DE69230037T2

DE69230037T2 - Kontinuierliche zellinie sowie impfstoff gegen geflügelinfektion mit kokkidien

Info

Publication number: DE69230037T2
Application number: DE69230037T
Authority: DE
Inventors: Robert Clare; Patricia Lufburrow; Timothy Miller
Original assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Inc
Priority date: 1991-07-12
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2012-07-11
Also published as: DE69230037D1; JP3129441B2; CA2112811A1; US5674484A; GR3032204T3; DK0594743T3; JPH07505041A; ES2137190T3; US5846527A; EP0594743A1; WO1993001276A1; CA2112811C; EP0594743A4; ATE184912T1; EP0594743B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine virusfreie kontinuierliche Zellinie, die geeignet ist zur Vermehrung von Gefügelkokzidien. Genauer betrifft die Erfindung die Verwendung der Zellinie zur Herstellung von Vakzinantigenen für die prophylaktische Behandlung von Geflügel gegen Kokzidiose.

Hintergrund der Erfindung

Kokzidiose ist eine enterische Erkrankung zahmer und wilder Tiere, die eine akute Morbidität verursacht, was zu vermindertem Wachstum und zu verminderter Futterverwertung führt. Die Gefügelkokzidien (Genus Eimeria) sind obligate intrazelluläre Protozoenparasiten des intestinalen Epithels. Diese Parasiten haben einen einwirtigen Lebenszyklus und haben einen hohen Grad an Wirtsspezifität und Gewebespezifität. Bei Geflügel führen Kokzidieninfektionen zu wirtschaftlichen Verlusten durch Verkümmerung und Hautverfärbung. Insgesamt führt die Kombination aus Verlusten durch Kokzidiose und prophylaktische Medikation zu Kosten in der Geflügelindustrie von mehr als 300 Mill. Dollar jährlich [Danforth und Augustine, Animal Nutrition and Health, Seiten 18-21 (August 1985)].
Tausende von Kokzidienoozysten können auf einmal von einem einzigen Wirt aufgenommen werden. Sobald die Parasiten aufgenommen sind, wandern sie in spezifische intestinale Zellen, wo sie verschiedene Runden einer asexuellen Vermehrung durchlaufen können, woran sich eine Gametogenie anschließt, bevor Millionen neuer Parasiten in die Streu gelangen, um den Lebenszyklus zu vervollständigen. Verschiedene Geflügelarten leiden unter Infektionen, die von verschiedenen Rokzidienarten verursacht werden. Hausgeflügel (Gallus domesticus) kann mit den Kokzidien Eimeria tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. maxima, E. acervulina und E. praecox infiziert werden. Die folgenden Rokzidien sind an Infektionen von Truthähnen (Meleagris) beteiligt: Eimeria meloagrimits, E. dispersa, E. meleagridis, E. gallopavonis, E. adenoides, E. innocua und E. subrotunda. Hausenten (Anas) leiden unter Infektionen, die von Tyzzeria perniciosa verursacht werden und es wird auch angenommen, an Seuchen, die durch Eimeria anatis verusacht werden, die sie von Wildenten (Anas platyrhyncos) erwerben können. Gänse (Anser) können unter Infektionen leiden, die von Eimeria anseris, E. nocens und E. parvula verusacht werden und es wird außerdem angenommen, daß Hausgänse Infektionen von Kanadagänsen erwerben können, die durch Eimeria hermani, E. striata und E. fulva verursacht werden.
Es wird berichtet, daß eine Immunität gegenüber Kokzidiose äußerst artspezifisch ist und eine Manifestation zellvermittelter Prozesse bedeutet [M. E. Rose, in "Biology of the coccidia", P. L. Long, ed.; University Park Press, Baltimore, Seiten 328-372 (1982)]. Der natürliche Kontakt mit Eimeriaoozysten ruft eine vollständige schützende Immunität hervor; diese Antwort scheint hauptsächlich durch die Entwicklung intrazellulärer Parasitenstadien zu entstehen statt durch extrazelluläre Sporozoiten oder Merozoiten [M. Jenkins et al., Infec. Immun., 59 : 4042-4048 (1991)]. Obwohl wenige Oozysten einen Schutz beitragen können für eine nachfolgende Exposition, beeinträchtigt dieser erste Kontakt die Gewichtszunahme, die Futterverwertung und die Hautpigmentretention negativ.
Derzeit bekannte Methoden zur Kontrolle betreffen hauptsächlich eine chemotherapeutische Behandlung mit antikokzidialen Arzneimitteln, die dem Futter beigemischt werden. Effektive Verbindungen schlossen Sulfonamide, Chinoline und ionophore Polyetherantibiotika ein [siehe z. B. L. R. McDougald, in "Bio logy of the Coccidia", Seiten 373-427 (1982)]. Diese Verbindungen scheinen die Parasitenentwicklung in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus zu beeinflussen. Mit der Zeit entwickelten sich jedoch arzneimittelresitente Stämme von Parasiten, was den Nutzen des Arzneimittels stark einschränkte [T. K. Jeffers, Avian Dis., 18 : 74 (1974); T. K. Jeffers, Avian Dis., 18 : 331 (1974) und H. D. Chapman, Vet. Parasit., 15 : 11-27 (1984)]
Andere weniger eingeführte Kontrollmaßnahmen schließen das tatsächliche Füttern von lebenden Oozysten aus gut charakterisierten Wildtyp- oder geschwächten Stämmen verschiedener Eimeria-Arten an Hühner ein, um Immunität zu erzeugen.
Cocci-Vac [Sterwin Labs] verwendet eine kontrollierte Anzahl spezifischer Arten von Geflügel-Eimeria, die dem Futter oder Wasser zugegeben werden oder einzeln verabreicht werden [siehe z. B. S. A. Edgar, Research in Coccidiosis, McDougald et al., Herausgeber University of Georgia, Seite 617 (1986)].
Ein weiterer Ansatz zur Entwicklung einer lebenden Vakzine schließt das Verabreichen abgeschwächter Parasitenstämme ein. Die Auswahl einer frühen Oozystenentwicklung oder einer frühzeitigen Entwicklung führt zu Stämmen mit abgekürzter asexueller Entwicklung und verminderter Pathogenizität [siehe Shirley et al., Avian Path., 15 : 629 (1986); Shirley et al., Res. Vet. Sci., 44 : 25 (1988) und Europäisches Patent Nr. 0 256 878-A2]. Serielle Passagen von Eimeriaarten in Hühnerembryos führen auch zu Stämmen mit verminderter Pathogenizität [Long, J. Comp. Path., 82 : 429 (1972) und Long., J. Comp. Path., 82 : 439 (1972)].
Beide Abschwächungspraktiken wurden verwendet in Kombination mit einer Verabreichungsmethode als "Tropfdosis", um eine wirksame Immunität zu erzielen [Johnson et al., "Research in Coccidiosis" McDougald et al., Herausgeber, University of Ge orgia, Seiten 634-641 (1986)]. Obwohl gezeigt wurde, daß diese Methode für die Impfung nützlich ist, erfordert sie die Einführung und Erhaltung von lebenden Parasiten in Geflügel, was das Risiko birgt, daß die Pathogenizität zurückkehrt.
Während eine aktive Infektion eine schützende Immunantwort erzeugt, ist eine wirksame Immunisierung mit abgetöteten parasitischen Stadien oder Strukturantigenen weniger eindeutig. Frühe Studien deuteten darauf hin, daß Antigenextrakte von toten Parasiten nicht immonogen waren [Long et al., Exp. Parasitol., 16 : 1 (1965); Rose et al., "Vakzines Against Parasites", Taylor und Muller, Herausgeber, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Seiten 57-74 (1980)].
Im Gegensatz dazu beschreibt die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 167 443 einen Extrakt, der von sporenbildenden E. tenella-Oozysten erzeugt wird, der wenn er intramuskulär injiziert wurde, Hühner gegen eine homologe Parasitenexposition schützte. Ein ähnlicher Extrakt, der aus E. acervulinaoozysten erzeugt wurde, wird in US-Patent Nr. 4,724,145 beschrieben, der eine schützende Antwort gegenüber einer Exposition mit diesen Parasiten hervorruft,, ebenso wie E. maxima und E. tenella. Ein exzystierter Extrakt von E. tenella-Sporozoiten in einer wäßrigen Suspension zur subkutanen Verabreichung wird in US-Patent Nr. 4,808,404 beschrieben.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 135 712 beschreibt solubilisierte E. tenella-Sporozoit-Antigene als wirksame Immunogene, während sich die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 135 073 auf die Verwendung von Antigenen aus solubilisierten E. tenella-Merozoiten als Immunogene bezieht. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 291 173 beschreibt sporenbildende E. tenella-Extrakte zur Injektion in das Ei des Vogels vor dem Schlüpfen, um Immunität zu induzieren. US-Patent Nr. 4,863,731 beschreibt die Verwendung eines wäßrigen Konzentrats lebensfähiger sporenbildender Oozysten von mindestens einer Art von Kokzidien als Futterzusatzstoff.
Außerdem wurden Antigenextrakte von Gametocyten von E. maxima auf ihre potentielle Immunogenizität untersucht [siehe z. B. Europäische Patente Nr. 0 256 514 und 0 256 536]. Obwohl verschiedene Grade an Immunität mit den obigen Präparaten gezeigt wurden, ist ihre Herstellung äußerst arbeitsintensiv und die Herstellungsverfahren sind schwierig in großem Maßstab durchzuführen.
In letzter Zeit erfolgte und praktischere Ansätze für eine Impfstoffentwicklung beinhalten die Herstellung und Charakterisierung von gentechnisch erzeugten Antigenen [Binger et al., J. Cell Biochem., 10A:144 (1986), Brothers et al., Mol. Biochem. Parasitol:, 28 : 235 (1988); Danforth et al., Avian Dis., 30 : 37 (1985); Jenkins et al., Exp. Parasitol., 66 : 96 (1988); Europäische Patentanmeldung Nr. 0 164 176; Europäische Patentanmeldung Nr. 0 337 589 und Australische Patentanmeldung Nr. 65867/86]. Diese Verfahren erfordern die Isolierung von mRNA aus Sporozoiten oder Merozoiten, die Erstellung einer cDNA-Bibliotek, das Screening der cDNA-Bibliotek mit einem geeigneten Antikörper und das anschließende Klonieren in einem Expressionsvektor. Die entstehenden klonierten Antigene können dann in großen Mengen in mikrobiellen Fermentern erzeugt werden.
Bis heute wurde über wenige Immunogenizitätsstudien berichtet, aber es wurde darauf hingewiesen, daß ein Teilschutz durch diese Antigene hervorgerufen wird [Danforth und Augustine, oben; Jenkins et al., oben]. Insgesamt induzieren diese klonierten Strukturproteine im besten Fall einen unvollständigen Schutz und ihre immunisierenden Fähigkeiten hängen teilweise von der Genetik des Wirts ab [Clare, Infect. Immmunol., 57 : 701 (1989)].
Schießlich wurden passive Immunisierungen mit monoklonalen Antikörpern die gegen E., tenella-Sporozoiten erzeugt wurden [DS-Patent Nr 4,710,377], und aktive Immunisierungen mit monoklonalen Antiidiotyp-Antikörpern [Europäisches Patent Nr. 0 241 139], die von E. tenella-Sporozoiten stammen, untersucht.
Die Fortschritte im Wissen bezüglich Wirt/(Protozoen)- Parasitwechselwirkungen wurde behindert durch den Mangel an entsprechenden in vitro-Zellkultursystemen, in denen Parasiten gehalten werden können. Kokzidien sowohl vom Säugetier als auch von Geflügel sind sehr schwierig in vitro zu züchten, mit Ausnahme von Toxoplasma gondii, der gut in einer Vielzahl von Primärkulturen und etablierten Zellinien wächst [D. J. Doran, in "The Biology of the Coccidia", Seiten 253-257 (1982)].
