DE69533673T2

DE69533673T2 - Behandlung und prävention von helicobacter-infektionen

Info

Publication number: DE69533673T2
Application number: DE69533673T
Authority: DE
Inventors: Christopher Vincent Doidge; Adrian Lee; Fiona Jane Radcliff; Stuart Lloyd Hazell
Original assignee: CSL Ltd; UNSW Sydney
Current assignee: CSL Ltd; UNSW Sydney
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: JPH10500958A; EP0771214A4; US6468545B1; WO1995033482A1; EP0771214B1; KR100368475B1; NZ287385A; AUPM612494A0; US6005090A; EP0771214A1; DE69533673D1; US6630582B1; ATE279940T1; KR970703164A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft protektive Helicobacter-Antigene, insbesondere H. pylori-Antigene und die Verwendung dieser Antigene zur Behandlung und Prävention einer mit einer H. pylori-Infektion verbundenen Gastroduodenalerkrankung bei Menschen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Helicobacter pylori ist ein Bakterium, das die Magenauskleidung (oder Magenschleimhaut) von vielleicht der Hälfte der Weltbevölkerung infiziert. Spiralförmige Organismen wurden 1906 zum ersten Mal per Mikroskop in der humanen Magenschleimhaut beobachtet. Jedoch wurde H. pylori erst 1982 erfolgreich kultiviert. Die Infektion mit dem Organismus ist üblicherweise chronisch und sie führt zu einer fortgesetzten Entzündung der Magenschleimhaut. Die Infektion ist häufig symptomlos. Jedoch entwickeln in Verbindung mit anderen Cofaktoren ein Teil der infizierten Personen Folgeerscheinungen, die peptische Ulzeration des Magens oder Duodenums, Magenadenokarzinome und Magenlymphome umfassen. Untersuchungen der Behandlung von peptischem Ulkus zeigten, dass die Heilung einer H. pylori-Infektion mit einer drastischen Verringerung der Rückfallrate dieser üblicherweise chronischen Erkrankung verbunden ist. Eine Langzeitinfektion mit H. pylori führt zur Entwicklung von chronischer atrophischer Gastritis, von der seit langem bekannt ist, dass sie eine Vorläuferschädigung bei der Entwicklung von Magenkrebs ist. Daher verknüpten nun eine Zahl von Untersuchungen eine vorhergehende H. pylori- Infektion mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Magenkrebs. Daher besitzt das Ausrotten einer bestehenden Infektion und die Verhinderung einer neuen Infektion mit diesem Organismus das Potential zur signifikanten Verringerung des Auftretens von Erkrankungen, die zu beträchtlicher Morbidität und Mortalität führen^1,2.
Eine Infektion mit H. pylori ist schwierig zu behandeln. Bestehende experimentelle Therapien zur Behandlung der Infektion haben Probleme mit der Wirksamkeit und signifikanten Ausmaßen nachteiliger Wirkungen. Es stehen keine prophylaktischen Maßnahmen zur Verfügung. Eine Lösung zur sowohl Prävention als auch Behandlung einer H. pylori-Infektion wäre die Entwicklung einer immunogenen Zubereitung, die als Immuntherapeutikum auftretende Infektionen behandelt und als Impfstoff die Etablierung neuer oder wiederkehrender Infektionen verhindert. Eine derartige Zubereitung müsste wirksame Immunreaktionen auf protektive Antigene induzieren, während die Induktion von Reaktionen auf Eigenantigene oder andere möglicherweise schädliche Immunreaktionen vermieden werden. Dies kann durch die Identifizierung der spezifischen protektiven Komponente oder Komponenten und die Formulierung von immuntherapeutischen oder Impfstoffzubereitungen, die diese Komponente(n) umfassen, erreicht werden.
