ES2352082T3 - Polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección. - Google Patents
Polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección. Download PDFInfo
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Abstract
Un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto (ORF) de un genoma de Chlamydia pneumoniae, que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos ORF291 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 291; (b) una secuencia de nucleótidos que exhibe una identidad de al menos 80% con la secuencia de la SEQ ID No. 291; o (c) una secuencia complementaria de la misma.
Description
Polipéptido de la membrana externa de
Chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en
particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de
una infección polipéptido de la membrana externa de Chlamydia
pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para
el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección.
El objeto de la invención es la identificación,
a partir de la secuencia genómica, de la secuencia de nucleótidos
que codifican un polipéptido de la membrana externa de Chlamydia
pneumoniae, así como vectores que incluyen dicha secuencia y
células o animales transformados con estos vectores. La invención
también se refiere a métodos para detectar estos ácidos nucleicos o
polipéptidos y a kits para diagnosticar una infección por
Chlamydia pneumoniae. Finalmente, la invención comprende
composiciones composiciones farmacéuticas, en particular vacunas,
para la prevención y/o el tratamiento de infecciones por
Chlamydia pneumoniae.
El análisis comparativo de la secuencia del gen
que codifica el ARN ribosómico 16S se ha usado ampliamente para el
estudio filogenético de procariotas. Esta estrategia ha hecho
posible clasificar las clamidias entre las eubacterias, entre las
cuales representan un grupo bien aislado que, sin embargo, tiene una
asociación muy débil con los planctomices. De esta manera, las
clamidias presentan algunas características únicas dentro de las
eubacterias, en particular su ciclo de desarrollo y la estructura de
sus membranas. Tienen un ciclo celular singular de dos fases: el
cuerpo elemental, una pequeña forma extracelular, se une al
hospedador y se introduce en éste por fagocitosis; en el fagosoma,
se convierte en la forma intracelular replicativa, el cuerpo
reticulado. Las clamidias son bacterias intracelulares obligadas que
se multiplican en células eucariotas a expensas de sus reservas de
energía y reservas de nucleótidos; son responsables de una amplia
diversidad de enfermedades en mamíferos y aves. Las clamidias son
los únicos miembros del orden Chlamydiales, de la familia
Chlamydiaceae y del género Chlamydia. Dentro del género
Chlamydia, actualmente están descritas cuatro especies:
Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia
pneumoniae y Chlamydia pecorum. Estas bacterias están
agrupadas y comparten propiedades biológicas y bioquímicas. Entre
ellas, sólo las tres primeras infectan a los seres humanos, siendo
Chlamydia pecorum un patógeno de rumiantes.
La especie Chlamydia psittaci infecta a
muchos animales, en particular aves, y es transmisible a los seres
humanos. Es responsable de neumonía atípica, disfunción hepática y
renal, endocarditis y conjuntivitis.
La especie Chlamydia trachomatis es la
mejor caracterizada. Además de ser una cepa murina, se divide en
dos grupos que se pueden distinguir por la naturaleza de las
enfermedades de las que son responsables: tracoma, infecciones
genitales y linfogranulomatosis venérea. Hay quince serotipos
humanos de Chlamydia trachomatis (A, K) y LGV (L1, L2, L3).
Las cepas A a C se encuentran principalmente en infecciones
oculares, mientras que las cepas D a K y LGV son responsables
esencialmente de infecciones genitales. Debe mencionarse que las
cepas LGV son responsables de enfermedades sistémicas.
Históricamente, en 1906 Halberstaeder y Von Provaseck descubrieron,
en pacientes con tracoma, la presencia de inclusiones en el
citoplasma de las células obtenidas a partir de raspados
conjuntivales. En 1940, Rake y Jones describieron estas mismas
inclusiones en ciertas células obtenidas por punción de los
ganglios de un paciente que padecía granulomatosis venérea. La
caracterización del microorganismo Chlamydia trachomatis sólo
se realizó de forma satisfactoria en 1957, después de una serie de
aislamientos en cultivos celulares.
Fue en 1983 cuando Chlamydia pneumoniae
se reconoció como un patógeno humano (Grayston JT et al.,
1986); desde entonces, se ha puesto una atención especial en esta
bacteria y se estima (Gaydos CA et al., 1994) que 10% de las
neumonías y 5% de las bronquitis y sinusitis son atribuibles a
Chlamydia pneumoniae (Aldous MB et al., 1992). Más
recientemente, está suscitando un interés cada vez mayor la
asociación de esta bacteria con la patogénesis de enfermedades
asmáticas y de problemas cardiovasculares.
Los estudios serológicos han hecho posible
observar que la infección por Chlamydia pneumoniae es común
en niños con edades comprendidas entre los 5 y los 16 años. Antes de
esta edad es raro encontrar anticuerpos; entonces, el aumento en el
número de individuos que llevan anticuerpos está correlacionado con
la edad hasta los 20 años. Por consiguiente, 50% de los adultos son
portadores de anticuerpos, siendo posible que esta prevalencia sea
tan elevada como de 75%. Estas cifras son muy sorprendentes, ya que
una primera infección induce niveles de anticuerpo cuya
persistencia a lo largo del tiempo se limita a 3 o como máximo 5
años, lo que sugiere una frecuente reinfección a lo largo de toda
la vida. El índice de seroconversión anual es de aproximadamente 8%
entre los 8 y los 12 años y de aproximadamente 6% entre los 12 y los
16 años (Haidl et al., 1994). Antes de los 15 años, la
seroprevalencia de la enfermedad es idéntica entre los dos sexos.
Después de esta edad, los hombres se infectan con más frecuencia
que las mujeres; esto ocurre en todas las regiones del mundo en las
que se han realizado estos estudios.
Estas infecciones están muy extendidas
geográficamente, como demuestran numerosos estudios realizados en
todo el mundo (Kanamoto Y et al., 1991; Tong CY et
al., 1993). Los países desarrollados del norte tales como
Canadá, Dinamarca y Noruega tienen los menores índices de
infección; por el contrario, se encuentran los mayores índices de
prevalencia en los países menos desarrollados de regiones tropicales
en las que la infección puede producirse antes de los 5 años de
edad.
Los seres humanos son el único depósito conocido
de Chlamydia pneumoniae y es probable que la infección se
produzca por transmisión directa, siendo probablemente las
secreciones respiratorias las responsables de esta transmisión de
bajo rendimiento (Aldous et al., 1992). Parece ser que la
cadena de transmisión también puede ser indirecta (Kleemola M et
al., 1988), lo que sugiere que la infección se produce por una
transmisión eficaz, pero también que existen portadores
asintomáticos, lo cual podría explicar la elevada prevalencia de la
enfermedad. Otros estudios (Mordhorst CH et al., 1992)
demuestran que la eficacia de la transmisión varía de acuerdo con
los individuos e indica casos de infección que afectan a todos o a
la mayoría de los miembros de una familia o de un grupo de
familias. El período de incubación es de varias semanas,
significativamente mayor a este respecto que el de muchos otros
agentes patógenos respiratorios. Aunque en condiciones de alta
humedad relativa la infectividad de Chlamydia pneumoniae al
aire libre se reduce rápidamente, lo que sugiere un modo directo de
transmisión en estas condiciones, es probable que la transmisión se
realice en algunos casos de manera indirecta, ya que el
microorganismo puede sobrevivir durante un período de hasta 30 horas
en un medio hostil (Falsey et al., 1993).
Las manifestaciones clínicas debidas a
Chlamydia pneumoniae son enfermedades esencialmente
respiratorias. La neumonía y la bronquitis son las más frecuentes
porque son evidentes clínicamente: como en este caso se promueve el
diagnóstico etiológico, se identifica el agente infeccioso. Las
enfermedades asintomáticas son probablemente numerosas (Grayston JT
et al., 1992; Grayston JT et al., 1986; Thom DH et
al., 1990). La enfermedad entonces progresa por bronquitis o
neumonía; en el momento del examen no hay fiebre pero algunas veces
se notifica por el paciente. El grado de gravedad de la enfermedad
es variable y en pacientes hospitalizados es común observar una
efusión pleural; también puede observarse una infección generalizada
y, en casos severos, un examen anatomicopatológico muestra
enfermedades por Chlamydia pneumoniae.
Se han descrito otros síndromes tales como
sinusitis (Hashiguchi K et al., 1992), otitis media purulenta
(Ogawa H et al., 1992) o faringitis (Huovinen P et
al., 1989) así como infecciones con problemas respiratorios
similares al asma (Hahn DL et al., 1991). Chlamydia
pneumoniae también se ha asociado con sarcoidosis, con eritema
nodosum (Sundelof et al., 1993) e incluso se ha descrito un
caso de síndrome de Guillain-Barré (Haidl et
al., 1992). También se ha evaluado la implicación de
Chlamydia pneumoniae en el síndrome de Reiter (Braun J et
al., 1994).
La asociación de Chlamydia pneumoniae con
enfermedades coronarias y con infarto de miocardio se sospechó por
primera vez por la observación del alto nivel de anticuerpos en 71%
de los pacientes que tenían una enfermedad cardiaca (Shor A et
al., 1992; Kuo CC et al., 1993; Puolakkainen M et
al., 1993; Thomas GN et al., 1997). Los estudios
realizados en varios países han demostrado resultados similares en
pacientes con lesiones ateromatosas (Shor A et al., 1992;
Kuo CC et al., 1993; Puolakkainen M et al., 1993;
Grayston JT et al., 1996; Casas-Ciria J
et al., 1996; Thomas GN et al., 1997; Jackson LA et
al., 1997) y en pacientes con alteraciones carotídeas. Los
estudios anatomicopatológicos y microbiológicos han detectado
Chlamydia pneumoniae en los vasos sanguíneos. El microscopio
electrónico ha hecho posible visualizar la bacteria (Ladany S et
al., 1989) que, efectivamente, se ha demostrado por otras
técnicas tales como PCR (Campbell LA et al., 1992; Kuo CC
et al., 1993; Kuo CC et al., 1988). También parece
ser que la bacteria se encuentra con más frecuencia en lesiones
ateromatosas antiguas. Otros estudios realizados en sujetos jóvenes
de 15 a 35 años han dado la oportunidad de estudiar las arterias
coronarias de personas sin aterosclerosis, sin que esta observación
sea posible en sujetos de mayor edad (el inicio de la enfermedad
ateromatosa es una edad temprana). En estos sujetos jóvenes, los
estudios de PCR no encontraron Chlamydia pneumoniae en
sujetos sin enfermedad ateromatosa, pero revelaron la presencia de
Chlamydia pneumoniae en dos de los once sujetos que mostraron
lesiones tempranas y en seis de los siete sujetos que desarrollaron
placas de ateroma. Por lo tanto, estos estudios demuestran que la
placa de ateroma está muy correlacionada con la presencia de
Chlamydia pneumoniae, pero aún no está definido el papel que
juega la bacteria en la patología vascular.
Los datos relacionados con estudios clínicos
controlados que analizan el efecto de tratamientos en infecciones
por Chlamydia pneumoniae son limitados en número. A
diferencia de la penicilina, la ampicilina o las sulfamidas,
eritromicina, tetraciclina o doxiciclina muestran un actividad
antibiótica in vitro contra Chlamydia pneumoniae. Sin
embargo, un tratamiento a altas dosis debe continuarse durante
varias semanas para evitar la recurrencia de la infección. Por
consiguiente, hoy en día se prefiere el uso de dos nuevos
macrólidos, claritromicina y azitromicina, cuya difusión,
biodisponibilidad y vida media permiten curas más cortas y mejor
toleradas. En ausencia de una prueba definitiva basada en los
resultados de estudios clínicos, por lo tanto, sigue siendo
deseable un tratamiento eficaz, sin recurrencias y bien tolerado de
infecciones por Chlamydia pneumoniae.
Una necesidad incluso más importante percibida
hasta ahora tiene que ver con un diagnóstico específico y sensible
que pueda realizarse de manera conveniente y rápida, permitiendo una
investigación temprana de la infección. Los métodos basados en el
cultivo de Chlamydia pneumoniae son lentos y requieren una
experiencia considerable debido a la dificultad implicada en la
recogida, conservación y almacenamiento de la cepa en condiciones
apropiadas. Los métodos basados en la detección de antígenos (EIA,
DFA) o en la amplificación de ácidos nucleicos (PCR) proporcionan
ensayos que son más adecuados para la práctica de laboratorio. Por
lo tanto, es muy deseable un ensayo fiable, sensible y conveniente
que permita la distinción entre serogrupos y, con mayor motivo,
entre especies de Chlamydia pneumoniae.
Esto es lo más importante, ya que los síntomas
de la infección por Chlamydia pneumoniae aparecen lentamente,
ya que aún no se han identificado todas las patologías asociadas con
estas infecciones y ya que, como se ha mencionado anteriormente, se
sospecha una asociación entre estas infecciones e infecciones
crónicas graves, asma o aterosclerosis.
Aún no se dispone de ninguna vacuna contra
Chlamydia pneumoniae: esto se debe a la naturaleza lábil de
los antígenos específicos para la cepa, lo cual ha impedido hasta
ahora su identificación específica.
Aunque el número de estudios y de modelos
animales creados es elevado, los antígenos usados no han inducido
suficiente inmunidad protectora para conducir al desarrollo de
vacunas humanas. En el caso de Chlamydia pneumoniae,
probablemente debe entenderse el papel de la defensa inmune en la
fisiología y patología de la enfermedad para crear vacunas
satisfactorias.
Una información más detallada en relación con la
biología de estas cepas, sus interacciones con sus hospedadores, el
fenómeno asociado de infectividad y los de escape de las defensas
inmunes del hospedador en particular, y finalmente su implicación
en el desarrollo de estas patologías asociadas, permitirá comprender
mejor estos mecanismos. Por lo tanto, en vista del texto precedente
que muestra, en particular, las limitación de los medios para
controlar la infección por Chlamydia pneumoniae, en el
momento actual es esencial, por una parte, crear herramientas
moleculares, en particular a partir de un mejor conocimiento
genético de Chlamydia pneumoniae, pero también crear nuevos
tratamientos preventivos y terapéuticos, nuevos métodos de
diagnóstico y nuevas estrategias de vacuna que sean específicas,
eficaces y que se toleren. Este es precisamente el objeto de la
presente invención.
El objeto de la presente invención es la
secuencia de nucleótidos de ORF 291 que codifica la secuencia de
aminoácidos SEQ ID No. 291 del genoma de Chlamydia
pneumoniae.
De esta manera, el objeto de la presente
invención incluye un polinucleótido aislado que tiene una secuencias
de nucleótidos de un ORF1 de un genoma de C. pneumoniae, que
comprende:
- a)
- la secuencia de nucleótidos de ORF 291 que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 291, que presenta una identidad de al menos 80% con la secuencia de ORF 291;
- b)
- una secuencia complementaria de la misma.
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Se entiende que secuencia de nucleótidos,
polinucleótido o ácido nucleico significa, de acuerdo con la
presente invención, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario o
productos de la transcripción de dichos ADNs.
Debe entenderse que la presente invención no se
refiere a las secuencias de nucleótidos genómicas de Chlamydia
pneumoniae tomadas en su medio natural, es decir en el estado
natural. Son secuencias que pueden haberse aislado, purificado o
purificado parcialmente por métodos de separación tales como, por
ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
exclusión molecular por tamaños o cromatografía de afinidad, o como
alternativa técnicas de fraccionamiento basadas en la solubilidad en
diversos disolventes, o por métodos de ingeniería genética tales
como amplificación, clonación o subclonación, siendo posible que las
secuencias de la invención se lleven por vectores.
La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1,
publicada en la solicitud de patente madre WO 99/27105 o EP 1 032
674, se obtuvo secuenciando el genoma de Chlamydia pneumoniae
por el método de secuenciación directa después de la secuenciación
automática fluorescente de los insertos de clones y el ensamblaje de
estas secuencias de fragmentos de nucleótidos (insertos) por medio
de softwares (véanse los ejemplos). A pesar de la alta precisión de
la secuencia de la SEQ ID No. 1, es posible que no represente
perfectamente, al 100%, la secuencia de nucleótidos del genoma de
Chlamydia pneumoniae y que en la secuencia de la SEQ ID No. 1
queden algunos errores o incertidumbres de secuenciación raros. En
la presente invención, la presencia de una incertidumbre para un
aminoácido se designa con "Xaa" y la de un nucleótido se
designa con "N" en la lista de secuencias que se proporciona
más adelante. Estos pocos errores o incertidumbres raros pueden
detectarse fácilmente y corregirse por personas especialistas en la
técnica usando el cromosoma entero y/o sus fragmentos
representativos de acuerdo con la invención y los métodos
convencionales de amplificación, clonación y secuenciación, siendo
posible que las secuencias obtenidas se comparen fácilmente, en
particular por medio de un software informático y usando medios
legibles por un ordenador para registrar las secuencias de acuerdo
con la invención como se describe, por ejemplo, más adelante.
Después de corregir estos posibles errores o incertidumbres raros,
la secuencia de nucleótidos corregida obtenida presentaría una
identidad de al menos 99,9% con la secuencia de la SEQ ID No. 1.
Estas incertidumbres de secuenciación raras no están presentes
dentro del ADN contenido en el depósito ATCC Nº
1366-VR, y sea cual sea la incertidumbre de
secuencia rara que exista dentro de la SEQ ID No. 1 puede corregirse
rutinariamente utilizando el ADN del depósito ATCC.
Se entiende que secuencia de nucleótidos
homóloga para los fines de la presente invención significa una
secuencia de nucleótidos que tiene un porcentaje de identidad con
las bases de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No. 1 de al
menos 80%, preferiblemente 90% y 95%, siendo este porcentaje
puramente estadístico y siendo posible que las diferencias entre
las dos secuencias de nucleótidos se distribuyan aleatoriamente y a
lo largo de toda su longitud. Dichas secuencias homólogas que
presentan un porcentaje de identidad con las bases de la secuencia
de nucleótidos de la SEQ ID No. 1 de al menos 80%, preferiblemente
90% y 95%, pueden comprender, por ejemplo, las secuencias
correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de sus
fragmentos representativos de una bacteria que pertenece a la
familia Chlamydia, incluyendo las especies Chlamydia
trachomatis, Chlamydia psittaci y
Chlamydia pecorum mencionadas anteriormente, así como las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de sus fragmentos representativos de una bacteria perteneciente a las variantes de la especie
Chlamydia pneumoniae. En la presente invención, los términos familia y género son mutuamente intercambiables, y los términos variante, serotipo, cepa y subespecie también son mutuamente intercambiables. Estas secuencias homólogas, por lo tanto, pueden corresponder a variaciones asociadas con mutaciones dentro de la misma especie o entre especies y pueden corresponder en particular a truncamientos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Dichas secuencias homólogas también pueden corresponder a variaciones asociadas con la degeneración del código genético o a una desviación en el código genético que es específica para la familia, para la especie o para la variante y que probablemente estará presente en Chlamydia.
Chlamydia pecorum mencionadas anteriormente, así como las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de sus fragmentos representativos de una bacteria perteneciente a las variantes de la especie
Chlamydia pneumoniae. En la presente invención, los términos familia y género son mutuamente intercambiables, y los términos variante, serotipo, cepa y subespecie también son mutuamente intercambiables. Estas secuencias homólogas, por lo tanto, pueden corresponder a variaciones asociadas con mutaciones dentro de la misma especie o entre especies y pueden corresponder en particular a truncamientos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Dichas secuencias homólogas también pueden corresponder a variaciones asociadas con la degeneración del código genético o a una desviación en el código genético que es específica para la familia, para la especie o para la variante y que probablemente estará presente en Chlamydia.
Las homologías entre proteínas y/o secuencias de
ácidos nucleicos pueden evaluarse usando cualquiera de la
diversidad de algoritmos y programas de comparación de secuencias
conocidos en la técnica. Estos algoritmos y programas incluyen,
pero sin limitación, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW
(Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85(8): 2444-2448; Altschul et al.,
1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410;
Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res.
22(2):4673-4680; Higgins et al.,
1996, Methods Enzymol. 266: 383-402;
Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):
403-410; Altschul et al., 1993, Nature
Genetics 3: 266-272).
En una realización particularmente preferida,
las homologías entre las secuencias de proteínas y de ácidos
nucleicos se evalúan usando la Basic Local Alignment Search Tool
("BLAST"), que es bien conocida en la técnica (véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87: 2267-2268; Altschul et al., 1990,
J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul et
al.,1993, Nature Genetics 3: 266-272;
Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:
3389-3402). En particular, se usan cinco programas
BLAST específicos para realizar la siguiente tarea:
- (1)
- BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de aminoácidos problema con una base de datos de secuencias de proteínas;
- (2)
- BLASTN compara una secuencia de nucleótidos problema con una base de datos de secuencias de nucleótidos;
- (3)
- BLASTX compara los productos de traducción conceptuales de seis fases de una secuencia de nucleótidos problema (las dos cadenas) con una base de datos de secuencias de proteínas;
- (4)
- TBLASTN compara una secuencia proteica problema con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas en las seis fases de lectura (las dos cadenas); y
- (5)
- TBLASTX compara las traducciones en seis fases de una secuencia de nucleótidos problema con las traducciones en seis fases de una base de datos de secuencias de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los programas BLAST identifican secuencias
homólogas identificando segmentos similares, que se denominan en
este documento "pares de segmentos de alta puntuación" entre
una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico problema y una
secuencia de ensayo que se obtiene preferiblemente a partir de una
base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. Los
pares de segmentos de alta puntuación preferiblemente se identifican
(es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntuación, de
las que se conocen muchas en la técnica. Preferiblemente, la matriz
de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al.,
1992, Science 256: 1443-1445; Henikoff y
Henikoff, 1993, Proteins 17: 49-61). Menos
preferiblemente, también pueden usarse las matrices PAM o PAM250
(véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds., 1978, Matrices for
Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and
Structure, Washington: National Biomedical Research
Foundation).
Los programas BLAST evalúan el significado
estadístico de todos los pares de segmentos de alta puntuación
identificados y preferiblemente selecciona los segmentos que
satisfacen un umbral de significado especificado por el usuario,
tal como un porcentaje de homología especificado por el usuario.
