DE69332111T2

DE69332111T2 - Darmprotozoen-Impfstoffe

Info

Publication number: DE69332111T2
Application number: DE69332111T
Authority: DE
Inventors: Howard Ceri; Douglas W. Morck; Merle E. Olson
Original assignee: University Technologies International Inc
Current assignee: University Technologies International Inc
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1993-11-26
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2013-11-27
Also published as: US6153191A; EP0600396B1; JP2004137286A; US5512288A; DK0600396T3; JPH0789872A; EP0600396A2; CA2109977A1; PT600396E; JP3856345B2; CA2109977C; US5922329A; DE69332111D1; ATE220557T1; EP0600396A3; ES2177535T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Impfstoffe gegen Darmprotozoen. Im Besonderen sind Impfstoffe gegen Giardia offenbart.

Druckschriften

Die folgenden Druckschriften werden in dieser Anmeldung als hochgestellte Zahlen an den relevanten Abschnitten der Anmeldung zitiert.
1. Taylor et al., Human immune response to Giardia lamblia infection, J. Infect. Dis 155: 137-140 (1987).
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3. Wolfe, Clinical Symptoms and diagnosis by traditional methods, "Human Parasitic Diseasis, Band 3 - Giardiasis", Meyer, Herausgeber, Elsevier Science Publishers, New York, 175-186 (1990).
4. Feely et al., The biology of Giardia, "Human Parasitic Diseasis, Band 3 - Giardiasis", Meyer, Herausgeber, Elsevier Science Publishers, New York, 11-49 (1990).
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Darmprotozoen sind die Ursache vieler menschlicher und tierischer Erkrankungen. Wenn sie Hautiere infizieren, dann können schwere wirtschaftliche Verluste resultieren. Darmprotozoen von Bedeutung schließen Cryptosporidium, Trichomonaden, Histomonas, Spironucleus, Entamoeba, Coccidia, Toxoplasma und Sarcocystis ein. Eines der problematischsten Darmprotozoen ist Giardia.
Giardia lamblia ist der am meisten gefundene pathogene Parasit in westlichen Ländern und ist im großen Teil von Nordamerika¹ endemisch. Giardia ist eines von Protozoen mit Geißeln, das durch die fäkal-orale Route² übertragen wird. Der Mechanismus der Pathogenese in Giardia wird schlecht verstanden, doch führt sie zu Symptomen ähnlich vieler anderer gastro-intestinaler leiden. Die häufigsten Symptome sind Diarrhöe, Anorexie, Unwohlsein, abdominale Distension und Flatulenz. Akute Stadien der Infektion dauern gewöhnlich nur einige Tage, obwohl gelegentlich, insbesondere bei Kindern, das chronische Stadium Monate³ andauern kann.
Nachdem sie einmal in ihren Wirt eingedrungen sind, heften sich die Giardia-Trophozoiten an das Epithel der Darmzotten des Wirtes, wo sie sich vermehren, Zysten bilden und dann mit dem Kot des Wirtes ausgeschieden werden. Einige infizierte Wirte lassen nach dem kurzen akuten Studium der Infektion&sup4; Zysten ohne Symptome passieren.
Eine Hauptquelle der Giardia-Infektion ist verunreinigtes Trinkwasser. Dies hat ihr wegen der großen Anzahl infizierter Menschen aufgrund der Einnahme verunreingten Wassers beim Kampen&sup4; den Namen "Rucksacktouristen-Diarrhoe" eingebracht. Der Ausbruch von Giardiasis ist duch ein häufiges Problem in Kindertagesstätten. Wiederkehrende Giardia-Infektionen in Kindertagesstätten sind häufig, und viele der Kinder wurden als Träger der Infektion festgestellt, obwohl sie keine Symptome zeigen. Dies macht den Nachweis und die wirksame Behandlung von Giardia in Kindertagesstätten schwierig&sup5;.
Ein Hauptbereich des Interesses an Giardia-Infektionen ist die Fähigkeit tierischer Wirte, als Reservoire für Menschen infizierende Stämme von Giardia zu wirken. Es gibt Beweisanzeichen, dass die Übertragung von Giardia zwischen den Arten vorkommen kann und vorkommt. Menschliche Stämme von Giardia haben sich als infektiös in Wüstenmäusen, Mäusen, Meerschweinchen, Waschbären und Bibern&sup6;&supmin;&sup8; erwiesen. Der Name "Biber-Fieber", der Giardia-Infektionen in Kanada gegeben wird, stammt aus einer epidemischen Infektion durch Verunreinigung einer Wasserquelle eitler Familie von drei Bibern&sup9;. Giardia-Infektionen sind üblich in Hunden und Katzen. Es wird geschätzt, dass 10-68% der Hunde und 25% der Katzen mit Giardia infiziert sind. Untersuchungen des Vorherrschens von Giardia-Infektion in Haustieren fanden eine Infektion in 17,7% der Schafs und 10,4% der Rinder, wobei das Vorkommen in Lämmern (35,6%) und Kälbern (27,7%)¹&sup0; hoher war.
Wie oben erwähnt, kann die klinische Giardiasis im Bereich vom asymptomatischen Tragen des Parasiten bis zu einer Krankheit liegen, die durch Diarrhöe, Bauchkrämpfe, Kopfschmerzen, Gas, Aufblähen, Dehydratation und Unwohlsein1,11 charakterisiert ist. Gewichtsverlust und Verzögerung des Wachstums sind auch übliche Probleme, die mit Giardiasis in Menschen und Tieren¹¹ in Verbindung stehen.
In Menschen schließen die histologischen Änderungen, die mit Giardia assoziiert werden, Darmzotten-Atrophie² ein. Kürzliche Untersuchungen unter Einsatz mongolischer Wüstenmäusen, als ein Tiermodel, haben eine diffuse Verkürzung der Mikrozotten hauptsächlich im Duodenum so wie eine Verminderung in der Enzym-Aktivität des Bürstensaums gezeigt. Die Enzym-Beeinträchtigungen können durch das Verkürzen der Epithel-Microzotten¹² verursacht sein. Andere Untersuchungen haben Giardia-Infektion mit einer verringerten Gewichtszunahme, einer verminderten Nahrungsaufnahme, verminderten Darm-Disaccharidase-Aktivitäten und Darmzotten-Atrophie¹³ in Beziehung gesetzt. Das diffuse Verkürzen von Darmzotten kann das Resultat eines durch Giardia¹² produzierten Toxins sein.
In Anbetracht des Vorherrschens der Giardiasis und der Schwierigkeit bei der Behandlung all Solcher, die durch Träger ohne Symtome infiziert werden, ist die Entwicklung eines Impfstoffes gegen Giardia sehr erwünscht. Es wurde gzeigt, dass Wirte eine Immunantwort gegen Giardia, entwickeln, und dass sie eine lange andauernde Immunität nach der primären Infektion14,15 beibehalten können. Ist ein Wirt wiederholt Giardia ausgesetzt, dann nimmt das Risiko der Infektion ab¹&sup6;. Es ist daher möglich, dass ein Wirt Immunität erwirbt. Die Immunantwort des Wirtes kann die weite Vielfalt der Ansprecharten von Wirten auf Giardia erklären. Krankheit resultiert, wenn das Immunsystem nicht in der Lage ist, eine angemessene Verteidigung gegen die Protozoen¹&sup4; zu erzeugen. Frühere Untersuchungen auf dem Gebiet der Giardia-Immunität waren durch den Mangel des Verstehens der pathogenen Mechanismen beeinträchtigt.
In natürlichen und experimentellen Giardia lamblia- und Giardia muris-Infektionen wurde gezeigt, dass sowohl zellulare als auch humorale Immunität durch den Wirt1,3,14,17,18 erzeugt worden. In natürlichen und experimentellen Infektionen wurde die Entwicklung der Immunität mit der Beseitigung des Parasiten16,19 in Beziehung gesetzt. Menschen und Tiere mit einer stärkeren Immunantwort auf Giardia können jedoch noch immer klinische oder subklinische Giardiasis haben, und dies aufgrund einer unangemessenen Immunität im Wirt14,20,21. Es wurde in Menschen und in Tiermodellen gezeigt, dass die Schwere der Symptome, der Verlauf der Infektion und die Infektionsraten nach einem zweiten Aussetzen gegenüber Giardia-Parasiten14,16,19 vermindert sind.
In Labortieren wurden zahlreiche monoklonale und polyklonale Antikörper gegen Giardia lamblia- und Giardia muris-Trophozoiten und -Zysten produziert. Der Zweck der Produktion dieser Antikörper war für Diagnosezwecke oder Reagenzien für Laboruntersuchungen. Diese Antikörper wurden produziert durch Anwenden einer standardgemäßen Hybridom-Technologie und unter Einsatz von BALB/c-Mäusen. Polyklonale Antikörper wurden in Kaninchen und kleinen Nagetieren durch Ausführen multipler Immunisierung mit Antigenen und Freund's Adjuvans produziert.
Die passive Immunisierung mit Anti-giardia-Antikörpern wurde ausgeführt. Butscher et al.²² zeigten, dass die intraperitoneale Verabreichung monoklonaler Antiköper an ein Oberflächen- Glykoprotein von G. muris-Trophozoiten die parasitäre Belastung in Mäusen verringerte. Die passive Übertragung der Immunität wurde in Muttermilch²³ gezeigt. Muttermäuse, die vorher mit Gardia muris infiziert worden waren, konnten Schutz auf ihre trinkenden Jungen übertragen, während die Milch uninfizierter Mütter nicht schützend war.
Die Züchtung und/oder Ernte von Giardia lamblia in Medium, enthaltend Gallesalze und Rindergalle, wurde offenbart (siehe Infection and Immunity, 1992, 60(2): 637-643; Infection and Immunity, 1988, 56(3): 705-707; Science, 1987, 235: 1040-1043 und Gut, 1991, 32: 1260). Einige pharmakologische Wirkungen des Toxins Sarcocystin sind im Journal of the Egyptian Medical Association, 1969, 52: 942-948 offenbart.
Es gibt außerordentlich begrenzte Untersuchungen der aktiven Immunisierung von Tieren mit Giardia-Trophozoiten oder mit Subeinheits-Impfstoffen. Roberts-Thomsen et al. führten eine Untersuchung aus, bei der zwei Stämme von Labormäusen geimpft und einer Infektion ausgesetzt wurden²&sup4;. Intakte Giardia muris-Trophozoiten (10&sup6;) wurden mit Freund's Adjuvans (Verhältnis 1 : 0 kombiniert und intraperitonial und in die Pfote injiziert. Vier Wochen später wurden, die Tiere an den gleichen Stellen mit der gleichen Dosis ohne Adjuvans injiziert. Vergleichsmäuse erhielten nur Adjuvans oder waren unbehandelt. Eine Woche später wurden die Mäuse mit Giardia muris- Zysten infiziert. Geimpfte BALB/c-Mäuse hatten eine verringerte Zystenausscheidung für eine kürzere Dauer, während es keinen Unterschied in der Zystenausscheidung zwischen Vergleichs- und geimpften C3H/He-Mäusen gab. Diese Untersuchung erzeugte somit variable und unwirksame Resultate.
Vinayak et al.¹¹ isolierten 56 kDa-Protein aus Giardia lamblia. Mäuse wurden subcutan immunisiert (Tag 0) und oral immunisiert (Tag 7) mit 100 ug von mit multilammelarem Phosphatidylcholin-Liposomen (MPL) eingehülltem 56 kDa-Oberflächen-assoziiertem Antigen. Nicht immunisierte und in ähnlicher Weise mit in MLP eingehüllter PBS (Phosphat-gepufferter Salzlösung) dienten als Vergleich. Alle Tiere wurden sieben Tage nach der letzten Immunisierungsdosis infiziert. die Immunisierung mit in MPL eingehülltem 56 kDa Oberflächen-assoziiertem Antigen resultierte in einer Verringerung der Trophozoiten-Kolonisierung des Darmes und der Dauer der Infektion, verglichen mit den Vergleichsgruppen. Es wurde vorgeschlagen, dass das 56 kDa- Oberflächen-Antigen die Giardia-Infektion immunreguliert.
Es wird angenommen, dass Giardia Zytotoxine ausscheidet, die die Funktion oder Struktur der Schleimhaut des Dünndarms beeinflussen25,26 doch müssen noch ein oder mehrere toxische Prinzipien unter Anwendung klassischer Verfahren zur Identifikation von Zytotoxinen25,26 identifiziert werden. Kulturfiltrate von Giardia bringen exkretorische/sekretorische Produkte in das Kulturmedium²&sup5; ein. Kulturfiltrate schädigen Fibroblasten in der Kultur und verringern die Salz- und Wasser-Absorption aus Perfusions-Schleifen von Ratten, doch ist die Rolle dieser Substanzen in der Pathogenese von Giardiasis unbekannt²&sup7;.
Es besteht ein Bedarf an einem wirksamen Impfstoff, der zum Verhindern und Behandeln von Protozoen-Infektionen, einschließlich Giardiasis, in Tieren, einschließlich Menschen, benutzt werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung schafft Impfstoffe zum Verhindern oder Behandeln von Darmprotozoen- Infektion in einem Tier sowie neue Toxine, die in diesen Impfstoffen eingesetzt werden können. Impfstoffe zum Verhindern oder Behandeln der Giardiasis werden insbesondere auch geschaffen. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Herstellen und Verfahren zum Benutzen neuer Toxine, Antiköper, Impfstoff-Stämme und Zusammensetzungen, die aus diesen Verfahren resultieren oder darin benutzt werden.
In einem Aspekt scharrt die Erfindung Impfstoff-Stämme von Darmprotozoen. Es wird auch ein Verfahren zum Herstellen dieser Impfstoff-Stämme geschaffen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Impfstoff-Zusammensetzung, umfassend einen Impfstoff-Stamm eines Darmprotozoen. Eine zellfreie Impfstoff-Zusammensetzung, umfassend eine Untereinheit oder ein Toxin eines Darmprotozoen wird auch geschaffen, ebenso wie ein Verfahren zum Herstellen dieser Impfstoff-Zusammensetzungen.
Weiter wird ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln der Infektion durch Darmprotozoen in einem Tier beschrieben, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Impfstoff-Stammes der Darmprotozoen an das Tier. Ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln der Infektion durch Darmprotozoen, umfassend das Verabreichen einer zellfreien Zusammensetzung, umfassend eine Untereinheit oder ein Toxin der Darmprotozoen, wird auch beschrieben.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Toxin von Giardia. Ein Verfahren zum Herstellen des Toxins wird auch geschaffen, ebenso wie ein Antiköper gegen das Toxin und ein Verfahren der passiven Immunisierung unter Einsatz des Antiköpers.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 veranschaulicht das Wachstum verschiedener Stämme von Giardia.
Fig. 2 veranschaulicht den Toxin-Titer von Stamm S2 von Giardia in CHO-Zellen.
Fig. 3 veranschaulicht den Toxin-Titer von Stamm WB von Giardia in CHO-Zellen.
Fig. 4 veranschaulicht den Toxin-Titer von Stamm D3 von Giardia in CHO-Zellen.
Fig. 5 veranschaulicht die Wirkung der Impfung auf die Gewichtszunahme in Kätzchen nach der Infektion mit Giardia.
Fig. 6 veranschaulicht die Wirkung der Impfung auf die Immunantwort in Kätzchen.
Fig. 7 veranschaulicht die Wirkung der Impfung auf die Trophozoiten-Zählung in Kätzchen nach der Infektion mit Giardia.
Fig. 8 veranschaulicht die Wirkung der Impfung auf den Prozentsatz der Kätzchen- Darmproben, in denen nach einer Infektion mit Giardia Trophozoiten gefunden werden.
Fig. 9 veranschaulicht die Ausscheidung von Kotzysten in geimpften und ungeimpften. Hunden.
Fig. 10 veranschaulicht die Wirkung von Giardia-Toxin auf CHO-Zellen.
Fig. 11 veranschaulicht eine Toxin-Produktionskurve.
Fig. 12 veranschaulicht die Wirkung von Galle auf die Produktion von Giardia-Toxin, gemessen durch die CHO-Zellenverlängerung bzw. -dehnung.
Fig. 13 veranschaulicht die Wirkung der Impfung auf die Gewichtszunahme in Kätzchen vor und nach der Infektion mit Giardia.
Fig. 14 veranschaulicht die Wirkung der Impfung auf die Serum-IgG-Titer in Kätzchen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

