn es während der Cytokin-Induktion gegenwärtig ist. Zusätzlich hat IgA eine hemmende Wirkung, wenn es Hib-vorbehandelten Monocyten während der Induktion der Cytokin-Erzeugung, während der Zeit der Cytokin-Freisetzung oder sogar nach Entfernung des Stimulus durch gründliches Waschen zugesetzt wird. Wenn IgA sowohl während der Cytokin-Induktion als auch während der Cytokin-Freisetzung anwesend ist, ist die IgA-vermittelte Herabregulation der Erzeugung von TNF-α und IL-6 maximal. Dies ist ein starker Hinweis nicht nur auf eine vorbeugende Wirkung von IgA auf entzündliche Reaktionen, sondern auch auf einen therapeutischen Nutzen. Die Kenntnis oder Richtigkeit der oben beschriebenen vorgeschlagenen Wirkungsart von IgA ist jedoch nicht notwendig für die Durchführung der vorliegenden Erfindung.

Claims

1. Verwendung eines Präparats umfassend IgA zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Verhinderung von Entzündungen.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Präparat im wesentlichen kein IgG enthält.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin IgA multimeres IgA umfaßt.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, worin das Präparat im wesentlichen kein polymeres IgG enthält.

5. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Präparat außerdem eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Antibiotika, antiphlogistische Mittel und Mittel gegen Magensäure.

6. Verwendung eines Präparats umfassend IgA zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung oder Verbesserung von Entzündungen.

7. Verwendung gemäß Anspruch 6, worin das Präparat im wesentlichen kein IgG enthält.

8. Verwendung gemäß Anspruch 6, worin IgA multimeres IgA umfaßt.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8, worin das Präparat im wesentlichen kein polymeres IgG enthält.

10. Verwendung gemäß Anspruch 6, worin das Präparat außerdem eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Antibiotika, antiphlogistische Mittel oder Mittel gegen Magensäure.

11. Ein Kit zur antientzündlichen Verwendung, umfassend ein Präparat, das multimeres IgA und außerdem eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antibiotika, antiphlogistischen Mitteln und Mitteln gegen Magensäure.

12. Ein Präparat zur antientzündlichen Verwendung, umfassend multimeres IgA, das im wesentlichen kein IgG enthält.

13. Verfahren zur Untersuchung der antientzündlichen Wirkung eines Immunglobulins, umfassend die Schritte: in vitro Inkubation von Cytokin- erzeugenden Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monocyten, Lymphocyten und Granulocyten in Gegenwart eines Entzündungsstimulus und des besagten Immunglobulins in einem serumfreien Medium; und Untersuchung der Zellen aus dem Inkubationsschritt bezüglich der Erzeugung entzündlicher Cytokine.

14. Verwendung von IgA und einem Impfantigen zur Herstellung eines Impfstoffs.

15. Verwendung gemäß Anspruch 14, worin der Impfstoff zusätzlich ein Adjuvans umfaßt.

16. Verwendung gemäß Anspruch 14, worin das IgA multimeres IgA umfaßt.

17. Verwendung gemäß Anspruch 16, worin das Präparat im wesentlichen kein IgG enthält.

18. Pharmazeutisches Präparat zur Impfung, umfassend ein Impfantigen und IgA.

19. Präparat zur Impfung gemäß Anspruch 18, worin das IgA multimeres IgA umfaßt.

20. Präparat zur Impfung gemäß Anspruch 18, worin das Präparat im wesentlichen kein IgG enthält.

21. Präparat zur Impfung gemäß Anspruch 18, das außerdem ein Adjuvans umfaßt.

22. Verwendung eines Präparats umfassend IgA für die Herstellung eines Pharmazeutikums zur Immunmodulation.

23. Verwendung gemäß Anspruch 22, worin das IgA multimeres IgA umfaßt.