Die in vitro-Vermehrung von Eimeria war bis heute beschränkt. Die gesamte Präpatent-Kokzidien-Entwicklung vom Sporozoiten zwn Oozysten wurde bisher nur für E. tenella erhalten und nur in primären Vogelnierenzellen [Doran et al., J. Protozool., 20 : 658 (1973)]. Das primäre Hühnernierenepitelzeilsystem ist jedoch nicht kompatibel mit den Herstellungsprotokollen und hat Einschränkungen bei der Verwendung als Untersuchungstestsystem.
Es wurde berichtet, daß nur eine etablierte Zellinie, Madin Darby Rindernieren (MDBK), das Wachstum von Eimeria in vitro unterstützt, aber die Kokzidien entwickeln sich nur über eine Generation durch asexuelle Entwicklung [D. M. Schmatz, Adv. Cell Culture, 5 : 241 (1987)].
Oozysten wurden von Vogel-E. acervulina [M. Nacri-Bontemps, Ann. Rech. Vet., 7 : 223 (1976)] und E. meleagrimitis [Augustin et al., J. Protozool., 25 : 82 (1978)] erhalten, ebenso wie von Rinder-E. bovis [Speer et al., Z. Parasitenkd, (1973)], wenn vom Ursprungswirt stammende Merozoiten als Inoculum verwendet wurden.
Bis heute wurde über keine etablierte Zellinie berichtet, die das Wachstum von Eimerien unterstützt über die erste Generation einer asexuellen Entwicklung hinaus. Es bleibt ein Bedarf auf dem Gebiet der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von verschiedenen pathogenen Vogelinfektionen für eine etablierte Zellinie, die in vitro Komponenten der Eimeriaart vermehren kann, um sichere und wirksame Impfstoffe gegen diese Pathogene zu liefern, einschleißlich Kokzidien.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine kontinuierliche Nichtlymphoid-Zellinie, die die Entwicklung der Präpatentstufe des Lebenszyklus von Vogel-Kokzidien zulassen kann, wobei die Zellinie 5B-CEV-1/P ist, die die ATCC- Hinterlegungsnr. CRL-10497 erhalten hat, oder eine Zellinie, die daraus vermehrt wurde.
Zellinien, die aus der oben erwähnten Stammlinie vermehrt wurden, schließen 5B-CEV-1/F7 mit der Hinterlegungsnr. CRh- 10495 und 5B-CEV-1/G7 mit der Hinterlegungsnr. CRL-10496 ein.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine mit Parasiten infizierte Zellinie, die eine kontinuierliche Nichtlyphoid-Zellinie umfaßt, die die Entwicklung des Präpatentstadiums des Lebenszyklus von Vogelkokzidien zulassen kann, wobei die Zellinie 5B-CEV-1/P mit der ATCC-Hinterlegungsnr. CR-10497, oder eine daraus abgeleitete Zellinie ist, wobei die Zellen der Zellinie mit einem ausgewählten Vogel-Eimeria-Parasiten infiziert sind. Die kontinuierliche Nichtlyphoid-Zellinie kann auch 5B-CEV-1/F7 mit der ATCC- Hinterlegungsnr. CRL-10495 oder 5B-CEV-1/G7 mit der Hinterlegungsnr. CRL-10496 sein. Bevorzugt ist der Vogel- Eimeria-Parasit Eimeria tenella.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Impfstoff für Kokzidiose, der einen Schutz gegen eine Infektion bei Geflügel hervorrufen kann, der mindestens eine Impfstoffkomponente für Kokzidiose mit einer pathogenen Antigenzusammensetzung umfaßt, die durch Züchten einer mit Parasiten infizierten Zellinie, wie oben definiert, erzeugt wurde, wobei die Komponente gegebenenfalls mit einem geeigneten Träger oder Hilfsstoff vereinigt ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Antikokzidioseimpfstoffs, das umfaßt, daß man die oben definierten mit Parasiten infizierten Zellen züchtet und Antigenkomponenten erntet, die eine schützende Antwort in Geflügel gegen Vogel-Kokzidien induzieren können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung liefert ein Verfahren zum Screenen von Mitteln, die das Wachstum von Vogel-Kokzidienparasiten stören oder hemmen, das umfaßt, daß man die oben definierten mit Parasiten infizierten Zellen züchtet, die infizierten Zellen einem Testmittel aussetzt und die Zellen auf eine zerstörende oder hemmende Wirkung auf den Parasiten untersucht.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfingung beschrieben.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren und Zusammensetzungen für die prophylaktische Impfung von Aves gegen eine Infektion durch Vogelpathogene und -parasiten, insbesondere zur Behandlung und Kontrolle von Kokzidien bei Geflügel. "Geflügel" wird hier so definiert, daß Vögel der Ordnung Galliformes eingeschlossen sind, z. B. das gewöhnliche Haushuhn oder Hühnchen (Gallus domesticus), Truthähne (Meleagris), Fasane (Phasianus), Rebhühner (Pedrix), Waldhühner (Lagopus), Perlhühner (Numida) und Pfauen (Pavo) und auch Vögel der Ordnung Anseriformes, wie Enten (Anas) und Gänse (Anser).
Die Erfindung liefert eine neue kontinuierliche Zellinie 5B- CEV-1/P, die im Detail in Beispiel 1 unten beschrieben wird. Diese Zellinie hat 42 Chromosomen pro Zelle und ist Reverse- Transcriptase-Negativ. Die Zellinie ist dadurch gekennzeichnet, daß sie nur eine geringe Befallsextensität mit nicht infektiösen Virenteilchen (Typ A), die mit dem endoplasmatischen Retikulum verbunden sind, aufweist. Die Zellinie ist auch negativ bezüglich endogener Säugetierpathogene und hat keine Indikation für Vogel-Leukosevirus. Weiterhin ist die Zellinie nicht mit Mycoplasma, Bakterien oder Pilzen kontaminiert. Somit ist die Zellinie frei von Säugetier- und Vogelviren.
Die Zellinie hat auch funktionelle Eigenschaften, die mit diesem Hintergrund als Vogelzellen verbunden sind. Z. B. vermehrt sich diese Zellinie bei 41ºC, was charakteristisch für Vogelzellen ist und hat einzigartige Nährerfordernisse, um in vitro aufrecht erhalten zu werden. Weiterhin ist die neue Zellinie der Erfindung die einzige bestehende kontinuierliche Zellinie, die den Präpatent-Lebenszyklus (d. h. den Zeitraum zwischen Infektion und Nachweis des Parasiten im Körper) von Vogelkokzidien, Eimeria, in hohem Anteil replizieren kann.
5B-CEV-1-Zellinie der Erfindung wurde ausgewählt zur Erzeugung von Impfstoffantigenen, insbesondere Vogelkokzidien. Die Zellinie liefert auch Substrate zur Verwendung für das Wachstum von genetisch veränderten Vektoren, die rekombinante DNA exprimieren, die von fremden Genen stammt.
Verschiedene Zellpopulationen wurden aus dieser Stammzellinie kloniert. Diese Klone haben unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der Vermehrung und Erhaltung des Vogelparasiten. Weiterhin haben diese klonierten Zellpopulationen 5B-CEV-1/F7 und 5B-CEV-1/G7 eine hohe Inzidenz für mehrkernige Riesenzellen. Das Auftreten verschiedener Klone aus einer Stamuzellinie ist auch ein Hinweis auf einen multizellulären Ursprung, z. B. mögliches abweichendes Wachstum in den Hühnereingeweiden, die als Ursprung für die Stanmzellinie verwendet wurden. Diese klonierten "Brut"-Zellinien sind jedoch auch kontinuierliche Zellinien, die den Präpatent- Lebenszyklus von Geflügelkokzidien, Eimeria, auf hohem Niveau replizieren können. Es wird angenommen, daß diese Zellinien die gleichen Eigenschaften wie der Elternstamm aufweisen und die Fähigkeit, Kokzidien zu vermehren wurde auch gezeigt. Die Erfindung umfaßt daher auch andere Zellinien, die aus 5B-CEV- 1/P subkloniert wurden oder in anderer Weise davon abgeleitet wurden oder von spezifisch identifizierten Klonen dieser Elternzellinie. Es wird davon ausgegangen, daß solche zusätzlichen nachkommenden Klone wichtige Eigenschaften der Elternzellinie teilen. Dies Subklone können die Elternzellinie ersetzen, wann immer 5B-CEV-1 oder 5B-CEV-1/P spezifisch in der Beschreibung erwähnt wird. Wann immer in der folgenden Besschreibung eine Zellinie in der Einzahl behandelt wird, ist der Ausdruck "die Zellinie" oder "5B-CEV- 1-Zellinie" so zu verstehen, daß 5B-CEV-1/P oder die Subklone davon, wie 5B-CEV-1/F7 oder 5B-CEV-1/G7 eingeschlossen sind.
Die erfindungsgemäße Elternzellinie und die Subklone davon können angewendet werden, um die Entwicklung von Vogel-Eimeria-Arten in vitro zu unterstützen. Während sich die Beschreibung unten spezifisch auf Verfahren und Impfstoffzusammensetzungen für E. tenella-Infektionen bezieht, versteht es sich, daß andere Vogelparasiten-Pathogene, einschließlich Viren, ebenso wie andere Tierartenprotozoen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zellinie in analogen Verfahren herge stellt werden können. So kann die Zellinie ein Expressionssystem für eine Vielzahl pathogener Antigene und anderer Proteine zur Verwendung in der Untersuchung, Charakterisierung und Erzeugung von Impfstoffkomponenten liefern. Als einzige existierende kontinuierliche Zellinie, die den Präpatent- Lebenszyklus von Vogel-Eimerien repliziert, bietet die Zelle ein einzigartiges Substrat, um enzymatische und genetische Eigenschaften einer parasitenpermissiven Zellinie zu untersuchen.
Die Zellinie der Erfindung liefert auch ein Mittel zur Erzeugung von rekombinanten Vogelimpfstoffkomponenten, z. B. Untereinheit-Antigene, die von Reovirus, Coronavirus, Herpesvirus, Para- und Orthomycoviren stammen. Die Zellinie kann mit einem rekombinanten DNA-Molekül oder einem Expressionsvektor, der ein ausgewähltes Pathogenprotein oder Peptid unter der Kontrolle üblicher Steuerkontrollsequenzen kodiert, transfiziert werden und gezüchtet werden. Das rekombinante Protein kann dann durch die kultivierte 5B-CEV-1-Zellinie oder ihre Nachkommen exprimiert werden.
Die neue Zellinie liefert auch ein Substrat zur Replikation anderer Eimeriaarten. Diese kontinuierliche Zellinie der Erfindung kann auch verwendet werden, um unabhängige Stadienspezifische Komponenten intrazellulärer Parasitenstadien zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Zellinie liefert spezifisch die einzige Quelle für leicht verfügbare Parasiten-DNA, RNA und Proteine von intrazellulären Strukturen. Weiterhin kann diese Zellinie verwendet werden, um andere erwünschte, ausgewählte Pathogene zu züchten.
Die 5B-CEV-1-Zellen der vorliegenden Erfindung lassen die Entwicklung der Hühnerart E. tenella und E. necatrix ebenso wie die Entwicklung der Truthahnkokzidien E. adenoides und E. meleagrimilis zu. Es wird erwartet, daß die Zellinie auch die Entwicklung anderer Arten, z. B. E. acervulina und E. maxima zuläßt.
Die derzeit bevorzugten Kulturbedingungen zum Wachstum der Zellinie schließen ein, daß man die Zellinie in Medium 199 [Irvine Scientific] und 5% fötalem Rinderserum (FBS) (oder einem Äquivalent wie Optimen und 1% FBS) unter Inkubationsbedingungen von 5% CO&sub2; und 40,5ºC züchtet. Die Zellen wachsen langsamer bei 37ºC und erreichen selten ein Zusammenfließen und erfordern mindestens 10% Serum. Andere Züchtungsbedingungen, einschließlich der Rezepturen für die Medien im Hinblick auf spezifische Nährstoffe, Sauerstoffgehalt und vermindertes Serum können für das Wachstum dieser Zellen angewendet werden und können vom Fachmann auf diesem Gebiet ausgewählt und optimiert werden.