Die Identifizierung derartiger protektiver Komponenten eines Organismus wird häufig durch die Verwendung eines Tiermodells der Infektion erreicht. H. pylori infiziert Labortiere von Natur aus nicht. Jedoch wurde ein Tiermodell einer humanen H. pylori-Infektion unter Verwendung eines nahe verwandten Organismus, H. felis, und von spezifischen pathogenfreien (SPF) Mäusen entwickelt³. Diese Organismen können die Magenschleimhaut von SPF-Mäusen besiedeln, wo sie eine chronische Infektion mit vielen der Merkmale einer H. pylori-Infektion bei Menschen entwickeln. Eine H. felis-Infektion bei Mäusen induziert eine chronische Gastritis und eine erhöhte Immunreaktion. Wie in dem humanen Fall ist diese Reaktion nicht zur Heilung der Infektion wirksam.
Dieses Modell wurde verwendet, um zu zeigen, dass eine orale Behandlung von mit H. felis infizierten Mäusen mit einer Zubereitung, die aufgebrochene H. pylori-Zellen und Choleratoxin als Mukosaadjuvans enthält, einen signifikanten Teil von infizierten Mäusen heilen kann⁴. Dieser Effekt wird wahrscheinlich durch eine Immunreaktion mit einem kreuzreaktiven Antigen, das jede der nahe verwandten Arten besitzt, vermittelt.
Bei den zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten durch die Erfinder wurden diese kreuzreaktiven Antigene dadurch erkannt, dass ein Western-Blot unter Verwendung von aufgebrochenen H. pylori-Zellen als Antigen durchgeführt und der Blot mit Serum von mit H. felis und Choleratoxin-Adjuvans immunisierten Mäusen sondiert wurde. Membranabschnitte, die Proteine enthielten, die als kreuzreaktiv erkannt wurden, wurden von der Membran entfernt, die daran gebundenen Proteine wurden eluiert und deren N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch Mikrosequenzierung bestimmt.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von einem der zwei Proteine, die erfolgreich Sequenzdaten ergaben, stimmte eng mit der früher veröffentlichten Sequenz des Mikroorganismenenzyms Urease überein⁵. Es wurde bereits gezeigt, dass dieses Enzym ein protektives Antigen ist, wenn es in einem Impfstoff zur Verhinderung einer Infektion verwendet wird.
Die N-terminale Aminosäuresequenz des anderen Proteins stimmte eng mit der früher veröffentlichten N-terminalen Sequenz des Mikroorganismenenzyms Katalase überein⁶. Von diesem Enzym wurde bisher nicht gezeigt, dass es ein protektives Antigen von H. pylori ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Säugerwirt bereit, wobei diese eine immunologisch wirksame Menge einer Antigenzubereitung, die eine zumindest teilweise gereinigte Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Verdünnungsmitteln umfasst.
In einem verwandten Aspekt stellt diese Erfindung die Verwendung einer Antigenzubereitung, die eine zumindest teilweise gereinigte Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Säugerwirt bereit.
Die Impfstoffzusammensetzung kann ferner ein Adjuvans umfassen, das ein Mucosaadjuvans sein kann.
Vorzugsweise, wobei dies jedoch nicht wesentlich ist, ist die Impfstoffzusammensetzung dieser Erfindung, die ein Mucosaadjuvans umfasst, zur oralen Verabreichung an den Wirt angepasst. Die Erfindung erstreckt sich jedoch auch auf eine parenterale Verabreichung.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Abgabe der Antigenzubereitung dieser Erfindung an den Wirt unter Verwendung eines Vektors, der die Katalase von Heli cobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben exprimiert. Daher stellt diese Erfindung in einem weiteren Aspekt eine Zubereitung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Säugerwirt bereit, die einen Lebendimpfstoffvektor, der die Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben exprimiert, umfasst.
Ferner erstreckt sich die Erfindung auf die Verwendung eines Lebendimpfstoffvektors, der die Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben exprimiert, zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Säugerwirt.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf einen Antikörper, der entweder ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein kann, der für eine Antigenzubereitung, die die Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, spezifisch ist.
In diesem Aspekt stellt die Erfindung ferner eine Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Säugerwirt bereit, die einen Antikörper gemäß der Erfindung umfasst. Die Verwendung eines Antikörpers gemäß der Erfindung bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion in einem Säugerwirt wird ebenfalls bereitgestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Durchgängig in dieser Beschreibung soll, falls der Zusammenhang nichts anderes erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassend" so verstanden werden, dass der Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder einer Gruppe von ganzen Zahlen, jedoch nicht der Ausschluss einer anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen impliziert wird.