Preferiblemente, el significado estadístico de un par de segmentos
de alta puntuación se evalúa usando la fórmula de significado
estadístico de Karlin (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, 1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
2267-2268).
Se entiende que una secuencia de nucleótidos
complementaria a una secuencia de la invención significa cualquier
ADN cuyos nucleótidos son complementarios a los de la secuencia de
la invención, y cuya orientación es inversa (secuencia
antiparalela).
La secuencia de nucleótidos ORF 291 se define en
las Tablas 1 y 2, mostradas más adelante, por su posición en la
secuencia de la SEQ ID No. 1. El ORF 291 se ha identificado por
análisis de homología así como por análisis de sitios de inicio
potenciales de ORF, como se describe en los ejemplos proporcionados
más adelante. Debe entenderse que el ORF identificado comprende una
secuencia de nucleótidos que incluye la secuencia de nucleótidos
contigua desde el codón de parada del ORF inmediatamente en posición
3' con respecto al codón de parada del ORF precedente y a lo largo
del codón 5' al siguiente codón de parada de la SEQ ID No. 1 en fase
con la secuencia de nucleótidos del ORF. La Tabla 2, presentada más
adelante, indica el principio, el final y el sitio de inicio
potencial del ORF 291. En una realización, el ORF comprende la
secuencia de nucleótidos contigua que abarca desde el sitio de
inicio potencial de ORF cadena abajo (es decir 3') con respecto al
codón de parada del ORF (o el codón del ORF inmediatamente
adyacente y cadena arriba del codón de parada del ORF). El ORF 291
codifica el polipéptido de la SEQ ID No. 291.
La Tabla 1 también representa los resultados de
las búsquedas de homología que compararon las secuencias de los
polipéptidos codificados por cada uno de los ORFs con secuencias
presentes en bases de datos públicas publicadas.
\newpage
A modo de ejemplo y sin limitación, procesos que
utilizan condiciones de alta rigurosidad son como sigue: La
prehibridación de filtros que contienen ADN se lleva a cabo durante
8 h hasta durante una noche a 65ºC en tampón compuesto de 6X SSC,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%,
Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02% y 500 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 h a 65ºC,
la temperatura de hibridación preferida, en una mezcla de
prehibridación que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado y 5-20 X 10^{6} cpm de
sonda marcada con ^{32}P. Alternativamente, la etapa de
hibridación se puede realizar a 65ºC en presencia de tampón SSC,
correspondiendo 1 x SSC a NaCl 0,15 M y citrato de Na 0,05 M.
Subsiguientemente, se pueden realizar lavados del filtro a 37ºC
durante 1 h en una solución que contiene 2X SSC, PVP al 0,01%,
Ficoll al 0,01% y BSA al 0,01%, seguido de un lavado en 0,1X SSC a
50ºC durante 45 min. Alternativamente, los lavados del filtro se
pueden efectuar en una solución que contiene 2 x SSC y SDS al 0,1%,
ó 0,5 x SSC y SDS al 0,1%, ó 0,1 x SSC y 0,1% de SDS a 68ºC a
intervalos de 15 minutos. Después de las etapas de lavado, las
sondas hibridadas son detectables por aurorradiografía. Otras
condiciones de alta rigurosidad que se pueden utilizar son bien
conocidas en la técnica y según se citan en Sambrook et al.,
1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold
Spring Harbor Press, N.Y. págs. 9.47-9.57; y
Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology,
Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. se
incorporan en esta memoria en su totalidad. Preferiblemente, este
tipo de secuencias codifican un homólogo de un polipéptido
codificado por uno de ORF2 a ORF1297. En una realización, secuencias
de este tipo codifican un polipéptido de Chlamydia
pneumoniae.
A modo de ejemplo y sin limitación, procesos que
utilizan condiciones de rigurosidad intermedia son como sigue: Se
prehibridan filtros que contienen ADN y luego se hibridan a una
temperatura de 60ºC en presencia de un tampón 5 x SSC y sonda
marcada. Subsiguientemente, se realizan lavados de los filtros en
una solución que contiene 2x SSC a 50ºC, y las sondas hibridadas
son detectables por aurorradiografía. Otras condiciones de
rigurosidad intermedia que se pueden utilizar son bien conocidas en
la técnica y según se citan en Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring
Harbor Press, N.Y. págs. 9.47-9.57; y Ausubel et
al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green
Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. se incorporan en
esta memoria en su totalidad. Preferiblemente, este tipo de
secuencias codifican un homólogo de un polipéptido codificado por
uno de
ORF2 a ORF1297. En una realización, secuencias de este tipo codifican un polipéptido de Chlamydia pneumoniae.
ORF2 a ORF1297. En una realización, secuencias de este tipo codifican un polipéptido de Chlamydia pneumoniae.
En relación con la homología con la secuencia de
nucleótidos de ORF 292 se prefieren las secuencias homólogas que
exhiben una identidad de porcentaje con las bases de las secuencias
de nucelótidos de ORF 291 de al menos un 80%, de preferencia de 90%
y 95%. Secuencias homólogas de este tipo se identifican
rutinariamente, por ejemplo a través del algoritmo descrito
anteriormente y en los ejemplos que figuran a continuación. Dichas
secuencias homólogas corresponden a las secuencias homólogas según
se definen anteriormente y pueden comprender, por ejemplo, las
secuencias correspondientes a las secuencias de ORF de una bacteria
perteneciente a la familia Chlamydia, incluida la especie
Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci y Chlamydia
pecorum antes mencionadas, así como las secuencias
correspondientes a las secuencias del ORF de una bacteria
perteneciente a las variantes de la especie Chlamydia
pneumoniae. Estas secuencias homólogas pueden corresponder,
igualmente, a variaciones unidas a mutaciones dentro de la misma
especie o entre especies y pueden corresponder, en particular, a
truncamientos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de al menos
un nucleótido. Dichas secuencias homólogas también pueden
corresponder a variaciones unidas a la degeneración del código
genético o a una predisposición en el código genético que es
especifica de la familia, a las especies o a la variante y que es
probable que estén presentes en Chlamydia.
La invención comprende un polipéptido codificado
por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, una
secuencia de ORF, en particular los polipéptidos de Chlamydia
pneumoniae, caracterizados porque tienen la secuencia de la SEQ
ID No. 291.
En la presente descripción, los términos
polipéptido, péptido y proteína son intercambiables.
Deberá entenderse que la invención no se refiere
a los polipéptidos en forma natural, es decir, no son tomados en su
medio natural, sino que pueden haber sido aislados u obtenidos
mediante purificación a partir de fuentes naturales o,
alternativamente, obtenidos por recombinación genética, o incluso
por síntesis química y que, en este caso, pueden comprender
aminoácidos no naturales, tal como se describirá más abajo.
Se entenderá que polipéptido homólogo designa
los polipéptidos que presentan, en relación con el polipéptido
natural, ciertas modificaciones tales como, en particular, una
deleción, adición o sustitución de al menos un aminoácido, un
truncamiento, una extensión, una fusión quimérica y/o una mutación,
o polipéptidos que presentan modificaciones postraduccionales.
Entre los polipéptidos homólogos, se han de citar aquellos cuya
secuencia de aminoácidos presenta una homología o identidad de al
menos 80%, preferiblemente 90% con las secuencias de aminoácidos de
los polipéptidos de acuerdo con la descripción. En el caso de una
sustitución, uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos
se reemplazan por aminoácidos "equivalentes". La expresión
aminoácido "equivalente", como se entiende en este documento,
designa cualquier aminoácido que puede sustituir a uno de los
aminoácidos de la estructura básica, pero sin modificar
esencialmente las actividades biológicas de los péptidos
correspondientes y como se definirá más adelante.
Se entiende que un fragmento polipeptídico de
acuerdo con la invención designa un polipéptido que comprende un
mínimo de 5 aminoácidos, preferiblemente 10 aminoácidos o
preferiblemente 15 aminoácidos. Debe entenderse que estos
fragmentos se refieren sólo a porciones del polipéptido codificadas
por ORF291 que no están indicadas actualmente en una base de datos
disponible para el público.
Los fragmentos polipeptídicos de acuerdo con la
invención pueden corresponder a fragmentos aislados o purificados
que están presentes naturalmente en Chlamydia pneumoniae o
que se secretan por Chlamydia pneumoniae, o pueden
corresponder a fragmentos que pueden obtenerse por escisión de dicho
polipéptido con una enzima proteolítica, tal como tripsina,
quimotripsina o colagenasa, o con un reactivo químico tal como
bromuro de cianógeno (CNBr) o, como alternativa, poniendo dicho
polipéptido en un medio muy ácido, por ejemplo a pH 2,5. Estos
fragmentos polipeptídicos pueden prepararse igualmente bien por
síntesis química, usando hospedadores transformados con un vector
de expresión de acuerdo con la invención que contiene un ácido
nucleico que permite la expresión de dichos fragmentos, situado bajo
el control de elementos apropiados para la regulación y/o
expresión.
La estructura de las membranas citoplásmicas y
de la pared de las bacterias depende de las proteínas asociadas. La
estructura de la membrana citoplásmica hace que sea impermeable al
agua, a sustancias hidrosolubles y a moléculas de pequeño tamaño
(iones, pequeñas moléculas inorgánicas, péptidos o proteínas). Para
entrar o interferir con una célula o una bacteria, un ligando debe
establecer una relación especial con una proteína anclada en la
membrana citoplásmica (el receptor). Estas proteínas que están
ancladas en la membrana juegan un papel importante en el
metabolismo, ya que controlan los intercambios en la bacteria. Estos
intercambios se aplican a moléculas de interés para la bacteria
(moléculas pequeñas tales como azúcares y péptidos pequeños) así
como a moléculas indeseables para la bacteria tales como
antibióticos o metales pesados.
La estructura de bicapa lipídica de la membrana
requiere que las proteínas que están insertadas en la misma tengan
dominios hidrófobos de aproximadamente 20 aminoácidos que forman una
hélice alfa. A partir de la secuencia primaria de las proteínas,
deducida a su vez a partir de la secuencia de nucleótidos, pueden
predecirse las regiones predominantemente hidrófobas y
potencialmente transmembrana. La presencia de uno o más supuestos
dominios transmembrana plantea la posibilidad de que una proteína se
asocie con la membrana citoplásmica y pueda jugar un papel
metabólico importante en la misma o, como alternativa, de que la
proteína expuesta de esta manera pueda presentar epítopos
potencialmente protectores.
Si las proteínas insertadas en la membrana
presentan varios dominios transmembrana capaces de interaccionar
entre sí a través de enlaces electrostáticos, entonces es posible
que estas proteínas formen poros que atraviesan la membrana, la
cual se vuelve permeable para varias sustancias. Debe tenerse en
cuenta que las proteínas que no tienen dominios transmembrana
también pueden anclarse por la intermediación de ácidos grasos en la
membrana citoplásmica, siendo posible que la ruptura del enlace
entre la proteína y su anclaje en algunos casos sea responsable de
la liberación del péptido al exterior de la bacteria.
Forman también parte de la invención
polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención ,
así como polipéptidos de fusión que comprenden a polipéptidos de
este tipo. En una realización, los polipéptidos y polipéptidos de
fusión inmunorreaccionan con suero seropositivo de un individuo
infectado con Chlamydia pneumoniae. Por ejemplo, según se
describe más abajo, se encuentran secuencias de polipéptidos que
exhiben características particularmente preferibles.
El objeto de la invención es también un
polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un
polipéptido de la envuelta celular, preferiblemente de la envuelta
celular externa de Chlamydia pneumoniae o uno de sus
fragmentos representativos. De acuerdo con la invención, dicho
polipéptido es el polipéptido que tiene la secuencia SEQ ID No. 291
y uno de sus fragmentos representativos.
Preferiblemente, la invención se refiere a un
polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un
polipéptido de la transmembrana de Chlamydia pneumoniae o uno
de sus fragmentos representativos, que tiene entre 1 y 3 dominios de
la transmembrana, y porque es el polipéptido que tiene la secuencia
SEQ ID No. 291.
Preferiblemente, la invención se refiere a un
polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un
polipéptido expuesto a la superficie de Chlamydia pneumoniae
o uno de sus fragmentos representativos, y porque es el polipéptido
que tiene la secuencia SEQ ID No. 291.
Preferiblemente, la invención se refiere a un
polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es una
lipoproteína de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos
representativos, y porque es el polipéptido que tiene la secuencia
SEQ ID No. 291.
Preferiblemente, la invención se refiere a un
polipéptido de acuerdo con la invención, caracterizado porque es un
polipéptido de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos
representativos, que no se encuentran en Chlamydia
trachomatis (Blastp P>e^{-10}) y porque es el polipéptido
que tiene la secuencia SEQ ID No. 291.
En general, en la presente invención, el grupo
funcional al que pertenece el polipéptido, así como su secuencia de
nucleótidos correspondiente, puede determinarse por analogía
comparativa con secuencias ya conocidas o por medio del uso de
técnicas convencionales de bioquímica, de citología combinada con
las técnicas de ingeniería genética tales como inmunoafinidad,
localización por inmunomarcaje, extracción diferencial, medición de
la actividad enzimática, estudio de la actividad que induce o
reprime la expresión o el estudio de la expresión en E.
coli.
Se entiende claramente que, en la presente
descripción, una secuencia de nucleótidos (ORF) mencionada dentro
de un grupo funcional dado también puede ser parte de otro grupo
teniendo en cuenta, por ejemplo, la interrelación entre los grupos
indicados. Por consiguiente, y como ejemplo de esta interrelación,
en el proceso de virulencia de Chlamydia pneumoniae también
puede estar implicado un polipéptido exportado y/o secretado, así
como su secuencia de nucleótidos codificante por medio de la
modificación del mecanismo de defensa de la célula hospedadora
infectada, o un polipéptido transmembrana o su secuencia de
nucleótidos codificante también forma parte de los polipéptidos o
secuencias de nucleótidos codificantes de la envuelta celular.
La invención también describe las secuencias de
nucleótidos de acuerdo con la invención, caracterizadas porque están
covalentemente o no covalentemente inmovilizadas en un soporte.
De acuerdo con otra realización ventajosa de las
secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la descripción, estas
últimas pueden usarse inmovilizadas en un soporte y de esta manera
pueden servir para capturar, por medio de hibridación específica,
el ácido nucleico diana obtenido a partir de la muestra biológica a
ensayar. Si es necesario, el soporte sólido se separa de la muestra
y el complejo de hibridación formado entre la denominada sonda de
captura y el ácido nucleico diana después se detecta por medio de
una segunda sonda, denominada sonda de detección, marcada con un
elemento fácilmente detectable.
Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la
invención también pueden usarse en nuevos sistemas analíticos,
chips de ADN, que permiten la secuenciación, el estudio de
mutaciones y de la expresión de genes, y que actualmente tienen
interés dado su pequeño tamaño y su alta capacidad en términos del
número de análisis.
El principio de la operación de estos chips se
basa en sondas moleculares, la mayoría de las veces
oligonucleótidos, que están unidos a una superficie miniaturizada,
generalmente del orden de unos pocos centímetros cuadrados. Durante
un análisis, una muestra que contiene fragmentos de un ácido
nucleico diana a analizar, por ejemplo ADN o ARN marcado, por
ejemplo después de la amplificación, se deposita sobre el chip de
ADN en el que se ha recubierto el soporte de antemano con sondas.
La puesta en contacto de las secuencias diana marcadas con las
sondas conduce a la formación, por medio de la hibridación, de un
dúplex de acuerdo con la regla del emparejamiento definida por J.
D. Watson y F. Crick. Después de una etapa de lavado, el análisis de
la superficie del chip permite localizar las hibridaciones eficaces
por medio de las señales emitidas por los marcadores que señalizan
la diana. A partir de este análisis se obtiene un modelo específico
de hibridación que, por medio de un procesamiento informático
apropiado, hará posible determinar la información tal como la
presencia de fragmentos específicos en la muestra, la determinación
de secuencias y la presencia de mutaciones.
El chip consta de una multitud de sondas
moleculares, organizadas de forma precisa o en serie en un soporte
sólido cuya superficie está miniaturizada. Es en el centro del
sistema donde otros elementos (sistema de formación de imágenes,
microordenador) permiten la adquisición e interpretación de un
modelo específico de hibridación.
Los soportes de hibridación se proporcionan en
forma de superficies planas o porosas (perforadas con pocillos)
compuestas de diversos materiales. La elección de un soporte se
determina por sus propiedades fisicoquímicas, o más precisamente,
por la relación entre estas últimas y las condiciones en las que se
colocará el soporte durante las síntesis o la unión de las sondas o
durante el uso del chip. Por lo tanto es necesario, antes de
considerar el uso de un soporte particular (R.S. Matson et
al., 1994), considerar características tales como su
estabilidad al pH, su resistencia física, su reactividad y su
estabilidad química, así como su capacidad de unirse de forma no
específica a ácidos nucleicos. Comúnmente se usan materiales tales
como vidrio, silicio y polímeros. En una primera etapa denominada
"funcionalización", su superficie se hace reactiva hacia los
grupos con los que se desea que se una. Después de la
funcionalización, se injertan las denominadas moléculas
espaciadoras sobre la superficie activada. Usadas como intermedios
entre la superficie y la sonda, estas moléculas de tamaño variable
hacen que sean poco importantes las propiedades de la superficie de
los soportes, que a menudo resultan problemáticas para la síntesis
o la unión de las sondas y para la hibridación.
Entre los soportes de hibridación pueden
mencionarse vidrio que se usa, por ejemplo, en el método de síntesis
in situ de oligonucleótidos por tratamiento fotoquímico
desarrollado por la compañía Affymetrix (E. L. Sheldon, 1993),
activándose la superficie de vidrio por silano. Genosensor
Consortium (P. Mérel, 1994) también usa portaobjetos de vidrio que
llevan pocillos separados por una distancia de 3 mm, activándose
este soporte con epoxisilano.
Entre estos soportes de hibridación también
pueden mencionarse polímeros o silicio. Por ejemplo, el equipo de
Andrei Mirzabekov ha desarrollado un chip que consiste en cuadrados
de poliacrilamida polimerizados en una superficie de vidrio
silanizado (G. Yershov et al., 1996). Varios equipos usan
silicio, en particular el laboratorio IFOS de Ecole Centrale of
Lyon que usa un sustrato semiconductor de silicio que está
p-dopado por medio de la introducción en su
estructura cristalina de átomos cuya valencia es diferente de la del
silicio. Como soporte también pueden usarse diversos tipos de
metales, en particular oro y platino (Genosensor Consortium (K.
Beattie et al. 1993)).
Las sondas de acuerdo con la invención pueden
sintetizarse directamente in situ sobre los soportes de los
chips de ADN. Esta síntesis in situ puede realizarse por
tratamiento fotoquímico (desarrollado por la compañía Affymax
(Ámsterdam, Holanda) y explotarse industrialmente por su filial
Affymetrix (Estados Unidos)) o basándose en la tecnología VLSIPS
(síntesis de polímeros inmovilizados a escala muy grande) (S.P.A.
Fodor et al., 1991) que se basa en un método de síntesis
combinatoria dirigida fotoquímicamente y cuyo principio combina la
química de fase sólida, el uso de grupos protectores fotolábiles y
fotolitografía.
Las sondas de acuerdo con la invención pueden
unirse a los chips de ADN de diversas formas tales como tratamiento
electroquímico, tratamiento automático o el uso de impresores de
sondas (T. Livache et al., 1994; G. Yershov et al.,
1996; J. Derisi et al., 1996 y S. Borman, 1996).
La revelación de la hibridación entre las sondas
de la invención, depositadas o sintetizadas in situ sobre los
soportes de los chips de ADN y la muestra a analizar puede
determinarse, por ejemplo, midiendo señales fluorescentes, por
recuento radiactivo o por detección electrónica.
El uso de moléculas fluorescentes tales como
fluoresceína constituye el método más común para marcar las
muestras. Permite la revelación directa o indirecta de la
hibridación y permite el uso de diversos fluorocromos.
Affymetrix actualmente proporciona un aparato o
un escáner diseñado para leer sus chips Gene Chip^{TM}. Hace que
sea posible detectar las hibridaciones explorando la superficie del
chip en microscopía confocal (R.J. Lipshutz et al., 1995).
Se han ensayado otros métodos para detectar señales fluorescentes:
acoplamiento de un microscopio de epifluorescencia y una cámara CCD
(G. Yershov et al., 1996), el uso de un sistema de recogida
de fibra óptica (E.L. Sheldon, 1993). Un método convencional
consiste en realizar un marcaje terminal, con fósforo 32, de las
secuencias diana, por medio de un aparato apropiado, el
Phosphorimager (comercializado por Molecular Dynamics). La
detección electrónica se basa en el principio de que la hibridación
de dos moléculas de ácido nucleico va acompañada de fenómenos
físicos que pueden cuantificarse en ciertas condiciones (sistema
desarrollado por Ecole Centrale of Lyon y denominado
GEN-FET (transistor de efecto de campo GEN)).
También pueden mencionarse Genosensor Consortium y la compañía
Beckman Instruments que están desarrollando un chip electrónico o
Permittivity Chips^{TM} (K. Beattie et al., 1993).
De esta manera, las secuencias de nucleótidos de
acuerdo con la invención pueden usarse en chips de ADN para realizar
el análisis de mutaciones. Este análisis se basa en la producción de
chips capaces de analizar cada base de una secuencia de nucleótidos
de acuerdo con la invención.
Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la
invención también pueden usarse en chips de ADN para realizar el
análisis de la expresión de los genes de Chlamydia
pneumoniae. Este análisis de la expresión de genes de
Chlamydia pneumoniae se basa en el uso de chips en los que
están presentes sondas de la invención, elegidas por su
especificidad para caracterizar un gen dado (D.J. Lockhart et
al., 1996; D.D. Shoemaker et al., 1996). Para los métodos
de análisis de expresión génica usando los chips de ADN, puede
hacerse referencia, por ejemplo, a los métodos descritos por D.J.
Lockhart et al. (1996) y Sosnowsky et al. (1997) para
la síntesis de sondas in situ o para el tratamiento y la
unión de sondas sintetizadas previamente. Las secuencias diana a
analizar están marcadas y en general se fragmentan en secuencias de
aproximadamente 50 a 100 nucleótidos antes de hibridarse en el
chip. Después de lavarse como se describe, por ejemplo, por D.J.
