Hintergrund der Erfindung
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Kokzidiose ist eine Krankheit, die durch Infektion mit
einer oder mehreren Arten von Kokzidien, einer Unterabteilung
des Stammes der Protozoen, verursacht wird. Die Kokzidien sind
intrazellulare Parasiten, die eine Vielzahl von Wirten
infizieren können und zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in der
Schaf-, Ziegen-, Rinder-, Schweine- und Geflügelindustrie
führen können. In der Tat hat aus der Infektion mit Eimeria-Arten
resultierende Kokzidiose verheerende wirtschaftliche Verluste
in der Geflügelindustrie verursacht. Unter Hausvögeln sind
Hühner am empfänglichsten für wirtschaftliche Verluste durch
Kokzidiose, obwohl Verluste auch bei Truthähnen, Gänsen, Enten und
Perlhühnern auftreten können. Kokzidiose verursacht auch schwere
Verluste bei in Gefangenschaft gezogenen Fasanen und Wachteln.
Kokzidiose kann akut auftreten und durch eine verheerende
Mortalität des Bestandes gekennzeichnet sein, oder die Krankheit
kann chronisch verlaufen und durch einen Mangel an
Gewichtszunahme gekennzeichnet sein.
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Geflügel wird durch Kokzidiose nach Aufnahme des
vegetativen Stadiums des Parasiten, von sporulierten Oozysten,
infiziert. Das infektiöse Stadium, der Sporozoit, wird in den
Eingeweiden freigesetzt, wo er schnell in Epithelzellen eindringt und
danach mehrere Generationen lang intrazellularer
geschlechtsloser Vermehrung unterliegt, bevor er in das Stadium der sexuellen
Differenzierung eintritt, die zur Erzeugung von Oozysten führt,
welche mit den Ausscheidungen abgegeben werden. Geringe
Infektionsgrade mit beliebigen Eimeria-Spezien (spp.) führen zu einer
schützenden Immunität gegen Neuinfektion. Dies läßt vermuten, daß
Kokzidiose durch die Verwendung von Lebendimpfstoffen kontrolliert
werden kann. Die Entwicklung von effektiven Impfstoffen wurde
durch den komplexen Lebenszyklus von Eimeria gebremst sowie durch
die Tatsache, daß postinfektiöse Immunität im allgemeinen
artspezifisch ist (Long und Rose, Worlds Poultry Sci. J. 38, 85-96, 1982).
Es wurde gezeigt, daß die Infektion bis zur Entwicklung der
geschlechtslosen Stufen fortschreiten muß, bevor eine Immunität
induziert wird. Demnach sind die immunisierenden Antigene für
wenigstens einige Spezies wahrscheinlich in den geschlechtslosen
Stufen enthalten (Rose und Hesketh, Parasitology 73, 25-37, 1976).
Das Sporozoitenstadium scheint jedoch wenig immunisierende
Wirkung zu haben (M.E. Rose, 1982, Biology of the Coccidia, P.L.
Long, Hrsg., University Park Press, Baltimore, S. 329, 1982).
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Bisherige Versuche, Hühner mit nicht lebensfähigen Eimeria-
Komponenten zu immunisieren, blieben erfolglos. Parenteral
verabreichte lösliche Eimeria-Antigene konnten die anschließende
Herausforderung mit infektiösen Sporozoiten nicht reduzieren (Long
und Rose, Exp. Parasitology 16, 1-7, 1965). Dagegen wurden
löslich gemachte Sporozoit-Antigene von E. tenella verwandt, um
Hühner gegen eine Herausforderung durch E. tenella zu schützen,
Schenkel et al., EP-A-0 135 712, und löslich gemachte Merozoit-
Antigene wurden als möglicher Impfstoff angesehen, Schenkel et
al., EP-A-0 135 073.
Zusammenfassung der Erfindung
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Extrakte wurden durch Vermahlen von sporulierten Oozysten
von E. acervulina und anschließendem Gefrieren und Auftauen sowie
Beschallen der überstehenden Flüssigkeit hergestellt. Der
Sporozoitenextrakt wird durch Gefrieren und Auftauen sowie Beschallen
von mit DE-52-Anionenaustausch gereinigten Sporozoiten hergestellt.