Vorzugsweise umfasst die Antigenzubereitung dieser Erfindung eine Zubereitung der Katalase von H. pylori oder H. felis, vorzugsweise der Katalase von H. pylori oder eines immunogenen Fragments derselben. Ebenfalls vorzugsweise wird diese Antigenzubereitung in einer Impfstoffzusammensetzung zur oralen Verabreichung, die ein Mucosaadjuvans umfasst, verwendet.
In einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung wird eine orale Impfstoffzusammensetzung, die eine Antigenzubereitung einer zumindest teilweise gereinigten H. pylori-Katalase in Verbindung mit einem Mucosaadjuvans umfasst, zur Behandlung oder Prävention einer H. pylori-Infektion in einem humanen Wirt verwendet.
Der hier verwendete Ausdruck "zumindest teilweise gereinigt" bezeichnet eine Zubereitung, in der der Katalasegehalt größer, zweckmäßigerweise mindestens 30% und vorzugsweise mindestens 50% größer als der Katalasegehalt eines Ultraschallbehandlungsprodukts ganzer Zellen von Helicobacter-Bakterien ist. Vorzugsweise ist die Zubereitung eine, in der die Katalase "im wesentlichen rein" ist, d. h. eine Zubereitung, in der der Katalsegehalt mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, der gesamten Helicobacter-Antigene in der Zubereitung beträgt.
Es ist klar, dass sich die vorliegende Erfindung nicht nur auf eine Antigenzubereitung, die die Katalase von Helicobacter-Bakterien umfasst, sondern auch auf Antigenzubereitungen, die immunogene Fragmente dieser Katalse, d. h. Katalasefragmente, die eine spezifische protektive Immunreak tion in einem Säugerwirt hervorrufen können, umfassen, erstreckt. Derartige immunogene Fragmente können auch durch Helicobacter-spezifische Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, die eine protektive oder therapeutische Wirkung in Bezug auf eine Helicobacter-Infektion aufweisen, oder polyklonale Antikörper, die in Immunseren von Säugerwirten, die gegen eine Helicobacter-Infektion geimpft wurden, enthalten sind, erkannt werden.
Die Verwendung des Ausdrucks "immunologisch wirksame Menge" hier im Zusammenhang der Behandlung einer Helicobacter-Infektion soll bedeuten, dass die Verabreichung dieser Menge an einen individuellen infizierten Wirt, entweder in einer Einzeldosis oder als Teil einer Reihe, zur Behandlung einer Helicobacter-Infektion wirksam ist. Die Verwendung des Ausdrucks "immunologisch wirksame Menge" hier im Zusammenhang der Prävention einer Helicobacter-Infektion soll bedeuten, dass die Verabreichung dieser Menge an einen individuellen Wirt, entweder in einer Einzeldosis oder als Teil einer Reihe, zur Verzögerung, Hemmung oder Verhinderung einer Helicobacter-Infektion wirksam ist. Die wirksame Menge variiert in Abhängigkeit von der Gesundheit und dem physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums, der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem gewünschten Schutzgrad, der Formulierung des Impfstoffs, der Beurteilung der medizinischen Situation und anderen relevanten Faktoren. Es wird angenommen, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch Routineversuche bestimmt werden kann.
Das Mucosaadjuvans, das optional ist und vorzugsweise mit der zumindest teilweise gereinigten Helicobacter-Katalsezubereitung an den infizierten Wirt verabreicht wird, ist vorzugsweise Choleratoxin. Mucosaadjuvantien außer Cholera toxin, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen nichttoxische Derivate von Choleratoxin, wie die B-Untereinheit (CTB), chemisch modifiziertes Choleratoxin oder verwandte Proteine, die durch Modifikation der Aminosäuresequenz von Choleratoxin hergestellt werden. Diese können zu der Helicobacter-Katalasezubereitung gegeben oder mit dieser konjugiert werden. Die gleichen Techniken können auf andere Moleküle mit Mucosaadjuvans- oder -abgabeeigenschaften, wie hitzelabiles Toxin von Escherichia coli, angewandt werden. Andere Verbindungen mit Mucosaadjuvans- oder -abgabeaktivität, wie Galle; Polykationen, wie DEAE-Dextran und Polyornithin; Detergentien, wie Natriumdodecylbenzolsulfat; mit Lipid konjugierte Materialien; Antibiotika, wie Streptomycin; Vitamin A; und andere Verbindungen, die die strukturelle oder funktionale Integrität von Mucosaoberflächen ändern, können verwendet werden. Andere mucosal aktive Verbindungen umfassen Derivate von Mikroorganismenstrukturen, wie Muramyldipeptid (MDF); Acridin und Cimetidin.
