DE69529219T2

DE69529219T2 - Helicobacter proteine und impstoffe

Info

Publication number: DE69529219T2
Application number: DE69529219T
Authority: DE
Inventors: William Byrne; Dermot Kelleher; Ross Mcmanus; Henry Windle
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: College of the Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth near Dublin
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2015-07-04
Also published as: AU696941B2; WO1996001272A1; CA2194236C; AU695769B2; EP0769018B1; GB2303854A; US20070104731A1; GB2303855B; DE69529219D1; GB2303855A; ATE229978T1; US20010010821A1; EP0769018A1; WO1996001273A1; CA2194237A1; AU2751495A; JP2006348036A; GB9626484D0; GB2303854B; CA2194236A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff oder eine therapeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung der Krankheit, die mit Helicobacter pylori zusammenhängt, und Protein, das bei dem Impfstoff verwendet wird.

Hintergrund

Helicobacter pylori ist ein weit verbreiteter Organismus, der in der Magenbiopsie bei etwa 30% der Bevölkerung unter 40 Jahren gefunden wird, wobei das Vorkommen danach zunimmt. Der Organismus ist das auslösende Mittel der chronischen Gastritis beim Menschen (vgl. Marshall & Warren 1984¹; Blaser 1990²). Epidemiologische Studien haben gezeigt, daß H. pylori meistens in Zusammenhang mit Gastritis gefunden wird. Serologische Untersuchungen haben gezeigt, daß eine gegenwärtige oder vorherige Infektion bei 30-50% einer zufällig ausgewählten Population von Blutspendern gefunden werden kann. Für die Duodenum-Geschwürerkrankung wurde nicht zwingend ein kausaler Zusammenhang nachgewiesen. Der Organismus wird jedoch bei 95% der Patienten mit Duodenum-Geschwür gefunden. Darüber hinaus resultiert die Ausrottung des Organismus in einer raschen Heilung des Geschwürs (vgl. Rauws & Tytgat, 1990³). Diese Ergebnisse sind ein eindeutiger Hinweis, daß H. pylori ein dominanter Faktor bei der Entwicklung eines Duodenum-Geschwürs ist. Zusätzliche Evidenz für die pathogene Beteiligung von H. pylori bei diesen Zuständen wurde durch Untersuchungen mit gnotobiotischen Ferkeln (Lambert et al., 1987&sup4;) und der Erfüllung des Koch'schen Postulats bei menschlichen Freiwilligen (Marshall et al., 1985&sup5;; Morris & Nicholson, 1981&sup6;) bereitgestellt.
Zusätzlich gibt es nunmehr starke Indizien, die nahelegen, dass H. pylori bei der Pathogenese von Magenkrebs eine Rolle spielt (vgl. Jiang et al., 198&sup7;; Lambert et al., 1986&sup8;; Crabtree et al., 1992&sup9;; 1993¹&sup0;; Forman et al., 1990¹¹, 1991¹²; Nomura et al., 1991¹³; Parsonnet et al., 1991¹&sup4;). Kürzlich zeigte die Eurogast-Studiengruppe, die von Forman (1993¹&sup5;) geleitet wird, einen signifikanten Zusammenhang zwischen Seropositivität für H. pylori und der Mortalität und dem Auftreten von Magenkrebs. In der Tat gibt es nunmehr eine überzeugende Menge an Literatur, die nahelegt, daß bei der oberen gastrointestinalen Erkrankung die Infektion mit H. pylori in beträchtlichem Maße beteiligt ist. Für den pathogenen Mechanismus von H. pylori bei der Induktion der gastroduodenalen Erkrankung sind eine Anzahl von Hypothesen vorgeschlagen worden, einschließlich der Produktion von Cytotoxinen und der mechanischen Zerstörung des Epithels (vgl. Blaser, 1992¹&sup6;). Interessanterweise jedoch bleiben viele infizierte Personen trotz der anhaltenden Anwesenheit des Pathogens asymptomatisch (Taylor & Blaser, 1991¹&sup7;).
J. Bacteriol. (1991), 173(2), 505-513 (O'Toole et al) beschreibt ein Helicobacter pylori-Protein.
J. Clin. Microbiol. (1991) Bd. 29, 16-201624 (Drouet et al) beschreibt ein anderes Helicobacter pylori-Protein.