A. Definitionen

Die folgenden Begriffe, wie sie hier benutzt werden, haben die folgenden Bedeutungen;
Adjuvans: ein Träger, der zum Fördern der Antigenität eingesetzt wird. Der Gebrauch, von Adjuvantien ist im Stande der Technik bekannt. Adjuvantien können Suspensionen von Mineralien einschließen, auf denen Antigen adsorbiert sein kann, wie Alaun, Aluminiumhydroxid oder Phosphat; W/O-Emulsionen, in denen Antigen-Lösung in Mineralöl emulgiert ist, wie Freund's unvollständiges Adjuvans, und sie können zusätzliche Faktoren einschließen, wie getötete Mycobakterien in Freund's vollständigem Adjuvans, um die Antigenität weiter zu fördern.
Antiköper: ein Molekül, speziell ein Protein, das sich immunologisch an ein bekanntes gütigen oder eine Determinante eines Antigens bindet.
Galle: die von der Leber ausgeschiedene und in das Duodenum abgegebene Substanz, wo sie die Emulgierung von Fetten unterstützt, die Peristaltik steigert und die Fäulnis verzögert. Der Begriff Galle wird auch für pulverisierte oder getrocknete Galle benutzt. Galle bedeutet auch irgendeine Komponente der Galle, wie ein einzelnes Gallensalz.
Kolonisierung: Haften der Protozoen am Darm des infizierten Tieres.
Zyste: die infektiöse Form vieler Protozoen-Parasiten, wie Giardia. Zysten werden üblicherweise mit einem stark kondensierten Zytoplasma und einer resistenten Zellwand bereitgestellt. Sie werden häufig im Kot ausgeschieden, und dies ist der Weg, auf dem die Krankheit von einem Tier zum anderen ausgebreitet wird. Zysten können lebensfähig sein, d. h., in der Lage, in einem neuen Wirt einen Trophozoiten zu produzieren, oder sie können nicht lebensfähig sein.
Effektive Menge: die zum Schützen eines Tieres gegen Infektion oder Erkrankung oder zur Erleichterung eines speziellen Symptoms einer Infektion oder Erkrankung erforderliche Dosis.
Futter-Umwandlung: Maß der Fähigkeit eines Tieres zur Gewichtszunahme, ausgedrückt, als das Futtergewicht, das zum Erzeugen einer Einheitsquantität des Körpergewichtes erforderlich ist. Darmerkrankungen, einchließlich solcher, die durch Protozoen verursacht werden, verringern diesen Parameter, indem sie das Tier weniger effizient bei der Umwandlung von Futter in Körpergewicht machen.
Giardia: eine Gattung parasitärer Flaggelaten, die den Dünndarm befallen. Wie er in dieser Anmeldung benutzt wird, schließt der Begriff alle Arten dieser Gattung ein. Die Gattung Lambia, die früher zur Bezeichnung von Giardia benutzt wurde, wird durch diesen Begriff, wie er in dieser Anmeldung benutzt wird, ebenfalls umfasst.
Giardiasis: Infektion mit Giardia. Die Symptome der Infektion, wie Diarrhöe, Bauchkrämpfe, Kopfschmerzen, Gas, Aufblähen, Gewichtsverlust, Mangel an Gewichtszunahme, Dehydratation, Unwohlsein, schlechte Absorption, Kolonisierung des Darmes mit dem Parasiten, Ausscheldung von Zysten usw., sind von dem Begriff Giardiasis umfasst.
Immunantwort: Entwicklung einer zellularen und/oder Antiköper-vermittelten Immunantwort im Wirt auf eine Zusammensetzung oder einen interessierenden Impfstoff. Eine solche Antwort kann aus einer oder mehreren der Folgenden bestehen: Produzieren von Antiköpern, B-Zellen Helfer-T-Zellen, Presser-T-Zellen und/oder zytotoxische T-Zellen, die spezifisch auf ein Antigen oder Antigene gerichtet sind, die in der Zusammensetzung oder dem Impfstoff von Interesse vorhanden sind.
Darmprotozoen: irgendwelche Protozoen, die den Darm des Tieres bewohnen, das sie infizieren.
Darmprotozoen-Infektion: Infektion mit Darmprotozoen. Die Symptome der Infektion, wie Diarrhöe, Darmkrämpfe, Kopfschmerzen, Gas, Aufblähen, Gewichtsverlust, Mangel an Gewichtszunahme, Dehydratation, Unwohlsein, schlechte Absorption, Kolonisierung des Darmes mit dem Parasiten, Ausscheidung von Zysten usw., sind auch eingeschlossen.
Neutralisieren: fähig, toxische Effekte zu verhindern oder zu vermindern.
Verhinderung von Symptomen: schließt die Verhinderung irgendeiner Wirkung ein, die durch ein Toxin verursacht wird.
Produktion in vitro: Produktion in Kultur, nicht in einem infizierten Wirtstier. Die Produktion in vitro schließt rekombinante Produktion ein.
Schützend immunogen: fähig, ein Tier gegen Infektion oder Krankheit zu schützen oder ein spezielles Symptom einer Infektion oder Krankheit zu vermindern.
Rekombinant produziert: produziert mittels einer Genexpression in irgendeinem arideren System, einschließlich Mikroorganismen, Pflanzen oder Tieren und/oder chemisch synthetisiert nach im Stande der Technik bekannten Verfahren, wenn die Sequenz bekannt ist.
Ultraschall-Behandlung: Zerstörung von Zellen, indem man eine Suspension der Zellen Schallwellen hoher Frequenz aussetzt.
Untereinheit: irgendein Teil von Darmprotozoen, der geringer als der ganze Organismus ist. Untereinheiten, die antigen sind, können in Impfstoff-Zusammensetzungen eingesetzt werden um eine Immunantwort zu erzeugen. Untereinheiten können Geißeln, die ventrale adhäsive Schreibe Membranen, Zytoskelettmembran-Proteine, Zytosolmembran-Proteine, Toxine und irgendeinen anderen Teil eines Organismus einschließen, der antigen sein kann und eine Immunantwort induziert. Dies schließt rekombinant produzierte Untereinheiten ein.
Toxin: eine schädliche oder giftige Substanz, die durch Darmprotozoen produziert wird. Es kann ein extrazellulares Produkt (Exotoxin) sein. Werden Darmzellen beeinflusst dann wird ein Toxin als Enterotoxin klassifiziert. Dies schließt rekombinant produzierte Toxine ein.
Trophozoit: die vegetative Form gewisser Darmparasiten, wie Giardia.
Impfstoff-Stamm: ein Stamm von Darmprotozoen, der schützend immunogen ist, wenn er einem Tier verabreicht wird. Dies schließt Stämme ein, die genetisch geschwächt worden sind.

B. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung schafft Impfstoff-Stämme von Darmprotozoen. Es wurde unerwarterweise festgestellt, dass das Züchten von Darmprotozoen in Galle-haltigen Medien diese schützend immunogen macht, wenn sie zum Impfen von Tieren eingesetzt werden.
Im Besonderen sind Darmprotozoen, die extrazellulär im Darm des Wirtstieres vorhanden sind, bevorzugt zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform schafft die Erfindung Impfstoff-Stämme und Toxine von Giardia. Solche Stamme und Toxine sind brauchbar zum Verhindern und Behandeln von Giardiasis und deren Symptomen.
Eine Vielfalt von Giardia-Stämmen ist in der vorliegenden Erfindung brauchbar. Stamme die gut in vitro wachsen und in der Lage sind, Ziel-Tierarten zu infizieren und beim Züchten in vitro ein Toxin zu produzieren, sind bevorzugt. Im Besonderen, können Giardia-Stämme WB (ein menschliches Isolat), S2 (ein Stamm, der aus Schafen isoliert wurde), D3 (ein Stamm, der aus Hunden isoliert wurde) und N (ein Stamm, der aus Trinkwasser isoliert wurde) eingesetzt werden. Stamme N und S2 sind am meisten bevorzugt.
Die Giardia-Stämme dieser Erfindung wurden gezüchtet, indem man sie in Galle-haltigen TYI-S-33-Medien wachsen ließ. Dehydratisierte Rindergalle wurde im Allgemeinen eingesetzt doch wird davon ausgegangen, dass Fraktionen von Galle, einschließlich einzelner Gallesalze, in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind. Die Gardia-Trophozoiten können in Behältern gezüchtet erden, die auch fein zerteilte feste Träger enthalten. Dies erhöht die Oberfläche, an der sich die Trophozoiten anheften können. Dextran-Perlen sind ein besonders bevorzugter fester Träger²&sup9;. Andere Träger-Systeme, wie Glasperlen oder -fasern, können auch geeignet sein. Einzelheiten dar Medien-Herstellung, Giardia-Trophozoiten-Subkultur und -Ernte sind in den folgenden Beispielen angegeben.
Die Erfindung schafft auch Impfstoff-Zusammensetzungen, umfassend einen Impfstoff- Stamm von Giardia oder anderer Darmprotozoen, der wirksam immunogen ist. Verschiedene Stämmme von Giardia können in solchen Impfstoff-Zusammensetzungen brauchbar sein. Im Besonderen sind Stämme bevorzugt, die ein Toxin produzieren, wenn sie in vitro gezüchtet werden. Beispiele der am meisten bevorzugten Stämme sind Gardia-Stämme S2 und N.
Die Impfstoff-Stämme können, wie in den Beispielen unten ausgeführt, gezüchtet und dann zum Einsatz in Impfstoff-Zusammensetzungen geerntet werden. Protozoen können vor dem Einsatz in Impfstoff-Zusammensetzungen zerstört bzw. zerrissen werden. Verschiedene Verfahren zum Zerstören können vorzugsweise benutzt werden, einschließlich Ultraschall-Behandlung, Osmose, die Anwendung von Druckunterschieden oder Gefrieren. Ultraschall-Behandlung ist am meisten bevorzugt.
Impfstoff-Zusammensetzungen können ein oder mehrere Impfstoff-Stämme von Darmprotozoen und/oder ein oder mehrere Untereinheiten und/oder Toxine von Giardia oder anderen Darmprotozoen enthalten. Solche Untereinheiten und/oder Toxine können zusätzlich zu ganzen oder Ultraschall behandelten Protozoen benutzt werden, oder sie können in zellfreien Impfstoff-Zusammensetzungen eingesetzt werden.
Es kann brauchbar sein, die Darmprotozoen, Toxine oder Untereinheiten vor dem Einsatz in Impfstoff-Zusammensetzungen zu inaktivieren. Konventionelle Techniken, wie milde Wärmebehandlung oder Formalin-Inaktivierung, können benutzt werden.
Die Formulierung solcher Impfstoff-Zusammensetzungen kann geeignete pharmazeutische Träger, einschließlich Adjuvantien, einschließen. Der Einsatz eines Adjuvans, wie eines Adjuvans auf Alaun-Grundlage, ist bevorzugt. Viele kommerzielle Adjuvantien können in der vorliegende Erfindung brauchbar sein. Für diese Untersuchungen wurde ein Adjuvans auf Alaun-Grundlage, enthaltend Aluminiumhydroxid, und Quill A (Super Fos, Kopenhagen, Dänemark) benutzt. Die genaue Formulierung dieser Impfstoff-Zusammensetzungen hängt von dem speziellen Impfstoff- Stamm, der zu immunisierenden Art und der Immunisierungsroute ab. Eine solche Impfstoff-Zusammensetzungsformulierung ist dem Fachmann bekannt.
Solche Impfstoff-Zusammensetzungen sind brauchbar zum Immunisieren irgendeines Tieres, das für Darmprotozoen empfänglich ist, wie Rinder-, Schaf-, Ziegen-, Pferde-, Hasen-, Schweine-, Hunde-, Katzen- und Vogelarten. Sowohl Haus- als auch wilde Tiere können immunisiert werden, und die Immunisierung von Nahrung erzeugenden Tieren ist vorgesehen. Auch Menschen können mit diesen Impfstoff-Zusammensetzungen immunisiert werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Giardiasis oder anderer Darmprotozoen-Infektion durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Impfstoff-Stammes von Giardia oder anderer Darmprotozoen an ein Tier, das eine solche Vorbeugung oder Behandlung benötigt. Ein solcher Impfstoff-Stamm kann in einer Impfstoff- Zusammensetzung eingesetzt werden, wie oben diskutiert. Dieses Verfahren ist brauchbar in Hunden, Katzen, Schafen, Menschen, Haustieren (insbesondere Nahrung erzeugenden Tieren), Vogelarten und wilden Tieren. Der Einsatz in wilden Tieren kann die Verunreinigung von Wasserquellen verhindern, die von Menschen oder Haustieren benutzt werden.
Die Verabreichungsroute kann irgendeine geeignete Route sein und sie kann in Abhängigkeit von den Darmprotozoen, dem zu behandelnden Tier und anderen Faktoren variieren. Parenterale Verabreichung, wie subcutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung, ist bevorzugt. Subcutane Verabreichung ist am meisten bevorzugt für Kaninchen- und Katzenarten. Die orale Verabreichung kann auch benutzt werden, einschließlich oraler Dosierungsformen, die für den Einsatz im Darm überzogen sind.
Der Zeitplan der Verabreichung kann in Abhängigkeit von den Darmprotozoen und dem zu behandelnden Tier varrieren. Tiere können eine einzelne Dosis oder eine sehr starke Dosis oder Dosen erhalten. Jährliche große Dosen können für einen fortgesetzten Schutz angewendet werden. Als ein primärer Kurs werden insbesondere zwei Dosen im Abstand von 21 Tagen bevorzugt.
Das Alter des zu behandelnden Tieres kann auch die Route und den Zeitplan der Verabreichung beeinflussen. Die Verabreichung ist bevorzugt in dem Alter, in dem mütterliche Antiköper nicht mehr vorhanden sind und das Tier immunologisch kompetent ist. Dies ist im Alter von etwa 6 bis 7 Wochen bei Kaninchen- oder Katzenarten der Fall. Zusätzlich ist die Immunisierung von Müttern zur Verhinderung der Infektion ihrer Jungen durch passive Übertragung von Antiköpern in ihrer Milch bevorzugt.
Das Verfahren dieser Erfindung ist wirksam bei der Verhinderung der Kolonisierung des Darmes, d. h., zum Verhindern des Anhaftens der Protozoen an der Darmschleimhaut. Es ist auch wirksam beim Verhindern von Symptomen bei Giardiasis. Dies schließt Neutralisationen von Toxin und Verhinderung irgendwelcher physiologischer Toxinwirkungen ein, die auftreten können, wenn, die Organismen im Hohlraum des Darmes vorhanden sind, nicht aber daran haften. Weiter vermindert das Verfahren dieser Erfindung die Kotausscheidung von Zysten und insbesondere lebensfähigen Zysten. Dies verhindert die Ausbreitung der Infektion.
Die Behandlung kann bei Tieren mit oder ohne Symptome erfolgen, einschließlich Tieren oder Menschen mit chronischer Infektion, und sie kann zum Erhöhen der Wachstumsrate durch Vermindern solcher Infektionssymptome, wie Diarrhöe, benutzt werden. Wird ein Nahrung erzeugendes Tier behandelt, dann kann dies die Futterumwandlung erhöhen.
Die vorliegende Erfindung schafft Toxine von Giardia oder anderen Darmprotozoen und Verfahren zur Herstellung dieser Toxine. Es wurde unerwarteterweise festgestellt, dass das Züchten von Organismen in Galle-haltigen Medien diese zum Produzieren eines Toxins in vitro veranlagst. Dieses Toxin kann zum Immunisieren von Tieren gegen Darmprotozoen-Infektion benutzt werden. Werden die Medien, in denen diese Organismen gezüchtet werden, konzentriert, dann wurde ein Toxin zum Verhindern und/oder Behandeln der Infektion erhalten. Dieses Toxin in Giardia ist ein Exotoxin und hoch zytotoxisch. Es scheint ein potentes Enterotoxin zu sein.
Bis vor Kurzem waren Versuche zum Isolieren eines Gardia-Enterotoxins nicht erfolgreich. Der Einsatz konzentrierter Lösungen und eines empfindlicheren Assay-Systems hat jedoch den Nachweis eines zytotoxischen Faktors gestattet, der durch Giardia produziert wird. Das Toxin wurde unter Einsatz von Zellen des Eierstockes des chinesichen Hamsters (CHO) nachgewiesen. Per CHO-Bioassay war 100- bis 10.000-fach empfindlicher als Hautpermeabilitäts-, Fettzellen- Lipolyse- und Ileumschlaufen-Assays. Tests mit dem Toxin haben gezeigt, dass es eine Verlängerung bzw. Dehnung von CHO-Zellen verursacht. Das Ausmaß der Dehnung (d. h., der Prozentsatz der Zellenverlängerung) nahm allgemein zu mit der Toxin-Konzentration. Die mit Giardia-Toxin beobachteten Resultate sind sehr ähnlich anderen Arbeiten, die mit bakteriellen Enterotoxinen ausgeführt wurden. Ein ähnlicher Effekt auf CHO-Zellen wurde unter Einsatz von E. coli-Toxinen, Cholera-Toxin und Keuchhusten-Toxin gefunden.
Teilreinigung des Giardia-Toxins wurde ausgeführt. Es wurde festgestellt, dass das Giardia-Toxin ein intrazellular produziertes Protein ist, das stabil ist bei 37ºC, bei Raumtemperatur, gekühlt oder gefroren. Unter Einsatz von SDS-PAGE wurde festgestellt, dass Toxin-haltige Medien mit Coomassie® zu färbende Proteine des etwaigen Molekulargewichtes von 22, 32, 38 und 39 kDa sowie mehrere Proteine von einem Molekulargewicht von größer als 97 kDa enthalten, die in Vergleichsmedien nicht vorhanden sind. Ammoniumsulfat-Fraktionierung von Toxin-haltigen Medien produzierten eine zytotoxische Fraktion mit Proteinen vom etwaigen Molekulargewicht von 16-20, 25-28, 36-42 und 50-65 kDa, die in Vergleichsmedien nicht vorhanden waren.
Immunisierung mit dem Toxin verringerte Symptome von Giardiasis, einschließlich Diarrhoe, und verminderte die Ausscheidung von Zysten mit dem Kot.
Die Verfahren dieser Erfindung sind brauchbar zum Produzieren von Impfstoff-Stämmen, Impfstoff-Zusammensetzungen, Toxinen und Antitoxinen zum Verhindern bzw. Vorbeugen und Behandeln anderer Darmprotozoen-Infektionen. Andere in der vorliegenden Erfindung brauchbar Darmprotozoen schließen Cryptosporidium, Trichomonaden, Histomonas, Spironucleus, Entamoeba. Coccidia, Toxoplasma und Sargocystis ein. Im Besonderen sind Cryptosporidium, Trichomonaden, Histomonas, Spironucleus und Entamoeba bevorzugt.
Cryptosporidium muris (auch Cryptosporidium parvum genannt) ist ein Protozoen-Parasit, der im Dünndarm und Dickdarm von Säugetieren und Geflügel gefunden wird, und Cryptosporidium melegridis wird im Bürstensaum des Atmungs- und Gastrointestinaltraktes von Geflügel gefunden. Der Parasit verursacht milde bis schwere Diarrhöe in Menschen, anderen Säugetieren und Vögeln und Atmungserkrankung in Vögeln. Cryptosporidium verursacht eine Verringerung der Oberfläche des Bürstensaumes, eine Beeinträchtigtung des Elektrolyten-Transportes und eine Diarrhöe mit schlechter Absorption, ähnlich Giardiasis. Es gibt ein ungeheures Potential für die Entwicklung eines Ganzzellen- oder Untereinheits-Impfstoffes für Cryptosporidium spp. Dieser Impfstoff kann hergestellt werden durch Zerstören des Parasiten, Kombinieren dieser Proteine mit Adjuvans und Immunisieren von Tieren oder Menschen durch ein orale oder parenterale Route. Ein oder mehrere Toxine können ein wichtiger Virulenz-Faktor sein und diese Toxine (oder Toxoide) können auch zum Impfen über orale oder parenterale Routen eingesetzt werden. Der Impfstoff kann zum Vorbeugen der Erkrankung oder zum Schutz gegen die Symptome der Erkrankung benützt werden. Antitoxin-Antiköper können zum Behandeln der Symptome von Cryptosporidiosis benutzt werden.
Trichomonaden sind eine große Familie von Protozoen-Parasiten mit Geißeln, die im Gastrointestinal-, Reproduktions- und Atmungstrakt von Säugetieren und Vögeln gefunden werden. Von den meisten Trichomonaden wird angenommen, dass sie nicht pathogene Kommensale sind. Wir glauben jedoch, dass, wie Giardia, einige dieser Protozoen-Parasiten die Gewichtszunahme und Flutterum Wandlung in Tieren beeinflussen und in einigen Fällen Diarrhöe verursachen können. Der Mechanismus kann Toxin-vermittelt sein. Impfung mit zerstörten Trichomonaden-Parasiten und Adjuvans kann Schutz vor Infektionen bieten oder Symptome der Infektion vermindern. Ähnlicherweise kann ein Toxin oder Toxoid Schutz bieten. Der Impfstoff würde die Kolonisierung des Darmes und die Beschädigung des Darmes verhindern. Es mag einen Überkreuzschutz von verschiedenen Trichomonadenarten geben.
Histomonas meleagridis ist ein Protozoen-Parasit mit Geißeln von Gefügel. Der Parasit wird aus dem Caecum freigesetzt und gelangt über den Blutstrom in die Leber. Es gibt Nekrose und Gewebedegeneration der Leber und des Caecums. Vögel, die sich von der Infektion erholt haben, sind immun gegen die Erkrankung. Wir glauben, dass ein Toxin bei der Pathogenese der Erkrankung eine Rolle spielt. Impfung mit einem zerstörten Zellen- oder Toxin-Impfstoff kann ein wirksames Verfahren der Bekämpfung von Histomoniasis in Geflügel sein. Der Impfstoff wurde die Kolonisierung des Darmes und das Durchdringen des Caecums verhindern. Der Impfstoff kann auch die Nekrose der Leber und des Caecums verhindern.
Spironucleus meleagridis ist eine Erkrankung junger Vögel, die zu Diarrhöe und Tod führt. Der Darm ist dann nach dem Tod gefüllt mit einer wässerigen Flüssigkeit. Dieser Parasit infiziert Haus- und wilde Vögel. Wir glauben, dass Spironucleus meleagridis Symptome durch ein Toxin- vermittelstes Verfahren induziert. Ein Impfstoff aus zerstörten ganzen Parasiten oder Toxin oder Toxoid kann Schutz vor dieser Infektion bieten. Der Impfstoff würde das Toxin neutralisieren und/ oder die Kolonisierung durch den Parasiten verhindern.
Entamoeba histolytica gehört zu den pathogenen amoebenartigen Protozoen, die Amoebenruhr in Menschen und Tieren verursachen. Der Organismus kolonisiert das Caecum und das Color und verursacht Diarrhöe und Dysenterie. Der Parasit kann in die Darmwand eindringen und sich in der Submucosa vermehren und Geschwürbildung verursachen. Der Parasit kann auch in die Lymphkanäle oder mesenterialen Venen eindringen, was zu Abszessen im ganzen Körper führt. Wir glauben, dass eines oder mehrere Toxine wichtige Virulenz-Faktoren sein können. Die Impfung mit zerrissenen Trophozoiden und/oder Toxin kann Schutz gegen Kolonisierung und/oder Eindringen des Parasiten schaffen. Die Impfung kann auch gegen die Diarrhöe und Dysenterie schützen, die bei dieser Erkrankung auftritt, da sie das Toxin neutralisieren und/oder das Eindringen des Parasiten verhindern würde.
Kokzidiose ist eine komplexe Darmerkrankung, die von Eimeria spp. oder Isospora spp. induziert wird, und die von großer wirtschaftlicher Bedeutung bei Haustieren ist. Diese Protozoen hüben einen komplexen Lebenszyklus und sie sind wirtsspezifisch. Versuche zur Herstellung von Impfstoffen wurden unternommen. Geflügel-Impfstoffe wurden produziert (CocciVac, CocciVac T, Sherwin Laboratories). Diese Impfstoffe schließen alle pathogenen Arten für Hühner und Puten ein. Die Entwicklung von Untereinheits-Impfstoffen war zum großen Teil nicht erfolgreich. Ein Kokzidien-Toxin wurde nicht identifiziert und Toxin-Impfstoffe nicht produziert. Es gibt ein Potential zur Produktion einer Untereinheits- oder verstärkten Impfstoffes auf der Grundlage eines Toxins oder Toxoids für Kokzidien von Menschen und Tieren. Diese schließen ein: Isospora ssp., Eimeria spp., Wenyonella spp. und Tyzzeria spp.
Toxoplasma haben einen komplexen Lebenszyklus. Mehrere Untersuchungsgruppen waren nicht in der Lage, Mäuse, Hamster und Kaninchen durch experimentelle Immunisierung mit Hitzegetöteten und Hitze- oder Formalin-getöteten homologen Tachyzoiten mit oder ohne Adjuvans zu Schützen. Gewisse Fraktionen haben Schutz gegen experimentelle Infektion geboten. Ein Zytotoxin von Zytoplasma wurde nicht identifiziert, die Immunisierung mit einem Toxin oder Toxoid kann jedoch Schutz gegen diese Erkrankung in Tieren und Menschen bieten.
Wie Kokzidien, haben Sarcocystis einen komplexen Lebenszyklus, bei dem die Eizysten in den Darmzellen des Raubtieres und während des asexuellen Stadiums in den Geweben des Beutetieres vorhanden sind. Sie sind üblich in vielen Haus- und wilden Tieren. Derzeit gibt es keinen Impfstoff für diese Protozoen-Parasiten und ein Zytotoxin wurde nicht gezeigt. Es gibt Potential für feine Impfstoff-Entwicklung für diesen Parasiten unter Anwendung der vorliegenden Erfindung.
Die folgenden Beispiele sollen in keiner Weise beschränken.

