-
Die
vorliegende Erfindung betrifft das Hervorrufen, in einem Säuger, einer
Immunantwort gegen ein Antigen oder ein Gemisch von Antigenen durch
Verabreichen des Antigens oder Gemischs von Antigenen an eine Schleimhautoberfläche des
Säugers.
-
Genauer
gesagt betrifft die vorliegende Erfindung das Impfen eines Säugers, zum
Beispiel eines Menschen, gegen Tetanus- und B. pertussis-Infektionen.
-
Es
stellt eine seit langem gängige
Praxis der Ärzte
dar, Säuglinge
und Kinder gegen eine Vielfalt verbreiteter Krankheiten mit einem
Impfstoffgemisch, das auf eine Vielfalt von Krankheiten gerichtet
ist, zu immunisieren. Beispielsweise stehen vielkomponentige Impfstoffzusammensetzungen,
die sich gegen Diphtherie, Tetanus und Keuchhusten richten, seit
einer beträchtlichen
Anzahl von Jahren zur Verfügung.
Solche Impfstoffe sind bisher durch Injektion verabreicht worden.
Die Vorteile der vielkomponentigen Impfstoffe sind leicht erkennbar,
da der Patient (gewöhnlich
ein Säugling
oder Kind) einer viel kleineren Anzahl an potenziell peinigenden
Injektionen ausgesetzt wird, als ansonsten der Fall wäre.
-
Der
Großteil
der Infektionskrankheiten wird durch Kontakt mit einer Schleimhautoberfläche ausgelöst. Das
infektiöse
Agens kann an oder innerhalb der Schleimhautmembranen während des
Verlaufs der Infektion verbleiben oder kann in den Körper eindringen
und sich an anderen Stellen lokalisieren. Die Bedeutung der Schleimhautmembranen
in der ersten Abwehrlinie gegen Infektionskrankheiten lässt sich
aus der Tatsache ableiten, dass 90 % der Lymphozyten des Körpers unter
solchen Oberflächen
sitzen. Das Priming von Schleimhautoberflächen durch Immunisierung, so
dass sie stark reagieren und wirksam pathogene Organismen kontrollieren,
auf die sie treffen, wäre
von Vorteil. Ungünstigerweise
sind die herkömmlichen
Im munisierungsschemata in der Hervorrufung von Schleimhautreaktionen
ineffektiv. Die systemischen und lokalen (mukosalen) Immunsysteme
scheinen kompartimentalisiert zu sein und treffen nicht aufeinander
auf; das heißt,
dass eine parenterale Immunisierung mit nicht-lebenden Impfstoffen
mukosale Immunantworten schwach, wenn überhaupt, stimuliert. Eine
mukosale Immunisierung (oral oder intranasal) kann Serum-Antikörper wachrufen,
doch ist dies gewöhnlich
weniger wirksam als die parenterale Immunisierung. Die Immunozyten
der verschiedenen Schleimhautmembranen bilden ein riesiges interkommunizierendes
Netzwerk, bezeichnet als das allgemeine Schleimhaut-Immunsystem,
so dass die topische Immunisierung einer Oberfläche (z.B. des Magendarmtrakts) zu
einer Immunantwort an jener Oberfläche und ebenso an entfernten
Oberflächen
wie dem Respirationstrakt, führen
kann.
-
EP-A-0209281
schlägt
vor, dass Impfstoffzusammensetzungen, einschließlich eines Tetanustoxin-Proteins
oder -Peptids, oral verabreicht werden können, doch beziehen sich die
Beispiele in diesem Dokument lediglich auf die Verabreichung durch
Injektion.
-
Die
internationale Anmeldung WO-A-9015871 beschreibt einen Vorgang für die Produktion
des C-Fragments von Tetanustoxin und beschreibt außerdem,
dass eine Impfstoffzusammensetzung, die das C-Fragment enthält, unter
anderem oral oder parenteral verabreicht werden kann, doch ist lediglich
die Verabreichung durch Injektion spezifisch veranschaulicht.
-
S.N.
Chatfield et al., Vaccine Vol. 10, Ausgabe 1, 1992, S. 53 – 60, beschreiben
die Konstruktion und Verwendung als einem Impfstoff einer mutierten
Form von Salmonella, die in ihrem Chromosom ein Gen für das nicht-toxische
50 kD-Fragment von Tetanustoxin enthält. Obschon die orale Verabreichung
des Impfstoffs erwähnt
ist, sind auch hier keine experimentellen Daten bereitgestellt.