Die Sporozoitenextrakte enthalten Polypeptide, die eine Antwort
durch spezifische Antikörper induzieren. Von diesen Polypeptiden
sind 20 immunodominant, das heißt die Polypeptide mit einem
Molekulargewicht von 20, 21,5, 22,5, 23, 24, 26, 26,5, 27, 29, 31,
34, 37, 41,5, 45, 59, 65, 68, 74, 84 und 115 kD. Mit diesen
Polypeptiden reaktive antikörperhaltige Seren neutralisieren die
Infektiosität von Sporozoiten in nicht immunisierten
herausgeforderten Hühnern. Eines oder mehrere dieser Polypeptide können als
Immunogen für die prophylaktische Immunisierung gegen durch eine
virulente Infektion mit E. acervulina, E. tenella oder E. maxima
verursachte virulente Infektion verwandt werden.
Ziele der Erfindung
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Entsprechend ist es Ziel der Erfindung, einen Extrakt von
E. acervulina bereitzustellen, der Immunogene enthält, welche
eine schützende Immunität gegen Kokzidiose induziert. Ein
weiteres
Ziel ist die Bereitstellung von immunogenen Polypeptiden
des Typs, der normalerweise an der Oberfläche oder innerhalb
intakter Oozysten oder Sporozoiten lokalisiert ist. Ein weiteres
Ziel ist die Bereitstellung von Mitteln zum Erhalt solcher
immunogener Extrakte. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung von
Zusammensetzungen für die prophylaktische Verabreichung dieser
Immunogene. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines
Impfstoffes gegen Kokzidiose, der gegen die Formen von Eimeria schützt,
die hauptsächlich für wirtschaftliche Verluste verantwortlich ist.
Diese und andere Ziele der Erfindung erschließen sich aus der
folgenden Beschreibung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft einen Kokzidioseimpfstoff auf
Basis von Parasitenextrakten und einem oder mehreren immunogenen
Polypeptiden, die normalerweise an der Oberfläche intakter
Sporozoiten und in sporulierten Oozysten gefunden werden. Die
Erfindung betrifft ferner die immunogenen Polypeptide selbst und
Verfahren zum Erhalt von Extrakten oder immunogenen Polypeptiden
sowie deren Verwendung bei der Herstellung eines gegen Kokzidiose
wirksamen Impfstoffs.
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Parasitenextrakte mit immunogenen Polypeptiden werden (1)
aus sporulierten Oozysten und/oder (2) aus Sporozoiten erhalten.
Oozysten werden durch physikalisches Aufbrechen von
Fäkalmaterialien von Hühnern etwa 6 Tage nach der Infektion isoliert. Ein
Fäkalhomogenisat wird durch ein Quarktuch filtriert und die
Bruchstücke werden durch Waschen und Zentrifugieren entfernt. Eine
teilweise reine Oozystenfraktion wird durch Flotation auf einer
Lösung von etwa 20 %iger Salzlösung gesammelt und bakterienfrei
gemacht, beispielsweise durch Behandeln mit einer
Hypochloritlösung, vorzugsweise Natriumhypochlorit, in einer Konzentration von
etwa 5 bis etwa 6 % in Wasser bei etwa 4ºC über etwa 10 Minuten.
Das Hypochlorit wird durch mehrere Wäschen mit steriler
gepufferter Salzlösung entfernt. Oozysten werden nach der Technik von
Edgar, Trans. Am. Micr. Soc., 62, 237-242 (1954) sporulieren
gelassen.
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Sporulierte Oozysten werden in einem physiologisch
annehmbaren Medium suspendiert und nach dem Verfahren von Patton, Science
150, 767-769 (1965) aufgebrochen. Solche physiologisch annehmbaren
Medien schließen physiologische Kochsalzlösung,
phosphatgepufferte Kochsalzlösung, phosphatgepufferte
Kochsalz/Glukose-Lösung, gepufferte Kochsalzlösung und dergleichen ein, ohne darauf
beschränkt zu sein. Sporozysten aus aufgebrochenen Oozysten
werden durch Zentrifugieren bei etwa 1000 x g über ungefähr 10
Minuten abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wird als
immunogene Zusammensetzung aus überstehender Flüssigkeit nach dem
Vermahlen (post-grind supernatant, (PGS)) bezeichnet und das die
Sporozysten enthaltende pelletisierte Material weiter auf die
Sporozoiten hin verarbeitet. Das pelletisierte Material wird
bei etwa 25º bis etwa 41ºC in einer Atmosphäre aus etwa 5 %
CO&sub2; -95 % Luft etwa eine halbe Stunde mit einer
zystenaufbrechenden Lösung mit etwa 0,125 % Trypsin und etwa 1,0 %
Taurodeoxycholinsäure in einer Pufferlösung behandelt. Die
zystenaufbrechende Lösung wird durch Waschen mit einer Pufferlösung und
Zentrifugieren entfernt. Das erhaltene Pellet wird erneut in einem
physiologisch annehmbaren Medium suspendiert, wie oben
beschrieben, und die Sporozoiten werden unter Verwendung einer DE-52-
Anionenaustauscherkolonne unter Einsatz der Methode von Schmatz
et al., J. Protozool. 31, 181-183 (1984) isoliert. Die
isolierten Sporozoiten werden dreimal in einer etwa 1 mM
Phenylmethylsulfonylfluorid enthaltenden Pufferlösung eingefroren und
aufgetaut und dann mit Schall aufgebrochen.