Lockhart et al. (1996) y de la aplicación de diferentes
campos eléctricos (Sosnowsky et al., 1997), los compuestos
marcados se detectan y cuantifican, realizándose las hibridaciones
al menos por duplicado. El análisis comparativo de las intensidades
de señal obtenidas con respecto a la misma sonda para diferentes
muestras y/o para diferentes sondas con la misma muestra, determina
la expresión diferencial del ARN o del ADN derivado de la
muestra.
Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la
invención, además, pueden usarse en chips de ADN en los que también
están presentes otras sondas de nucleótidos específicas para otros
microorganismos, y pueden permitir la realización de un ensayo
seriado que permite una rápida identificación de la presencia de un
microorganismo en una muestra.
Por consiguiente, el objeto de la descripción
también son las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la
invención, caracterizadas porque están inmovilizadas en un soporte
de un chip de ADN.
También forman parte de la invención los chips
de ADN, caracterizados porque contienen al menos una secuencia de
nucleótidos de acuerdo con la invención, inmovilizados sobre el
soporte de dicho chip.
Dichos chips preferiblemente contendrán varias
sondas o secuencias de nucleótidos de la invención de diferente
longitud y/o correspondientes a diferentes genes para identificar,
con mayor certeza, la especificidad de las secuencias diana o la
mutación deseada en la muestra a analizar.
Por consiguiente, los análisis realizados por
medio de cebadores y/o sondas de acuerdo con la invención,
inmovilizados en soportes tales como chips de ADN, harán posible,
por ejemplo, identificar, en muestras, mutaciones asociadas a
variaciones tales como variaciones intraespecie. Estas variaciones
pueden correlacionarse o asociarse con patologías específicas para
la variante identificada y harán posible seleccionar el tratamiento
apropiado.
Otro objeto de la presente invención es un
vector para la clonación y/o expresión de una secuencia,
caracterizado porque contiene una secuencia de nucleótidos de
acuerdo con la invención.
De acuerdo con la invención, los vectores
comprenden los elementos necesarios para permitir la expresión y/o
la secreción de dichas secuencias de nucleótidos en una célula
hospedadora dada, y forman parte de la invención. En este caso, el
vector debe comprender un promotor, señales para el inicio y para la
terminación de la traducción, así como regiones apropiadas para la
regulación de la trascripción. Debe poder mantenerse de manera
estable en la célula hospedadora y opcionalmente puede poseer
señales particulares que especifiquen la secreción de la proteína
traducida. Estos diferentes elementos se eligen de acuerdo con la
célula hospedadora usada. Para este efecto, las secuencias de
nucleótidos de acuerdo con la invención pueden insertarse en
vectores de replicación autónoma dentro del hospedador elegido, o
vectores de integración en el hospedador elegido.
Para construir vectores de expresión que
contengan un gen quimérico que conste de señales de control de la
trascripción/traducción apropiadas y las secuencias codificantes de
proteínas puede usarse cualquiera de los métodos convencionales
conocidos por los especialistas en la técnica para la inserción de
fragmentos de ADN en un vector. Estos métodos pueden incluir
técnicas sintéticas y técnicas de ADN recombinante in vitro y
recombinantes in vivo (recombinación genética).
La expresión de un polipéptido, péptido o
derivado, o análogos de los mismos codificados por una secuencia
polinucleotídica ORF291 contenida dentro de la SEQ ID No. 1 puede
regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de manera que
la proteína o péptido se exprese en un hospedador transformado con
la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una
proteína o péptido puede controlarse por cualquier elemento
promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores que
pueden usarse para controlar la expresión incluyen, pero sin
limitación, el promotor de CMV, la región promotora temprana de SV40
(Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:
304-310), el promotor contenido en la repetición
terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et
al., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor
de la timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), las
secuencias reguladores del gen de metalotioneína (Brinster et
al., 1982, Nature 296: 39-42); vectores
de expresión procarióticos tales como el promotor de
\beta-lactamasa (Villa-Kamaroff,
et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:
3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et
al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:
21-25); véase también "Useful proteins from
recombinant bacteria" en Scientific American, 1980,
242:74-94; vectores de expresión vegetales
que comprenden la región promotora de la nopalina sintetasa
(Herrera-Estrella et al., 1983, Nature
303: 209-213) o el promotor de ARN 35S del
virus del mosaico de la coliflor (Gardner, et al., 1981,
Nucl. Acids Res. 9: 2871), y el promotor de la enzima
fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa
(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature
310: 115-120); elementos promotores de
levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el
promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK
(fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina, y
las siguientes regiones de control de la trascripción en animales,
que presentan especificidad de tejido y que se han utilizado en
animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I
que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et
al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et
al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:
399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:
425-515); región de control del gen de la insulina
que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature
315: 115-122), región de control del gen de
la inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl
et al., 1984, Cell 38: 647-658;
Adames et al., 1985, Nature 318:
533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell.
Biol. 7: 1436-1444), región de control del
virus del tumor mamario de ratón que es activa en células
testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al.,
Cell 45: 485-495), región de control del gen
de la albúmina que se activa en hígado (Pinkert et al.,
1987, Genes y Devel. 1: 268-276), región de
control del gen de la alfa-fetoproteína que es
activa en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol.
5: 1639-1648; Hammer et al., 1987,
Science 235: 53-58; región de control del gen
de alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado
(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:
161-171), región de control del gen de la
beta-globina que se activa en células mieloides
(Mogram et al., 1985, Nature 315:
338-340, Kollias et al., 1986, Cell
46: 89-94); región de control del gen de la
proteína básica de la mielina que es activa en oligodendrocitos del
cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:
703-712); región de control del gen de la cadena 2
ligera de la miosina que es activa en músculo esquelético (Sani,
1985, Nature 314: 283-286), y región de
control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina que es
activa en el hipotálamo (Mason et al, 1986, Science
234: 1372-1378).
Los vectores de acuerdo con la invención son,
por ejemplo, vectores de origen plasmídico o viral. En una
realización específica, se usa un vector que comprende un promotor
unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica
una proteína o péptido ORF291 contenida dentro de la SEQ ID No. 1,
uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más
marcadores de selección (por ejemplo, un gen de resistencia a
antibióticos). Los vectores de expresión comprenden secuencias
reguladoras que controlan la expresión génica, incluyendo la
expresión génica en una célula hospedadora deseada. Los vectores
preferidos para la expresión de los polipéptidos de la invención
incluyen los vectores plasmídicos de tipo pET (Promega) o vectores
plasmídicos pBAD (Invitrogen). Además, los vectores de acuerdo con
la invención son útiles para transformar células hospedadoras para
clonar o expresar las secuencias de nucleótidos de la invención.
La expresión también puede conseguirse usando
recombinación homóloga dirigida para activar genes de
Chlamydia pneumoniae presentes en el ADN genómico clonado. Un elemento regulador heterólogo puede insertarse en una línea celular estable o microorganismo clonado, de tal manera que esté unido de forma operativa con un gen endógeno de Chlamydia pneumoniae presente en el genoma clonado, usando técnicas, tales como recombinación homóloga dirigida, que son bien conocidas para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Chappel, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051 y Skoultchi, documento WO 91/06667, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria en su totalidad).
Chlamydia pneumoniae presentes en el ADN genómico clonado. Un elemento regulador heterólogo puede insertarse en una línea celular estable o microorganismo clonado, de tal manera que esté unido de forma operativa con un gen endógeno de Chlamydia pneumoniae presente en el genoma clonado, usando técnicas, tales como recombinación homóloga dirigida, que son bien conocidas para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Chappel, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051 y Skoultchi, documento WO 91/06667, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria en su totalidad).
Los sistemas de vector de expresión/célula
hospedadora que contienen insertos de secuencias de polinucleótidos
de la SEQ ID No. 1 u ORF dentro de la SEQ ID No. 1, que codifican
polipéptidos, péptidos o derivados o análogos de los mismos, pueden
identificarse por tres estrategias generales: (a) hibridación de
ácido nucleicos, (b) presencia o ausencia de funciones de genes
"marcadores" y (c) expresión de secuencias insertadas. En la
primera estrategia, la presencia de una secuencia polinucleotídica
insertada en un vector de expresión puede detectarse por
hibridación de ácidos nucleicos usando sondas que comprenden
secuencias que son homólogas a una secuencia polinucleotídica
insertada. En la segunda estrategia, el sistema vector
recombinante/hospedador puede identificarse y seleccionarse
basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones de genes
"marcadores" (por ejemplo, actividad timidina quinasa,
resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de
cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) debida a la inserción de
una secuencia polinucleotídica en el vector. Por ejemplo, si la
secuencia polinucleotídica de la SEQ ID No. 1 u ORF dentro de la SEQ
ID No. 1 se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del
vector, pueden identificarse recombinantes que contienen el inserto
por ausencia de la función del gen marcador. En la tercera
estrategia pueden identificarse vectores de expresión recombinantes
ensayando el producto de la secuencia polinucleotídica expresada por
el recombinante. Estos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las
propiedades físicas o funcionales del polipéptido expresado en
sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, unión con un
anticuerpo o promoción de la proliferación celular.
Una vez identificada y aislada una molécula de
ADN recombinante particular, pueden usarse varios métodos conocidos
en la técnica para propagarla. Los clones identificados pueden
introducirse en una célula hospedadora apropiada por métodos
convencionales, tales como, por ejemplo, lipofección,
electroporación y choque térmico. Una vez establecido el sistema
hospedador y las condiciones de crecimiento adecuadas, los vectores
de expresión recombinantes pueden propagarse y prepararse en grandes
cantidades.
La invención también comprende las células
hospedadoras transformadas por un vector de acuerdo con la
invención. Estas células pueden obtenerse introduciendo en células
hospedadoras una secuencia de nucleótidos insertada en un vector
como se ha definido anteriormente, y después cultivando dichas
células en condiciones que permitan la replicación y/o la expresión
de la secuencia de nucleótidos utilizada para la transfección.
La célula hospedadora puede elegirse entre
sistemas eucariotas o procariotas, tales como por ejemplo células
bacterianas (Olins y Lee, 1993), pero también células de levadura
(Buckholz, 1993), así como células animales, en particular cultivos
de células de mamífero (Edwards y Aruffo, 1993), y en particular
células de ovario de hámster chino (CHO), pero también células de
insecto en las que pueden usarse, por ejemplo, métodos que usan
baculovirus (Luckow, 1993).
Además, puede elegirse una cepa de célula
hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o
que modifique y procese el producto génico de la manera específica
deseada. La expresión a partir de ciertos promotores puede estar
elevada en presencia de ciertos inductores; de esta manera, puede
controlarse la expresión del polipéptido modificado por ingeniería
genética. Además, diferentes células hospedadoras tienen mecanismos
característicos y específicos para el procesamiento y la
modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo,
glicosilación, fosforilación) de proteínas. Pueden elegirse líneas
celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la
modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña
expresada. Por ejemplo, puede usarse expresión en un sistema
bacteriano para producir un producto de proteína nuclear no
glicosilado. La expresión en levadura producirá un producto
glicosilado. La expresión en células de mamífero puede usarse para
asegurar la glicosilación "nativa" de una proteína heteróloga.
Además, diferentes sistemas de expresión de vector/hospedador pueden
afectar a las reacciones de procesamiento en diferentes medidas.
Una célula hospedadora preferida para la
expresión de las proteínas de la invención consiste en células
procariotas, tales como bacterias Gram^{-}. Otra célula
hospedadora preferida de acuerdo con la invención es una bacteria
que pertenece a la familia Chlamydia, más preferiblemente que
pertenece a la especie Chlamydia pneumoniae o elegida entre
un microorganismo asociado con la especie Chlamydia
pneumoniae.
En otras realizaciones específicas, los
polipéptidos, péptidos o derivados, o análogos de los mismos, pueden
expresarse como un producto de proteína de fusión o quimérica (que
comprende la proteína, fragmento, análogo o derivado unido a través
de un enlace peptídico a una secuencia de proteína heteróloga (de
una proteína diferente)). Este producto quimérico puede obtenerse
ligando las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican
las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por métodos
conocidos en la técnica, en la fase codificante apropiada, y
expresando el producto quimérico por métodos conocidos comúnmente en
la técnica. Como alternativa, este producto quimérico puede
obtenerse por técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, por
medio del uso de un sintetizador de
péptidos.
péptidos.
Las secuencias genómicas pueden clonarse y
expresarse como productos génicos traduccionales (es decir,
péptidos, polipéptidos y proteínas) o productos génicos
transcripcionales (es decir, fragmentos antisentido y
ribozimas).
Ahora es posible producir polipéptidos
recombinantes en una cantidad relativamente grande por ingeniería
genética usando las células trasformadas con vectores de expresión
de acuerdo con la invención, o utilizando animales transgénicos de
acuerdo con la invención.
Los métodos para preparar un polipéptido de la
invención en forma recombinante se caracterizan porque usan un
vector y/o una célula trasformada con un vector de acuerdo con la
invención y/o un animal transgénico que comprende una de dichas
células trasformadas de acuerdo con la invención, o están por sí
mismos incluidos en la presente invención.
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Entre dichos métodos para preparar un
polipéptido en forma recombinante, se prefieren los métodos de
preparación que usan un vector y/o una célula transformada con
dicho vector y/o un animal transgénico que comprende una de dichas
células transformadas, que contiene una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido de la envuelta celular de Chlamydia
pneumoniae o uno de sus fragmentos representativos, más
preferiblemente que codifica un polipéptido de la envuelta celular
externa de Chlamydia pneumoniae o uno de sus fragmentos.
Los polipéptidos recombinantes obtenidos como se
ha indicado anteriormente pueden proporcionarse en forma glicosilada
o no glicosilada y pueden tener o no la estructura terciaria
natural.
Una variante preferida consiste en la producción
de un polipéptido recombinante fusionado a una proteína de
"soporte" (proteína quimérica). La ventaja de este sistema es
que permite una estabilización y una reducción de la proteolisis
del producto recombinante, un aumento de la solubilidad durante la
renaturalización in vitro y/o una simplificación de la
purificación cuando la molécula de fusión tiene afinidad por un
ligando específico.
Más particularmente, la invención se refiere a
un método para preparar un polipéptido de la invención que comprende
las siguientes etapas:
- a)
- cultivo de las células trasformadas en condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención;
- b)
- cuando sea apropiado, recuperación de dicho polipéptido recombinante.
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Cuando el método para preparar un polipéptido de
la invención usa un animal transgénico de acuerdo con la invención,
el polipéptido recombinante se extrae luego de dicho animal.
El objeto de la invención es también un
polipéptido capaz de ser obtenido por un método de la invención
según se define antes.
La invención también comprende un método para
preparar un polipéptido sintético, caracterizado porque usa una
secuencia de aminoácidos de polipéptidos de acuerdo con la
invención.
La invención también se refiere a un polipéptido
sintético, obtenido por un método de acuerdo con la invención.
También pueden prepararse polipéptidos de
acuerdo con la invención por técnicas convencionales en el campo de
la síntesis de péptidos en condiciones adecuadas para producir los
polipéptidos codificados por el polinucleótido de la invención.
Esta síntesis puede realizarse y recuperarse a partir de una
solución homogénea o en fase sólida.
Por ejemplo, puede usarse la técnica de síntesis
en una solución homogénea descrita por Houbenweyl en 1974.
Este método de síntesis consiste en condensar
sucesivamente, por parejas, los aminoácidos sucesivos en el orden
requerido, o condensar aminoácidos y fragmentos previamente formados
y que ya contienen varios aminoácidos en el orden apropiado o, como
alternativa, varios fragmentos preparados de esta manera
previamente, entendiéndose que debe tenerse cuidado de proteger con
antelación todos los grupos funcionales reactivos que llevan estos
aminoácidos o fragmentos, con la excepción de los grupos funcionales
amino de uno y los grupos funcionales carboxilo de otro o
viceversa, que normalmente participan en la formación de los enlaces
peptídicos, en particular después de la activación del grupo
funcional carboxilo, de acuerdo con métodos bien conocidos en la
síntesis de péptidos.
De acuerdo con otra técnica preferida de la
invención, se usa el método descrito por Merrifield.
Para fabricar una cadena peptídica de acuerdo
con el método de Merrifield se usa una resina polimérica muy
porosa, sobre la cual se une el primer aminoácido
C-terminal de la cadena. Este aminoácido se une a
una resina a través de su grupo carboxilo y se protege su grupo
amino funcional. De esta manera se unen los aminoácidos que
constituirán la cadena peptídica, uno después de otro, sobre el
grupo amino, cada vez desprotegido de antemano, de la porción de la
cadena peptídica ya formada, y que está unida a la resina. Cuando se
forma la cadena peptídica entera deseada, los grupos protectores se
retiran de los diversos aminoácidos que constituyen la cadena
peptídica y el péptido se separa de la resina con ayuda de un
ácido.
La invención se refiere, además, a polipéptidos
híbridos (de fusión) que tienen al menos un polipéptido o uno de sus
fragmentos representativos de acuerdo con la invención, y una
secuencia de un polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune en
seres humanos o animales.
Ventajosamente, el determinante antigénico es
tal que puede inducir una respuesta humoral y/o celular. Un
determinante antigénico puede identificarse seleccionando
bibliotecas de expresión del genoma de Chlamydia pneumoniae
con anticuerpos contenidos en el suero de pacientes infectados con
una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia
pneumoniae. Un determinante antigénico puede comprender un
polipéptido o uno de sus fragmentos representativos de acuerdo con
la invención, en forma glicosilada, usado para obtener composiciones
inmunogénicas capaces de inducir la síntesis de anticuerpos
dirigidos contra múltiples epítopos. Dichos polipéptidos o sus
fragmentos glicosilados también forman parte de la invención.
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Estas moléculas híbridas pueden constar, en
parte, de una molécula de soporte para polipéptidos o para sus
fragmentos representativos de acuerdo con la invención, combinada
con una porción que puede ser inmunogénica, en particular un
epítopo de la toxina diftérica, la toxina tetánica, un antígeno de
superficie del virus de la hepatitis B (Patente FR 79 21811), el
antígeno VP1 del virus de la poliomielitis o cualquier otra toxina o
antígeno viral o bacteriano.
Los métodos para sintetizar las moléculas
híbridas incluyen los métodos usados en ingeniería genética para
construir secuencias de nucleótidos híbridas que codifican las
secuencias polipeptídicas deseadas. Ventajosamente puede hacerse
referencia, por ejemplo, a la técnica para producir genes que
codifican proteínas de fusión descrita por Minton en 1984.
Dichas secuencias de nucleótidos híbridas que
codifican un polipéptido híbrido, así como los polipéptidos híbridos
de acuerdo con la invención se caracterizan porque son polipéptidos
recombinantes obtenidos por la expresión de dichas secuencias de
nucleótidos híbridas forman también parte de la invención.
La invención también comprende los vectores
caracterizados porque contienen una de dichas secuencias de
nucleótidos híbridas. Las células hospedadoras, transformadas por
dichos vectores, los animales transgénicos que comprenden una de
dichas células transformadas, así como los métodos de preparar
polipéptidos recombinantes utilizando dichos vectores, dichas
células transformadas y/o dichos animales transgénicos forman,
naturalmente, también parte de la invención.
Los polipéptidos de acuerdo con la invención,
los anticuerpos de acuerdo con la invención descritos más adelante
y las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención,
ventajosamente pueden usarse en métodos in vitro y/o in
vivo para la detección y/o la identificación de bacterias que
pertenecen a la especie Chlamydia pneumoniae, en una muestra
biológica (tejido o fluido biológico) que es probable que los
contenga. Estos métodos, dependiendo de la especificidad de los
polipéptidos, de los anticuerpos y de las secuencias de nucleótidos
de acuerdo con la invención que se usarán, pueden detectar y/o
identificar en particular las variantes bacterianas que pertenecen
a la especie Chlamydia pneumoniae así como los
microorganismos asociados que pueden detectarse por los
polipéptidos, los anticuerpos y las secuencias de nucleótidos de
acuerdo con la invención que se elegirán. Por ejemplo, puede ser
ventajoso elegir un polipéptido, un anticuerpo o una secuencia de
nucleótidos de acuerdo con la invención que sea capaz de detectar
cualquier bacteria de la familia Chlamydia eligiendo un
polipéptido, un anticuerpo y/o una secuencia de nucleótidos de
acuerdo con la invención que sea específica para la familia o, por
el contrario, será ventajoso más particularmente dirigir una
variante de la especie Chlamydia pneumoniae, que es
responsable, por ejemplo, de la inducción o empeoramiento de
patologías específicas para la variante dirigida, eligiendo un
polipéptido, un anticuerpo y/o una secuencia de nucleótidos de
acuerdo con la invención que sea específica para dicha variante.
Los polipéptidos de acuerdo con la invención
pueden usarse ventajosamente en un método para la detección y/o la
identificación de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia
pneumoniae o a un microorganismo asociado, en una muestra
biológica (tejido o fluido biológico) que es probable que los
contenga, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- poner en contacto esta muestra biológica con un polipéptido o uno de sus fragmentos representativos de acuerdo con la invención (en condiciones que permitan una reacción inmunológica entre dicho polipéptido y los anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra biológica);
- b)
- detectar los complejos de antígeno-anticuerpo que pueden formarse.
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Preferiblemente, la muestra biológica consta de
un fluido, por ejemplo un suero humano o animal, sangre o
biopsias.
Puede usarse cualquier procedimiento
convencional para realizar dicha detección de los complejos de
anticuerpo-antígeno que pueden formarse.
A modo de ejemplo, un método preferido usa
procedimientos inmunoenzimáticos basados en la técnica ELISA,
procedimientos de inmunofluorescencia o procedimientos
radioinmunológicos (RIA) y similares.
Por consiguiente, la invención también se
refiere a los polipéptidos de acuerdo con la invención, marcados con
la ayuda de un marcador adecuado tal como un marcador de tipo
enzimático, fluorescente o radiactivo.