C. Beispiele von Ausführungsformen der Erfindung

Im Allgemeinen wurden die folgenden Materialien und Verfahren in den Beispielen benutzt, sofern nichts Anderes angegeben:

1. Medienrezept und Herstellung

Medium für G. lamblia (TYI-S-33) wurde unter Einsatz der folgenden Bestandteile hergestellt:
g/l
Caseinhydrolysat (Gibco 152-0014M) 20,0
Hefeextrakt (BBL 11929) 10,9
Dextrose (wasserfrei) 10,0
NaCl 2,0
K&sub2;HPO&sub4; (wasserfrei) 1,0
KH&sub2;PO&sub4; (wasserfrei) 0,6
L-Cystein (Sigma C 2529) 2,0
L-Ascorbinsäure (Sigma A 4034) 0,2
Rindergalle (Sigma B 3883) 0,8
Die Chemikalien kamen von British Drug Houses (BDH), sofern nichts Anderes angegeben.
Die obigen trockenen Bestandteile wurden kombiniert und bei 4ºC im Dunkeln aufbewahrt, bis sie benötigt wurden. Vitamin-Mischung der National Collection of Type Cultures, Colindale, England (NCTC) (Gibco Kat. #440-1100 EB) wurde gemäß Verpackungs-Instruktionen zubereitet, steril filtriert (0,22 um (0,22 u)) und als 30 ml-Mengen bei -20ºC gelagert. Eine Lösung von Eisen(III)ammoniumcitrat wurde durch Suspensieren von 2,28 g in 50 ml destilliertem Wasser (dH&sub2;O) unter Einsatz eines volumetrischen Kolbens hergestellt. Die Lösung wurde im Dunkeln bei 4ºC aufbewahrt, da sie fotolabil ist. CLEX (fötales Kalbsserum (FCS)-Ersatz) wurde aufgetaut und dann bei -20ºC als sterile 100 ml-Mengen (Dextran Products CLEX C-500) aufbewahrt.
Für einen Liter Medium wurde die Hälfte von 870 ml dH&sub2;O unter Benutzung eines Rührstabes in einen 1 l-Kolben gegossen, die trockenen Bestandteile wurden hinzugegeben und das Übrige Wasser wurde zum Spülen des Behälters und der Kolbenkanten benutzt. Dann gab an 500 m l der Eisen(III)ammoniumcitrat-Lösung hinzu. Die Lösung wurde gerührt, bis das Medium transparent war (üblicherweise 2-3 Stunden), dann wurde der pH mit 5 M NaOH auf 6,8 eingestellt. Das Medium wurde steril filtriert [0,22 um (0,22 u)] und unter aseptischen Bedingungen 30 ml Vitamin- Mischung und 100 ml CLEX hinzugegeben und eingemischt. Das zubereitete Medium wurde in Bruchteile aufgeteilt und bei -20ºC aufbewahrt, bis es benötigt wurde.

2. Gefrieren von Giardia-Trophozoiten

Giardia-Trophozoiten wurden unter Anwendung der folgenden Verfahren gefroren, Giardia wurde bis in die späte log-Phase (72 Stunden) gezüchtet. Das Medium wurde ausgegossen, um die gesunden Trophozoiten zurückzuhalten, die sich auf den Seitendes Röhrchens befanden. Frisches Medium wurde eingegossen und die Röhrchen für 10-15 Minuten auf Eis kältegeschockt und dann 10 Minuten bei 4ºC mit 500 · g zentrifugiert. Unter sterilen Bedingungen wurden 14 ml Medium abpipettiert, wodurch 2 ml für die erneute Suspension der Trophozoiten zurückblieb. Etwa 0,9 ml dieser Trophozoiten-Suspension wurde zu Gefrierröhrchen hinzugegeben, die 0,9 ml 20% DMSO in CLEX enthielten. Die Gefrierröhrchen wurden in Röhren zum Lagern in flüssigem N&sub2; angeordnet und in einem isolierten Behälter plaziert. Der isolierte Behälter wurde für mindestens 12 Stünden und maximal 72 Stunden in einer Gefriervorrichtung bei -70ºC und dann in der Gefriervorrichtung mit flüssigem N&sub2; angeordnet.
Die Trophozoiten wurden rasch aufgetaut durch Anordnen der Gefrierrohre in einem Wasserbad von 37ºC, in frisches Medium eingebracht und horizontal den ersten Tag inkubiert, nach 24 Stunden subgezüchtet und dann, wie üblich, inkubiert.

