DE69919754T2

DE69919754T2 - Verwendung von aufgereinigtem invaplex als impfstoff für gram-negativebakterien

Info

Publication number: DE69919754T2
Application number: DE69919754T
Authority: DE
Inventors: V. Edwin OAKS; Ross Kevin TURBYFILL; Berrong Antoinette HARTMAN
Original assignee: Walter Reed Army Institute of Research
Current assignee: Walter Reed Army Institute of Research
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2019-09-29
Also published as: WO2000018354A3; ATE274353T1; WO2000018355A9; US6680374B2; EP1198245A2; US20010009957A1; US6245892B1; DE69919754D1; WO2000018355A2; US6277379B1; EP1198245B1; US20050013822A1; AU1098400A; WO2000018354A2; WO2000018355A3; AU1199900A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung stellt die neue Zusammensetzung Invaplex bereit, die wenigstens ein Invasin-Protein, d.h. Proteine, die für den Vorgang wesentlich sind, mit dem ein Bakterium in eine Wirtszelle eindringt, und Lipopolysaccharid aus invasiven Gram-negativen Bakterien umfasst. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann als Adjuvans für Impfstoffe, biochemische oder andere Substanzen, als diagnostisches Werkzeug und als Impfstoff gegen eine Infektion mit Gram-negativen Bakterien verwendet werden.
Einführung
Bacillendysenterie wird von Vertretern der Gattung Shigella sowie von enteroinvasivem Escherichia coli (EIEC) verursacht. Shigellose findet sich in allen Teilen der Welt, wobei Entwicklungsländer die große Mehrzahl der Fälle ausmachen. In einem neueren Bericht im Bulletin of the World Health Organization wird geschätzt, dass es in Entwicklungsländern bei 0 bis 4 Jahre alten Kindern 113 Millionen Shigella-Episoden pro Jahr und in allen anderen Altersgruppen weitere 50 Millionen Fälle pro Jahr gibt. In industrialisierten Ländern gibt es schätzungsweise ungefähr 1,5 Millionen Fälle von Shigellose pro Jahr (Kotloff et al., 1999, WHO 77, 651-666). Das um sich greifende Vorkommen von Antibiotika-Resistenz bei Shigella sp. und die hohe Häufigkeit dieser Krankheit unterstreichen die Notwendigkeit eines Impfstoffs gegen dieses humane Pathogen. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist ein Impfstoff gegen Bacillendysenterie jedoch nicht kommerziell verfügbar.
Die Pathogenität von Shigella wird der Fähigkeit dieses Organismus zugeschrieben, in das Dickdarmepithel einzudringen, sich dort aufzuhalten und sich intrazellulär innerhalb dieses Epithels zu replizieren. Die Invasion von Wirtszellen durch Shigella sp. ist ein komplexes multifaktorielles Ereignis, bei dem viele verschiedene Bakterienproteine beteiligt sind. Viele der Gene für entscheidend wichtige Proteine der Shigella-Virulenz sind auf einem großen 140-Megadalton-Plasmid codiert. Mehrere der plasmidcodierten Proteine, die Invasionsplasmidantigene genannt werden (IpaA-, IpaB-, IpaC- und IpaD-Protein) (Buysse et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 2561-2569), sind wesentliche Virulenzfaktoren. Ähnliche Proteine, die Sip-Proteine genannt werden, werden von Vertretern der Gattung Salmonella produziert (Kaniga et al., 1995, J. Bacteriol. 95, 3965-3971). Nach Kontakt mit oder Bindung an die Wirtszellen induzieren die Shigella-Invasine ein Phagocytose-Ereignis, das zur Aufnahme und zur Internierung des Bakteriums durch die Wirtszelle führt. Neuere Berichte kommen zu dem Ergebnis, dass IpaB und IpaC einen Komplex bilden, der im Wachstumsmedium von Shigella-Kulturen zu finden ist (Menard et al., 1998, EMBO J. 13, 5293-5302; Watari et al. 1995, EMBO J. 14, 2461-2470). Die Komponenten dieses Komplexes sind am Invasionsvorgang beteiligt, aber die tatsächlichen Mechanismen wurden nicht definiert (Menard et al., 1994, Cell 79: 515-525). Außerdem zeigte sich, dass gereinigtes IpaC an Wirtszellen bindet und an der Aufnahme von avirulenter Shigellen durch Wirtszellen beteiligt ist (Marquart et al., Infect. Immun. 64: 4182-4187, 1996). IpaB, IpaC und IpaD sind zusammen mit LPS bekannte Hauptantigene, auf die infizierte Individuen nach einer Infektion mit Shigellen reagieren (Li et al. 1993, Scand. J. Infect. Dis. 25, 569-577; Oaks et al., 1986, Infect. Immun. 53, 57-63; van DeVerg et al. 1992, J. Infect. Dis. 166, 158-161). Mit Shigellen infizierte Affen oder Menschen erzeugen vorwiegend Antikörper gegen IpaB und IpaC und erzeugen auch mit hoher Häufigkeit Antikörper gegen IpaA, IpaD und VirG (ein weiteres plasmidcodiertes Virulenzprotein, das an der interzellulären Verbreitung beteiligt ist) (Oaks et al., 1986, siehe oben). Es ist nicht bekannt, ob die Immunreaktion gegen die Shigella-Invasine oder insbesondere gegen den Invasinkomplex entscheidend für die schützende Immunität ist.
Es gibt keinen nachgewiesenen sicheren und effektiven Impfstoff gegen Shigellose, EIEC-Diarrhöe oder Salmonellose, obwohl mehrere Impfstoffe mit lebendem abgeschwächtem Shigella am Menschen getestet werden. Wegen der vielen Serotypen von Shigella, und weil die Immunität serotypspezifisch zu sein scheint, würde es leider eine Vielzahl von Lebendimpfstoffen erfordern, um das Spektrum der Serotypen in der Natur abzudecken. Außerdem sind abgeschwächte Lebendimpfstoffe schwierig zu standardisieren.
Daher gibt es ein Bedürfnis nach einem standardisierten Impfstoff gegen Gramnegative Bakterien, der aus verschiedenen Serotypen von Shigella hergestellt werden kann, ohne dass jeder Serotyp abgeschwächt werden muss.
Turbyfill et al. (Infection and Immunity, Mai 1998, Volume 666, Nr. 5, S. 1199-2006) beziehen sich auf die Identifizierung von Epitopen und oberflächenexponierten Domänen des Shigella-flexneri-Invasionsplasmid-Antigens D.
Barzu et al. (Infection and Immunity, April 1996, Volume 64, Nr. 4, S. 1190-1196) beschreiben die Einführung einer lokalen Anti-IpaC-Antikörper-Reaktion bei Mäusen durch Verwendung eines Kandidaten für einen Shigella-flexneri-2a-Impfstoff.
Kurzbeschreibung
Die vorliegende Erfindung erfüllt die oben beschriebenen Bedürfnisse. In dieser Anmeldung wird eine neue Zusammensetzung beschrieben, die wenigstens ein Invasionsprotein, d.h. Proteine, die für die bakterielle Invasion einer Wirtszelle wesentlich sind, umfasst. Die Invasionsproteine der vorliegenden Erfindung sind mit Lipopolysaccharid (LPS) komplexiert. Der Komplex aus Invasinproteinen und LPS liegt in einer nativen Konformation vor und wurde Invaplex genannt. Der im Folgenden beschriebene Invaplex ist nicht nur als Impfstoff gegen eine Infektion mit Gram-negativen Bakterien wirksam, sondern kann auch als mukosales Adjuvans und diagnostisches Werkzeug zum Nachweis von Antikörperreaktionen, die mit einem Schutz vor zukünftiger Infektion korrelieren, dienen.
Unsere Experimente zielten anfangs auf die Isolierung und Reinigung von IpaC aus einem Wasserextrakt von Shigella, einem Gram-negativen Bakterium. Gewöhnlich wird IpaC aus dem Kulturmedium extrahiert. Wir entschieden uns für die Verwendung des Wasserextrakts, d.h. die Lösung, die aus dem Inkubieren der Bakterien unter Schütteln in sterilem Wasser resultiert, da wir die Hypothese aufstellten, dass die Menge des IpaC in einem solchen Extrakt größer wäre. Unseres Wissens wurde bisher noch kein Protein, das an der Invasionsfähigkeit von Gram-negativen Bakterien beteiligt ist, aus einem Wasserextrakt von Gram-negativen Bakterien isoliert. Als Wasserextrakt verschiedenen Trennungstechniken, wie Gelfiltration und Ionenaustausch-Chromatographie, unterzogen wurde, fanden wir zu unserer Überraschung, dass wir immer dann, wenn wir IpaC in dem Wasserextrakt nachweisen konnten, in denselben Fraktionen auch IpaB, IpaD und LPS nachweisen konnten. Wir gingen dazu über, ein Verfahren zu entwerfen, um diesen Komplex zu isolieren und zu charakterisieren. Wir haben ein Verfahren entwickelt, um den Invasinkomplex aus intakten invasiven Shigellen oder enteroinvasiven E. coli zu reinigen (siehe 1 wegen eines allgemeinen Überblicks). Kurz gesagt, die Invaplex-Präparate werden aus virulenten invasiven Shigellen isoliert. Ein rohes Gemisch wird mit Wasser aus den Shigellen extrahiert. Der Wasserextrakt besteht aus vielen Proteinen und Lipopolysaccharid (LPS). Dann wird das Wasserextraktmaterial auf eine FPLC-Ionenaustauscher-Säule aufgetragen, die zwei Hauptproteinpeaks auflöst, die Invaplex (Invasin-Komplex) 24 und Invaplex 50 genannt werden. Fraktionen, die Invaplex 24 und Invaplex 50 enthalten, werden aufgefangen. Wir fanden heraus, dass der Komplex neben LPS aus vielen Proteinen einschließlich IpaB, IpaC und IpaD zusammengesetzt war. Die Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparate, die Ipa-Proteine und das LPS enthalten, bilden eine Struktur in einer vollständig nativen Konfiguration und Umgebung. Wenn eine solche Struktur verwendet wird, um Tiere zu immunisieren, führt sie zu einer Immunreaktion, die gegen eine native Struktur gerichtet ist, welche während einer Infektion von Gramnegativen Bakterien präsentiert wird. Mit den Invaplex-Präparaten immunisierte Mäuse und Meerschweinchen zeigten eine ausgeprägte Serum-IgA- und -IgG-Reaktion auf mehrere verschiedene Antigene (einschließlich des Wasserextrakt antigens IpaC und LPS), die in den Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparaten vorhanden sind. Die beiden Invaplex-Präparate waren insofern ähnlich, als sie beide das mukosale Immunsystem aktivierten, unterschieden sich aber hinsichtlich der Spezifität der erzeugten Immunreaktion. Die Tiere waren vor einer Reizung mit Gram-negativen Bakterien und Immunisierung mit einem der beiden Invaplexe geschützt. Tiere, die mit einem der beiden Invaplexe immunisiert wurden, zeigten keine sichtbaren Anzeichen von Belastung oder Toxizität.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine gereinigte Zusammensetzung, Invaplex, die Invasinproteine in Kombination mit LPS umfasst, die unter Bildung einer nativen Struktur miteinander assoziiert sind. Der Invaplex kann aus irgendwelchen invasiven Gram-negativen Bakterien, wie Shigella, Salmonella oder EIEC verschiedener Serotypen, isoliert und kombiniert werden, so dass ein effektiver Impfstoff gegen Gram-negative Bakterien entsteht.
Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff gegen Gramnegative Bakterien bereitzustellen, der Invaplex aus Gram-negativen Bakterien in einer Menge, die bei einem Patienten eine Produktion von schützenden Antikörpern gegen diese Bakterien bewirkt, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Träger oder Arzneimittelhilfsstoff umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Shigella-Impfstoff bereitzustellen, der Invaplex aus Shigella in einer Menge, die bei einem Patienten eine Produktion von schützenden Antikörpern gegen Shigella bewirkt, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Träger oder Arzneimittelhilfsstoff umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen EIEC-Impfstoff bereitzustellen, der Invaplex aus EIEC in einer Menge, die bei einem Patienten eine Produktion von schützenden Antikörpern gegen EIEC bewirkt, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Träger oder Arzneimittelhilfsstoff umfasst.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Gram-negative Bakterien bereitzustellen, das das Isolieren des Invaplexes aus Gram-negativen Bakterien umfasst.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1. Herstellung von Invaplex 24 und Invaplex 50 aus Shigella sp.
2. FPLC-Chromatogramme der Invaplex-Reinigung durch Ionenaustausch-Chromatographie aus Shigella flexneri 5, S. flexneri 2a, S. sonnei, S, dysenteriae 1, S. boydii 2 und enteroinvasivem Escherichia coli O152. Produkte der FPLC-Ionenaustausch-Chromatographie von wasserextrahierten Proteinen, die aus Shigella flexneri 5 (2A), S. flexneri 2a (2B), S. sonnei (2C), S. dysenteriae 1 (2D), S. boydii 2 (2E) und enteroinvasivem Escherichia coli 0152 (2F) hergestellt wurden, wurden auf 5-ml-Säulen mit Anionenaustauscherharz HiTrapQ (Pharmacia) getrennt. Zwei Kurven sind aufgetragen; eine entspricht der optischen Dichte (O.D.) bei 280 nm (AU, dicke Linie), die die vier Proteinpeaks zeigt; die andere Kurve ist eine Auftragung der Leitfähigkeit oder des Prozentsatzes an Puffer B (1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 9,0) und zeigt eindeutig die 24%-, 50%- und 100%-Puffer-B-Stufen. Die Fließgeschwindigkeit war 2,0 ml/min, und während des gesamten Durchlaufs wurden 2-ml-Fraktionen aufgefangen. Der Invaplex-24- und der Invaplex-50-Peak sind markiert. Diese Fraktionen werden aufgefangen und in weiteren Experimenten verwendet. Alle Fraktionen werden durch Spot-Blot auf IpaC- und IpaB-Gehalt analysiert. Der Spitzen-IpaC- und -IpaB-Gehalt befindet sich in den Invaplex-24- und Invaplex-50-Peakfraktionen.
3. Western-Blot-Analyse von Invaplex 24 und Invaplex 50 aus S. flexneri 2a, S. sonnei, S. dysenteriae 1, S. boydii 2 und enteroinvasivem Escherichia coli O152 mit monoklonalen Antikörpern gegen IpaB, IpaC und IpaD. Proben, die auf diesem Gel laufen gelassen wurden, sind Ganzzelllysate von S, flexneri 5, M90T-Wash, vir+ (Spur 1), Ganzzelllysate von S. flexneri 5, M90T-55, vir- (Spur 2) und Invaplex 24 (linkes Bild) oder Invaplex 50 (rechtes Bild) von S. flexneri 2a (Spur 3), S, sonnei (Spur 4), S. dysenteriae 1 (Spur 5), S, boydii 2 (Spur 6) und enteroinvasivem E. coli O152 (Spur 7). Dies ist eine Zusammensetzung von Western Blots, die mit monoklonalen Antikörpern sondiert wurden, welche reaktiv gegenüber IpaB (Mab 2F1), IpaC (Mab 2G2) und IpaD (Mab 16f8) sind. Die IpaB-, IpaC- und IpaD-Banden sind notiert. Jede Spur, die Invaplex-Präparate enthielt, wurde mit 20 μg Protein beladen.
4. Antikörperreaktion auf LPS und Wasserextrakt bei Meerschweinchen, die mit unterschiedlichen Dosen von Invaplex-24- oder Invaplex-50-Impfstoff immunisiert und anschließend mit virulentem S. flexneri 2a gereizt wurden. Fünf Gruppen von Meerschweinchen (4 Tiere pro Gruppe) wurden mit entweder 0, 5, 10, 25, 50 oder 100 μg/Dosis S. flexneri 2a Invaplex 24 oder Invaplex 50 immunisiert. Meerschweinchen wurden an den Tagen 0, 14 und 28 intranasal immunisiert und dann am Tag 49 gereizt. Blut wurde an den Tagen 0, 28, 42 und 56 abgenommen. Die Serum-IgG-Reaktion wurde durch ELISA gegen S. flexneri 2a LPS (oberes Bild), Wasserextrakt aus Vir-positiven (mittleres Bild) und Vir-negativen (unteres Bild) Shigellen gemessen. In jedem der 3 Bilder befinden sich die Daten für die mit Invaplex 24 immunisierten Tiere links, die Daten für die mit Invaplex 50 immunisierten Tiere sind in der Mitte, und die Daten für die mit Puffer behandelten Kontrolltiere sind auf der rechten Seite jeder Graphik. Die Balken stellen die mittlere O.D.405 ± Standardabweichung für jede Gruppe von 4 Meerschweinchen dar. Die Impfstoffdosis (μg) ist für jede Gruppe von Meerschweinchen unter den Daten angegeben.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff für Gram-negative Bakterien auf der Basis von Invaplex und auf Verfahren zur Herstellung eines solchen Impfstoffs.
Insbesondere führt der in dieser Erfindung beschriebene Impfstoff für Gramnegative Bakterien zu einer verbesserten funktionellen (bakteriziden, neutralisierenden, opsonisierenden) Antikörperreaktion gegen Gram-negative Bakterien bei Tieren, und es wird erwartet, dass er bei Menschen eine verbesserte Antikörperreaktion ergibt, indem er die Invasine und LPS in ihrer natürlichen Umgebung als native Strukturen präsentiert. Eine Impfung mit Gram-negativen Untereinheit-Impfstoffen, die sowohl Invasine als auch LPS enthalten, war vor dieser Erfindung nicht effektiv. Es wird erwartet, dass die intranasale Impfung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung einen effektiven Impfungsweg darstellt, da sie nicht nur Antikörper im Serum, sondern auch sekretorische Antikörper auf der Schleimhautoberfläche induziert. Diese Art von Impfstoff wird einfach und kostengünstig herzustellen sein; sie erlaubt es, Kombinationen von Invaplexen aus verschiedenen Serotypen miteinander zu kombinieren, so dass man einen Schutz vor mehr als einem Serotyp von Gram-negativen Bakterien erhält, ist sicher und induziert keine negativen Nebenwirkungen, und die Dosen können quantifiziert und standardisiert werden.
Der Invaplex kann aus beliebigen Gram-negativen Bakterien hergestellt werden; dazu gehören unter anderem solche, die unter den folgenden Gattungen klassifiziert werden: Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia, Rickettsia, Brucella, Ehrlichiae, Edwardsiella, Campylobacter, Legionella und Neisseria. Dies sind alles invasive Bakterien mit einer Gram-negativen Architektur (d.h. sie haben eine innere oder cytoplasmatische Membran und eine äußere Membran, die die innere Membran umgibt).
Neben virulenten Gram-negativen Bakterien des Wildtyps können auch Mutanten dieser Organismen geeignet sein, wie solche, die Mengen der Invasinproteine überexprimieren und die zur Produktion größerer Mengen an Invaplex führen könnten. Das Gen virF ist zum Beispiel an der Regulation der Ipa-Proteine bei Shigellen beteiligt (Sakai et al. 1988, Mol. Microbiol. 2, 589-597). Auf alle oben und im Folgenden hier zitierten Dokumente wird ausdrücklich Bezug genommen. Weiterhin kann es günstig sein, den Invaplex aus Bakterien herzustellen, die in Toxingenen mutiert sind, so dass die Organismen kein Toxin, zum Beispiel Shiga-Toxin, produzieren. Aus tox-negativen Stämmen hergestellter Invaplex wären potentiell sicherer, da die potentielle Kontaminierung durch das Toxin beseitigt wäre.
Erhöhte Invaplex-Niveaus können erreicht werden, indem man den Komplex in Gegenwart von Chemikalien extrahiert, die die Sekretion der Invasinproteine stimulieren. Zu diesen Chemikalien gehören Kongorot, Evans-Blau und Direktorange (F.K. Bahrani, Infect. Immun. 65: 4005-4010, 1997). Diese Chemikalien könnten während der Wasserextraktion oder während des Wachstums der Bakterien hinzugefügt werden.
Um die Invasinproteine (Ipa-Proteine bei Shigella oder ähnliche Proteine bei anderen invasiven Bakterien) zu isolieren, müssen die Invasinproteine durch die Bakterien exprimiert werden. Wenn die Invasinproteine nicht auf der Oberfläche oder überhaupt nicht exprimiert werden, ist der Invaplex nicht vorhanden. Bei S. sonnei muss man zum Beispiel Kulturen der Form I verwenden, da sie virulent sind. Kulturen der Form II exprimieren die Ipa-Proteine aufgrund einer großen spontanen Deletion im Virulenzplasmid nicht. Außerdem kann der Invaplex aus Bakterien isoliert werden, denen Gene, die Invasinproteine codieren, hinzugefügt wurden und die diese exprimieren. Solche Bakterien können vorher bereits Invasinproteine enthalten und exprimieren oder auch nicht, und sie werden für einen besonderen Zweck gewählt, wie leichte Reinigung des Invaplexes oder vorteilhafte Eigenschaften, wie reduzierte Toxinproduktion.
Die Präsentation von Ipa-Protein auf der Oberfläche von Shigellen kann reduziert werden, indem man Gene im spa- oder mxi-Genlokus mutiert. Die spa/mxi-Genmutanten produzieren die Ipa-Proteine in normalen Mengen, aber die Ipa-Proteine werden nicht auf der Außenseite des Organismus präsentiert oder sezerniert. Es wurde schon früher gezeigt, dass sich bei spa-Mutanten reduzierte Mengen von IpaB und IpaC im Wasserextrakt befinden (Venkatesan et al., 1992, J. Bacteriol. 174, 1990-2001).
Um die Möglichkeit der Verwendung von avirulenten Kulturen auszuschließen, ist es wichtig, dass als Quelle für den Invaplex verwendete Kulturen getestet werden und sich als virulent erweisen. Dies geschieht gewöhnlich durch den Sereny-Test (Keratokonjunktivitis bei Meerschweinchen, wie es unten im Abschnitt "Materialien und Methoden" und in den Beispielen beschrieben ist). Eine weitere Methode, um Virulenz zu gewährleisten, besteht darin, Kulturen von Shigellen auf Kongorot-Medien zu kultivieren, bei denen Kolonien, die rot sind (oder den Farbstoff Kongorot binden), fast stets virulent sind. Die Bewertung der Virulenz ist bei Shigella-Kulturen äußerst wichtig, da spontane Mutationen, die zu avirulenten Kulturen führen, an der Tagesordnung sind. Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass es auch möglich ist, den Invaplex aus partiell virulenten Kulturen zu isolieren, doch wird die Ausbeute dadurch beeinträchtigt.