Aussagen der Erfindung

Gemäß der Erfindung wird ein Impfstoff zur Behandlung oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-Infektion oder einer Helicobacter pylori-assoziierten Krankheit bereitgestellt, umfassend ein Helicobacter pylori-Protein, gegen welches Immunreaktivität in Helicobacter pylori negativen Individuen festgestellt wird, wobei das Protein eine oder beide der folgenden Komponenten umfasst:
(a) ein Helicobacter pylori-Protein mit einem Molekulargewicht von 18 bis 19 kDa und einer oder mehrerer der folgenden Sequenzeigenschaften: (i) eine N-terminale Aminosäuresequenz wie aufgeführt unter SEQ ID NO.: 2, oder ein Teil davon; (ii) eine N- terminale Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID No.: 6, oder ein Teil davon; (iii) eine interne Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO.: 3, oder ein Teil davon; oder ein Derivat, Fragment oder eine Mutante des Helicobacter pylori-Proteins,
(b) ein Helicobacter pylori-Protein mit einem Molekulargewicht von 24 bis 25 kDa und einer oder mehrerer der folgenden Sequenzeigenschaften: (i) eine N-terminale Aminosäuresequenz wie aufgeführt unter SEQ ID NO.: 1, oder ein Teil davon; (ii) eine interne Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO.: 4, oder ein Teil davon; oder ein Derivat, Fragment oder eine Mutante des Helicobacter pylori-Proteins.
Der Impfstoffe kann einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Der Impfstoff kann mit einem geeigneten Adjuvans wie Interleukin 12 oder einem Hitzeschockprotein kombiniert werden, oder mit beiden.
Der Impfstoff kann mindestens ein anderes pharmazeutische Produkt umfassen wie ein Antibiotikum und/oder ein antibakterielles Mittel wie Wismutsalze. Typischerweise ist das Antibiotikum ausgewählt aus einem oder mehreren Mitgliedern der Gruppe bestehend aus Metronidazol, Amoxycillin, Tetracyclin, Erythromycin, Clarithromycin oder Tinidazol.
Der Impfstoff ist ideal zur Behandlung oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori- Infektion oder einer Helicobacter pylori-assoziierten Krankheit.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung von einem oder mehreren Helicobacter- Proteinen der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-assoziierten Krankheit bereit.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1: Seren von Erwachsenen (CLO-negativ); die auf die Anwesenheit von IgG-Antikörpern gegen H. pylori durchmustert wurden. Die Figur zeigt einen Western-Blot von H. pylori, hybridisiert mit Serum, das von CLO-negativen Individuen erhalten worden war. Alle Seren waren 1 : 100 mit PBS verdünnt, das fettfreie Trockenmagermilch (5%, Gew./Vol.) enthielt. Die Proteine wurden von SDS-PAGE-Gelen auf PVDF- Membranen übertragen. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden auf den gewaschenen Membranen unter Verwendung eines verstärkten Chemieluminezenz- Nachweissystems nachgewiesen. Jede Spur stellt eine verschiedene Serumprobe dar.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-assoziierten Krankheit in einem Wirt bereit, umfassend die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge von einem oder mehreren der Helicobacter-Proteine der Erfindung an den Wirt.
Vorzugsweise wird das Helicobacter pylori-Protein in Kombination mit mindestens einem anderen pharmazeutischen Mittel verabreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das pharmazeutische Mittel ein Antibiotikum.
Idealerweise ist das Antibiotikum ausgewählt aus einem oder mehreren Mitgliedern der Gruppe bestehend aus Metronidazol, Amoxycillin, Tetracyclin oder Erythromycin, Clarithromycin oder Tinidazol.
Typischerweise umfaßt das pharmazeutische Mittel ein antibakterielles Mittel wie Wismutsalze.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Adjuvans in Kombination mit dem Helicobacter-Protein verabreicht. Vorzugsweise ist das Adjuvans Interleukin 12 oder ein Hitzschockprotein oder beides.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung von einem oder mehreren Helicobacter- Proteinen der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Helicobacter pylori-assoziierter/assoziierten Krankheit(en) bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin monoclonale oder polyclonale Antikörper oder Fragmente davon gegen das Protein-Material der Erfindung bereit und gereinigte Antikörper oder Serum, das durch die Immunisierung eines Tieres mit dem Impfstoff gemäß der Erfindung erhalten wurde.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung von solch einem Serum und solchen Antikörpern zur Behandlung oder Vorbeugung von Helicobacter-assoziierter/assoziierten Krankheit(en) bereit und insbesondere von Helicobacter pylori-assoziierter/assoziierten Krankheit(en) bereit.
Die Erfindung stellt auch einen Impfstoff für die Behandlung oder Vorbeugung von Helicobacter pylori-assoziierter Krankheit bereit, umfassend eine immunogen wirksame Menge des Helicobacter pylori-Proteins von 24 bis 25 kDa und/oder des Helicobacter pylori- Proteins von 18 bis 19 kDa der Erfindung, ein Adjuvans wie Interleukin 12 und ein Antibiotikum.
Der Impfstoff kann ein antibakterielles Mittel wie Wismutsalze umfassen.
Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung von Interleukin 12 in Kombination mit dem Protein von 18 bis 19 kDa, von 24 bis 25 kDa oder jeder anderen H. pylori-Untereinheit als Adjuvans-Therapie.
Deshalb stellt die Erfindung in einem andern Aspekt einen Impfstoff gegen H. pylori bereit, umfassend eine immunogen wirksame Menge eines Helicobacter oder einer Untereinheit, eines Fragments, Derivats, Vorläufers oder einer Mutante davon in Kombination mit Interleukin 12 als Adjuvans. Vorzugsweise ist der Helicobacter Helicobacter pylori.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Impfstoff ein Antibiotikum und kann alternativ oder zusätzlich ein antibakterielles Mittel umfassen.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1: Seren von Erwachsenen (CLO-negativ), die auf die Anwesenheit von IgG-Antikörpern gegen H. pylori durchmustert wurden. Die Figur zeigt einen Western Blot von H. pylori, hybridisiert mit Serum, das von CLO-negativen Individuen erhalten worden war. Alle Seren waren 1 : 100 mit PBS verdünnt, das fettfreie Trockenmagermilch (5%, Gew./Vol.) enthielt. Die Proteine wurden von SDS-PAGE-Gelen auf PVDF- Membranen übertragen. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden auf den gewaschenen Membranen unter Verwendung eines verstärkten Chemieluminezenz- Nachweissystems nachgewiesen. Jede Spur stellt eine verschiedene Serumprobe dar.
Fig. 2: Adsorbierte Seren: Seren von zwei für H. pylori negativen Individuen wurden mit entweder ganzen C. jejuni (Spur A), H. pylori (Spur B) oder E. coli (Spur C) adsorbiert.
Fig. 3: Partielle Reinigung der Proteine von 18 und 25 kDa: Beide Proteine wurden von ganzen Helicobacter pylori auf der Basis des Molekulargewichts unter Verwendung der präparativen SDS-PAGE mit kontinuierlicher Elution auf einem Modell 491 Prep- Cell (Bio-Rad) gereinigt.
Fig. 4: Seren, die von CLO-negativen Kindern erhalten wurden, durchmustert auf die Anwesenheit von IgG-Antikörpern gegen H. pylori. Die Figur zeigt einen Western Blot von H. pylori, hybridisiert mit Serum, das von CLO-negativen Kindern erhalten wurde. Alle Seren waren 1 : 50 mit PBS verdünnt, das fettfreie Trockenmagermilch (5%, Gew./Vol.) enthielt. Jede Spur stellt eine verschiedene Serumprobe dar.
Fig. 5: Von einem Antiserum gegen H. pylori erkannte Antigene auf C. jejuni und E. coli. Die Figur zeigt einen Western Blot von H. pylori (Spur A), C. jejuni (Spur B), und E. coli (Spur C), hybridisiert mit Antiserum des Kaninchens gegen H. pylori. Jedes Bakterium (5 ug) wurde einer SDS-PAGE unterworfen, gefolgt von Immunblotting.
Fig. 6: Western-Blot von gereinigtem Protein von 25 kDa, der mit Serum von einem Individuum entwickelt wurde, das negativ für H. pylori war. Das gereinigte Protein von 25 kDa wurde einer SDS-PAGE und Western Blotting unterworfen. Der Blot wurde mit Serum hybridisiert, das von einem Individuum erhalten wurde, das nicht mit H. pylori infiziert war.
Fig. 7: Biotinylierung von Proteinen, die auf der Oberfläche von Helicobacter pylori liegen. Auf Agar gewachsene H. pylori wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,3) geerntet und vor der Biotinylierung der auf der Oberfläche exponierten Proteine zweimal mit diesem Puffer gewaschen. Die Bakterien (~2 mg ml&supmin;¹) wurden in PBS (1 ml) resuspendiert und auf 37ºC vorgewärmt. Danach wurde Biotin-X-NHS (Sulfsuccinimidyl-6(biotinamido)-hexanoat; Calbiochem) mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. Nach 10 Min. Mischen bei 37ºC wurde die Markierungsreaktion durch die Zugabe von 1,5 M Tris-HCl (pH 8) mit einer Endkonzentration von 10 mM beendet. Die Suspension wurde durch Zentrifugation (10.000 g, 1 Min.) in eiskaltem PBS dreimal gewaschen. Die Überprüfung der Bakterien mittels Lichtmikroskopie nach den Markierungs- und Waschverfahren zeigte, daß die Zellen noch intakt und beweglich waren. Biotinylierter H. pylori wurde einer analytischen SDS-PAGE unterworfen, gefolgt von Western Blotting, um die biotinylierten Proteine zu identifizieren. Die Western Blots wurden mit Extravidin-Peroxidase (Sigma) entwickelt.
Fig. 8: Zeigt den Tymidin-Einbau von Lymphocyten als Antwort auf H. pylori wurde in der Anwesenheit und Abwesenheit von Interleukin 12.