3. Subzüchten von Giardia-Trophozoiten

Die benutzten Giardia lamblia-Stämme waren: WB (ein menschliches Isolat, ATTC 30957), S2 (ein in unserem Laboratorium aus Schafen isolierter Stamm), D3 (ein in unserem Laboratorium aus Hunden iolierter Stamm) und N (ein in unserem Laboratorium, aus Trinkwasser in Botwood, Neufundland, isolierter Stamm).
Die folgenden Verfahren wurden zum Subzüchten von Giardia-Trophozoiten aller Stämme benutzt. Giardia wurde bis zur späten log-Phase (72 h) gezüchtet und dann durch Anordnen der Kultur-Röhrchen in Eis für 10 bis 15 Minuten kältegeschockt. Unter einer Haube mit laminarer Strömung wurden etwa 7-8 mg Piperacillin (Pipracil, Lederle) zu jedem neuen Kulturröhrchen hinzugegeben und dann wurden 15 ml frisches TYI-S-33-Medium zu jedem neuen Röhrchen hinzugegeben. Nach dem Kälteschock wurden die Röhrchen mit spätem log-Giardia einige Minuten lang Umgedreht, um die abgesetzten und anhaftenden Populationen zu vermischen. Mit einer sterilen 1 ml-Pipette wurden 1 ml Trophozoiten entnommen und zu dem neuen Kulturröhrchen hinzugegeben, wobei die Pipette ein- bis zweimal gespült wurde. Die neuen Röhrchen wurden mit Parafilm abgedichtet und aufrecht in einem Inkubator bei 37ºC angeordnet. Die Subkultur wurde in 3 bin 4 Tagen wiederholt.
Alternativ wurden Giardia-Trophozoiten in Doppeloberflächen-Glaswalzenflaschen (Bellco Kat. #7730-38910) gezüchtet. Die Konzentration von 10&sup6; Trophozoiten/m Kulturmedium wurden nach 72 Stunden der Inkubation leicht erhalten. Jede Walzenflasche erforderte etwa 650 ml Medium. Damit die Flasche voll genug war, um irgendwelche großen Luftblasen zu verdrängen, wurde das Medium vor der Verwendung auf 37ºC erwärmt. Um zu vermeiden, dass Trophozoiten am Oberteil der Flasche einer hohen Konzentration von Piperacillin ausgesetzt waren, wurde das Antibiotikum zuerst in einem gewissen Medium gelöst (bis etwa 0,5 mg/ml Endkonzentration), die Lösung in die Flache gegossen, die Flasche bis nahe dem Oberteil mit mehr Medium gefüllt, Giardia hinzugegeben (mindestens 10&sup6; Trophozoiten, wie oben kältegeschockt), die Flasche bis oben gefüllt, irgendwelche Luftblasen unter Benutzung einer Pipette entfernt und die Flasche dicht mit Parafilm verschlossen. Der Walzenflaschen-Apparat (Whaeton Modell III) wurde auf 6-8% der Motorleistung (2 Umdrehungen/min) eingestellt und die Flaschen 3-4 Tage kultiviert.

4. Ernten von Giardia-Trophozoiten

Giardia-Trophozoiten wurden folgendermaßen geerntet. Giardia wurde bis in die späte log- Phase (72 h) gezüchtet und dann durch Anordnen der Röhrchen oder Flaschen auf Eis (15-20 Minuten für 10 und 30 ml-Röhrchen, 45 Minuten für Walzenflaschen) kältegeschockt. Röhrchen oder Flaschen wurden dann mehrere Male umgekehrt und der Inhalt in sterile Zentrifugen-Röhrchen oder -Flaschen gegossen. Diese wurden bei 4ºC für 10 Minuten bei 500 · g zentrifugiert, um Trophozoiten-Pellets zu erhalten. Das Medium wurde entfernt und das Pellet erneut in sterilem PBS (pH 7,2) zum ursprünglichen Volumen des Mediums suspendiert. Die Suspension wurde bei 4ºC für 10 Minuten bei 100 · g zentrifugiert. Überstehendes wurde entfernt und die Trophozoiten in frischem PBS resuspendiert. Es wurden insgesamt vier Waschungen mit PBS ausgeführt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurden die Trophozoiten bis zu der erwünschten Konzentration in PBS resuspendiert.
Die Trophozoiten wurden bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert, um sie nicht zu beschädigen, sodass das gebildete Pellet sehr weich war und die Organismen beweglich waren. Es ist wichtig, das Überstehende rasch zu entfernen, bevor sich das Pellet selbst resuspendiert.

5. Ultraschall-Behandeln von Giardia-Trophozoiten

Giardia-Trophozoiten wurden unter Benutzung eines Virsonic Cell Disrupters Ultraschallbehandelt. Drei Behandlungen von 20 Sekunden waren im Allgemeinen genügend. Die Anwesenheit intakter Trophozoiten wurde unter Benutzung eines Hämozytometers überprüft. Eine zusätzliche Behandlung wurde, wo erforderlich, für die vollständige Zerstörung benutzt. Die Trophozoiten. Wurden immer auf Eis gehalten und die Spitze der Ultraschall-Vorrichtung mit 70% Ethanol zwischen den Behandlungen gekühlt. Das Ultraschall-Behandelte wurde in Bruchteile aufgeteilt und bei -20ºC gelagert.

6. Zubereiten von Impfstoff aus dem gesamten Ultraschall-Behandelten

Ein Impfstoff aus dem gesamten Ultraschall-Behandelten von Giardia wurde folgendermaßen zubereitet. Die Protein-Konzentration des Ultraschall-Behandelten wurde bestimmt (BIORAD Proteinassay) und auf 0,75 mg/ml in sterilem PBS eingestellt. Diese Lösung wurde in den folgenden Untersuchungen 4 : 1 mit dem vorbeschriebenen Adjuvans auf Alaun-Grundlage vermischt zur Verwendung beim Immunisieren von Tieren.

7. Konzentrieren von Giardia-Toxin

Mittel und sehr verdünnte Giardia-Proben wurden konzentriert, um eine brauchbar Konzentration von Toxin unter Einsatz einer Amicon-Vorrichtung (Modell Nr. 8200) zu erhalten. Diese Vorrichtung benutzt N&sub2;-Druck, um Wasser und Teilchen geringen Molekulargewichtes (MW) durch eine Membran mit einem spezifizierten MW-Durchgang zu drücken. Die für diese Untersuchungen benutzte Membran YM-10 hat einen MW-Durchgang von 10.000. Die Vorrichtung enthält auch einen Rührstab, der hilft, dass die Proteine nicht die Membran verstopfen und Wasser leichter hindurchgehen kann.
Membranen wurden manchmal mehr als einmal für das gleiche Protein benutzt. Nach dem Gebrauch wurde die Membran in dH&sub2;O gespült und in 10% Ethanol gekühlt. Neue Membranen wurde 1 Stunde lang bei dreimaliger Wasseränderung in dH&sub2;O eingetaucht, um das Haltbarkeitmittel der Membran zu entfernen.

8. Junge Kätzchen-Modell

Eine Untersuchung der Machbarkeit der Benutzung von jungen (6-8 Wochen) Kätzchen als ein Modell-Infektionssystem wurde als anfängliche Untersuchung ausgeführt. Mehrmalige Kot-Flotationen wurden mit dem Kot dieser Kätzchen während ihrer Konditionierungs-Periode ausgeführt, um einen Gardia-freien Status sicherzustellen. Die Kätzchen (n = 6) wurden anästhesiert, Laparotomien ausgeführt, und die Kätzchen intraduodenal mit 1,0 · 10&sup6; Giardia lamblia-Trophozoiten in 1 ml PBS inokuliert. Jedes von zwei Kätzchen erhielt die folgenden Giardia lamblia-Stämme 1) WB-Stamm (ein gut charakterisiertes menschliches Isolat (ATCC 30957); 2) S2-Stamm (ein durch unser Laboratorium aus einem Schaf isolierter Stamm) oder 3) D3-Stamm (ein durch unser Laboratorium aus einem Hund isolierter Stamm).
Klinische Zeichen wurden überwacht und vier Kot-Untersuchungen auf Cysten während der 7 Tage unmittelbar nach der Infektion ausgeführt (siehe Tabelle 1). Serum-Proben wurden am Tag der experimentellen Infektion und am 7. Tag (dem Tag post mortem) zur Bestimmung des IgM- Titers und IgG-Titers (Tabelle 2) der entsprechenden. Ultraschall-behandelten Giardia-Stämme (d.h., WB, S2 bzw. D3) genommen. Es wurden Trophozoiten-Zählungen an 1,0 cm-Längen des Duodenums jedes Kätzchens (Tabelle 3) ausgeführt und Gewebeproben für das Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop genommen. Galle und Schleimhaut-Auskratzungen wurden gesammelt und Juroren (-70ºC) für das zukünftige lokale Testen der immunologischen Reaktion und für enzymatische Assays gelagert.
Protozoen-Parasiten mit einer für Giardia lamblia typischen Morphologie wurden im Duodenum, Jejunum und (zu einem geringeren Ausmaß) Ileum von WB- und S2-infizierten Kätzchen gesehen. Keine Trophozoiten waren bei den D3-infizierten Kätzchen unter Anwendung irgendeiner der Mikroskopie-Techniken evident. Auf der Grundlage dieser Pilot-Untersuchung wurde entschieden, das Kätzchen-Infektionsmodell für weitere Untersuchungen zu benutzen, da Giardia-Stämme Infektiös sind und klinische Zeichen in diesem Modell produzieren. Tabelle 1: Klinische Zeichen Giardia-infizierter Kätzchen Tabelle 2: ELISA-Titer von Kätzchenserum auf Giardia Tabelle 3: Trophozoiten-Zählungen von Duodenalgewebe

9. Enzym linked immunosorbent assay (ELISA)

Homogenisat-Proben von Katzen- und Hunde-Darmschleimhaut wurden zubereitet durch Homogenisieren des Gewebes bei 10 Gew.-% pro Volumen in 2 mM EDTA, dann Lagern bei -80ºC. Proben wurden aufgetaut, 1 : 2 (Katzen) oder 1 : 1 (Hunde) mit PEPBS (2 mM EDTA, 1 mM PMSF) verdünnt, die Mischung durch fünf Durchgänge durch eine 18G-Nadel dispergiert, dann für 20 Minuten bei 17.000 · g zentrifugiert. Die Überstehenden, die lösliche Protein-Fraktionen enthielten, wurden zur Ausführung des ELISA benutzt. Serum- und Galle-Proben wurden bei -80ºC gelagert, aufgetaut, 2-fach mit PEPBS verdünnt, zentrifugiert und die Überstehenden zum Einsatz bei der Ausführung von ELISA entfernt. Alle Proben wurden im Doppel untersucht.
Das Blockieren für alle Assays mit Ausnahme der Hunde-IgG-Serumassays erfolgte mit 2% Gamma-Globulin-freiem FCS in PBS für eine Stunde bei 37ºC mit drei Waschungen. Hunde-IgG- Serumassays wurden mit 10% Magermilchpulver in PBS für eine Stunde bei 37ºC blockiert.
Für Katzen-IgG-Assays wurden Ultraschall-behandelte Giardia (S2) als das Antigen benüzt. Ultraschall-behandeltes S2 (0,2 mg/ml in PBS) wurde zu jeder Bohrung (100 ul pro Bohrung) hinzugegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Bohrungen wurden dann (dreimal) mit PBS- Tween gewaschen. Serum-, Galle- oder Darmschleimhaut-Überstehende, zubereitet wie oben beschrieben, wurden als der primäre Antikörper (37ºC, 1 Stunde, 3 Waschungen) benutzt. Ziegen- Antikatzen-IgG-HRP (KPL Kat. #042002), verdünnt 1 : 1.000 in PBS, wurde als der sekundäre Antiköper (37ºC, 1 Stunde, 4 Waschungen) eingesetzt.
Für IgA-Katzen-Assays wurde Ultraschall-behandelter Giardia-S2-Stamm als Antigen eingesetzt. Serum-, Galle- oder Darmschleimhaut-Überstehende, zubereitet wie oben beschrieben, wurden als der primäre Antikörper eingesetzt. Ziegen-Antikatzen-IgA (Bethyl Lab. Kat # A20-101), verdünnt 1 : 250 in PBS, wurde als der sekundäre Antiköper (37ºC, 1 Stunde, 4 Waschungen) benutzt. Kaninchen-Antiziegen-IgA-HRP (Sigma Kat. #A-4174), verdünnt 1 : 500 in PBS (37ºC, 1 h, 4 Waschungen) wurde als der tertiäre Antiköper benutzt.
Für Hunde-Assays wurde Ultraschall-behandelter Giardia-S2-Stamm eingesetzt, uni die Bohrung zu überziehen, wie im Katzen-Assay beschrieben. Serum-, Galle- oder Darmschleimhaut- Überstehende, zubereitet wie oben beschrieben, wurden als der primäre Antikörper benutzt. Ziegen-Antihunde-IgG-HRP (KPL Kat #041902) oder Ziegen-Antihunde-IgA-HRP (Bethyl Lab. Kat #A40-104B), verdünnt 1 : 1.000 in PBS, wurde als der sekundäre Antiköper eingesetzt.