In einer Ausführungsform bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Invaplex aus Gram-negativen Bakterien. Das Verfahren verwendet eine Verbesserung der von Oaks et al., 1986 (Infect. Immun. 53, 57-63), beschriebenen Wasserextraktionstechnik. Diese Verbesserungen sollten die Ausbeute an funktionellem Produkt erhöhen, indem sie die Zeit zur Herstellung des Wasserextraktpräparates minimierten. Zu den Verbesserungen gehört die Verwendung einer Ionenaustauschersäule, mit der sich der Invaplex konzentrieren lässt, wodurch die Notwendigkeit entfällt, den Wasserextrakt durch einen zeitraubenden Ultrafiltrationsschritt zu konzentrieren, bevor man ihn auf die Ionenaustauschersäule lädt. Die Durchführung der Ultrafiltration dauerte oft über Nacht, und während dieser Zeit könnte ein proteolytischer Abbau erfolgen. Die Ipa-Proteine sind äußerst labil und zersetzen sich ziemlich schnell. Eine weitere Verbesserung ist die Wassermenge, die zum Extrahieren der Proteine verwendet wird. Das vorliegende Verfahren verwendet ein Wasservolumen, das 1/20 des Volumens des zum Züchten der Kultur verwendeten Mediums beträgt, anstelle des zuvor verwendeten Verhältnisses von 1/10 (Oaks et al., 1986, siehe oben). Wenn die Shigellen zum Beispiel in 20 Liter Medium gezüchtet werden, würde man 1 Liter Wasser für die Extraktion verwenden. Weitere Modifikationen umfassen die Filtration des Wasserextrakts mit einer 0,45- oder 0,22-μm-Membran vor und/oder nach der Ultrazentrifugation. Dieser Schritt entfernt Bakterien aus dem Wasserextraktmaterial und macht es weniger wahrscheinlich, dass dieses lebensfähige Bakterien enthält. Dieser Schritt ist wesentlich für jedes Produkt, das bei Tests am Menschen verwendet werden soll. Außerdem wurde bei dem ursprünglichen Verfahren, das in Oaks, 1986 (siehe oben), beschrieben ist, PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), ein sehr starker und gefährlicher Protease-Inhibitor, verwendet. Dieser Protease-Inhibitor wird nicht mehr verwendet, da er toxisch ist. Um die Zersetzung der Proteine in dem Komplex zu minimieren, wird der Wasserextrakt auf Eis gehalten, um die proteolytische Zersetzung zu minimieren.
Das vorliegende Verfahren beinhaltet die Schritte des Isolierens von Bakterienzellen, des Extrahierens der Zellen in sterilem Wasser, des Abtrennens und Verwerfens von Membranfragmenten aus dem Wasserextrakt, was zu einer Lösung führt, die den Invaplex enthält, und des Isolierens des Invaplexes aus der Lösung. Das Züchten von Gram-negativen Bakterien in Kultur ist dem Fachmann bekannt. Wegen eines allgemeinen Nachschlagewerks, siehe Manual of Methods for General Bacteriology, 1981, Washington, D.C., P. Gephardt et al. (Hrsg.). Medien und Bedingungen für das Wachstum werden für Shigella ausführlich unten im Abschnitt "Materialien und Methoden" diskutiert. Nach dem Wachstum werden die Bakterienzellen in sterilem Wasser, 20 mM Tris-HCl, normaler Kochsalzlösung (0,15 M NaCl) oder anderen Puffern extrahiert, solange die Bedingungen eine Bindung der Invaplex-24- und Invaplex-50-Fraktionen an die gewünschte Säule ermöglichen.
Vorzugsweise werden Detergentien in der Extraktionslösung weggelassen, da Detergentien häufig gemischte Micellen (Micellen, die eine Vielzahl von Proteinen enthalten) bilden, die sich auf der Ionenaustauschersäule möglicherweise nicht in konsistenter Weise verhalten. Detergentien bringen auch integrale Membranproteine in Lösung, die das Invaplex-Produkt stören können. Schließlich können Detergentien auch den Invaplex zerstören oder denaturieren und alle einzelnen Komponenten des Komplexes in Lösung bringen. Steriles Wasser kann nach in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel Filtrieren durch 0,10-, 0,22- oder 0,45-μm-Filter. Die Konzentration von Bakterienzellen in Wasser beträgt vorzugsweise 1 × 10⁷ bis etwa 2 × 10¹² Zellen pro ml Wasser oder Puffer, vorzugsweise 1 × 10⁸ bis etwa 2 × 10¹¹.
Die Extraktionszeit wird vorzugsweise reguliert, denn wenn sie zu lang ist, kann eine Zersetzung des Produkts resultieren, und eine zu kurze Extraktionszeit führt zu einer schlechten Ausbeute an Produkt.
Während des Extraktionsschrittes kann ein Protease-Inhibitor hinzugefügt werden, um die Reduktion der Proteinzersetzung im Endprodukt zu unterstützen. Beispiele für Proteasen, die hinzugefügt werden könnten, umfassen Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Es sind auch andere Protease-Inhibitoren verfügbar, wie Serin-Protease-Inhibitoren, doch sind sie gewöhnlich etwas toxisch. Wenn der Invaplex an lebende Zellen verabreicht werden soll, wäre es wegen der Toxizität der Protease-Inhibitoren zu bevorzugen, die Protease-Inhibitoren wegzulassen oder sie vor der Verabreichung aus der Lösung zu entfernen. Wenn der Invaplex jedoch für ein ELISA-Reagens verwendet werden soll, könnte der Protease-Inhibitor in der Lösung bleiben, und tatsächlich wäre es sogar zu bevorzugen, ihn in der Lösung zu haben.
Dann werden die Zellen und Membranfragmente durch in der Technik bekannte Verfahren, wie Zentrifugation, Filtration, Mikrofiltration, Ultrafiltration, aus der Lösung entfernt, doch Ultrazentrifugation ist zu bevorzugen, um die kleinen Membranfragmente zu entfernen, bevor die Lösung einer Ionenaustausch-Chromatographie unterzogen wird. Nach der Extraktion kann der Komplex mit jeder Technik, die für die Trennung von Teilchen in komplexen Gemischen geeignet ist, aus den Zelltrümmern abgetrennt werden. Der Komplex kann dann durch Anion- oder Kationaustausch-Chromatographie oder andere Isolierungstechniken gereinigt werden; diese können unter anderem Folgende umfassen: Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Immunadsorption, Phosphocellulose-Chromatographie, Hydrophobchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunoaffinitätschro matographie, Ausschlusschromatographie, Flüssigchromatographie (LC), HPLC (high performance LC), FPLC (fast performance LC), Hydroxyapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie. Zu den Anionenaustauschern gehören Diethylaminoethyl (DEAE) {-OCH₂CH₂N⁺H(CH₂CH₃)₂}, quartäres Aminoethyl (QAE) {-OCH₂CH₂N⁺(C₂H₅)-CH₂CHOH-CH₃} und quartäres Ammonium (Q) {-OCH₂CHOH-CH₃CHOH-CH₂N⁺(CH₃)C₃}. Solche funktionellen Gruppen sind an verschiedene Träger gebunden, wobei jeder Träger in der Teilchengröße variiert, aber auch in Bezug auf das Trägermaterial variiert. Beispiele für Trägermaterial sind: Monobeads, 10-μm-Kügelchen aus hydrophilem Polystyrol/Divinylbenzol {d.h. Mono Q (Pharmacia, Uppsala, Schweden)}, Minibeads, 3-μm-Kügelchen aus einem hydrophilen Polymer {d.h. Mini Q (Pharmacia)}, SOURCE, 15 & 30 μm monodisperse hydrophilisierte starre Polystyrol/Divinylbenzol-Kügelchen {d.h. SOURCE Q (Pharmacia)}, Sepharose, 34-50 μm hochgradig vernetzte Agarose-Kügelchen {d.h. HiTRap Q (Pharmacia) und Econo-Pac High Q (Bio-Rad)}, Sepharose Fast Flow, 90 μm Agarose-Kügelchen {d.h. QSepharose Fast Flow (Pharmacia)}, Sepharose Big Beads, 100-300 μm Agarose-Kügelchen {d.h. QSepharose Big Beads (Pharmacia)}.
Das Chloridion (Cl^-) ist das Gegenion der Wahl für die Anionaustausch-Chromatographie, wobei die Wahl des Puffers von dem erforderlichen pH-Intervall abhängt, wobei Tris einen effektiven Pufferbereich von 7,6 bis 8,0 hat. Zu den weiteren Puffern, die verwendet werden können, gehören: N-Methyldiethanolamin (pH 8,0-8,5), Diethanolamin (pH 8,4-8,8), 1,3-Diaminopropan (pH 8,5-9,0), Ethanolamin (pH 9,0-9,5) und gegebenenfalls Piperazin (pH 9,5-9,8). Diese Puffer werden in einer geringen Konzentration, gewöhnlich 20 mM, verwendet, die jedoch durchaus auch 50 mM betragen kann.
Es können auch weitere Säulen oder Verfahren verwendet werden, solange sie eine native Struktur des Invaplexes aufrechterhalten, so dass Immunogenität und Funktion intakt sind, das Aufladen und Konzentrieren von großen Volumina einer verdünnten Proteinlösung ermöglichen, die Puffer biologisch verträglich sind, das Verfahren schnell ist, um die Zersetzung des Produkts zu minimieren, und nur wenige Verarbeitungsschritte erforderlich sind.
Vorzugsweise ist jede Säule einem speziellen Serotyp und einem speziellen Shigella-Stamm vorbehalten. Die optimale Proteinkonzentration im Endprodukt wäre ungefähr 10 Dosen pro ml. Aber der Bereich kann auch nur 0,1 Dosis pro ml (Proteinkonz. 2,5 μg/ml) bis zu viel höheren Werten von 5000 Dosen pro ml (Proteinkonz. 125 mg/ml) betragen, solange die Löslichkeit aufrechterhalten wird, d.h. die Konzentration nicht zu hoch ist, so dass sie eine Fällung bewirkt, und nicht zu gering ist und somit die Filtration zu kostspielig und zeitraubend macht.
Idealerweise erreichen wir in Peakfraktionen von Invaplex 24 und Invaplex 50 0,25 mg/ml bis 5 mg/ml. Wenn die Proteinkonzentration kleiner als 0,25 mg/ml ist, muss die Lösung durch zentrifugale Ausschlussfiltration (Molekulargewichtsschwelle von 10 000 bis 100 000, besonders bevorzugt Molekulargewichtsschwelle von 30 000) konzentriert werden.
Unter Verwendung des Verfahrens, das unten im Abschnitt "Materialien und Methoden" beschrieben ist, wurden die Fraktionen, die die größte Menge an IpaB und IpaC enthielten, in Fraktionen gefunden, die bei 24% Puffer und 50% Puffer aus der Ionenaustauschersäule eluiert wurden, was zu Invaplex 24 bzw. Invaplex 50 führte.
Dieses Verfahren muss für die Verwendung mit anderen Gram-negativen Bakterien minimal modifiziert werden. Zum Beispiel können andere Ionenaustauschersäulen verwendet werden, und verschiedene Antikörper müssen verwendet werden, um die Zielantigene zu sondieren. Zum Beispiel müsste man Antikörper für SipB und SipC verwenden, um Peakfraktionen zu identifizieren, die den Komplex enthalten, der aus Salmonella sp. erhalten wird. Yersinia würde Anti-YOP-Protein-Antikörper benötigen (Corneliz und Wolf-Watz, 1997, Mol. Microbiol. 23, 861-867).
Weitere Verfahren zur Herstellung von Invaplex umfassen Verfahren, bei denen einzelne Invasinproteine mit LPS kombiniert werden, um einen Komplex mit einer nativen Konfiguration zu bilden. Außerdem kann der Komplex aus Invasinen und LPS durch Reinigungstechniken, wie sie oben und im Folgenden beschrieben sind, weiter von anderen Komponenten in den Invaplex-24- und Invaplex-50-Fraktionen gereinigt werden.
In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Impfstoff zum Schutz vor Gram-negativen Bakterien. Der Impfstoff umfasst Invaplex aus Gram-negativen Bakterien. Der Impfstoff kann hergestellt werden, indem man den Invaplex unter Verwendung von Verfahren, die oben oder im Folgenden ausführlich beschrieben sind, isoliert. Ein oder mehrere isolierte Invaplexe werden für die Verabreichung an Säuger nach in der Technik bekannten Verfahren hergestellt; dazu können das Sterilfiltrieren der Lösung, das Verdünnen der Lösung, das Hinzufügen eines Adjuvans und das Stabilisieren der Lösung gehören. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass Invaplex-Präparate nicht zusammen mit einem Immunpotentiator, wie einem Adjuvans oder einem Träger, verabreicht werden müssen, da der Invaplex selbst als solcher fungiert. Dieses Merkmal als solches schließt nicht die Verwendung von Immunpotentiatoren in Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung aus. Als solche kann eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform einen oder mehrere Invaplexe und ein oder mehrere Adjuvantien oder Träger enthalten.