Estos métodos comprenden, por ejemplo, las
siguientes etapas:
- -
- deposición de cantidades definidas de una composición polipeptídica en los pocillos de una placa de microtitulación,
- -
- introducción, en dichos pocillos, de diluciones crecientes de suero, o de una muestra biológica diferente como se ha definido anteriormente, que tiene que analizarse,
- -
- incubación de la microplaca,
- -
- introducción, en los pocillos de la placa de microtitulación, de anticuerpos marcados dirigidos contra inmunoglobulinas humanas o animales, habiéndose marcado estos anticuerpos con la ayuda de una enzima seleccionada entre las que pueden hidrolizar un sustrato, modificando de esta manera la absorción de la radiación de este último, al menos a una longitud de onda definida, por ejemplo a 550 nm,
- -
- detección, por comparación con un control, de la cantidad de sustrato hidrolizado.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a un kit o
estuche para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un
microorganismo asociado, caracterizado porque comprende los
siguientes componentes:
- -
- un polipéptido de acuerdo con la invención,
- -
- cuando es apropiado, los reactivos para constituir el medio apropiado para la reacción inmunológica o específica,
- -
- los reactivos que permiten la detección de los complejos de antígeno-anticuerpo producidos por la reacción inmunológica entre el polipéptido o polipéptidos de la invención y los anticuerpos que pueden estar presentes en la muestra biológica, siendo posible que estos reactivos también lleven un marcador, o puedan reconocerse a su vez por un reactivo marcado, más particularmente en caso de que el polipéptido de acuerdo con la invención no esté marcado,
- -
- cuando sea apropiado, una muestra biológica de referencia (control negativo) sin anticuerpos reconocidos por el polipéptido de acuerdo con la invención,
- -
- cuando sea apropiado, una muestra biológica de referencia (control positivo) que contenga una cantidad predeterminada de anticuerpos reconocidos por un polipéptido de acuerdo con la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la invención, los polipéptidos,
péptidos, proteínas de fusión u otros derivados o análogos de los
mismos codificados por una secuencia polinucleotídica ORF291 pueden
usarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unan
inmunoespecíficamente a dicho inmunógeno. Estos anticuerpos pueden
incluir, pero sin limitación, anticuerpos policlonales y
monoclonales, anticuerpos quiméricos o humanizados, anticuerpos
monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2},
fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab,
anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-Id) y fragmentos de unión a epítopos de
cualquiera de los anteriores. En una realización específica, el
anticuerpo contra un polipéptido, péptido u otro derivado, o análogo
del mismo codificado por una secuencia polinucleotídica ORF 291 es
un anticuerpo biespecífico (véase en general, por ejemplo, Fanger y
Drakeman, 1995, Drug News and Perspectives 8:
133-137). Este anticuerpo biespecífico se modifica
por ingeniería genética para reconocer tanto (1) un epítopo como
(2) una de una diversidad de moléculas "desencadenantes" por
ejemplo, receptores Fc en células mieloides y CD3 Y CD2 en células
T, que se han identificado como moléculas capaces de hacer que una
célula T citotóxica destruya una diana particular. Estos anticuerpos
biespecíficos pueden prepararse por conjugación química, hibridoma
o por técnicas de biología molecular recombinante conocidas para el
especialista en la
técnica.
técnica.
Para la producción de anticuerpos policlonales
contra un polipéptido, péptido u otro derivado o análogo del mismo
codificado por una secuencia polinucleotídica de la SEQ ID No. 1,
pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica. Para
la producción del anticuerpo, pueden inmunizarse diversos animales
hospedadores por inyección con un polipéptido, péptido u otro
derivado o análogo del mismo, incluyendo pero sin limitación
conejos, ratones, ratas, etc. Pueden usarse diversos adyuvantes,
dependiendo de la especie hospedadora, para aumentar la respuesta
inmunológica, incluyendo pero sin limitación Stimulon^{TM}
QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham,
MA), MPL^{TM} (monofosforil lípido A
3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem
Research, Inc., Hamilton, MT), fosfato de aluminio,
IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), medio de
Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como
hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como
lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones
de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, BCG
(bacilo Calmette-Guerin) y
Corinebacterium parvum. Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos policlonales por purificación, en una columna de afinidad en la que previamente se ha unido un polipéptido de acuerdo con la invención, de los anticuerpos contenidos en el suero de pacientes infectados con una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae.
Corinebacterium parvum. Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos policlonales por purificación, en una columna de afinidad en la que previamente se ha unido un polipéptido de acuerdo con la invención, de los anticuerpos contenidos en el suero de pacientes infectados con una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
dirigidos contra un polipéptido, péptido u otro derivado o análogo,
puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de
moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo.
Por ejemplo, puede usarse la técnica de hibridoma desarrollada
originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:
495-497) así como la técnica de trioma, la técnica
de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983,
Immunology Today 4: 72) y la técnica de hibridoma de EBV para
producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al.,
1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., páginas 77-96). En una realización adicional
de la invención pueden producirse anticuerpos monoclonales en
animales sin gérmenes utilizando la tecnología descrita en el
documento PCT/US90/02545. En otra realización, pueden usarse
animales no humanos transgénicos para la producción de anticuerpos
humanos utilizando la tecnología descrita en los documentos WO
98/24893 y WO 96/33735. De acuerdo con la invención, pueden usarse
anticuerpos humanos y pueden obtenerse usando hibridomas humanos
(Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:
2026-2030) o trasformando células B humanas con el
virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, en
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
páginas 77-96). De hecho, de acuerdo con la
invención, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción
de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984,
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 81: 6851-6855;
Neuberger et al., 1984, Nature 312:
604-608; Takeda et al., 1985, Nature
314: 452-454) uniendo los genes de una
molécula de anticuerpo de ratón específica para un polipéptido,
péptido u otro derivado o análogo junto con genes procedentes de
una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada;
anticuerpos de este tipo pueden estar dentro del alcance de esta
invención.
De acuerdo con la invención, deben adaptarse
técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios
(Patente de Estados Unidos 4.946.778) para producir anticuerpos
monocatenarios con especificidad de polipéptido o péptido. Una
realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas
para la construcción de bibliotecas de expresión Fab (Huse et
al., 1989, Science 246: 1275-1281) para
permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab
monoclonales con la especificidad deseada para polipéptidos,
derivados o análogos.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que
contienen el idiotipo de la molécula por técnicas conocidas. Por
ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin limitación: el
fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión
con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que
pueden generarse reduciendo los enlaces disulfuro del fragmento
F(ab')_{2}, los fragmentos Fab que pueden generarse
tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor
y fragmentos Fv.
Además, se han desarrollado técnicas para la
producción de anticuerpos quimerizados (véase, por ejemplo, Boss,
M. et al., Patente de Estados Unidos 4.816.397; y Cabilly, S.
et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.585.089, cada uno de
los cuales se incorpora en esta memoria en su totalidad como
referencia) y humanizados (véase, por ejemplo, Queen, Patente de
Estados Unidos Nº 5.585.089, que se incorpora en esta memoria en su
totalidad como referencia). Una región variable de cadena ligera o
pesada de inmunoglobulina consta de una región "flanqueante"
interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas regiones
determinantes de complementariedad (CDR). La medida de la región
flanqueante y las CDR se han definido de forma precisa (véase,
"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabar, E.
et al., U.S. Department of Health and Human Services (1983).
En resumen, los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo
procedentes de especies no humanas que tienen una o más CDR de las
especies no humanas y una región flanqueante de una molécula de
inmunoglobulina humana.
Los anticuerpos de la invención también pueden
marcarse de la misma manera que se ha descrito anteriormente para
las sondas de ácido nucleico, tal como por medio de un marcaje de
tipo enzimático, fluorescente o radiactivo.
La invención se refiere, además, a un método
para la detección y/o la identificación de una bacteria
perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un
microorganismo asociado en una muestra biológica, caracterizado
porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- poner en contacto la muestra biológica (tejido o fluido biológico) con un anticuerpo mono- o policlonal de acuerdo con la invención (en condiciones que permitan una reacción inmunológica entre dichos anticuerpos y los polipéptidos de la bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado que puede estar presente en la muestra biológica, es decir, en condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunes);
- b)
- detectar el complejo de antígeno-anticuerpo que puede formarse.
\vskip1.000000\baselineskip
También cae dentro del alcance de la invención
un kit o estuche para la detección y/o la identificación de
bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o
a un microorganismo asociado, caracterizado porque comprende los
siguientes componentes:
- -
- un anticuerpo policlonal o monoclonal de acuerdo con la invención, marcado cuando sea apropiado;
- -
- cuando sea apropiado, un reactivo para constituir el medio apropiado para realizar la reacción inmunológica;
- -
- un reactivo que permita la detección de los complejos de antígeno-anticuerpo producidos por la reacción inmunológica, siendo posible que este reactivo también lleve un marcador, o pueda reconocerse a su vez por un reactivo marcado, más particularmente en caso de que dicho anticuerpo monoclonal o policlonal no esté marcado;
- -
- cuando sea apropiado, reactivos para realizar la lisis de las células en la muestra ensayada.
\newpage
El principio del chip de ADN que se explicó
anteriormente también puede usarse para producir "chips" de
proteínas en los que el soporte se ha recubierto con un polipéptido
o un anticuerpo de acuerdo con la invención, o series de los
mismos, en lugar del ADN. Estos "chips" de proteínas hacen que
sea posible, por ejemplo, analizar las interacciones biomoleculares
(BIA) inducidas por la captura de afinidad de analitos diana sobre
un soporte recubierto, por ejemplo, con proteínas, por resonancia
de plasma superficial (SPR). Puede hacerse referencia, por ejemplo,
a las técnicas para el acoplamiento de proteínas sobre un soporte
sólido que se describen en el documento EP 524 800 o a los métodos
que describen el uso de chips de proteínas de tipo biosensor tales
como la técnica de tipo BIAcore (Pharmacia) (Arlinghaus et
al., 1997; Krone et al., 1997, Chatelier et al.,
1995). Estos polipéptidos o anticuerpos de acuerdo con la invención,
capaces de unirse específicamente a anticuerpos o polipéptidos
derivados de la muestra a analizar, de esta manera pueden usarse en
chips de proteínas para la detección y/o la identificación de
proteínas en muestras. Dichos chips de proteínas pueden usarse, en
particular, para el diagnóstico de infecciones y pueden contener
preferiblemente, por chip, varios polipéptidos y/o anticuerpos de
la invención de diferente especificidad, y/o polipéptidos y/o
anticuerpos capaces de reconocer microorganismos diferentes de
Chlamydia pneumoniae.
Por consiguiente, el objeto de la presente
descripción son también los polipéptidos y los anticuerpos de
acuerdo con la invención, caracterizados porque están inmovilizados
sobre un soporte, en particular de un chip de proteína.
Los chips de proteína, caracterizados porque
contiene al menos un polipéptido o un anticuerpo de acuerdo con la
invención inmovilizado sobre el soporte de dicho chip, forman
también parte de la invención.
La presente descripción comprende, además, un
chip de proteína de acuerdo con la invención, caracterizado porque
contiene, adicionalmente, al menos un polipéptido de un
microorganismo diferente de Chlamydia pneumoniae o al menos
un anticuerpo dirigido contra un compuesto de un microorganismo
diferente de Chlamydia pneumoniae, inmovilizado sobre el
soporte de dicho chip.
La descripción también se refiere a un kit o
estuche para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un
microorganismo asociado, o para la detección y/o identificación de
un microorganismo, caracterizado porque comprende un chip de
proteína de acuerdo con la invención.
El objeto de la presente descripción es también
un método para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un
microorganismo asociado en una muestra biológica, caracterizado
porque usa una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la
invención.
Más particularmente, la invención se refiere a
un método para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae en una
muestra biológica, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- cuando sea apropiado, aislamiento del ADN de la muestra biológica a analizar u opcionalmente producción de un ADNc a partir del ARN presente en la muestra biológica;
- b)
- amplificación específica del ADN de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado con la ayuda de al menos un cebador, que se hibrida específicamente con el polinucleótido ORF 291;
- c)
- detección de los productos de amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Éstos pueden detectarse, por ejemplo, por la
técnica de hibridación molecular usando una sonda de ácido nucleico
de acuerdo con la invención. Esta sonda ventajosamente se marcará
con un elemento no radiactivo (sonda fría) o radiactivo.
Para los fines de la presente invención, se
entenderá que "ADN de la muestra biológica" o "ADN contenido
en la muestra biológica" significa el ADN presente en la muestra
biológica considerada, u opcionalmente el ADNc obtenido después de
la acción de una enzima de tipo transcriptasa inversa sobre el ARN
presente en dicha muestra biológica.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en un método de acuerdo con la invención, caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
- a)
- poner en contacto una sonda nucleotídica de acuerdo con la invención con una muestra biológica, habiéndose hecho accesible previamente el ADN contenido en la muestra biológica a la hibridación, en condiciones que permitan la hibridación de la sonda con pares de bases complementarias del ADN de una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado;
- b)
- detectar el complejo de hibridación formado entre la sonda de nucleótidos y el ADN en la muestra biológica.
\newpage
La presente descripción también se refiere a un
método de acuerdo con la invención, caracterizado porque comprende
las siguientes etapas:
- a)
- poner en contacto una sonda de nucleótidos inmovilizada sobre un soporte de acuerdo con la invención con una muestra biológica, habiéndose hecho accesible previamente el ADN de la muestra, cuando es apropiado, a la hibridación, en condiciones que permitan la hibridación de la sonda con el ADN de una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia pneumoniae o a un microorganismo asociado;
- b)
- poner el híbrido formado entre la sonda de nucleótidos inmovilizada sobre un soporte y el ADN contenido en la muestra biológica, cuando sea apropiado después de la eliminación del ADN de la muestra biológica que no se ha hibridado con la sonda, con una sonda nucleotídica marcada de acuerdo con la invención; y
- c)
- detectar el nuevo híbrido formado en la etapa b).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización ventajosa del
método para la detección y/o la identificación definido
anteriormente, se caracteriza porque, antes de la etapa a), el ADN
en la muestra biológica se extiende y/o se amplifica con cebadores
de antemano con la ayuda de al menos de un cebador de acuerdo con la
invención.
La invención se refiere, además, a un kit o
estuche para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae,
caracterizado porque comprende los siguientes componentes:
- a)
- un cebador o sonda nucleotídico capaz de hibridarse con un polinucleótido de acuerdo con la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también se refiere a un kit o
estuche para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un
microorganismo asociado, caracterizado porque comprende los
siguientes componentes:
- a)
- una sonda de nucleótidos, denominada sonda de captura;
- b)
- una sonda oligonucleotídica, denominada sonda de detección;
- c)
- cuando sea apropiado, al menos un cebador de acuerdo con la invención así como los reactivos (por ejemplo, polimerasa y/o desoxinucleótido trifosfatos) necesarios para una reacción de amplificación del ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción también se refiere a un kit o
estuche para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un
microorganismo asociado, caracterizado porque comprende los
siguientes componentes:
- a)
- al menos un cebador;
- b)
- cuando sea apropiado, los reactivos necesarios para realizar una reacción de amplificación de ADN;
- c)
- cuando sea apropiado, un componente que hace que sea posible comprobar la secuencia del fragmento amplificado, más particularmente una sonda oligonucleotídica de acuerdo con la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción se refiere, además, a un kit o
estuche para la detección y/o la identificación de bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o a un
microorganismo asociado, o para la detección y/o la identificación
de un microorganismo caracterizado porque comprende un chip de ADN
como se ha definido anteriormente.
La invención también se refiere a un método o a
un kit o estuche de acuerdo con la invención para la detección y/o
la identificación de bacterias pertenecientes a la especie
Chlamydia pneumoniae, que comprende un polipéptido de acuerdo
con la invención y un anticuerpo de acuerdo con la invención.
De acuerdo con la presente descripción,
Preferiblemente, dicho método o dicho kit o estuche anterior de
acuerdo con la invención, para la detección y/o la identificación
de bacterias pertenecientes a la especie Chlamydia
pneumoniae se caracteriza porque dicho cebador y/o dicha sonda o
dichos polipéptidos se eligen entre las secuencias de nucleótidos o
polipéptidos de acuerdo con la invención que se han identificado
como específicas para la especie Chlamydia pneumoniae y
porque dichos anticuerpos de acuerdo con la invención se eligen
entre los anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de acuerdo
con la invención elegidos entre los polipéptidos identificados como
específicos para la especie Chlamydia pneumoniae.
\newpage
La invención también comprende ensayos de
selección que comprenden las etapas de:
- a)
- poner en contacto dicho compuesto con un polipéptido o polinucleótido aislado de acuerdo con la invención; y
- b)
- determinar la capacidad de dicho compuesto para unirse con dicho polipéptido o dicha secuencia de polinucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente descripción se dirige a células
transformados de acuerdo con la invención que, ventajosamente,
pueden servir como modelo y pueden usarse en métodos para estudiar,
identificar y/o seleccionar compuestos que puedan ser responsables
de patologías inducidas o que empeoran por Chlamydia
pneumoniae, o capaces de prevenir y/o tratar estas patologías
tales como, por ejemplo, enfermedades cardiovasculares o
respiratorias. En particular, las células hospedadoras
transformadas, en particular bacterias de la familia
Chlamydia cuya transformación con un vector de acuerdo con
la invención puede, por ejemplo, aumentar o inhibir su infectividad,
o modular las patologías inducidas o que empeoran normalmente por
la infección, pueden usarse para infectar a animales en los que se
controlará el inicio de las patologías. Estos animales no
transformados, infectados por ejemplo con bacterias
Chlamydia transformadas, pueden servir como modelo de
estudio.
Los compuestos que pueden seleccionarse pueden
ser compuestos orgánicos tales como polipéptidos o carbohidratos o
cualquier otro compuesto orgánico o inorgánico ya conocido, o nuevos
compuestos orgánicos producidos usando técnicas de modelado
molecular y obtenidos por síntesis química o bioquímica, siendo
conocidas dichas técnicas para los especialistas en la técnica.
Dichos compuestos seleccionados pueden usarse
para modular el crecimiento y/o la replicación celular de
Chlamydia pneumoniae o cualquier otro microorganismo
asociado y de esta manera controlar la infección por estos
microorganismos. Dichos compuestos también pueden usarse para
modular el crecimiento y/o la replicación celular de todas las
células eucariotas o procariotas, en particular células tumorales y
microorganismos infecciosos, para los que dichos compuestos
resultarán activos, haciendo posible los métodos determinar dichas
modulaciones que son bien conocidas por los especialistas en la
técnica.
La invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende
- un polipéptido de acuerdo con la invención; o
- un anticuerpo de acuerdo con la invención; y
- un vehículo farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente descripción también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos de
acuerdo con la invención y/o uno o más polipéptidos de fusión de
acuerdo con la invención. Estas composiciones además comprenden un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones
farmacéuticas incluyen composiciones que comprenden un polipéptido
o polipéptido de fusión que presenta reacción inmunológica con
suero seropositivo de un individuo infectado con Chlamydia
pneumoniae. En una realización, una composición farmacéutica de
acuerdo con la invención, o que comprende un polinucleótido, un
vector o una célula hospedadora de acuerdo con la presente
invención puede utilizarse para la prevención o tratamiento de una
infección por una bacteria perteneciente a la especie Chlamydia
pneumoniae.
La invención se refiere, además, a una
composición inmunogénica o una composición de vacuna caracterizada
porque comprende uno o más polipéptidos y/o uno o más polipéptidos
híbridos (de fusión) de acuerdo con la invención. Estas
composiciones además comprenden un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Las composiciones inmunogénicas o el
polipéptido de fusión incluyen composiciones que comprenden un
polipéptido que presenta reacción inmunológica con suero
seropositivo de un individuo infectado con Chlamydia
pneumoniae.
Las composiciones de vacuna o inmunogénicas
también pueden comprender composiciones de vacuna o inmunogénicas
de ADN que comprenden secuencias polinucleotídicas de la invención
asociadas operativamente con una secuencia reguladora que controla
la expresión génica. Estas composiciones pueden incluir
composiciones que dirigen la expresión de un epítopo neutralizador
de Chlamydia pneumoniae.
La presente descripción también se refiere al
uso de una célula transformada como se ha definido anteriormente,
para la preparación de una composición de vacuna.
La invención también se refiere a una
composición de vacuna, caracterizada porque contiene una secuencia
de nucleótidos de acuerdo con la invención, un vector de acuerdo con
la invención y/o una célula transforma de acuerdo con la
invención.
\newpage
La invención también se refiere a las
composiciones de vacuna de acuerdo con la invención para la
prevención o el tratamiento de una infección por bacterias
pertenecientes a la especie Chlamydia pneumoniae o por un
microorganismo asociado.
La presente descripción también se refiere al
uso de ADN que codifica polipéptidos de Chlamydia pneumoniae,
en particular determinantes antigénicos, a formular como
composiciones de vacuna. De acuerdo con este aspecto de la
invención, el ADN de interés se introduce por ingeniería genética en
un vector de expresión bajo el control de elementos reguladores,
que promoverán la expresión del ADN, es decir, elementos promotores
o potenciadores. El elemento promotor puede presentar especificidad
de célula y permitir la trascripción sustancial del ADN sólo en
células predeterminadas. El ADN puede introducirse directamente en
el hospedador como ADN desnudo o formulado en composiciones con
otros agentes que pueden facilitar la captación del ADN incluyendo
vectores virales, por ejemplo, vectores de adenovirus, o agentes
que facilitan la inmunización, tales como bupivicaína y otros
anestésicos locales, saponinas y poliaminas catiónicas.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
antigénico y el elemento regulador puede insertarse en una línea
celular estable o un microorganismo clonado, usando técnicas, tales
como recombinación homóloga dirigida, que son bien conocidas para
los especialistas en la técnica, y descritas, por ejemplo, en
Chappel, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051; Skoultchi, WO
91/06667.
Estas líneas celulares y microorganismos pueden
formularse para realizar vacunas. La secuencia de ADN que codifica
el polipéptido antigénico y el elemento regulador puede
suministrarse a un hospedador mamífero e introducirse en el genoma
del hospedador por medio de recombinación homóloga.