Beispiel 1

Stammauswahl und Haltbarmachung

Eine Vielfalt von Stämmen von Giardia lamblia wurde in vitro in Röhrchen von TYI-S-33- Medium unter Benutzung unserer Standardlaboratoriums-Methoden gezüchtet. Primäre und sekundäre Materialien wurden gefrören bei -70ºC gelagert. Wachstums-Kurven dieser drei Stämme von Giardia, lamblia (WB, S2, D3) wurden bestimmt (Fig. 1) und mit der Toxin-Reaktion (Zelldehnung) von Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) (Fig. 2-4) verglichen. Obwohl D3 die beeindruckendsten Wachstums-Eigenschaften zeigte, erschienen alle drei Stämme auf 4 Grundlage angemessener Wachstumsfähigkeiten in vitro, der Fähigkeit Ziel-Tierarten zu infizieren und der toxischen Effekte auf CHO-Zellen viel versprechend.

Beispiel 2

Kätzchen-Impfung - experimentelle Infektion

Für diese Untersuchung wurden die folgenden experimentellen Gruppen fetsgelegt: Gruppe A - 7 Kärtchen wurden mit 0,2 ml des oben beschriebenen Adjuvans und 0,8 ml PBS subcutan verabreicht, scheinimmunisiert, dann mit Giadia lamblia Stamm S2 durch intraduodenale Inoculation von 1 · 10&sup6; lebensfähigen Trophozoiten in 1,0 m PBS am Tage 28 infiziert. Gruppe B - 3 Kätzchen wurden mit 0,2 ml Adjuvans und 0,8 ml konzentriertem (10-mal) Kultur-Überstehendem von S2 (750 ug Protein/ml und demonstrierter toxischer Wirkung auf CHO-Zellen, subcutan verabreicht, geimpft, dann mit der gleichen Zubereitung am Tage 21 aufgefrischt, dann mit S2 intraduodenal am Tage 28 infiziert; Gruppe C - 8 Kätzchen wurden mit 0,2 ml Adjuvans und 0,8 ml Ultraschallbehandelten ganzen S2-Trophozoiten (750 um Protein/ml), subcutan verabreicht, geimpft, mit der gleichen Zubereitung am Tage 21 aufgefrischt, dann intraduodenal mit S2 am Tage 28 infiziert.
Klinische Zeichen wurden überwacht und quantitative Zählungen der Kotzysten täglich 42 Tage nach der Infektion ausgeführt. Die Kätzchen wurden täglich gewogen und Wachstums-Kurven für die nicht geimpfte Gruppe (Gruppe A) und die S2-Ultraschall-Impfstoff-Gruppe (Gruppe C) aufgenommen. Serum-Proben wurden wöchentlich erhalten und post mortem für IgG-ELISA-Titer. Nach der Euthanasie wurden Darmproben (Duodenum, Jejunum, Ileum) für Trophozoiten-Zählungen, Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie genommen. Schleimhaut-Auskratzungen Serummproben und Galle wurden gesammelt und gefroren (-70ºC) für immunologische Analysen und enzymatische Untersuchungen gelagert.
Intermittierende Diarrhöe und weiche Stühle traten irregulär bei allen Kätzchen in dieser Untersuchung auf. Kein Unterschied der Schwere wurde zwischen nicht geimpften Tieren und geimpften Tieren beobachtet. Die Gewichtszunahme-Daten für die nicht geimpfte Gruppe A und die mit Ultraschall behandeltem S2 geimpfte Gruppe B nach der Infektion mit Giardia lamblia sind in Fig. 5 gezeigt. Geimpfte Kätzchen gewannen signifikant mehr Gewicht während der Untersuchung als nicht geimpfte Vergleiche. Die immunologischen Reaktionen in Kätzchen dieser drei Experimentellen Gruppen, wie durch Serum IgG-ELISA bestimmt, sind in Fig. 6 gezeigt. Sowohl Gruppe B (Toxin-immunisiert) als auch Gruppe C (mit Ultraschall behandelten S2 immunisiert) zeigte eine signifikante Zunahme im Serum-IgG, eine typische Reaktion auf die Immunisierung und das Auffrischen der Immunisierung. Nur eine minimale Zunahme im Titer wurde in diesen, immunisierten Tieren nach der Infektion mit Giardia festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigten die Gruppe A oder die nicht immunisierten infizierten Kätzchen eine Reaktion nur nach der Infektion, aper dies war eine minimale Zunahme im Serum-Titer. In Fig. 6 sind auch die IgG-Titer eines einzelnen (n = 1) nicht immunisierten und nicht infizierten Kätzchens eingeschlossen. Darm-Trophozolten-Zählungen wurden auf 1,0 cm-Darmsegmenten vom Duodenum, Jejunum und Ileum aller Kätzchen ausgeführt. Die Resultate sind in Fig. 7 dargestellt. Die Immunisierung mit Ultraschall behandelten S2-Trophozoiten (Gruppe C) reduzierte die Zahl der Trophozoiten, die im Darmhohlraum des Duodenums und Jejunums vorhanden war, verglichen mit nicht geimpften Kätzchen (Gruppe A). Daten der Toxin-immunisierten Tiere (Gruppe B) sind weniger überzeugend, möglicherweise wegen des vergleichsweise kleineren "n"-Wertes (n = 3) dieser Gruppe. Alternativ kann die Immunisierung mit Toxin allein Symptome verhindern, nicht aber die Infektion, oder eine höhere Toxindosis kann wirksamer werden. Interessanterweise wurden Trophozoiten nicht leicht im Ileum gefunden, wie dies typischerweise für Giardiasis in Hauskatzen³&sup0; beschrieben wurde. Eine Variation der oben beschriebenen Darm-Trophozoitendaten ist auch in Fig. 8 gezeigt, wo der Prozentsatz der Darmproben, in denen Trophozoiten gefunden wurden, zwischen den experimentellen Gruppen verglichen ist. Ein vergleichsweise geringer Prozentsatz von Darmproben war positiv hinsichtlich der Anwesenheit von Giardia-Trophozoiten in den mit Ultraschall behandelten S2-immunisierten Kätzchen (Gruppe C), verglichen mit nicht immunisierten (Gruppe A) und Toxin-immunisierten Kätzchen (Gruppe B).
Die Immunisierung mit Ultraschall behandelten S2-Trophozoiten verringerte die Schwere der Zysten-Ausscheidung der Kätzchen.
Die mikroskopische Untersuchung ausgewählter Darmgewebe-Proben zeigte, dass Trophozoiten in nicht immunisierten Kätzchen, nicht aber oder selten in mit Ultraschall behandeltem S2- immunisierten Kätzchen vorhanden waren.
Die Resultate der immunologischen Untersuchungen der IgA-Niveaus in Serum Und Darmschleimhaut sind in Tabelle 4 angegeben. Es wurde keine IgA-Reaktion in nicht geimpften, nicht infizierten Tieren festgestellt. Eine starke IgA-Reaktion wurde in Tieren festgestellt, die mit Ultraschall-behandeltem S2 geimpft und infiziert worden waren. Im Gegensatz dazu zeigten nicht geimpfte, infizierte Tiere nur eine schwache IgA-Reaktion. Es gab eine mäßige IgA-Reaktion in mit Toxin geimpften und infizierten Tieren. Die Impfung induzierte somit eine stärkere IgA-Immunantwort als die natürliche Infektion. Eine nicht spezifische Immunantwort wurde in allen Galle-Proben festgestellt, einschließlich bei nicht geimpften, nicht infizierten Tieren. Tabelle (Fortsetzung) Tabelle 4: Serum- und Schleimhaut-Antiköper IgA-Titer

Beispiel 3

Hunde-Impfung - experimentelle Infektion

Eine Untersuchung der Wirksamkeit der Impfung von Hunden mit Ultraschall-behandeltem Giardia Stamm S2 wurde folgendermaßen ausgeführt: zwei Gruppen von vier jungen Hunden im er von 8-10 Wochen wurden benutzt. Eine Gruppe von Tieren (Nummern 1 bis 4) erhielt subcutan einen Impfstoff, enthalten Ultraschall behandelten Giardia-Stamm S2, wie oben beschreiben hergestellt (Tag 1). Jedes Tier erhielt 1 ml des Impfstoffes, enthaltend 600 ug Protein in 0,8 ml PBS und 0,2 ml des vorbeschriebenen Adjuvans. Die andere Gruppe (Nummern 5 bis 8) wurde nicht, geimpft.
Drei Wochen später (Tag 21) erhielten die Tiere 1 bis 4 eine Auffrischungs-Impfung mit dem Giardia-Impfstoff, wie oben beschrieben. Die Tiere 5 bis B wurden nicht geimpft. Am Tage 28 wurden alle jungen Hunde mit 4 · 10&sup6; Giardia lamblia-Stamm N-Trophozoiten infiziert. Stamm N wurde benutzt, weil er in Hunden stark infektiös ist. Die Infektions-Organismen wurden intraduodenal on 1 ml PBS verabreicht. Die Resultate zeigen, dass die Immunisierung mit Giardia-Stamm S2 einen Überkreuzschutz gegen Infektion mit Giardia-Stamm N bietet.
Nach der Infektion wurden wöchentlich Blutproben genommen, der Kot wurde täglich, auf Konsistenz und Zysten-Ausscheidung bis zum Töten aller Tiere am Tage 56 untersucht.
Die Impfung schützte die Hunde gegen Diarrhöe, die die geimpften Tiere im Mittel nur 2,2 ± 1,5 Tage hatten, während nicht geimpfte Tiere Diarrhöe für im Mittel 8,2 ± 5,6 Tage zeigten.
Die Daten der Zysten-Abgabe zeigten, dass geimpfte Tiere weniger Zysten ausschiedet als ungeimpfte Tiere. Die Resultate sind in Fig. 9 gezeigt.
Darmabschnitte von 1 cm Länge wurden in PBS gehängt und eine Stunde bei 37ºC geschüttelt. Die Anzahl der Trophozoiten wurde auf einem Hämozytometer gezählt. Die Resultate sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Impfung beseitigte Giardia-Trophozoiten aus allen Bereichen des Darmes der immunisierten Tiere. Tabelle 5: Trophozoiten-Zahlen/cm Darm
Der Impfstoff induzierte eine spezifische Serum- und Schleimhaut-Immunreaktion auf Giardia. Es gab eine starke Serum-IgG-Antwort auf den Impfstoff, die drei Wochen nach der Impfung begann. Im Gegensatz dazu zeigten nicht geimpfte Hunde eine schwache Reaktion erst nach vier Wochen der Infektion.
Es gab eine schwache bis mäßige Serum-IgA-Reaktion nach Impfung und Infizierung in Woche 6, aber keine Serum-IgA-Rektion in ungeimpften Tieren. Beide Gruppen hatten nachweisbares IgA in der Galle post mortem. IgA wurde im Duodenum und Ileum in geimpften und ungeimpften Tieren nachgewiesen.