-
Fairweather
et al., Infection and Immunity, Mai 1990, S. 1323 – 1326,
beschreiben die orale Verabreichung eines Salmonella-Stamms, der
ein Gen für
das C-Fragment von Tetanustoxin enthält. Ebenfalls beschrieben ist
die Verabreichung des C-Fragments von Tetanustoxin auf dem subkutanen
Wege, doch wird nicht Bezug genom men auf die orale Verabreichung
des C-Fragments als solcher, oder auf die Verabreichung des C-Fragments
auf dem intranasalen Wege.
-
EP-A-462534
beschreibt azelluläre
Anti-Pertussis-Impfstoffe, die eine Doppelmutante von Pertussistoxin,
filamentöses
Hämagglutinin
und 69 kD-Protein, einzeln oder in Kombination mit Diphtherie- und
Tetanusanatoxin, umfassen. Allerdings wird in diesem Dokument nicht
Bezug genommen auf die orale Verabreichung der Impfstoffzusammensetzungen,
noch findet sich irgendeine Bezugnahme auf die intranasale Verabreichung.
-
WO-A-9013313
beschreibt eine synergistische Kombination von B. pertussis-FHA- und 69 kD-Antigen und
schlägt
vor, dass solche Impfstoffe oral verabreicht werden können, doch
finden sich in diesem Dokument keine Beispiele für die orale Verabreichung dieser
Antigene. Darüber
hinaus findet sich keine Beschreibung einer intranasalen Verabreichung.
-
JP-A-63002932
beschreibt generisch die Verabreichung von Peptiden auf dem intranasalen
Wege in Kombination mit einem spezifizierten Absorptionsverstärker.
-
Manclark
und Shahin (US-Patentanmeldung Nummer 07/532327, eingereicht am
05.06.90 – erhältlich durch
das US Department of Commerce, National Technical Information Service,
Springfield, VA 22161, USA) haben die intranasale und intraduodenale
Verabreichung des filamentösen
Hämagglutinins
(FHA), wie erhalten aus Bordetella pertussis, beschrieben und haben
veranschaulicht, dass FHA ein wirksames Schleimhaut-Immunogen ist.
Manclark und Shahin spekulierten in USSN 07/532.327, dass das 69
kD-Außenmembranprotein
(P.69) von B. pertussis ebenfalls ein wirksames Schleimhaut-Immunogen
sei, legten aber keine experimentellen Daten vor, um zu zeigen,
dass dies der Fall war.
-
Die
Tatsache, dass sehr wenige mukosale Impfstoffe kommerziell erhältlich sind,
weist darauf hin, dass es Probleme mit der Entwicklung solcher Impfstoffe
gibt. Viele nicht-lebende lösliche
Antigene, insbesondere solche, die herkömmlicherweise von Immunologen
verwendet werden, wie etwa Ovalbumin (OVA) und Napfschnecken- Hämocyanin (KLH), sind schwache
Schleimhaut-Immunogene. Große
Dosen solcher Antigene sind erforderlich, um irgendwelche Reaktionen
hervorzurufen, doch können
große
Dosen auch eine Toleranz im Individuum gegenüber einer späteren parenteralen
Exposition an ein Antigen bewirken, ein Zustand, der als orale Toleranz
bekannt ist. Einige mikrobielle Komponenten, wie etwa das Choleratoxin
(CT) oder hitzelabile E. coli-Toxin (LT) oder die nicht-toxischen
Bindungsabschnitte dieser Toxine (CT-B und LT-B) sind als potente
Schleimhaut-Immunogene befunden worden, die starke sekretorische
und zirkulierende Antikörper hervorrufen,
doch ist der Grund, warum solche Moleküle gute Schleimhaut-Immunogene
sind, bisher noch nicht vollständig
aufgeklärt
worden. Eine Eigenschaft, die wichtig sein kann, ist die Fähigkeit
dieser Moleküle, an
Schleimhaut-Epithelzellen über
bestimmte Oberflächenrezeptoren
zu binden, obwohl in Untersuchungen von anderen festgestellt worden
ist, dass nicht notwendigerweise eine Korrelation zwischen der Bindungsfähigkeit
eines Antigens an eukaryotische Zellen und seiner Schleimhaut-Immunogenität besteht.
-
Daher
besteht, soweit uns bewusst ist, derzeit keine Möglichkeit der Vorhersage mit
irgendeiner Gewissheit, ob ein gegebenes Antigen eine gute Schleimhaut-Immunogenität besitzen
wird.
-
Wir
haben nun festgestellt, dass bestimmte Moleküle ausgezeichnete Schleimhaut-Immunogene darstellen
und dass solche Komponenten in der Entwicklung eines mukosal (intranasal
oder oral) verabreichten Impfstoffs gegen die Krankheiten Keuchhusten
und Tetanus Verwendung finden können.