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Die aus den Sporozoiten erhaltenen Polypeptide werden
durch Gelelektrophorese an
Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamidgel analysiert, wobei Gele mit etwa 5 bis etwa 20 %
Polyacrylamid unter reduzierenden Bedingungen verwandt werden. Färbung mit
Coomassie-Blau und Vergleich mit Molekulargewichtsmarkierungen
ergibt 31 Polypeptide, die in der Größe in einem Bereich von etwa
300 Kilodalton (kd) bis etwa 13 kd liegen. Wenn diese
Polypeptide mit Anti-E. acervulina-Antikörpern des Kaninchens unter
Verwendung einer Western Blot-Analyse vermischt werden, zeigen nur
20 Polypeptide eine starke Antikörperbindung. Diese
immunodominanten Polypeptide von etwa 115, 84, 74, 68, 65, 59, 45, 41,5,
37, 34, 31, 29, 27, 26,5, 26, 24, 23, 22,5, 21,5 und 20 kd
können entweder einzeln oder in Kombination eine Immunantwort in
Hühnern hervorrufen, die sie gegen nicht nur von E. acervulina,
sondern auch andere Eimeria-Spezies hervorgerufene Kokzidiose
schützen können.
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Hühner werden durch Inokulieren der
PGS-Immunogenzusammensetzung oder der oben aufgeführten Polypeptid-Immunogene entweder
allein oder in Kombination oder als Parasitenextrakt in einem
physiologisch annehmbaren Medium immunisiert. Immunisierung auf
oralem oder intramuskularem Weg in neu geschlüpften oder
ausgewachsenen Vögeln führt zur Immunität gegenüber Infektion, so daß nach
Kontakt mit dem virulenten Parasiten keine nennenswerte Krankheit
resultiert. Schützende Immunität wird durch Verabreichung von
etwa 1 ug bis etwa 200 ug, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 75 ug,
Polypeptidimmunogen oder Immunogenzusammensetzung pro Huhn etwa 1 bis
etwa 4 getrennte Male pro Woche in einer Einzeldosis oder in
mehreren getrennten Dosen erreicht. Die bevorzugte Dosierung für
entweder auf dem intramuskularem oder dem oralen Weg immunisierte
zwei Tage alte Hühner ist etwa 10 ug, am zweiten, neunten und
sechzehnten Tag nach dem Schlüpfen verabreicht, oder eine
Einzeldosis von etwa 50 ug, am zweiten Tag nach dem Schlüpfen
verabreicht. Die Immunisierung von Hühnern mit E. acervulina, wie
beschrieben, führt nicht nur zu einem nennenswerten Schutz gegen
E. acervulina, sondern verleiht auch unerwartet einen
nennenswerten Immunschutz gegen eine Herausforderung mit E. tenella und
E. maxima.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sich
jedoch darauf zu beschränken.
Beispiel 1
Herstellung von E. acervulina-Oozysten und Oozyst-Immunogenen
Oozysten - Eimeria acervulina
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-Oozysten wurden von 5 bis 6
Tage vorher mit Vorratskulturen von E. acervulina infizierten
ausgewachsenen Hühnern erhalten. Fäkalien und der
Eingeweideinhalt von infizierten Vögeln wurden gesammelt, mit destilliertem
Wasser verdünnt und in einem Waring-Blender aufgebrochen. Das
aufgebrochene Material wurde durch Quarktuch filtriert. Der
feinteilige Anteil wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und durch
Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit, 1000 x g, gesammelt.
Eine partiell reine Oozystenfraktion wurde durch Flotation der
Oozysten auf 20 %iger Salzlösung isoliert und mit 5,25 %
Natriumhypochlorit
bei 4ºC 10 Minuten behandelt. Das
Natriumhypochlorit wurde durch mehrere Wäschen in steriler phosphatgepufferter
Salzlösung (PBS), pH 7,6, entfernt, wobei gereinigte
bakterienfreie Oozysten erhalten wurden.
