JP3856345B2 - 腸原生動物のワクチン類 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の分野】
本発明は、腸の原生動物（プロトゾア）に対するワクチンに関する。詳細には、ジアルジア属（Giardia）に対するワクチンを開示する。
【０００２】
【文献】
以下に示す文献を、本出願の関連した部分に肩文字として本出願の中で引用する。
【０００３】
１．Taylor他著「ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）感染に対する人免疫応答」、J. Infect. Dis.、 155:137-140 (1987）。
【０００４】
２．Gillon著「ジアルジア鞭毛虫症における小腸粘膜の変化」「Giardia and Giardiasis」、Erlandsen他編集、 Plenum Press、 New York、 163-183 (1984）。
【０００５】
３．Wolfe著「臨床的症状および古典的方法による診断」「Human Parasitic Diseases、Volume 3 - Giardiasis」、Meyer編集、 Elsevier Science Publishers、 New York、 175-186 (1990）。
【０００６】
４．Feely他著「ジアルジア属の生物学」「Human Parasitic Diseases、Volume 3 - Giardiasis」、Meyer編集、 Elsevier Science Publishers、 New York、 11-49 (1990）。
【０００７】
５．Steketee他著「チャイルド・デイケアセンターにおける最近のジアルジア鞭毛虫症の発生」、Wis. Am. J. Pub. Health 79:485-490 (1989）。
【０００８】
６．Faubert著「ジアルジア鞭毛虫症が動物寄生病であることの証拠」、Parasitology Today、4(3):66-71 (1988）。
【０００９】
７．Roach他著「野生マウスにおけるヒトおよび動物源からのジアルジア・ジュオデナリス（Giardia duodenalis）伝染」「Advances in Giardia Research」Wallis他編集、 Univ. Calgary Press、 Calgary、 79-82 (1988）。
【００１０】
８．Swabby他著「ヒトおよび動物源からのジアルジア属によるモンゴルアレチネズミ（Meriones unguiculatus）の感染」「Advances in Giardia Research」、Wallis他編集、 Univ. Calgary Press、 Calgary、 75-77 (1988）。
【００１１】
９．Jakubowski著「パープルバープス（Purple burps）および飲料水供給の濾過」、Am. J. Pub. Health、 78:123-125 (1988）。
【００１２】
１０．Buret他著「家畜反すう動物におけるジアルジア鞭毛虫症に関する動物寄生の可能性」、J. Infect. Dis.、 155: 137-140 (1987）。
【００１３】
１１．Vinayak他著「ランブル鞭毛虫の５６ｋＤａ分子を経口で用いた全身免疫化で実験マウスに保護を与える」、Vaccine 10:21-27 (1992）。
【００１４】
１２．Buret他著「成長、腸形態およびジサッカリダーゼ活性に対するマウスのジアルジア鞭毛虫症の影響」、J. Parasitol. 76 (3):403-409 (1990）。
【００１５】
１３．Buret他著「ジアルジア・ジュオデナリスに感染したアレチネズミにおける小腸の発育と酵素活性および微絨毛の音波処理」、Parasitol. Res. 77:109-114 (1991）。
【００１６】
１４．Janoff他著「ジアルジア属感染における免疫の役割」、「Human Parasitic Diseases、Volume 3 - Giardiasis」、Meyer編集、 Elsevier Science Publishers、 New York、 215-235 (1990）。
【００１７】
１５．Lewis他著「アレチネズミにおけるランブル鞭毛虫感染のコルチゾン誘発再燃」、Am. J. Trop. Med. Hyg. 36 (1):33-40 (1987）。
【００１８】
１６．Istre他著「山リゾートにおける飲料水を媒介とするジアルジア鞭毛虫症：後天性免疫に関する証拠」、Am. J. Public Health、 74 (6):602-604 (1984）。
【００１９】
１７．den Hollander他著「ジアルジア鞭毛虫症の免疫学」、Parasitology Today、 4:124-130 (1988）。
【００２０】
１８．Adam著「ジアルジア種の生物学」、Microbiology Reviews、 55:706-732
(1991）。
【００２１】
１９．Roberts-Thomson他著「動物モデルにおけるジアルジア鞭毛虫症感染に対する後天性耐性」、J. Immunology、 117:2036-2037 (1976）。
【００２２】
２０．LoGalbo他著「Ｘ関連無ガンマグロブリン血症を有する３人の患者における症候性ジアルジア鞭毛虫症」、J. Pediat、 101:78-80 (1982）。
【００２３】
２１．Janoff他著「エイズにかかった患者ではランブル鞭毛虫に対する急性抗体応答が押えられている」、J. Infect. Dis、 157:798-804 (1988）。
【００２４】
２２．Butscher他著「ジアルジア・ムリス（Giardia muris）の表面糖蛋白質に対するモノクローナル抗体の治療作用」、Immunology、 64:175-180 (1988）。
２３．Stevens他著「マウスのジアルジア鞭毛虫症における局所的免疫：母親の腸を犠牲にしてミルクが保護されるか」、Trans. Assoc. Am. Phys. 91:268-272 (1978）。
【００２５】
２４．Roberts-Thomson他著「ジアルジア・ムリス感染に対するマウスの保護」、Infect. Immun.、 24:971-973 (1979）。
【００２６】
２５．Smith他著「慢性ジアルジア鞭毛虫症：薬剤感受性、トキシン産生、および宿主免疫応答に関する研究」、Gastroenterology、 83:797-803 (1982）。
【００２７】
２６．Katelaris他著「ジアルジア鞭毛虫症における下痢と吸収不良：多因子進行か」、Gut. 33:295-297 (1992）。
【００２８】
２７．Nash他著「ランブル鞭毛虫の排泄−分泌産物」、J. Immunology、 131:2004-2010 (1983）。
【００２９】
２８．Katelaris他著「ランブル鞭毛虫による下痢の病原性：エキソトキシンに関する証拠」、J. Gastroenterology．Hepatol. 3 (suppl 1):A4 (1988）。
【００３０】
２９．Zaman著「電子顕微鏡走査するためのランブル鞭毛虫用担体としてのデキストラン粒子」、J. Electron. Microsc.、 41:179-180 (1992）。
【００３１】
３０．Kirkpatrick他著「猫のジアルジア鞭毛虫症、自然および誘発された感染に関する観察」、Am. J. Vet. Res.、 45:2182-2188 (1984）。
【００３２】
上記出版物および特許明細書の開示内容は、個々の出版物または特許明細書各々の文脈が具体的かつ独立して本明細書に包含されている場合には、同じ内容でそれらの全体が引用することによって本明細書の内容となる。
【００３３】
【発明の背景】
腸の原生動物は、人および動物の数多くの病気の原因となるものである。これらが家畜動物に感染すると、重大な経済的な損失がもたらされ得る。重要な腸原生動物には、クリプトスポリジウム（cryptosporidium）、トリコモナズ（trichomonads）、ヒストモナス（histomonas）、スピロヌクレウス（spironucleus）、アメーバ属（entamoeba）、球虫類（coccidia）、トキソプラスマ（toxoplasma）および住肉胞子虫類（sarcocystis）が含まれる。最も問題となる腸原生動物門の１つはジアルジア属（Giardia）である。
【００３４】
ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）は西洋諸国で最も通常に見いだされる病原性寄生性生物であり、北アメリカの多くで風土病である¹。ジアルジア属は、便−経口ルートで伝染する鞭毛のある原生動物である²。ジアルジア属における病原メカニズムはほとんど理解されていないが、これは、他の数多くの胃腸管病に類似した症状をもたらす。最も通常の症状は下痢、食欲不振、倦怠感、腹拡張および胃腸内にガスが溜まることである。感染の急性段階は通常数日間継続するのみであるが、時として特に子供では、慢性段階が数カ月に渡って継続し得る³。
【００３５】
ジアルジア属の栄養型がそれの宿主の中に一度入ると、これらは、宿主の腸絨毛の上皮に取り付き、胞のうに包まれた後、宿主の便の中に排出される。感染した宿主の数人は、この感染の短い急性段階が過ぎた後、症状を示さないでシスト（本明細書では、「のう子」ともいう。）を移す人になる^４。
【００３６】
ジアルジア属感染の主要源は飲料水の中に混入している。このことから、「バックパッカー下痢（backpackers diarrhea）」の名前を得ている、と言うのは、キャンプをしている時の多くの人が汚染された水に暴露されたことが原因となって感染したからである⁴。ジアルジア鞭毛虫症の発生もまたデイケアセンター（day care center）でしばしば問題になっている。デイケアセンターで繰り返されるジアルジア属感染は通常のことであり、子供達の多くが全く症状を示さないにも拘らず、その感染のキャリアであることが見いだされている。このことによって、デイケアセンターにおけるジアルジア属の検出および有効な治療が困難になっている⁵。
【００３７】