Adjuvantien sind typischerweise Substanzen, die die Immunantwort eines Tieres auf ein spezielles Antigen allgemein verstärken. Zu den geeigneten Adjuvantien gehören unter anderem Freunds Adjuvans, weitere Komponenten der Bakterienzellwand, Salze auf Aluminiumbasis, Salze auf Calciumbasis, Siliciumoxid, Polynucleotide, Toxoide, Serumproteine, virale Hüllproteine, andere von Bakterien stammende Präparate, gamma-Interferon, Blockcopolymer-Adjuvantien, wie Hunters Titermax-Adjuvans (CytRx^TM, Inc., Norcross, GA), Ribi-Adjuvantien (erhältlich von Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MO) und Saponine und ihre Derivate, wie Quil A (erhältlich von Superfos Biosector A/S, Dänemark).
Träger sind typischerweise Verbindungen, die die Halbwertszeit einer therapeutischen Zusammensetzung in dem behandelten Tier erhöhen. Zu den geeigneten Trägern gehören unter anderem polymere Zubereitungen mit gesteuerter Freisetzung, biologisch abbaubare Implantate, Liposomen, Öle, Ester und Glycole.
Der Impfstoff kann lyophilisiert werden, so dass ein Impfstoff gegen Gramnegative Bakterien in einer getrockneten Form für leichteren Transport und Lagerung entsteht. Die getrockneten Zusammensetzungen können für die orale Gabe verwendet werden. Invaplexe können auch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff, wie einem isotonischen Puffer, der von dem Organismus, dem der Impfstoff verabreicht werden soll, toleriert wird, gemischt werden. Beispiele für solche Arzneimittelhilfsstoffe sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung, Hanks-Lösung und andere wässrige, physiologisch ausgewogene Salzlösungen. Nichtwässrige Träger, wie fixierte Öle, Sesamöl, Ethyloleat oder Triglyceride, können ebenfalls verwendet werden. Zu den weiteren geeigneten Zubereitungen gehören Suspensionen, die Viskositätsmodifikatoren, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran, enthalten. Arzneimittelhilfsstoffe können auch kleinere Mengen von Additiven enthalten, wie etwa Substanzen, die die Isotonie und chemische Stabilität verstärken. Beispiele für Puffer sind Phosphatpuffer, Hydrogencarbonatpuffer und Tris-Puffer, während Beispiele für Konservierungsstoffe Thimerosal, m- oder o-Kresol, Formalin und Benzylalkohol sind. Standardzubereitungen können entweder flüssige injizierbare Lösungen oder Feststoffe, die für die Injektion in einer geeigneten Flüssigkeit als Suspension oder Lösung aufgenommen werden können, sein. In einer nichtflüssigen Zubereitung kann der Arzneimittelhilfsstoff also zum Beispiel Dextrose, Humanserumalbumin und/oder Konservierungsstoffe umfassen, zu denen vor der Verabreichung steriles Wasser oder Kochsalzlösung gegeben werden können.
Weiterhin kann der Impfstoff auch in Form eines gemischten Impfstoffs hergestellt werden, der die oben beschriebenen Invaplexe sowie wenigstens ein weiteres Antigen enthält, solange das hinzugefügte Antigen die Wirksamkeit des Impfstoffs nicht stört und die Nebenwirkungen und nachteiligen Reaktionen nicht additiv oder synergistisch erhöht werden. Der Impfstoff kann mit chemischen Struktureinheiten assoziiert werden, die die Löslichkeit, Resorption, biologische Halbwertszeit usw. des Impfstoffs verbessern können. Die Struktureinheiten können alternativ dazu auch die Toxizität des Impfstoffs senken, eine unerwünschte Nebenwirkung des Impfstoffs beseitigen oder dämpfen usw. Struktureinheiten, die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. Verfahren zur Kopplung solcher Struktureinheiten an ein Molekül sind in der Technik wohlbekannt.
Der Impfstoff kann in einem verschlossenen Gläschen, einer Ampulle oder dergleichen gelagert werden. Der vorliegende Impfstoff kann im Allgemeinen in Form eines Sprays für die intranasale Verabreichung oder durch Nasentropfen, Inhalantien, Tampons auf Mandeln oder als Kapsel, Flüssigkeit, Suspension oder Elixier für die orale Verabreichung verabreicht werden. Wenn der Impfstoff in getrockneter Form vorliegt, wird der Impfstoff vor der Verabreichung in sterilisiertem destilliertem Wasser gelöst oder suspendiert.
Im Allgemeinen kann der Impfstoff einem Patienten oral, subkutan, intradermal, transdermal oder intramuskulär, aber vorzugsweise intranasal oder oral, rektal und vaginal in einer für die Produktion von neutralisierendem Antikörper wirksamen Dosis, die zu einem Schutz vor Infektion oder Krankheit führt, verabreicht werden. "Patient" bedeutet ein Tier, Vogel, Fisch oder Säuger einschließlich des Menschen. Der Impfstoff kann in Form von Einzeldosispräparaten oder in Multidosisflaschen, die für Massenimpfungsprogramme verwendet werden können, vorliegen. Wegen Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Impfstoffen wird Bezug genommen auf Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol (Hrsg.) (1980), sowie New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (Hrsg.), University Park Press, Baltimore, MD (1978). Annehmbare Vorschriften zur Verabreichung von Zusammensetzungen in effektiver Weise beinhalten eine individuelle Dosisgröße, Anzahl von Dosen, Häufigkeit der Dosisverabreichung und Verabreichungsmodus. Die Bestimmung solcher Vorschriften kann durch den Fachmann bewerkstelligt werden. Eine bevorzugte Einzeldosis einer Invaplex-Zusammensetzung beträgt etwa 0,1 μg/kg Körpergewicht bis etwa 100 μg/kg Körpergewicht. Auffrischimpfungen werden vorzugsweise verabreicht, wenn die Immunreaktion eines Organismus nicht mehr effektiv moduliert wird. Solche Zusammensetzungen können etwa zwei Wochen bis mehrere Jahre nach der ursprünglichen Verabreichung verabreicht werden. Ein bevorzugtes Verabreichungsschema ist eines, bei dem etwa 0,5 μg bis etwa 10 μg einer Zusammensetzung pro kg Körpergewicht des Organismus etwa einmal bis etwa viermal über einen Zeitraum von etwa einem Monat bis etwa 6 Monaten verabreicht werden.
Symptome einer Infektion mit Gram-negativen Bakterien bei einem Patienten können reduziert werden, indem man dem Patienten eine effektive Menge Invaplex-Antikörper, einschließlich solcher, die im Menschen hergestellt wurden, entweder polyklonal oder Kombinationen von monoklonalen, gegen Invaplex verabreicht, wie es oben beschrieben ist. Wenn man einen Patienten mit Invaplex-Antikörpern versorgt, variiert die verabreichte Dosis in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht, allgemeinen medizinischen Zustand, Anamnese usw. des Patienten. Im Allgemeinen ist es wünschenswert, den Empfänger mit einer Dosis der obigen Verbindungen zu versorgen, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 500 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit bereit, der ein Pharmakon (für die Prophylaxe, d.h. einen Impfstoff, oder für die Therapie, d.h. ein Therapeutikum) gemäß der obigen Beschreibung in einem Behälter, vorzugsweise einer vorgefüllten Spritze oder einem vorgefüllten Gläschen/Ampulle mit auf dem Behälter aufgedruckten oder diesen begleitenden Anweisungen, die die Verabreichung des Pharmakons an einen Patienten betreffen, umfasst, zur Prävention oder Behandlung von Zuständen, die durch Infektionen durch Gram-negative Bakterien verursacht sind.
Im Folgenden sind Beispiele für die vorliegende Erfindung beschrieben, die nur zu veranschaulichenden Zwecken angegeben werden und nicht, um den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken. Weitere geeignete Modifikationen und Adaptationen der Vielzahl von Bedingungen und Parameter, denen man auf diesem Fachgebiet normalerweise begegnet und die für den Fachmann offensichtlich sind, sind vom Wesen und Umfang der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
In den untenstehenden Beispielen wurden die folgenden Methoden und Materialien verwendet.
Bakterienkultur und -stämme
Die meisten der in diesen Studien verwendeten Shigella-Stämme sind ein Bestandteil der WRAIR-Sammlung. Dazu gehören Shigella flexneri 5 (M90T-W und Inc 103, beide sind vir-positiv), S. flexneri 5 (M90T-55, vir-negativ), S. flexneri 2a (2457T), S. sonnei (Mosley), S. dysenteriae 1 (Ubon) und enteroinvasives Escherichia coli (O152). S. boydii 2 (CDC-Stamm 3057-98) wurde freundlicherweise von N. Strockbine zur Verfügung gestellt.
Isolierte Shigella-Kolonien wurden verwendet, um 50 ml PenAssay-Brühe (Antibiotic Medium Nr. 3, Difco) bei 37 °C zu beimpfen. Nach 4 h Wachstum wurden 10 ml der in logarithmischer Phase befindlichen Kultur zu jedem Liter vorgewärmter (37 °C) PenAssay-Brühe gegeben, die für die Kultur über Nacht verwendet werden sollte. Die 1-Liter-Kulturen wurden über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator inkubiert.
Wasserextraktion von Shigella-Proteinen
Eine Modifikation des ursprünglichen von Oaks et al. (Oaks et al., 1986, siehe oben) beschriebenen Wasserextraktionsverfahrens wurde verwendet, um das Material herzustellen, aus dem der Shigella-Invasinkomplex isoliert wurde. Identische -Verfahren werden für enteroinvasives E. coli verwendet. Typischerweise wurden vier Liter einer Übernachtkultur von virulenten Shigellen für eine Charge Wasserextrakt verwendet. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation in einem GS3-Rotor (Sorvall) mit 6000 U/min (etwa 6000 x g) während 30 min bei 4 °C isoliert. Dann wurden die Bakterienzellen in sterilem, entionisiertem Wasser (0,45-μm-Membran-filtriert) mit einem Volumen von 50 ml pro Liter Übernachtkultur suspendiert und 2 h lang bei 37 °C in einem Schüttelwasserbad (etwa 200 U/min) inkubiert. Nach der Extraktion mit Wasser wurden die Zellen durch Zentrifugation mit 16 000 x g (GSA-Rotor, 10 000 U/min) während 30 min bei 4 °C isoliert. Der Überstand wurde entnommen und 1 h lang bei 4 °C mit ungefähr 100 000 x g zentrifugiert, um Membranfragmente zu sedimentieren. Der Überstand nach 100 000 x g wurde in einen sterilen vorgekühlten Kolben auf Eis dekantiert. Alle Überstände nach 100 000 x g für eine einzelne Charge Wasserextrakt wurden zu diesem Zeitpunkt vereinigt. Wenn möglich, wurden alle Proben auf Eis gehalten, und Protease-Inhibitoren wurden während des Verfahrens nicht verwendet. Der Wasserextrakt wurde bei -70 °C aufbewahrt.
Charakterisierung des Wasserextrakts
Der Gesamtproteingehalt jeder Charge Wasserextrakt wurde mit dem Bicichoninsäure-Assay (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) gemessen. Durch Western-Blots oder Spot-Blots unter Verwendung von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen IpaB (mab 2F1), IpaC (mab 2G2) und IpaD (mab 16F8) (Mills et al., 1988; Turbyfill et al., 1998), um die einzelnen Ipa-Proteine zu sondieren, wurden Wasserextraktchargen auch auf die Anwesenheit von IpaB, IpaC und IpaD analysiert. Nur Wasserextrakte, die in Bezug auf die Ipa-Proteine positiv waren, wurden für die Invasinkomplex-Reinigung verwendet.