Insbesondere haben wir festgestellt, dass das P.69-Außenmembranprotein
(P.69 – auch
bekannt als Pertactin) von B. pertussis und der nicht-toxische immunogene
50 kD-Abschnitt von Tetanustoxin (C-Fragment) von C. tetanii bei
intranasaler Verabreichung hochgradig immunogen sind. Das C-Fragment
und P.69 wurden mittels rekombinanter DNA-Technologie erzeugt. Rekombinantes C-Fragment
und P.69, wie aus E. coli und Hefe produziert, sind als immunogen
und protektiv in Mäusen
nachgewiesen worden, siehe M. Roberts et al., Recombinant P.69/pertactin:
immunogenicity and protection of mice against Bordetella pertussis
infection; Vaccine 10, 43 (1992); und siehe auch N.F. Fairweather
et al., Infection and Immunity, 55, 2541 (1987).
-
In
einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines azellulären, mukosal
immunogen aktiven Antigens bereit, umfassend das 50 kD C-Fragment
von Tetanustoxin, ein immunogenes Fragment davon oder ein Derivat
davon, gebildet durch Aminosäure-Deletion,
-Substitution oder -Insertion, für
die Herstellung einer azellulären
Impfstoffzusammensetzung zur Verabreichung an eine Schleimhautoberfläche, um
eine Immunantwort in der Schleimhautoberfläche gegen eine Tetanusinfektion
hervorzurufen.
-
In
einer speziellen Ausführungsform
der Erfindung wird die Verwendung eines Gemischs von Antigenen für die Herstellung
einer Impfstoffzusammensetzung zur Verabreichung an eine Schleimhautoberfläche bereitgestellt,
um eine Immunantwort in der Schleimhautoberfläche gegen jedes der besagten
Antigene hervorzurufen, wobei das Gemisch von Antigenen umfasst:
- (a) eine mukosal immunogen aktive Substanz,
umfassend das 50 kD C-Fragment von Tetanustoxin, ein immunogenes
Fragment davon oder ein Derivat davon, gebildet durch Aminosäure-Deletion,
-Substitution oder -Insertion; und
- (b) eine mukosal immunogen aktive Substanz, umfassend das P.69-Außenmembranprotein
von B. pertussis; ein immunogenes Fragment davon oder ein Derivat
davon, gebildet durch Aminosäure-Deletion,
-Substitution oder -Insertion.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die Verwendung eines Gemischs von Antigenen bereitgestellt,
wie im vorangegangenen definiert, wobei aber das Gemisch über (a)
und (b) hinaus umfasst:
- (c) eine mukosal immunogen
aktive Substanz, umfassend filamentöses B. pertussis-Hämagglutinin, ein immunogenes
Fragment davon oder ein Derivat davon, gebildet durch Aminosäure-Deletion,
-Substitution oder -Insertion.
-
Die
Zusammensetzungen für
die Verabreichung an die Schleimhaut können zum Beispiel für die Verabreichung
an eine oder mehrere von oraler, gastro-intestinaler und respiratorischer
(z.B. nasaler und bronchialer) Schleimhaut formuliert sein.
-
Wo
die Zusammensetzung für
die Verabreichung an die respiratorische (z.B. nasale oder bronchiale) Schleimhaut
vorgesehen ist, wird sie typischerweise als eine wässrige Lösung zur
Verabreichung als ein Aerosol oder Nasentropfen, oder als ein Trockenpulver,
z.B. für
die Inhalation, formuliert.
-
Zusammensetzungen
für die
Verabreichung als Nasentropfen können
ein oder mehrere Exzipienten von der Art enthalten, die üblicherweise
in solchen Zusammensetzungen enthalten sind, zum Beispiel Konservierungsstoffe,
Viskositäts-einstellende
Agenzien, Tonizitäts-einstellende
Agenzien, Puffermittel und ähnliches.
-
Die
Antigen-Präparate
können
auch die Form von Zusammensetzungen annehmen, die zur Verabreichung
des Gemischs von Antigenen an die Schleimhautoberflächen im
Magendarmtrakt vorgesehen sind. Es ist bevorzugt, dass solche Zusammensetzungen
mit Mitteln zur Vermeidung des Abbaus der Antigene durch die Magensäfte versehen
werden. Zum Beispiel können
die Zusammensetzungen die Form von Kapseln, z.B. Mikrokapseln, annehmen,
in denen die Antigene innerhalb einer schützenden Matrix oder Beschichtung
rückgehalten
werden, die aus einem geeigneten schützenden Polymer, wie einem
Poly(glykolid), Poly(lactid-coglykolid), Polyacrylstärke, oder
pH-abhängigen
Beschichtungen, wie den Polyacrylaten oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat,
hergestellt sind.