ジアルジア属感染で興味の持たれている主要な領域は、ジアルジア属の人感染株のための貯蔵者として動物宿主が作用し得ることである。ジアルジア属の種間伝染が生じる可能性もありそして生じていると言った証拠が存在している。人におけるジアルジア属の株は、アレチネズミ、マウス、モルモット、ラクーンおよびビーバー^6-8に感染性を示すことが示されている。カナダでジアルジア属感染に与えられている一般名の「ビーバーフィーバー（beaver fever）」は、３匹のビーバーから成る集団による水源の汚染が原因となる感染が流行したことで生まれた⁹。ジアルジア属感染は犬および猫においては通常のことである。犬の１０−６８％および猫の２５％がジアルジア属に感染していると見積もられている。家畜の反すう動物でジアルジア属感染が流行していることに関する研究により、羊の１７．７％および牛の１０．４％が感染していることが確認されており、子羊（３５．６％）および子牛（２７．７％）の罹病率の方が高い¹⁰。
【００３８】
前に示したように、臨床的ジアルジア鞭毛虫症は、無症状の寄生性生物キャリアから下痢、腹痙攣、頭痛、ガス、膨満および不快によって特徴づけられる病気の範囲であり得る¹’¹¹。体重減少および成長の遅れもまた、人および動物におけるジアルジア鞭毛虫症に関連した通常の問題である¹¹。
【００３９】
人では、ジアルジア属に関係した組織学的変化には絨毛萎縮が含まれる²。動物モデルとしてモンゴルアレチネズミ（Mongolian gerbils）を用いた極最近の研究により、主に十二指腸内で微絨毛の拡散が低下すると共に刷子縁の酵素活性が低下することが示された。この酵素欠乏症は、上皮の微絨毛が短くなることによって引き起こされ得る¹²。他の研究は、体重増加の低下、食物吸収の低下、腸ジサッカリダーゼ活性の低下および絨毛萎縮と、ジアルジア属感染とを相互に関係付けている¹³。この微絨毛の拡散低下は、ジアルジア属が産生するトキシンの結果であり得る¹²。
【００４０】
【発明が解決しようとする課題】
ジアルジア鞭毛虫症が流行しそして無症状担体キャリアが原因となって感染した全ての人を治療することが困難であることから、ジアルジア属に対するワクチンを開発することが非常に望まれている。宿主はジアルジア属に対して免疫応答を上昇し、そしてこれらは、一次感染の後長く継続する免疫を維持し得ることが示された¹⁴'¹⁵。宿主を繰り返してジアルジア属に暴露すると、感染の危険性が低下する¹⁶。従って、宿主が免疫を取得する可能性がある。この宿主が示す免疫応答は、ジアルジア属に対して示す宿主応答の幅広い多様性を説明するものであり得る。この免疫システムがその原生動物に対して適当な防御を生じることができない場合、病気になる¹⁴。ジアルジア属の免疫分野における先の研究は、病原メカニズムに関する理解が不足していたことで妨げられていた。
【００４１】
自然的および実験的ランブル鞭毛虫およびジアルジア・ムリス感染で、その宿主は細胞および体液免疫を生じることが示された¹’³’¹⁴’¹⁷’¹⁸。自然的および実験的感染における免疫の進展は、この寄生性生物がいなくなることに関連している¹⁶’¹⁸。しかしながら、ジアルジア属に対して上昇した免疫応答を示す人および動物でも、その宿主における不適当な免疫が原因となり得る臨床的または準臨床的ジアルジア鞭毛虫症を示し得る¹⁴’²⁰’²¹。ジアルジア属寄生性生物に二次暴露された後、症状のひどさ、感染過程および感染率が低下することが、人および動物モデルで示された¹⁴’¹⁶’¹⁹。
【００４２】
ランブル鞭毛虫およびジアルジア・ムリス栄養型およびのう子に対する数多くのモノクローナルおよびポリクローナル抗体が実験室動物の中で産生された。このような抗体を作り出す目的は、診断目的であるか或は実験室研究のための試薬を得るためである。これらの抗体は、標準的ハイブリドーマ技術およびＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて作り出されている。抗原およびフロインドのアジュバンドで複数免疫化を行うことによって、ラビットおよび小型げっ歯類動物の中でポリクローナル抗体が作り出された。
【００４３】
抗ジアルジア属抗体を用いた受動免疫化が行われた。Butscher他²²は、Ｇ．ムリス栄養型の表面糖蛋白質に対するモノクローナル抗体を腹こう内投与することでマウスにおける寄生性生物数が減少することを示した。免疫の受動的転移が母乳で示された²³。ジアルジア・ムリスに予め感染させた母マウスはそれらの乳飲み子に保護を与えるが、ナイーブな（naive）母親の母乳は保護を与えない。
【００４４】
ジアルジア属の栄養型またはサブユニットワクチンを用いた動物の実際的免疫化に関する研究は極めて限定されている。Roberts-Thomson他は、実験室マウスの２つの株に予防接種した後、対抗研究を行った²⁴。損傷を受けていないジアルジア・ムリス栄養型（１０⁶）をフロインドのアジュバンドと一緒にした後（１：１の比率）、腹こう内注射および足裏内注射を行った。４週間後、アジュバントなしの同じ服用を動物の同じ場所に投与した。対照マウスにはアジュバントのみを与えるか或は処理を行わなかった。１週間後、マウスにジアルジア・ムリスののう子を投与した。予防接種したＢＡＬＢ／ｃマウスは、より短い期間の間にのう子の排出を低くする一方、対照マウスと予防接種したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの間では、のう子排出に関する差は全くなかった。従って、この研究では、変動を示すと共に有効性を示さない結果が得られた。
【００４５】
Vinayak他¹¹は、ランブル鞭毛虫から５６ｋＤａの蛋白質を単離した。マウスを皮下で免疫化し（０日）、そして多重ラメラホスファチジルコリンリポソーム（ＭＰＬ）に捕捉されている５６ｋＤａの表面関連抗原を１００μｇ用いて経口免疫化した（７日）。免疫化していない動物と、ＭＰＬ−に捕捉されているＰＢＳ（燐酸塩緩衝食塩水）で同様に免疫化した動物を対照として用いた。最後の免疫化服用を行った後７日で、全ての動物へチャレンジを行った。ＭＰＬ−に捕捉されている５６ｋＤａの表面関連抗原を用いた免疫化により、対照群と比較して、腸の栄養型コロニー形成および感染期間の低下がもたらされた。この５６ｋＤａの表面抗原はそのジアルジア属感染を免疫調節することが示された。
【００４６】
ジアルジア属は、小腸粘膜の機能または構造に影響を与える細胞毒を分泌すると考えられているが²⁵’²⁶、細胞毒を同定するための古典的方法を用いて同定される毒性原理はまだ１つ以上存在しているべきである²⁵’²⁶。ジアルジア属の培養物濾液を用いて排泄／分泌産物を処理することにより培養培地を生じさせることが示された²⁵。培養物の濾液は、培養中の線維芽細胞に損傷を与えると共に、ラットの潅流ループ（perfused loops）からの塩および水吸収を低下させることが示されているが、ジアルジア鞭毛虫症の病原性でこれらの物質が果す役割は未知である²⁷。
【００４７】
人を含む動物におけるジアルジア鞭毛虫症を含む原生動物感染を予防および治療する目的で用いられ得る有効なワクチンに対する必要性が存在している。
【００４８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、動物における腸原生動物感染を予防または治療するためのワクチンおよび方法、並びに上記ワクチンで用いられ得る新規なトキシン類を提供するものである。特にジアルジア鞭毛虫症を予防または治療するためのワクチン類および方法も提供する。本発明はまた、これらの方法で得られるか或は用いられる新規なトキシン類、抗体、ワクチン株および組成物の製造および使用方法も包含している。
【００４９】
従って、１つの態様において、本発明は、腸原生動物のワクチン株を提供するものである。これらのワクチン株の製造方法も提供する。
【００５０】
本発明の別の態様は、腸原生動物のワクチン株を含んでいるワクチン組成物である。腸原生動物のサブユニットまたはトキシンを含んでいる、細胞が入っていないワクチン組成物もまた、これらのワクチン組成物を製造する方法と同様提供する。
【００５１】
本発明のさらなる別の態様は、腸原生動物門のワクチン株の有効量を動物に投与することを含む、動物における腸原生動物門による感染を予防または治療する方法である。腸原生動物のサブユニットまたはトキシンを含んでいる、細胞が入っていない組成物を投与することを含む、腸原生動物による感染を予防または治療する方法も提供する。
【００５２】
本発明のさらなる別の態様は腸原生動物のトキシンである。このトキシンの製造方法もまた、このトキシンに対する抗体およびこの抗体を用いた受動免疫化方法と同様提供する。
【００５３】
Ａ． 定義
本明細書で用いる下記の言葉は以下の意味を有する。
【００５４】
アジュバント：抗原性を増強する目的で用いられる賦形剤。アジュバント類の使用は当該技術分野でよく知られている。アジュバント類には、抗原を吸着し得る鉱物、例えばみょうばん、水酸化または燐酸アルミニウムなどの懸濁液；鉱油の中に抗原溶液が乳化させてある油中水エマルジョン、例えばフロインドの不完全アジュバンドなどが含まれると共に、更に抗原性を増強するための追加的因子、例えばフロイントの完全アジュバント内の死滅ミコバクテリアなどが含まれ得る。
【００５５】
抗体：公知抗原または抗原決定基に免疫学的に結合する分子、特に蛋白質。
【００５６】
胆汁：肝臓によって分泌されたあと十二指腸に排泄される物質であり、ここでこれは脂肪の乳化を助け、ぜん動を上昇させ、そして腐敗作用を遅らせる助けをする。この言葉胆汁はまた、粉末にしたか或は乾燥した胆汁を表す目的でも用いる。胆汁はまた、胆汁の如何なる成分、例えば個々の胆汁塩も意味している。
【００５７】
コロニー形成：原生動物がその感染した動物の腸に付着すること。
【００５８】
のう子：数多くの原生動物の寄生性生物、例えばジアルジア属の感染性形態。のう子には通常、非常に濃縮された細胞質と抵抗力を示す細胞壁が備わっている。これらはしばしば便の中に落とされ（shed）、そしてこれが、１つの動物から別の動物に病気が広がる経路である。のう子は生存能力を示し得る、即ち新しい宿主の中で栄養型を生じ得るか、或は生存能力を示さない可能性がある。
【００５９】
有効量：感染または病気に対して動物を保護するに必要とされるか或は感染または病気の特別な症状を和らげるに必要とされる用量。
【００６０】
飼料変換率：単位量の体重を生じるに必要とされる飼料の重量として表す、動物が体重を増やす能力の尺度。原生動物門によって引き起こされる病気を含む腸の病気は、動物が飼料を体重に変換する効率が低いことによってこのパラメーターが低くする。
【００６１】