FPLC (fast protein liquid chromatography)
Ionenaustausch-Chromatographie wurde verwendet, um Invasinkomplexfraktionen aus dem Wasserextrakt zu isolieren. Eine 5-ml-Anionenaustausch-HiTrapQ-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) wurde bei Umgebungstemperatur mit 20 mM Tris-HCl, pH 9,0 (Puffer A) äquilibriert. Vor der Beladung wurde Tris-HCl (0,2 M, pH 9,0) bis zu einer Endkonzentration von 20 mM zu der Wasserextraktprobe gegeben, und danach wurden 20 ml des Wasserextrakts mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min durch die Säule laufen gelassen. Nach der Beladung wurde die Säule mit 6 Säulenvolumina Puffer A gewaschen. Alle Elutionen wurden mit Stufengradienten durchgeführt, die aus 24% Puffer B bestanden, gefolgt von einem Schritt mit 50% Puffer B, und schließlich wurde die Säule mit 100% Puffer B (1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 9,0) gewaschen. Nach dem Waschen mit 100% Puffer B wurde die Säule vor dem nächsten Durchlauf mit Puffer A reäquilibriert. Jede Säule, die in diesen Studien verwendet wurde, blieb einem speziellen Serotyp und einem speziellen Stamm von Shigella vorbehalten. Der Durchlauf der Proteine durch die Säule wurde bei 280 nm überwacht, und 2-ml-Fraktionen wurden in Polypropylenröhrchen aufgefangen. Daten vom UV-Detektor wurden über die ADInstruments-PowerChrom-Datenerfassungs- und -analyse-Software für das Macintosh-Computerbetriebssystem aufgezeichnet. Für jede Wasserextraktcharge waren mehrere FPLC-Durchläufe erforderlich. Wenn die Fraktionen aufgefangen wurden, wurden sie sofort auf -70 °C gelegt.
Jede Fraktion wurde durch Immuno-Spot-Blot auf Anwesenheit von IpaC und IpaB analysiert. Fraktionen (gewöhnlich 1 oder 2), die die größte Menge an IpaB und IpaC im 24%igen Puffer B enthielten, wurden vereinigt, wie auch die Peak-Ipa-Proteinfraktionen im Schritt mit dem 50%igen Puffer, was für einen Durchlauf zu Invaplex 24 und Invaplex 50 führte. Pools aus Durchläufen von Invaplex 24 und Invaplex 50, von denen einmal bestimmt wurde, dass sie relativ ähnlich in Bezug auf IpaB-, IpaC- und IpaD-Gehalt (bestimmt durch Western Blot), LPS-Gehalt (bestimmt durch Silberfärbungsanalyse von Gelen, siehe unten) und Gesamtproteinzusammensetzung sind, wurde für alle Durchläufe aus einer bestimmten Wasserextraktcharge miteinander kombiniert. Diese endgültigen Pools wurden in Aliquote von 1,5 ml aufgeteilt und bei -80 °C aufbewahrt und als besondere "Charge" von Invaplex 24 oder Invaplex 50 identifiziert.
ELISA unter Verwendung von Wasserextrakt, IpaC und IpaD sowie LPS als Antigene
ELISA-Tests wurden verwendet, um die Mengen der Antikörper gegen verschiedene Antigene in Tierseren zu messen (Oaks et al., 1986, siehe oben; Turbyfill et al., 1998, siehe oben). Zu den verwendeten Antigenen gehören Wasserextrakte von vir-positiven (M90T-W) und vir-negativen (M90T-55) Stämmen von S. flexneri 5, gereinigtes LPS S. flexneri 2a, S, flexneri 5, S. sonnei, S. dysenteriae 1, S. boydii 2 und enteroinvasives E. toll O152 sowie Ovalbumin (Sigma Chemical Co.). Die in den Assays verwendeten Antigenkonzentrationen betrugen 1 μg/Napf (Wasserextrakt und LPS) sowie 0,5 μg/Napf für gereinigtes IpaC und IpaD. Antigene wurden in Carbonat-Beschichtungspuffer (0,2 M Carbonat, pH 9,8) verdünnt und zu Polystyrol-96-Napf-Antigenplatten (Dynex Technologies, Inc., Chantilly, Virginia) gegeben. Dann wurde das Antigen aus den Näpfen entfernt, und dann wurde 2% Casein (2% Casein in einem Tris-Kochsalz-Puffer, pH 7,5) hinzugefügt, um die Platten zu blockieren. Primäre Antikörper wurden in 2% Casein verdünnt und 2 h lang mit dem Antigen inkubiert. Nach 4 Waschvorgängen in PBS (10,75 mM Natriumphosphat, 145 mM NaCl) mit 0,05% Tween 20 wurden die Platten mit kommerziellem Antiimmunglobulin IgG oder IgA (verdünnt 1/500 in Casein, Kirkgaard & Perry, Gaithersburg, MD), das mit Alkalischer Phosphatase konjugiert war, sondiert. Die Konjugate wurden in dem Casein-Verdünnungsmittel verdünnt. Das in allen ELISAs verwendete Substrat war para-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml in 10% Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, mit 0,1 mg/ml MgCl₂ und 0,02% Natriumazid). Die optische Dichte (OD) wurde mit einem ELISA-Plattenlesegerät von Molecular Devices bei 405 nm gemessen.
Elektrophorese und Western-Blots
Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde für die Trennung und Analyse von Shigella-Polypeptiden und Lipopolysaccharid verwendet. Gele für Western-Blots und Coomassieblau-Färbung bestanden aus 13% Acrylamid, das mit N,N'-Diallylweinsäurediamid vernetzt war, während Gele für die Silberfärbung mit Bis(acrylamid) vernetzt wurden. Western-Blots wurden so durchgeführt, wie es zuvor beschrieben wurde (Oaks et al., 1986, siehe oben). Silberfärbung (Tsai und Reeves, 1982, Anal. Biochem. 119, 115-119) wurde verwendet, um LPS in Proben, die vor dem Auftragen auf Gele mit Proteinase K behandelt wurden, anzufärben (Hitchcock und Brown, 1983, J. Bacteriol. 154, 269-277). Zu den Antiseren, die in Western-Blots verwendet wurden, gehörten monoklonale Antikörper gegen IpaB (2F1), IpaC (2G2) und IpaD (16F8) sowie Affenrekonvaleszentenserum, das Antikörper gegen alle Ipa-Proteine und VirG enthält.
Immunogenität von Invaplex 24 und Invaplex 50
Kleine Tiere (Meerschweinchen oder Mäuse) wurden mit Invaplex 24 und Invaplex 50 immunisiert, um die Immunogenität und Sicherheit dieser Strukturen zu bestimmen.
Die Fähigkeit der Invaplex-Fraktionen, eine Immunantwort bei Balb/c-Mäusen zu fördern, wurde in Gruppen von 5 Mäusen getestet. Jede Maus wurde an den Tagen 0, 14 und 28 intranasal mit 5 μg Invaplex 24 oder Invaplex 50 immunisiert. Verdünnungspuffer wurde verwendet, um Kontrolltiere zu immunisieren. Ein Gesamtantigenvolumen von 25 μl wurde in 5 bis 6 kleinen Tröpfchen abgegeben, die mit einer Mikropipette auf die äußeren Nasenlöcher aufgetragen wurden. An den Tagen 0, 21 und 35 wurde von allen Mäusen Blut aus dem Schwanz entnommen.
Meerschweinchen (4 bis 5 pro Gruppe) wurden intranasal mit 25 μg/Dosis von entweder Invaplex 24 oder Invaplex 50 immunisiert. Verdünnungspuffer (0,9% Kochsalzlösung) wurde verwendet, um Kontrolltiere zu immunisieren. Das Antigen wurde mit einer Mikropipette in einem Gesamtvolumen von 50 μl pro Nasenloch auf die äußeren Nasenlöcher aufgetragen. Die Meerschweinchen wurden an den Tagen 0, 14 und 28 immunisiert. Am Tag 0, 28 und 42 sowie 2 Wochen nach der Reizung wurde den Meerschweinchen Blut aus der lateralen Ohrvene entnommen. Vor der intranasalen Immunisierung wurden die Meerschweinchen und Mäuse mit Ketamin/Rompun anästhetisiert.
Reizung von Meerschweinchen, die mit Invaplex 24 oder Invaplex 50 immunisiert sind
Drei Wochen nach der dritten Immunisierung wurden die Meerschweinchen intraokulär mit S. flexneri 5 (M90T-W) (3,6 × 10⁸ cfu), S. flexneri 2a (2457T) (6,0 × 10⁸ cfu), S. sonnei (Mosley) (4,1 × 10⁸ cfu), S. dysenteriae 1 (4,8 × 10⁸ cfu), S. boydii 2 (5,2 × 10⁸ cfu) oder enteroinvasivem Escherichia coli O152 (5,8 × 10⁸ cfu) gereizt. Die Tiere wurden 5 Tage lang täglich hinsichtlich des Auftretens von Keratokonjunktivitis beobachtet. Die Bewertung des Grades der Entzündung und der Keratokonjunktivitis wurde schon früher beschrieben (Hartman et al., 1991, Infect. Immun. 59, 4075-4083).
Beispiel 1
Isolierung und Charakterisierung von Invaplex 24 und Invaplex 50
In Anfangsexperimenten wurde das wasserextrahierte Material mit kontinuierlichen Gradienten von 0 bis 1,0 M NaCl in 20 mM Tris, pH 9,0, von einer FPLC-Ionenaustauschersäule eluiert. Es zeigte sich, dass die Mehrzahl der IpaB- und IpaC-Proteine durchweg in zwei Peaks bei ungefähr 24% Puffer B bzw. 50% Puffer B eluierte (Daten nicht gezeigt). Daher wurden bei allen anschließenden Elutionen Stufengradienten von 24% Puffer B, 50% Puffer B und eine endgültige Waschlösung mit 100% Puffer B verwendet.
Typische Chromatogramme für Wasserextrakte von S. flexneri 5, S. flexneri 2a, 5. sonnei, S, dysenteriae 1, S, boydii 2 und enteroinvasivem E. coli O152, die durch FPLC in die Invasinkomplexpeaks aufgetrennt worden waren, sind in 2 gezeigt. Der Invaplex-24-Peak und der Invaplex-50-Peak sind für jedes Chromatogramm markiert. Peak 0 (0% Puffer B) stellt Protein dar, das nicht an die HiTrapQ-Anionenaustauschersäule gebunden hat. Ein Peak für 100% Puffer B (Peak 100) ist ebenfalls angezeigt. Jede Fraktion wurde durch Immuno-Spot-Blots mit monoklonalen Antikörpern gegen IpaB und IpaC bewertet. Die Fraktionen, die den größten Teil der IpaB- und IpaC-Aktivität enthielten, befanden sich im Invaplex-24- und Invaplex-50-Peak. Dieses FPLC-Profil ist insofern reproduzierbar, als mit denselben Wasserextraktchargen, mit verschiedenen Wasserextraktchargen und mit Wasserextrakten aus allen vier Spezies von Shigella sowie von enteroinvasivem E. coli (siehe 2) identische Ergebnisse erhalten werden. Typische Ausbeuten von Invaplex 24 und Invaplex 50 betragen ungefähr 5 mg bzw. 1 mg pro Liter ursprünglicher Kultur.
Die Übereinstimmung verschiedener FPLC-Durchläufe mit gereinigtem Invaplex 24 oder Invaplex 50 wurde durch Western-Blots und durch silbergefärbte Polyacrylamid-Gele bewertet. Die silbergefärbten Gele bestätigen die Gesamtübereinstimmung jedes FPLC-Durchlaufs. Es war auch möglich zu zeigen, dass dieselbe Antigen-Zusammensetzung (zum Beispiel die Anwesenheit von IpaB, IpaC, IpaD) in Invaplex-24- oder Invaplex-50-Präparaten, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten gereinigt wurden, vorhanden war (Daten nicht gezeigt). Jedes Invaplex-24-Präparat ist identisch, und alle Invaplex-50-Präparate sind es auch.