Die neue Zellinie der Erfindung 5B-CEV-1/P wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland am 3. Juli 1990 unter der Hinterlegungsnr. ATCC Nr. CRL-10497 hinterlegt. Die Entwicklung dieser Zellinie wird im Detail in Beispiel 1 unten beschrieben. Die Nachkommenzellinie 5B-CEV-1/F7 wurde ebenso am 3. Juli 1990 unter der Hinterlegungsnr. ATCC Nr. CBL-10495 hinterlegt. Die Nachkommenzellinie 5B-CEV-1/G7 wurde am 3. Juli 1990 unter der Hinterlegungsnr. CRL-10496 hinterlegt. Diese Hinterlegungen erfolgten nach den Erfordernissen des United States Patent and Trademark Office für die Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke und den Erfordernissen des Budapester Vertrages.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin eine Vielzahl von Impfstoffkomponenten und Zusammensetzungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zellinien hergestellt werden. Eine besonders wünschenswerte Ausführungsform der Erfindung ist eine Impfstoffzusammensetzung, die von Eimeria-Parasiten abgeleitet ist. Diese Impfstoffzusammensetzung kann Vollzellextrakt (lebend oder inaktiviert) von den oben beschriebenen Zellinien, die mit einem ausgewählten Pathogen infiziert sind, oder Subfraktionen davon enthalten. Diese Impfstoffzusammensetzungen können auch modifizierte zelluläre oder parasitische Antigene enthalten, die hergestellt wurden, indem die Kulturbedingungen der infizierten Zellinie modifiziert wurde.
In einer Ausführungsform werden Impfstoffzusammensetzungen zur Verwendung in Impfstoffen für Vogelkokzidiose entwickelt, indem eine Zellinie der Erfindung mit einem ausgewählten Parasiten, bevorzugt einem Eimeria-Parasiten, z. B. E. tenella, infiziert wird. Die Infektion der Zellen wird überwacht durch Verwendung eines in vitro-Enzymimmunosorbensassays (ELISA) unter Anwendung von in üblicher Weise entwickelten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern für verschiedene Lebenszyklusstufen des Parasiten. Die Infektion kann auch mit einem radioaktiv markierten Uracilaufnahmeassay gemessen werden. Sowohl der ELISA- als auch der Aufnahmetest sind im Detail in Beispiel 2 unten beschrieben.
Ungefähr 72 Stunden nach der Infektion werden die Zellen und Medium oder extrazelluläre Ausscheidungen geerntet, indem Zellen und/oder Kulturflüssigkeit gesammelt werden. Als fakultative Stufe kann, falls notwendig, die Kulturflüssigkeit inaktiviert werden unter Verwendung üblicher Techniken, z. B. durch aufeinanderfolgende Einfrier/Auftauzyklen oder durch die Zugabe von Filtrations-, Denaturierungs- oder Vernetzungsmitteln, wie β-Propiolacton, Formaldehyd oder Glutaraldehyd.
Verschiedene Anteile dieses infizierten Zellkulturpräparates können für Impfstoffzusammensetzungen angewendet werden:
1. Das gesamte Präparat ohne Subfraktionierung;
2. Ein modifiziertes Präparat, das durch Veränderungen der Kulturmedien und Bedingungen beeinflußt wurde, (z. B. das Weglassen von Serum während der kritischen Wachstumsphasen, Änderungen von pH odet Ionen);
3. Subfraktionierung, um zellassozierte lösliche Komponenten zu erzeugen und
4. Subfraktionierung und modifizierte Impfstoffkomponenten.
Eine Ausführungsform einer Impfstoffzusammensetzung oder von Impfstoffkomponenten gemäß der Erfindung wird hergestellt, indem die infizierten Zellen der oben beschriebenen Kultur durch Schaben zerstört werden. Die entstehende aufgerissene Zellzusammensetzung wird für ein Impfstoffpräparat ohne weitere Trocknung oder Hydratisierung verwendet.
Als weitere Impfstoffkomponente der Erfindung kann die oben beschriebene Impfstoffkomponente modifiziert werden, indem die Serumkonzentration oder Serumkomponenten oder andere Nährzusätze in dem zur Züchtung der mit Parasiten infizierten Zellinie der Erfindung angewendeten Medium verändert werden. Z. B. können frühe Stufen des Parasiten gestoppt werden, indem die infizierte Zellinie in Minimalessentialmedium, MEM, gezüchtet wird. Alternativ kann, indem chemisch definierte Medien eingesetzt werden, die Zellinie spätere Stufen der Parasitenentwicklung, die in dem Impfstoff entwickelt werden sollen, zulassen. Zusätzliche Nährstoffveränderungen des Mediums, die die Parasitenentwicklung beeinflussen und die antigenen Proteine, die in der erfindungsgemäßen Zellinie hergestellt werden, modifizieren, betreffen die Zugabe oder Wegnahme von Biotin, Cholinchlorid, Insulin und/oder nichtessentiellen Aminosäuren zu dem Medium.
Eine modifizierte Impfstoffkomponente kann auch in der infizierten Zellinie erzeugt werden durch Anwendung klassischer mutagener Techniken, z. B. die Zugabe von alkylierenden Mitteln, komplexierenden Mitteln, dimerisierenden Mitteln oder die äußere Behandlung der Zellinie mit Ultra-Violettlicht während der Züchtung der infizierten Zellinie. Diese Mittel können die Zelle genetisch modifizieren und liefern eine veränderte Fähigkeit, abnorme Parasiten zu erzeugen. Alternativ kann abhängig von der Entwicklungsstufe des Parasiten innerhalb der Zelle, wenn er das erste Mal mit dem mutagenen Mittel in Kontakt kommt, der Parasit selbst direkt mutagenisiert werden zur Erzeugung einer bevorzugten Impfstoffkomponente.
Eine weitere Ausführungsform einer Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung für die prophylaktische Behandlung von Aves, insbesondere Geflügel, gegen Kokzidien wird mit den obigen Methoden erzeugt unter Verwendung von Subfraktionen, die aus den aufgerissenen Zellen und dem Medium aus der Zellkultur gebildet werden. Diese Fraktionen werden erhalten, indem die Medien zuerst von den Zellfraktionen abgetrennt werden, z. B. durch Zentrifugation, Größe, Molekulargewicht, Ladung oder verschiedene übliche chemische Mittel. Diese Fraktionen werden dann als Impfstoffzusammensetzungen angewendet, die den Vögeln verabreicht werden können. z. B. wird eine Fraktion der oben beschriebenen Zellkultur erhalten, indem das die aufgerissenen Zellen enthaltende Medium zentrifugiert wird. Das Medium wird entfernt und das verbleibende Material pelletisiert, um die zellulären Komponenten zu erhalten. Dieses Pellet wird in frischem Gewebekulturmedium resuspendiert. Außerdem kann die Fraktion des Überstandes als Impfstoffkomponente verwendet werden.
Eine oder mehrere der oben beschriebenen Impfstoffkomponenten können mit einem üblichen Adjuvans vermischt oder an diesem adsorbiert werden oder ohne ein Adjuvans verabreicht werden.
Das Adjuvans wird als unspezifisches Reizmittel verwendet, um Leukocyten anzuziehen und die Immunantwort zu verbessern. Solche Adjuvantien schließen unter anderem Öl und Wasser, Aluminiumhydroxid, Muramyldipeptid, abgetötete Bordetella und Saponine, wie Quil A, ein. Derzeit ist das bevorzugte Adjuvans Amphigen [Hydronics Inc.; US-Patent Nr. 5,084,269].
Eine bevorzugte Impfstoffdosierung liegt zwischen ungefähr 0,05 ug und 100 ug Parasitenprotein. Andere geeignete therapeutisch wirksame Dosen können leicht vom Fachmann auf diesem Gebiet bestimmt werden auf Basis der obigen immunogenen Mengen, dem zu behandelnden Zustand und den physiologischen Eigenschaften des Tieres. So liefert ein pharmazeutisches Präparat eine Einheitsdosis von 0,1 bis 2 ml eines sterilen Präparats einer immunogenen Menge der aktiven Impfstoffkomponenten oder einer Kombination davon. In Gegenwart zusätzlicher aktiver Mittel können diese Einheitsdosierungen leicht vom Fachmann auf diesem Gebiet eingestellt werden.
Eine wünschenswerte Dosierung beinhaltet die Verabreichung von 1 bis 2 Dosen der gewünschten Impfstoffzusammensetzung, wobei der Antigengehalt jeder Fraktion wünschenswerterweise wie oben angegeben ist. Die Verabreichungsart der Impfstoffe der Erfindung kann irgend ein geeigneter Weg sein, der den Impfstoff dem Wirt zuführt. Der Impfstoff wird jedoch bevorzugt subcutan verabreicht. Der Impfstoff kann jedoch auch dem Futter oder Wasser zur Aufnahme in Form einer Suspension zugegeben werden. Andere Verabreichungsarten können auch, falls erwünscht, angewendet werden, z. B. intradermal, intravenös oder intramuskulär.
Es versteht sich jedoch, daß die spezifische Dosishöhe, die Art und der zeitliche Ablauf der Verabreichung für jedes spezielle Tier von einer Vielzahl Faktoren abhängen, einschließlich dem Alter, dem allgemeinen Gesundheitszustand und der Nahrung des Tiers; der Tierart; synergistischen Wirkungen mit irgendwelchen anderen Arzneimitteln, die verabreicht werden, und dem Grad an Schutz, der erreicht werden soll. Natürlich kann die Verabreichung in geeigneten Intervallen wiederholt werden, falls notwendig oder wünschenswert.
In vorbereitenden Tests mit diesen Impfstoffen wird die Leistung bei Vögeln verbessert. Vorbereitende Ergebnisse zeigen, daß der oben beschriebene Impfstoff, der einfach durch Dekantieren von konditioniertem Medium oder Aufreißen von 5B- CEV-1-Zellen gebildet wurde durch Ernten der Zellflüssigkeit durch Zentrifugation, die Ergebnisse bei einer Exposition der Vögel verbessert. Außerdem wurde auch gezeigt, daß die oben beschriebene, als Impfstoff verwendete Subtraktion in einem in vivo-Test wirksam ist. Die in vivo-Tests werden wie folgt durchgeführt. Zwei Wochen alte Küken werden subcutan mit 1 ml Kulturmedium immunisiert. Zwei Wochen später werden die Küken mit 10.000 Oocyten von E. tenella beaufschlagt. Für die nächsten 6 Tage werden die Hühner überwacht im Hinblick auf Gewichtszunahme und Futterverwertung. Intestinalschäden oder intestinale Veränderungen werden danach gescreent und auf dieser Basis eine Wertung durchgeführt. Dieser Test wird genauer in Beispiel 4 unten beschrieben.
Zusätzlich zu der Verwendung der erfindungsgemäßen Zellinien zur Entwicklung von Impfstoffen können diese Zellinien auch verwendet werden für Methoden zum Screenen von antiparasitischen Mitteln bei der Entwicklung von neuen Antikokzidien- Arzneimitteln. Z. B. können Kulturen von infizierten Zellen in üblicherweise markiert werden, z. B. mit einem radioaktiven Molekül. Das für den Test ausgewählte Arzneimittel kann dann in die Zellkultur eingearbeitet werden. Die Zellkultur kann dann in diskreten Intervallen nach der Infektion geerntet werden und der Einbau der Markierung des radioaktiven Vorläufers kann bestimmt werden, indem geerntet und prozessiert wird für eine Scintillationszählung. Ein Beispiel eines sol chen Arzneimittelscreenings unter Anwendung von α-Amanitin als Testarzneimittel wird im Detail in Beispiel 5 unten beschrieben. Wenn ein Arzneimittel bei einer bestimmten Dosis oder zu einer bestimmten Verabreichungszeit wirksam ist, sollte der Einbau von Zellimpulsen (Parasitenmaterial) gestoppt werden. Wenn keine Hemmung des Einbaus der Markierung beobachtet wird, ist das Arzneimittel unwirksam für die Kontrolle der Parasiteninfektion in vitro.
Andere übliche Arzneimittelscreeningarten, die dem Fachman auf diesem Gebiet bekannt sind, können auch unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zellinien angewendet werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben erläuternd die Herstellung der neuen kontinuierlichen Zellinien der Erfindung. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung und begrenzen den Schutzbereich der Erfindung in keiner Weise.