Fig. 9: Zeigt den Tymidin-Einbau von peripheren mononukleären Zellen des Bluts in der Anwesenheit oder Abwesenheit von H. pylori mit oder ohne anti-Interleukin 10 oder rekombinantem Interleukin 12.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wir haben die Verbreitung der Immunreaktivität gegen H. pylori in infizierten und nicht infizierten Individuen untersucht und gefunden, dass nicht infizierte Individuen in ihrem B-Zell- und T-Zell-System eine hohe Antwort auf H. pylori haben. Spezifisch scheint die T- Zell-Immunantwort gegen H. pylori bei Individuen stärker zu sein, die für den Organismus negativ sind. Unter diesem Aspekt haben wir die Sekretion des Cytokins -Interferon untersucht, das bei der Tötung von Mikroorganismen durch Makrophagen extrem wichtig ist. Die Sekretion von -Interferon durch die T-Zellen von Patienten, die mit H. pylori infiziert waren, war beträchtlich niedriger als die Sekretion bei nicht infizierten Individuen, wenn ihre T-Zellen dem Organismus ausgesetzt wurden (Fan et al., 1993¹&sup8;). Diese Daten legen daher nahe, dass Individuen, die H. pylori-negativ sind, diesem Organismus ausgesetzt waren und sich wahrscheinlich von dem Organismus befreit haben. Darüber hinaus ist die Antwort auf den Organismus in dieser Gruppe von Individuen beträchtlich stärker als bei H. pylori- positiven Patienten.
Der Ausdruck "H. pylori-negative Individuen" bedeutet Individuen mit einer Immunreaktivität gegen H. pylori, die keine Anzeichen einer Kolonisierung des Magens mit H. pylori haben, wie bestimmt mittels Techniken wie einer oder mehreren von rascher Urease- Test, histologische Untersuchung oder Kultur von Magenbiopsien.
Eine zweite Komponente betrifft die Antikörperantwort gegen H. pylori in H. pylori- negativen Individuen. Kurz gesagt haben wir unter Verwendung eines empfindlichen Nachweissystems gezeigt, dass die Mehrzahl der H. pylori negativen Individuen nachweisbare Antikörper gegen zwei H. pylori-Proteine haben. Spezifisch haben diese Proteine ein MG vo 18-19 und 24-25 kDa. Es wird daher vorgeschlagen, dass eine starke Immunantwort gegen diese Antigene in einer schützenden Immunität gegen den Organismus resultiert. Darüber hinaus haben wir diese Proteine partiell sequenziert.
In vielen Fällen werden Antikörper gegen H. pylori mittels ELISA nachgewiesen.
Eine inhärente Beschränkung bei der Planung von Nachweissystemen auf der Basis von ELISA ist die Festlegung eines Grenzpunktes so, dass alle Proben unterhalb dieser Grenze als negativ angesehen werden. In dieser Situation werden selbstverständlich viele seropositive Fälle unerkannt bleiben und eine wahre Einschätzung des Vorkommens vorheriger Kontakte mit dem Organismus wird daher unterschätzt sein. In dieser Herangehensweise verwenden wir Western Blotting, um die Antigen-Spezifität der systemischen Antwort auf H. pylori bei gesunden und mit H. pylori infizierten Individuen zu untersuchen und wir haben gezeigt, dass das Vorkommen von Seropositivität bei H. pylori negativen Individuen viel höher ist als zuvor gezeigt worden war. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Antikörper gegen ein Protein von 24 bis 25 kDa in der Mehrzahl der H. pylori negativen Individuen nachweisbar sind. Diese wurden unter Verwendung eines Verfahrens nachgewiesen, das wir modifiziert haben und das verstärkte Chemilumineszenz genannt wird. Verstärkte Chemilumineszenz bei der Western Blot-Analyse zeigt, dass die Mehrzahl der nicht infizierten Individuen Antikörper hat, die spezifisch für H. pylori sind und Antigene erkennen, die auf anderen Mikroorganismen nicht vorhanden sind. Von diesen Antigenen ist das am häufigsten erkannte ein Protein von 24 bis 25 kDa, das spezifisch für H. pylori zu sein scheint. Diese Daten legen daher nahe, dass eine Immunisierung mit dem Protein von 24 bis 25 kDa oder einer Untereinheit davon das Potentiel haben könnte, eine schützende Immunität bei den Individuen hervorzurufen, die entweder nicht mit dem Organismus infiziert sind oder bei den Individuen, bei denen der Organismus durch anti-bakterielle Behandlung ausgerottet wurde. Ein zweites Protein wurde bei 18 bis 19 kDa in einer großen Untergruppe von H. pylori negativen Individuen ebenfalls identifiziert. In ähnlicher Weise könnte eine Immunisierung mit diesem Protein oder einer Untereinheit davon eine schützende Immunität hervorrufen.
Wir haben einen neuen Test für den Nachweis von Antikörpern gegen H. pylori entwickelt. Dieser Test verwendet Western Blotting und verstärkte Chemilumineszenz (ECL). Unter Verwendung dieses Tests haben wir gezeigt, dass etwa 75% der Individuen, die beim Routinetest wie dem schnellen Urease-Test negativ für H. pylori sind, tatsächlich gut nachweisbare Antikörper gegen H. pylori haben (Fig. 1).
Darüber hinaus werden diese Antikörper nicht von C. jejuni oder E. coli adsorbiert, was nahe legt, dass dies eine spezifische Antikörperantwort ist (Fig. 2). Besonders hervorzuheben ist, dass wir unter Verwendung von ECL Western Blotting über das Molekulargewicht eine Charakterisierung der Antigene durchgeführt haben, die durch diese Antikörper erkannt werden. Seren von nicht infizierten Individuen erkennen eine Reihe von Antigenen auf H. pylori. Das am häufigsten erkannte Antigen ist ein Protein von 24 bis 25 kDa, das bei über 70% von Individuen erkannt wird, die beim schnellen Urease-Test negativ für den Organismus sind. Dies legt daher nahe, dass das Protein von 24 bis 25 kDa ein immundominantes Antigen sein könnte, das bei Individuen, die für den Organismus negativ sind, eine starke Immunantwort hervorruft. Es wurde bei 18 bis 19 kDa ein zweites Protein indentifiziert, das bei H. pylori negativen Kindern eine signifikante Antikörperantwort hervorrief. Diese Proteine wurden durch N-terminale und interne Sequenzierung weiterhin charakterisiert, wie im Anhang erläutert.
Letztlich kann ein Cytokin, das von Makrophagen produziert wird und das als Interleukin 12 bezeichnet wird, als Antwort auf das Antigen die Produktion von γ-Interferon signifikant erhöhen. Wie vorstehend festgehalten ist die Antigen-spezifische Interferon- Produktion bei H. pylori-positiven Individuen reduziert. Die Zugabe von IL-12 zu Immunisierungsplänen mit einem Protein von 25 kDa könnte durch Erhöhung der γ- Interferon-Antwort erwartunsgemäß die Immunität des Wirts gegen H. pylori verstärken.
Materialien. Alle Antikörper wurden von Dako Ltd., High Wycombe, Bucks., U.K. erhalten. Alle anderen Chemikalien und Lösungsmittel wurden entweder von Sigma Chemical Company Ltd., Poole, Dorset, United Kingdom oder von BDH Chemicals Ltd., Poole, Dorset, United Kingdom bezogen.
SDS-PAGE. Die nicht kontinuierliche SDS-PAGE wurde im Wesentlichen wie bei Laemmli (1970)¹&sup9; beschrieben durchgeführt. Insgesamt 5 mg von mit Aceton ausgefälltem H. pylori-Protein wurden in jede Mulde gegeben. Die Gele wurden entweder mit Coomassie Blau R-250 gefärbt oder für das Immunblotting weiterverarbeitet. Molekulargewichtsmarker in einem weiten Bereich wurden von Bio-Rad Laboratories, 3300 Regatta Blvd., Richmond, CA 94804 bezogen Die Molekulargewichte sind in kDa ausgedrückt.
Western Blotting. Die Proteine von den SDS-PAGE-Gelen (30% T/2,67% C) wurden dem Elektroblotting (1 Std. 0,8 mA/cm²) auf eine PVDF-Membran unterzogen unter Verwendung eines halb-trocken Blottinggeräts (LKB/Pharmacia), im Wesentlichen wie von Towbin et al., (1979) beschrieben. Primäre Antikörper (menschliches Serum; Verdünnung 1/50-1/100) wurden unter Verwendung eines 1/5.000 verdünnten menschlichen anti-IgG (mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert) in Kombination mit verstärkter Chemilumineszenz nachgewiesen. Die Blots wurden mit PBS gewaschen, das fettfreie Trockenmagermilch (5%, Gew./Vol.) und Tween-20 (0,05%, Vol./Vol.) enthielt. Die Blots wurden 1-10 Sek. einem Kodak X-OMAT S-Film ausgesetzt. Die belichteten Filme wurden in einem Kodak LX-24 Entwickler entwickelt und in einem dentalen Kodak X-ray-Fixierbad fixiert.
Seren. Serumproben wurden vom Research Centre, Our Ladies Hospital for Sick Children, Crumlin, Dublin, erhalten. Alle Individuen wurden für alle medizinischen Zustände behandelt außer gastroenterologische Erkrankungen. Außerdem wurden von einer zufällig ausgewählten Gruppe an Kindern (Harcourt Street Childrens Hospital, Dublin) Blutproben entnommen oder von Erwachsenen, die die gastroenterologische Abteilung am St. James's Hospital, Dublin aufsuchten. Bei allen Patienten wurde ein schneller Urease-Test (CLOTest) durchgeführt. Die Patienten wurden auf der Basis von positiven oder negativen Antworten auf den schnellen Urease-Test als H. pylori-positiv oder H. pylori-negativ definiert.
Anti-H. pylori-Antiserum. Anti-H. pylori-Antiserum war eine freundliche Gabe von Prof. B. Drumm und Dr. M. Clyne. Das Antiserum wurde in weißen New Zealand-Kaninchen gegen ganzes H. pylori unter Verwendung herkömmlicher Immunisierungs- und Boost-Verfahren hergestellt.
Proteinmessungen. Protein wurde gemäß dem Verfahren von Markwell et al. (1978)²&sup0; mit Rinderserumalbumin als Proteinstandard gemessen.
Adsorption von Seren. Antiseren wurden entweder an E. coli oder C. jejuni durch 2 Std. Inkubation einer Suspension der Bakterien mit Patientenseren bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Mischen adsorbiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (12.000 · g, 3 Min.) aus der Suspension entfernt.
Bakterienstämme und Wachstumsbedingung. Die klinischen Isolate von H. pylori, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Antrum-Biopsien isoliert, die von Patienten erhalten wurden, die die gastroenterologische Klinik am St. James's Hospital, Dublin, aufsuchten. H. pylori wurde 4 Tage bei 37ºC unter mikroaerophilen Bedingungen auf 7% lysiertem Pferdeblut-Agar gezüchtet. Die Zellen wurden in eiskalter phospatgepufferter Salzlösung (pH 7,5) geerntet, die PMSF (1 mM), EDTA (1 mM) und Leupeptin (50 ug/ml) enthielt. Die Zellen wurden vor der Verwendung zweimal durch Zentrifugation (10.000 · g, 5 Min., 4ºC) in diesem Puffer gewaschen. C. jejuni war ein klinisches Isolat aus dem Stuhl eines Patienten mit C. jejuni-Enteritis und wurde zwei Tage genau wie vorstehend beschrieben gezüchtet mit der Ausnahme, dass die Inkubationstemperatur 42ºC war. Der in dieser Studie verwendete E. coli-Stamm ist der kommerziell erhältliche (Gibco) NTCC 11637 und wurde freundlicherweise von Dr. Ciaran Cronin, Dpt. Pharmacology, University College Dublin, zur Verfügung gestellt.
Verfahren, die bei der Identifikation und partiellen Reinigung von zwei neuen Antigenen von Helicobacter pylori verwendet wurden.