ジアルジア属：小腸に寄生する寄生性鞭毛虫の属である。この出願で用いるこの言葉は、この属の全ての種を含んでいる。ジアルジア属を表す目的で前に用いたランブル（Lamblia）属もまた本出願で用いるこの言葉の中に包含される。
【００６２】
ジアルジア鞭毛虫症：ジアルジア属による感染。この感染の症状、例えば下痢、腹痙攣、頭痛、ガス、膨満、体重損失、体重上昇の不足、脱水、不快、吸収不良、寄生性生物による腸のコロニー形成、のう子の排出などもまた、この言葉ジアルジア鞭毛虫症の中に含まれる。
【００６３】
免疫応答：宿主における興味の持たれている組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体仲介免疫応答の進展。上記応答は下記の１種以上を含んでいる可能性がある、即ち興味の持たれている組成物またはワクチンの中に含まれている抗原または抗原類に特異的に向かう抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞毒性Ｔ細胞の産生。
【００６４】
腸原生動物門：それが感染する動物の腸に棲息する原生動物門のいずれも。
【００６５】
腸原生動物感染：腸原生動物門による感染。この感染の症状、例えば下痢、腹痙攣、頭痛、ガス、膨満、体重損失、体重上昇の不足、脱水、不快、吸収不良、寄生性生物による腸のコロニー形成、のう子の排出などもまた含まれる。
【００６６】
中和する：毒性効果を防止するか或は和らげることができる。
【００６７】
症状の予防（防止）：トキシンによって引き起こされる影響いずれかの防止（予防）を含む。
【００６８】
インビトロ（in vitro）産生：感染した宿主動物の動物内ではなく培養物内で産生。インビトロ産生には組換え体産生が含まれる。
【００６９】
防御免疫性（本明細書では、「保護免疫性」ともいう。）を示す:感染または病気に対して動物を保護するか、或いは感染または病気の特別な症状を和らげることができる。
【００７０】
組換え的に作り出される：微生物、植物または動物を含む何らかの他のシステムにおける遺伝子発現を用いて作り出される、および／または配列が公知の場合本技術分野で知られている方法を用いて化学的に合成される。
【００７１】
音波処理：細胞の懸濁液を高周波数の音波に暴露することによって細胞を崩壊させること。
【００７２】
サブユニット：全有機体よりも小さい腸原生動物門の一部いずれか。抗原性を示すサブユニットをワクチン組成物の中で用いて免疫応答を生じさせることができる。サブユニットには、鞭毛、腹の粘着性を示す円板（ventral adhesive disk）、膜、細胞骨格膜蛋白質、シトゾル膜蛋白質、トキシン類、並びに抗原性を示し得るものであり免疫応答を誘発する有機体の他のいずれかの部分が含まれ得る。これには組換え的に作り出されたサブユニットが含まれる。
【００７３】
トキシン：腸原生動物門が産生する有毒または毒性を示す物質。これは細胞外産物（エキソトキシン）であってもよい。腸の細胞が影響を受ける場合、トキシンをエンテロトキシンと分類する。これには組換え的に作り出されたトキシン類も含まれる。
【００７４】
栄養型：特定の腸寄生性生物、例えばジアルジア属の増殖型（begetative）形態。
【００７５】
ワクチン株：動物に投与されたとき保護免疫原性を示す腸原生動物門の株。これには遺伝的に弱毒化された株も含まれる。
【００７６】
Ｂ． 具体的な態様
本発明は、腸原生動物のワクチン株および上記原生動物からのトキシン類を提供するものである。予想外に、胆汁が入っている培地の中で腸原生動物を培養すると、それらを用いて動物に予防接種したとき保護免疫原性を示すようになることが見いだされた。更に、胆汁含有培地内の上記培養により、インビトロにおけるトキシンの産生がもたらされる。このトキシンは、腸原生動物による感染に対する免疫化を行うか或はトキシンを中和する抗体を上昇させる目的で用いられ得る。
【００７７】
特に、宿主動物の腸内で細胞外的に存在している腸原生動物が本発明で用いるに好適である。最も好適な具体例において、本発明は、ジアルジア属のワクチン株、トキシン類およびトキシン類に対する抗体を提供する。上記株、トキシン類および抗体は、ジアルジア鞭毛虫症およびそれの症状を防止および治療するに有効である。
【００７８】
本発明では種々のジアルジア属株が有効である。インビトロで充分に増殖し、標的動物種に感染し得るものであり、そしてインビトロで増殖させた時トキシンを産生する株が好適である。特に、ジアルジア属株ＷＢ（人からの単離物）、Ｓ２（我々が羊から単離した株）、Ｄ３（我々が犬から単離した株）、およびＮ（我々が飲料水から単離した株）が用いられ得る。株ＮおよびＳ２が最も好適である。
【００７９】
本発明のジアルジア属株を胆汁含有ＴＹＩ−Ｓ−３３培地の中で増殖させることによって培養した。脱水した牛の胆汁を一般に用いたが、しかしながら、個々の胆汁塩を含む胆汁の画分もまた本発明で有効であると予測される。ジアルジア属の栄養型は、細かく分割した固体状支持体も含んでいる容器の中で増殖し得る。これは、その栄養型が付着する表面積を上昇させる。デキストランビードが特に好適な固体状支持体である²⁹。他の支持体系、例えばガラスビードまたは繊維もまた適切であり得る。培地製造、ジアルジア属栄養型の副次培養および収穫の詳細を以下の実施例の中に示す。
【００８０】
本発明はまた、ジアルジア属か或は有効に免疫原性を示す他の腸原生動物のワクチン株を含んでいるワクチン組成物も提供する。上記ワクチン組成物ではジアルジア属の種々の株が有効であり得る。特に、インビトロで培養したときトキシンを産生する株が好適である。最も好適な株の例はジアルジア属株Ｓ２およびＮである。
【００８１】
これらのワクチン株を以下の実施例の中に示す如く培養した後、ワクチン組成物で用いる目的で収穫する。ワクチン組成物の中で用いるに先立って原生動物を崩壊させ得る。種々の崩壊方法を好適に用いることができ、これらには音波処理、浸透、圧力差の利用または凍結が含まれる。音波処理が最も好適である。
【００８２】
ワクチン組成物は、腸原生動物の１種以上のワクチン株および／またはジアルジア属または他の腸原生動物の１種以上のサブユニットおよび／またはトキシン類を含んでいてもよい。上記サブユニットおよび／またはトキシン類は、全原生動物門または音波処理した原生動物に追加して用いられ得るか、或は細胞が入っていないワクチン組成物の中で用いられ得る。
【００８３】
ワクチン組成物の中で用いるに先立ってその腸原生動物、トキシン類またはサブユニットを不活性化することが有効であり得る。穏やかな熱処理またはホルマリンによる不活性化などの通常の技術が用いられ得る。
【００８４】
上記ワクチン組成物の組成には、アジュバントを含む適切な製薬上許容される担体が含まれ得る。アジュバント、例えばみょうばんを基とするアジュバントの使用が好適である。本発明では数多くの市販アジュバント類が有効である。これらの試験では、水酸化アルミニウムおよびQuill A（Super Fos、 Copenhagen、 Denmark）が入っているみょうばんを基とするアジュバントを用いた。上記ワクチン組成物に関する正確な組成は、特別なワクチン株、免疫化すべき種および免疫化ルートに依存している。上記ワクチン組成物の組成は当該技術分野の技術者によく知られている。
【００８５】
上記ワクチン組成物は、腸原生動物に敏感な如何なる動物、例えば牛、羊、山羊、兎、馬、豚、犬、猫および鳥種などの免疫化で有効である。家畜および野生型両方の動物を免疫化することが可能であると共に、食物製造用動物の免疫化も意図している。これらのワクチン組成物を用いて人を免疫化することもできる。本発明は、予防または治療を必要としている動物にジアルジア属または他の腸原生動物のワクチン株の有効量を投与することによる、ジアルジア鞭毛虫症または他の腸原生動物感染の予防もしくは治療方法を提供するものである。上記ワクチン株は上に考察した如きワクチン組成物の中で用いられ得る。この方法は犬、猫、羊、人、家畜動物（特に食物製造用動物）、鳥種および野生動物で有効である。野生動物における使用は、人または家畜動物が用いる水源の汚染を防止し得る。
【００８６】
投与のルートは便利なルートのいずれかであってもよく、腸原生動物、処理すべき動物および他の要因に応じて変化し得る。非経口投与、例えば皮下、筋肉内または静脈投与が好適である。犬および猫種では皮下投与が最も好適である。腸用のコートされている経口服用形態を含む経口投与もまた用いられ得る。
【００８７】
投与のスケジュールは、その腸原生動物および処理すべき動物に応じて変化し得る。動物に単一投与を受けさせるか、或は補助服用か数回の服用を受けさせ得る。連続した保護を行う目的で年１回の補助服用が用いられ得る。特に、一次過程として、２１日離した２回投与が好適である。
【００８８】
治療すべき動物の年令もまた投与のルートおよびスケジュールに影響を与える。母親の抗体がもはや存在しなくなりそしてその動物が免疫学的に受容能力を有するようになる年令における投与が好適である。これは、犬または猫種の年令で約６から７週である。追加的に、母親を免疫化して母親のミルク内抗体の受動転移を通して子の感染を防止するのが好適である。
【００８９】
本発明の方法は、腸のコロニー形成を防止するに有効である、即ち腸粘膜に原生動物が付着するのを防止するに有効である。これはまた、ジアルジア鞭毛虫症の症状を防止するに有効である。これには、トキシンの中和、並びにこれらの有機体が腸内腔の中に存在しているが付着していない場合に生じる生理学的トキシン効果のいずれかを防止することが含まれる。更に、本発明の方法は、のう子、特に生存能力のあるのう子が便に排出されるのを低くするものである。これによって、感染が更に広がるのを防止する。
【００９０】
慢性的に感染している動物または人を含む、症状を示すか或は無症状の動物に対して治療を行うことが可能であると共に、その治療を用いて、下痢の如き感染症状を和らげることによって成長速度を上昇させることができる。このように、これを食物製造用動物に投与すると、飼料変換率が上昇し得る。
【００９１】
本発明は、ジアルジア属または他の腸原生動物のトキシン類およびこれらのトキシン類の製造方法を提供する。予想外に、胆汁が入っている培地の中で有機体を培養すると、それらがインビトロでトキシンを産生するようになることを見い出した。このトキシンを用いることで、腸原生動物感染に対して動物を免疫化することができる。これらの有機体が増殖する培地を濃縮すると、感染を予防および／または治療するに有効なトキシンが得られた。このジアルジア属におけるこのトキシンはエキソトキシンであり、非常に高い細胞毒性を示す。これは効力のあるエンテロトキシンであると見られる。