Invaplex-Präparate von verschiedenen Shigella-Serotypen wurden ebenfalls bewertet und miteinander verglichen, um zu bestimmen, ob die Invaplex-Zusammensetzung von einer Spezies zu einer anderen variierte. 3 ist eine Zusammensetzung von mehreren Western Blots von Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparaten, die mit monoklonalen Antikörpern gegen IpaB, IpaC und IpaD (3) auf verschiedene Antigene sondiert wurden. Die Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparate von S. flexneri 5, S. flexneri 2a, S. sonnei, S. dysenteriae, S. boydii und enteroinvasivem Escherichia coli enthielten allesamt IpaB, IpaC und IpaD. Sowohl Invaplex 24 als auch Invaplex 50 enthielten auch IpaA. Ein Unterschied zwischen den Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparaten besteht darin, dass die Invaplex-24-Proben mehr IpaD enthalten als die Invaplex-50-Präparate (Tabelle 1). Außerdem enthalten die Invaplex-50-Präparate VirG* (eine verkürzte Form des 120-kD-VirG-Proteins). In Invaplex-24-Fraktionen wurde VirG* mit den verwendeten Verfahren nicht nachgewiesen. In den Invaplex-Präparaten sind noch zusätzliche Proteine vorhanden, doch ihre Identität ist nicht bekannt.
Lipopolysaccharid kann durch Silberfärbung von Polyacrylamid-Gelen nachgewiesen werden. Wenn Proben zuerst mit Proteinase K behandelt werden, um alle Proteine zu verdauen, sind nur noch die LPS in den Proben vorhanden. Silbergefärbte Gele mit Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparaten von allen Shigella sp. und enteroinvasivem E. coli vor und nach der Proteinase-K-Behandlung zeigen sowohl bei Invaplex-24- als auch bei Invaplex-50-Proben einen typischen LPS-Kern (eine herausragende Bande am Boden des Gels). Außerdem waren andere LPS-Banden mit allmählich zunehmenden Molekülgrößen (die verschiedene Grade der Biosynthese der O-Seitenketten am Kern darstellen) ebenfalls vorhanden. Ähnliche LPS-Profile waren in Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparaten von S. flexneri, S. boydii, S. dysenteriae und enteroinvasivem E. coli vorhanden. Der LPS-Gehalt von Invaplex 24 von S, sonnei war geringer als der von anderen Invaplex-Präparaten. Invaplex 50 von S. sonnei war ähnlich wie das von anderen Invaplex-50-Präparaten.
Eine Zusammenfassung der verschiedenen antigenischen Proteine und LPS in den Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparaten für jede Spezies sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1A. Zusammenfassung des Antigengehalts in Invaplex-24-Präparaten auf der Basis von Western-Blot-Analyse oder silbergefärbten Polyacrylamid-Gelen
Tabelle 1B. Zusammenfassung des Antigengehalts in Invaplex-50-Präparaten auf der Basis von Western-Blot-Analyse oder silbergefärbten Polyacrylamid-Gelen
Beispiel 2
Immunogenität und Sicherheit von Invaplex 24 und Invaplex 50
Meerschweinchen wurden mit Invaplex 24 und Invaplex 50 immunisiert, um die Immunogenität und Sicherheit dieser Strukturen und der einzelnen Komponenten innerhalb der Invaplex-Präparate zu bestimmen.
Meerschweinchen, die mit Invaplex 24 oder Invaplex 50, der aus jedem der vier Shigella-Spezies oder EIEC hergestellt wurde, immunisiert wurden, reagierten mit erhöhten Serumantikörpern auf mehrere verschiedene Shigella-Antigene (siehe Tabelle 2 und 3). Die Meerschweinchen wurden mit drei 25-μg-Dosen immunisiert, die alle zwei Wochen intranasal verabreicht wurden.
Mit Invaplex 24 immunisierte Meerschweinchen erzeugten nach drei intranasalen Immunisierungen (Tabelle 2A) eine starke IgG-Antwort auf LPS. Nach Immunisierung mit Invaplex 24 wurde auch IgA gegen LPS erzeugt (Tabelle 2B). Im Unterschied zu den anderen Invaplex-24-Präparaten erzeugten mit S.-sonnei-Invaplex-24 immunisierte Tiere einen minimalen Titer gegen LPS. Dies stützt Daten, die darauf hinweisen, dass der Invaplex 24 von S. sonnei weniger LPS aufweist als Invaplex-24-Präparate von anderen Shigella-Spezies. Auch so erzeugten die mit S.-sonnei-Invaplex-24 immunisierten Tiere bei Reizung mit virulentem S. sonnei eine starke IgG- und IgA-Reaktion auf LPS, was darauf hinweist, dass das Immunsystem durch Impfung mit Invaplex 24 auf eine Anti-LPS-Immunantwort vorbereitet wurde.
Invaplex-24-Präparate stimulierten eine starke Reaktion gegenüber dem virpositiven Wasserextraktantigen und nur eine minimale Reaktion gegenüber dem vir-negativen Wasserextraktantigen (Tabelle 2C und 2D). Dies ist sehr ähnlich der virulentspezifischen Immunantwort, die bei Menschen oder Affen nach Infektion mit Shigellen erzeugt wird. Invaplex-24-Präparate von allen getesteten Shigella-Spezies stimulierten bei Meerschweinchen eine Serum-IgG-Antwort. Nach der Reizung zeigten die Tiere alle eine enorme Verstärkung der Mengen der Antikörper gegen den Wasserextrakt, was auf eine erfolgreiche Aktivierung durch den Invaplex-24-Impfstoff hinweist. Die Verstärkung der Mengen der Antikörper war viel größer als bei Kontrolltieren, die mit Puffer behandelt und dann mit Shigellen gereizt wurden.
Seren von Meerschweinchen, die mit Invaplex 24 immunisiert wurden, wurden ebenfalls hinsichtlich Antikörpern gegen die zur Impfung verwendeten homologen Invaplex-24- und Invaplex-50-Antigene gemessen. Wenn eine Gruppe von Tieren mit S. flexneri Invaplex 24 immunisiert wurde, wurden also ELISAs unter Verwendung von S.-f/exneri-Invaplex-24 und S.-flexneri-Invaplex-50 durchgeführt (siehe Tabellen 2E und 2F). Wie erwartet, reagierten die Meerschweinchen, indem sie Antikörper gegen das immunisierende Invaplex-Antigen erzeugten. In den meisten Gruppen waren die Antikörpermengen für das gleiche Invaplex-24-Antigen größer als für das Invaplex-50-Antigen, das aus demselben Shigella-Serotyp hergestellt wurde. Dies liefert einen weiteren Beweis dafür, dass das Invaplex-24- und das Invaplex-50-Präparat nicht identisch sind. Wie wir bereits sahen, erzeugten die mit S.-sonnei-Invaplex-24 immunisierten Tiere nach 3 Immunisierungen keine großen Mengen an Antikörper, aber nach Reizung mit virulentem S. sonnei waren sie in der Lage, eine eindrucksvolle Gedächtnisreaktion zu zeigen, was wiederum darauf hinweist, dass der Invaplex-Impfstoff einen starken Reiz für das Immunsystem liefert.
Meerschweinchen, die mit Invaplex 50 immunisiert wurden, zeigten starke Antikörperreaktionen gegen Wasserextraktantigene (sowohl vir-positive als auch vir-negative) und LPS (Tabellen 3A-3F). Die durch Invaplex-50-Impfstoffe hervorgerufenen LPS-Reaktionen (Tabelle 3A und 3B) schienen mit denjenigen, die vom Invaplex-24-Impfstoff erzeugt wurden, vergleichbar zu sein. Jede Gruppe (außer dem S.-dysenteriae-Invaplex-50) erzeugte nach 3 Dosen Anti-LPS-IgG- und -IgA-Antikörper. Interessanterweise erzeugten Tiere, die mit dem S.-sonnei-Invaplex 50 oder dem EIEC-Invaplex-50 immunisiert wurden, schon nach nur zwei Immunisierungsdosen nachweisbares IgG und IgA gegen LPS. Meerschweinchen, die mit dem S.-dysenteriae-Invaplex-50 immunisiert wurden, erzeugten minimale Mengen von Antikörpern gegen LPS, doch nach Reizung erzeugten diese Tiere keine drastische Erhöhung der Anti-LPS-IgG, was darauf hinweist, dass der Invaplex-50-Impfstoff das Immunsystem dieser Tiere erfolgreich aktivierte.
Invaplex 50 rief bei allen Präparaten von den verschiedenen Shigella-Spezies und EIEC eine starke Serum-IgG-Antwort hervor, die gegenüber dem Wasserextraktantigen reaktiv war (Tabellen 3C und 3D). Messbare IgG-Antikörper waren in jeder Invaplex-50-Gruppe nach zwei Impfstoffdosen vorhanden. Dies ist etwas besser, als man es bei den Invaplex-24-Impfstoffen beobachtet. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass die Invaplex-50-Impfstoffe Antikörper stimulierten, die gegenüber dem Wasserextrakt von vir-negativen Shigellen reaktiv waren. Dies ist sehr wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass Antikörper gegen nicht plasmidcodierte Proteine erzeugt werden, die sich im Invaplex-50-Impfstoff befinden und sich nicht oder nur in geringen Konzentrationen im Invaplex-24-Impfstoff befinden. Wenn die Seren von mit Invaplex 50 immunisierten Tieren durch Western Blots analysiert werden, ist auch so klar, dass Antikörper gegen IpaC und IpaB vorhanden sind. Auch wenn die vom Invaplex-50-Impfstoff hervorgerufene Immunantwort im Wasserextrakt-ELISA nicht virulentspezifisch zu sein scheint (wie diejenige, die man bei Invaplex 24 oder einer natürlichen Infektion beobachtet), stimuliert sie also die Produktion von Antikörpern gegen Virulenzproteine.
Seren von den mit Invaplex 50 immunisierten Tieren wurden ebenfalls in ELISAs getestet, wobei man Invaplex 50 oder Invaplex 24 als ELISA-Antigen verwendete (Tabelle 3E und 3F). Wie man anhand des Invaplex-24-Impfstoffs erkennt, erzeugten mit Invaplex 50 immunisierte Tiere große Mengen an IgG-Antikörpern, die gegenüber dem immunisierenden Invaplex-50-Antigen reaktiv waren. Bei allen Serotypen wurden Antikörper nach nur zwei Dosen nachgewiesen. Außerdem wurde eine positive Reaktion gegen das Invaplex-24-Antigen gefunden, aber meistens waren die Antikörpermengen geringer als diejenigen, die mit dem Invaplex-50-Antigen gemessen wurden. Wiederum ist dies ein Beweis dafür, dass Invaplex 50 und Invaplex 24 verschiedene Antigene enthalten und Antikörper mit etwas unterschiedlichen Spezifitäten stimulieren.
Bei allen Experimenten mit Meerschweinchen erzeugten Kontrolltiere, die mit Puffer-Verdünnungsmittel immunisiert wurden, keine Antikörper gegen eines der getesteten Shigella-Antigene. Nach Reizung erzeugten diese Tiere viel geringere Mengen an Antikörpern als diejenigen Tiere, die mit Invaplex-24- oder Invaplex-50-Impfstoff immunisiert wurden.