Beispiel 5

Produktion, Reinigung und Assay von Toxin

Das WB-Isolat von Gardia lamblia wurde 10 Tage in TYI-S-33-Medium, ergänzt mit NTCC- 109 Vitamin-Mischung (3%), CLEX (10%), Galle (0,8 g/l) und Piperacillin, bei 37ºC gezüchtet. Die Kulturen wurden in der log-Phase mit Übertragungen in dreitägigen Intervallen gehalten. Nach 10 Tagen wurde das Medium ("konditioniertes Medium") bei 3000 · g für 15 Minuten zentrifugiert steril filtriert (0,22 u-Filter - Nalgene Co.) und mit einer Amicon-Vorrichtung mit YM-10 Membranfilter konzentriert.
Die Zelllinie CHO-K1 (ATCC Nr. CCL61) von Eierstöcken des chinesischen Hamsters wurde in Eagles speziellen α-Minimalmedium (MEM), ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum (PCS) und 0,5% Penicillin und Streptomycin mit Aminosäuren, in 5% CO&sub2; bei 37ºC unter 90% relativer feuchte gezüchtet.
Für morphologische Untersuchungen wurde eine Suspension von 5 · 10³ CHO-Zellen in 200 ul Medium zu jeder Bohrung einer Gewebezüchtungsplatte mit 96 Bohrungen (Linbro Corp.) hinzugegeben und in 5% CO&sub2; bei 37ºC für 48 Stunden inkubiert. Das Medium in jeder Bohrung wurde mit einer Pipette entnommen und durch 150 u frisches Medium ersetzt. 50 ul der zu testenden Substanz wurden zu der ersten Bohrung einer Reihe hinzugegeben und eine vierfache Reihenverdunnung wurde zum Ende der Reihe (12 Bohrungen) ausgeführt. Die Platte wurde wiederum 48 Stunden lang inkubiert. Jede Bohrung wurde dann mit Giemsa-Färbung gefärbt und der Prozentsatz der verlängerten Zellen bestimmt. Jedes morphologische Datum auf der graphischen Darstellung repräsentiert die mittleren Prozent verlängerter Zellen aus 500 gezählten Zellen (Fig. 10). Die Resultate des Assays von konzentriertem Gardia lamblia-Medium wurden mit einem Vergleich konzentrierten Gardia-freien Mediums verglichen. Cholera-Toxin (Sigma Corp.) und Keuchhusten Toxin wurden als positive Vergleiche benutzt. Cholera-Toxin bewirkt eine charakteristische Verlängerungs-Reaktion und Keuchhusten-Toxin bewirkt eine charakteristische Verklumpungs-Reaktion.
Die Wirkung variierender Verdünnungen der Filtrate auf die Morphologie von CHO-Zellen ist in Fig. 10 veranschaulicht. Die Dehnung der Zellen ist sehr deutlich nach dem Aussetzen gegenüber konzentriertem 10 Tage-Medium von Giardia (GM). CHO-Zellen zeigten auch eine Verlängerung, nicht aber zum gleichen Grade, wenn sie einer identischen Verdünnung des konzentrierten sterilen Vergleichs-Mediums (cm) ausgesetzt wurden. Das cm zeigte einige morphologisch Reaktionen bei höheren Konzentrationen, doch resultierte selbst die größte Reaktion nur in einer Verlängerung von 31,6% der CHO-Zellen bei einer Konzentration von 0,25 der ursprünglichen Konzentration. Das GM hatte eine sehr viel größere Wirkung auf die CHO-Zellen-Morphologie bei der höhehren Konzentration (75% bei 0,25% der ursprünglichen Konzentration) und erzeugte auch eine Verlängerung bei sehr geringen Konzentrationen. Die Verlängerung von CHO-Zellen resultierte bei Konzentrationen oberhalb 1,5 · 10&supmin;&sup5; · dem ursprünglich konzentrierten Giardia-Medium. Die durch das GM erzeugte Verlängerung vergrößerte sich nach der ersten Verdünnung und begann dann mit nachfolgenden Verdünnungen abzunehmen (Fig. 10).
Fünfhunderttausend Trophozoiten wurden am Tage 0 in 16,0 ml von frischem TYI-S-33- Medium in 10 Kulturröhrchen inokuliert. Die Trophozoiten wurden täglich aus einem statistisch ausgewählten Röhrchen gezählt. Ein 2,0 ml-Probe des Mediums wurde abgezogen und steril mit erlern 0,22 um (0,22 u)-Filter (Costar Corp.) filtriert. Ein ml des sterilisierten Kulturmediums wurde bei 4ºC gekühlt und der andere 1 ml bei -70ºC gefroren. Dieses Verfahren wurde 8 Tage lang wiederholt. Jede gesammelte Fraktion des Kulturmediums wurde, wie oben beschrieben, mit dem CHO-Zellen-Bioassay untersucht.
Gesunde log-Phasen-Giardia-Trophozoiten wurden zweimal in 20 mM Tris-Puffer, pH 6,0, gewaschen, 15 Minuten bei 5000 · g zentrifugiert, dann in 1,0 ml Puffer resuspendiert. Die Trophozoiten wurden dann einmal 15 Sekunden lang Ultraschall-behandelt und das erhaltene Material durch Lichtmikroskopie auf überlebende Trophozoiten untersucht. Das Ultrachall-behandelte Material wurde durch einen 0,22 um (0,22 u)-Filter (Costar Corp.) filtriert, um den Zytosol-Inhalt zu sammeln. Der Filter wurde mit 1,0 ml Puffer zurückgewaschen, um die Membranen und Zytosol- Fraktionen zu sammeln. Der Puffer, die Zytosol-Fraktion und die Membran-Fraktion wurde auf toxische Aktivität mit dem CHO-Zellen-Bioassay untersucht.
Die Beziehung zwischen Titer des Wachstumsmediums (GM) und Giardia-Wachstumskurve ist in Fig. 11 gezeigt. Die Giardia-Trophozoiten teilen sich und nehmen in einer logarithmischen Weise in der Anzahl zu. Es gibt eine Verzögerungs-Phase am Tag 1, eine Beschleunigungs-Phase am Tag 2, eine Verlangsamungs-Phase am Tag 3. Danach nimmt die Anzahl der Trophozoiten beständig ab. Die Trophozoiten erreichten eine Maximalzahl von 4 · 10&sup7; am Tag 3. Der Titer des Mediums begann nach dem Tag 1 zuzunehmen und nahm während der Wachstumsphase der Trophozoiten zu. Nach dem Tag 3, an dem die Anzahl der Trophozoiten abzunehmen begann, nahm der Titer weiter zu.
Proteine im Toxin-Medium wurden unter Anwendung von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie®-Brilliantblau gefärbt. Das Vergleichsmedium wurde mit Ultraschall behandeltem Giardia-Material (Zytosol-Gehält), Toxinmedium, in dem Giardia lamblia 3, 4, 5, 6, 7, 10 und 25 Tage gezüchtet wurde, sowie FCS verglichen. Toxin enthaltendes Medium enthält Proteine vom etwaigen Molekulargewicht von 22, 32, 38, 39 und mehr als 97 kDa, die in den Vergleichsmedien nicht vorhanden waren.
Der Tris-Puffer und die Membran- und Zytoskelett-Fraktionen der Ultraschall-behandelten Trophozoiten waren negativ hinsichtlich toxischer Aktivität. Die Zytosol-Fraktion führte zum Zelltod bei der höchsten Konzentration und nachfolgendem Zellüberleben und Verlängerung bei geringeren Konzentrationen. Diese Feststellungen waren ähnlich den mit GM erhaltenen Resultaten.
Die Wirkung von Galle auf die Toxin-Produktion ist in Fig. 12 gezeigt. In Galle-haltigen Medium gezüchtete Giardia produzierten ein Toxin, gemessen durch die CHO-Zellen-Dehnung. In Medien ohne Galle gezüchtete Giardia taten dies nicht.

Beispiel 6

Immunisierung erwachsener Katzen

Es wurde eine weitere Untersuchung ausgeführt, um die immunologische Reaktion erwachsener Katzen auf Impfung mit Extrakten der drei Stäme von Giardia lamblia zu untersuchen. 12 erwachsene Katzen wurden mit Ultraschall behandelten Giardia lamblia-Stämmen WB (373 ug Protein/ml) (n = 4), S2 (864 ug Protein/ml) (n = 4) und D3 (120 ug Protein/ml) (n = 4) immunisiert. Die Katzen wurden subcutan geimpft und erhielten 1,0 ml Impfstoff, der 0,2 m des vorbeschriebenen Adjuvans und 0,8 ml Ultraschall-behandeltes Material umfasste. Die Katzen erhielten 21 Tage später eine Auffrischungs-Impfung und ein weiteres Mal nach weiteren 21 Tagen. Eine Vorimmunisierungs-Blutprobe wurde genommen, und allen Katzen entnahm man Proben für IgG-ELISA 7 Tage nach jeder Auffrischungs-Impfung. Die folgende Tabelle (Tabelle 6) ist eine Zusammenfassung der immunologischen Daten, die bei dieser Untersuchung erhalten wurden. Erwachsene Katzen hatten einen höheren anfänglichen IgG-Titer auf Giardia als junge Kätzchen, die im obigen Experiment beschrieben wurden (d. h., Tabelle 2) und diese erwachsenen Katzen reagierten auf Impfung mit einer signifikanten Zunahme im IgG-Titer. Tabelle 6: Serum-IgG-Titer von mit Giardia immunisierten erwachsenen Katzen
nd = nicht bestimmt

Beispiel 7

Lamm-Immunisierung

Fünf kaiserliche Lämmer mit einem mittleren Gewicht von 18 kg wurden aus der Schafherde (Romanov-Kreuzung) der Agriculture Kanada, Lethbridge, Alberta, Kanada ausgewählt. Eine vorimmune Blutprobe wurde am Tage der anfänglichen Impfung genommen. Die Lämmer wurden dann mit 1 ml intramusculär (IM) verabreichtem Impfstoff inokuliert. Der Impfstoff wurde am Tage zuvor unter Einsatz von 0,8 ml Ultraschall behandelten Giardia lamblia-Trophozoiten (S2- Stamm), zubereitet wie oben beschrieben, resuspendiert zum Erhalt von 0,75 mg Protein/ml PBS (Phosphat-gepufferter Salzlösung) zubereitet. Die Ultraschall-behandelte Lösung wurde dann zu 0,2 ml Adjuvans auf Alaun-Grundlage hinzugegeben, um eine Protein-Endkonzentration von. 0,6 mg/ml zu erhalten.
Drei Wochen später wurde eine andere Blutprobe genommen und die Lämmer erhielte ihre zweite Injektion (Auffrischung), die identisch der ersten war und auch IM verabreicht wurde. Dann sammelte man Blutproben in der 5. und 7. Woche nach der anfänglichen Inokulierung. Die Injektionsstellen wurden regulär überwacht und es wurde keine abnormale Reaktion beobachtet.
Das Blut wurde bald nach dem Sammeln zentrifugiert und das Serum vor der Analyse gefroren. Der Nachweis spezifischer Antikörper-Titer auf Giardia lamblia erfolgte unter Benutzung eines ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)-Tests. Es wurden doppelte Proben ausgeführt. Der ELISA wurde in der gleichen Weise wie der vorbeschriebene Katzen-IgG-Assay mit der Ausnahme ausgeführt, dass Kaninchen-Antischaf-IgG-HRP-konjugiertes Reagenz (ICN Kat. #674501) als sekundärer Antiköper benutzt wurde. Die Woche 0 wurde als negativer Vergleich benutzt, Titer- Resultate sind in Tabelle 7 gezeigt.
Die Lämmer zeigten signifikante Antiköper-Titer gegen Giardia lamblia, selbst nach einer einzelnen Inokulation mit dem Impfstoff. Die Auffrischungs-Inokulation in Woche 3 erhöhte die anfängliche Immunreaktion. TABELLE 7 Serum IgG-Titer aus mit Giardia immunisierten Lämmern

Beispiel 8

Ammoniumsulfat-Fraktionierung von konditioniertem zehnfachen TYI-S-33-Medium

Das S2-Isolat von Giardia lamblia wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, gezüchtet. Zehnfach konzentriertes konditioniertes TYI-S-33- und Vergleichs-Medium wurden mit 0-40%-, 40-60%-, 60- 80%-Ammoniumsulfat-Pellets, 80-100% Überstehendem und dem 100% Ammoniumsulfat-Pellet hinsichtlich Toxinaktivität in einem CHO-Dehnungsassay, wie oben beschrieben, vergliche. Die Resultate sind in Tabelle 8 gezeigt. Die Aktivität wurde als die höchste Verdünnung des zehnfächen Mediums definiert, die eine 50%-ige Dehnung der CHO-Zellen verursachte.
Die Ammoniumsulfat-Fraktionierung führte zu einer 115,9-fachen Reinigung (6400/55,2). Die Gewinnung betrug 10%.
Die aktive Fraktion wurde auf einem SDS-PAGE-Gel untersucht. Einzigartige Banden, die weder im Vergleichs- noch konditionierten Medium nachweisbar waren, waren in der Ammoniumsulfat-Fraktion sichtbar. Diese Banden haben Molekulargewichte im Bereich von 65-50 kDa, 42-36 kDa, 28-25 kDa und 20-16 kDa. Es mögen andere Proteine vorhanden sein, doch waren sie nicht nachweisbar. TABELLE 8 Ammoniumsulfat-Fraktionierung von zehnfachem konditioniertem TYI-S-33-Medium
* Aktivität nicht nachgewiesen