【００９２】
最近まで、ジアルジア属のエンテロトキシンを単離する試みは不成功であった。しかしながら、濃縮した溶液を用いると共により高い感度を示す分析システムを用いることにより、ジアルジア属が産生する細胞毒性因子を検出することが可能になった。このトキシンを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて検出した。このＣＨＯバイオアッセイは、皮膚透過性アッセイ、脂肪細胞脂肪分解アッセイおよび回腸ループアッセイよりも１００−１０，０００倍高い感度を有することが確かめられた。このトキシンを用いた試験により、これがＣＨＯ細胞の伸長を生じさせることが示された。伸長度合（即ち長くなった細胞のパーセント）は、一般にトキシン濃度と共に上昇することが見いだされた。ジアルジア属トキシンを用いたとき観察される結果は、細菌のエンテロトキシン類を用いて行う他の研究と非常に類似している。大腸菌のトキシン類、コレラトキシンおよび百日咳トキシンを用いた時と同様な効果がＣＨＯ細胞に関して見いだされた。
【００９３】
ジアルジア属トキシンの部分的精製を達成した。このジアルジア属トキシンは細胞内で産生される蛋白質であり、これは、３７℃または室温か或は冷蔵または冷凍したとき安定性を示すことが確立された。トキシン含有培地は、分子量が約２２、３２、３８および３９ｋＤａのクマシー染色蛋白質と共に９７ｋＤａ以上の分子量を有するいくつかの蛋白質を含んでいることがＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認され、これらの蛋白質は対照培地の中には存在していない。トキシン含有培地を硫酸アンモニウムで分別することにより、分子量が約１６−２０、２５−２８、３６−４２および５０−６５ｋＤａの蛋白質（これらは対照培地の中には存在していない）と共に細胞毒性を示す画分が得られた。
【００９４】
このトキシンを用いた免疫化により、下痢を含むジアルジア鞭毛虫症の症状が低くなると共に、便へののう子排出が低下した。
【００９５】
本発明はまた、ジアルジア属または他の腸原生動物のトキシン類に対する抗体も提供する。ポリクローナル抗体がジアルジア属トキシンに対して上昇した。通常技術を用いることで、モノクローナル抗体もまた上昇し得る。これらの抗体は、このトキシンの毒性効果を中和する抗血清として有効性を示す。従って、これらは、ジアルジア鞭毛虫症および他の腸原生動物感染の症状を解放すると期待され得る。腸用のコートされている服用調合物を用いた上記抗体の経口投与が好適であると期待される。
【００９６】
本発明の方法は、他の腸原生動物感染を予防および治療するためのワクチン株、ワクチン組成物、トキシン類、および抗トキシン類の製造で有効である。本発明で有効な他の腸原生動物としては、クリプトスポリジウム、トリコモナド類、ヒストモナス、スピロヌクレウス、アメーバ属、球虫類、トキソプラスマおよび肉胞子虫属が含まれる。特に、クリプトスポリジウム、トリコモナド類、ヒストモナス、スピロヌクレウスおよびアメーバ属が挙げられる。
【００９７】
クリプトスポリジウム・ムリス（クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）とも呼ばれている）は、哺乳動物および家禽類の小腸および大腸の中で見いだされる原生動物寄生性生物であり、そしてクリプトスポリジウム・メレグリジス（Cryptosporidium melegridis）は、家禽類の呼吸および胃腸管の刷子縁の中で見いだされる。この寄生性生物は、人および他の哺乳動物および鳥において軽いからひどい下痢を引き起こすと共に、鳥の呼吸病の原因となっている。クリプトスポリジウムは、刷子縁表面積を狭くし、電解質の輸送を悪化し、そしてジアルジア鞭毛虫症と同様な吸収不良下痢の原因となっている。クリプトスポリジウム種のための全細胞もしくはサブユニットワクチンを開発することに関して多大な可能性が存在している。このワクチンは、この寄生性生物を崩壊させることによって製造され、これらの蛋白質とアジュバントを組み合わせた後、経口もしくは非経口ルートで動物または人を免疫化することができる。１種以上のトキシン類が重要な毒性を示す因子である可能性があり、そしてこれらのトキシン類（またはトキソイド類）もまた経口もしくは非経口ルートによる予防接種で用いられ得る。このワクチンを用いることでこの病気を予防するか或はこの病気の症状に対する保護を行うことができる。クリプトスポリジウム症（cryptosporijiosis）の症状を治療する目的で抗トキシン抗体も用いられ得る。
【００９８】
トリコモナド類は、哺乳動物および鳥の胃腸管、生殖および呼吸管の中に見いだされる鞭毛を有する原生動物寄生性生物の大きな集団である。大部分のトリコモナド類は非病原性の共生動物であると信じられている。しかしながら、我々は、これらの原生動物寄生性生物のいくつかはジアルジア属と同様、動物における体重上昇および飼料変換率に影響を与える可能性があると共に、ある場合には下痢の原因となり得ると考えている。このメカニズムにはトキシンが介在している可能性がある。崩壊させたトリコモナス属（trichomonas）寄生性生物とアジュバントを用いた予防接種は、感染からの保護を与えるか、或はこの感染の症状を軽減し得る。同様に、トキシンまたはトキソイドも保護を与え得る。このワクチンは、腸のコロニー形成およびこの腸の損傷を防止する。異なるトリコモナド種の交差保護もあり得る。
【００９９】
ヒストモナス・メレアグリジス（Histomonas meleagridis）は、家禽類における鞭毛のある原生動物寄生性生物である。この寄生性生物は、盲腸から放出された後、血液流を通って肝臓に至る。この肝臓および盲腸の壊死および組織変性が生じる。この感染から回復した鳥はこの病気に対して免疫性を示す。我々は、この病気の病原性にトキシンが関与している可能性があると考えている。崩壊させた細胞またはトキシンのワクチンを用いた予防接種は、家禽類におけるヒストモナス症を制御する²有効な方法を提供し得る。このワクチンは、腸のコロニー形成または盲腸の貫入を防止する。このワクチンはまた肝臓および盲腸の壊死を防止し得る。
【０１００】
スピロヌクレウス・メレアグリジス（Spironucleus meleagridis）は、下痢および死亡をもたらす若鳥の病気である。死後この腸内は水状の液体で満たされていることが確認されている。この寄生性生物は家庭用および野生鳥類に感染する。我々は、スピロヌクレウス・メレアグリジスは、トキシンが介在した過程を通して症状を誘発すると考えている。崩壊させた全寄生性生物またはトキシンもしくはトキソイドのワクチンは、この感染からの保護を与え得る。このワクチンは、このトキシンの中和を行いそして／またはこの寄生性生物のコロニー形成を防止する。
【０１０１】
赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）は、人および動物におけるアメーバ赤痢の原因となる病原性を示すアメーバ状原生動物である。この有機体は、盲腸および結腸にコロニー形成して下痢および赤痢の原因となる。この寄生性生物は腸壁に侵入して粘膜下組織の中で増殖することで潰瘍化の原因となり得る。この寄生性生物はまたリンパ管または腸間膜静脈の中に入る結果として体全体の膿瘍を生じ得る。我々は、１種以上のトキシン類が重要な毒性因子であり得ると考えている。崩壊させた栄養型および／またはトキシンを用いた予防接種は、この寄生性生物のコロニー形成および／または侵入に対する保護を与える作用を示し得る。予防接種もまた、この病気で見られる下痢および赤痢に対する保護となり得る、と言うのは、これはこのトキシンを中和しそして／またはこの寄生性生物の侵入を防止するからである。
【０１０２】
コクシジウム症は、アイメリア種（Eimeria spp.）またはイソスポラ種（Isospora spp.）によって引き起こされる複雑な腸の病気であり、これは、家畜動物で主要な経済的重要さを有している。これらの原生動物類は、複雑な生活環を有しておりそして宿主に特異的である。ワクチンを製造する試みが行われた。家禽類のワクチンが製造された（CocciVac、 CocciVac T、 Sherwin Laboratories）。これらのワクチン類は、鶏および七面鳥に対して病原性を示す種の全てを含んでいる。サブユニットワクチン類の開発は大きく不成功であった。球虫類のトキシンはまだ同定されておらず、トキシンワクチン類もまだ製造されていない。人および動物の球虫類に関するトキシンまたはトキソイドを基とするサブユニットまたは強化ワクチンの製造には可能性がある。これらには、イソスポラ種、アイメリア種、ウェニオネラ種（Wenyonell spp.）およびチゼリア種（Tyzzeria spp.）が含まれる。
【０１０３】
トキソプラスマは複雑な生活環を有している。いくつかの研究グループは、アジュバントの有り無しによる、熱死滅および熱−もしくはホルマリンで死滅させた相同タキゾイトを用いた実験的免疫化ではマウス、ハムスターおよびラビットを保護することができなかった。実験的挑戦に対して特定の画分が保護を与えた。トキソプラスマの細胞毒はまだ同定されていないが、しかしながら、トキシンまたはトキソイドを用いた動物および人における免疫化はこの病気からの保護を与え得る。
【０１０４】
球虫類と同様、肉胞子虫属も複雑な生活環を有しており、それらの接合子のうは、この捕食動物の腸細胞内に存在していると共にその無性段階の間は捕食される動物の組織内に存在している。これらは数多くの家畜および野生動物に共通している。現在の時点では、これらの原生動物寄生性生物のためのワクチンは存在しておらず、そして細胞毒も示されていない。本発明を用いることでこの寄生性生物のためのワクチンを開発することが可能である。
【０１０５】
以下に示す実施例は如何なる様式でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１０６】
【実施例】
一般に、特に言及しない限り、これらの実施例では下記の材料と方法を用いた。
【０１０７】
１．培地の処方および製造
ランブル鞭毛虫用培地（ＴＹＩ−Ｓ−３３）を、下記の材料を用いて調製した。
【０１０８】