Die Helicobacter-Katalasezubereitung kann gemäß dieser Erfindung in ISCOMS (Immune Stimulating Complexes), CTB enthaltenden ISCOMS, Liposomen oder eingekapselt in Verbindungen, wie Acrylaten oder Poly(DL-lactid-co-glycosid), unter Bildung von Mikrokügelchen einer zur Adsorption durch M-Zellen geeigneten Größe zugeführt werden. Alternativ können Mikro- oder Nanopartikel an Moleküle, wie Vitamin B12, die spezifische Magen- bzw. Darmrezeptoren besitzen, kovalent gebunden werden. Die Helicobacter-Katalasezubereitung kann auch in Ölemulsionen eingearbeitet und oral zugeführt werden. Eine breite, wenn auch nicht erschöpfende Liste von Adjuvantien findet sich bei Cox und Coulter⁷.
Andere Adjuvantien sowie herkömmliche pharmazeutisch akzeptable Träger, Streckmittel, Puffer oder Verdünnungsmittel können ebenfalls in die prophylaktische oder therapeutische Impfstoffzusammensetzung dieser Erfindung eingearbeitet werden. Die Impfstoffzusammensetzung kann beispielsweise zu enterisch beschichteten Gelatinekapseln, die Natriumbicarbonatpuffer zusammen mit der Helicobacter-Katalasezubereitung und Choleratoxin-Mucosaadjuvans umfassen, formuliert werden.
Die Formulierung derartiger therapeutischer Zusammensetzungen ist Personen mit Erfahrung auf diesem Gebiet bekannt. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Verdünnungsmittel umfassen beliebig alle herkömmlichen Lösemittel, Dispersionsmedien, Füllstoffe, festen Träger, wässrigen Lösungen, Beschichtungen, antibakteriellen und Antipilzmittel, isotonische und eine Absorption verzögernden Mittel und dgl. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist einschlägig bekannt und wird beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA, beschrieben. Mit Ausnahme dessen, dass ein herkömmliches Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird die Verwendung desselben in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Als Alternative zur Abgabe der Helicobacter-Katalasezubereitung in der Form einer therapeutischen oder prophylaktischen oralen Impfstoffzusammensetzung kann die Katalase oder ein immunogenes Fragment derselben unter Verwendung eines Lebendimpfstoffvektors, insbesondere unter Verwendung von lebenden rekombinanten Bakterien, Viren oder anderen lebenden Mitteln, die das zur Expression der Katalase oder des immunogenen Fragments als fremdes Antigen notwendige genetische Material enthalten, an den Wirt abgegeben werden. Insbesondere wurden Bakterien, die den Gastrointestinaltrakt besiedeln, wie Salmonella, Yersinia, Vibrio, Escherichia und BCG, als Impfstoffvektoren entwickelt, und diese und andere Beispiele sind bei Holmgren et al.⁸ und McGhee et al.⁹ diskutiert.
Die Helicobacter-Katalasezubereitung der vorliegenden Erfindung kann als das einzige aktive Immunogen in einer Impfstoffzusammensetzung verabreicht oder durch einen lebenden Vektor exprimiert werden. Alternativ kann die Impfstoffzusammensetzung jedoch andere aktive Immunogene, die andere Helicobacter-Antigene, wie Urease oder das Lipopolysaccharid (LPS) von Helicobacter-Bakterien (siehe die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU95/00077), sowie immunologisch aktive Antigene gegen andere pathogene Arten umfassen oder der lebende Vektor kann diese exprimieren.