Beispiel 1

Isolierung der Elternzellinie 5B-CEV-1/P und der Klone SB- CEV-1/F7 und 5B-CEV-1/G7

5B-CEV-1-Zellen wurden isoliert aus einer anormalen Gewebemasse (ungefähr 1 cm · 2 cm) die mit dem Eingeweidebindegewebe eines 20 Tage alten SPAFAB (COFAL-24] Hühnerembryos verbunden war. Das Gewebe wurde aseptisch entfernt und in Hank's basischer Salzlösung (HBSS) gespült, die 1% Fungi-Bact-Lösung [Irvine Scientific, Irvine, CA] enthielt. Das Gewebe wurde mit Messern zerkleinert, dann enzymatisch dissoziiert unter Verwendung von 0,25% Trypsin (1 : 250) in HBSS. Die dissoziierte Zellsuspension wurde in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt, das 0,5 ml fötales Rinderserum enthielt, um das Trypsin zu inaktivieren, und bei 700 g 10 Minuten lang zentrifugiert.
Die Zellen wurden in 5 ml Weymouth's MAB87/3 Medium [Irvine Scientific], das mit 8 mg/l Rinderinsulin [Collaborative Research, Inc. Bedford, MA], 12 ml/l 200 mM L-Glutamin und 1% Fungi-Bact-Läsung [Irvine) ergänzt war, resuspendiert. Dieses Volumen von 5 ml wurde in einen 25 cm² Corninggewebekulturkolben pipettiert und bei 40,5ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Nach 24-ständiger Inkubation wurden die Medien ausgetauscht. Diese primäre Kultur enthielt zahlreiche Explantate mit Zentren epithelartiger Zellen und ausstrahlenden Fibroblasten.
Nach 72 Stunden wurde die fast zusammenfließende Kultur einmal mit Ca++/Mg++ freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann mit 0,02% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in HBSS behandelt, um die Zellen zu dissoziieren. Die entstehende Zelldispension wurde dekandiert, die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und in dem MA387/3 Medium, was vorher verwendet wurde, resuspendiert. Diese Kultur wurde dann 1 : 10 aufgeteilt, wobei Passage-1 (P1) erzeugt wurde, indem Zellen in sieben 25 cm² Kulturkolben und in zwei 60 mm² Petrischalen plattiert wurden. Die Kulturen wurden wie vorher inkubiert.
Die Medien wurden bei aktiv wachsenden Kulturen nach 72 Stunden ausgetauscht, wobei das fötale Rinderserum (FBS) weggelassen wurde. Die Medien in einem Kolben wurden durch Medium 199 [Irvine Scientific], das mit 10% FBS ergänzt war, ersetzt. Nach weiteren 48 Stunden Inkubation zeigte die Kultur, die Medium 199 enthielt, aktiv wachsende Zellen, während die MAB87/3-Kulturen statisch waren. Ein erneutes Zuführen von Serum zu diesen Kulturen bis zu 10% förderte das Zellwachstum nicht in dem Maße, wie es mit Medium 199 beobachtet wurde. Daher erfolgte im folgenden jede Subkultivierung in Medium 199 plus 10% FBS.
Eine weitere Subkultivierung erfolgte (Passage-2 bis Passage- 11), als die Kolben Konfluenz erreichten. Mit ansteigender Passagezahl wuchsen die Zellen langsamer, wurden fibroblastoid und hatten große Vacuolen und gaben Bruchstücke ins Medium ab. Zusätzliche Medienrezepturen (EMEM + 10% FBS; RPMI 1640 + 10% FBS; DMEM/Ham's F-12 + 5% FBS) wurden an diesen Zellen getestet, um diese Vergreisung zu stoppen oder ihr entgegen zu wirken. Die Zellen zeigten jedoch die geringste Verschlechterung im Medium 199. Zellen aus verschiedenen Passagen (P4, PS, P6, P7, P9, P10) wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren. Diese Stellen schienen die Krise bei P11 bis P13 zu erreichen und starben.
Ein 75 cm² Kolben mit P11-Zellen, der sehr wenig isolierte Zellfoci enthielt, wurde wiederholt mit Medium 199 und 10% FBS 58 Tage nach der letzten Subkultivierung gefüttert. Zu diesen Zeitpunkt begannen fibroblastartige Zellen ausserhalb dieser Foci zu wachsen. Nach weiteren 15 Tagen erreichten die Zellen in diesem T-75-Kolben Konfluenz und wurden 1 : 2 aufgespalten, was P12 erzeugte.
Die Subkultivierung wurde bis zur Gegenwart in Medium 199 [Gibco Laboratories, Grand Island, NY], 3,43 ml/l 200 mM L- Glutamin und 1% Antibiotikum-Antimycoticum [Gibco Laboratories] fortgesetzt unter Verwendung des Kriteriums bezüglich der Passage, daß alle 7 Tage 1 : 20 aufgespalten wurde. Die Zellen haben alle Epitheleigenschaften verloren und sind unterscheidbar fibroblastartig in der Morphologie. Andere Medienrezepturen, die erfolgreich von der Krise ab verwendet wurden, schließen Weymouth's MAB87/3 und 5% FBS, Dulbecco' s MEM [Gibcco Laboratories] und 5% FBS und MEM mit Earle's Salzen [Gibcco Laboratories]und 5% FBS ein. Das Erfordernis für FBS wurde auf 5% reduziert für 5B-CEV-1-Zellen von Passage 24, die einer Subklonierung unterzogen wurden, indem sie unter Verwendung einer Einzelzelleisolierung in 96 Napfmikrokulturplatten verdünnt wurden. Diese Technik erzeugte 25 Klone aus der Elternzellinie 5B-CEV-1/P in unkonditioniertem Medium 199 mit 5% FBS. Von diesen Klonen zeigten zwei, die mit 5B-CEV-1/F7 und 5B-CEV-1/G7 bezeichnet wurden, eine außergewöhnliche Fähigkeit, die asexuelle Entwicklung von E. tenella zu fördern.
Diese zwei Klone wurden zusammen mit der Elternlinie, 5B-CEV- 1/P bei ATCC hinterlegt, wie oben angegeben. Passage Nr. 10 wurde für beide Klone hinterlegt und Passage Nr. 20 für die Elternlinie.
Einfrieren hatte keine schädliche Wirkung auf die Zelleistung, da viele gefrorene Proben erfolgreich wieder hergestellt wurden. Eine biologische Standardqualitätskontrolle war befriedigend bei P33 der Elternlinie. Außerdem zeigt die Elternlinie einen Kariotyp von ungefähr 42 Chromosomen, ist negativ bezüglich reverser Transcriptase, exprimiert keine Vogel-Retroviren (z. B. Vogelleukose), exprimiert keine anderen endogenen Pathogene (Säugetier oder Vogel), ist tumorigen in nu/nu-Mäusen und zeigt keine bakterielle, Pilz- oder Mycoplasmakontamination. Eine geringe Anfälligkeit für Virenteilchen vom Typ A, die mit dem endoplasmatischen Retikulum verbunden sind, wurde aufgelöst durch Transmissionselektronenmikroskopie. Die Elternlinie ebenso wie die beiden Klone zeigten Isoenzym-Focosierungsprofile, die ähnlich denen von BHR-21-Zellen waren [National Veterinary Services Laboratory] und unähnlich denen von 5129-Zellen (einer transformierten Hühner-Fibroblastenlinie) [ATCC Nr. CR11590] für die Enzyme Lactosedehydrogenase, Malatdehydogenase, Nucleosidphosphorylase, Peptidase A und Phosphorglucomutase. Im Gegensatz dazu sind beide Klone und die Eltern-5B-CEV-1- Linie morphologisch distinkt von BHR-21- und ACC-111-Zellen. Außerdem zeigen die 5B-CEV-1-Zellinien eine hohe Inzidenz für mehrkernige Riesenzellen. Am wichtigsten ist es, daß 5B-CEV- 1-Zellen einen hohen Anteil an Parasitenmaterial von verschiedenen Stadien des Eimeria-Präpatent-Lebenszyklus produzieren.

Beispiel 2

Assays, um die Parasitenentwicklung in der Zellinie zu überwachen.