Verfahren

Western Blotting. Proteine von SDS-PAGE-Gelen (30% T/2,67% C) wurden unter Verwendung eines halbtrockenen Blottingapparats (LKB/Pharmacia) auf eine PVDF- Mmebran elektrogeblotted (1 Std. 0,8 mA/cm²). Primäre Antikörper (menschliches Serum; Verdünnung 1/50-1/100) wurden unter Verwendung einer 1/5.000 Verdünnung von menschlichem anti-IgG (konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase) in Verbindung mit verstärkter Chemilumineszenz (siehe nachstehend) nachgewiesen. Die Blots wurden mit phospatgepufferter Salzlösung (pH 7,5) gewaschen, die fettfreie Trockenmagermilch (5%, Gew./Vol.) und Tween-20 (0,05%, Vol./Vol.) enthielt. Die Blots wurden 1-10 Sek. einem Kodak X-OMAT S-Film ausgesetzt. Die belichteten Filme wurden in einem Kodak LX-24 Entwickler entwickelt und in einem dentalen Kodak X-ray-Fixierbad fixiert.

Verstärkte Chemilumineszenz (ECL)

Die bevorzugte Verwendung der Chemilumineszenz zum Nachweis von Antikörpern beim Western Blotting gegenüber den herkömmlichen Verfahren der Verwendung von chromogenen Substraten als Nachweisreagens wurde primär wegen des berichteten Gewinns bei der Empfindlichkeit des Nachweises (etwa 10-fach) gegenüber dem bei der Verwendung von Chromogenen etabliert. Oxidiertes Luminol emittiert sichtbares Licht und die Intensität dieser Lichtemission erhöht sich etwa 1000-fach in der Gegenwart von Verstärkern (z. B. Jodphenol). Das Verfahren ist nachstehend beschrieben.
Substrat Konzentration/Menge
Luminol 1,2 mM (in 0,1 M-Tris (50 ml), pH 8,8)
4-Jodphenol 0,4 mM (vor der Verwendung in DMSO gelöst)
Wasserstoffperoxid 17 ul einer 30%-igen (Vol./Vol.) Lösung
Die Blots wurden eine Minute in den vorstehenden Gemischen inkubiert und dann wie vorstehend beschrieben einem Röntgenfilm ausgesetzt.

Partielle Reinigung der Proteine von 18 und 25 kDa

Beide Proteine wurden auf der Basis des Molekulargewichts (Fig. 2) unter Verwendung der präparativen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE) mit kontinuierlicher Elution auf einem Modell 491 Prep-Cell (Bio-Rad) aus ganzen Helicobacter pylori partiell gereinigt. Dieses Verfahren ermöglicht uns die quantitative Reinigung präparativer Mengen von Proteinen in löslicher Form.