-
Die
Antigene können
die Form des C-Fragments von Tetanustoxin als solchem, des P.69-Proteins
als solchem oder des B. pertussis-Hämagglutinins als solchem aufweisen.
Alternativ können
sie die Form eines größeren Moleküls aufweisen,
das eines oder mehrere der zuvor genannten Antigene, immunogen aktiven Fragmente
davon, oder Derivate, die durch Aminosäure-Deletion, -Substitution
und -Insertion gebildet sind, enthält, vorausgesetzt, dass das
größere Molekül immunogen
aktiv ist, wenn es direkt an die Schleimhaut verabreicht wird.
-
Das
Antigen oder Gemisch von Antigenen wird typischerweise so ausgewählt, dass
es für
seinen Empfänger
bei den zur Hervorrufung einer Immunantwort verwendeten Konzentrationen
nicht-toxisch ist.
-
Bei
einer Ausführungsform
können
zwei weitere der Antigene, die das Gemisch bilden, in einem einzigen
Molekül
vorhanden sein. Solch ein Molekül
kann mittels rekombinanter Methoden hergestellt werden, indem ein
DNA-Konstrukt präpariert
wird, das Gene enthält,
die für
zwei oder mehr der Antigene codieren, und dieses in einem geeigneten
Wirt gemäß bekannter
Methoden exprimiert wird.
-
Die
einzelnen antigenischen Substanzen können jeweils auch als Träger für ein oder
mehrere weitere Antigene dienen. Zum Beispiel kann ein Antigen,
wie etwa das P.69-Außenmembranprotein
oder C-Fragment, an ein anderes Antigen gekoppelt werden, wobei
zu Beispielen solcher "anderer" Antigene die Haemophilus-Gruppe
B- und Meningokokken-Polysaccharid-Antigene
zählen.
-
Um
die Schleimhaut-Immunogenität
des Gemischs der Antigene oder jeglicher antigenischer Komponente
davon oder entsprechender immunogener Fragmente davon zu erhöhen, können diese
in geeignete Träger
aufgenommen werden, zum Beispiel Virosome. Die Immunogenität kann auch
durch Aufnahme entsprechender mukosaler Adjuvantien, wie etwa des
Choleratoxins oder hitzelabilen E. coli-Toxins, genetisch detoxifizierter
Varianten davon oder ihrer Bindungs-(B)-Untereinheiten, in den Impfstoff
erhöht
werden.
-
Die
Impfstoffzusammensetzung kann wahlweise einen weiteren mukosal immunogen
aktiven Abschnitt des Tetanustoxin-Moleküls enthalten. Außerdem kann
das Impfstoffgemisch ein oder mehrere weitere mukosal immunogen
aktive Antigene enthalten.
-
Bei
einer Ausführungsform
kann die Impfstoffzusammensetzung, über die nichttoxischen immunogenen
Formen des Tetanustoxins und der Pertussis-Antigene hinaus, nicht-toxische
immunogene Formen des Diphtherietoxins und immunogene Formen des
Haemophilus influenzae-Gruppe B-Polysaccharids (HiB) enthalten,
wobei ein mukosaler Diphtherie-Tetanus-Pertussis-(DTP)-Impfstoff
oder DTHiB-Impfstoff
bereitgestellt wird.
-
Das
P.69-Außenmembranprotein
von B. pertussis stellt ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa
61 kD dar; siehe A. J. Makoff et al., "Protective surface antigen P.69 of Bordetella
pertussis: ist characteristics and very high level expression in
Escherichia coli",
Bio-Technology, 8, 1030 (1990).
-
Es
kann präpariert
und isoliert werden gemäß dem Verfahren,
beschrieben bei P. Novotny et al.: The Journal of Infectious Diseases,
164, 114 (1991), oder kann ein rekombinantes Material sein, das
aus E. coli mittels des Verfahrens präpariert ist, das im oben genannten
Artikel von A.J. Makoff et al. wiedergegeben ist. Es kann an eukaryotische
Zellen binden.
-
Gereinigtes
filamentöses
Hämagluttinin
von B. pertussis enthält
gewöhnlich
Polypeptide von unterschiedlichem Molekulargewicht im Bereich von
98–220
kD, und kann isoliert und ausgereinigt werden aus Zellkultur-Überständen von
B. gertussis, wie zum Beispiel beschrieben in dem oben genannten
Artikel von P. Novotny et al. Das filamentöse Hämagglutinin ist zur Bindung
an eukaryotische Zellen und zur Bewirkung der Hämagglutinierung von Schafs-Erythrozyten
fähig.