特に明記されていない限り、化学品はBritish Drug Houses（ＢＤＨ）から入手したものであった。
【０１０９】
上に示した乾燥材料を一緒にした後、必要になるまで暗所中４℃で貯蔵した。National Collection of Type Cultures、 Colindale、 England（ＮＣＴＣ）のビタミンミックス（Gibco Cat. #440-1100 EB）を、包装の指示に従って調製し、滅菌濾過（０．２２μ）した後、３０ｍＬの一定分量として−２０℃で貯蔵した。容積測定用フラスコを用い５０ｍＬの蒸留水（ｄＨ₂Ｏ）の中に２．２８ｇ懸濁させることによって、クエン酸第二鉄アンモニウム溶液を調製した。この溶液は光に不安定なことから、暗所中４℃で貯蔵した。ＣＬＥＸ（牛胎児血清（ＦＣＳ）代用品）を解凍した後、無菌の１００ｍＬ一定分量として−２０℃で貯蔵した（Dextran Products CLEX C-500）。
【０１１０】
１リットルの培地に関して、撹拌棒が入っている１リットルのフラスコの中に８７０ｍＬのｄＨ₂Ｏの半分を注ぎ込み、乾燥材料を加えた後、残りの水を用いてこの容器とフラスコの縁を濯いだ。次に、そのクエン酸第二鉄アンモニウム溶液の５００ｍＬを加えた。この培地が透明になるまで（通常２−３時間）この溶液を撹拌した後、５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．８に調整した。この培地を無菌条件下で滅菌濾過（０．２２μおよびプレフィルター）し、３０ｍＬのビタミンミックスと１００ｍＬのＣＬＥＸを加えた後、混合した。調製した培地を一定分量に分けた後、必要になるまで−２０℃で貯蔵した。
【０１１１】
２．ジアルジア属栄養型の凍結
下記の操作を用いてジアルジア属の栄養型を凍結した。ジアルジア属を増殖させて後期対数期に入らせた（７２時間）。この管の側面上に存在している健康な栄養型を保持するように培地を注ぎ出した。新鮮な培地を注ぎ入れ、そしてこれらの管に氷上で１０−１５分間冷衝撃を与えた後、５００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離した。無菌条件下、１４ｍＬの培地をピペットで取り出し、約２ｍＬを残すことにより、これらの栄養型を再懸濁した。この栄養型懸濁液の約０．９ｍＬを、ＣＬＥＸ中２０％のＤＭＳＯが０．９ｍＬ入っているクリオチューブに加えた。これらのクリオチューブを、液体Ｎ₂に貯蔵するためのガラス管の中に入れ、そしてこれらを絶縁容器の中に入れた。この絶縁容器を最小で１２時間そして最大で７２時間−７０℃の冷凍庫の中に入れた後、液体Ｎ₂冷凍庫の中に入れた。
【０１１２】
クリオチューブを３７℃の水浴の中に入れることで栄養型を急速解凍し、新鮮な培地の中に入れた後、最初の日は水平に培養し、２４時間後継代培養し、そして通常に培養した。
【０１１３】
３．ジアルジア属栄養型の継代培養
用いたランブル鞭毛虫株は、ＷＢ（人からの単離物、ATCC 30957）、Ｓ２（我々の実験室において羊から単離した株）、Ｄ３（我々の実験室において犬から単離した株）、およびＮ（我々の実験室においてBotwood、 Newfoundlandの飲料水から単離した株）であった。
【０１１４】
使用した全ての株のジアルジア栄養型を継代培養する目的で下記の操作を用いた。ジアルジア属を増殖させて後期対数期に入らせた（７２時間）後、培養管を氷の中に１０から１５分間入れることで冷衝撃を与えた。層流れフード下、新鮮な培養管各々に約７−８ｍｇのピペラシリン（Piperacillin）（Pipracil、 Lederle）を入れた後、新しい管各々に新鮮なＴＹＩ−Ｓ−３３培地を１５ｍＬ加えた。冷衝撃を与えた後、後期対数期のジアルジア属が入っている管を数回逆さにすることで、沈降および粘着している集団を混合した。１ｍＬの無菌ピペットを用い、１ｍＬの栄養型を取り出した後、その新しい培養管に加え、このピペットを１から２回フラッシュ洗浄した。新しい管をパラフィルム（Parafilm）でシールした後、直立させて３７℃の培養器の中に入れた。継代培養を再び３から４日間行った。
【０１１５】
二者択一的に、二重表面ガラス製のローラーボトル（Bellco Cat. #7730-38910）の中でジアルジア属栄養型を培養した。７２時間の培養後、１ｍＬの培養培地当たり１０⁶個の栄養型から成る濃度が容易に得られる。各々のローラーボトルは約６５０ｍＬの培地を必要とした。如何なる大きな気泡も追い出してこのボトルを充分に満たす目的で、この培地を使用に先立って３７℃に温めた。このボトルの上部で高濃度のピペラシリンに栄養型が暴露されるのを回避する目的で、この抗生物質を最初にいくらかの培地（最終濃度１ｍＬ当たり約０．５ｍｇまで）の中に溶解させ、この溶液をそのボトルの中に注ぎ込み、このボトルにその培地を更に加えてその上部近くまで満たし、ジアルジア属を加え（上に示した如く冷衝撃を与えた最小で１０⁶個の栄養型）、このボトルの上部まで満たし、ピペットを用いて如何なる気泡も除去した後、このボトルをパラフィルムでしっかりと密封する。このローラーボトル装置（Wheaton Model III）をモーター出力の６−８％に設定（１分当たり２回の回転）して、ボトルを３−４日間培養した。
４．ジアルジア属栄養型の収穫
ジアルジア属の栄養型を下記の如く収穫した。ジアルジア属を増殖させて後期対数期に入らせた（７２時間）後、管またはボトルを氷の上に置くことで（１０ｍＬの管および３０ｍＬの管では１５−２０分間、ローラーボトルでは４５分間）冷衝撃を与えた。次に、管またはボトルを数回逆さにした後、この内容物を無菌遠心分離管またはボトルの中に注ぎ込む。これらを５００ｘｇで１０分間４℃で高速回転させることにより、これらの栄養型をペレットにする。培地を取り出し、そしてこのペレットを無菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）の中に再懸濁させることでこの培地の元の体積にした。この懸濁液を５００ｘｇで１０分間４℃で高速回転させた。上澄み液を取り出し、そしてその栄養型を新鮮なＰＢＳの中に再懸濁させた。ＰＢＳ洗浄を全体で４回行った。最終的な高速回転を行った後、その栄養型を再懸濁させて、ＰＢＳ中所望濃度とした。
【０１１６】
これらの栄養型に損傷を与えないように低速で遠心分離し、このようにして生じたペレットは非常に柔らかであり、そしてこれらの有機体は自動性を示す。このペレットそれ自身が再懸濁する前にその上澄み液を除去するような迅速な行動を取ることが重要である。
【０１１７】
５．ジアルジア属栄養型の音波処理
Virsonic Cell Disrupterを用いてジアルジア属栄養型の音波処理を行った。２０秒間の破壊を３回行うことで一般に充分である。血球計数器を用いて無傷の栄養型が存在していることを検査した。完全な崩壊が必要な場合、追加的破壊を用いた。常に栄養型を氷の上に保持し、そして破壊と破壊の間は、７０％のエタノールを用いてその音波処理装置の先端を冷却した。音波処理物を一定分量に分けて−２０℃で保存した。
【０１１８】
６．全音波処理物ワクチンの製造
ジアルジア属の全音波処理物ワクチンを下記の如く製造した。その音波処理物の蛋白質濃度を測定（BIORAD蛋白質アッセイ）した後、無菌ＰＢＳ中０．７５ｍｇ／ｍＬになるように調整した。この溶液を、前に記述したみょうばんを基とするアジュバントと４：１で混合することで、次の試験における動物の免疫化で用いた。
【０１１９】
７．ジアルジア属トキシンの濃縮
Amicon装置（Model No. 8200）を用いてジアルジア属培地および非常に希釈されているサンプルを濃縮することで、有効なトキシン濃度を達成した。この装置では、指定ＭＷカットオフが備わっている膜を通して水および低分子量（ＭＷ）粒子を追い出すようにＮ₂圧力が用いられている。これらの試験で用いる膜ＹＭ−１０は、１０，０００のＭＷカットオフを有している。この装置にはまた、この膜に蛋白質が詰まらないようにして水をより容易に通すことを可能にする撹拌棒が備わっている。
【０１２０】
同じ蛋白質に関しては、時には膜を２回以上用いた。使用後、これらの膜をｄＨ₂Ｏの中で濯いだ後、１０％のエタノールの中で冷蔵した。新しい膜をｄＨ₂Ｏの中に１時間浸し、水を３回交換することで、この膜の防腐剤を除去した。
【０１２１】
８．若い子猫モデル
モデル感染システムとして若い（６−８週）子猫を用いることの可能性に対する調査を、我々の初期研究として行った。ジアルジア属が存在していない状態であることを確かめる目的で、条件付けを行っている期間の間、これらの子猫の便に対して便浮選を数回行った。子猫（ｎ＝６）に麻酔をかけ、側腹切開を行って、これらの子猫に、１．０ｍＬのＰＢＳ中１．０ｘ１０⁶個のランブル鞭毛虫栄養型を十二指腸内接種した。２匹の子猫の各々に下記のランブル鞭毛虫株を受けさせた。１）ＷＢ株（充分に特徴付けされている人からの単離物、ATCC 30957）；２）Ｓ２株（我々の実験室が羊から単離した株）；または３）Ｄ３株（我々の実験室が犬から単離した株）。
【０１２２】
臨床的な兆候を監視し、感染直後７日間の間、のう子に関する便検査を４回行った（表１）。音波処理した個々のジアルジア属株（即ちそれぞれＷＢ、Ｓ２、Ｄ３）に対するＩｇＭタイターおよびＩｇＧタイター（表２）を測定する目的で、実験的感染を行ったその日と７日後（と殺した日）に血清サンプルを採取した。各々の子猫から得た長さが１．０ｃｍの十二指腸に関して栄養型の数測定を行い、そして組織サンプルを採取して光顕微鏡および電子顕微鏡で検査した。胆汁と粘膜切屑を集め、そして後の局所的免疫学応答試験および酵素アッセイを行う目的で冷凍（−７０℃）保存した。
【０１２３】
ＷＢおよびＳ２に感染させた子猫の十二指腸、空腸および回腸（より低い度合）の中に、ランブル鞭毛虫に典型的な形態を有する原生動物寄生性生物が見られた。これらの顕微鏡技術のいずれを用いても、Ｄ３に感染させた子猫の中には栄養型の証拠は全く見られなかった。このような試験的調査を基にして、更に一層の試験で子猫感染モデルを用いることを決定した、と言うのは、このモデルでは、ジアルジア属株が感染して臨床的兆候を生じるからである。
【０１２４】
【表１】