Reinigungsverfahren

25 mg H. pylori wurden mit eiskaltem Aceton ausgefällt, einmal mit Aceton gewaschen und der Niederschlag dann in 3,8 ml SDS-PAGE-Probenpuffer (62 mM Tris, pH 6,8; Glycerin (10%, Vol./Vol.); SDS (2%, Vol./Vol.); 2-Mercaptoethanol (5%, Vol./Vol.); Bromphenol-Blau (0,002%, Vol./Vol.) gelöst. Publizierte Elektrophoreseverfahren mit kleineren Modifikationen wurden während der Probenpräparation befolgt.
Beladung. Das Proteingemisch in Probenpuffer wurde auf ein 12,5%-iges Polyacrylamid- Röhrengel (30% T/2,67% C) geladen. Die Ausmaße des Röhrengel waren: 28 mm innerer Durchmesser; oberer Oberfläche 3,6 cm²; Stapelgel 2 cm; Auflösegel 10 cm.
Laufbedingungen: Die Elektrophorese wurde bei 40 mA (Gleichstrom) übernacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Fraktionen (1 ml) wurden mit 0,1 ml/Min. gesammelt. Proben von jeder Fraktion (5 ul) wurden einer analytischen SDS-PAGE unterworfen, um die Reinheit und Antigenität von jedem Protein zu überprüfen. Jede Fraktion im Molekulargewichtsbereich von Interesse wurde bei dem Versuch, die einzelnen immunogenen Proteine zu isolieren und charakterisieren, sowohl mittels SDS-PAGE (um die Reinheit zu überprüfen) und Western Blotting (um die Antigenität zu überprüfen) durchmustert. Die Auflösung dieses Verfahrens ist so, dass reine Präparationen einzelner Proteine erhalten werden können, nachdem optimale Bedingungen der Elektrophorese etabliert worden sind. Vorläufige Optimierungsprotokolle hatten die Elektrophorese von Gemischen von H. pylori-Proteinen unter Bedingungen zur Folge, die die hohe Auflösung von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht favorisierten. Die endgültigen Bedingungen der Elektrophorese, die verwendet wurden, um die partielle Reinigung der ausgewählten Proteine zu erreichen, sind in der Abteilung Verfahren detailliert beschrieben. Unter Verwendung genau dieser Bedingungen eluierte das Protein von 18 kDa zwischen ml 11-14 und das Protein von 25 kDa eluierte zwischen ml 16-20. Die Molekulargewichte der Proteine wurden mittels analytischer SDS-PAGE unter Verwendung einer Reihe von Markern für niedriges Molekulargewicht (Bereich: 14,5 kDa-66 kDa; Code: Sigma SDS-7) bestimmt und Western Blotting bestätigte, dass diese Proteine die Immunogene von Interesse waren.
Fig. 1 zeigt die Western-Blot-Analyse der Antikörperantworten gegen H. pylori bei Individuen, die im schnellen Urease-Test negativ für H. pylori sind. Western Blotting wurde unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Nachweissystems wie vorstehend beschreiben durchgeführt. Antikörper gegen eine weiten Bereich von H. pylori-Proteinen wurden in Individuen gesehen, die beim schnellen Urease-Test negativ für H, pylori sind. Das häufigste Antigen, für das ein Antikörper nachgewiesen wurde, war das Protein von 25 kDa. Fig. 3 zeigt das Elutionprofil eines präparativen SDS-Gels der Proteine von 25 kDa und 18 kDa. Diese Proteine wurden durch N-terminale und interne Sequenzierung weiter charakterisiert, wie im Anhang ausgeführt.

BEISPIEL 1

CLO-negative Erwachsene

In ähnlicher Weise wurde eine Gruppe von Seren von 19 Erwachsenen auf IgG- Antikörper gegen H, pylori durchmustert. Jedes dieser Individuen war CLO-negativ, 83% hatten jedoch nachweisbare Antikörper (IgG) gegen H. pylori (Fig. 1). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse intensiven früheren Kontakt mit H. pylori nahe. Das häufigste Antigen, gegen das ein Antikörper nachgewiesen wurde, war eine Art von 25 kDa.

CLO-negative Kinder

Die systemische humorale Immunantwort (IgG) gegen H. pylori wurde auch in zwei Gruppen von Kindern untersucht. Keines dieser Individuen hatte in irgendeiner Form eine Therapie gegen H. pylori erhalten. In fast allen Fällen hatten die Kinder jedoch eine spezifische Antikörperantwort gegen H. pylori. Die erste untersuchte Gruppe bestand aus zwanzig Kindern (Altersbereich: 4-15 Jahre), die im CLO-Test negativ für H. pylori waren. Von diesen hatten 75% nachweisbare IgG-Antikörper gegen H. pylori (Fig. 4).
Die zweite Gruppe von Kindern (n = 20) war asymptomatisch und suchten das Krankenhaus wegen anderer Zustände als gastrointestinalen Erkrankungen auf. 13/18 (72%) hatten jedoch nachweisbare IgG-Antikörper gegen mehrere H. pylori-spezifische Antigene. Von der Intensität der Antwort legen diese Daten jedoch nahe, dass die Antikörperantwort wahrscheinlich auf früheren Kontakten mit dem Bakterium beruht, verglichen mit der beträchtlich stärkeren Antwort, die bei H. pylori-positiven Individuen beobachtet wird.

BEISPIEL 2

Kreuzreaktivität mit anderen Bakterien

Da viele Bakterien gemeinsame antigene Determinanten haben, untersuchten wir das Ausmaß der Kreuzreaktivität zwischen H. pylori und dem nahe verwandten C. jejuni, zusätzlich zu E. coli, unter Verwendung von zwei sich ergänzenden Verfahren. Zunächst wurde mittels Western Blotting die Fähigkeit des polyclonalen Antiserums gegen H. pylori untersucht, Antigene auf C. jejuni und E. coli zu erkennen (Fig. 2).
Antiserum gegen H. pylori erkannte eine Anzahl an antigenen Determinanten auf E. coli und C. jejuni. Spezifisch erkennt das Antiserum Proteine mit dem Molekulargewicht 72, 50, 40, 36 und 25 kDa auf C. jejuni und Proteine mit dem Molekulargewicht 200, 116, 45 und 38 kDa auf E. coli (Fig. 5). Von diesen zeigen nur 3 Proteine (70, 25 kDa von C. jejuni und 200 kDa von E. coli) eine ausgeprägte Kreuzreaktivität mit Antiserum gegen H. pylori. Somit ist die beobachtete Kreuzreaktivität klar nicht intensiv. Zum zweiten zeigten die Adsorptionsexperimente, dass diese kreuzreaktive Antigenerkennung von geringer Bedeutung war. Serumproben, die mit klinischen Isolaten von H. pylori und C. jejuni adsorbiert waren zusätzlich zu einem kommerziell erhältlichen Stamm von E. coli, zeigten, dass die Seroreaktivität durch Adsorption mit H. pylori eliminiert werden konnte, aber nicht mit C. jejuni oder E. coli (Fig. 2). Fig. 2 ist ein repräsentatives Experiment. Adsorptionsuntersuchungen wurden mit etwa der Hälfte der Serumproben gemacht, die bei dieser Studie durchmustert wurden, mit ähnlichen Ergebnissen wie den gezeigten. Die Proteine mit 18 und 25 kDa wurden auch auf den H. pylori-Referenzstämmen NTCC 11637 und 11638 zusätzlich zu allen getesteten klinischen Stämmen nachgewiesen.
Nachdem wir das Protein von 24-26 kDa mittels präparativer Elektrophorese mit kontinuierlicher Elution, wie in Fig. 3 gezeigt, partiell gereinigt hatten, bestätigten wir durch Hybridisierung eines Western Blots des Proteins von 24-26 kDa mit Serum von einem nicht infizierten Individuum die Antigenität des Proteins von 24-26 kDa (Fig. 6). Das in Fig. 6 gezeigten Beispiel ist ein repräsentatives Experiment, wobei der Blot mit Serum von einem Individuum inkubiert wurde, das nicht mit H. pylori infiziert war. Klar enthält diese Serumprobe Antikörper, die spezifisch das Protein von 24-26 kDa erkennen und darüber hinaus zeigen die Ergebnisse von diesem Experiment, das die Antigenpräparation mit diesem Protein hoch angereichert ist und dass in dieser Präparation keine anderen immunogenen Proteine anwesend sind. Mit dem Protein von 18-20 kDa haben wir ähnliche Ergebnisse erhalten.