-
Das
C-Fragment von Tetanustoxin stellt ein Peptid mit einem Molekulargewicht
von etwa 50 kD dar, das isoliert und ausgereinigt werden kann aus
E. coli mittels des Verfahrens, beschrieben bei A.J.Makoff et al., Bio/Technology
7, 1043 (1989). Das C-Fragment ist durch seine Bindungsfähigkeit
an eukaryotische Zellen charakterisiert, die das Trisialogangliosid
GT16 besitzen, und durch seine Fähigkeit,
in Mäusen
eine Schutz gegen eine lethale Provokation mit Tetanustoxin hervorzurufen.
-
Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antigen-Moleküle können durch
Isolierung und Ausreinigung aus den Organismen präpariert
werden, in denen sie natürlicherweise
vorkommen, oder sie können mittels
rekombinanter Techniken präpariert
und in einem geeigneten Wirt wie E. coli in bekannter Weise exprimiert
werden. Wenn mittels einer rekombinanten Methode oder durch Synthese
präpariert,
so können
ein oder mehrere Insertionen, Deletionen, Inversionen oder Substitutionen
der Aminosäuren,
aus denen das Peptid besteht, vorgenommen werden.
-
Jedes
der zuvor genannten Antigene wird vorzugsweise in im Wesentlichen
reinem Zustand verwendet. Die Verabreichungsmenge des Gemischs der
Antigene wird zum Teil von der Reinheit der einzelnen Antigene abhängen. Somit
würde bei
einer im Wesentlichen reinen Form des P.69-Außenmembranproteins eine Dosis
im Bereich von etwa 1–100
Mikrogramm/Dosis typischerweise an einen Menschen verabreicht werden, wobei
die tatsächliche
Menge von der Immunogenität
des Präparats
in Menschen bei Verabreichung an Schleimhautoberflächen abhängt.
-
Für eine im
Wesentlichen reine Form des filamentösen Hämagglutinins von B. pertussis,
und des 50 kD C-Fragments von Tetanustoxin, würde ein typischer Dosierungsbereich
in der oben bezüglich
des P.69-Proteins angegebenen Größenordnung
liegen. Bei einem typischen Immunisierungsschema unter Verwendung der
Antigen-Präparationen
der vorliegenden Erfindung kann der Impfstoff in mehreren Dosen
(z.B. 1–4)
verabreicht werden, wobei jede Dosis 1–100 μg jedes Antigens enthält. Das
Immunisierungsschema kann eine Immunisierung rein auf dem mukosalen
Wege oder durch eine Kombination von mukosaler und parenteraler
Immunisierung umfassen. Die Dosierung wird generell von der Immunogenität der verschiedenen
Antigene abhängen,
wenn sie für
die Atem- oder Magendarmwege des Menschen vorgesehen ist.
-
Die
Erfindung wird nun in größerer Ausführlichkeit
unter Bezugnahme auf die in den folgenden Beispielen beschriebenen
spezifischen Ausführungsformen
veranschaulicht werden.
-
Die
Beispiele sollen rein zur Veranschaulichung der Erfindung dienen
und sind in keinster Weise als Beschränkung ihres Rahmens zu verstehen.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1 veranschaulicht
das Wachstum von B. pertussis in den Lungen intranasal immunisierter
Mäuse. Die
Mäuse wurden
intranasal mit zwei Dosen des Antigens am Tag 0 und Tag 29 immunisiert
und dann 14 Tage später
(Tag 43) mit B. pertussis Aerosol-provoziert. Die Zählungen
stellen den Mittelwerte von 4 Lungenpaaren ± SEM dar.
-
2 veranschaulicht
die lokale Immunantwort in den Lungen von Mäusen als Reaktion auf die intranasale
Immunisierung und Provokation. Lymphozyten wurden aus den Lungen
von Gruppen von Mäusen
nach der intranasalen Immunisierung und der Aerosol-Provokation
ausgereinigt, und die Zahl der Zellen, die Antikörper gegen das immunisierende
Antigen sekretierten, wurde mittels des ELISPOT-Assays bestimmt.
Die Zählungen
repräsentieren
die aus 4 Mäusen
gepoolte Antwort der Lymphozyten.
-
3 veranschaulicht
die primäre
Antikörper-Antwort
auf Pertussis-Antigene in den Lungen von Mäusen nach der Aerosol-Provokation.
Lymphozyten aus Lungen, die 10 Tage nach der Aerosol-Provokation
entnommen wurden, wurden auf die Antikörperproduktion gegen P.69 oder
FHA analysiert. Die Zählungen
repräsentieren
die aus Gruppen von 4 Mäusen
gepoolte Antwort der Lymphozyten.