【０１２５】
【表２】

【０１２６】
【表３】

９． 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
２ｍＭのＥＤＴＡ中、１体積当たり１０重量％で組織を均一化することによって、猫および犬の腸粘膜均一サンプルを調製した後、−８０℃で貯蔵した。サンプルを解凍し、ＰＥＰＢＳ（２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）で１：２（猫）または１：１（犬）に希釈し、この混合物を１８Ｇの針に５回通すことで分散させた後、１７，０００ｘｇで２０分間高速回転させた。可溶蛋白質画分を含んでいる上澄み液を用いてこのＥＬＩＳＡを行った。血清および胆汁サンプルを−８０℃で保存し、解凍し、ＰＥＰＢＳで２倍希釈し、遠心分離にかけた後、このＥＬＩＳＡの実施で用いる目的で上澄み液を取り出した。全てのサンプルに関して重複分析を行った。
【０１２７】
ＰＢＳ中２％の、ガンマグロブリンが入っていないＦＣＳを用い、３７℃で１時間、３回洗浄を行うことにより、イヌＩｇＧ血清アッセイ以外の全てのアッセイに関するブロッキングを行った。イヌＩｇＧ血清アッセイでは、ＰＢＳ中１０％のスキンミルク粉末を用いたブロッキングを３７℃で１時間行った。
【０１２８】
ネコＩｇＧアッセイでは、その抗原として、音波処理したジアルジア属（Ｓ２）を用いた。音波処理したＳ２（ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍＬ）を各々のウエル（ウエル１個当たり１００μＬ）に加えた後、４℃で一晩培養した。次に、これらのウエルをＰＢＳ−Tweenで洗浄（３回）した。上に記述した如く調製した血清、胆汁または腸粘膜上澄み液を、その一次抗体として用いた（３７℃、１時間、３回の洗浄）。その二次抗体として、ヤギ抗ネコＩｇＧ−ＨＲＰ（KPL cat. #042002）をＰＢＳ中に１：１０００で希釈したものを用いた（３７℃、１時間、４回の洗浄）。
【０１２９】
ＩｇＡネコアッセイでは、その抗原として、音波処理したジアルジア属Ｓ２株を用いた。上に記述した如く調製した血清、胆汁または腸粘膜上澄み液を、その一次抗体として用いた。その二次抗体として、ヤギ抗ネコＩｇＡ（Bethyl Lab. cat. #A20-101）をＰＢＳ中に１：２５０で希釈したものを用いた（３７℃、１時間、４回の洗浄）。その三次抗体として、ラビット抗ヤギＩｇＡ−ＨＲＰ（Sigma cat. #A-4174）をＰＢＳ中に１：５００で希釈したものを用いた（３７℃、１時間、４回の洗浄）。
【０１３０】
イヌのアッセイでは、ネコのアッセイで記述した如く、音波処理したジアルジア属Ｓ２株を用いてそのウエルをコートした。上に記述した如く調製した血清、胆汁または腸粘膜上澄み液を、その一次抗体として用いた。その二次抗体として、ヤギ抗イヌＩｇＧ−ＨＲＰ（KPL cat. #041902）またはヤギ抗イヌＩｇＡ−ＨＲＰ（Bethyl Lab. cat. #A40-104P）をＰＢＳ中に１：１０００で希釈したものを用いた。
【０１３１】
実施例１
株の選択および保存
我々の標準的実験室方法を用いて、ＴＹＩ−Ｓ−３３培地が入っている管中インビトロで、種々のランブル鞭毛虫株を増殖させた。一次および二次ストックを−７０℃で凍結させて保存した。これらの３種のランブル鞭毛虫株（ＷＢ、Ｓ２、Ｄ３）の増殖曲線を測定（図１）し、そしてこれらを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のトキシン応答（細胞伸長）に対して比較した（図２−４）。Ｄ３は最も印象的な増殖特性を示したが、これらの３種全ての株は、インビトロで適当な増殖能力を示し、標的動物種に感染する能力を有すると共に、ＣＨＯ細胞に毒性効果を示すことから、明らかに有望であった。
【０１３２】
実施例２
子猫の予防接種−実験的感染
この調査では、下記の実験グループを確立した：グループＡ−上に記述したアジュバントの０．２ｍＬと０．８ｍＬのＰＢＳを皮下投与することで７匹の子猫の模擬免疫化を行った後、２８日後に、１．０ｍＬのＰＢＳ中１ｘ１０⁶個の生存能力のある栄養型を十二指腸内接種することによって、ランブル鞭毛虫株Ｓ２に感染させたグループ；グループＢ−０．２ｍＬのアジュバントとＳ２の濃縮（１０ｘ）培養物の上澄み液の０．８ｍＬ（７５０μｇの蛋白質／ｍＬ、そしてＣＨＯ細胞毒性活性を示すことが示されたもの）を皮下投与することで３匹の子猫に予防接種し、２１日後に同じ調合物をブースター投与した後、２８日後にＳ２で十二指腸内感染させたグループ；グループＣ−０．２ｍＬのアジュバントと音波処理した全Ｓ２栄養型の０．８ｍＬ（７５０μｇの蛋白質／ｍＬ）を皮下投与することで８匹の子猫に予防接種し、２１日後に同じ調合物をブースター投与した後、２８日後にＳ２で十二指腸内感染させたグループ。
【０１３３】
臨床的兆候を監視し、そして感染後４２日間、定量的に便のう子数を毎日数えた。これらの子猫の体重を毎日測定し、予防接種していないグループ（グループＡ）とＳ２音波処理物ワクチンのグループ（グループＣ）に関する成長曲線を生じさせた。血清サンプルを毎週および死後入手して、ＩｇＧのＥＬＩＳＡタイターを測定した。安楽死させた後、腸サンプル（十二指腸、空腸、回腸）を取り出して、栄養型数、光顕微鏡および電子顕微鏡測定を行った。粘膜切屑、血清サンプルおよび胆汁を採取し、凍結（−７０℃）貯蔵することで、免疫学的分析および酵素的調査を行った。
【０１３４】
この試験において、全ての子猫で、間欠的下痢または軟便が不規則に見られた。予防接種していない動物と予防接種した動物の間には、ひどさに関する差は観察されなかった。予防接種していないグループＡ、および音波処理したＳ２で予防接種したグループＢに関する、ランブル鞭毛虫感染させた後の体重上昇データを図５に示す。予防接種した子猫は、予防接種していない対照に比べて、この試験期間中有意に体重が上昇した。血清ＩｇＧのＥＬＩＳＡで測定した、上記３種の実験グループの子猫に関する免疫学的応答を図６に示す。グループＢ（トキシンで免疫化した）およびグループＣ（音波処理したＳ２で免疫化した）の両方共、免疫化およびブースター投与に典型的な応答である、血清ＩｇＧの有意な上昇を示した。これらの免疫化した動物をジアルジア属に後感染させた時見られるタイター上昇は、最小限のみであった。それとは対照的に、グループＡ、即ち免疫化しないで感染させた子猫は、感染させた後でのみ応答を示したが、これの血清タイターの上昇は最小限であった。図６にはまた、免疫化せずそして感染させていない子猫１匹（ｎ＝１）に関するＩｇＧタイターも含める。全ての子猫の十二指腸、空腸および回腸から得られる１．０ｃｍの腸セグメントに対して、腸栄養型数を数えた。その結果を図７に示す。音波処理したＳ２栄養型を用いた免疫化（グループＣ）では、予防接種していない子猫（グループＡ）と比較して、十二指腸および空腸の腸内腔内に存在している栄養型の数が減少していた。トキシンで免疫化した（グループＢ）の動物で得られるデータは、説得力の低いものである、と言うのは、恐らくは、このグループの「ｎ値」が比較的小さい（ｎ＝３）ことによるものであろう。二者択一的に、トキシン単独を用いた免疫化は、感染を生じさせることなく症状を防止するか、或はより多い服用量のトキシンはより高い効果を示し得る。興味の持たれることに、家庭用猫のジアルジア鞭毛虫症に関して典型的に記述されているようには³⁰、回腸の中に栄養型を見付け出すのは容易でなかった。上に記述した腸栄養型データに関する変化もまた図８に示し、ここでは、栄養型が見られる腸サンプルのパーセントを実験グループの中で比較する。ジアルジア属栄養型の存在に関して、音波処理したＳ２で免疫化した（グループＣ）子猫では、免疫化していない（グループＡ）およびトキシンで免疫化した（グループＢ）子猫に比較して、腸サンプルの比較的低いパーセントが陽性を示した。
【０１３５】
音波処理したＳ２栄養型を用いた免疫化により、子猫ののう子排泄のひどさが低下した。
【０１３６】
選択した腸組織サンプルの顕微鏡検査により、免疫化していない子猫の中には栄養型が存在していたが、音波処理したＳ２で免疫化した子猫に関しては全くか或はほとんど存在が観察されなかった。
【０１３７】
血清および腸粘膜内のＩｇＡレベルに関する免疫学的試験結果を表４に示す。予防接種せずそしてチャレンジしていない動物では全くＩｇＡ応答が記録されなかった。Ｓ２音波処理物で予防接種した後、チャレンジした動物では、強いＩｇＡ応答が記録された。それとは対照的に、予防接種しないでチャレンジした動物が示すＩｇＡ応答は弱かった。トキシンで予防接種した後、チャレンジした動物では、中程度のＩｇＡ応答があった。このように、予防接種は、自然感染よりも強力なＩｇＡ免疫応答を引き出した。予防接種をせずそしてチャレンジしていない動物を含む、全ての胆汁サンプルにおいて、非特異的免疫応答が記録された。
【０１３８】
【表４】

【０１３９】
実施例３
犬の予防接種−実験的感染
音波処理したジアルジア属株Ｓ２を用いた犬の予防接種の効果に関する試験を下記の如く行った。８から１０週令の子犬４匹から成る２つのグループを用いた。１つのグループの動物（番号１から４）には、上に記述した如く調製した音波処理ジアルジア属株Ｓ２が入っているワクチンを皮下注射した（１日）。上に記述したアジュバントの０．２ｍＬと０．８ｍＬのＰＢＳの中に６００μｇの蛋白質が含まれているワクチンを、各々の動物に受けさせた。もう１つのグループ（番号５から８）には予防接種を行わなかった。
【０１４０】
３週間後（２１日）、動物１から４に、上と同じジアルジア属ワクチンの補助予防接種を受けさせた。動物５から８には予防接種を行わなかった。２８日目、全ての子犬に、４ｘ１０⁶個のランブル鞭毛虫株Ｎ栄養型のチャレンジを行った。株Ｎは犬に高い感染性を示すことからこれを用いた。この挑戦用有機体を、１．０ｍＬのＰＢＳの中に入れて十二指腸内投与した。結果は、ジアルジア属株Ｓ２を用いた免疫化は、ジアルジア属株Ｎの感染に対して交差保護性を示すことを示している。
【０１４１】
チャレンジを行った後、血液サンプルを週毎に採取し、そして全ての動物を５６日目にと殺するまで、堅さおよびのう子排出に関して便を毎日検査した。
【０１４２】
予防接種は下痢に対して犬を保護しており、予防接種した動物が示す下痢は平均で２．２±１．５日である一方、予防接種していない動物が示す下痢は平均で８．２±５．６日であった。
【０１４３】
のう子の排出データは、予防接種した動物が排出するのう子数は予防接種していない動物よりも少ないことを示していた。結果を図９に示す。
【０１４４】
長さが１ｃｍの腸セグメントをＰＢＳの中に懸濁させ、そして３７℃で１時間振とうした。血球計数器を用いて栄養型の数を数えた。結果を表５に示す。予防接種により、免疫化した動物の腸の全ての領域でジアルジア属栄養型がなくなっていた。
【０１４５】
【表５】