Beispiel 3

Biotinylierung von ganzen intakten Helicobacter pylori

Auf Agar gezüchteter H. pylori wurde in phophatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) geerntet und vor der Biotinylierung der an der Oberfläche exponierten Proteine zweimal mit diesem Puffer gewaschen. Die Bakterien (~2 mg ml&supmin;¹) wurden in PBS (1 ml) resuspendiert und auf 37ºC vorgewärmt. Danach wurde Biotin-X-NHS (Sulfosuccinimidyl-6(biotinamido)- hexanoat; Calbiochem) mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, das unmittelbar vor der Verwendung hergestellt worden war. Nach 10 Minuten Mischen bei 37ºC wurde die Markierungsreaktion durch die Zugabe von 1,5 M Tris-HCl (pH 8) mit einer Endkonzentration von 10 mM beendet. Die Suspension wurde dreimal durch Zentrifugation (10.000 g, 1 Min.) in eiskaltem PBS gewaschen. Die Überprüfung der Bakterien mittels Lichtmikroskopie nach den Markierungs- und Waschverfahren zeigte, dass die Zellen noch intakt und beweglich waren.

Analyse von biotinylierten Proteinen

Biotinylierte H. pylori wurden einer analytischen und präparativen SDS-PAGE unterworfen, gefolgt von Western Blotting, um biotinylierte Proteine zu identifizieren. Die Western Blots wurden mit Extravidin-Peroxidase (Sigma) entwickelt. Es wurde ein intensiver Einbau des Biotinesters in H. pylori-Proteine beobachtet (Fig. 7). Darüber hinaus ist es nach der Figur klar, dass Proteine im Bereich 18-24 kDa biotinyliert werden, wie auch eine Reihe von anderen Proteinen (Tabelle 1), was anzeigt, dass diese Proteine auf der Oberfläche des Bakteriums vorhanden sind. Tabelle 1

Verfahrensbeschreibung

T-Zell-Immunantwort auf Helicobacter pylori

Wir untersuchten die proliferativen Antworten von T-Lymphocyten auf H. pylori unter Verwendung eines Thymidineinbau-Tests. Kurz gesagt wurden mittels Dichtegradienten- Zentrifugation Lymphocyten auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten isoliert. In eine Mikrotiterplatte mit 96 Mulden wurden mit einer Dichte von 10&sup5; Zellen/Mulde in RPMI 1640- Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, Lymphocyten gesät. Eine mit Ultraschall behandelte und bestrahlte Präparation von H. pylori wurde mit einer Konzentration von 3 ug/ml zugegeben. In die Kontrollmulden wurde nur Medium zugegeben. Zusätzlich wurde Interleukin 12 (R&D Suppliers) mit einer Konzentration von 500 pg/ml zugegeben. Die Zellen wurden dann 4 Tage bei 37ºC in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; gezüchtet. Nach 4 Tagen wurde mit Tritium markiertes Thymidin mit 1 uCi/ml zugegeben und die Kultur weitere 24 Stunden fortgesetzt, bevor unter Verwendung eines vielfachen automatisierten Probenernters geernete wurde. In zusätzlichen Experimenten wurde unter Verwendung des OKT3- Antikörpers Zellen zum CD3 T-Zellrezeptor assoziierten Komplex in der Gegenwart und Abwesenheit der vorstehenden H, pylori-Präparation stimuliert. Bei diesen Untersuchungen wurde Interleukin 12 in ähnlicher Weise zugegeben. Bei einigen Experimenten wurde Antikörper gegen Interleukin 12 zugegeben.

Beispiel 4

Die T-Zell-Antwort gegen H. pylori wird durch Interleukin 12 signifikant erhöht

Bei einer Gruppe von Patienten, bei denen die proliferativen Antworten von Lymphocyten auf H. pylori wie unter Methoden beschrieben untersucht wurden, erhöhte Interleukin 12 signifikant die Proliferation der Population an peripheren mononukleären Zellen des Bluts auf H. pylori (n = 12, p < 0,05) (Fig. 8). Diese Daten zeigen klar, dass Interleukin 12 in Bezug auf die Immunogenität von H. pylori adjuvante Eigenschaften hat.

Interleukin 12 überwindet die Suppression der T-Zell-Antworten, die durch H. pylori induziert werden

Die Präparation an H. pylori-Antigen inhibierte signifikant die Proliferation, die durch das T-Zell-Mitogen OKT3 induziert wird. Diese Inhibition konnte unter Verwendung eines Antikörpers gegen Interleukin 10 beseitigt werden, einem Cytokin, das von T-Helfer 2-Zellen produziert wird und von dem bekannt ist, dass es den T-Helfer 1-Zell-Weg supprimiert, der in die Zellproliferation involviert ist. Diese Daten legen daher nahe, dass die Suppression der T- Zell-Proliferation, die durch H. pylori induziert wird, durch Interleukin 10 durch den T-Helfer 2-Weg vermittelt wird. Interleukin 12 beseitigte auch die Suppression von T-Zell-Antworten, die durch H. pylori induziert werden, und erhöhte die proliferativen Antworten signifikant über die Grundlinie der von OKT3 induzierten Antworten, was nahe legt, dass dieses Cytokin in der Lage ist, die Wirkungen des H. pylori T-Helfer 2-Wegs zu überwinden.
Fig. 8 zeigt den Thymidineinbau von Lymphocyten als Antwort auf H. pylori in der Anwesenheit und Abwesenheit von Interleukin 12. Interleukin 12 erhöhte signifikant die Proliferation der peripheren mononukleären Zellen des Bluts als Antwort auf H. pylori.
Fig. 9 zeigt den Thymidineinbau von peripheren mononukleären Zellen des Bluts in der Anwesenheit oder Abwesenheit von H. pylori mit oder ohne anti-Interleukin 10 oder rekombinantem Interleukin 12. Interleukin 12 und anti-Interleukin 10 beseitigten signifikant die von H. pylori induzierte Inhibition der Proliferation von Lymphocyten.
Es sollte verstanden werden, dass Interleukin 12 auch als Adjuvans mit einem H. pylori-Protein oder einem Derivat oder Fragment davon verwendet werden kann. Seine Anwendung ist nicht beschränkt auf die vorstehend beschreibenen spezifischen Proteine von 25 kDa oder 18 kDa. Das Interleukin 12 kann auch auf eine Weise mit der H. pylori-Einheit konjugiert sein, die es zuläßt, dass das Interleukin in vivo freigesetzt wird, zum Beispiel durch Peptinsäure und Magenenzyme/oder Urease.
Es wird vom Durchschnittsfachmann verstanden, dass, während wir uns auf ein Molekulargewicht von 24 bis 25 kDa und 18 bis 19 kDa bezogen haben, das Molekulargewicht im Bereich 24 bis 26 kDa und 17 bis 19 kDa liegen kann. Andere verwandte Organismen wie H. Felis oder H. mustelis können Magenerkrankungen in Tiermodellen erzeugen.
Die Kreuzreaktivität zwischen Proteinen von Helicobacter-Arten kann bedeuten, dass Antigene von einer einzelnen Bakterienart in einem Tier Schutz bewirken könnten, das nicht ihr normaler Wirt ist.
Die dominanten Antigene, gegen die bei Helicobacter pylori negativen Individuen Antikörper nachgewiesen wird, sind die Antigene von 18 bis 19 und 24 bis 25 kDa. Somit wäre eine Präparation von Antigenen, die alle Antigene enthält, die unter 30 kDa liegen, vorzugsweise unter 29 kDa, idealerweise unter 28 kDa und vorzugsweise unter 27 kDa, zu verwenden und die Präparation wäre mit den immundominanten Antigenen, die bei einem möglichen Impfstoff zu verwenden wären, angereichert.
Es zeigt sich deutlich, dass das Cytokin Interleukin 12 als Adjuvans wirkt, um die Immunogenität von H. pylori zu verstärken. Insbesondere verstärkt es die Immunogenität der Proteinfraktionen unter 30 kDa, insbesondere die Proteinfraktionen von 18 kDa und 25 kDa von H. pylori.