Beispiel 3
Impfung mit Invaplex 24 und Invaplex 50 und Reizung von Tieren mit virulenten Shigellen
Eine ausgeprägte Serum-IgA- und -IgG-Antwort wurde bei Meerschweinchen erzeugt, die mit dem Invaplex-24- und Invaplex-50-Präparat immunisiert wurden. Ein minimaler Titer wurde nach 2 Immunisierungen erzeugt, aber ein stärker ausgeprägter Titer wird mit 3 Immunisierungen erreicht, insbesondere mit Invaplex 50 (Tabelle 2 und 3). Antikörper wurden mit ELISAs nachgewiesen, wobei man entweder vir-positive oder vir-negative Wasserextraktantigene oder gereinigtes LPS verwendete. Ebenfalls von Interesse war die erhebliche Verstärkung der Antikörperspiegel, die immunisierte Tiere nach Reizung mit virulenten Shigellen aufwiesen. Diese Verstärkung des Titers weist darauf hin, dass die Invaplex-Impfstoffe das mukosale Immunsystem erfolgreich aktivierten. Kontrolltiere, die mit Puffer behandelt und dann gereizt wurden, zeigten eine viel geringere Antikörperreaktion nach Infektion mit Shigellen, die zu einer voll ausgeprägten Keratokonjunktivitis führte.
Unter Verwendung des Meerschweinchen-Keratokonjunktivitis-Modells war es möglich, Krankheit bei Meerschweinchen, die intranasal entweder mit Invaplex 24 oder mit Invaplex 50 immunisiert wurden, zu verhindern (siehe unten Tabelle 4). Ein homologer Schutz war bei den Invaplex-Präparaten zu beobachten, die von S. flexneri 2a, S. flexneri 5, S. sonnei, S. boydii und enteroinvasivem E. coli hergestellt wurden. Im Falle von S. dysenteriae wurde mit Invaplex 24 ein guter Schutz beobachtet, während der S.-dysenteriae-Invaplex-50 nur ein geringes Schutzniveau aufwies.
Das Niveau des Schutzes vor Krankheit bei Invaplex-immunisierten Meerschweinchen ist mit demjenigen vergleichbar, der von vorhandenen experimentellen Shigella-Impfstoffen, die Phase-I- und Phase-II-Tests unterzogen werden, erzeugt wird. Die Immunisierung mit einem der beiden Invaplex-Präparate verursachte keine sichtbare Belastung bei den Tieren.
Tabelle 4. Schutz im Meerschweinchen-Keratokonjunktivitis-Modell unter Verwendung von Invaplex-24- oder Invaplex-50-Impfstoff, der aus virulentem Shigella oder enteroinvasivem E. coli hergestellt wurde

1. Meerschweinchen wurden dreimal intranasal mit 25 μg des Invaplex-Präparats pro Dosis immunisiert. Die Tiere wurden an den Tagen 0, 14 und 28 immunisiert und am Tag 49 gereizt.
2. Die Tiere wurden mit 3 – 6 × 10⁸ cfu des Reizmittels infiziert, bei dem es sich um denselben Stamm handelte, der auch verwendet wurde, um den Invaplex-Impfstoff herzustellen.
3. Die Tiere wurden als positiv in Bezug auf die Krankheit angesehen, wenn sie auf der Basis der von Hartman et al. (IAI 59: 4075, 1991) entwickelten Skala eine Bewertung von 2+ oder 3+ bekamen (schwere Keratokonjunktivitis mit Eiterbildung oder Keratokonjunktivitis ohne Eiterbildung). Die "Zahl der positiven/Gesamtzahl" bezieht sich auf die Zahl der Augen mit Krankheit, geteilt durch die Gesamtzahl der gereizten Augen.
4. Kontrolltiere, die mit enteroinvasivem E. coli infiziert wurden, wiesen keine schweren (3+) Krankheitsgrade auf. Die immunisierten Tiere zeigten keinerlei Anzeichen einer Krankheit.

Beispiel 4
Dosis-Wirkungs-Experimente mit dem Invaplex-24-und dem Invaplex-50-Impfstoff
Experimente wurden durchgeführt, um die Immunogenität des S.-flexnei-2a-Invaplex-24- und -Invaplex-50-Impfstoffs zu bestimmen. Meerschweinchen (4 pro Gruppe) wurden entweder mit 0, 5, 10, 25, 50 oder 100 μg Invaplex pro Dosis immunisiert. Jedes Tier wurde dreimal im Abstand von zwei Wochen intranasal immunisiert. Mehrere verschiedene ELISAs wurden verwendet, um die als Reaktion auf die verschiedenen Invaplex-Dosen erzeugte Antikörperreaktion zu messen (4). Gegen LPS waren mit zunehmenden Invaplex-Dosen allmählich höhere Mengen von Anti-LPS-IgG vorhanden (4A). Der Invaplex-24-Impfstoff erzeugte etwas höhere Anti-LPS-Mengen als der Invaplex-50-Impfstoff. Bei einer Dosis von 100 μg ist eine positive Anti-LPS-Reaktion nach zwei Dosen Impfstoff vorhanden. Bei niedrigeren Dosen ist eine positive Anti-LPS-Reaktion erst nach drei Immunisierungen nachweisbar.
Höhere Mengen von Antikörpern, die gegenüber dem Wasserextrakt reaktiv sind, waren bei den Tieren zu sehen, die höhere Dosen von Invaplex erhielten ( 4, mittleres und unteres Bild). Antikörper gegen das Wasserextraktantigen wurden jedoch in der Gruppe mit der niedrigsten Dosis (5 μg) nach 3 Immunisierungen nachgewiesen. Positive Antikörperreaktionen gegen den vir-positiven Wasserextrakt waren für Invaplex 24 bei allen Dosisgruppen nach nur 2 Dosen zu sehen, während bei Invaplex 50 eine positive Antikörperreaktion nach 2 Dosen bei Tieren zu sehen war, die mit 25 μg des obigen Invaplex immunisiert wurden. Wie oben erwähnt, erzeugte Invaplex 24 in allen Dosen eine verblüffende virulenzspezifische Antikörperreaktion; während Invaplex 50 Antikörper erzeugte, die sowohl gegenüber vir-positiven als auch vir-negativen Wasserextraktantigenen reaktiv waren. Die Invaplex-50-Reaktion trat bei allen Dosen auf.
Die starke Immunreaktion bei Meerschweinchen, die mit 5 bis 100 μg entweder Invaplex 24 oder Invaplex 50 immunisiert wurden, war ausreichend, um Meerschweinchen im Sereny-Test nach Reizung mit virulentem S. flexneri 2a zu schützen. Das Schutzniveau betrug wenigstens 80% für jede Gruppe im Vergleich zu mit Kochsalzpuffer behandelten Kontrolltieren, bei denen alle Tiere eine Krankheit entwickelten (0% Schutz).
Beispiel 5
Sicherheit und Nebenwirkungen von Invaplex 24 und Invaplex 50
Tiere (Meerschweinchen oder Mäuse), die intranasal mit Invaplex 24 oder Invaplex 50 immunisiert wurden, zeigten nach der Immunisierung keine sichtbaren Nebenwirkungen (zerzaustes Fell, Lethargie, Diarrhöe). Bei Mäusen wurde diese fehlende Toxizität bei Dosen von 5 und 10 μg beobachtet, und bei Meerschweinchen war die fehlende Toxizität bei Dosen im Bereich von 5 μg bis 100 μg zu sehen. Außerdem nahmen Meerschweinchen, die entweder mit Invaplex 24 oder mit Invaplex 50 immunisiert wurden, mit vergleichbarer Geschwindigkeit an Gewicht zu wie Meerschweinchen, die mit normaler Kochsalzlösung behandelt wurden. Dies weist darauf hin, dass die Wasseraufnahme und Nahrungsaufnahme bei diesen Tieren normal war. Eine Gewichtszunahme wurde bei Mäusen nicht gemessen, aber es gab keine offensichtlich fehlende Gewichtszunahme bei Mäusen, die mit dem Invaplex-24- oder Invaplex-50-Präparat immunisiert wurden.
Beispiel 6
Weitere Reinigung von Invaplex 24 und Invaplex 50 durch Gelfiltrationschromatographie
Gelfiltrationschromatographie wurde verwendet, um den aus Fraktionen der Ionenaustausch-Chromatographie isolierten Invaplex weiter zu reinigen. Invaplex-Proben wurden auf eine Superose-6-HR10/30-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgetragen, die mit 20 mM Tris-HCl (pH 9), das 0,24 M NaCl (bei Invaplex-24-Trennungen) oder 0,5 M NaCl (bei Invaplex-50-Trennungen) enthielt, äquilibriert wurde. Fraktionen (0,5 ml) wurden isoliert und auf die Anwesenheit von IpaB, IpaC und LPS analysiert, wobei Immuno-Spot-Blots, Western-Blots oder silbergefärbte Polyacrylamid-Gele verwendet wurden. Die Säule wurde mit Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht standardisiert.
Für Invaplex 24 wurde ein großer Komplex (größer als MW 670 000) gefunden, der LPS, IpaB und IpaC enthielt. Die Fraktionen, die diesen Komplex mit dem großen Molekulargewicht enthielten, wurden von Fraktionen, die kleinere Proteine enthielten, abgetrennt. Für Invaplex 50 wurde ebenfalls ein großer Komplex (größer als MW 670 000) gefunden, der LPS, IpaB und IpaC enthielt. Die Fraktionen, die diesen Komplex mit dem großen Molekulargewicht enthielten, wurden von Fraktionen, die kleinere Proteine enthielten, abgetrennt.
Diskussion
Shigellose ist eine führende Ursache von Diarrhöeerkrankungen beim Menschen. Jedes Jahr treten Millionen von Fällen auf, insbesondere in Entwicklungsländern, und es wird geschätzt, dass über 1 Million Fälle zum Tod führen (Kotloff et al., 1999, Bull. WHO 77, 651-666). Das ständige Auftreten von Antibiotika-Resistenz bei Shigella, auch gegen die neuesten Antibiotika, unterstreicht die Notwendigkeit eines effektiven Impfstoffs, um die Bekämpfung der Shigella-Krankheit zu unterstützen. Unglücklicherweise müssen Impfstoffstrategien die Notwendigkeit eines Schutzes vor 4 Shigella-Spezies (S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae und S. boydii) sowie enteroinvasivem E. coli in Betracht ziehen, da Kreuzschutz nicht bedeutsam ist. Dieses Problem wird dadurch verkompliziert, dass es über 45 verschiedene Serotypen gibt und der Grad der schützenden Kreuzreaktionen zwischen diesen Serotypen nicht bekannt ist. Die derzeitigen Impfstoffstrategien beinhalten abgeschwächte Lebendimpfstoffe (Coster et al., 1999, Infect. Immun. 67, 3437-3443) und auch die Abgabe von Shigella-LPS oder O-Polysacchariden zusammen mit Trägern, wie Proteosomen (Orr et al., 1993, Infect. Immun. 61, 2390-2395) oder Proteinträgern, wie Tetanustoxoid (Polotsky et al., 1994, Infect. Immun. 62, 210-214).
Die schützende Immunantwort, die notwendig ist, um zukünftige Shigella-Infektionen zu verhindern, wird nicht vollständig verstanden. Bei natürlichen Infektionen erzeugt das Immunsystem Antikörper gegen LPS und gegen mehrere Virulenzproteine einschließlich IpaC, IpaB und in geringerer Häufigkeit IpaD, IpaA und VirG. Neuere Studien haben darauf hingewiesen, dass die Shigella-Virulenzproteine oder Invasine tatsächlich in einem Komplex miteinander assoziiert sind, und es wird die Hypothese aufgestellt, dass dieser Komplex die funktionelle Einheit ist, die an dem Invasionsereignis beteiligt ist (Menard et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1254-1258). Es ist nicht bekannt, ob der Invasinkomplex vom Immunsystem als intakte Struktur erkannt wird, aber wenn, dann ist es sehr wahrscheinlich, dass Invasin-Komplex-Antikörper auftreten können. Solche Antikörper könnten eine Rolle beim Neutralisieren von invasiven Shigellen spielen.