このワクチンは、ジアルジア属に対して特異的な血清および粘膜免疫応答を誘発した。予防接種後３週間で始まる、このワクチンに対する強力な血清ＩｇＧ応答が存在していた。それとは対照的に、予防接種していない犬は、感染４週間後に弱い応答を示したのみであった。
【０１４６】
予防接種して６週でチャレンジした時、若干から中程度の血清ＩｇＡ応答が存在していたが、予防接種していない動物では全く血清ＩｇＡ応答がなかった。両方のグループ共、死後、胆汁中に検出可能なＩｇＡを有していた。予防接種した動物および予防接種していない動物の十二指腸および回腸の中でＩｇＡが検出された。
【０１４７】
実施例５
トキシンの産生、精製およびアッセイ
ランブル鞭毛虫のＷＢ単離物を、ＮＣＴＣ−１０９ビタミンミックス（３％）、ＣＬＥＸ（１０％）、胆汁（０．８ｇ／Ｌ）およびピペラシリンを補ったＴＹＩ−Ｓ−３３培地中３７℃で１０日間培養した。３日の間隔で移しながら、培養物を対数期に維持した。１０日後、この培地（「条件付けした培地」）を３，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、無菌濾過（０．２２μのフィルター−Nalgene Co.）した後、ＹＭ−１０膜フィルターが備わっているAmicon装置を用いて濃縮した。
【０１４８】
チャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC No. CCL61）を、相対湿度が９０％の３７℃で、５％のＣＯ₂中、アミノ酸類と共に１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）および０．５％のペニシリンとストレプトマイシンを補ったイーグルのアルファ最少必須培地（ＭＥＭ）の中で増殖させた。
【０１４９】
形態学的試験に関して、９６個のウエルが備わっている組織培養プレート（Linbro Corp.）の各々のウエルに、２００μＬの培地中５ｘ１０³個のＣＨＯ細胞から成る懸濁液を入れた後、５％のＣＯ₂中３７℃で４８時間培養した。各々のウエルの中の培地をピペットで集めて、１５０μＬの新鮮な培地で置換した。試験すべき基質の５０μＬを、第一列のウエルに加え、そしてこの列の最後に至るまで、連続的な４倍希釈を行った（１２個のウエル）。このプレートを再び４８時間培養した。次に、各々のウエルをギムザ染色で染色し、そして長く伸びた細胞のパーセントを測定した。このグラフ上の形態学データ各々は、数を数えた５００個の細胞から長く伸びた細胞の平均パーセントを表している（図１０）。ランブル鞭毛虫の濃縮培地に関する分析結果を、ジアルジア属が入っていない濃縮培地の対照と比較した。コレラトキシン（Sigma Corp.）および百日咳トキシンを正の対照として用いた。コレラトキシンは、特徴的な伸長反応を引き出し、そして百日咳トキシンは、特徴的な凝集反応を引き出す。
【０１５０】
ＣＨＯ細胞の形態に対する、これらの濾液の希釈度を変化させることによる効果を、図１０に示す。濃縮したジアルジア属１０日培地（ＧＭ）に暴露した後の細胞の伸長率は顕著である。同じ希釈度の濃縮対照無菌培地（ＣＭ）に暴露した時、ＣＨＯ細胞はまた伸長を示したが同じ度合ではなかった。このＣＭは、より高い濃度のときある程度の形態学的応答を示し、元の濃度の０．２５倍の濃度のとき最大の応答が得られたが、それでもＣＨＯ細胞の３１．６％のみの伸長であった。このＧＭは、より高い濃度の時ずっと大きな効果をＣＨＯ細胞形態にもたらし（元の濃度の０．２５倍の時７５％）、そしてまた、非常に低い濃度でも伸長を生じさせた。元の濃縮したジアルジア属培地の１．５ｘ１０^-5以上の濃度の時、ＣＨＯ細胞の伸長が生じた。第一希釈の後ＧＭを上昇させることによってその伸長が生じた後、希釈するにつれて減少し始めた（図１０）。
【０１５１】
１０個の培養管の中に入っている１６．０ｍＬの新鮮なＴＹＩ−Ｓ−３３培地の中に、０日の時、５００，０００個の栄養型を接種した。１つの管をランダムに選択して栄養型の数を毎日数えた。この培地のサンプル２．０ｍＬを取り出した後、０．２２μのフィルター（Costar Corp.）を用いて無菌濾過した。この滅菌した培養培地の１ｍＬを４℃で冷蔵し、そして他方の１．０ｍＬを−７０℃で冷凍した。この操作を８日間繰り返した。集めた培養培地の画分各々を、上に記述した如きＣＨＯ細胞バイオアッセイで分析した。
【０１５２】
健康な対数期のジアルジア属栄養型を、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄し、５，０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、１．０ｍＬの緩衝液の中に再懸濁させた。次に、１５秒の破壊１回で、これらの栄養型を音波処理し、そしてこの音波処理物を、生存している栄養型に関して光顕微鏡で試験した。シトゾル内容物を集める目的で、その音波処理物を０．２２μのフィルター（Costar Corp.）で濾過した。このフィルターを１．０ｍＬの緩衝液で逆洗浄することにより、それらの膜とシトゾル画分を集めた。この緩衝液、シトゾル画分および膜画分を、ＣＨＯ細胞バイオアッセイにより、毒性活性に関して分析した。
増殖培地（ＧＭ）タイターとジアルジア属増殖の曲線関係を、図１１に示す。これらのジアルジア属栄養型は分割して、対数様式で数が上昇した。１日目では、遅滞期の証拠が存在しており、２日目には促進期に入り、そして３日目には減速期に入る。その後、この栄養型の数は一定して少なくなる。これらの栄養型の数は３日で最大値に到達し４ｘ１０⁷個であった。この培地のタイターは１日後上昇し始め、そしてこれらの栄養型の増殖段階の間上昇した。３日後、この栄養型数は少なくなり始めた時、このタイターは上昇し続けた。
【０１５３】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、トキシン培地内の蛋白質を分離した。このゲルを、クーマシーブリリアントブルーで染色した。この対照培地を、ジアルジア属音波処理物（シトゾル内容物）、その中で３、４、５、６、７、１０および２５日間増殖させたランブル鞭毛虫が入っているトキシン培地、並びにＦＣＳと比較した。トキシンが入っている培地は、分子量が約２２、３２、３８および３９ｋＤａの蛋白質と、９７ｋＤａ以上の分子量を有する蛋白質を含んでいるが、これらは、対照培地の中には存在していない。
【０１５４】
そのトリス緩衝液、並びにその音波処理した栄養型から得られる膜および細胞骨格画分は、毒性活性に関して陰性であった。そのシトゾル画分は、その最大濃度で細胞の死滅を生じさせ、そしてより低い濃度では細胞を生存させそして伸長させた。このような発見は、ＧＭを用いたとき得られる結果と類似している。
【０１５５】
トキシン産生に対する胆汁の効果を図１２に示す。胆汁が入っている培地の中で増殖させたジアルジア属は、ＣＨＯ細胞伸長で測定して、トキシンを産生した。胆汁無しの培地で増殖させたジアルジア属は産生しなかった。
【０１５６】
実施例６
成体猫の免疫化
３種のランブル鞭毛虫株の抽出物を用いた免疫化に対する成長した猫の免疫学的応答を調査する目的で追加的試験を行った。１２匹の成体猫を、音波処理したランブル鞭毛虫株ＷＢ（３７３μｇの蛋白質／ｍＬ）（ｎ＝４）、Ｓ２（８６４μｇの蛋白質／ｍＬ）（ｎ＝４）およびＤ３（１２０μｇの蛋白質／ｍＬ）（ｎ＝４）で免疫化した。前に記述したアジュバントの０．２ｍＬと０．８ｍＬの音波処理物から成るワクチンの１．０ｍＬを皮下注射で受けさせることにより、猫の予防接種を行った。２１日後、これらの猫にブースター投与し、そして更に２１日後２回目の補助投与を行った。免疫化前の血液サンプルを採取し、そして全ての猫に関して、各々の促進免疫化後７日で、ＩｇＧのＥＬＩＳＡのためのサンプリングを行った。以下に示す表（表６）は、この試験で得られる免疫学的データの要約である。成熟した猫は、上の実験（即ち表２）で記述した若い子猫よりも高い、ジアルジア属に対する初期ＩｇＧタイターを示し、そしてこれらの成熟した猫は、ＩｇＧタイターが有意に上昇すると共に予防接種に対する応答を示した。
【０１５７】
【表６】

【０１５８】
実施例７
子羊の免疫化
平均体重が１８ｋｇの、Caesarean誘導子羊の５匹を、Agriculture Canada、 Lethbridge、 Alberta、 Canadaの羊（Romanof交雑種）集団から選択した。最初の予防接種を行うその日に、免疫化前の血液サンプルを採取した。次に、これらの子羊に、１ｍＬのワクチンを筋肉内注射（ＩＭ）で接種した。このワクチンは、前に記述した如く調製した音波処理ランブル鞭毛虫栄養型（Ｓ２株）の０．８ｍＬを用い、その前日に再懸濁して、１ｍＬのＰＢＳ（燐酸塩緩衝食塩水）当たり０．７５ｍｇの蛋白質を得るように調製したものであった。次に、この音波処理した溶液を、みょうばんを基としたアジュバントの０．２ｍＬに加えることにより、最終蛋白濃度である０．６ｍｇ／ｍＬを得た。
【０１５９】
３週間後、別の血液サンプルを採取した後、これらの子羊に、最初の注射と同じ２番目の注射（補助服用）をまたＩＭで受けさせた。その最初の接種後５５週および７０週で、血液サンプルを採取した。この注射した部位を定期的に監視したが、異常な反応は全く観察されなかった。
【０１６０】
採血した後直ぐこの血液を遠心分離にかけ、そして分析するまで血清を凍結した。ランブル鞭毛虫に特異的な抗体タイターの検出をＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）試験を用いて行った。重複してサンプルを実験した。ラビット抗−ヒツジＩｇＧ ＨＲＰ接合試薬（ICN Cat. #674531）を二次抗体として用いる以外は前に記述したネコＩｇＧアッセイと同じ様式で、このＥＬＩＳＡを行った。負の対照として０週を用いた。タイターの結果を表７に示す。
【０１６１】
これらの子羊は、このワクチンを１回接種した後でさえ、ランブル鞭毛虫に対して有意に抗体タイターを上昇した。３週目に行ったブースター接種により、この初期の免疫応答が上昇した。
【０１６２】
【表７】

【０１６３】
実施例８
１０ＸのＴＹＩ−Ｓ−３３で条件付けした培地の硫酸アンモニウム分別
ランブル鞭毛虫のＳ２単離物を実施例５に記述したのと同様にして培養した。１０倍濃度のＴＹＩ−Ｓ−３３で条件付けした培地と対照培地を、前に記述した如きＣＨＯ伸長アッセイにおけるトキシン活性に関して、０−４０％、４０−６０％、６０−８０％の硫酸アンモニウムペレット、８０−１００％の上澄み液および１００％の硫酸アンモニウムペレットに対して比較した。結果を表８に示す。ＣＨＯ細胞の５０％伸長を生じさせる１０Ｘ培地の最大希釈度として活性を定義した。
【０１６４】
硫酸アンモニウム分別により１１５．９倍（６４００／５５．２）の精製度が得られた。回収は１０％であった。
【０１６５】
活性を示す画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上を流した。対照培地にも条件付けした培地にも検出されないユニークな帯が、硫酸アンモニウム画分の中に見られた。これらの帯は、６５−５０ｋＤａ、４２−３６ｋＤａ、２８−２５ｋＤａおよび２０−１６ｋＤａの範囲の分子量を有している。他の蛋白質も存在し得るが検出不可能である。
【０１６６】
【表８】