A. Der direkte Enzyme linked Immunosorbentassay auf Sporozoitenbasis zum Nachweis von Kokzidienproteinen (SPZELISA) beinhaltet die Haftung von Antigen (z. B. Überständen von nicht infizierten oder infizierten F7-Zellen oder aufgerissenen Sporozoiten (SPZ) oder Merozoiten) in zweifachen Reihenverdünnungen an dem Napfeines 96- Napftabletts. Antikörper, die SPZ-Antigene erkennen, binden an das Antigen in einer dosisabhängigen Reaktion. Nachdem der primäre Antikörper gefunden ist, wird ein zweiter Antikörper, der in Ziegen gegen Kaninchen IgG erzeugt wurde, der auch biotinyliert ist, zugegeben. Wiederum bindet dieser Anti- Kaninchenantikörper an den Kaninchen #15, 16 Anti-SPZ- Antikörper, der vorher an das Antigen in den Näpfen gebunden hat. Die Anti-SPZ-Antikörper wurden wie folgt hergestellt. Gereinigte Sporozoiten (unten beschrieben) für E. tenella wurden in serumfreiem Medium in einer Konzentration von 2-5 · 10º Sporozoiten/ml suspendiert. Ein gleiches Volumen Freunds komplettes Adjuvans wurde zugegeben, vermischt und 0,5 ml wurden subcutan an 2-4 Stellen am Rücken von weißen Neuseeland-Kaninchen (gemischtes Geschlecht) mit 6 kg geimpft. Boosterimpfungen wurden in ähnlicherweise gegeben unter Verwendung von inkomplettem Freunds Adjuvans in Intervallen von 2-4 Wochen (Minimum 3 Impfungen). Blut wurde in Serum-Vacutainern (Becton-Dickenson) zwei Wochen nach der dritten Impfung gesammelt. Das Serum wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerinnen gelassen und dann mit 2000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert, um das Gerinsel zu pelletisieren. Das Serum wurde entfernt, in Aliquots mit je 1,5 ml pro Röhrchen aufgeteilt und bei -20ºC aufbewahrt. Nachdem der zweite Antikörper gebunden hat, wird ein mit Enzym markierte s Streptavidin, das an Biotin bindet, zugegeben. Das Substrat wird inkubiert und das über Streptavidin an den Napfgebundene Enzym wandelt das Substrat in eine sichtbare Form um. Die Menge an Farbe, die gemessen wird, ist proportional der Menge an Antigen, das mit SPZ-Proteinen in dem Testüberstand kreuzreagiert. Auf der Platte sind Proben enthalten, die Antigene von nicht infizierten Überständen enthalten, als negative Kontrolle, ebenso wie mit Ultraschall aufgerissene SPZ. Dieses Sporozoitenmaterial dient als positive Kontrolle und wird verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen, gegen die Parasitenantigene in infizierten überstanden gemessen werden. Auf diese Weise kann parasitenspezifisches Material in infizierten Zellüberständen quanitativ bestimmt und verglichen werden.
Ungefähr fünfzig 3-4 Wochen alte Vögel werden jeweils oral mit 100.000 E. tenella-Oozysten infiziert. Blindsäcke wurden nach ungefähr 7,5 Tagen geerntet und der Lumeninhalt einem Pepsinverdau unterzogen. Die Oozysten wurden dann einer Sporenbildung in 2,5% Kaliumdichromat 3-4 Tage lang unterzogen und mit Chlorbleiche sterilisiert. Die sterilisierten Oozysten werden in Medium 199 plus 2x Antibiotikum bei 4ºC aufbewahrt. Allgemein lieferten 50 Vögel ungefähr 5 · 109 Oozysten. Dieses Protokoll wird alle 3-4 Wochen wiederholt, um die Virulenz aufrecht zu erhalten.
Zellkulturantigen für den Assay wird erzeugt mit dem folgenden modifizierten Exzystierungsverfahren. Die Sporozysten werden gereinigt, indem 10 ml Oozysten (3 · 10'/ml) mit 5 ml 0,5 um Glasperlen in einer kleinen Kugelmtihlenkammer aufgebrochen werden und die Bruchstücke abgetrennt werden unter Verwendung von 0,75 M Sacharose in PBS gefolgt von einer Zentrifugation unter Verwendung von 50% isotonischem Percoll. Unter Verwendung einer Lösung, die aus 4% (G/V) Tauradeoxycholinsäure, 0,25% (G/V) Trypsin, HBSS besteht, wobei der pH mit Bicarbonat auf 8,0 eingestellt wird, wird eine SPZ- Exzystisierung durchgeführt, indem diese Mischung mit den gereinigten Sporozysten bei 40,5ºC 60-90 Minuten lang unter Vortexen in Intervallen von ungefähr 15 Minuten inkubiert wird. Die SPZ werden dann gesammelt unter Verwendung von 60% isotonischen Percoll, das Pellet wird in serumfreien Medium wieder suspendiert und ausgezählt. Allgemein liefern 3 · 10&sup8; Oozysten ungefähr 7,2 · 10&sup8; SPZ (30%). Die SPZ werden beschallt und bei -20ºC als Standardquelle für das Antigen für den Test aufbewahrt.
Das Beimpfen mit Antigen wird wie folgt durchgeführt. 200 ul Antigen, hergestellt in 10 mM Boratpuffer, pH 9,0, werden in die oberen Näpfe einer 96 Napf-Nung-Immunoplatte gegeben. Alle verbleibenden Näpfe, enthalten 100 ul des Boratpuffers alleine. Zweifache Reihenverdünnungen werden in den Reihen B- G gemacht. Reihe H enthält nur Puffer und wird als negative Kontrolle verwendet. Die Näpfe werden mit Parafiln bedeckt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die SPZ-Kontrolle wird mit 10 ng in die obere Reihe der Näpfe gegeben. Antigen ohne 1% FBS wird mit 100 ng und Antigen +1% FBS [Gibcco] mit 1000 ng beladen. Die Antigene im überstand von uninfizierten F7- Zellen werden als negative Kontrolle in jedem Test eingeschlossen. Die überstände, die nach 72 Stunden aus einer angegebenen infizierten Passage von F7-Zellen geerntert wurden, sind auch auf jeder Platte als innerer Standard enthalten. Die überstände von 72 Stunden werden zuerst quanitativ mit SPZ ELISA ausgewertet und dann ihr relativer Wert mit der SPZ-Kontrolle verglichen, um die Variabilität von Assay zu Assay zu überwachen und einzustellen.
Als nächstes werden die überstände 3x mit PBS + 0,05% Tween- 20 (PBS-T) gewaschen und blockiert, indem 200 ul 5% Magermilch (Difco) in PBS-T jedem Napfzugegeben werden. Die Näpfe werden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und mit Plastikfolie bedeckt und wiederum 3x mit PBS-T gewaschen. Der erste Antikörper wird dann zugegeben. 100 ul Kaninchen-Anti-SPZ-Antikörper #15, 16, verdünnt auf 1 : 20.000 in 0,5% BSA in PBS-T wird pro Napfzugegeben und die Platten werden 1 Stunde bei 37ºC, bedeckt mit Plastikfolie, inkubiert. Die Platten werden wiederum 3x mit PBS-T gewaschen. Dann werden der konjugierte Antikörper, 100 ul einer 1 : 2.000 Verdünnung von mit Biotin markiertem Ziege-Antikaninchen-IgG (KP) in 2% Magermilch in PBS-T pro Napfzugegeben. Die Platten werden wiederum 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und dann 3x mit PBS-T gewaschen. Danach werden 100 ul einer 1 : 1.500 Verdünnung von mit Peroxidase markiertem Streptavidin [Kirkegaard Perry] in 2% Magermilch in PBS-T pro Napfzugegeben. Die Platten werden dann 1 Stunde bei 37ºC im Dunkeln inkubiert und 3x mit PBS-T gewaschen. TMB-Peroxidase [Kirkegaard Perry] wird in einem Verhältnis von 1 : 1 mit H&sub2;O2 vermischt und 100 ul Substrat pro Napfwerden zugegeben. Die Platten werden dann 15-30 Minuten lang bei 37ºC in der Dunkelheit inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraumes werden 100 ul 1 M HCl pro Napfzugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Werte werden bei 450 nm am Vmax abgelesen.
8. Ein weiterer Assay, der angewendet wird, um die Parasitenentwicklung in den Zellen zu überwachen, nutzt die Fähigkeit des Parasiten, nicht aber des Wirts, aus,. radioaktiv markiertes Dracil in die RNA einzubauen [D. M. Schmatz et al., J. Protozool., 33 : 109-114 (1986)]. Kurz gesagt werden Kulturen von Zellen in Mikrotiterplatten mit 1 · 105 Zellen/ml, 0,1 ml/Napf, 24 Stunden vor der Infektion mit E. tenella mit 1 · 105 Sporozoiten/Napfgeimpft. Die Sporozoiten werden mit den Zellen 4 Stunden lang bei 40,5ºC inkubiert und dann durch Waschen mit serumfreiem Medium entfernt. Die Zellen werden dann mit Medium und Serum überschichtet und 24 Stunden lang inkubiert. 24 Stunden nach der Infektion werden die Zellen gewaschen und dann wieder mit Medium beschickt, das [3H]-Uracil enthält. Die Markierung wird über einen Zeitraum von 24 Stunden eingearbeitet und dann werden die Zellen auf Filtern gesammelt unter Verwendung eine s Zellerntegerätes (Cambridge Technology, Inc.). Die Radioaktivität auf den Filtern wird in einem Beckmann LS 3801 Flüssigszintillationszähler bestimmt nach Zugabe des wäßrigen Szintillationscocktails (Beckman Ready Safe). Der Nulleffektimpuls und die in uninfizierte Zellen eingebaute radioaktive Markierung werden auch gemessen.

Beispiel 3

Vogelimpfstoff

A. Eine Impfstoffrezeptur wird erstellt aus einem 5B-CEV-1/P- Wirtszellklon, mit dem in einer Rate von 1,0 · 10&sup5; Zellen/ml ein T-150 Kolben, der 30 ml Medium 199 mit 5% FBS [Irvine Scientific] oder OptiMEM enthaltend 1% FBS enthält, beimpft wird. E. tenella-Sporozoiten, die mit üblichen dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Techniken exzystiert wurde, werden als Inoculum 24 Stunden später in einer Rate von 1 · 10b/ml verwendet. Die Sporozoiten werden 2 Stunden lang sich ausbreiten gelassen, wonach nicht eingedrungene Sporozoiten durch vorsichtiges Waschen entfernt werden. Frisches Medium wird zu jedem Kolben zugegeben. In Intervallen von 24 Stunden nach der Infektion werden die Kulturmedien gesammelt, mit 3.000 · g 30 Minuten lang zentrifugiert und mit 5% Amphigen als Adjuvans versetzt. Dieses Präparat (als 24 Stunden Überstand, 48 Stunden-Überstand, 72 Stunden-Überstand etc. bezeichnet) wird bis zur Verwendung bei 4ºC aufbewahrt.
B. Eine alternative Rezeptur verwendet die verbleibenden Zellen von dem oben beschriebenen Impfstoff. Ein Volumen von 30 ml frischem Medium, Medium 199 oder OptiMEM, wird in den T- 150 Kolben gegeben und die Zellen werden in die Suspension geschabt. Diese Suspension wird gesammelt, einem Einfrier- /Auftauzyklus unterzogen und mit 5% Amphigen als Adjuvans versetzt. Dies Formulierung wird bis zur Verwendung bei 4ºC aufbewahrt.
C. Eine weitere alternative Formulierung verwendet die gesamte infizierte Kultur von dem oben beschriebenen Impfstoff, unfraktioniert. Bei der Ernte werden die infizierten Zellen in die Suspension geschabt. Diese Suspension wird gesammelt, einem Einfrier/Auftauzyklus unterzogen und mit 5% Amphigen als Adjuvans versetzt. Diese Formulierung wird bei 4ºC aufbewahrt.