Sporulierte Oozysten
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- Wie oben hergestellte Oozysten
wurden in einem Rüttelwasserbad von 29ºC über 48 Stunden sporuliert.
Sporulierte Oozysten wurden in PBS (pH 7,6) bei 4ºC bis zur
Verwendung aufbewahrt.
Überstehende Flüssigkeit nach dem Vermahlen
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- 2
ml-Suspension von gereinigten sporulierten Oozysten (5 x 10&sup7;/ml PBS, pH
7,6) wurden bei 700 Upm und 4ºC 6 Minuten in einem
Gewebehomogenisator mit einem lose eingepaßten Stößel vermahlen, wonach das
überstehende Material durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 1000
x g) gesammelt wurde. Diese milchige, lipidreiche
Zusammensetzung wurde als Immunogenzusammensetzung nach dem Vermahlen der
überstehenden Flüssigkeit (PGS) bezeichnet. Das pelletisierte
Material wurde weiter auf Sporozoiten verarbeitet, wie in
Beispiel 2 beschrieben.
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Vor der Injizierung der PGS in Hühner wurde diese dreimal
durch schnelles Abkühlen auf Trockeneistemperatur und
anschliessendes schnelles Aufwärmen auf Raumtemperatur eingefroren und
aufgetaut, wonach die PGS in phosphatgepufferter Salzlösung mit
1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid zur Inhibierung der
Proteindegradierung beschallt wurde.
Beispiel 2
Herstellung von Sporozoit-Immunogenen
Sporozoiten
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- Das in Beispiel 1 erhaltene pelletisierte
Material, aus unaufgebrochenen Oozysten, Sporozysten und
Oozystenschalen zusammengesetzt, wurde erneut in einer
zystenaufbrechenden Lösung mit 0,125 % (G/V) Trypsin (1:250) und 1,0 %
(G/V) Taurodeoxycholinsäure in ausbalancierter Hank's-Salzlösung
(pH 7,4) suspendiert und in 5 % CO&sub2; bei 41ºC inkubiert. Nach
1/2 h wurde die zystenaufbrechende Lösung durch Zentrifugieren
entfernt und Parasitenmaterial zweimal in phosphatgepufferter
Salz-Glukose (PBSG: 9,44 g/l wasserfreies Na&sub2;HPO&sub4;, 0,55 g/l
NaH&sub2;PO&sub4; 2H&sub2;O, 2,98 g/l NaCl, 10 g/l Glukose, pH 8,0) gewaschen.
Die Parasitenmischung wurde auf eine mit PBSG äguilibrierte DE-
52-Anionenaustauschersäule gegeben. Die Sporozoiten wurden von
anderen Parasitmaterialien durch Elution in das Leervolumen
gereinigt.
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Sporozoitenimmunogene wurden aus Sporozoiten erhalten, die
dreimal durch Abkühlen mit Trockeneis und Aufwärmen auf
Raumtemperatur eingefroren und aufgetaut worden waren, sowie bis zum
Aufbrechen in PBS mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid als
Proteaseinhibitor beschallt worden waren. Proteinkonzentrationen
wurden nach der Methode von Lowry et al. (1951), J. Biol. Chem.
193, 265-275, bestimmt, und die Immunogene wurden in flüssigem
N&sub2; gelagert.
Beispiel 3
Trennung und Charakterisierung von Polypeptidimmunogenen von
E. acervulina-Sporozoiten
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Sporozoiten-Immunogene, erhalten nach der Beschreibung
in Beispiel 2, wurden durch
Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. 200 ug
Sporozoitimmunogen wurden an einem linearen Polyacrylamidgradienten von
5 bis 20 %, überlagert mit 3 % Polyacrylamidgelschicht, in
Gegenwart von 0,1 % SDS und 2-Mercaptoethanol, Laemmli, Nature,
227, 680-685 (1970), aufgetrennt. Die Polypeptide wurden bei
50 mA und 10 bis 12ºC 3 bis 4 Stunden elektrophoresiert, bis
die Spurfärbung, Bromphenolblau, innerhalb von 1 cm vom Boden
war. Die einzelnen Polypeptidbanden wurden durch Färbung mit
Coomassie-Blau sichtbar gemacht und das Molekulargewicht der
einzelnen Polypeptide durch ihre Wanderung im Verhältnis zur
Wanderung von Proteinstandards bekannten Molekulargewichts
bestimmt. Die Molekulargewichtstandards lagen im Bereich von
200 000 dalton bis 14 400 dalton. Diese Technik ergab 31
Polypeptide mit den folgenden relativen Molekulargewichten: 300,
215, 145, 115, 100, 94, 84, 74, 68, 59, 51, 50, 48, 45, 44, 41,5,
40, 36, 34, 31, 29, 27, 26, 25, 24, 22, 21,5, 19, 17, 15,5 und
13 kd.