Es ist besonders vorteilhaft, Zusammensetzungen zur leichten Verabreichung und Gleichförmigkeit der Dosierung in Einheitsdosisform zu formulieren. Die hier verwendete Einheitsdosisform bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für die zu behandelnden humanen Subjekte geeignet sind; wobei jede Einheit eine vorgegebene Menge des Wirkstoffs, die so berechnet wurde, dass die gewünschte therapeutische Wirkung hervorgerufen wird, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält. Die Spezifikationen für die neuen Einheitsdosisformen der Erfindung werden von (a) den singulären Eigenschaften des Wirkstoffs und der zu erreichenden speziellen therapeutischen Wirkung und (b) den auf dem Gebiet der Compoundierung inhärenten Beschränkungen eines derartigen Wirkstoffs für die spezielle Behandlung diktiert und sind davon direkt abhängig.
Daten, die aufgrund der oben genannten Western-Blots erhal ten wurden, zeigen, dass H. pylori-Katalase durch das Serum von mit einer H. felis-Antigenzubereitung (plus Choleratoxin-Adjuvans) geimpften Mäusen erkannt wird. Es kann gezeigt werden, dass diese Mäuse gegen eine H. felis-Infektion geschützt sind. Diese Daten zeigen die Verwendung von H. pylori-Katalase als protektives Antigen bei einer humanen H. pylori-Infektion, und gereinigte oder rekombinante Katalase kann als Antigenkomponente eines therapeutischen oder prophylaktischen Impfstoffs, entweder allein oder in Kombination mit anderen Antigenen, Trägern, Adjuvantien, Zufuhrvehikeln oder Streckmitteln verwendet werden.
Weitere Details der vorliegenden Erfindung sind lediglich zum Wege der Erläuterung in den folgenden Beispielen angegeben. Es ist jedoch klar, dass diese detaillierte Beschreibung nur zum Zweck von Beispielen für die vorliegende Erfindung angegeben ist und in keinster Weise als Beschränkung der oben angegebenen breiten Beschreibung der Erfindung zu verstehen ist.
BEISPIEL 1
A. VERFAHREN
Ultraschallbehandelte H. pylori-Zellen wurden in einem 12 diskontinuierlichen (d. h. homogenen) SDS-PAGE-Gel unter denaturierenden Bedingungen unter Verwendung eines Mini-Protean-II-Geräts (Bio-Rad) getrennt. Proteine wurden von dem Gel auf eine ProBlott (Applied Biosciences PVDF-Polyvinylidendifluorid)-Membran unter Verwendung von CAPS-Puffer (3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäurepuffer) in einem Mini Transblot System (Bio-Rad) übertragen.
Streifen wurden von den Enden des PVDF entfernt und mit Immunseren von mit H. felis plus Choleratoxin geimpften Mäusen umgesetzt und mit einem HRP-markierten Anti-Maus- Serum spurmarkiert und unter Verwendung von 4-Chlor-1-naphthol gemäß Standard-Western-Blot-Verfahren entwickelt. Der übrige Teil des PVDF wurde mit Coomassieblau (Bio-Rad) angefärbt, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Sechs Proteine, die durch das Immunserum erkannt wurden, wurden ausgewählt und die entsprechenden Coomassie-gefärbten Banden auf dem PVDF wurden zur Sequenzierung sorgfältig ausgeschnitten.
Die sechs ausgeschnittenen Banden von PVDF wurden in kleine Stücke (etwa 0,5 cm lang) geschnitten und in die Reaktionskartusche eines Applied Biosystems Model 476A Protein Sequencer System gegeben. Die gesamte Chemie, HPLC-Trennungen, die quantitative Datenangabe und die Proteinsequenzierungsberichterstattung wird in diesem System automatisch durchgeführt.
B. ERGEBNISSE
Vier Proben ergaben in dem Protein Sequencer System kein Signal. Zwei Proben ergaben klare Aminosäuresequenzdaten: Probe 5 ein Protein von etwa 53 kD (±10%) und Probe 3 ein Protein von etwa 66 kD (±10%). Diese Daten sind im folgenden angegeben. (i) Probe 3
Anmerkung: die ersten drei Zyklen ergaben gleichlautende Ergebnisse.