-
BEISPIEL 1 PERTUSSIS-KOMPONENTEN
-
Mäuse wurden
mit 12 μg
entweder von P.69, FHA oder OVA am Tag 1 und Tag 29 immunisiert.
Die Mäuse
wurden dann mit Bordetella pertussis am Tag 43 (14. Tag nach Auffrischung)
Aerosol-provoziert. Die Lungen wurden aus Gruppen von Mäusen nach
bestimmten Zeiträumen
nach der Provokation entnommen, homogenisiert und Zählungen
der lebensfähigen
Bakterien vorgenommen, um das Wachstum von B. pertussis im Respirationstrakt
zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Die Bakterien nahmen in den Lungen der Kontrollmäuse (OVA) während der ersten sieben Tage
zahlenmäßig zu.
Im Gegensatz dazu nahmen sowohl bei den P.69- als auch FHA-immunisierten
Tieren die Bakterienzahlen während
dieses Zeitraums ab, und am Tag 7-Zeitpunkt betrugen die Mengen
der Bakterien in den Lungen der immunisierten Mäuse lediglich 1–4 % derer
in der Kontrollgruppe. Bis zum Tag 14 waren die Bakterien aus den
Lungen der immunisierten Mäuse
nahezu verschwunden, waren aber nach wie vor in den OVA-immunisierten
Mäusen
in großen
Anzahlen vorhanden.
-
Die
lokale Immunantwort in den Lungen der Mäuse wurde durch Auszählen der
Zellen, die Antikörper gegen
FHA, P.69 oder OVA sekretierten, unter den Lymphozyten, die aus
den Lungen der Mäuse
isoliert waren, mittels "ELISPOT" analysiert. Es lagen
geringe Anzahlen an Antikörper-sekretierenden
Zellen (ASC), die Antikörper
gegen die immunisierenden Antigene produzierten, nach der zweiten
Immunisierung vor (2). Nach der Aerosol-Provokation
nahmen die ASC in den Lungen von Mäusen, die mit FHA oder P.69
immunisiert waren, jedoch nicht mit OVA, um mehrere Größenordnungen
zu (2). Zellen, die Antikörper der IgG-, IgA- und IgM-Isotypen sekretierten,
wurden detektiert.
-
Der
Anstieg der ASC nach der Aerosol-Provokation kann für eine Primärantwort
auf die Antigene, die in den provozierten Organismen vorhanden waren,
oder für
die Verstärkung
(Booster-Impfung) der Antwort in immunisierten Mäusen stehen. Um zu sehen, welche
dieser Optionen korrekt war, wurden Lungen-Lymphozyten gegen Antigene
ge-screent, denen die Mäuse
bis zur Provokation nicht ausgesetzt waren (FHA-immunisierte Mäuse wurden
gegen P.69 getestet etc.). Wie aus 3 erkennbar,
waren die Antworten bei allen Mäusen ähnlich,
und Vergleiche mit demselben Zeitpunkt (d23) in 1 zeigen,
dass vorherige intranasale Immunisierungen die Antwort um ein Mehrfaches
verstärken.
-
Die
Serum-Reaktion wurde unter Verwendung von ELISA untersucht, und
die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt: Tabelle
1: Serum-Anti-Pertussis-Antikörper-Reaktion
von intranasal immunisierten Mäusen ANTIKÖRPERTITER
a Tage
nach Immunisierung
- a = bestimmt mittels
ELISA
- b = Mäuse, Aerosol-provoziert d 14
-
Es
waren keine detektierbaren Antikörper
gegen FHA oder P.69 vor der Aerosol-Provokation vorhanden (d8). Es waren
keine Anti-OVA-Antikörper
gegen Serum von OVA-immunisierten Mäusen vorhanden (Daten nicht
gezeigt). Nach der Provokation (> d14)
zeigte die Anti-FHA-Antwort einen großen Anstieg bei den FHA-immunisierten
Mäusen.
Dieser Anstieg war spezifisch, da die Anti-P.69-Antwort bei diesen
Mäusen
nicht proportional anstieg. Es lag eine kleine Zunahme im Anti-P.69-Titer
bei P.69-immunisierten Mäusen
im Vergleich zu FHA- oder P.69-immunisierten Mäusen vor. Dies zeigte, dass
eine zuvorige respiratorische Exposition an FHA und, möglicherweise,
P.69 die Mäuse
primen kann, um eine amnestische Serumreaktion auf den Kontakt mit
dem Pathogen hin zu erbringen.