Beispiel 4
Herstellung von Anti-Sporozoit-Antikörpern
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E. acervulina-Sporozoitimmunogen wurde hergestellt, wie in
Beispiel 2 im einzelnen angegeben. Antiseren wurden in
NZW-Kaninchen durch subkutane (SC) Immunisierung an mehreren Stellen mit
insgesamt 100 ug Proteinäquivalenten an in vollständigem Freund'
schem Adjuvans emulgiertem Sporozoitimmunogen hergestellt. Die
Kaninchen wurden an den Tagen 36, 48 und 84 nach der
Erstimmunisierung SC mit 100 ug proteinäquivalentem Sporozoitimmunogen
in unvollständigem Freund'schem Adjuvans (IFA) gefördert, 10
Tage nach der letzten Injektion zur Ader gelassen, wonach Seren
hergestellt wurden.
Beispiel 5
Charakterisierung des Oberflächenantigens von E. acervulina-
Sporozoiten durch Immunseren
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DE-52-gereinigte E. acervulina-Sporozoiten wurden
hergestellt, wie im Detail in Beispiel 2 angegeben. Anti-E.
acervulina-Sporozoit-Immunseren vom Kaninchen wurden hergestellt, wie
im einzelnen in Beispiel 4 angegeben.
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Die Fähigkeit dieser Antiseren zur Agglutinierung von
E. acervulina-Sporozoiten wurde unter Verwendung von
Testplatten mit 96 Vertiefungen bestimmt. Eine Sporozoitensuspension,
0,05 ml, mit 4 x 10&sup6; Sporozoiten pro ml wurde mit 0,05 ml
verdünntem Serum in jede Vertiefung gegeben. Normale
Kaninchenseren vor der Immunisierung und Anti-E.
acervulina-Sporozoit-Immunseren vom Kaninchen wurden in doppelter Verdünnung von 1/100
bis 1/12 800 getestet.
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Die Mischungen wurden bei 41ºC eine Stunde inkubiert und
mikroskopisch auf Agglutinierung und/oder Lyse (aufgrund der
Gegenwart von Komplementen in den Seren) hin untersucht. Das
normale Kaninchenserum hatte keine nachweisbaren Auswirkungen
auf die Sporozoiten; es wurde weder eine Agglutinierung noch
eine Lyse beobachtet. Das Kaninchen-Immunserum lysierte
Parasiten in Verdünnungen von 1/200 und agglutinierte Sporozoiten in
Verdünnungen von 1/3200.
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Kaninchenseren wurden auch auf ihre Fähigkeit zur
Neutralisierung der Infektiosität von E. acervulina-Sporozoiten in
vivo getestet. E. acervulina-Sporozoiten wurden mit sowohl
normalem Kaninchenserum als auch Kaninchen-Anti-E.
acervulina-Sporozoit-Immunserum in Verdünnungen von 1/100 eine Stunde bei 41ºC
inkubiert. Entweder 30 000 oder 100 000 behandelte Sporozoiten
wurden dann in die oberen Eingeweide von Gruppen mit 5 Hühnern
injiziert. Fünf Tage nach der Inokkulierung wurden die
Eingeweide entfernt und auf Läsionen hin untersucht, die nach Johnson und
Reid, Exp. Parasit. 28, 30-36 (1970) bewertet wurden. Die
folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Zahl der injizierten Sporozoiten
Serum
30 000 mittlere Läsionenbewertung der Gruppe
100 000 mittlere Läsionenbewertung der Gruppe
Kaninchen normal
Kaninchen-Anti-E. Acervulina
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß
Kaninchen-Anti-Eimeria-Antikörper an die Oberfläche von intakten Sporozoiten binden und
die Infektiosität der transferierten Sporozoiten neutralisieren.
Diese Daten zeigen weiterhin, daß Sporozoit-Immunogene
Antikörper hervorrufen, die die Ausbildung von Kokzidiose inhibieren.