Die Sequenzdaten von Probe 3 entsprechen eng, jedoch nicht exakt, der früher veröffentlichten N-terminalen Sequenz für das Enzym Urease⁵. Es wurde gezeigt, dass dieses Enzym ein protektives Antigen in Untersuchungen unter Verwendung des H. felis-Mausmodells ist.
(ii) Probe 5

M V N K D V K Q T T A F G T P

Die Sequenzdaten von Probe 5 entsprechen eng, mit einer Unterscheidung, der früher veröffentlichten N-terminalen Sequenz des Enzyms Katalase⁶. Von diesem Enzym wurde bisher nicht gezeigt, dass es ein protektives Antigen ist, doch zeigt die Tatsache, dass das Enzym durch das Immunserum von Mäusen, die mit einer H. felis-Antigenzubereitung zum Schutz gegenüber einer H. felis-Infektion geimpft wurden, erkannt wird, in Kombination mit der Tatsache, dass Mäuse, die mit einer H. pylori-Antigenzubereitung geimpft wurden, gegen eine H. felis-Infektion geschützt sind, dass die H. pylori-Katalase ein protektives Antigen bei einer H. pylori-Infektion bei Menschen ist.
BEISPIEL 2
1. REINIGUNG VON H. PYLORI-KATALASE¹⁰
Etwa 60 Platten (CSA) von H. pylori (klinischer Stamm 921023) wurden 48 h bei 37°C in 10% CO₂ wachsen gelassen. Alle folgenden Stufen bis zum Laden auf die Säule wurden auf Eis durchgeführt. Die H. pylori-Zellen wurden in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,2, geerntet und die Suspension wurde sanft zum Absetzen rotiert und in nicht mehr als 5 ml eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers resuspendiert. Die Suspension wurde dann 5 min mit 6 kHz, 40% Nutzzyklus, ultraschallbehandelt. Anschließend wurde das Ultraschallbehandlungsprodukte 5 min mit 10 000 g geschleudert, der Überstand gewonnen und durch ein 0,22-μm-Filter in einen sterilen Behälter gegeben.
Das Filtrat wurde auf eine K26/100-Gelfiltrationssäule mit Sephacryl S-300 HR geladen und unter Verwendung eines Natriumphosphatpuffers mit einer Durchflussrate von 1,0 ml/min eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen gewonnen (100 Tropfen/Fraktion), und die Katalase enthaltenden wurden durch Testen auf Katalaseaktivität (1 Tropfen der Fraktion wurde in H₂O₂, das 1 : 10 in destilliertem Wasser verdünnt war, gegeben und auf Blasenbildung überprüft) identifiziert. Fraktionen, die die stärkste Katalaseaktivität enthielten, wurden gepoolt und dann 1 : 10 in 0,01 M Natriumphosphat verdünnt (filtriert). Die Fraktionen wurden dann durch eine MEMSEP-1000-cm-Ionenaustauschkapsel laufen gelassen. 100 ml des 0,01 M Natriumphosphatpuffers wurden dann über die Ionenaustauschkapsel zur Entfernung etwaiger überschüssiger Proteine laufen gelassen. 1 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphatpuffer wurde über die Ionenaustauschkapsel zur Elution der Katalase laufen gelassen. Katalasepositive Fraktionen wurden durch ihre starke gelbe Farbe identifiziert und durch Testen auf eine Blasenbildungsreaktion in H₂O₂ festgestellt.
Die katalasepositiven Fraktionen wurden bei 4°C und vor Licht geschützt aufbewahrt. Jede Fraktion wurde auf die Proteinkonzentration unter Verwendung des Bio-Rad DC Protein Assay getestet und zur Immunisierung von Mäusen ausgewählt, wenn sie über 1,5 mg/ml Protein enthielt. Vor der Immunisierung von Mäusen wurde die gereinigte Katalase auf Verunreinigungen unter Verwendung von 12% SDS-PAGE überprüft. Proteine wurden durch Einfärben mit Coomassieblau sichtbar gemacht, was zeigte, dass die Katalasezubereitung mindestens 95% rein war. Die Bildanalyse zeigte, dass das Molekulargewicht der Katalase 52–53 kDa betrug. Die gereinigte Katalase wurde auch durch einen monoklonalen Antikörper gegen Katalase stark erkannt.