Neuere Studien haben darauf hingewiesen, dass die Shigella-Invasine, insbesondere IpaB und IpaC, in verbrauchtem Kulturmedium miteinander assoziiert sind und dass dieser IpaB:IpaC-Komplex an der Wechselwirkung mit Wirtszellmem branen, die schließlich zur Phagozytose des Bakteriums führt, beteiligt sein kann (Menard et al., 1996, siehe oben). Es ist nicht klar, ob der in Kulturmedium gefundene IpaB:IpaC-Komplex tatsächlich die aktive Struktur ist, die am Invasionsereignis beteiligt ist. Es ist wahrscheinlicher, dass der aktive Komplex auf der Oberfläche der Shigellen vorkommt und bei Einwirkung des richtigen Reizes, wie große Nähe einer Wirtszelle oder Nachweis einer Wirtszellenbiochemikalie, die darauf hinweist, dass eine Wirtszelle in der Nähe ist, aktiviert und freigesetzt wird. In dieser Studie wurde ein neues Verfahren entwickelt, um eine makromolekulare Struktur zu isolieren, die die hauptsächlichen bekannten Virulenzfaktoren und Immunogene aus intakten, lebensfähigen, virulenten Shigellen enthält. Diese Struktur wird Invasinkomplex oder "Invaplex" genannt und enthält die Invasine (Ipa-Proteine) und LPS. Zwei Formen des Invaplexes wurden durch FPLC-Ionenaustausch-Chromatographie isoliert. Es sind das Invaplex-24- und das Invaplex-50-Präparat. Sowohl Invaplex 24 als auch Invaplex 50 enthalten IpaB, IpaC, IpaD, IpaA und LPS. VirG*, eine verkürzte Form von VirG, findet sich nur in Invaplex 50. Invaplex 24 und Invaplex 50 wurden aus allen vier Shigella-Spezies und auch aus EIEC isoliert. Invaplex 24 oder Invaplex 50, die jeweils von den Spezies abgeleitet sind, sind ähnlich in Bezug auf den Ipa-Proteingehalt und LPS-Gehalt. Die Übereinstimmung von einem Durchlauf zum nächsten ist sehr hoch, so dass die Herstellung von Invaplex ein reproduzierbares Verfahren ist.
Die Verfügbarkeit eines von Shigellen abgeleiteten Untereinheitpräparats, das die hauptsächlichen Antigene und Virulenzfaktoren enthält, ergibt ein Reagens, das für die Messung der Immunreaktion auf eine intakte Virulenzstruktur verwendet werden könnte, und ergibt auch einen neuen Untereinheit-Ansatz für Shigella-Impfstoffe.
Unsere Studien weisen darauf hin, dass sowohl Invaplex 24 als auch Invaplex 50 bei Mäusen und Meerschweinchen sehr immunogen sind. Intranasale Immunisierungen ohne irgendein zusätzliches Adjuvans stimulierten sowohl eine IgA- als auch eine IgG-Antwort auf LPS und auf Antigene im Wasserextrakt-ELISA- Antigen. Dieses umfasst IpaC, IpaB und andere Virulenzproteine. Interessanterweise erzeugte Invaplex 24 eine virulentspezifische Antikörperreaktion, die sehr ähnlich derjenigen ist, die bei mit Shigella sp. infizierten Affen oder Menschen entsteht (Oaks et al., 1986, Infect. Immun. 53, 57-63). Invaplex 50 stimulierte eine Serumantikörperreaktion, die nicht virulentspezifisch war (gemessen anhand des Wasserextrakt-ELISA). Dies weist darauf hin, dass sich im Invaplex 50 nichtplasmidcodierte Antigene befinden und eine Antikörperreaktion stimulieren können. Auch so stimulieren Invaplex-50-Präparate Antikörper gegen Virulenzproteine, wie IpaC und IpaB, was durch eine Western-Blot-Analyse von Immunseren bestimmt wurde. Invaplex-Präparate von allen Spezies von Shigella konnten eine durch ELISA gemessene Antikörperreaktion auf den homologen immunisierenden Invaplex stimulieren. Mit Invaplex 24 immunisierte Tiere hatten stets höhere Mengen von Antikörpern gegen das immunisierende Antigen (d.h. Invaplex 24) als gegen das analoge (d.h. von demselben Shigella-Serotyp) Invaplex-50-Antigen. In der umgekehrten Situation hatten Invaplex-50-Tiere größere Mengen von Antikörpern gegen das immunisierende Invaplex-50-Antigen als gegen das analoge (d.h. von demselben Shigella-Serotyp) Invaplex-24-Antigen. Diese Ergebnisse sind ein guter Beweis dafür, dass Invaplex 24 und Invaplex 50 einzigartige Antigene enthalten oder möglicherweise Antigene in einer einzigartigen Weise präsentieren, was zu einer vorherrschenden Immunantwort gegen das immunisierende Invaplex führt. Die hervorgerufene einzigartige Immunantwort gegen die beiden Invaplex-Präparate kann teilweise darauf zurückzuführen sein, dass VirG* nur in den Invaplex-50-Präparaten vorhanden ist.
Starke Immunantworten wurden mit kleinen Invaplex-Mengen erreicht. Bei Mäusen konnten 5 oder 10 μg und bei Meerschweinchen 25 μg nach 3 intranasalen Immunisierungen messbare Antikörperkonzentrationen erzeugen. In Dosis-Wirkungs-Experimenten unter Verwendung von S.-flexneri-2a-Invaplex-24 und -Invaplex-50 war es möglich, eine messbare Antikörperreaktion auf LPS, Wasserextrakt oder Invaplex mit drei 5-μg-Dosen Impfstoff zu stimulieren. Höhere Dosen (25, 50 und 100 μg) erzeugten nach 2 intranasalen Dosen eine positive Antikörperreaktion. In allen Fällen zeigten mit Invaplex 24 oder Invaplex 50 immunisierte Tiere bei Reizung mit virulenten Shigellen des gleichen Serotyps wie der Invaplex-Impfstoff eine drastische Zunahme der Antikörpermengen. Diese schnelle Erhöhung des Titers (Blut wurde eine Woche nach der Reizung aufgefangen) ist ein Ergebnis der effektiven Aktivierung des Immunsystems durch die Invaplex-Impfstoffe.
Die Abgabe von Impfstoffen über den mukosalen Weg (intranasal, oral usw.) ist schwierig und nicht sehr effektiv, außer wenn geeignete mukosale Adjuvantien verwendet werden. Die starke Immunantwort, die durch die Invaplex-Präparate und die bekannte Kapazität der Ipa-Proteine zur Wechselwirkung mit Wirtszellen erzeugt wird, lässt vermuten, dass der Invaplex in der Lage sein könnte, die Immunantwort auf gleichzeitig verabreichte Antigene zu verstärken, etwa so wie Choleratoxin. Das beste mukosale Adjuvans ist Choleratoxin insofern, als es eine ausgeprägte IgA-Antwort in Sekretionen und Blut sowie eine Serum-IgG-Antwort verstärkt. Bei Mäusen wurde festgestellt, dass der zugrundeliegende Immunmechanismus, der durch das Choleratoxin als Adjuvans stimuliert wird, auf einer T-Helfer-2-(Th2)-Antwort beruht. Diese ist durch erhöhte Mengen der Cytokine IL4 und IL5 gekennzeichnet, die durch aktivierte T-Zellen freigesetzt werden. Dies führt zu erhöhten Mengen an sekretorischem und Serum-IgA. Eine Wirkung von IL4 besteht darin, dass es eine IgG1-Antwort (bei Mäusen) auf das immunisierende Antigen fördert. Bei Mäusen, die mit einem CT-Ovalbumin-Gemisch immunisiert werden, ist die vorherrschende Immunglobulin-G-Subklasse zum Beispiel IgG1, wobei geringe Mengen an IgG2b gegen Ovalbumin ebenfalls hergestellt werden (Marinaro et al., 1995, siehe oben). IgG2a und IgG3 werden nach intranasaler Immunisierung nicht von CT/Ovalbumin stimuliert. Um die Adjuvanswirkung von Invaplex 24 und Invaplex 50 zu bestimmen, wurden Gemische von Ovalbumin und Invaplex Mäusen intranasal verabreicht. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich sowohl Invaplex 24 als auch Invaplex 50 insofern als Adjuvantien verhalten, als sie die Immunantwort auf eine ansonsten nichtimmunogene Substanz (d.h. Ovalbumin) verstärkten. Die durch Ovalbumin/Invaplex-Gemische erzeugte Antikörperreaktion auf Ovalbumin war mit der von mit CT gemischtem Ovalbumin, eines bekannten mukosalen Adjuvans, vergleichbar. Weiterhin zeigte eine IgG-Unterklassen-Analyse der Anti-Ovalbumin-IgG-Antwort, dass die vorwiegend erzeugte IgG-Unterklasse IgG1 war, was auf eine Th2-Antwort hinweist. Die durch Invaplex/Ovalbumin-Gemische hervorgerufene IgG-Unterklassen-Antwort war fast identisch mit der als Antwort auf CT/Ovalbumin-Gemische erzeugten. Ein zusätzliches Merkmal von Th2-Antworten sind erhöhte IgA-Mengen (Marinaro et al., 1995, siehe oben) als Ergebnis von erhöhten Mengen an Il-5. IgA-Mengen waren bei mit Invaplex immunisierten Tieren herausragend, und weiterhin sind mit Invaplex immunisierte Tiere vor einer Reizung im Keratokonjunktivitis-Assay, die eine mukosale Reizung ist, geschützt.

Claims

Impfstoff zum Schutz vor einer Infektion mit Gram-negativen Bakterien, wobei der Impfstoff einen Komplex aus einem Lipopolysaccharid und einem Invasin-Protein (Invaplex) von den Bakterien in einer effektiven Menge, um bei einem Impfling schützende Antikörper gegen die Gramnegativen Bakterien zu erzeugen, und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel umfasst.
Impfstoff zum Schutz vor einer Infektion mit Gram-negativen Bakterien gemäß Anspruch 1, wobei die Bakterien aus den Gattungen ausgewählt sind, die aus Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia, Rickettsia, Brucella, Ehrlichiae, Edwardsiella, Campylobacter, Legionella und Neisseria bestehen.
Impfstoff zum Schutz vor Gram-negativen Bakterien gemäß Anspruch 1, wobei die Verabreichung des Impfstoffs aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus oraler, genitaler, subkutaner, intradermaler oder intramuskulärer, intranasaler und transdermaler Verabreichung besteht.
Verwendung eines Antikörpers, der an ein einziges Antigen eines Komplexes aus einem Lipopolysaccharid und einem Invasin-Protein (Invaplex) von Gram-negativen Bakterien bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Reduktion von Symptomen der Infektion durch die Gramnegativen Bakterien.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens einen Komplex aus einem Lipopolysaccharid und einem Invasin-Protein (Invaplex) von Gramnegativen Bakterien sowie eine pharmazeutisch annehmbare Trägersubstanz umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein heterologes Antigen umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die eine Dosis umfasst, die 1 ng bis 10 mg des Komplexes (Invaplex) enthält.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die eine Dosis umfasst, die 100 ng bis 500 μg des Komplexes (Invaplex) enthält.
Kit, der einen Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 in einem Behälter umfasst, wobei der Kit für die Verabreichung des Impfstoffs oder der Zusammensetzung an einen Patienten zum Schutz vor einer Infektion durch Gram-negative Bakterien oder zur Behandlung von dadurch verursachten Zuständen geeignet ist.
Verwendung eines Komplexes aus einem Lipopolysaccharid und einem Invasin-Protein (Invaplex) von Gram-negativen Bakterien bei der Herstellung eines Impfstoffs zur prophylaktischen oder therapeutischen Verwendung bei der Erzeugung einer Immunantwort bei einem Impfling mit einer Infektion durch Gram-negative Bakterien.
Mehrwertiger Impfstoff, der mehr als einen Komplex aus einem Lipopolysaccharid und einem Invasin-Protein (Invaplex) von Gram-negativen Bakterien umfasst, die aus den Gattungen ausgewählt sind, die aus Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia, Rickettsia, Brucella, Ehrlichiae, Edwardsiella, Campylobacter, Legionella und Neisseria bestehen.