Beispiel 6
Charakterisierung der immunodominanten Polypeptidantigene im
schützenden Extrakt von E. acervulina-Sporozoiten
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50 ug Sporozoit-Immunogen wurden in die Polypeptide der
Zusammensetzung durch
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt, wie in Beispiel 3 im einzelnen
angegeben. Nach der Auftrennung wurden sie nach den Verfahren von
Erickson et al., J. Imm. Meths. 51, 241-249 (1982) und Towbin et
al., P.N.A.S. 76, 4350 (1979) auf Nitrocellulosepapier
transferiert. Für diesen Transfer wurde ein Biorad-Transblot-Apparat
verwandt, wobei ein Spannungsgradient von 3,5 V/cm 21 Stunden
bei 11ºC angewandt wurde.
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Immunodominante Polypeptide im transferierten Sporozoit-
Immunogen wurden unter Verwendung von Kaninchenantiseren,
hergestellt wie in Beispiel 4 im einzelnen angegeben, lokalisiert.
Dieses Serum wurde 1:100 mit 0,25 % Gelatine-TEN (0,05 M Tris,
0,14 M NaCl, 0,005 M EDTA, 0,05 % Triton x 100) verdünnt. Nach
der Wäsche wurde Ziegen-Antikaninchen-IgG, das mit Meerrettich-
Peroxidase konjugiert war, zum die die transferierten
Polypeptide enthaltenden Cellulosepapier zugegeben. Das
Peroxidasesubstrat 4-Chlor-1-naphthol, wurde auf das Nitrocellulosepapier
angewandt und ergab an der Stelle des
Polypeptid-Antikörperkomplexes ein sichtbares Reaktionsprodukt. 20 Polypeptide aus dem
Sporozoitextrakt reagierten mit diesem Antisporozoitserum. Es
handelt
sich um die Moleküle mit 115, 84, 74, 68, 65, 59, 45, 41,5,
37, 34, 31, 29, 27, 26,5, 26, 24, 23, 22,5, 21,5 und 20 kd
relativem Molekulargewicht.
Beispiel 7
Intramuskulare Immunisierung von 3 Wochen alten Hühnern gegen
Kokzidiose mit einem Extrakt aus sporulierten Oozysten von
E. acervulina (PGS)
-
Weibliche Brathühnchen (Hubbard Farms) wurden
intramuskulär mit verschiedenen Dosen immunogener PGS-Zusammensetzung,
wie im einzelnen in Beispiel 1 angegeben, immunisiert. Die
Dosierung beruhte auf dem Proteingehalt, bestimmt nach dem
Verfahren von Lowry et al., oben, und wurde einmal wöchentlich bei
vier Gelegenheiten verabreicht, wobei im Alter von 3 Wochen
begonnen wurde. Die Hühner des Experiments und Kontrolle wurden
eine Woche nach der letzten Immunisierung mit einer oralen
Inokkulation von 3 x 10&sup5; virulenten sporulierten Oozysten von E.
acervulina inokkuliert. Sechs Tage nach der Herausforderung
wurden die Hühner getötet und die Schwere der Läsionen in den
Innereien nach dem Verfahren von Johnson und Reid, oben, bestimmt.
Die Läsionen wurden anhand einer definierten Skala von 1 bis 4
bewertet, wobei 4 die schwerwiegendste ist. Oozystenzahlen in
den Fäkalien wurden durch Hämozytometerzählungen an Material
bestimmt, das aus der Salzflotation nach einer Standardtechnik
herrührte. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt.
Gruppe
Dosis (ug)
Zahl der Vögel
mittlere Läsionenbewertung der Gruppe
mittlere Oozystenzahl der Gruppe
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine immunogene
PGS-Zusammensetzung, ein Extrakt von sporulierten Oozyssten von E. acervulina,
der keine lebensfähigen oder intakten Parasiten mehr enthält, zur
Immunisierung von 3 Wochen alten Brathühnchen verwandt werden
kann. Eine intramuskulare Inokkulierung ergibt einen hohen
Schutzgrad
gegen die Krankheit, was durch das Fehlen der Entwicklung
schwerer Läsionen in immunisierten Vögeln nach einer normalen
virulenten Infektion gezeigt wird. Die Immunität manifestiert
sich auch in einer Reduktion der Oozystenzahl in geimpften
Vögeln.