2. IMMUNISIERUNG MIT H. PYLORI-KATALASE
Ausreichende gereinigte Katalase zur Immunisierung von 10 Mäusen wurde erhalten und gepoolt. Die Mäuse erhielten 0,2 mg gereinigte Katalase + 10 μg Choleratoxin (CT) viermal an den Tagen 0, 7, 14 und 21. Kontrollgruppen erhielten nur Choleratoxin oder nur PBS-Puffer. Die Dosisgröße betrug 150 μl für alle Gruppen. Am Tag jeder Immunisierungsdosisgabe wurde die Katalase auf Aktivität unter Verwendung von ₂ und auf etwaige Zeichen eines Abbaus unter Verwendung von SDS-PAGE und Coomassieblau-Färbung überprüft. Keine Zeichen einer abnehmenden Aktivität oder eines Abbaus wurden während des Immunisierungsablaufs beobachtet. Drei Wochen nach der letzten Immunisierungsdosisgabe wurden alle Gruppen zweimal mit ~10⁸ H. felis infiziert. Drei Wochen später wurden die Mäuse euthanasiert und Proben (Seren, Speichel, Galle und Magen – eine Hälfte zur Histologie und das halbe Antrum für den direkten Ureasetest) gewonnen.
Versuchsdiagramm
3. ERGEBNISSE Urease
Western Blotting
Western-Blots von Seren von Mäusen zeigten ein starkes Erkennen von H. pylori-Katalse durch die immunisierten Mäuse, während Mäuse von den anderen Gruppen ein schwaches oder nicht vorhandenes Erkennen zeigten.
LITERATURSTELLEN

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Claims

Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion bei einem Säugerwirt, die eine immunologisch wirksame Menge einer Antigenzubereitung, die eine zumindest teilweise gereinigte Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, die ferner ein Adjuvans umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Adjuvans ein Mucosaadjuvans ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die die Katalase von H. pylori oder H. felis oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ferner mindestens ein zusätzliches aktives Immunogen umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das zusätzliche Immunogen bzw. die zusätzlichen Immunogene mindestens ein weiteres Helicobacter-Antigen umfassen.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das weitere Helicobacter-Antigen aus Helicobacter-Urease und einem Helicobacter-Lipopolysaccharid ausgewählt ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die zur oralen Verabreichung angepasst ist.
Verwendung einer Antigenzubereitung, die eine zumindest teilweise gereinigte Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion bei einem Säugerwirt.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Impfstoffzusammensetzung ferner ein Adjuvans umfasst.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Adjuvans ein Mucosaadjuvans ist.
Zubereitung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion bei einem Säugerwirt, der einen Lebendimpfstoffvektor, der die Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben exprimiert, umfasst.
Zubereitung nach Anspruch 12, wobei der Lebendimpfstoffvektor ein Bakterium ist, das den Gastrointestinaltrakt des Säugerwirts besiedelt.
Zubereitung nach Anspruch 13, wobei das Bakterium ein Salmonella-, Yersinia-, Vibrio-, Escherichia- oder BCG-Bakterium ist.
Verwendung eines Lebendimpfstoffvektors, der die Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben exprimiert, zur Herstellung einer Zubereitung zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion bei einem Säugerwirt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Lebendimpfstoffvektor ein Bakterium ist, das den Gastrointestinaltrakt des Säugerwirts besiedelt.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Bakterium ein Salmonella-, Yersinia-, Vibrio-, Escherichia- oder BCG-Bakterium ist.
Antikörper, der für eine Antigenzubereitung, die die Katalase von Helicobacter-Bakterien oder ein immunogenes Fragment derselben umfasst, spezifisch ist.
Antikörper nach Anspruch 18, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion bei einem Säugerwirt, die einen Antikörper nach Anspruch 18 oder 19 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder Anspruch 19 zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Behandlung oder Prävention einer Helicobacter-Infektion bei einem Säugerwirt.