-
BEISPIEL 2 TETANUS-KOMPONENTE
-
Gruppen
von 10 Mäusen
wurden intranasal mit ein oder zwei Dosen von 20 μg des C-Fragments
oder OVA als einer Kontrolle immunisiert. 28 Tage nach der letzten
Immunisierung wurden die Mäuse
mit 500 LD50 des Tetanustoxsins provoziert
und ihre Überlebensrate
für 4 Tage überwacht,
wobei die Ergebnisse in nachstehender Tabelle 2 gezeigt sind. Die Überlebensrate
war bei Mäusen
erhöht,
die ein oder zwei Dosen des C-Fragments erhielten, im Vergleich
zu den Kontrollmäusen.
Alle Kon trollmäuse
waren am Tag nach der Provokation tot. Der Schutz war durch Verabreichung
von 2 Dosen des C-Fragments stark erhöht, da bis zum Tag 4 nach der
Provokation 80 % der Mäuse
in der Gruppe mit 2 Dosen nach wie vor am Leben waren, im Vergleich zu
10 % bei den Mäusen,
die eine einzige Dosis erhalten hatten.
-
Tabelle
2. Schutz der Mäuse
gegen eine Tetanustoxin-Provokation durch I/N-Immunisierung mit C-Fragment
-
Serumreaktion
-
Die
Mäuse,
die 2 Dosen des C-Fragments erhalten hatten, wiesen einen mittleren
Serum-Anti-C-Fragment-Titer von größer als 200 vor der Provokation
auf.
-
MATERIALIEN UND METHODEN
-
ANTIGENE
-
P.69
wurde intrazellulär
in E. coli synthetisiert und gereinigt, wie beschrieben bei A.J.
Makoff et al., Bio/Technology 8, 1030 (1990). FHA wurde von SKB
unter einer Übereinkunft über den
Austausch von Reagenzien bereitgestellt. C-Fragment wurde aus E.
coli wie bei A.J.Makoff et al., Bio/Technology 7, 1043 (1989) produziert.
Antigene wurden in PBS unmittelbar vor der Immunisierung verdünnt.
-
IMMUNISIERUNG
-
Ausgewachsene
(6–8 Wochen)
Balb/C-Mäuse
wurden mit Methathan anästhesiert.
30 μl der
Antigenlösung
wurden in die äußeren Nasenlöcher der
Mäuse (10 μl/Nasenlöcher) eingebracht,
als sie das Bewusstsein wiedererlangten. Das Antigen wurde in den
Atemweg durch Inhalation eingebracht.
-
AEROSOL-PROVOKATION MIT
B. PERTUSSIS
-
Die
Mäuse wurden
in Käfige
auf einem rotierenden Karussell in einer Kunststoff-Sichtkammer eingebracht,
wie beschrieben bei P. Novotny et al., Development for Biological
Standards, 61, 27 (1985). Eine Bakteriensuspension in PBS wurde
aus 2 bis 3 Tage alten Kulturen von B. gertussis BBC26, gezüchtet auf
CW-Blutagarplatten, präpariert.
Die Mäuse
wurden einem Aerosol (erzeugt aus der Bakteriensuspension) von 2 × 109 koloniebildenden Einheiten (CFU) in PBS
mittels eines Turret-Mundstück-Röhrchens,
betrieben mittels eines System 22 CR60 High-Glow-Kompressors (Medic-Aid, Pagham, West
Sussex, UK), der einen sehr feinen Nebel bei einem dynamischen Fluss
von 8,5 Litern/Min. ergab, ausgesetzt. Der erzeugte Nebel wurde
durch eine Kammer mittels einer Vakuumpumpe bei einem Durchgang
von ca. 12 l Luft pro Nebelgemisch pro Min. gezogen, was eine relative
Feuchtigkeit von 70 % in der Kammer aufrecht erhielt. Die Exposition
an Aerosol dauerte 30 Min., ein Zeitraum von 10 Min. ermöglichte
dann das Ablüften
der Kammer.
-
Der
Verlauf der Infektion wurde unter Durchführung von Zählungen der lebensfähigen Bakterien
in den Lungen ausgewertet. Gruppen von vier Mäusen wurden in Intervallen
entnommen und durch Halswirbeldislokation getötet, und ihre Lungen wurden
aseptisch entfernt und in einem Potter-Elvehjem-Homogenisator mit
2 ml PBS homogenisiert. Verdünnungen
des Homogenats wurden auf Cohen-Wheeler (CW) Blutagar-platten getupft,
und die Anzahl der CFU wurde für
jeden Satz von Lungen bestimmt.
-
TETANUS-PROVOKATION
-
Mäuse wurden
mit 500 LD50 des Tetanustoxins subkutan
provoziert und regelmäßig für 5 Tage
beobachtet.