Beispiel 8
Intramuskulare Immunisierung von zwei Tage alten Hühnern gegen
Kokzidiose mit einem Extrakt aus sporulierten Oozysten von E.
acervulina (PGS)
-
Weibliche Brathühnchen (Hubbard Farms) wurden mit
verschiedenen Dosen einer immunogenen PGS-Zusammensetzung, wie im
einzelnen in Beispiel 1 angegeben, immunisiert. Die Dosierung beruhte
auf dem Proteingehalt, bestimmt nach dem Verfahren von Lowry et
al., oben, und wurde intramuskular an den Tagen 2, 9 und 16 nach
dem Schlüpfen verabreicht. Hühner des Experiments und der
Kontrolle wurden eine Woche nach der letzten Immunisierung mit einer
oralen Inokkulierung von 5 x 10&sup5; sporulierten Oozysten von E.
acervulina herausgefordert. 6 Tage nach der Herausforderung wurden die
Hühner getötet und die Schwere der Läsionen in den Eingeweiden
nach dem Verfahren von Johnson und Reid, oben, bestimmt. Die
Läsionen wurden bewertet, wie im einzelnen in Beispiel 7 angegeben.
Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt.
Gruppe
Dosis (ug)
Zahl der Vögel
mittlere Läsionenbewertung der Gruppe
-
Die Ergebnisse zeigen, daß PGS, ein Extrakt von
sporulierten Oozysten von E. acervulina, der keine lebensfähigen oder
intakten Parasiten enthält, zur Immunisierung von Hühnern verwandt
werden kann, wenn in einem sehr frühen Alter verabreicht. Die
immunogene PGS-Zusammensetzung ergibt einen hohen Schutzgrad gegen
die Krankheit, wie durch das Fehlen der Entwicklung schwerer
Läsionen in immunisierten Vögeln nach einer normalen virulenten
Infektion gezeigt wird.
Beispiel 9
Orale Immunisierung von zwei und eine halbe Woche alten Hühnern
gegen Kokzidiose mit einem Extrakt aus sporulierten Oozyssten
von E. acervulina (PGS)
-
Weibliche Brathühnchen (Hubbard Farms) wurden mit
verschiedenen Dosen einer immunogenen PGS-Zusammensetzung, wie in
Beispiel 1 im einzelnen angegeben, immunisiert. Die Dosierung
basierte auf dem Proteingehalt, bestimmt nach dem Verfahren von
Lowry et al., oben, und wurde auf oralem Weg in wöchentlichen
Intervallen bei vier Gelegenheiten verabreicht. Die Hühner des
Experiments und Kontrolle wurden 8 Tage nach der letzten
Immunisierung mit einer oralen Inokkulierung von 3 x 10&sup5; infektiösen
sporulierten Oozysten von E. acervulina herausgefordert. 6 Tage
nach der Herausforderung wurden die Hühner getötet und die
Schwere der Läsionen in den Eingeweiden nach der Methode von Johnson
und Reid, oben, bestimmt. Die Läsionen wurden bewertet, wie im
einzelnen in Beispiel 7 angegeben. Die folgenden Ergebnisse
wurden erhalten.
Gruppe
Dosis (ug)
Anzahl der Vögel
mittlere Läsionenbewertung der Gruppe
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß Hühner mit PGS, einem Extrakt
aus sporulierten Oozysten von E. acervulina, der keine
lebensfähigen oder intakten Parasiten mehr enthält, auf oralem
Inokkulationsweg immunisiert werden können. Die resultierende
Immunität bietet einen hohen Schutzgrad gegen die Krankheit, wie durch
das Fehlen von schweren Läsionen im Anschluß an eine
normalerweise virulente Infektion angezeigt.
Beispiel 10
Intramuskulare Immunisierung von zwei Tage alten Hühnern gegen
Kokzidiose mit einem Extrakt aus Sporozoiten von E. acervulina
-
Weibliche Brathühnchen (Hubbard Farms) wurden mit
verschiedenen Dosen eines Sporozoit-Immunogens, wie in Beispiel 3
im einzelnen dargelegt, immunisiert. Die Dosierung beruhte auf
dem Proteingehalt, bestimmt nach der Methode von Lowry et al.,
oben, und wurde intramuskular am Tag 2, 9 und 16 nach dem
Schlüpfen verabreicht. Die Hühner des Experiments und der
Kontrolle wurden 6 Tage nach der letzten Immunisierung durch eine
orale Inokkulierung von 5 x 10&sup5; infektiösen sporulierten
Oozysten von E. acervulina herausgefordert. 6 Tage nach der
Herausforderung wurden die Hühner getötet und die Schwere der Läsionen
in den Eingeweiden nach der Methode von Johnson und Reid, oben,
bestimmt. Die Läsionen wurden bewertet, wie in Beispiel 7 im
einzelnen dargelegt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Gruppe
Dosis (ug)
Anzahl der Vögel
mittlere Läsionenbewertung der Gruppe
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß aus E. acervulina
extrahierte Sporozoit-Immunogene zur Immunisierung von sehr jungen Hühnern
gegen Infektionen mit sporulierten Oozysten von E. acervulina
verwandt werden können. Die Hühner zeigten einen hohen Immunitätsgrad,
wie durch das allgemeine Fehlen von schweren Läsionen nach der
Herausforderung mit einer infektiösen Dosis angezeigt.