【０１６７】
実施例９
子犬および子猫の免疫化
子犬（３３）と子猫（３３）をランダムに割り当てて、予防接種グループ（２０匹の子犬と２０匹の子猫）、対照の予防接種無しグループ（１０匹の子犬と１０匹の子猫）および対照の処置無しグループ（３匹の子犬と３匹の子猫）を生じさせた。０日および２１日目に、胆汁が入っている培地の中で増殖させたジアルジア属Ｓ２栄養型を含んでいるジアルジア属ワクチンの１．０ｍＬを、２０匹の子犬と２０匹の子猫に皮下予防接種した。予防接種無しの対照グループには食塩水のみを受けさせた。
【０１６８】
ポリスチレン製のボトル（１．２から２．５Ｌ）の中に入っている胆汁を含む培地の中で栄養型を培養し、３４から３７℃で４８から９６時間培養することによって、ワクチンの調製を行った。ボトルを２４時間以内に２から７℃に冷却することで、栄養型が脱離して増殖表面を生じるのを可能にした。栄養型を収穫した後、連続流のローター遠心分離で濃縮した。次に、この濃縮した栄養型を遠心分離にかけ、冷標準食塩水で２回洗浄した後、元の培養体積の５から１０％になるように再懸濁した。この懸濁液を高圧ホモジェナイザーにより２回均一化することにより、栄養型の全体的崩壊を達成した。この均一化させた懸濁液が含んでいる全蛋白質は１ｍＬ当たり２００μｇ以上であった（Biorad蛋白質アッセイ）。ワクチンの各々１．０ｍＬは、０．９ｍＬの標準食塩水と０．１ｍＬのみょうばんを基とするアジュバントの中に蛋白質を１５０μｇ含んでいた。
【０１６９】
３５日目、この予防接種したグループと対照の予防接種無しグループに、１００万個のランブル鞭毛虫栄養型を用いた十二指腸内接種の挑戦を行った。ジアルジア属Ｓ２株を用いた挑戦を子猫に行い、そしてＮ株を用いた挑戦を子犬に行った。この病気に関する３５日から５６日の臨床的症状（下痢、食欲不振、活動）を毎日記録し、そして動物の体重を毎週測定した。便のサンプルを毎週採取し、便ののう子の数を数えた。第一予防接種の前およびこの試験全体を通して週毎に採血して、血清抗体レベルを測定した。５６日目、動物を安楽死させた後、十二指腸、空腸および回腸のセグメントを取り出して、栄養型の数を数えた。
【０１７０】
予防接種した子犬の軟便は１２．３±１．３日であり、そして下痢は０．２±０．１日であったが、予防接種しなかった子犬の軟便は１５．１±１．３日であり、そして下痢は０．６±０．２日であった。予防接種した子猫の軟便は２．８５±０．６０日であったが、予防接種しなかった子猫の軟便は４．４±０．９日であった。従って、予防接種した動物に下痢または軟便が生じる回数は減少していた。
【０１７１】
活動に関しては予防接種動物と対照動物の間には差が見られなかった。
【０１７２】
予防接種した子犬と予防接種しなかった子犬との間には、上昇率の差は存在していなかった。予防接種しなかった子猫は、予防接種した動物に比較して、感染後期間の間成長の遅れを示した（図１３）。
【０１７３】
感染前および感染後期間の間のう子の数を数えた。予防接種した動物は便にのう子を排泄しないか、或はのう子排泄を示した期間は短かった。予防接種しなかった動物は、より長い期間に渡ってより多くの数ののう子を排泄した。
【０１７４】
予防接種しなかった動物はより大きな比率でジアルジア属ののう子を排出した。子犬でのう子を排出したのは、予防接種した動物では０−５％であるのに比較して、予防接種しなかった動物では２０−８０％であった。子猫でのう子を排出したのは、予防接種した動物では０−３５％であるのに比較して、予防接種しなかった動物では４０−８０％であった。
【０１７５】
予防接種した子猫と予防接種しなかった子猫に関して、のう子の生存能力を評価した。これらののう子をメチレンブルーで染色した後これらののう子が染料を吸収するのを観察することによって上記を達成した。生存能力損失の指示である空胞化および異常構造に関しても、のう子を検査した。のう子が排泄された時ののう子の生存能力は、予防接種した動物では３８．８％±５．０％であり、そして予防接種しなかった子猫では９９．９％±０．１％であった。
【０１７６】
剖検時に、前の実施例に記述した方法を用いて、十二指腸、空腸および回腸内の栄養型の数を数えた。これらの数および対数変換した数を表９から１２に示す。予防接種した動物の栄養型出現率および栄養型数は、予防接種しなかった動物よりも低かった。
【０１７７】
この試験の最後に、予防接種した子犬の中でその寄生性生物に感染したのは、これらの動物の５−１０％であったが、予防接種した子猫の中で感染したのは、これらの動物の０−５％であった。予防接種しなかった動物の中でその寄生性生物に感染したのは、これらの子犬の８０−９０％であり、そしてこれらの子猫の３０−６０％であった。
【０１７８】
【表９】

【０１７９】
【表１０】

【０１８０】
【表１１】

【０１８１】
【表１２】

【０１８２】
前の実施例に記述した方法を用いて抗体測定を行った。予防接種した動物では体液免疫が明確な一方、予防接種しなかった動物が示すジアルジア属寄生性生物に対する応答は劣っていた。子猫における感染前および感染後期間中の血清ＩｇＧ応答を図１４に示す。
【０１８３】
本文中に示した如き本発明の教示を受けた後の本分野の技術者に、本発明の種々の具体例を実施する上記様式の修飾形が明らかになるであろう。上に記述した実施例は制限するものではなく単に本発明を例示するものであり、請求の範囲で本発明の範囲を定義する。
【０１８４】
本発明の特徴および態様は以下のとうりである。
【０１８５】
１．保護免疫原性を示すように胆汁が入っている培地の中で培養した腸原生動物のワクチン株。
【０１８６】
２．ａ）胆汁が入っている増殖用培地中インビトロで腸原生動物の株を培養する結果として、保護免疫原性を示すワクチン株を生じさせ、そして
ｂ）その得られるワクチン株を単離する、
ことを含む、腸原生動物のワクチン株を製造する方法。
【０１８７】
３．保護免疫原性を示すようにする目的で胆汁が入っている培地の中で培養した腸原生動物のワクチン株、上記腸原生動物の上記ワクチン株のサブユニット、上記腸原生動物のトキシン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される免疫原を保護免疫原性量で含んでいる、インビボ投与されたとき腸原生動物に対する保護免疫を与えるワクチン組成物。
【０１８８】
４．野生または家畜動物、食物製造で用いられる動物、人、犬、猫または鳥種で用いるに適合している第３項の組成物。
【０１８９】
５．上記組成物内の上記腸原生動物以外の腸原生動物門に対して交差保護免疫を与える第３項の組成物。
【０１９０】
６．ａ）腸原生動物のワクチン株を調製し、そして
ｂ）上記ワクチン株と薬学的許容担体とを一緒にする、
ことを含む、ワクチン組成物の製造方法。
【０１９１】
７．保護免疫原性を示すようにする目的で胆汁が入っている培地の中で培養した、感染の原因となる腸原生動物のワクチン株、上記腸原生動物の上記ワクチン株のサブユニット、上記腸原生動物のトキシン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される免疫原を有効量で含んでいる少なくとも１つの服用量を動物に投与することを含む、動物における腸原生動物の感染を予防または治療する方法。
【０１９２】
８．上記有効量が、生存能力のある腸原生動物のう子が動物内で落ちるのを防止するに充分な量である第７項の方法。
【０１９３】
９．上記投与を、症状を示すか或は症状を示さない動物に対して行い、そして上記有効量が、上記動物の成長速度を上昇させるに充分である第７項の方法。
【０１９４】
１０．上記動物が人であり、そして上記人が慢性の腸原生動物感染を示している第７項の方法。
【０１９５】
１１．上記投与を、食物製造で用いられる動物に対して行い、そして上記有効量が、上記動物における飼料変換率を上昇させるに充分である第７項の方法。
【０１９６】
１２．胆汁が入っている培地の中で培養したときインビトロでトキシンを産生し得る腸原生動物の株から単離される、腸原生動物のトキシン。
【０１９７】
１３．上記腸原生動物に感染した動物に有効量の上記トキシンが投与される時、上記トキシンによる免疫化で腸原生動物感染の症状を防止する、第１２項のトキシン。
【０１９８】
１４．上記トキシンが細胞毒性を示す効果を生じる第１２項のトキシン。
【０１９９】
１５．上記トキシンがエキソトキシンを含んでいる第１２項のトキシン。
【０２００】
１６．上記トキシンがエンテロトキシンを含んでいる第１２項のトキシン。
【０２０１】
１７．ａ）胆汁が入っている培地中インビトロで腸原生動物を増殖させることによって培養物を調製し、そして
ｂ）上記培養物からトキシンを単離する、
ことを含む、腸原生動物のトキシンを製造する方法。
【０２０２】
１８．胆汁が入っている培地の中で腸原生動物を培養するとき上記腸原生動物が産生する腸原生動物トキシンに対する抗体。
【０２０３】
１９．上記トキシンを中和する第１８項の抗体。
【０２０４】
２０．腸原生動物感染の症状を示す動物に投与されたとき上記症状を和らげる第１８項の抗体。
【０２０５】
２１．胆汁が入っている培地の中で原生動物を培養するとき上記腸原生動物が産生する腸原生動物トキシンに対する抗体の有効量を動物に投与することを含む、腸原生動物の感染に敏感な動物またはそれに苦しんでいる動物の中に受動免疫を与える方法。
【０２０６】
２２．上記腸原生動物が、ジアルジア属、クリプトスポリジウム、トリコモナド類、ヒストモナス、スピロヌクレウス、アメーバ属、球虫類、トキソプラスマまたは肉胞子虫属を含む第１、２、３、６、７、１２、１７、１８または２１項いずれか記載の発明。
【０２０７】
２３．上記ワクチン株がインビトロでトキシンを産生する第１、２、３、６または７項いずれか記載の発明。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々のジアルジア属株の増殖を説明するものである。
【図２】 ＣＨＯ細胞におけるジアルジア属株Ｓ２のトキシンタイターを説明するものである。
【図３】 ＣＨＯ細胞におけるジアルジア属株ＷＢのトキシンタイターを説明するものである。
【図４】 ＣＨＯ細胞におけるジアルジア属株Ｄ３のトキシンタイターを説明するものである。
【図５】 子猫における、ジアルジア属で挑戦した後の体重上昇に対する予防接種の効果を説明するものである。
【図６】 子猫における、免疫応答に対する予防接種の効果を説明するものである。
【図７】 子猫における、ジアルジア属で挑戦した後の栄養型数に対する予防接種の効果を説明するものである。
【図８】 ジアルジア属で挑戦した後、栄養型が見られる子猫腸サンプルのパーセントに対する予防接種の効果を説明するものである。
【図９】 予防接種した犬および予防接種していない犬における、便ののう子排泄を説明するものである。
【図１０】 ＣＨＯ細胞に対するジアルジア属トキシンの効果を説明するものである。
【図１１】 トキシン産生曲線を説明するものである。
【図１２】 ＣＨＯ細胞伸長で測定した、ジアルジア属トキシン産生に対する胆汁の効果を説明するものである。
【図１３】 子猫における、ジアルジア属でチャレンジする前と後の体重上昇に対する予防接種の効果を説明するものである。
【図１４】 子猫における、血清ＩｇＧタイターに対する予防接種の効果を説明するものである。

Claims (4)

1. 防御免疫原性量のランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）の株とアジュバントを含んでなるジアルジア鞭毛虫症を予防または治療するためのワクチン組成物であって、該ランブル鞭毛虫の株が防御免疫原性となるように胆汁を含有する培地中で培養され、かつ、該ランブル鞭毛虫の株が該組成物中で使用する前に崩壊されたものであることを特徴とするワクチン組成物。
2. 該ワクチン組成物中のランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）以外のジアルジア（Giardia）に対して交差防御免疫を提供する請求項１に記載のワクチン組成物。
3. イヌまたはネコの種で使用するためのものである請求項１または２に記載のワクチン組成物。
4. ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）の株がＷＢ，Ｓ２およびＤ３からなる群より選ばれる請求項１〜３のいずれかに記載されたワクチン組成物。

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