-
ELISA
-
Serum-Anti-P.69-,
-Anti-FHA- und -Anti-C-Fragment-Antikörper wurden unter Anwendung
eines Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen. Antigen
(50 μl;
1 g/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2) wurde auf 96-Well-Mikrotiterplatten
(EIA ,Costar' NBL,
Northumbria, UK) durch Inkubation bei 4°C über Nacht absorbiert. Die Wells
wurden abgesaut und dreimal mit PBS gewaschen, das 0,05 % (v/v) Tween
20 (PBS-T; Sigma) enthielt, und dann mit 3 % (w/v) Rinderserumalbumin
(BSA; Sigma) in PBS blockiert. Nach dem Waschen wurden 50 μl des in
PBS-T-0,1 % BSA entsprechend verdünnten Testserums pro Well zugegeben.
Nach der Inkubation bei 37°C
für 2 Std.
wurden die Wells gewaschen und bei Raumtemperatur mit 50 μl Substrat
(0,04 % O-Phenylendiaminhydrochlorid; Sigma), gelöst in Phosphatcitrat-Puffer
(pH 5,0 [24 mM Citrat, 64 mM Dinatriumhydrogenphosphat], enthaltend
40 μl Wasserstoffperoxid)
inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl an 1 M
Schwefelsäure
beendet. Die Platten wurden in einem Titertek Multiscan MCC ELISA-Lesegerät bei 492
nm ausgelesen.
-
Der
Titer wurde als der Kehrwert der höchsten Verdünnung des Testserums, die eine
Absorbanz-Auslesung vom Zweifachen dessen des ähnlich verdünnten Serums vor dem Blutenlassen
ergab, ausgedrückt. Absorbanzwerte
unter 0,1 wurden verworfen.
-
ELISPOT-Assay für spezifische
Antikörper-sekretierende
Zellen (ASC) in Mäuselungen.
-
Die
lokale Antikörper-Produktion
in der Mäuselunge
wurde unter Anwendung der ELISPOT-Technik bestimmt. Lymphozyten
wurden aus den Mäuselungen
wie folgt isoliert: die Lungen wurden kurz mit PBS zur Entfernung
von Spuren von Blut gewaschen und wurden dann mit einer Skalpellklinge
fein gehackt. 1 ml PBS, enthaltend 10 mM MgCl2,
0,5 U/ml Collagenase A (Boehringer Mannheim, Lewes, UK) und 0,25
mg/ml DNase 1 (Boehringer), wurde für jedes Lungenpaar hinzugegeben
und dies bei 37°C
unter leichtem Rütteln
für 45
min. inkubiert. Das Gemisch wurde dann durch ein 40 Gauge-Sieb passiert.
Klümpchen
wurden durch das Sieb mit dem Taucher einer 5 ml-Spritze gedrückt. Die
Zellsuspension wurde in ein Zentrifugierröhrchen eingebracht und durfte
für mehrere
Minuten stehen bleiben, damit sich große Trümmer absetzen konnten. Der Überstand wurde
entfernt, und die Zellen wurden pelletiert und mehrmals gewaschen.
Rote Zellen und nicht-lebensfähige Zellen
wurden durch Zentrifugation auf einem Ficoll-Isopaque-Gradienten
(LSM, Flow Laboratories Ltd., Herts, UK) entfernt. Nach dem Waschen
wurde die Zelllebensfähigkeit
durch Trypan Blau-Ausschluss bestimmt. Die Zellen wurden abschließend in RPM11640
komplettem Medium (10 % fötales
Kälberserum,
Penicillin 100 IU/ml, Streptomycin 100 g/ml, L-Glutamin 2 mm; Flow)
suspendiert.
-
Der
ELISPOT-Assay wurde wie folgt durchgeführt. Kurz dargestellt wurden
24-Well-Gewebekulturplatten
(Costar) über
Nacht mit P.69, FHA oder OVA (0,5 ml an 1 g·ml in PBA) überzogen,
und nach dem Waschen und Blockieren wurden 0,5 ml-Volumina der Verdünnungen
der Lymphozytensuspension in komplettem RPM1 1640
den Wells hinzugefügt
und bei 37°C/10
% CO2 für
3 Std. inkubiert. Nach dem Waschen wurden Ziege-Anti-Maus-IgG, A
oder M (1/1000, Sigma) und Kaninchen-Anti-Ziege-IgG-alkalische Phosphatase (1/1000,
Sigma) aufeinanderfolgend zugegeben.
-
Schließlich wurde
die Substratlösung
(0,5 μl
an 1 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) in 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-(AMP)-Puffer,
Sigma) hinzugefügt,
und die Platten wurden inkubiert, bis blaue Spots unter einem leistungsschwachen
Mikroskop sichtbar waren.