Beispiel 9

Immunisierung von kleinen Hunden und Kätzchen

Kleine Hunde (33) und Kätzchen (33) wurden statistisch einer geimpften Gruppe (20 kleine Hunde und 20 Kätzchen), einer ungeimpften Vergleichsgruppe (10 kleine Hunde und 10 Kätzchen) und einer unmanipulierten Vergleichsgruppe (3 kleine Hunde und 3 Kätzchen) zugewiesen. Am Tage 0 und am Tage 21 wurden die 20 kleinen Hunde und 20 Kätzchen subcutan mit 1,0 ml eines Giardia-Impfstoffes geimpft, der aus Giardia S2-Trophozoiten zusammengesetzt war, die in einem Galle-haltigen Medium gezüchtet worden waren. Die ungeimpfte Vergleichsgruppe erhielt nur Salzlösung.
Die Zubereitung des Impfstoffes erfolgte durch Züchten von Trophozoiten in Galle-haltigem Medium in Polystyrol-Flaschen (1,2 bis 2,5 l), inkubiert für 48 bis 96 Stunden bei 34 bis 37ºC. Die Flaschen wurden für bis zu 24 Stunden bei 2 bis 7ºC gekühlt, um die Lösung der Trophozoiten von der Wachstums-Oberfläche zu gestatten. Die Trophozoiten wurden geerntet und durch kontinuierliche Strömungsrotor-Zentrifugation konzentriert. Die konzentrierten Trophozoiten wurden dann zentrifugiert, zweimal mit kalter normaler Salzlösung gewaschen, dann auf 5 bis 10% des ursprünglichen Züchtungsvolumens resuspendiert. Die Suspension wurde zweimal mittels eines, Hochdruck-Homogenisators homogenisiert, um ein totales Zerreißen der Trophozoiten zu erzielen. Die homogenisierte Suspension enthielt nicht weniger als 200 ug/ml Gesamtprotein (Biorad-Proteinassay). Jeweils 1,0 ml des Impfstoffes enthielt 150 ug Protein in 0,9 ml normaler Salzlösung plus 0,1 ml Adjuvans auf Alaun-Grundlage.
Am Tag 35 wurde die geimpfte und die ungeimpfte Vergleichsgruppe mit 10&sup6; Giardia lamblia-Trophozoiten durch intraduodenale Inokulation infiziert. Kätzchen wurden mit Giardia S2- Stamm, kleine Hunde mit N-Stamm infiziert. Vom Tag 35 bis zum Tag 56 wurden klinische Symptome der Erkrankung (Diarrhöe, Anorexie, Aktivität) täglich überprüft und die Tiere wöchentlich gewogen. Kotproben wurden wöchentlich gesammelt und Kotzysten gezählt. Blut wurde vor der ersten Impfung und wöchentlich während der Untersuchung genommen und die Serum-Antikörperniveaus wurden bestimmt. Am Tag 56 wurden die Tiere durch Euthanasie getötet und Segmente des Duodenums, Jejunums und Ileums entfernt und die Trophozoiten gezählt.
Geimpfte kleine Hunde hatten 12,3 ± 1,3 Tage weiche Stühle und 0,2 ± 0,1 Tage Diarrhoe, während ungeimpfte kleine Hunde 15,1 ± 1,3 Tage weichen Stuhl und 0,6 ± 0,2 Tage Diarrhoe hatten. Geimpfte Kätzchen hatten 2,85 ± 0,60 Tage weichen Stuhl, während ungeimpfte Kätzchen 4,4 ± 0,9 Tage weichen Stuhl hatten. Geimpfte Tiere zeigten also ein vermindertes Auftreten von Diarrhoe oder weichem Stuhl.
Kein Unterschied in der Aktivität wurde zwischen geimpften und Vergleichs-Tieren festgestellt.
Es gab keinen Unterschied in der Gewichtsrate zwischen geimpften und ungeimpften kleinen Hunden. Ungeimpfte Kätzchen zeigten eine Wachstumsverzögerung während der Nachinfektions-Periode im Vergleich zu den geimpften Tieren (Fig. 13).
Zysten wurden während der Vorinfektions- und Nachinfektions-Periode gezählt. Geimpfte Tiere hatten keine Kotzysten oder zeigten nur eine kurze Periode der Zystenausscheidung. Ungeimpfte Tiere wiesen eine größere Anzahl von Zysten für eine längere Zeitdauer auf.
Ein größerer Anteil ungeimpfter Tiere schied Giardia-Zysten aus. Bei kleinen Hunden schieden 0-5% der geimpften Tiere Zysten aus, verglichen mit 20-80% ungeimpfter Tiere. Bei Kätzchen schieden 0-35% der geimpften Tiere Zysten aus, verglichen mit 40-80% ungeimpfter Tiere.
Die Zysten-Lebensfähigkeit würde in geimpften und ungeimpften Kätzchen bewertet. Dies erfolgte durch Färben der Zysten mit Methylenblau und Beobachten der Aufnahme von Farbe durch die Zysten. Die Zysten wurden auch auf Vakuolenbildung und abnormale Struktur untersucht, die Anzeichen für einen Verlust der Lebensfähigkeit sind. Wurden Zysten ausgeschieden, dann betrug die Zysten-Lebensfähigkeit 38,8% ± 5,0% in geimpften Tieren und 99,9% ± 0,1% in ungeimpften Kätzchen.
Bei der Nekroskopie wurden Trophozoiten im Duodenum, Jejunum und Ileum nach dem in früheren Beispielen beschriebenen Verfahren gezählt. Die Zahlen und log-transformierten fahlen sind in den Tabellen 9 bis 12 angegeben. Geimpfte Tiere hatten ein geringeres Auftreten von Trophozoiten und geringere Zahlen von Trophozoiten als ungeimpfte Tiere.
Am Ende der Untersuchung waren bei geimpften kleinen Hunden 5-10% der Tiere mit dem Parasiten infiziert, während bei geimpften Kätzchen 0-5% der Tiere infiziert waren. Bei ungeimpften Tieren waren 80-90% der kleinen Hunde und 30-60% der Kätzchen mit dem Parasiten infiziert. TABELLE 9 Darm-Trophozoitenzählen in ungeimpften Kätzchen (Anzahl der Trophozoiten/cm Darm)
AVG = Mittel; STE = Standardfehler, T = Gesamtzahl der Tiere, I = Anzahl der infizierten Tiere %I = Prozent infizierte Tiere TABELLE 10 Darm-Trophozoitenzahlen in geimpften Kätzchen (Die Daten repräsentieren die Anzahl von Trophozoiten/cm Darm) Tabelle 10 (Fortsetzung)
AVG = Mittel, STE = Standardfehler, T = Gesamtzahl der Tiere, I = Anzahl der infizieren Tiere %I = Prozent infizierte Tiere TABELLE 11 Darm-Trophozoitenzahlen in ungeimpften kleinen Hunden (Anzahl der Trophozoiten/cm Darm) Tabelle 11 (Fortsetzung)
AVG = Mittel, STG = Standardfehler, T = Gesamtzahl der Tiere, I = Anzahl der infizierten Tiere %I = Prozent infizierte Tiere TABELLE 12 Darm-Trophozoitenzahlen in geimpften kleinen Hunden (Die Daten reoräsentieren die Anzahl von Trophozoiten/cm Darm) Tabelle 12 (Fortsetzung)
AVG = Mittel, STE = Standardfehler, T = Gesamtzahl der Tiere, I = Anzahl der infizierten Tiere %I = Prozent infizierte Tiere
Die Antiköper-Messung erfolgte unter Benutzung von in den vorigen Beispielen beschriebenen Verfahren. Die humorale Immunität war ausgeprägt in geimpften Tieren, während ungeimpfte Tiere dürftig auf den Giardia-Parasiten reagierten. Die Serum-IgG-Reaktion in der Vorinfektions- und Nachinfektions-Periode in Kätzchen ist in Fig. 14 gezeigt.
Eine Modifikation der oben beschriebenen Arten der Ausführung der verschiedenen Ausführungsformen dieser Erfindung werden für den Fachmann augenscheinlich, wenn er den Lehren dieser Erfindung folgt, wie sie hier beschrieben sind. Die oben beschriebenen Beispiele sind nicht beschränkend, sondern nur exemplarisch für diese Erfindung, die durch die folgenden Ansprüche definiert ist.

Claims

1. Giardia-Stamm, wobei diese Giardia in Galle enthaltenden Medien gezüchtet wurden, als ein Impfstoff-Stamm zur Verwendung als ein schützendes Immunogen.

2. Impfstoff-Stamm nach Anspruch 1, der ja vitro ein Toxin erzeugt.

3. Impfstoff-Zusammensetzung, die bei er Verabreichung ja vivo eine schützende Immunität gegen Darm-Protozoen schafft, wobei die Impfstoff-Zusammensetzung eine schützend immunogene Menge eines Immunogens umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Impfstoff- Stamm der Darm-Protozoen, wobei die Darm-Protozoen in Galle enthaltenden Medien gezüchtet wurden, um sie schützend immunogen zu machen, einer Untereinheit des Impfstoff-Stammes der Darm-Protozoen, einem Toxin der Darm-Protozoen und Kombinationen davon.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, angepasst zur Verwendung in wilden oder domestizierten Tieren, für die Nahrungsmittelproduktion benutzten Tieren, Menschen, Hunde-, Katzen- oder Vogelarten.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, die eine schützende Überkreuz-Immunität gegen andere Darm-Protozoen als die Darm-Protozoen in der Zusammensetzung schafft.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 3, die wirksam ist, das Ausstreuen lebensfähiger Darmprotozoen-Zysten in dem Tier zu verhindern.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 3, die einem Symptome oder keine Symptome aufweisenden Tier verabreicht wird und die Wachstumsrate dieses Tieres erhöht.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 3, die einem Menschen verabreicht wird, der eine chronische Darmprotozoen-Infektion aufweist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 3, die einem zur Nahrungsmittel-Produktion eingesetzten Tier verabreicht wird und die Futter-Umwandlung in dem Tier erhöht.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Darm-Protozoen Giardia sind.

11. Giardia-Toxin, erhältlich aus einem Gardia-Stamm, der zur Erzeugung des Toxins in vitro in der Lage ist, wenn er in Galle enthaltenden Medien gezüchtet wird, wobei die Immunisierung mit dem Toxin Symptome einer Gardia-Infektion verhindert, wenn eine wirksame Menge des Toxins einem mit Gardia infizierten Tier verabreicht wird.

12. Toxin nach Anspruch 11, das eine zytotoxische Wirkung erzeugt.

13. Toxin nach Anspruch 11, das ein Exotoxin umfasst.

14. Toxin nach Anspruch 11, das ein Enterotoxin umfasst.

15. Verfahren zum Herstellen einer Impfstoff-Zusammensetzung, umfassend:

a) Zubereiten eines Impfstoff-Stammes von Darm-Protozoen durch Züchten der Darm- Protozoen in Galle umfassenden Medien in vitro und

b) Kombinieren des Impfstoff-Stammes mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

16. Verfahren zum Herstellen eines Gardia-Toxins, umfassend:

a) Zubereiten einer Kultur durch Züchten von Giardia ja vitro in Galle umfassenden Medien,

b) Konzentrieren der Medien der Kultur durch Entfernen von Wasser und Materialien mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 und

c) Reinigen des Toxins aus dem Konzentrat,

wobei das Toxin zur Verhinderung von Symptomen einer Gardia-Infektion in der Lage ist, wenn eine wirksame Menge des Toxins einem mit Gardia infizierten Tier verabreicht wird.

17. Verwendung einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Immunogens umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Impfstoff-Stamm von Giardia, einer Untereinheit von Giardia, einem Giardia-Toxin und deren Kombinationen, wobei die Giardia in Galle enthaltenden Medien gezüchtet wurden, um sie schützend immunogen zu machen, zur Herstellung eines Medikamentes zur Verhinderung oder Behandlung einer Giardia-Infektion in einem Tier.