Se describe que las composiciones inmunogénicas
y/o de vacuna de acuerdo con la invención, que están destinadas
para la prevención y/o tratamiento de una infección por Chlamydia
pneumoniae se elegirán entre las composiciones inmunogénicas
y/o de vacuna que comprenden un polipéptido o uno de sus fragmentos
representativos correspondientes a una proteína, o uno de sus
fragmentos representativos, de la envuelta celular de Chlamydia
pneumoniae. Las composiciones de vacuna que comprenden
secuencias de nucleótidos también comprenderán secuencias de
nucleótidos que codifican un polipéptido o uno de sus fragmentos
representativos correspondientes a una proteína, o uno de sus
fragmentos representativos, de la envuelta celular de Chlamydia
pneumoniae.
Los polipéptidos o sus fragmentos
representativos que entran en las composiciones inmunogénicas de
acuerdo con la invención pueden seleccionarse por técnicas
conocidas por los especialistas en la técnica, tales como por
ejemplo, basándose en la capacidad de dichos polipéptidos para
estimular células T, que tiene como resultado, por ejemplo, su
proliferación o la secreción de interleuquinas, y que conduce a la
producción de anticuerpos dirigidos contra dichos polipéptidos.
En ratones, en los que se administra una dosis
ponderada de la composición de vacuna comparable a la dosis usada
en seres humanos, la reacción de anticuerpos se ensaya recogiendo
suero seguido de un estudio de la formación de un complejo entre
los anticuerpos presentes en el suero y el antígeno de la
composición de vacuna, de acuerdo con las técnicas habituales.
Se describe que composiciones de vacuna
preferiblemente estarán en combinación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable y, cuando sea apropiado, con uno o más
adyuvantes de inmunidad apropiado.
Actualmente se dispone de diversos tipos de
vacunas para proteger a los seres humanos contra enfermedades
infecciosas: microorganismos vivos atenuados (M. Bovis - BCG
para tuberculosis), microorganismos inactivados (virus de la
influenza), extractos acelulares (Bordetella pertussis para
tos ferina), proteínas recombinantes (antígeno de superficie del
virus de la hepatitis B), polisacáridos (neumococos). Se han
realizado experimentos con vacunas preparadas a partir de péptidos
sintéticos o a partir de microorganismos modificados genéticamente
que expresan antígenos heterólogos. Incluso más recientemente, se
propusieron genes que llevaban ADN de plásmido recombinante que
codificaban antígenos protectores como estrategia de vacuna
alternativa. Este tipo de vacunación se realiza con un plásmido
particular derivado de un plásmido de E. Coli que no se
replica in vivo y que codifica sólo la proteína de la
vacuna. Se inmunizaron animales por medio de una simple inyección
del ADN plasmídico desnudo en el músculo. Esta técnica conduce a la
expresión de la proteína de la vacuna in situ y a una
respuesta inmune de tipo celular (CTL) y de tipo moral (anticuerpo).
Esta doble inducción de la respuesta inmune es una de las ventajas
principales de la técnica de vacunación con ADN desnudo.
Las composiciones de vacuna pueden evaluarse en
modelos animales in vitro e in vivo antes de su
administración al hospedador, por ejemplo, al ser humano. Por
ejemplo, pueden utilizarse ensayos de neutralización in vitro
tales como los descritos por Peterson et al. (1988). El
ensayo descrito por Peterson et al. (1988) es adecuado para
ensayar composiciones de vacuna dirigidas hacia Chlamydia
pneumoniae o Chlamydia trachomatis.
En resumen, se diluye antisuero
hiper-inmune en PBS que contiene 5% de suero de
cobaya como fuente de complemento. Se añaden clamidias (10^{4}
IFU; unidades infecciosas) a las diluciones de antisuero. Las
mezclas de antígeno-anticuerpo se incuban a 37EC
durante 45 minutos y se inoculan por duplicado en monocapas de
células Hep-2 o HeLa confluentes contenidas en
viales de vidrio (por ejemplo, 15 por 45 mm), que se han lavado dos
veces con PBS antes de la inoculación. Las células de la monocapa
se infectan por centrifugación a 1000X g durante 1 hora seguido de
incubación estacionaria a 37E durante 1 hora. Las monocapas
infectadas se incuban durante 48 o 72 horas, se fijan y se tiñen
con un anticuerpo específico de Chlamydia, tal como
anti-MOMP para C. trachomatis, etc. Las IFU
se cuentan en diez campos a 200 aumentos. La titulación de
neutralización se asigna basándose en la dilución que proporciona
una inhibición de 50% en comparación con las monocapas de
control/IFU.
La eficacia de las composiciones de vacuna puede
determinarse in vivo exponiendo modelos animales de infección
por Chlamydia pneumoniae, por ejemplo, ratones o conejos, a
las composiciones de vacuna. Por ejemplo, pueden realizarse
estudios de exposición a la composición de vacuna in vivo en
el modelo murino de infección por Chlamydia pneumoniae
descrito por Moazed et al. (1997). En resumen, se inmunizan
ratones C57 BL/6J y/o deficientes en apoE homocigotos, machos, con
composiciones de vacuna. Después de la vacunación, los ratones se
sedan suavemente por inyección subcutánea de una mezcla de ketamina
y xilazina, y se les inocula por vía intranasal un volumen total de
0,03-0,05 ml de organismos suspendidos en medio SPG
o con SPG solo. Las inoculaciones de Chlamydia pneumoniae
son de aproximadamente 3 x 10^{7} IFU/ratón. Los ratones se
inoculan con Chlamydia pneumoniae a las 8, 10 y 12
semanas de edad. Después se recogen tejidos del pulmón, bazo,
corazón, etc. 1-20 semanas después de la primera
inoculación. La presencia de organismos se puntúa usando PCR,
histología e inmunocitoquímica, o por cultivo cuantitativo/IFU
después de la homogeneización del tejido.
Como alternativa, pueden realizarse estudios de
exposición a la composición de vacuna in vivo en el modelo
de conejo de Chlamydia pneumoniae descrito por Laitinen et
al. (1997). En resumen, se inmunizan conejos blancos de Nueva
Zelanda (de 5 meses de edad) con las composiciones de vacuna.
Después de la vacunación, los conejos se sedan con Hypnorm, 0,3
ml/kg de peso corporal, por vía intramuscular, y se les inocula por
vía intranasal un total de 0,5 ml de Chlamydia pneumoniae
suspendido en medio SPG o con SPG solo. Las inoculaciones de
Chlamydia pneumoniae son aproximadamente 3 x 10^{7}
IFU/conejo. Los conejos se reinfectan de la misma manera y con la
misma dosis 3 semanas después de la inoculación primaria.
Posteriormente, los tejidos se recogen 2 semanas después de la
infección primaria y 1, 2 y 4 semanas después de la reinfección. La
presencia de Chlamydia pneumoniae se evalúa usando PCR,
histología e inmunocitoquímica, o por cultivo cuantitativo/IFU
después de la homogeneización de tejidos.
Las composiciones de vacuna que comprenden
secuencias de nucleótidos o vectores en los que se insertan dichas
secuencias se describen, en particular, en la Solicitud
Internacional Nº WO 90/11092 y también en la Solicitud Internacional
Nº WO 95/11307.
Se describe que las secuencias de nucleótidos
que constituyen la composición de vacuna de acuerdo con la invención
pueden inyectarse en el hospedador después de haberse acoplado a
compuestos que promueven la penetración de este polinucleótido
dentro de la célula o su transporte hasta el núcleo celular. Los
conjugados resultantes pueden encapsularse en micropartículas
poliméricas, como se describe en la Solicitud Internacional Nº WO
94/27238 (Medisorb Technologies Internacional).
Se describe que la secuencia de nucleótidos,
preferiblemente un ADN, de la composición de vacuna se compleja con
el DEAE-dextrano (Pagano et al., 1967) o con
proteínas nucleares (Kaneda et al., 1989), con lípidos
(Felgner et al., 1987) o se encapsula en liposomas (Fraley
et al., 1980) o, como alternativa, se introduce en forma de
un gel facilitando su transfección en las células (Midoux et
al., 1993, Pastore et al., 1994). El polinucleótido o el
vector también pueden estar en suspensión en una solución tampón o
puede combinarse con liposomas.
Ventajosamente, esta vacuna se preparará de
acuerdo con la técnica descrita por Tacson et al. o Huygen
et al. en 1996 o, como alternativa, de acuerdo con la técnica
descrita por Davis et al. en la Solicitud Internacional Nº WO
95/11307.
Esta vacuna también puede prepararse en forma de
una composición que contiene un vector de acuerdo con la invención
situado bajo el control de elementos reguladores permitiendo su
expresión en seres humanos o animales. Es posible, por ejemplo,
usar como vector para la expresión in vivo del antígeno
polipeptídico de interés, el plásmido pcDNA3 o el plásmido
pcDNA1/neo, ambos comercializados por Invitrogen ® & D Systems,
Abingdon, Reino Unido). También es posible usar el plásmido
VlJns.tPA, descrito por Shiver et al. en 1995. Esta vacuna
ventajosamente comprenderá, además del vector recombinante, una
solución salina, por ejemplo una solución de cloruro sódico.
También se describe que las composiciones
inmunogénicas de la invención también pueden utilizarse como parte
de métodos para inmunización, donde dichos métodos comprenden
administrar a un hospedador, por ejemplo, un hospedador humano, una
cantidad inmunizadora de las composiciones inmunogénicas de la
invención. El método de inmunización es un método de inmunización
contra Chlamydia pneumoniae.
Se entiende que un vehículo farmacéuticamente
aceptable indica un compuesto o combinación de compuestos que
entran en una composición farmacéutica o de vacuna que no produce
efectos secundarios y que hace que sea posible, por ejemplo,
facilitar la administración del compuesto activo, aumentar su vida
y/o su eficacia en el cuerpo, aumentar su solubilidad en solución
o, como alternativa, mejorar su conservación. Estos vehículos
farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y se adaptarán por
personas especialistas en la técnica de acuerdo con la naturaleza y
modo de administración del compuesto activo elegido.
Por lo que respecta a las formulaciones de
vacuna, éstas pueden comprender adyuvantes de inmunidad apropiados
que son conocidos por personas especialistas en la técnica tales
como, por ejemplo, hidróxido de aluminio, un representante de la
familia de muramil péptidos tales como uno de los derivados
peptídicos de N-acetil-muramilo, un
lisado bacteriano o, como alternativa, adyuvante incompleto de
Freund, Stimulon^{TM} QS-21 (Aquila
Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA), MPL^{TM} (monofosforil
lípido A 3-O-desacilado; RIBI
ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), fosfato de aluminio,
IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA).
Estos compuestos se administrarán por vía
sistémica, en particular por vía intravenosa, por vía intranasal,
intramuscular, intradérmica o subcutánea, o por vía oral. La
composición de vacuna que comprende polipéptidos de acuerdo con la
invención se administrará varias veces, extendidas a lo largo del
tiempo, por vía intradérmica o subcutánea.
Los modos óptimos de administración,
dosificaciones y formas galénicas pueden determinarse de acuerdo con
criterios que generalmente se tienen en cuenta para establecer un
tratamiento adaptado a un paciente, tal como por ejemplo la edad o
el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la
tolerancia del tratamiento y los efectos secundarios observados.
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Figura 1: Línea para la producción de secuencias
de Chlamydia pneumoniae.
Figura 2: Análisis de las secuencias y
ensamblaje.
Figura 3: Técnicas de acabado.
Figura 3a): Mapa de ensamblaje.
Figura 3b): Determinación y uso de los extremos
huérfanos de los contigs.
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La cepa de Chlamydia pneumoniae (CM1)
usada por los inventores se obtiene en la ATCC (American Culture
Type Collection) donde tiene el número de referencia ATCC
1360-VR.
Se cultivan células HeLa 229, obtenidas en la
American Type Culture Collection, con la referencia ATCC
CCL-2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células HeLa ATCC CCL-2.1 se
cultivan en matraces de cultivo de células de 75 ml (Corning). El
medio de cultivo es medio de cultivo de células modificado por
Dulbecco (Gibco BRL Nº 04101965) suplementado con MEM aminoácidos
(Gibco BRL - Nº 04301140) L (5 ml por 500 ml de medio) y suero
bovino fetal al 5% (Gibco BRL Nº 10270 lote 40G8260K) sin
antibióticos o antifúngicos.
La solución madre de cultivo de células se
mantiene de la siguiente manera. Los cultivos celulares se examinan
con un microscopio invertido. Veinticuatro horas después de la
confluencia, cada césped celular se lava con PBS (Gibco BRL Nº
04114190), se aclara y después se pone durante 5 minutos en una
estufa en presencia de 3 ml de tripsina (Gibco BRL Nº 25200056).
Después se separa el césped celular y posteriormente se resuspende
en 120 ml de medio de cultivo, y el conjunto se agita para hacer
homogénea la suspensión celular. Después se distribuyen 30 ml de
esta suspensión por matraz de cultivo de células. Los matraces se
mantienen en una estufa de CO_{2} (al 5%) durante 48 horas a una
temperatura de 37ºC. La solución madre de células se mantiene de
manera que se disponga diariamente de 16 matraces de células
subconfluentes. Son estas células subconfluentes las que se usarán
para infectarse con Chlamydia. También se usan matraces de cultivo
de células de 25 ml que se preparan de una manera similar, pero los
volúmenes usados para mantener las células son los siguientes: 1 ml
de tripsina, y 28 ml de medio de cultivo para resuspender las
células; se usan 7 ml de medio de cultivo por matraz de 25 ml.
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Inicialmente, las clamidias se obtienen
congeladas a partir de la ATCC (-70ºC) en suspensión, en un volumen
de 1 ml. Esta preparación se descongela lentamente, se recogen 500
\mul y se ponen en contacto con células subconfluentes que se
obtienen como se ha indicado anteriormente, en un matraz de cultivo
de células de 25 ml que contiene 1 ml de medio, de manera que se
cubran las células. El matraz después se centrifuga a 2000 rpm en
un rotor "oscilante" para placas de microtitulación,
manteniéndose la centrífuga a una temperatura de 35ºC. Después de
la centrifugación, los dos matraces se ponen en una estufa a 35ºC
durante tres horas. Después se añaden 6 ml de medio de cultivo que
contiene cicloheximida (1 \mug/ml) y el matraz se almacena a
35ºC. Después de 72 horas, el nivel de infección se evalúa por
inmunofluorescencia directa y por el efecto citopatogénico producido
en las células.
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Partiendo con células infectadas que se
obtuvieron como se ha indicado anteriormente, se deposita un frotis
celular con una pipeta Pasteur en un portaobjetos de microscopio. El
frotis celular se fija con acetona durante 10 minutos. Después de
drenar la acetona, el frotis se cubre con 30 \mul de anticuerpos
monoclonales murinos dirigidos contra MOMP (proteína principal de
la membrana externa) de Chlamydia (Syva, Biomérieux) marcada con
isotiocianato de fluoresceína. El conjunto después de incuba en una
cámara húmeda a una temperatura de 37ºC. Los portaobjetos después
se aclaran con agua, se secan ligeramente y después de depositar una
gota de medio de montaje, se monta un cubreobjetos antes de la
lectura. La lectura se realiza con la ayuda de un microscopio de
fluorescencia equipado con los filtros requeridos (excitación a 490
nm, emisión a 520 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Después de comprobar la infección por
inmunofluorescencia directa, realizada como se ha indicado
anteriormente, los matraces de cultivo se abren en una cabina
estéril, y en el matraz se ponen perlas de vidrio estéril con un
diámetro del orden de un milímetro. El matraz se cierra y después se
agita vigorosamente mientras se mantiene horizontalmente el césped
celular en el fondo, de manera que las perlas de vidrio puedan tener
una acción mecánica sobre el césped celular. De esta manera, la
mayoría de las células se separan o se rompen. El efecto de la
agitación se observa con un microscopio óptico para asegurar la
liberación apropiada de clamidias.
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El producto de la recolección de clamidias
(medio de cultivo y desecho celular) se recoge con una pipeta y se
distribuye en tres matraces de cultivo de células que contienen
células HeLa ATCC CCL-2.1 subconfluentes, obtenidas
como se ha indicado anteriormente. Las células inoculadas de esta
manera se ponen bajo agitación suave (oscilante) en una estufa a
35ºC. Después de una hora, los matraces se mantienen horizontalmente
en una estufa de manera que el medio de cultivo cubra las células
durante 3 horas. Después se añaden 30 ml de medio de cultivo que
contiene actidiona (1 \mug/ml) a cada uno de los matraces.
Después, los matraces de cultivo se almacenan a 35ºC durante 72
horas. Las células infectadas de esta manera se examinan con un
microscopio óptico después de 24 horas, el efecto citopatogénico se
evalúa por la aparición de inclusiones citoplásmicas que son
visibles con un microscopio óptico invertido. Después de 72 horas,
las vacuolas que contienen las clamidias ocupan el citoplasma de la
célula y empujan a los núcleos celulares hacia un lado. En esta
fase, numerosas células se destruyen espontáneamente y dejan
cuerpos elementales libres en el medio de cultivo. Las clamidias se
recogen como se ha descrito anteriormente y se congelan a -80ºC o se
usan para otra propagación.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de las recolecciones de clamidias se
almacenan a -80ºC y se descongela en un baño de agua a temperatura
ambiente. Después de la descongelación, cada tubo se agita
vigorosamente durante un minuto y se sumerge durante un minuto en
un depósito de ultrasonidos (BRANSON 1200); los tubos después se
agitan por inversión antes de centrifugarse durante 5 minutos a
2000 rpm. El sobrenadante se retira cuidadosamente y se mantiene a
una temperatura fría (hielo). El sobrenadante se agita
vigorosamente y después se filtra en filtros de nylon que tienen
poros de 5 \mum de diámetro sobre un soporte (Nalgene) que
permite establecer un vacío delicado bajo el filtro de nylon. Para
cada filtración, se superponen tres filtros de nylon; estos filtros
se reemplazan después de cada 40 ml de filtrado. Se mantienen 200
ml de producto de filtración a temperatura ambiente y después de
agitarse por inversión, se centrifugan a 10.000 rpm durante 90
minutos, se retira el sobrenadante y el sedimento se recoge en 10
ml de Tris 10 mM, se somete a una agitación vorticial vigorosa y
después se centrifuga a 10.000 rpm durante 90 minutos. Se retira el
sobrenadante y el sedimento se recoge en un tampón (Tris 20 mM pH
8,0, KCl 5 mM, MgCl_{2} 5 mM) al que se añaden 800 unidades de
DNAsa I (Boehringer). El conjunto se mantiene a 37ºC durante una
hora. Después se añade 1 ml de EDTA 0,5 M, el conjunto se somete a
agitación vorticial y se congela a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las clamidias purificadas anteriormente se
descongelan y se someten a una digestión con proteinasa K
(Boehringer) en un volumen final de 10 ml. Las condiciones de
digestión son las siguientes: 0,1 mg/ml de proteinasa K, 0,1 x SDS
a 55EC, agitación cada 10 minutos. El producto de digestión después
se somete a una doble extracción con
fenol-cloroformo, se añaden dos volúmenes de etanol
y el ADN se recupera directamente con una pipeta Pasteur que tiene
un extremo en forma de un gancho. El ADN se seca en el borde del
tubo y después se resuspende en 500 \mul de Tris 2 mM pH 7,5. El
ADN se almacena a 4ºC durante al menos 24 horas antes de usarse para
la clonación.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la precipitación, el ADN se
cuantifica midiendo la densidad óptica a 260 nm. Se distribuyen 30
\mug de ADN de Chlamydia en 10 tubos de 1,5 ml y se diluyen en 300
\mul de agua. Cada uno de los tubos se somete a 10 aplicaciones
de ultrasonidos que duran 0,5 segundos en un sonicador (unisonix
XL2020). Después se agrupan los contenidos de los 10 tubos y se
concentran por extracciones sucesivas con butanol (Sigma B1888) de
la siguiente manera: se añaden dos volúmenes de butanol a la mezcla
de ADN diluida. Después de agitar, el conjunto se centrifuga
durante cinco minutos a 2500 rpm y se retira el butanol. Esta
operación se repite hasta que el volumen de la fase acuosa es menor
de 1 ml. El ADN después se precipita en presencia de etanol y de
acetato sódico 0,5 M pH 5,4 y después se centrifuga durante 30
minutos a 15.000 rpm a temperatura fría (4ºC). El sedimento se lava
con etanol al 75%, se centrifuga durante cinco minutos a 15.000 rpm
y se seca a temperatura ambiente. La décima parte de la preparación
se analiza en un gel de agarosa al 0,8%. Típicamente, el tamaño de
los fragmentos de ADN preparados de esta manera está comprendido
entre 200 y 8000 pares de bases.
Para permitir la clonación del ADN obtenido, los
extremos se reparan. El ADN se distribuye en una cantidad de 10
\mug/tubo, en el siguiente medio de reacción: volumen final 100
\mul, 1 x tampón (Biolabs 201L), 0,5 \mul de BSA a 0,05 mg/ml,
dATP 0,1 mM, 0,1 mM de cada uno de dGTP, dCTP o dTTP y 60.000 UI de
ADN polimerasa de T4. La reacción se incuba durante 30 minutos a
16ºC. Después se agrupan los contenidos de los tubos antes de
realizar una extracción con fenol-cloroformo y
después se precipita la fase acuosa como se ha descrito
anteriormente. Después de esta etapa, el ADN preparado de esta
manera se fosforila. Para esto, el ADN se distribuye en tubos en
una cantidad de 10 \mug por tubo, y después en un volumen final de
50 \mul, la reacción se prepara de la siguiente manera: ATP 1 mM,
1 x tampón quinasa y 10 UI de polinucleótido quinasa de T4 (Biolabs
201L). La preparación se incuba durante 30 minutos a 37ºC. Los
contenidos de los tubos se combinan y se realiza una extracción con
fenol-cloroformo y después una precipitación para
precipitar el ADN. Este último después se suspende en 1 \mul de
agua y posteriormente los fragmentos de ADN se separan de acuerdo
con su tamaño en un gel de agarosa al 0,8% (1 x TAE). El ADN se
somete a un campo eléctrico de 5 V/cm y después se visualiza en una
tabla UV. Los fragmentos cuyo tamaño varía entre 1200 y 2000 pares
de bases se seleccionan cortando el gel. El fragmento de gel
aislado de esta manera se pone en un tubo y después el ADN se
purifica con el kit Qiaex (20021 Qiagen), de acuerdo con el
procedimiento proporcionado por el fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyen 14 \mug del vector de clonación
pGEM-5Zf (Promega P2241) en un volumen final de 150
\mul y se someten a digestión con la enzima de restricción EcoRV
300 UI (Biolabs 195S) de acuerdo con el protocolo y con los
reactivos proporcionados por el fabricante. El conjunto se pone a
37ºC durante 150 minutos y después se distribuye en los pocillos de
un gel de agarosa al 0,8% sometido a un campo eléctrico de 5 V/cm.