Beispiel 4

Daten über die Immunogenizität

A. Immunogenizitätsuntersuchung #1 bei Brathähnchen

Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, um die von einer E. tenella-Zellkultur stammenden Antigene bezüglich der Immunogenizität bei handelsüblichen Brathähnchen zu screenen, wobei Amphigen und Freunds komplettes Adjuvans (FCA) als Adjuvantien für die primäre Immunisierung verglichen wurden.
Dreihundert 4 Tage alte direkt gezogene direkt im Handel erhältliche Hähnchenküken wurden in 20 Gruppen eingeteilt (15 Vögel pro Gruppe und die Flügel mit Bändern versehen), wie folgt. PSB bezieht sich auf parasitenspezifisches Protein, das quantitativ ausgewertet wurde unter Verwendung des direkten SPZELISA, wie in Beispiel 2 oben beschrieben.
Küken der Gruppen 1-8 wurden subcutan (sc) im Alter von 4 Tagen immunisiert, wie bezeichnet, und oral mit der gleichen Menge Antigen in 5% Amphigen im Alter von 7 Tagen geboostert. Beide Kontrollgruppen erhielten 1 ml Impfungen von Gewebekulturmedium (Gibco-Medium 199 + 1% FBS), das mit 5% Amphigen oder 1 : 1 mit FCA als Adjuvans versetzt war [SIGMA]. Das Antigen für die Gruppen 3-8 wurde aus Wirtszellklonen F7 (P24-31) für das 24 Stunden-Antigen und F7 (P24-29) sowohl für das 48 Stunden- als auch das 72 Stunden-Antigen hergestellt. Die Antigene wurden bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt oder einem Einfrier/Auftauzyklus unterzogen.
E. tenella Oozysten für die Gruppen 9A und 9B wurden oral verabreicht, 500 Oozysten pro Tag an 5 aufeinanderfolgenden Tagen (Lilly Strain #65 strain, Lilly, CO) [Geschenk von der Universität von New Hampshire (UNH)]. Außerdem erhielten die Vögel der Gruppe 9B eine s.c.-Injektion von 50% FCA im Alter von 4 Tagen.
Die Gruppen 2-9 wurden mit 35.000 L. S. #65 E. tenella- Oozysten (Nummer bestimmt durch Titration) im Alter von 21 Tagen beaufschlagt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Körpergewicht aller Küken gemessen und die Nahrungsverwertung während des Präpatentzeitraumes überwacht. 6 Tage nach der Beaufschlagung wurden Körpergewichte, Nahrungsverwertung und Blindsackbewertung gemessen.
Die klinischen Daten von Versuch #1 wurden in Tabelle 1 und 2 zusammengefaßt. Alle statistischen Vergleiche mit den kleinsten Quadraten für die Gewichtszunahme erfolgten zwischen geimpften und der nicht immunisierten/belasteten (UI/C) Kontrollgruppe. Die Haupteffekte, die getestet wurden, schlossen Behandlung, Federn innerhalb der Behandlungsgruppen, Geschlecht und eine Wechselwirkung zwischen Geschlecht und Behandlung ein. Sowohl die Datensätze für Amphigen als auch für FCA wurden getrennt getestet. Für beide Datensätze ergab die Analyse über die Geschlechter eine beträchtliche Wechselwirkung mit der Behandlung. Kein Effekt durch das Geschlecht wurde für die Schädigungsbewertung gemessen. Die Futterverwertung wurde nur bezüglich der Behandlungswirkungen getestet.
In der folgenden Tabelle bedeutet UI/UC unimmunisiert/unbeaufschlagt und Ag bedeutet Antigen. Tabelle 1 Klinische Ergebnisse für Versuch #1- Amphigen
*p< 0,05
#p< 0,1 Tabelle 2 Klinische Ergebnisse für Versuch #1 FCA
* p< 0,05
Mit Amphigen als Adjuvans versehene Zellkulturantigene, die im Alter von 4 Tagen s.c. verabreicht wurden und im Alter von 7 Tagen oral verabreicht wurden, riefen eine signifikante (p< 0,05) oder fast signifikante (p< 0,1) Gewichtszunahme hervor, wobei ein Schutz gegenüber 35.000 E. tenella-Oozysten in den Käfigbatterien bestand. Das Schema 24 Stunden-Antigen s.c. gefolgt von 48 Stunden-Antigen oral rief eine signifikante Gewichtszunahmeleistung hervor, während die Gewichtszunahme bei 72 Stunden Antigen und Kombinationen 24/48 Stunden und 24/48/72 Stunden sich der Signifikanz annäherte. Keine der mit Amphigen als Adjuvans verwendeten Behandlungen bewirkte eine Reduktion der Schädigungsbewertung. Nur die mit 72 Stunden-Antigen geimpfte Gruppe zeigte eine signifikante Verbesserung des Futterverwertungsverhältnisses. Bei den mit Tropfen von Oozysten immunisierten Gruppen ergab sich kein signifikanter Schutz.
Die Zellkultur, die mit FCA als Adjuvans versehen worden war, rief keinen signifikanten Schutz vor einer Exposition hervor, gemessen durch Gewichtszunahme oder Futterverwertung. Tatsächlich hatte die Gruppe, die mit der 24/48/72 Stunden-Antigenkombination immunisiert worden war, eine signifikant geringere Gewichtszunahme, als die Belastungskontrollgruppe. Nur die Tropfenoozystengruppe hatte eine signifikante Reduktion der Schädigungsbewertungen.
Die folgenden Schlüsse können aus diesen Daten gezogen werden. Das Schema 24 Stunden s.c./48 Stunden oral-Impfstoff rief einen signifikanten Schutz der Gewichtszunahme gegenüber einer Exposition hervor, wenn Amphigen als Adjuvans verwendet wurde. Das 72 Stunden-Antigen und die Kombination 24/48 Stunden- und 24/48/72 Stunden-Antigen, jeweils mit Anphigen als Adjuvans, zeigte Hinweise auf einen Schutz in bezug auf Gewichtszunahme. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, daß jedes Antigenpräparat entweder eine andere Zusammensetzung von Antigen oder ein anderes Verhältnis gleicher Antigene enthält.
Der Schutz der Gewichtszunahme wurde in Abwesenheit irgendeiner Reduktion der Schädigungsbewertung gemessen, was darauf hindeutet, daß diese Parameter durch verschiedene Mechanismen beeinflußt werden. Gewichtszunahme und Futterverwertungleistung können sogar in Gegenwart von Schädigungen des Blindsacks erhalten bleiben.
Während das 48 Stunden-Antigen allein ineffektiv war, kann dieses Antigen in Kombination mit dem 24 Stunden-Antigen und/oder 72 Stunden-Antigen oder wenn es oral im Alter von 7 Tagen verabreicht wird, kritisch sein, um eine Immunität gegenüber einer Exposition zu erzeugen. Es wird angenommen, daß die 72 Stunden-Antigenernte einen Verbund von Antigenen enthält, die representativ sind für alle 3 Zeitpunkte.
Das FCA war nicht erfolgreich bei der Potenzierung der Immunogenizität von Zellkulturantigenen. FCA alleine kann eine unspezifische Antwort auf eine Exposition hervorrufen, wie durch die höhere Kontrollgewichtszunahme nach der Exposition in dem FCA-Datensatz gezeigt wird.
Die Bedeutung der oralen Dosis, ihre Verabreichungszeit und der nachfolgende Einfluß auf die Leistung bei Bodenkäfigen mit einem Auswachsen nach der Exposition wird mit den folgenden Untersuchungen ausgewertet (Teil B)

B. Immunogenizitätsuntersuchung #2 bei Brathähnchen

Der Zweck dieser Untersuchung war es, verschiedene von E. tenella-Zellkulturen abgeleitete Antigene für die Immunogenizität bei handelsüblichen Brathähnchen zu screenen unter Verwendung von Bodenkäfigen und einem Aufwachsen bis 40 Tage.
Zweihundertfünfzig 4 Tage alte männliche im Handel erhältliche Brathähnchenküken wurden in 10 Gruppen aufgeteilt (25 Vögel/Gruppe und die Flügel mit Bändern versehen) wie folgt. In der Tabelle bedeutet UI/UC/Med unimmunisiert/unbelastet/mit Arzneimittel; UI/UC/Unmed bedeutet unimmunisiert/unbelastet/ohne Arzneimittel und UI/C/Unmed bedeutet unimmunisiert/belastet/ohne Arzneimittel.
Alle Küken wurden bis zu einem Alter von 4 Tagen auf einem Draht gehalten. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Küken in den Gruppen 1-10 s.c. immunisiert und in Bodenkäfige mit sauberem Stroh, wie bezeichnet, gebracht. Die Küken in den Gruppen 5, 7, 9 und 10 wurden oral geboostert, wie angegeben, im Alter von 7 Tagen. Die Kontrollgruppen erhielten 1 ml Inoculationen mit Gewebekulturmedium (Gibco Medium 199 + 1% FBS), mit 5% Amphigen als Adjuvans. Außerdem erhielt Gruppe 1 mit Stenerol als Arzneimittel versehenes Futter mit einem Anteil von 3 ppm während der gesamten Untersuchung. Das Antigen für die Gruppen 4-10 wurde aus Wirtszellklonen F7 (P24-24) und mit 5% Amphigen als Adjuvans hergestellt.
Alle Küken erhielten eine Starterration bis zum Alter von 27 Tagen und es wurde auf eine Wachstumsration umgestellt für die Tage 27-40 des Aufwachsens. Futter und Wasser wurden ad libitum bereitgestellt.
Alle Vögel in den Gruppen 3 bis 10 wurden mit 35.000 (Dosis bestimmt durch Titration) L. S. #65 E. tenella-Oozysten im Alter von 21 Tagen beaufschlagt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Körpergewichte aller Vögel gemessen und der Futterverbrauch während dieser Präpatentperiode überwacht.
Sechs Tage nach der Exposition wurden die Körpergewichte und der Futterverbrauch gemessen. Außerdem wurden 5 Vögel aus jedem Käfig statistisch ausgewählt, um die Blindsackschädigungen zu bewerten. Alle verbleibenden Vögel wurden umgestellt auf eine Wachstumsration und diese bis zum Alter von 40 Tagen fortgesetzt. Während dieser Zeit wurden sowohl die Körpergewichtszunahme als auch der Futterverbrauch überwacht. Am Tag 40 wurden alle Vögel getötet und die Blindsackschädigung bewertet.
Die klinischen Daten von Versuch #2 wurden in Tabelle 3 zusammengefaßt. Die statistischen Vergleiche mit den kleinsten Quadraten bezüglich der Gewichtszunahme erfolgten zwischen der unimmunisierten/belasteten (UI/C) Kontrollgruppe und jeder einzelnen Behandlungsgruppe (nicht mit der mit Arzneimittel behandelten Kontrollgruppe). Es wurde keine Statistik durchgeführt bezüglich der Schädigungbewertung oder der Futterdaten (eine Beobachtung pro Gruppe). Tabelle 3 Klinische Ergebnisse für Versuch #2
#p< 0,05
*p< 0,01
**p< 0,001
Vor dieser Untersuchung wurde E. tenella experimentell nicht in diesem Satz von 10 Bodenkäfigen verwendet und es wurden keine Blindsackbeschädigungen in der UI/UC/Unmed-Gruppe nachgewiesen (es gab die Möglichkeit, daß E. tenella vor der Exposition in den anderen Käfigen cyclisiert wurde). Jedoch wurde E. acervulina vorher in dem gleichen Satz von Bodenkäfigen verwendet und obere intestinale Schädigungen, die für diese Art charakteristisch sind, wurden in der UI/UC/Unmed- Gruppe nachgewiesen.
Obwohl statistisch nicht signifikant zeigte 6 Tage nach der Exposition nur die Gruppe, die das 72 Stunden-Antigen 4 Tage s.c./7 Tage oral erhalten hatte, eine Gewichtszunahme, die höher war als die der Expositionskontrollen und eine Futterverwertung, die geringer war als die der mit Arzneimittel behandelten Kontrollgruppe. Nach dem Aufwachsen mit 40 Tagen zeigte diese gleiche mit 72 Stunden-Antigen geimpfte Gruppe einen hohen signifikanten (p< -0,001) Schutz gegeüber Expositionskontrollen in bezug auf die Gewichtszunahme und eine geringes Futterverwertungsverhältnis. Außerdem riefen das 24 Stunden-Antigen, das mit 4 Tagen s.c. verabreicht wurde und das 48 Stunden-Antigen, das mit 7 Tagen oral verabreicht wurde, einen beträchtlichen Schutz im Hinblick auf die Gewichtszunahme gegenüber Expositionskontrollen hervor und waren vergleichbar oder besser bezüglich der Nahrungsverwertung als die mit Arzneimittel behandelten Kontrollen nach der 40-tägigen Aufzucht. Das 24 Stunden 4 Tage/48 Stunden 7 Tage Antigen- Schema (Gruppe 10) ebenso wie die 24/48 Stunden 4 Tages.c./7 Tage oral-Behandlung rief eine geringer Intestinalschädigungsbewertung 6 Tage nach der Exposition hervor. Es wurden keine intestinalen Schädigungen nachgewiesen nach dem Aufwachsen, obwohl eine allgemeine Verdickung der Mucosa bei der Expositionskontrollgruppe beobachtet wurde. Es ist vernünfig anzunehmen, daß der Schutz gegenüber E. tenella, gemessen während des Aufwachsens, in Gegenwart von cyclisierendem E. acervulina hervorgerufen wurde.
Die folgenden Schlüsse können aus den Daten gezogen werden. Ein Leistungsschutz (Gewichtszunahme) kann bei Bodenkäfigen 6 Tage nach der Oozystenbelastung im Alter von 21 Tagen schwierig zu messen sein. Ein Auswachsen auf mindestens 40 Tage kann erforderlich sein, um eine wesentliche Impfstoffwirksamkeit in Bodenkäfigen zu zeigen.
Das 72 Stunden-Antigen, das 1x s.c. mit 4 Tagen oder 2x s.c. mit 4 Tagen/oral mit 7 Tagen gegeben wurde, rief einen signifikanten Schutz gegenüber Expositionkontrollen hervor. Das 72 Stunden-Antigen, das 2x gegeben wurde, behielt eine vergleichbare Leistung zu der, die für die mit Arzneimittel behandelte Kontrollgruppe gemessen wurde. Dieser Schutz wurde in Gegenwart einer Beaufschlagung mit 35.000 E. tenella und E. acervulina, die in der Streu cyclisierten, gezeigt. Dies ist die erste Demonstration eines inaktivierten Kokzidioseimpfstoffs, der in Bodenkäfigsystemen wirksam ist.
Das 24/48 Stunden-Antigen, das am Tag 4 s.c./am Tag 7 oral verabreicht wurde und das Schema, 24 Stunden-Antigen gegeben am Tag 4 s.c. und 48 Stunden-Antigen oral gegeben am Tag 7, riefen die größte Reduktion der intestinalen Schädigungen sowohl für E. acervulina als auch für E. tenella hervor. Diese zwei Dosierungspläne 4 Tage s.c. gefolgt von 7 Tagen oral scheint besser zu sein als eine einzige s.c.-Immunisierung am Tag 4.