Beispiel 11
Intramuskulare Immunisierung von zwei Tage alten Hühnern gegen
durch E. acervulina, E. tenella und E. maxima verursachte
Kokzidiose mit einem Extrakt von sporulierten Oozysten (PGS) von
E. acervulina
-
Weibliche Brathühnchen (Hubbard Farms) wurden mit
verschiedenen Dosen von immunogenen PGS-Zusammensetzungen, wie im
einzelnen in Beispiel 1 dargelegt, immunisiert. Die Dosierung beruhte
auf dem Proteingehalt, bestimmt nach der Methode von Lowry et al.,
oben, und wurde auf intramuskularem Weg an den Tagen 2, 9 und 16
nach dem Schlüpfen verabreicht. Die Hühner des Experiments und
der Kontrolle wurden 1 Woche nach der letzten Immunisierung mit
einer oralen Inokkulierung von entweder 5 x 10&sup5; E. acervulina-,
5 x 10&sup4; E. tenella- oder 2 x 10&sup5; E. maxima-sporulierten Oozysten
herausgefordert. 6 Tage später wurden die Hühner getötet und die
Schwere der Läsionen im Blinddarm oder in den Eingeweiden wurden
nach dem Verfahren von Johnson und Reid, oben, bestimmt. Die
Läsionen wurden bewertet, wie in Beispiel 7 im einzelnen dargelegt.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Läsionenbewertungen im Gruppenmittel¹
PGS-Dosis (ug)
Herausfordernde Spezies
E. acervulina
E. tenella
in maxima
¹Es waren 7 Hühner in jeder Gruppe.
-
Diese Ergebnisse sind die ersten, die den Schluß zulassen,
daß Immunität gegen Immunogene einer Eimeria-Spezies auch gegen
Infektionen mit anderen Eimeria-Spezies schützt. Tatsächlich
entsprach der Schutzgrad gegen nicht immunisierte Spezies dem der
zur Impfung der Hühner verwandten Spezies.
Beispiel 12
Intramuskulare Immunisierung von zwei Tage alten Hühnern gegen
durch E. acervulina, E. tenella und E. maxima verursachte
Kokzidiose mit einem Extrakt von E. acervulina-Sporozoiten
-
Weibliche Brathühnchen (Hubbard Farms) wurden mit
verschiedenen Dosen Sporozoit-Immunogen, wie im einzelnen in Beispiel 2
angegeben, immunisiert. Die Dosierung beruhte auf dem
Proteingehalt, bestimmt nach der Methode von Lowry et al., oben, und
wurde auf intramuskularem Weg am Tage 2, 9 und 16 nach dem
Schlüpfen verabreicht. Die Hühner des Experiments und der
Kontrolle wurden eine Woche nach der letzten Immunisierung mit einer
oralen Inokkulierung von entweder 5 x 10&sup5; E. acervulina-, 5 x 10&sup5;
E. tenella- oder 2 x 10&sup5; E. maxima-sporulierten Oozysten
herausgefordert. 6 Tage später wurden die Hühner getötet und die Schwere
der Läsionen im Blinddarm oder in den Eingeweiden nach der
Methode von Johnson und Reid, oben, bestimmt. Die Läsionen wurden
bewertet,
wie in Beispiel 7 im einzelnen dargestellt. Die
folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Läsionenbewertung im Gruppenmittel¹
Sporozoitantigen-Dosis (ug)
Herausfordernde Spezies
E. acervulina
E. tenella
E. maxima
¹Es waren 7 Hühner in jeder Gruppe.
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß Sporozoit-Immunogene in Form
eines Extrakts von gereinigten E. acervulina-Sporozoiten, der
keine lebensfähigen oder intakten Parasiten mehr enthält, zur
Immunisierung von Hühnern gegen infektiöse Oozysten von E.
acervulina, E. tenella und E. maxima verwandt werden können. Der
Immunitätsgrad gegen die nicht immunisierten Spezies entsprach
dem der zur Impfung der Hühner verwandten Spezies.