El vector linealizado se visualiza en una tabla UV, se aísla
cortando el gel y después se purifica por el kit Qiaex (Qiagen
20021) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los
productos de purificación se agrupan en un tubo, se mide el volumen
y después se añade la mitad del volumen de fenol, y el conjunto se
agita vigorosamente durante 1 minuto. Se añade la mitad del volumen
de cloroformo-alcohol isoamílico 24:1 y se agita
vigorosamente durante 1 minuto. El conjunto se centrifuga a 15.000
rpm durante 5 minutos a 4ºC, la fase acuosa se recupera y se
transfiere a un tubo. El ADN se precipita en presencia de acetato
sódico 0,3 M, pH 5,4 y 3 volúmenes de etanol y se pone a -20ºC
durante 1 hora. Después, el ADN se centrifuga a 15.000 rpm durante
30 minutos a 4ºC, se retira el sobrenadante mientras se conserva el
sedimento y se lava dos veces con etanol al 70%. Después de secar a
temperatura ambiente, el ADN se suspende en 25 \mul
de agua.
de agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyen 25 \mul del vector preparado en la
etapa anterior en un volumen final de 500 \mul de la siguiente
mezcla de reacción:
Después de la reparación, el ADN se somete a una
extracción con fenol-cloroformo y una precipitación,
después se recoge el sedimento en 10 \mul de agua y el ADN se
cuantifica midiendo la densidad óptica a 260 nm. El ADN
cuantificado se une al vector PGEm-5Zf(+) preparado
por la enzima de restricción EcoRV y se desfosforila (véase la
preparación del vector). La unión se realiza en tres condiciones que
varían en la relación entre el número de moléculas de vector y el
número de moléculas de inserto. Típicamente, se usa una relación
equimolar, una relación de 1:3 y una relación de 3:1 para las
uniones que, además, se realizan en las siguientes condiciones: 25
ng de vector PGEm-5Zf(+), ADN cortado y tampón de
unión en un volumen final de 20 \mul con ADN ligasa de T4
(Amersham E70042X); el conjunto después se pone en un refrigerador
durante una noche y después se realiza una extracción con
fenol-cloroformo y una precipitación de una manera
convencional. El sedimento se recoge en 5 \mul de agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan placas Petri que contienen medio Agar LB
que contiene ampicilina (50 \mug/ml), Xgal (280 \mug/ml)
[5-bromo-4-cloroindolil-beta-D-galactopiranósido
(Sigma B-4252)] e IPTG (140 \mug/ml)
[isopropil-beta-D-tiogalactósido
(Sigma I-6758)], se cultivan 50 y 100 \mul de
bacterias para cada uno de los ligamientos. Las placas Petri se
ponen en posición invertida a 37ºC durante 15 a 16 horas en una
estufa. El número de clones positivos "recombinantes" se evalúa
contando las colonias blancas y las colonias azules que se considera
que contienen el vector solo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogen noventa y cuatro colonias blancas y
dos colonias azules con la ayuda de conos estériles y se depositan
en el fondo de los pocillos de placas diseñadas para realizar las
técnicas de amplificación. A cada pocillo se le añaden 30 \mul de
la siguiente mezcla de reacción: MgCl_{2} 1,7 mM, 0,2 mM de cada
uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, dos oligonucleótidos sintéticos
correspondientes a secuencias flanqueantes del sitio de clonación
en cada lado y que orientan la síntesis del ADN de una manera
convergente (cebadores RP y PU 0,5 \muM, 1 U de TAQ polimerasa
(GibcoBRL 18038-026)).
Las colonias preparadas de esta manera se
someten a una temperatura de 94ºC durante 5 minutos y después a 30
ciclos térmicos compuestos de las siguientes etapas: 94ºC durante 40
s, 50ºC durante 30 s, 72ºC durante 180 s. La reacción después se
mantiene durante 7 minutos a 72ºC y después se deja a 4ºC.
Los productos de amplificación se depositan en
un gel de agarosa (0,8%), se tiñen con bromuro de etidio, se
someten a electroforesis y después se analizan en una tabla
ultravioleta. La presencia de un fragmento de amplificación con un
tamaño mayor de 500 pares de bases indica la presencia de un
inserto. Después se preparan los clones bacterianos para estudiar la
secuencia de su inserto.
\vskip1.000000\baselineskip
Para secuenciar los insertos de los clones
obtenidos como se ha indicado anteriormente, éstos se amplificaron
por PCR en cultivos de bacterias realizados durante una noche usando
los cebadores para los vectores que flanquean los insertos. La
secuencia de los extremos de estos insertos (con un promedio de 500
bases en cada lado) se determinó por secuenciación fluorescente
automática en un secuenciador ABI 377, equipado con el software de
Análisis de Secuenciación de ADN ABI Prism (versión 2.1.2).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias obtenidas por secuenciación en
una línea de alto rendimiento (Figura 1) se almacenan en una base
de datos; esta parte de la producción es independiente de cualquier
tratamiento de las secuencias. Las secuencias se extraen de la base
de datos, evitando todas las regiones de calidad inadecuada, es
decir las regiones para las que se observan incertidumbres en la
secuencia en más de 95%. Después de la extracción, las secuencias
se introducen en una línea de procesamiento, cuyo diagrama se
describe en la Figura 2. En una primera trayectoria de esta línea
de procesamiento, las secuencias se ensamblan por el software Gap4
de R. Staden (Bonfield et al., 1995) (OS UNIX/SUN Solaris);
los resultados obtenidos por este software se mantienen en forma de
dos archivos que se usarán para un procesamiento posterior. El
primero de estos archivos proporciona información sobre la
secuencia de cada uno de los contigs obtenidos. El segundo archivo
representa todos los clones que participan en la composición de
todos los contigs así como sus posiciones en los contigs
respectivos.
La segunda ruta de procesamiento usa un
ensamblador de secuencias (TIGR-Asmg assembler
UNIX/SUN Solaris); los resultados de esta segunda ruta de
procesamiento se mantienen en forma de un archivo en formato
TIGR-Asmg que proporciona información sobre la
relación existente entre las secuencias seleccionadas para el
ensamblaje. Este ensamblador algunas veces no puede unir contigs
cuyos extremos solapan en varios cientos de pares de bases.
Los resultados obtenidos a partir de estos dos
ensambladores se comparan con la ayuda del programa BLAST,
comparándose cada uno de los contigs derivados de una ruta de
ensamblaje con los contigs derivados de la otra ruta.
Para las dos rutas de procesamiento, se fijan
los parámetros de ensamblaje estrictos (homología de 95%, 30
nucleótidos de superposición). Estos parámetros evitan la confusión
de 3 a 5% de los clones derivados de células eucariotas con
secuencias obtenidas a partir de los clones derivados de
Chlamydia pneumoniae. Sin embargo, las secuencias eucariotas
se conservan durante el transcurso de este proyecto; la estrategia
introducida, que se describe más adelante, se diseñará, entre otras
cosas, de manera que no se obstaculice por estas secuencias
derivadas de clones contaminantes.
Los resultados de estos dos ensambladores se
procesan en un software desarrollado para este proyecto. Este
software opera en una plataforma Windows NT y recibe, como datos,
los resultados derivados del software STADEN y/o los resultados
derivados del ensamblador TIGR-Asmg, el software,
los resultados, después del procesamiento de los datos, en la
determinación de un mapa de ensamblaje que proporciona la relación
de proximidad y la orientación de los contigs entre sí (Figura 3a).
Usando este mapa de ensamblaje, el software determina todos los
cebadores necesarios para terminar el proyecto. Este tratamiento,
que se detallará más adelante, tiene la ventaja de distinguir entre
las secuencias aisladas procedentes de las contaminaciones por el
ADN de células eucariotas y las secuencias de pequeño tamaño
integradas claramente en el proyecto por las relaciones que
establecen con contigs. Para permitir, sin riesgo de error, la
redisposición y la orientación de los contigs entre sí, se realiza
una evaluación estadística de la precisión de los nombres
(nominación). La "nominación" de la secuencia se realiza a
partir de los resultados de la "contigación". Esta evaluación
hace que sea posible proporcionar a cada una de las placas de
clones, así como a cada una de las subseries de placas, un peso que
es inversamente proporcional al índice de error probable que existe
en la "nominación" de las secuencias obtenidas a partir de
esta placa o partir de una subserie de esta placa. A pesar de que
haya un índice bajo de error, pueden producirse errores a lo largo
de todas las etapas de producción de los clones y de las secuencias.
Estas etapas son numerosas, repetitivas y aunque la mayoría de
ellas son automáticas, otras, tales como la deposición en los
secuenciadores, son manuales; por lo tanto, es posible que el
operario tenga fallos tales como la inversión de dos secuencias.
Este tipo de error tiene una repercusión sobre el procesamiento
posterior de los datos, dando como resultado relaciones (entre los
contigs) que no existen en realidad, y por lo tanto intentos de
dirigir la secuenciación entre los contigs que producirán fallo. Es
a causa de esto por lo que la evaluación de la nominación de
errores tiene una importancia particular, ya que permite el
establecimiento de un mapa de ensamblaje probabilístico a partir
del cual se hace posible determinar todos los clones que servirán
como plantilla para obtener secuencias que separan dos contigs
adyacentes. La Tabla 2 de la solicitud de Patente de Estados Unidos
parental con el Nº de serie 60/107078 presentada el 4 de Noviembre
de 1998 y la Solicitud Francesa 97-14673 presentada
el 21 de Noviembre de 1997, cada una de las cuales se incorpora
como referencia en esta memoria en su totalidad, proporciona los
clones y las secuencias de los cebadores usados inicialmente durante
las operaciones iniciales.
Para evitar la etapa que consiste en ordenar y
después preparar los clones por medios microbiológicos
convencionales, el software define cebadores externos e internos
orientados hacia las regiones que aún no se han secuenciado. Los
cebadores determinados de esta manera hacen que sea posible
preparar, por PCR, una plantilla que cubra la región no
secuenciada. Son los denominados cebadores externos (los más
distantes de la región a secuenciar) los que se usan para preparar
esta plantilla. La plantilla después se purifica y se obtiene una
secuencia en cada una de las 2 cadenas durante dos reacciones de
secuenciación que usan uno de los 2 cebadores internos. Para
facilitar el uso de esta estrategia, los dos cebadores externos y
los dos cebadores internos se preparan y después se almacenan en la
misma posición de 4 placas de 96 pocillos diferentes. Las dos placas
que contienen los cebadores externos se usan para realizar las PCR
que servirán para preparar las plantillas. Estas plantillas se
purificarán en columnas de purificación que conservan la topografía
de las placas. Cada una de las secuencias se obtendrá usando
cebadores situados en una y después en la otra de las placas que
contienen los cebadores internos. Esta distribución permite una
automatización muy considerable del proceso y tiene como resultado
un método que es sencillo de usar para terminar las regiones que aún
no se han secuenciado. La Tabla 3 de la solicitud de patente de
Estados Unidos parental con el Nº de serie 60/107078 presentada el 4
de Noviembre de 1998 y la Solicitud Francesa
97-14673 presentada el 21 de Noviembre de 1997, cada
una de las cuales se incorpora como referencia en esta memoria en
su totalidad, proporciona los nombres y las secuencias de los
cebadores usados para terminar el proyecto de Chlamydia
pneumoniae.
Finalmente, varios contigs existen en una
configuración en la que uno de sus extremos no está asociado a
ningún otro extremo de contig (Figura 3b) por una relación de
clones de conexión (un clon de conexión se define como un clon que
tiene un extremo de secuencia en un contig y el otro extremo de su
secuencia en otro contig; además, este clon debe proceder de una
placa o una subserie de placas con una calidad de denominación
adecuada). Para el proyecto de Chlamydia pneumoniae, este
caso particular se produjo 24 veces. Se definen dos cebadores de
PCR adyacentes que orientan la síntesis del ADN hacia el extremo de
la secuencia consenso para cada uno de los extremos huérfanos de la
secuencia consenso. El cebador que está más próximo al extremo de la
secuencia se denomina cebador interno, mientras que el cebador que
está más distante del extremo de la secuencia se denomina cebador
externo. Los cebadores externos se usan para explorar la relación
mutua entre los extremos huérfanos de los diferentes contigs. La
presencia de un solo producto de PCR y la posibilidad de amplificar
este producto de forma inequívoca usando los cebadores internos
provoca la probable relación entre los contigs sobre los cuales
están situados los cebadores que permitieron la amplificación. Esta
relación se confirmará por secuenciación y permitirá la conexión
entre los extremos huérfanos de las secuencias consenso. Esta
estrategia hace que sea posible obtener un mapa completo del
cromosoma de Chlamydia pneumoniae y después terminar el
proyecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se anotaron todas las bases no determinadas con
certeza en la secuencia cromosómica y se midió la densidad de
incertidumbres en el cromosoma entero. Se anotaron las regiones con
una alta densidad de incertidumbres y se extrajeron los cebadores
de PCR que abarcaban estas regiones y se representan en la Tabla 4
de la Solicitud de Patente de Estados Unidos parental con el Nº de
serie 60/107078 presentada el 4 de Noviembre de 1998 y la Solicitud
de Patente Francesa 97-14673 presentada el 21 de
Noviembre de 1997, cada una de las cuales se incorpora como
referencia en esta memoria en su totalidad.
La secuencia de cada uno de los productos de PCR
se obtuvo con dos cebadores operativos diferentes de los cebadores
de amplificación. Las secuencias se obtuvieron en las dos
direcciones para todas las PCR (100% de éxito).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron reorganizaciones locales de los bancos
públicos principales. El banco de proteínas usado comprende la
fusión no redundante del banco Genpept (traducción automática de
GenBank, NCBI; Benson et al., 1996).
Se usó el software BLAST entero (dominio
público, Altschul et al., 1990) para la búsqueda de
homologías entre una secuencia y bancos de datos de proteínas o
ácidos nucleicos. Los niveles de significado usados dependen de la
longitud y complejidad de la región ensayada así como del tamaño del
banco de referencia. Se ajustaron y adaptaron a cada análisis.
Los resultados de la búsqueda de homologías
entre una secuencia de acuerdo con la invención y los bancos de
datos de proteínas y ácidos nucleicos se presentan y se resumen en
la Tabla 1 presentada más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
Leyenda de la Tabla 1: las fases de lectura
abiertas se identifican con el software GenMark versión 2.3A
(GenePro), la plantilla usada es Chlamydia pneumoniae de
orden 4 en una longitud de 196 nucleótidos con una ventana de 12
nucleótidos y una señal mínima de 0,5. El marco de lectura ORF291
está numerado en orden de aparición en el cromosoma. Las posiciones
del principio y del final se proporcionan en la columna 2
(posición). Cuando la posición del principio es mayor que la
posición del final, esto significa que la región se codifica por la
cadena complementaria a la secuencia que se proporcionó en la
secuencia SEQ ID No. 1.
Todos los supuestos productos se sometieron a
una investigación de homología en GENPEPT (liberación 102 para ORF
Nº 291) con el software BLASTP (Altschul et al., 1990). Se
usaron como parámetros los parámetros por defecto con la excepción
del valor E esperado fijado a 10^{-5} (para ORF Nº 291).
Posteriormente, solo se tuvieron en cuenta las identidades mayores
de 30% (columna I%). La descripción de la secuencia más homóloga se
proporciona en la columna de Homología; el identificador para la
última secuencia se proporciona en la columna ID y la especie de
animal a la que pertenece esta secuencia se proporciona en la
columna de Especie. La puntuación de homología se evalúa por la
suma de las puntuaciones blast para cada región de homología y se
presenta en la columna de Puntuación.
\vskip1.000000\baselineskip
El software DAS se usó como recomiendan los
autores (Cserzo et al., 1997).
Este método usa, para predecir los dominios
transmembrana, plantillas derivadas de un muestreo de proteínas
seleccionadas. Se tuvieron en cuenta todas las regiones para las que
se encontró un "Límite" mayor de 1,5 por el programa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para este análisis se usaron dos programas para
encontrar ORF adicionales para predecir las fases de lectura
abierta potenciales de una longitud mínima de 74 aminoácidos;
Glimmer (Slazberg, S.L., Delcher, A., Kasif, S., y W. White, 1998.
Microbial gene identification using interpolated Markov models.
Nucleic Acids Res. 26: 544-548), y un programa
interno escrito. El programa interno usó un algoritmo de búsqueda
muy sencillo. El análisis requería que el texto de la secuencia de
ADN genómico estuviera en la dirección 5' a 3', que el genoma fuera
circular y que TAA y TAG y TGA fueran codones de parada (codones
stop). Los parámetros de búsqueda fueron los siguientes:
- (1)
- Se realizó una búsqueda de un ORF que empezaba con un codón GTG. Si no se encontraban codones GTG, se realizaba una búsqueda de un codón ATG. Sin embargo, si se encontraba un codón GTG entonces se realizaba una búsqueda cadena debajo de un codón ATG. Se registraron todas las posiciones de nucleótidos de inicio y parada.
- (2)
- Se realizó una búsqueda de un ORF que empezaba con un codón TTG. Si no se encontraban codones TTG, se realizaba una búsqueda de un codón ATG. Sin embargo, si se encontraba un codón TTG se realizaba una búsqueda cadena debajo de un codón ATG. Se registraron todas las posiciones de nucleótidos de inicio y parada.
- (3)
- El análisis descrito en las etapas 1 y 2 se repitió para la cadena opuesta de la secuencia de ADN.
- (4)
- Se realizó una búsqueda de ORF que determinaba todas las longitudes de ORF usando posiciones de inicio y parada en las mismas fases de lectura.
- (5)
- Todos los ORFs cuya longitud de ADN era menor de 225 nucleótidos se eliminaron de la búsqueda.
\vskip1.000000\baselineskip
Las posibles dianas de vacunas de la superficie
celular son proteínas de la membrana externa tales como porinas,
lipoproteínas, adhesinas y otras proteínas no integrales. En
Chlamydia psittaci, los inmunógenos principales son un grupo
de supuestas proteínas de la membrana externa (POMP) y no se han
encontrado homólogos en Chlamydia pneumoniae y Chlamydia
trachomatis por análisis tradicional (Longbottom, D., Russell,
M., Dunbar, S.M., Jones, G.E., y A.J. Herring. 1998. Molecular
Cloning and Characterization of the Genes Coding for the Highly
Immunogenic Cluster of 90-Kilodalton Envelope
Proteins from Chlamydia psittaci Subtype That Causes Abortion
in Sheep. Infect Immun 66: 1317-1324). En
Chlamydia pneumoniae se han identificado varias supuestas
proteínas de la membrana externa, de las que todas pueden
representar candidatos de vacuna. Se ha encontrado el gen de la
proteína principal de la membrana externa (MOMP) (omp1) en diversos
aislados de Chlamydia pneumoniae (Jantos, CA., Heck, S.,
Roggendorf, R., Sen-Gupta, M., y Hegemann, JH. 1997.
Antigenic and molecular analyses of different chlamydia pneumoniae
strains. J. Clin Microbiology 35(3):
620-623). Se usaron varios criterios, como se
indica más adelante, para identificar supuestos ORFs expuestos en la
superficie a partir de la secuencia de ADN genómico de Chlamydia
pneumoniae (Solicitud de Patente Francesa
91-14673 presentada el 21 de Noviembre de 1997). En
esta categoría se indicó cualquier ORF que cumpliera uno o más de
los criterios individuales.
Se realizaron búsquedas de homología de
proteínas usando la herramienta Blastp 2.0 (Altschul, S.F., Madden,
T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J. Zhang, Z., Miller, W., y D.J.
Lipman. 1997. Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.
25: 3389-3402). Un producto de ORF estaba expuesto
en la superficie marcado si había homología con una proteína
expuesta en la superficie conocida, hipotética o supuesta con una
puntuación P mejor que e^{-10}.
La mayoría, si no todas las proteínas que se
localizan en la membrana de las bacterias, a través de una ruta
secretora, contienen un péptido señal. Un programa de software
SignalP analiza la secuencia de aminoácidos de un ORF para este
péptido señal (Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., y G. von
Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal
peptides and prediction of their cleavage sites. Protein
Engineering 10: 1-6). Los primeros 60 aminoácidos
N-terminales de cada ORF se analizaron por SignalP
usando la base de datos del software Gram-Negative.
El resultado genera cuatro valores separados, C máxima, Y máxima, S
máxima y S media. La puntuación S, o región señal, es la
probabilidad de la posición que pertenece al péptido señal. La
puntuación C, o sitio de escisión, es la probabilidad de la posición
que está la primera en la proteína madura. La puntuación Y es la
media geométrica de la puntuación C y un derivado suavizado de la
puntuación S. Cerca de cada puntuación se proporciona una
conclusión de Sí o No. Si las cuatro conclusiones son Sí y el
aminoácido C-terminal es una fenilalanina (F) o una
tirosina (Y), el producto de ORF es de la membrana externa marcada
(Struyve, M., Moons, M., y J. Tommassen. 1991.
Carboxy-terminal Phenylalanine is Essential for the
Correct Assembly of a Bacterial Outer Membrane Protein. J. Mol.
Biol. 218: 141-148).
El programa denominado Psort determina la
localización de una proteína basada en su secuencia señal,
reconocimiento de segmentos transmembrana y análisis de su
composición de aminoácidos (Nakai, K., y M. Kanehisa. 1991. Expert
system for predicting protein localization sites in
gram-negative bacteria. Proteins
11:95-110). Un producto de ORF se considera una
proteína de la membrana externa si los datos producidos predicen que
la proteína es de la membrana externa con un valor de certidumbre
de 0,5 o mejor y cuyo valor es al menos dos veces mayor que el
siguiente valor de certidumbre localizado previsto.