Beispiel 5

In vitro Arzneimittelscreening

Mikrokulturen infizierter Zellen (in Gegenwart von ³H-Uracil) wurden zum Zeitpunkt T = 0 etabliert unter Verwendung von log&sub2;- Verdünnungen von α-Amanitin beginnend mit 50 ug/ml. Die Kulturen wurden dann 1, 6, 12, 24 und 48 Stunden nach der Infektion geerntet und der Einbau der Markierung des radioaktiven Vorläufers wurde bestimmt durch Ernten und Prozessieren für die Szintillationszählung. Wenn α-Amanitin während der ersten 24 Stunden des Parasitismus vorhanden war, wurde der Einbau von Impulsen (Parasitenmaterial) gestoppt. Wenn jedoch das α-Amanitin nach 24 Stunden zugegeben wurde, wurde keine Hemmung des Einbaus der Markierung beobachtet.

Beispiel 6

Immunmessungen

Ein Tage alte Inzuchthühnchen (B¹&sup9;B¹&sup9; und B³&sup0; Bso NHC-Haplotyp) [New Hampshire Poultry Research Center], die ursprünglich aus der DCD.003-Linie stammten, wurden verwendet. Die Küken wurden mit nicht mit Arzneimittel versehener Starter/- Wachstumsnahrung gefüttert und mit Wasser ad libitum. Die Vögel wurden im Alter zwischen 1 und 43 Tagen verwendet.
Um die natürliche Immunität nachzuahmen, wurden 1 Tage alte Küken mit lebenden E. tenella (Lilly Strain #65)-Oozysten 5 aufeinanderfolgende Tage lang immunisiert (500 Oozysten/Tag) oder künstlich immunisiert mit verschiedenen Dosen mit Vakzinantigenen (5% Amphigen als Adjuvans). Typischerweise wurden 1- oder 4 Tage alte Vögel subcutan (s.c.) in einem 1,0 ml Volumen am unteren Hals immunisiert und dann mit einem Impfstoff mit Adjuvans und Antigenen im Alter von 4 oder 7 Tagen durch eine Oralsonde in einem 1,0 ml Volumen geboostert. Zum Schein immunisierte (Medium + 5% Amphigen) Hühner wurden als Kontrollen verwendet. In einigen Versuchen wurden die Hühner im Alter von 10 Tagen durch orale Impfung mit 35.000 E. tenella-Oozysten beaufschlagt.

A. Impfstoff und Parasitenantigene

Medien von mit E. tenella infizierten F7 Zellen, die 24, 48 und 72 Stunden nach der Infektion gesammelt werden, wurden als Quelle für das Antigen für die Immunisierungen und für in vitro-Assays verwendet. Für die Immunisierungen enthielten Medien, die von infizierten F7-Zellen gesammelt wurden, 1% FBS und für in vitro-Assays waren die gesammelten infizierten Medien serumfrei (0,1% FBS). Antigenhaltige Medien wurden durch Zentrifugation (800 · g, 30 Minuten, 4ºC) geklärt, Aliquots entnommen und bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Alle zellfreien überstände (SN) wurden quantitativ auf parasitenspezifisches Protein (PSP) ausgewertet unter Verwendung des direkten SPZEIJISA. Fraktionierte Proben wurden zusammengefaßt nach der PSP- und Western-Reaktivität. Sporozoiten-(SPZ)- und Merozoiten-(MRZ)-Antigen wurden durch Beschallung auf Eis in serumfreiem 199 Medium hergestellt und anschließend zentrifugiert (800 · g, 10 Minuten, 4ºC). Die Proteinkonzentrationen wurden bestimmt mit der Methode von Bradford, Anal. Biochem., 72 : 248-252 (1976). Beschallte Parasitensuspensionen wurden auf eine Endkonzentration von 10 ug/ml in serumfreiem Medium 199 eingestellt, Aliquots gebildet und bis zur Verwendung bei -20ºC aufbewahrt.

B. Zellisolierung

Periphere Blutlymphocyten (PBL) und Milzzellen wurden von natürlich oder künstlich (Impfstoff) immunisierten oder immunisierten/beaufschlagten Vögeln zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung erhalten. PBL, die durch Herzpunktur erhalten wurden, wurden mit Histopaque 1077-(400 · g, 15 Minuten, bei Raumtemperatur)-Zentrifugation von heparinisierten Blutproben isoliert. In einigen Assays wurden auch die roten Blutkörperchen von Gradienten aufbewahrt und als Costimmulantien für in vitro-Vermehrungsassays verwendet. Einzelzellmilzsuspensionen wurden erhalten durch Aufreißen von zerkleinertem Gewebe durch Spritzenkanülierung gefolgt von einer Zentrifugation bei langsamer Geschwindigkeit (50 · g, 10 Minuten, bei Raumtemperatur), und nachfolgende Zentrifugation über Histopaque 1077-Gradienten. Zählungen lebensfähiger Zellen wurden durchgeführt unter Verwendung von Trypanblau und einem Hämacytometer.

C. Erzeugung von Antigen und Mitogen-stimiuulierten Zellüberständen

Unverdünnte serumfreie Antige, verschiedene Konzentrationen von Conconavalin A (Con A) oder Lipopolysacharid (125) oder serumfreies Medium 199 (1,0 ml/Napf) wurden mit Lymphocyten bei 40ºC, 5% CO&sub2; gezüchtet. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurden die Überstände aus den Näpfen entfernt und durch Zentrifugation (800 · g, 15 Minuten, bei Raumtemperatur) gekärt. α-Methylmannosid (α-MM) wurde zu dem Con A-haltigen Überstand auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben. Proben des Überstands wurden in 1,5 ml Röhrchen in Aliquots verteilt und bei -80ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Die 0-48 Stunden (24/48) oder 48-72 Stunden (72) nach der Infektion erzeugten Medien wurden gesammelt, mit S-Sepharose fraktioniert unter Verwendung eines linearen NaCl-Gradienten und auf Basis ihrer PSP- und Western-Reaktivität zusammengefaßt. Fraktion I bedeutet einen Pool von 8 Fraktionen, die von dem ersten Teil aller gesammelten Fraktionen abgenommen wurden. Fraktion II bedeutet einen Pool der Fraktionen Nummer 9-14 und Fraktion III einen Pool von 15-18.

D. Zellvermehrungsassays

Zehn ug Gesamtprotein aus jeder Fraktion wurden auf ihre Reaktivität in dem unten beschriebenen Zellvermehrungsassay getestet.
Die Zellen wurden auf 10&sup7; Zellen/ml eingestellt mit komplettem serumfreiem Leibovitz's Modified Hahns media (chMH), das gleiche Teile an McCoys 5A und Leibovitz's Medium, 5 · 10&supmin;&sup5; 2-Mercaptoethanol, 5 ug/ml Insulin, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 0,25 ug/ml Amphotericin B, 2% Trytosephosphat und 1 mM Natriumpyruvat enthielt. Rote Blutkörperchen (10&sup7;/ml) wurden zu allen Näpfen von Mikroliterplatten mit rundem Boden zugegeben (0,05 ml/Napf). Unverdünnte serum freie Antigene, Con A, oder serumfreies Medium 199 (0,1 ml/Napf) wurden in einem Wasserbad bei 37ºC aufgetaut und 4- fach zugegeben gefolgt von PBL oder Milzzellen (0,05 ml/Napf). Für die Mitogen- und Antigenvermehrungsassays wurden Kulturen bei 40ºC, mit 5% Co&sub2; 72 beziehungsweise 96 Stunden lang inkubiert und dann mit 1 uCl/Napf³[H]-Thymidin (spezifische Aktivität, 5,0 uCl/mmol) während der letzten 18 Stunden der Kultur gepulst. Die Zellen wurden auf Glasfasermatten geerntet unter Verwendung eines MACHIII-Erntegeräts und die Radioaktivität an einem Packard Matrix 96 Direktbetazähler bestimmt. Hohe und niedrige cpm für jede Probe wurden verworfen. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt durch einen Stimulationsindex (S. I.) gemäß der Gleichung:
wenn nicht anders angegeben.
Es wurde gefunden, daß sich Milzlymphocyten von natürlicherweise immunen Vögeln als Antwort auf die mit E. tenella infizierte biochemisch abgetrennte Fraktion II von einer S- Sepharosesäule vermehrten. Milzlymphocyten, die von 25 Tagen alten natürlicherweise immunen Vögeln erhalten wurden, zeigten höhere S. I.-Werte für Fraktin II verglichen mit den Fraktionen I und III (Tabelle 4) Tabelle 4

E. T-Zell-Western

Die gepoolte Fraktion 72-II wurde durch eindimensionale SDS- PAGE abgetrennt und auf Nitrocellulose überführt, solubilisiert und auf eine Reaktivität in dem unten beschriebenen T- Zell-Westernvermehrungsassay untersucht.
Eindimensionale Immunblotteruntersuchungen wurden durchgeführt unter Verwendung einer Modifikation der Methode von Lanb und Young, Immunol., 60 : 1 (1987). Kurz gesagt wurden zusammengefaßte Fraktionen von S-Sepharose durch Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) unter reduzierenden Bedingungen auf 10 oder 12,5% Acrylamidminigelen aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden auf Nitrocellulose (Porengröße 0,2 uM) überführt und die Nitrocellulose in 12 gleiche Abschnitte geschnitten, die verschiedenen Molekulargewichtsbereichen entsprachen. Nitrocellulosestücke wurden gemäß der Methode von Abou-Zeid, J. Imm. Methods., 98 : 5 (1987) solubilisiert unter Verwendung einer Ausfällung mit DMSO/Carbonat-Bicarbonat und anschließend durch Einfrieren/Auftauen in deionisiertem H&sub2;O. Solubilisierte mikroteilchenförmige Proben wurden 3x mit serumfreiem cLMH gewaschen und auf ein endgültiges Volumen von 1,0 ml serumfreiem cLMH suspendiert. Die Proben wurden bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Für die Assays wurden die Proben bei Raumtemperatur aufgetaut, 1 : 5 in serumfreiem cLMH verdünnt und 4-fach (0,1 ml/Napf) zu Mikroplatten mit rundem Boden, die 5 · 105 rote Blutkörperchen (0,05 ml/Napf) enthielten, zugegeben. PBL oder Milzzellen (10&sup7; Zellen/ml, 0,1 ml/Napf) wurden dann zu den Platten zugegeben und die Kulturen bei 40ºC, 5% CO&sub2; inkubiert. Die Kulturen wurden mit 1 pci/Napf³[H]-Tymidin während der letzten 18 Stunden der Kultur gepulst, geerntet und wie vorher beschrieben gezählt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als S. I. in Tabelle 5 gemäß der obigen Formel.
PBL von natürlicherweise immunen Vögeln vermehrten sich auch als Antwort auf eine beschränkte Zahl von E. tenella 72-II- Fraktionen. PBL, die von 16 Tage alten natürlicherweise immunisierten/belasteten Vögel erhalten wurden, zeigten die höchste S. I. Reaktivität auf drei diskreten Bereichen des Immunoblots entsprechend den Antigenen für ungefähre relative Molekulargewichte (M = S) von 68-75, 38-41 und 27-30 kDa (Tabelle 5). Ähnliche Parasitenproteine mit ungefähren MrS von 25-28 und 38-40 kDa wurden auch in rohem konzentrierten 72 Stunden- Antigen mit Westernanalyse identifiziert unter Verwendung von Seren aus diesen gleichen natürlicherweise immunisierten/belasteten Vögeln. Tabelle 5