Partielle Sequenzierung der zwei Antigene von Helicobacter pylori.

N-terminale Sequenzanalyse

Gereinigte Proteine von 18 und 24 kDa wurden aus 12,5%-igen Polyacrylamidgelen auf PVDF bzw. ProBlott elektrogeblotted. Die Proteine wurden mittels 15 Sek. Färbung mit 0,1%-igem Amidoschwarz (in 1% Essigsäure, 40% Methanol) auf den Membranen lokalisiert, gefolgt von Entfärbung durch mehrfachen Wechsel von destilliertem entionisiertem Wasser. Die Membranen wurden sorgfältig an der Luft getrocknet und unter Verwendung des Edman-Abbauverfahrens, wie von Matsudaira (1989²¹) beschrieben, der Sequenzanalyse unterzogen.
Die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins von 25 und 18 kDa ist in den Sequenz Id Nrn. 1 und 2 gegeben.

Peptidkartierung

Das N-Chlorsuccinimid-Peptidkartierungsverfahren von Lischwe und Ochs (1982)²² wurde mit kleineren Modifikationen verwendet. Banden von Interesse wurden durch kurzes Anfärben des Gels mit Coomassie-Blau R250 (in 50% Methanol, 10% Essigsäure) auf SDS- PAGE-Gelen lokalisiert und dann mit einer Skalpellklinge ausgeschnitten. Das in den Gelscheiben vorhandene Protein wurde mit N-Chlorsuccinimid (15 mM) in Essigsäure/Harnstoff/Wasser (1 : 1 : 1, Vol./Gew./Vol.) 30 Min. bei 20ºC verdaut. Die behandelten Gelscheiben wurden dann durch mehrfaches Wechseln von Wasser gewaschen und dann mit SDS-PAGE-Probenpuffer äquilibriert, genau wie von Lischwe und Ochs beschrieben. Letztlich wurden die Gelscheiben in die Probenmulden eines 15%-igen Polyacrylamid-SDS-PAGE-Gels gegeben und einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die getrennten Peptide mittels Western Blotting auf PVDF oder ProBlott übertragen. Die Peptide wurden mittels Anfärbung der Membran mit 0,1%-igem Amidoschwarz in Essigsäure (1%) und Methanol (40%) sichtbar gemacht. Nach intensivem Waschen mit Wasser wurden die Peptide ohne weitere Modifikationen der Sequenzierung unterworfen.
Mercaptoessigsäure (2 mM) war während aller SDS-PAGE-Elektrophoreseverfahren im oberen Elektrodenpuffer enthalten. Diese mobile Thiol verhält sich wie ein Abfänger von freien Radikalen und verhindert somit die N-Blockierung.
Die Aminosäuresequenzen für interne Peptide vom Protein von 18 und 25 kDa sind in den Sequenz Id. Nrn. 3 und 4 gegeben.

Extraktion von chromosomaler DNA von Helicobacter pylori

Chromosomaler DNA wurde wie beschrieben (Silhavy et al., 1984. Experiments with gene fusions. C.S.H. publications) extrahiert.

Amplifikation der Sequenz des Proteins von 18-19 kDa unter Verwendung von degenerierten Primern.

Von den in den Sequenz Id. Nrn. 2 und 3 gelisteten Aminosäuresequenzen wurden degenerierte DNA-Sequenzen abgeleitet. Von diesen Sequenzen wurden vier degenerierte Primer entworfen, um eine zweistufige, "nested", PCR-Reaktion zuzulassen. Eag1 Restriktionsenzymstellen wurden in jeden Primer eingebaut, um die anschließende Clonierung des Fragments zuzulassen. Wenn an irgendeiner Stelle drei oder mehr Basen möglich waren, wurde anstelle aller möglichen Basen Inosin eingebaut, außer da, wo solche Stellen vier Basen oder weniger vom Ende des 3'-Primers (3 Strich) entfernt waren, wobei dann alle möglichen Basen eingeschlossen wurden. Inosin wurde auch an den Stellen vermieden, die unmittelbar benachbart zu den Eag1-Stellen waren.

Degenerierte Primer für das Gen p18:

1. GAARA CGGCC GARAT IYTIA ARCAY YTICA RGC
2. TCYTC GGCCG TYTCY TCIGT NGCY
3. RATIY TCGGC CGYYI CARGC IGAYG C
4. ATYTC GGCCG TIGCY TTRTG NAC
Die genomische DNA für das Gen p18 für das Protein von 18-19 kDa wurde unter Verwendung des äußeren Satzes an Primern (Primer 1 & 2) wie folgt amplifiziert: die Proben wurden 3 Minuten auf 94 Grad C erhitzt, um die DNA zu denaturieren, gefolgt von 35 Zykeln von 30 Sekunden bei 94 Grad C, 56 Grad C für 40 Sekunden und 72 Grad C für 30 Sekunden. In der Gegenwart von 2,5 mM MgCl&sub2; und 0,2 mM dNTPs wurden in einem Reaktionsvolumen von 50 ul 100 umol von jedem Primer verwendet. 1 ul dieser Reaktion wurde als das Substrat für die "nested" Reaktion verwendet. Diese Reaktion war dieselbe für die vorstehende für Reaktion ausgeführt, außer dass die inneren Primer (Primer 3 & 4) durch die externen Primer ersetzt wurden und dass eine Konzentration von 2,0 mM MgCl&sub2; verwendet wurde. Die Elektrophorese der Produkte der Reaktion resultierte in einer klar sichtbaren Bande auf einem 2%-igen Agarosegel, die auf etwa 120 bp Größe geschätzt wurde (beurteilt auf einer Leiter der molekularen Größe).

Sequenzierung der amplifizierten DNA-Sequenz.