Finalmente, se analizaron adicionalmente
productos de ORF que no se consideraron de la membrana externa o
expuestos en la superficie basándose en los criterios anteriores.
Los datos del resultado de blastp para estos ORFs se buscaron
usando diversas palabras clave generales y específicas, sugerentes
de proteínas expuestas en la superficie celular conocidas. Un ORF
estaba expuesto en la superficie marcada si las palabras claves
correspondientes tenían un acierto Blastp, tenían una puntuación de
P mejor que e^{-10} y no había datos mejores que indicaran otra
cosa. A continuación se proporciona una lista de las palabras clave
buscadas
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se incluyeron los ORFs que no cumplían los
requisitos mínimos para ser una proteína de la membrana externa
basándose en los criterios de búsqueda anteriores pero que eran
homólogas a ORF de la membrana externa identificadas en
Chlamydia trachomatis. El genoma de Chlamydia
trachomatis (Solicitudes de Patente Francesas
FR97-15041, presentada el 28 de Noviembre de 1997 y
97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997) se
analizó usando los criterios de búsqueda anteriores y se
identificaron varios ORFs de membrana externa. Estos ORFs de
Chlamydia trachomatis después se ensayaron frente al genoma
de Chlamydia pneumoniae usando Blastp. En esta sección se
incluyó cualquier ORF de Chlamydia pneumoniae con un valor P
de Blastp P mejor que e^{-10} contra la membrana externa de
Chlamydia trachomatis, si no había ningún dato mejor que
indicara otra cosa. En la memoria descriptiva se ha indicado
anteriormente una lista de ORFs en el genoma de Chlamydia
pneumoniae que codifica supuestas proteínas expuestas en la
superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
Las lipoproteínas son las proteínas secretoras
bacterianas modificadas después de la traducción más abundantes
(Pugsley, A.P., 1993. The complete general secretory pathway in
Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57:
50-108). Los rasgos característicos de las
lipoproteínas son un diacilglicérido unido a tiol y un grupo
monoacilo unido a amina en la cisteína que se convierte en el resto
amino-terminal después de la escisión del péptido
señal por la Peptidasa Señal II. (Pugsley, A. P., 1993. The
complete general secretory pathway in Gram-negative
bacteria. Microbiol. Rev. 57:50-108). La
identificación de supuestas lipoproteínas a partir de la
secuenciación genómica de Chlamydia pneumoniae se realizó
examinando la secuencia de aminoácidos deducida de ORF identificadas
con respecto a la presencia de un péptido señal con un sitio de
escisión de la Peptidasa Señal II análogo a la secuencia consenso
para la modificación de prolipoproteínas y reacciones de
procesamiento (Hayashi, S., y H. C. Wu. 1992. Identification and
characterization of lipid-modified proteins in
bacteria, p. 261-285. En N.M. Hooper y A.J. Turner
(ed.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford
University Press, New York: Sutcliffe, I. C. y R. R. B. Russell.
1995. Lipoproteins of Gram-positive bacteria J.
Bacteriol. 177:1123-1128).
Inicialmente se seleccionaron ORF de
Chlamydia pneumoniae con respecto a las características más
básicas de las lipoproteínas, una cisteína en los primeros 30
aminoácidos de la proteína deducida. Se seleccionaron ORF con codón
de iniciación convencional (ATG, GTG o TTG) y que tenían una o más
de las siguientes características para análisis directo de sus
primeros 30 aminoácidos:
- (a)
- Valor de P Señal significativo (al menos dos de los cuatro valores son Sí)
- (b)
- Valor PSORT que indica el paso a través de la membrana (IM-membrana interna, Peri-periplasma u OM membrana externa)
- (c)
- Identificación de la palabra lipoproteína entre la serie de datos de Blastp de ORF.
- (d)
- Un valor Blastp de <e^{-10} con una supuesta lipoproteína de Chlamydia trachomatis (Solicitudes Francesas 97-15041 presentada el 28 de Noviembre de 1997 y 97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997).
\newpage
\global\parskip0.870000\baselineskip
Los primeros 30 aminoácidos de cada ORF de esta
serie se analizaron para determinar las características encontradas
comúnmente en péptidos señal de lipoproteínas (Pugsley, A.P. 1993.
The complete general secretory pathway in
Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57:
50-108; Hayashi, S., y H. C. Wu. 1992.
Identification and characterization of lipid- modified proteins in
bacteria, p. 261-285. En N. M. Hooper y A. J. Turner
(ed.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford
University Press, New York, Sutcliffe, I. C. y R. R. B. Russell.
1995. Lipoproteins of Gram positive bacteria. J. Bacteriol. 177:
1123-1128.) Se requería que los supuestos péptidos
señal de lipoproteína tuvieran una cisteína entre el aminoácido 10 y
30 y alcanzaran una puntuación mínima de tres basándose en los
siguientes criterios para péptidos señal de lipoproteínas:
- (a)
- Identificación de aminoácidos específicos en posiciones específicas alrededor de la cisteína que forman parte del sitio de escisión consenso de la Peptidasa Señal II (Hayashi, S., y H. C. Wu. 1992. Identification and characterization of lipid-modified proteins in bacteria, p. 261-285. En N. M. Hooper y A. J. Turner (ed.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford University Press, New York); Sutcliffe, I. C. y R. R. B. Russell. 1995. Lipoproteins of Gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 177: 1123-1128). Como la identificación del sitio de escisión es el factor más importante para identificar supuestas lipoproteínas, cada aminoácido colocado correctamente contribuía a alcanzar la puntuación mínima de tres.
- (b)
- Una región hidrófoba rica en alanina y leucina antes del sitio de escisión (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108) contribuía a alcanzar la puntuación mínima de tres.
- (c)
- Un tramo corto de aminoácidos hidrófilos mayor o igual a 1, normalmente lisina o arginina después de la metionina N-terminal (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108) contribuía a alcanzar la puntuación mínima de tres.
En la memoria descriptiva se ha indicado
anteriormente una lista de ORF en el genoma de Chlamydia
pneumoniae que codifican supuestas lipoproteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
El lipopolisacárido (LPS) es un antígeno de
superficie clave importante de células del género Chlamydia.
Se han identificado anticuerpos monoclonales (Mab) dirigidos contra
LPS de Chlamydia pneumoniae que pueden neutralizar la
infectividad de Chlamydia pneumoniae tanto in vitro
como in vivo (Peterson, E. M., de la Maza, L.M., Brade, L.,
Brade, H. 1998. Characterization of a Neutralizing Monoclonal
Antibody Directed at the Lipopolysaccharide of Chlamydia
pneumoniae. Infect. Immun. Aug. 66(8):
3848-3855.) El LPS de Chlamydia está compuesto de
lípido A y una porción de oligosacárido nuclear y es fenotípicamente
de tipo rugoso (R-LPS) (Lukacova, M., Baumann, M.,
Brade, L., Mamat, U., Brade, H. 1994. Lipopolysaccharide
Smooth-Rough Phase Variation in Bacteria of the
Genus Chlamydia. Infect. Immun. Jun. 62(6):
2270-2276.) El componente del lípido A está
compuesto de ácidos grasos que sirven para anclar el LPS en la
membrana externa. El componente del núcleo contiene azúcares y
derivados de azúcar tales como un trisacárido de ácido
3-desoxi-D-mano-octulosónico
(KDO) (Reeves, P.R., Hobbs, M., Valvano, M. A., Skurnik, M.,
Whitfield, C., Coplin, D., Kido, N., Klena, J., Maskell, D., Raetz,
C.R.H., Rick, P.D. 1996. Bacterial Polysaccharide Synthesis and
Gene Nomenclature páginas 10071-10078, Elsevier
Science Ltd.). El producto del gen KDO es una glicosiltransferasa
multifuncional y representa un epítopo compartido entre las
clamidias. Como revisión de la biosíntesis de LPS véase, por
ejemplo, Schnaitman, C.A., Klena, J.D. 1993. Genetics of
Lipopolysaccharide Biosynthesis in Enteric Bacteria. Microbiol. Rev.
57: 655-682.
Una búsqueda de texto de los resultados de
blastp de ORF identificó varios genes que están implicados en la
producción de LPS en clamidias con una puntuación P mejor que
e^{-10}. En la búsqueda de texto se usaron los siguientes
términos clave: KDO, CPS (Biosíntesis de Polisacárido Capsular),
cápsula, LPS, rfa, rfb, rfc, rfe, rha, rhl, núcleo, epimerasa,
isomerasa, transferasa, pirofosforilasa, fosfatasa, aldolasa,
heptosa, mano, glucosa, lpxB, fibronectina, fibrinógeno,
fucosiltransferasa, lic, lgt, pgm, tolC, rol, ChoP, fosforilcolina,
waaF, PGL-Tb1. En la memoria descriptiva se ha
indicado anteriormente una lista de ORFs en el genoma de
Chlamydia pneumoniae que codifican supuestos polipéptidos
implicados en la biosíntesis de LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
La secreción de tipo III permite que las
bacterias gram-negativas secreten e inyecten
proteínas de patogenicidad en el citosol de células hospedadoras
eucariotas (Hueck, C. J., 1998. Type III Protein Secretion Systems
in Bacterial Pathogens of Animals and Plants. En Microbiology and
Molecular Biology Reviews. 62: 379-433). Estos
factores secretados a menudo se parecen a factores de transducción
de señales eucarióticos, permitiendo de esta manera que las
bacterias redirijan las funciones de la célula hospedadora (Lee,
C.A., 1997. Type III secretion systems: machines to deliver
bacterial proteins into eukariotic cells? Trends Microbiol. 5:
148-156). Sin embargo, en un intento de alterar las
funciones celulares normales, los factores de patogenicidad de
Chlamydia inyectados en el citosol del hospedador, como
constituyentes citoplásmicos, se procesarán y presentarán en el
contexto del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC de clase
I). Como tales, estas proteínas de patogenicidad representan
antígenos del MHC de clase I y jugarán un papel importante en la
inmunidad celular. En esta serie también se incluyen productos
secretados que no son de tipo III que pueden jugar un papel como
componentes de vacuna.
Una búsqueda de textos de los resultados de
blastp de ORF identificó genes que están implicados en la secreción
de proteínas de Chlamydia pneumoniae con una puntuación P
mejor que e^{-10}. En la búsqueda de textos se usaron los
siguientes términos clave con la intención de identificar productos
localizados en la superficie o secretados: Yop, Lcr, Ypk, Exo, Pcr,
Pop, Ipa, Vir, Ssp, Spt, Esp, Tir, Hrp, Mxi, hemolisina, toxina, IgA
proteasa, citolisina, tox, hap, secretado y Mip.
Los ORFs de Chlamydia pneumoniae que no
cumplieron los criterios de búsqueda de palabras clave anteriores,
pero tienen homólogos en Chlamydia trachomatis que cumplen
los criterios de búsqueda, se incluyen aquí. El genoma de
Chlamydia trachomatis (Solicitudes de Patente Francesas
FR97-15041, presentada el 28 de Noviembre de 1997 y
97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997) se
analizó usando los criterios de búsqueda anteriores y se
identificaron varios ORFs. Estos ORFs de Chlamydia
trachomatis se ensayaron frente al genoma de Chlamydia
pneumoniae usando Blastp. Se incluyó cualquier ORF de
Chlamydia pneumoniae con un valor P de Blastp < e^{-10}
frente a un homólogo de Chlamydia trachomatis, identificado
usando los criterios de búsqueda anteriores. En la memoria
descriptiva se proporciona una lista de ORFs en el genoma de
Chlamydia pneumoniae que codifica supuestas proteínas
secretadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas que contienen un sitio de unión a
Arg-Gly-Asp (RGD), junto con las
integrinas que sirven como su receptor, constituyen un sistema de
reconocimiento fundamental para la adhesión celular. La secuencia
RGD es el sitio de unión celular de un gran número de proteínas de
la matriz extracelular adhesivas, proteínas sanguíneas y proteínas
de la superficie celular y casi la mitad de las integrinas conocidas
reconocen esta secuencia en sus ligandos de proteínas de adhesión.
Hay muchas proteínas microbianas que contienen RGD tales como la
proteína pentona de adenovirus, el virus coxsackie, el virus de la
fiebre aftosa y la pertactina, una proteína de superficie de 69 kDa
(kilodaltons) de Bordetella pertussis, que sirven como
ligandos a través de los cuales estos microbios se unen a las
integrinas en la superficie celular y entran en la célula. A
continuación se proporcionan pruebas que confirman la importancia de
RGD en la adhesión microbiana:
- a)
- La proteína base de la pentona de adenovirus tiene una actividad de redondeo celular y cuando se expresaba la base pentona en E. coli, producía un redondeo celular y las células se adherían a pocillos de poliestireno recubiertos con la proteína. El análisis de mutantes demostró que estas propiedades requerían una secuencia RGD. Los virus mutantes con sustituciones de aminoácidos en la secuencia RGD mostraron una adherencia mucho menor a células HeLa S3, y también estaban retrasados en la reproducción de los virus (Bai, M., Harfe, B., y Freimuth, P. 1993. Mutations That Alter an RGD Sequence in the Adenovirus Type 2 Penton Base Protein Abolish Its Cell-Rounding Activity and Delay Virus Reproduction in Flat Cells. J. Virol. 67: 5198-5205).
- b)
- Se ha demostrado que la unión y entrada de virus coxsackie A9 a células GMK dependía de un motivo RGD en la proteína de la cápsida VP1. También se ha demostrado que VP1 se une a la integrina \alpha_{\gamma}\beta_{3}, que es un receptor de vitronectina (Roivainen, M, Piirainen, L., Hovi, T., Virtanen, I., Riikonen, T., Heino, J., y Hyypia, T. 1994. Entry of Coxsackievirus A9 into Host Cells: Specific Interactions with a_{\gamma}b_{3} Integrin, the Vitronectin Receptor Virology, 203: 357-65).
- c)
- Durante el transcurso de la tos ferina, la Bordetella pertussis interacciona con macrófagos alveolares y otros leucocitos en el epitelio respiratorio. Las bacterias enteras se adhieren por medio de dos proteínas, la hemaglutinina filamentosa (FHA) y la toxina pertussis. La FHA interacciona con dos clases de moléculas presentes en los macrófagos, glicoconjugados que contienen galactosa y la integrina CR3. La interacción entre CR3 y FHA implica el reconocimiento de la secuencia RGD en las posiciones 1097-1099 en FHA (Relman, D., Tuomanen, E., Falkow, S., Golenbock, D. T., Saukkonen, K., y Wright, S. D. "Recognitition of a Bacterial Adhesin by an Integrin: Macrophage CR3 Binds Filamentous Hemagglutinin of Bordetella Pertussis". Cell, 61: 1375-1382 (1990)).
- d)
- Se ha demostrado que la pertactina, una proteína de la membrana externa de 69 kDa de Bordetella pertussis, promueve la unión de células de ovario de hámster Chino (CHO). Esta unión está mediada por el reconocimiento de la secuencia RGD en la pertactina por integrinas de las células CHO y puede inhibirse por homólogos de péptidos que contienen RGD sintéticos al presente en la pertactina (Leininger, E., Roberts, M., Kenimer, J. G., Charles, I. G., Fairweather, N., Novotny, P., y Brennan, M. J. 1991. Pertactin, an Arg-Gly-Asp containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 345-349).
- e)
- La secuencia RGD está muy conservada en la proteína VP1 del virus de la tos ferina (FMDV). La unión de FMDV a células renales de cría de hámster (BHK), según se ha demostrado, está mediada por la proteína VP1 a través de la secuencia RGD. Los anticuerpos contra la secuencia RGD de VP1 bloqueaban la unión del virus a células BHK (Fox, G., Parry, N. R., Barnett, P. V., McGinn, B., Rowland, D. J., y Brown, F. 1989. The Cell Attachment Site on Foot-and-Mouth Disease Virus Includes the Amino Acid Sequence RGD (Arginine-Glycine-Aspartic Acid) J. Gen. Virol., 70: 625-637).
Se ha demostrado que la adherencia bacteriana
puede basarse en una interacción de una secuencia RGD de adhesina
bacteriana con una integrina y que las adhesinas bacterianas pueden
tener múltiples sitios de unión característicos de proteínas de la
matriz extracelular eucariótica. El reconocimiento de RGD es uno de
los mecanismos importantes usados por los microbios para entrar en
las células eucariotas.
Se buscó la presencia de la secuencia RGD en la
secuencia proteica deducida completa del genoma de Chlamydia
pneumoniae. Hubo un total de 54 ORF que tenían una o más
secuencias RGD. No todas las proteínas que contienen RGD median la
unión celular. Se ha demostrado que los péptidos que contienen RGD
que tienen prolina inmediatamente después de la secuencia RGD son
inactivos en ensayos de unión de células (Pierschbacher &
Ruoslahti. 1987. Influence of stereochemistry of the secuence
Arg-Gly-Asp-Xaa on
binding specificity in cell adhesion. J. Biol. Chem. 262:
17294-98). Se excluyeron de la lista las ORF que
tenían RGD, con prolina como aminoácido siguiente a la secuencia
RGD. Además, la secuencia RGD puede no estar disponible en la
superficie de la proteína y puede estar presente en un contexto que
no es compatible con la unión de la integrina. Como no todas las
proteínas que contienen RGD están implicadas en la unión de
células, se usaron otros criterios para perfeccionar la lista de
proteínas que contienen RGD. En la memoria descriptiva se
proporciona una lista de ORF del genoma de Chlamydia
pneumoniae que codifican polipéptidos con una o más secuencias
de reconocimiento RGD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon ORFs de Chlamydia
pneumoniae con los ORFs del genoma de Chlamydia
trachomatis (Solicitudes de Patente Francesas
FR97-15041, presentada el 28 de Noviembre de 1997 y
97-16034 presentada el 17 de Diciembre de 1997)
usando Blastp. En esta sección se incluye cualquier ORF de
Chlamydia pneumoniae con un valor P de Blastp peor que
e^{-10} (es decir > e^{-10}) frente a los ORFs de
Chlamydia trachomatis. En la memoria descriptiva se ha
indicado anteriormente una lista de los ORFs del genoma de
Chlamydia pneumoniae que no se encuentran en Chlamydia
trachomatis.
\vskip1.000000\baselineskip
Muchas proteínas de la superficie se anclan a la
pared celular de bacterias Gram-positivas a través
del motivo LPXTG conservado (Schneewind, O., Fowler, A., y Faull,
K.F. 1995. Structure of the Cell Wall Anchor of Surface Proteins in
Staphylococcus aureus. Science 268: 103-106).
Se realizó una búsqueda de los ORFs de Chlamydia pneumoniae
usando el motivo LPXTG. En la memoria descriptiva se proporciona una
lista de ORFs en el genoma de Chlamydia pneumoniae que
codifican polipéptidos anclados a la pared celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se depositaron muestras de Chlamydia
pneumoniae en la American Type Culture Collection (ATCC)
Rockville, Maryland, el 19 de Noviembre de 1998 y recibieron el
número de acceso 1360-VR. Las células pueden
cultivarse, recogerse y purificarse, y el ADN puede prepararse como
se ha descrito anteriormente. Para permitir la recuperación de
fragmentos específicos del cromosoma, se pueden realizar reacciones
PCR dirigidas, cuyos productos de amplificación después pueden
secuenciarse y/o clonarse en cualquier vector adecuado, de acuerdo
con procedimientos convencionales conocidos para los especialistas
en la técnica.
Además, se depositó una muestra de tres grupos
de clones que cubrían las regiones cromosómicas de interés en la
American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, el 19
de Noviembre de 1998. Cada conjunto de clones contiene una serie de
clones. Cuando se toman conjuntamente, los tres conjuntos de la
muestra cubren una porción del cromosoma, con una redundancia
ligeramente mayor de dos. El número total de clones en la muestra es
196.
Los clones cubren las tres siguientes regiones
de interés:
- (i)
- posición 30.000 a 40.000 de la SEQ ID No. 1, denominada región A;
- (ii)
- posición 501.500 a 557.000 de la SEQ ID No. 1, denominada región B; y
- (iii)
- posición 815.000 a 830.000 de la SEQ ID No. 1, denominada región C.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Tabla 4 indica un grupo de oligonucleótidos a
usar para amplificar el ORF 291 de acuerdo con procedimientos
convencionales conocidos para los especialistas en la técnica. Estos
oligonucleótidos se listan como SEQ ID No. 1956, 1957, 4460 y 4461.
Para cada ORF, se indica lo siguiente: un cebador directo colocado
2.000 pb cadena arriba del inicio del ORF; un cebador directo
colocado 200 pb cadena arriba del inicio del ORF; un cebador
inverso colocado 2.000 pb cadena abajo al final del ORF, que está
2.000 pb cadena arriba del sitio final del ORF en la cadena
complementaria; y un cebador inverso 200 pb cadena arriba al final
del ORF, que está 200 pb cadena arriba del sitio final del ORF en
la cadena complementaria. Los números correspondientes para los
cebadores se indican en la Tabla 4, donde Fp es el cebador directo
proximal; Fd es el cebador directo distal; Bp es el cebador inverso
proximal; y Bd es el cebador inverso distal. Las posiciones de los
extremos 5' de cada uno de estos cebadores en la secuencia de
nucleótidos de la SEQ ID No. 1 se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Adames et al., 1985,
Nature, 318: 533-538.
Aldous, M.B. et al., 1992,
J. Infect. Dis., 166: 646-649.
Alexander et al., 1987,
Mol. Cell. Biol., 7: 1436-1444.
Allan, G. M. et al., 1995,
Vet. Microbiol., 44: 49-64.
Altschul, S.F. et al.,
1990, J. Mol. Biol, 215: 403-410.
Altschul et al., 1993,
Nature Genetics, 3: 266-272.
Altschul et al., 1997,
Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402.
Ansubel et al., 1989,
Current Protocols in Molecular Biology.
Arlinghaus, H.F. et al.,
1997, Anal. Biochem., 69, 18,
3747-53.
Bai, M. et al., 1993, J.