F. TNF Assay

Maus L929-Zellen [ATCC] wurden in McCoys 5A/5% fötalem Kälberserum (FCS) auf 4 · 10&sup5; Zellen/ml, suspendiert und 0,1 ml in Mikrotiterplatten mit flachem Boden gegeben. Nach übernachtinkubation bei 37ºC, 5% CO&sub2;, wurden log&sub2;-Verdünnungen des rekombinaten Tumornekrosefaktors (TNF)-Mausstandards [Genzym] (2 ug/ml Anfangskonzentration) oder Testüberstände in Medien in Abwesenheit oder Gegenwart von Actinomycin D (2 ug/ml) hergestellt und doppelt zu den geeigneten Näpfen zugegeben. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37ºC, 5% CO&sub2;, wurden die Platten mit lx Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPNS) gewaschen und die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur in Ethanol/Essigsäure (3 : 1) fixiert. Die Platten wurden 10 Minuten lang mit 0,5% Kristallviolett/20% Methanol angefärbt und mehrere Male in dH&sub2;O gespült. Nach dem Waschen wurde 0,1 ml/Napf Essigsäure (33%) zugegeben und die Platten auf einem Drehschüttler vermischen gelassen, bis die Farbe gleichmäßig über die Näpfe verteilt war. Die Absorption der Näpfe bei 600 nm wurde an einem automatischen Mikroplattenlesegerät von Molekulardevices Vmax bestimmt. Die Daten werden aufgezeichnet als % Cytotoxitität gemäß der Formel:
% Cytotoxizität = Acont -Adil/Acont
worin % Cytotoxizitätdil die Menge an Zellzerstörung bei einer gegebenen Verdünnung bedeutet, Acont die Absorption in Kontrollnäpfen (Medium allein) bedeutet und Adil die Absorption bei einer gegebenen Verdünnung des Testüberstandes bedeutet. Der Titer wurde definiert als der Kehrwert der Verdünnung, die notwendig ist, um eine Zell-Cytotoxizität von 50% zu erreichen. Tabelle 6 Zusammenfassung der Ergebnisse des TNF-Assays
*5 · 500 bedeutet Dosen von 500 Oozysten pro Tag 5 Tage lang
**(+) bedeutet cytoxische Aktivität war vorhanden, aber der Kehrwerttiter konnte nicht bestimmt werden.

G. Interleukin-2-Assay

IL2-Responderzellen wurden aus der Milz naiver 2-4 Wochen alter B³&sup0;B³&sup0; Vögel isoliert. Einzelzellsuspensionen wurden auf 5 x 10&sup6; Zellen/ml in serumfreiem cLMH eingestellt, das 2,5 ug/ml Con A enthielt, und bei 40,5ºC, 5% CO&sub2; in T-75 Kolben inkubiert. Nach 48 Stunden wurden nicht haftende Zellen mit 50 mM α-MM 20 Minuten bei 40,5ºC behandelt und Blastzellen durch Zentrifugation über Histopaque 1077 isoliert. Lebensfähige Zellen wurden in serumfreiem cLMH/100 mM α-MM auf 2 · 10º/ml resuspendiert und in Mikrotiterplatten mit rundem Boden gegeben (0,1 ml/Napf). Log&sub2;-Verdünnungen von IL2-haltigen konditionierten Laborstandard-Medien wurden 4- fach in die geeigneten Näpfe gegeben und dienten als positive Kontrolle. Serumfreies cLMH (negative Kontrolle) oder Testüberstand wurde dann 4-fach zugegeben (0,1 ml, 25% V/V Endnapfkonzentration) und die Platten bei 40ºC, 5% CO&sub2; 48 Stunden lang inkubiert. Die Kulturen wurden dann mit 1 uCl/Napf (0,05 ml) ³[H]-Thymidin weitere 6 Stunden lang gepulst. Die Zellen wurden geerntet und wie vorher beschrieben gezählt. Hohe und niedrige cpm für jede Probe wurden verworfen. Überstände, die als für IL2 positiv angesehen wurden, sind solche mit mittleren cpm-Werten von mindestens dem 2-fachen der serumfreien Kontrollmedien jeder Platte.

H. Sekundärer in vitro-Antikörper-Assay (SIBA)

Log&sub2;-Verdünnungen von Antigen (SPZ, mrz oder Zellkulturantigene) wurden in 10 mM Boratpuffer, pH 9,0, mit einer Anfangskonzentration von 1 ug PSP/ml hergestellt und 0,1 ml/Napfauf Nung Immuno-Maxisorb ELISA-Platten gegeben. Nach Übernachtinkubation bei 4ºC wurden die Näpfe blockiert unter Verwendung von PBS/0,05% Tween-20 (PBS-T), das 5% Magermilch enthielt (0,2 ml/Napf) 2 Stunden lang bei 37ºC. Die Platten wurden 3x mit komplettem HBSS, 25 mM Hepes, pH 7,4, 1x Antibiotikum/Antimycotikum (cHBSS) gewaschen, durch UV-Bestrahlung mindestens 20 Minuten unter einer sterilen Haube sterilisiert. PBL oder Milzzellen wurden auf 2 · 10' Zellen/ml eingestellt und 0,2 ml auf die erste Säule aufgegeben. Log&sub2;-Verdünnungen von Zellen wurden dann über die gesamte Platte in serumfreiem chMH gemacht (unter Ausschluß der letzten Säule für jedes plattierte Antigen), um die Gittertitration zu vervollständigen. Die Näpfe wurden auf ein Endvolumen von 0,2 ml gebracht unter Verwendung von cLMH und die Platten 3-5 Tage lang bei 40,5ºC, 5% CO&sub2; inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten heftig 3x mit kaltem PBS-T gewaschen.
Die letzte Säule für jedes plattierte Antigen wurde mit 0,1 ml E. tenella-hyperimmunem Hühnerserum (1 : 2.000 in PBS- T/0,05% BSA) 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Nach 3-maligem Waschen in PBS-T wurde biotinylierter Ziegen-Antihühnchen-IgG (1 : 2.000 in PBS-T/2% Magermilch) zu allen Näpfen zugegeben und die Inkubation 1 Stunde lang bei 37ºC fortgesetzt. Nach 3-maligem Waschen in PBS-T wurden die Näpfe eine weitere Stunde lang mit mit Meerrettichperoxidase markiertem Streptavidin (1 : 1.000 in PBS-T/2% Magermilch) versetzt. Die Platten wurden sorgfältig mit PBS-T gewaschen und gebundenes Enzym unter Verwendung von TMB/Peroxidasesubstrat nachgewiesen. Die enzymatische Reaktion wurde nach 15 Minuten durch Zugabe von 1M HCl gestoppt und die optische Dichte bei 450 nm in einem automatischen Mikroplattenlesegerät von Molecular Devices Vmax gemessen. Tabelle 7 Sekundärer in vitro B-Zellen Assay
I. Parasitenhemmtest (PIA)
Die QT-35-Zellinie (QT35 wurde als Geschenk vom Department of Veterinary Services, College of Agricultur, Pennsylvania State University zur Verfügung gestellt) wurde in Opti-MEM/l% FBS gezüchtet, und mit 1 · 104 Zellen/Napf in 96 Napfplatten mit flachem Boden geimpft. Nach einer Übernachtinkubation bei 40ºC, 5% CO&sub2; wurden die Zellen mit doppelten log2-Verdünnungen von konditionierten Medien als positiver Kontrolle oder Testüberständen vorbehandelt. Eine Reihe wurde mit Medium allein vorbehandelt. Nach der 24-stündigen Vorbehandlung wurden frische Verdünnungen von Testüberstand den Zellen zusammen mit 1 · 10&sup5; E. tenella-Sporozoiten und 1 uCl/Napf³[H]-üracil zugegeben. Die Kulturen wurden weitere 24 Stunden lang inkubiert, geerntet und wie oben beschrieben gezählt. Ein Testüberstand wurde als positiv angesehen, wenn eine 1 : 8 Verdünnung eine 30%-ige Reduktion der mittleren cpm verursachte verglichen mit unbehandelten Kontrollen (Medium alleine). Tabelle 8 Parasitenhezumtest
LPL = Lamina Propria-Lymphocyten
NE = Natürlich exponiert (500 Oozysten täglich 5 Tage lang)
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in der oben angegebenen Beschreibung enthalten und ergeben sich für den Fachmann auf diesem Gebiet in naheliegender Weise. Z. B. wird davon ausgegangen, daß die Verwendung anderer geeigneter Vogelpathogene ähnliche Antigene, wie die hier beschriebenen Kokzidienantigene erzeugt. Daher können Impfstoffe gegen andere Pathogene als Kokzidien unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Solche Modifikationen und Veränderungen der Zusammensetzungen und der Verfahren der vorliegenden Erfindung sollen im Schutzbereich der beigefügten Ansprüche liegen.

Claims

1. Kontinuierliche Nicht-Lymphoid-Zellinie, die die Entwicklung des Präpatentstadiums des Lebenszyklus von Vogel-Kokzidien zuläßt, wobei die Zellinie 5B-CEV-1/P mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL-10497, oder eine daraus abgeleitete Zellinie ist.

2. Zellinie nach Anspruch 1, die 5B-CEV-1/F7 mit der ATCC- Hinterlegungs-Nr. CRL-10495 ist.

3. Zellinie nach Anspruch 1, die 5B-CEV-1/G7 mit der ATCC- Hinterlegungs-Nr. CRL-10496 ist.

4. Mit Parasiten infizierte Zellinie umfassend eine kontinuierliche Nicht-Lymphoid-Zellinie, die die Entwicklung des Präpatentsstadiums des Lebenszyklus von Vogelkokzidien zulassen kann, wobei die Zellinie 5B-CEV-1/P mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL-10497 ist oder eine Zellinie, die daraus entstanden ist, wobei die Zellen der Zellinie mit einem ausgewählten Vogel-Eimeria- Parasiten infiziert sind.

5. Mit Parasiten infizierte Zellinie nach Anspruch 4, worin die kontinuierliche Nicht-Lymphoid-Zellinie 5B-CEV-1/F7 mit der ATCC-Hinterlegungs Nr. CRL-10495 ist.

6. Mit Parasiten infizierte Zellinie nach Anspruch 4, worin die kontinuierliche Nicht-Lymphoid-Zellinie 5B-CEV-1/G7 mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL-10496 ist.

7. Mit Parasiten infizierte Zellinie nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin der Vogel-Eimeria-Parasit Eimeria tenella ist.

8. Impfstoff für Kokzidiose, der einen Schutz gegen eine Infektion bei Geflügel induzieren kann, der mindestens eine Impfstoffkomponente für Kokzidiose enthält mit einer pathogenen Antigenzusammensetzung, die erzeugt wurde, indem eine mit Parasiten infizierte Zellinie nach einem der Ansprüche 4 bis 7 gezüchtet wurde, wobei die Komponente gegebenenfalls mit einem geeigneten Träger oder Adjuvans kombiniert ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Antikokzidioseimpfstoffs umfassend, daß man die mit Parasiten infizierten Zellen nach einem der Ansprüche 4 bis 7 züchtet und antigene Komponenten davon erntet, die eine schützende Antwort gegen Vogel-Kokzidien in Geflügel induzieren können.

10. Verfahren zum Screenen von Mitteln, die das Wachstum von Vogel-Kokzidien-Parasiten zerstören oder hemmen können, umfassend, daß man mit Parasiten infizierte Zellen nach einem der Anspüche 4 bis 7 züchtet, die infizierten Zellen einem Testmittel aussetzt und die Zellen auf eine destruktive oder hemmende Wirkung auf den Parasiten untersucht.