Das "nested" PCR-Fragment, das dem Gen für das Protein von 18-19 kDa entspricht, wurde durch Verdau des Fragments mit Eag1 und Ligierung in die einzelne Eag1-Stelle im Bluescript-Vektor (Stratagene) cloniert. Es wurden E. coli-Zellen transformiert (gemäß Standardverfahren) und es wurde unter Verwendung des Verfahrens der alkalischen Lyse (Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning: A laboratory Manual 2. Ausg., CSH publications) Plasmid-DNA geerntet, gefolgt von einem Schritt des Verdaus mit einer RNAase, einer Extraktion mit Phenol/Chloroform und einer Präzipitation unter Verwendung von 2,5 M Ammoniumacetat und 2 Volumen Ethanol. Es wurde unter Verwendung von universellen Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierungsprimern zwei unabhängige Isolate von Plasmid- DNA sequenziert. Die inserierte DNA, die aus dem p18-Gen abgeleitet wurde, wurde in der Vorwärts- und Rückwärtsorientierung sequenziert. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines automatischen Sequenzierungsgeräts von ABI und eines auf einem Genpak PCR basierenden Sequenzierungs-Kit mit fluorezierenden Didesoxy-Kettenterminator-Enden durchgeführt.
Die Sequenz der Basen zwischen dem Ende der internen PCR-Primer ist:
Diese Sequenz an Basen wird in die Aminosäuresequenz translatiert, die in Sequenz Id. Nr. 5 aufgelistet ist.
Diese Sequenz (Sequenz Id. Nr. 5) überlappt sowohl mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des Proteins von 18 kDa, die in Sequenz Id. Nr. 2 aufgelistet ist, und der internen Aminosäuresequenz des Proteins von 18 kDa, die in Sequenz Id. Nr. 3 aufgelistet ist, um die erweiterte N-terminale Aminosäuresequenz zu ergeben, die in Sequenz Id. Nr. 6 aufgelistet ist.
Viele Variationen der beschriebenen spezifischen Ausführungsformen sind leicht vorstellbar und entsprechend ist die Erfindung nicht beschränkt auf die beschriebenen Ausführungsformen, die im Detail variiert werden können.

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ANHANG

SEQUENZLISTEN

(1) ALLGEMEINE INFORMATION
(I) ANMELDER
(A) NAME: RICAN LIMITED
(B) STRASSE: 1 STOKES PLACE
(C) STADT: DUBLIN 2,
(D) LAND: IRLAND
(E) POSTLEITZAHL:
(F) TELEPHON: 353-1-2881230
(G) TELEFAX: 353-1-2883439
(II) TITEL DER ERFINDUNG: Helicobacter-Proteine und -Impfstoffe
(III) ZAHL AN SEQUENZEN: 6
(IV)
(V) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG: ANMELDUNGS-NR.:
(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID. NR.: 1
(I) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 20 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) TOPOLOGIE: LINEAR
(II) MOLEKÜLTYP: PROTEIN
(IV) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: HELICOBACTER PYLORI (XI) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 1
(3) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID. NR.: 2
(I) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 20 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) TOPOLOGIE: LINEAR
(II) MOLEKÜLTYP: PROTEIN
(V) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: HELICOBACTER PYLORI (XI) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 2
(4) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID. NR.: 3
(I) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 20 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) TOPOLOGIE: LINEAR
(II) MOLEKÜLTYP: PROTEIN
(VI) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: HELICOBACTER PYLORI (XI) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 3
(5) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID. NR.: 4
(I) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 4 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) TOPOLOGIE: LINEAR
(II) MOLEKÜLTYP: PROTEIN
(IV) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: HELICOBACTER PYLORI (XI) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 4
(6) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID. NR.: 5
(I) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 21 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) TOPOLOGIE: LINEAR
(II) MOLEKÜLTYP: PROTEIN
(IV) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: HELICOBACTER PYLORI (XI) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR. 5
(7) INFORMATION FÜR SEQUENZ ID. NR.: 6
(I) SEQUENZCHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 46 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) TOPOLOGIE: LINEAR
(II) MOLEKÜLTYP: PROTEIN
(VII) ORIGINALQUELLE: (A) ORGANISMUS: HELICOBACTER PYLORI

Claims

1. Impfstoff zur Behandlung oder Vorbeugung einer Helicobacter pylori-Infektion oder einer Helicobacter pylori-assoziierten Krankheit, umfassend ein Helicobacter pylori-Protein, gegen welches Immunreaktivität in Helicobacter pylori-negativen Individuen festgestellt wird, wobei das Protein eine oder beide der folgenden Komponenten umfasst:

(a) ein Helicobacter pylori-Protein mit einem Molekulargewicht von 18 bis 19 kDa und einer oder mehrerer der folgenden Sequenzeigenschaften:

(I) eine N-terminale Aminosäuresequenz wie aufgeführt unter SEQ ID NO.: 2, oder ein Teil davon;

(ii) eine N-terminale Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID No.: 6, oder ein Teil davon;

(iii) eine interne Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO.: 3, oder ein Teil davon; oder ein Derivat, Fragment oder eine Mutante des Helicobacter pylori-Proteins,

(b) ein Helicobacter pylori-Protein mit einem Molekulargewicht von 24 bis 25 kDa und einer oder mehrerer der folgenden Sequenzeigenschaften:

(i) eine N-terminale Aminosäuresequenz wie aufgeführt unter SEQ ID NO.: 1, oder ein Teil davon;

(ii) eine interne Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO.: 4, oder ein Teil davon; oder ein Derivat, Fragment oder eine Mutante des Helicobacter pylori-Proteins.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Immunreaktivität auf Antikörpern basiert.

3. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, einschließlich eines pharmazeutischen Trägers.

4. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Anspüche in Kombination mit einem pharmakologisch passenden Adjuvans.

5. Impfstoff nach Anspruch 4, wobei das Adjuvans Interleukin 12 ist.

6. Impfstoff nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Adjuvans ein Hitzeschock- Protein ist.

7. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, einschließlich mindestens eines anderen pharmazeutischen Produkts.

8. Impfstoff nach Anspruch 7, wobei das pharmazeutische Produkt ein Antibiotikum ist, vorzugsweise ausgewählt aus einem oder mehreren Mitgliedern der Gruppe bestehend aus Metronidazol, Amoxycillin, Tetracyclin, Erythromycin, Clarithromycin oder Tinidazol.

9. Impfstoff nach Anspruch 7 oder 8, wobei das pharmazeutische Produkt ein antibakterielles Agens wie zum Beispiel Wismutsalze einschließt.

10. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in einer Form zur oralen Verabreichung.

11. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in einer Form zur intranasalen Verabreichung.

12. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in einer Form zur intravenösen Verabreichung.

13. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in einer Form zur intramuskulären Verabreichung.

14. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einschließlich eines Peptid- Verabreichungssystems.

15. Verwendung des Helicobacter pylori-Proteins gemäß der Definition in Anspruch 1 oder eines Derivats oder Fragments oder einer Mutante davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Helicobacter pylori-assoziierten Krankheiten.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei das hergestellte Medikament ein Impfstoff nach einem der Ansprüche 2 bis 14 ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welcher eine Helicobacter pylori-Infektion oder Helicobacter pylori- assoziierte Krankheit behandelt oder verhindert, das Verfahren umfassend:

Gewinnen eines Helicobacter pylori-Proteins nach Anspruch 1; und

Herstellen eines Impfstoffpräparates, das das Protein oder das Derivat oder Fragment oder die Mutante davon umfasst, welche(s) geeignet ist zur Verabreichung an einen Wirt und welche(s) nach Verabreichung eine Immunantwort verursacht.