Virol, 67: 5198-5205.
Barany, F., 1911, PNAS.
USA, 88:189-193.
Beattie, K. et al., 1993,
Clin. Chem., 39(4): 719-721.
Bernoist and Chambon, 1981,
Nature, 290: 304-310.
Borman, S., 1996, Chem. Eng.
News, 74(50): 42-43.
Braun, J. et al, 1994 Ann., Rheum Dis 53: 100-105.
Brinster et al., 1982,
Nature, 296: 39-42.
Buckholz, R.G., 1993, Yeast
systems for the expression of heterologous gene products. Curr.
Op. Biotechnology 4: 538-542.
Burg, J.L. et al., 1996,
Mol. and Cell. Probes, 10: 257-271.
Campbell, LA. et al., 1992 J. Clin. Microbiol. 30: 434-439.
Casas-Ciria J. et
al., 1996.
Chatelier, R.C. et al.,
1995, Anal. Biochem.,
229,1,112-118.
Chee, M. et al., 1996,
Science, 274: 610-613.
Chu, B.C.F. et al., 1986,
NAR, 14: 5591-5603.
Chu, P.W.G. et al., 1993,
Virus Research, 27: 161-171.
Clark, E.G., 1997, American
Association of Swine Practitioners, 499-501.
Cole et al., 1985, in
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.
77-96.
Cote et al, 1983, PNAS
USA, 80: 2026-2030.
Cserzo, M., Wallin, E.,
Simon, I. von Heijne G and Elofsson, A.,
1997, Prot. Eng., 10: 673-676.
DeBoer et al., 1980,
Scientific American, 242: 74-94.
DeBoer et al., 1983,
PNAS USA, 80: 21-25.
Derisi, J. et al., 1996,
Nature Genet, 14: 457-460.
Distance Relationships: Atlas of Protein
Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Reserach
Foundation.
Duck, P. et al., 1990,
Biotechniques, 9: 142-147.
Dulac, G.C. et al., 1989,
Can. J. Vet. Res., 53: 431-433.
Edwards, C.P., and Aruffo, A.,
1993, Current applications of COS cell based transient
expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4:
558-563.
Edwards, S. et al., 1994,
Vet. Res., 134: 680-681.
Erlich, H.A., 1989, In PCR
Technology. Principies and Applications for DNA Amplification. New
York: Stockton Press.
Falsey, et al., J. Infect. Dis.
168: 493-496.
Fanger and Drakeman, 1995,
Drug News and Perspectives, 8: 133-137.
Felgner, et al., 1987,
Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 7413.
Fodor, S.P.A. et al., 1991,
Science, 251: 767-771.
Fontes, E.P.B. et al.,
1994, J. Biol. Chem., Vol. 269, Nº 11:
8459-8465.
Fox, G. et al., 1989, J.
Gen. Virol., 70: 625-637.
Fraley et al., 1980, J.
Biol. Chem., 255: 10431.
Gardner et al., 1981,
Nucl. Acids Res. 9: 2871
Gaydos, C.A. et al., 1994 J. Clin. Microbiol. 32: 903-905.
Grayston, J.T. et al., 1986 N. Engl. J. Med., 315: 161-168.
Grayston, JT. et al., 1996 Rev., Med Interne 17, 45S-47S.
Gonnet et al., Science, 256:
1443-1445.
Green Publishing Associates and Wiley
Interscience, N.Y. Pearson and Lipman, 1988,
PNAS USA, 85(8): 2444-2448.
Grosschedl, et al., 1984,
Cell, 38: 647-658.
Guateli, J.C. et al., 1990,
PNAS. USA, 87: 1874-1878.
Hackland, A.F. et al.,
1994, Arch. Virol., 139: 1-22.
Hahn, DL. et al., 1991 JAMA. 266
Haidl, et al., 1992 N.
Engl. J. Med. 326: 516-511.
Haidl, et al., Chlamydial
infections 1994.
Hammer et al., 1987,
Science, 235: 53-58.
Hanahan, 1985, Nature, 315:
115-122.
Hanson, S.F. et al., 1995,
Virology, 211: 1-9.
Harding, J.C., 1997, American
Association of Swine Practitioners, 503.
Harding, R.M. et al., 1993,
Journal of General Virology, 74: 323-328.
Hashiguchi, K. et al., 1992 J. Laryngol. Otol. 106: 208-210.
Hayashi, S. and Wu, H.C.,
1992, in N.M. Hooper and A.J. Tumer (ed.) Lipid Modification
of Proteins: A Practical Approach. Oxford University Press, New
York, pp. 261-285.
Heinkoff and Heinkoff,
1993, Proteins, 17: 49-61.
Herrera-Estrella et
al., 1983, Nature, 303:
209-213.
Herrera-Estrella,
1984, Nature, 310: 115-120.
Heyraud-Nitschke, F.
et al., 1995, Nucleic Acids Research, Vol. 23,
Nº 6.
Higgins et al., 1996,
Meth. Enzymol., 266: 383-402.
Homer, G.W., 1991,
Surveillance 18(5): 23.
Houbenweyl, 1974, in Meuthode der
Organischen Chemie, E. Wunsch Ed., Volume 15-I et
15-II, Thieme, Stuttgart.
Hueck, C.J., 1998, Molec.
Biology Rev., 62: 379-433.
Huovinen, P. et al., 1989 Ann, Intem Med 110: 612-616.
Huse et al., 1989,
Science, 246: 1275-1281.
Huygen, K. et al., 1996,
Nature Medicine, 2(8): 893-898.
Innis, M.A. et al. 1990. in
PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. San Diego:
Academic Press.
Inoue et al., 1987,
Nucl. Acids Res., 15:6131-6148.
Inoue et al., 1987, FEBS
Lett. 215: 327-330.
Jackson, LA. et al., 1997 Am., J. Pathol. 150: 1785-1790.
Jantos et al., 1997, J.
Clin. Microbiol., 35(3): 620-623.
Kabat E. et al., 1983,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Of
Health and Human Services.
Kaneda, et al, 1989,
Science, 243: 375.
Kelsey et al., 1987,
Genes and Devel., 1: 161-171.
Kievitis, T. et al., 1991,
J. Virol. Methods, 35:273-286.
Kleemola, M. et al., 1988,
J. Infect. Dis. 157:230-236.
Kohler, G. et al., 1975,
Nature, 256(5517): 495-497.
Kollias et al, 1986,
Cell, 46: 89-94.
Kozbor et al., 1983,
Immunol. Today, 4: 72.
Krone, J.R. et al, 1997,
Anal. Biochem, 244,1,124-132.
Krumlauf et al, 1985,
Mol. Cell. Biol, 5:1639-1648.
Kuo, CC. et al, 1988, J.
Clin. Microbiol. 26: 812-815.
Kuo, CC. et al, 1993, J.
Infect. Dis. 167: 841-849.
Kwoh, D.Y. et al, 1989,
PNAS. USA, 86: 1173-1177.
Ladany, S. et al, 1989,
J. Clin. Microbiol. 27: 2778-2783.
Laitinen, K. et al, 1997.
Chlamydia pneumoniae Infection Induces Inflammatory Changes
in the Aortas of Rabbits. Infect. Immun. 65:
4832-4835.
Lazarowitz, S. G. et al,
1989, The EMBO Journal, Vol. 8 Nº 4:
1023-1032.
Leder et al, 1986,
Cell, 45: 485-495.
Lee, C.A., 1997, Trends
Microbiol., 5; 148-156.
Leininger, E. et al., 1991,
PNAS USA, 88: 345-349.
Lipshutz, R.J. et al.,
1995, Biotechniques, 19(3):
442-447.
Liu, H. et al., 1997, J.
Gen. Virol. 78(Pt6): 1265-1270.
Livache, T. et al., 1994,
NAR, 22(15): 2915-2921.
Lockhart, D.J. et al.,
1996, Nature Biotechnol., 14:
1675-1680.
Longbottom et al., 1998,
Infect Immunol., 66: 1317-1324.
Luckow, V.A., 1993, Baculovirus
systems for the expression ofhuman gene products. Curr. Op.
Biotechnology 4: 564-572.
Lukacova, M. et al., 1994,
Infect. Immunol. June, 62(6):
2270-2276.
MacDonald, 1987,
Hepatology, 7: 425-515.
Mankertz, A. et al., 1997,
J. Virol., 71: 2562-2566.
Mason et al., 1986,
Science, 234: 1372-1378.
Matson, R.S. et al, 1994,
Analytical Biochemistry, 217: 306-310.
Matthews, J.A. et al.,
1988, Anal. Biochem., 169: 1-25.
McNeilly, F. et al., 1996,
Vet. Immunol. Immunopathol., 49: 295-306.
Meehan, B.M. et al., 1997,
J. Gen. Virol., 78: 221-227.
Mérel, P., 1994, De la PCR aux
puces à ADN, Biofutur, 139: 58.
Merrifield, R.D., 1966, J. Am.
Chem. Soc., 88(21): 5051-5052.
Midoux, 1993, Nucleic Acids
Research, 21: 871-878.
Miele, E.A. et al., 1983,
J. Mol. Biol., 171:281-295.
Moazed, T.C. et al., 1997.
Murine Model of Chlamydia pneumoniae Infection and
Atherosclerosis. J. Infect. Dis. 175:
883-890.
Mogram et al., 1985,
Nature, 315: 338-340.
Mordhorst, C.H. et al.,
1992 Eur., J. Clin. Microbiol. Infect Dis 11:
617-620.
Morrison et al, 1984,
PNAS USA, 81: 6851-6855.
Momson, R.P. et al., 1995.
Gene Knockout Mice Establish a Primary Protective Role for Major
Histocompatibility Complex Class II-Restricted
Responses in Chlamydia trachomatis. Infect. Immun.
63:4661-4668.
Murphy, F.A. et al., 1995,
Sixth Report of the International Committec on Taxonomy of Virases.
Springer-Verlag Wien New York.
Nakai, K. and Kanehisa, M.,
1991, Proteins, 11: 95-110.
Nielsen, H. et al., 1997,
Protein Engin., 10: 1-6.
Neuberger et al., 1984,
Nature, 312: 604-608.
O'Donell-Maloney, M.J.,
1996, Trends Biotechnol., 14:
401-407.
Ogawa, H. et al., 1992 J. Laryngol. Oto 106: 490-492.
Olins, P.O., and Lee, S.C.,
1993, Recent advances in heterologous gene expression in
E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:
520-525.
Ornitz et al., 1986,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:
399-409.
Pagano et al, 1967, J.
Viral, 1: 891.
Peterson, E.M. et al, 1998,
Infect. Immunol. Aug, 66(8):
3848-3855.
Peterson, E. et al, 1988.
Protective Role of Magnesium in the Neutralization by Antibodies of
Chlamydia trachomatis Infectivity.
Pierschbacher and Ruoslahti,
1987, J. Biol. Chem, 262:
17294-17298.
Pinkert et al, 1987,
Genes and Devel, 1: 268-276.
Pugsley, A.P, 1993, Microbiol.
Rev, 57: 50-108.
Puolakkainen, M. et al,
1993 J. Clin. Microbiol. 31:
2212-2214.
Rank, R.G. et al, 1988.
Susceptibility to reinfection after a primary chlamydial genital
infection. Infect. Immun. 56: 2243-2249.
Readhead et al, 1987,
Cell, 48: 703-712.
Reeves, P.R. et al, 1996,
in Bacterial Polysaccharide Synthesis and Gene Nomenclature,
Elsevier Science Ltd, pp. 10071-10078.
Roivainen, M. et al, 1994,
Virology, 203: 357-365.
Rolfs, A. et al, 1991, In
PCR Topics. Usage of Polymerase Chain reaction in Genetic and
Infectious Disease. Berlín: Springer-Verlag.
Salzberg et al, 1998, Nucl.
Acids Res, 26: 544-548.
Sambrook, J. et al, 1989,
In Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY:
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sanchez-Pescador, R,
1988, J. Clin. Microbiol, 26(10):
1934-1938.
Sani, 1985, Nature, 314:
283-286.
Sarver et al, 1990,
Science, 247: 1222-1225.
Schachter, J. 1980. Chlamydiae,
p.357-365. In E.H. Lennette (ed.), Manual of
clinical microbiology, 3^{rd} ed. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
Schneewind, O. et al, 1995,
Science, 268: 103-106.
Schwartz and Dayhoff, eds,
1978, Matrices for Detecting Karlin and Altschul, 1990,
PNAS USA, 87: 2267-2268.
Segev D, 1992, in
"Non-radioactive Labeling and Detection of
Biomolecules". Kessler C. Springer Verlag, Berlin,
New-York: 197-205.
Sheldon, E.L., 1993, Clin.
Chem, 39(4): 718-719.
Shiver, J.W, 1995, in Vaccines
1995, eds Chanock, R.M. Brown, F. Ginsberg, H.S. &
Norrby, E.), pp. 95-98, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Shoemaker, D.D. et al,
1996, Nature Genet, 14:450-456.
Shor, A. et al., 1992 S.
Afr. Med. J. 82: 158-161.
Sosnowsky et al., 1997,
PNAS, 94, 1119-1123.
Struyve, M. et al., 1991,
J. Mol. Biol., 218: 141-148.
Sundelof, et al., 1993 Scand. J. Infec. Dis. 25: 259-261.
Sutcliffe, I.C. and Russell,
R.R.B., 1995, J. Bacteriol. 177:
1123-1128.
Swift et al., 1984,
Cell, 38: 639-646.
Takeda et al, 1985,
Nature, 314: 452-454.
Tascon, R.E et al., 1996,
Nature Medicine, 2(8): 888-892.
Thom, D.H. et al, 1990 Am. J. Epidemiol 132: 248-256.
Thomas, GN. et al, 1997 Scand, J. Infect. Dis. Suppl 104, 30-33.
Tischer, I. et al, 1982,
Nature, 295: 64-66.
Tischer, I. et al, 1986,
Arch. Virol, 91: 271-276.
Tischer, I. et al, 1988,
Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A] 270:
280-287.
Tischer, I. et al, 1995,
Arch. Virol, 140: 737-743.
Tompson et al, 1994,
Nucl. Acids Res, 22(2): 4673-4680.
Urdea, M.S, 1988, Nucleic Acids
Research, 11: 4937-4957.
Villa-Kamaroff et
al, 1978, PNAS USA, 75:
3727-3731.
Wagner et al, 1981, PNAS
USA, 78: 1441-1445.
Walker, G.T. et al, 1992,
NAR 20: 1691-1696.
Walker, G.T. et al, 1992,
PNAS. USA, 89: 392-396.
White, B.A. et al, 1997,
Methods in Molecular Biology, 67, Humana Press, Towota.
Yamamoto et al., 1980,
Cell, 22: 787-797.
Yershov, G. et al, 1996,
PNAS, USA, 93: 4913-4918.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> SERONO GENETICS INSTITUTE SA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptido de la membrana externa
de Chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y usos del
mismo, en particular para el diagnóstico, prevención y tratamiento
de una infección
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-11-21
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> ORF 291
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> ORF291
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Comienzo: posición nt323190, final:
posición nt322366 (véase Tabla 2) en la secuencia del genoma
completo SEQ ID No. 1 descrita en la solicitud de patente madre
W099/27105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID No.291
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEQ ID No.291
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID No.1956
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEQ ID No.1956
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcagcata agtgctacta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID No.1957
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEQ ID No.1957
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccttggcg tgtaggaatia
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID No.4460
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEQ ID No. 4460
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaaagcta tccacagctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID No.4461
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> SEQ ID No.4461
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagggattt gtcaaggaac
\hfill20
Claims (27)
1. Un polinucleótido aislado que tiene una
secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto (ORF) de un
genoma de Chlamydia pneumoniae, que comprende:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos ORF291 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 291;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que exhibe una identidad de al menos 80% con la secuencia de la SEQ ID No. 291; o
- (c)
- una secuencia complementaria de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que
codifica los siguientes polipéptidos o fragmentos de los mismos:
- (a)
- un polipéptido de Chlamydia pneumoniae de la envuelta celular, preferiblemente de la envuelta celular externa;
- (b)
- un polipéptido de la transmembrana de Chlamydia pneumoniae que tiene entre 1 y 3 dominios de la transmembrana;
- (c)
- un polipéptido expuesto a la superficie de Chlamydia pneumoniae;
- (d)
- una lipoproteína de Chlamydia pneumoniae; o
- (e)
- un polipéptido de Chlamydia pneumoniae que no se encuentra en Chlamydia trachomatis.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un polinucleótido que codifica una proteína
de fusión, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó
2, ligado en marco a un polinucleótido que codifica un polipéptido
heterólogo.
4. Un vector recombinante que contiene el
polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un vector recombinante que contiene el
polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3, operativamente
asociado con una secuencia reguladora que controla la expresión de
los genes.
6. Una célula hospedadora tratada mediante
ingeniería genética, que contiene el polinucleótido de las
reivindicaciones 1 a 3.
7. Una célula hospedadora tratada mediante
ingeniería genética, que contiene el polinucleótido de las
reivindicaciones 1 a 3, operativamente asociado con una secuencia
reguladora que controla la expresión de los genes en la célula
hospedadora.
8. Un método para producir un polipéptido, que
comprende:
- (a)
- cultivar la célula hospedadora tratada mediante ingeniería genética de la reivindicación 6 ó 7, en condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado por el polinucleótido; y
- (b)
- recuperar el polipéptido del cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un polipéptido codificado por el
polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3.
10. El polipéptido de la reivindicación 9, que
comprende los siguientes polipéptidos o fragmentos de los
mismos:
- (a)
- un polipéptido de Chlamydia pneumoniae de la envuelta celular, preferiblemente de la envuelta celular externa;
- (b)
- un polipéptido de la transmembrana de Chlamydia pneumoniae que tiene entre 1 y 3 dominios de la transmembrana;
- (c)
- un polipéptido expuesto a la superficie de Chlamydia pneumoniae;
- (d)
- una lipoproteína de Chlamydia pneumoniae; o
- (e)
- un polipéptido de Chlamydia pneumoniae que no se encuentra en Chlamydia trachomatis.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Una proteína de fusión, codificada por el
polinucleótido de la reivindicación 9 ó 10.
12. El polipéptido de las reivindicaciones 9 a
11, que inmunorreacciona con suero seropositivo de un individuo
infectado con Chlamydia pneumoniae.
13. Un anticuerpo que se une
inmunoespecíficamente al polipéptido de la reivindicación 9 ó
10.
14. Un método para la detección y/o la
identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra
biológica, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un cebador de polinucleótidos que se híbrida específicamente con el polinucleótido ORF291, o una secuencia complementaria del mismo, en presencia de una enzima polimerasa y nucleótidos en condiciones que permiten la extensión del cebador; y
- (b)
- detectar la presencia de productos de extensión del cebador en la muestra, en que la detección de productos de extensión del cebador indica la presencia de Chlamydia pneumoniae en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un método para la detección y/o la
identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra
biológica, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con una sonda de polinucleótidos que se híbrida específicamente con el polinucleótido ORF291, o una secuencia complementaria del mismo, en condiciones que permiten la hibridación de pares de bases complementarios; y
- (b)
- detectar la presencia de complejos de hibridación en la muestra, en que la detección de complejos de hibridación indica la presencia de Chlamydia pneumoniae en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un método para la detección y/o
identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra
biológica, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 13, en condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunes; y
- (b)
- detectar la presencia de complejos inmunes en la muestra en la que la detección de complejos inmunes indica la presencia de Chlamydia pneumoniae en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un método para la detección y/o
identificación de Chlamydia pneumoniae en una muestra
biológica, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un polipéptido de las reivindicaciones 9 y 10, en condiciones adecuadas para la formación de complejos inmunes; y
- (b)
- detectar la presencia de complejos inmunes en la muestra en la que la detección de complejos inmunes indica la presencia de Chlamydia pneumoniae en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Un chip de ADN que contiene una serie de
polinucleótidos que comprenden al menos uno de los polinucleótidos
de la reivindicación 1 a 3.
19. Un chip de proteína que contiene una serie
de polinucleótidos que comprenden al menos uno de los
polinucleótidos de la reivindicación 9 ó 10.
20. Una composición inmunogénica que comprende
el polipéptido de las reivindicaciones 9 a 12 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
21. Una composición inmunogénica de ADN que
comprende el vector de expresión de la reivindicación 4 ó 5.
22. La composición de ADN de la reivindicación
21, en donde la composición de ADN dirige la expresión de un epítopo
neutralizante de Chlamydia pneumoniae.
23. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido de las reivindicaciones 9 a 12, o un anticuerpo de la
reivindicación 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
\newpage
24. Composición para el tratamiento o la
prevención de una infección por Chlamydia pneumoniae,
comprendiendo dicha composición:
- a)
- un polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3;
- b)
- un polipéptido de las reivindicaciones 9 a 12;
- c)
- un anticuerpo de la reivindicación 13;
- d)
- un vector de las reivindicaciones 4 y 5; o
- e)
- una célula hospedadora de las reivindicaciones 6 y 7.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Una composición de la reivindicación 24, en
forma de una vacuna.
26. Un ensayo de selección, que comprende:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con un polinucleótido aislado de las reivindicaciones 9 y 10; y
- (b)
- detectar si se produce una unión.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Un kit que comprende un recipiente que
contiene un polinucleótido aislado de las reivindicaciones 1 a 3, o
un cebador o una sonda capaz de hibridarse específicamente con un
polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 3, un polipéptido aislado
de las reivindicaciones 9 y 10 o un anticuerpo de la reivindicación
13.
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| CA2523626A1 (en) * | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and system for the detection of cardiac risk factors |
| US20040192591A1 (en) * | 2002-11-22 | 2004-09-30 | Wooters Joseph L. | Composition for treating Chlamydia infections and method for identifying same |
| CN1856505A (zh) * | 2003-02-24 | 2006-11-01 | 巴斯德研究院 | 分泌型衣原体多肽、其编码多核苷酸及其治疗和诊断用途 |
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| KR20120085921A (ko) * | 2004-05-11 | 2012-08-01 | 압제노믹스 코오페라티에프 유.에이. | Ｔ 세포 사멸 유도성 에피토프 |
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