DE69829400T2

DE69829400T2 - Passive immunisierung gegen durch clostridium difficile verursachte krankheit

Info

Publication number: DE69829400T2
Application number: DE69829400T
Authority: DE
Inventors: D. William THOMAS; Paul Giannasca; Zhengi Zhang; Wende Lei; P. Thomas MONATH
Original assignee: Acambis Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Biologics LLC
Priority date: 1997-10-20
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2018-10-21
Also published as: CA2307331A1; EP2305303A2; HK1083736A1; EP1024826A1; DE69829400D1; US6680168B2; AU754270B2; CA2307331C; EP2305293A3; EP1024826A4; EP2305303A3; AU1108299A; US6214341B1; US20010051153A1; WO1999020304A1; EP1024826B1; EP2305293A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Vorbeugung und Behandlung einer Clostridium difficile-Krankheit.
Clostridium difficile, ein Toxin-produzierendes gramm-positives Bakterium, dringt in den Darmtrakt von Patienten ein, deren normale Darmflora aufgrund einer Behandlung mit Antibiotika mit breitem Spektrum unterdrückt ist. Die bakteriellen Toxine verursachen verschiedene Stufen von Beschädigungen des Dickdarm-(d.h. Colon-)Epitheliums und bringen ein Krankheitsspektrum hervor, das von einer leichten Diarrhöe bis zu einer schweren Colitis reicht. Da eine Antibiotika-Behandlung das Einsetzen einer C. difficile-Erkrankung auslöst, werden die damit assoziierten Syndrome als Antibiotika-assoziierte Diarrhöe und Colitis bezeichnet (LaMont, Bacterial Infections of the Colon, Textbook of Gastroenterology, 2. Ausgabe, 1897–1903, 1995).
Es werden drei klinische Syndrome, die durch C. difficile verursacht werden, basierend auf der Schwere ihrer Infektion unterschieden. Die schwerste Form ist die pseudomembranöse Colitis (PMC), die durch eine übermäßige Diarrhöe, Unterleibsschmerz, systemische Krankheitszeichen und einem ausgeprägten endoskopischen Aussehen des Colons charakterisiert ist. Die Todesrate von PMC beträgt bis zu 10%. Eine Antibiotika-assoziierte Colitis (AAC) ist auch durch eine übermäßige Diarrhöe, Unterleibsschmerz und eine schmerzhafte Bauchdeckenabwehrspannung, systemischen Anzeichen (z.B. Fieber) und Leukozytose charakterisiert. Eine Darmverletzung in AAC verläuft weniger schwer als bei einer PMC, das charakteristische endoskopische Aussehen des Darms ist bei PMC nicht vorhanden und die Sterbewahrscheinlichkeit ist gering. Schließlich ist eine Antibiotika-assoziierte Diarrhöe (AAD) das am schwächsten ausgeprägte Syndrom, das durch C. difficile verursacht wird und ist charakterisiert durch eine schwache bis moderate Diarrhöe, dem Fehlen einer Entzündung des Dickdarms (wie sie beispielsweise durch Unterleibs schmerz, eine schmerzhafte Bauchdeckenabwehrspannung charakterisiert ist) und systemischen Anzeichen einer Infektion (z.B. Fieber). Diese drei unterschiedlichen Syndrome treten in einer zunehmenden Häufigkeit auf. Dies bedeutet, dass PMC weniger häufig vorkommt als AAC, und AAD ist das am meisten vorkommende klinische Erscheinungsbild einer C. difficile-Krankheit.
Die Populationen, die durch C. difficile berücksichtigt werden können, sind im Allgemeinen im Krankenhaus eingewiesene ältere Patienten sowie Bewohner von Altenpflegeheimen, die ein breites Spektrum von Antibiotika empfangen haben. Ein hohes Alter, die Länge eines Krankenhausaufenthaltes, die zugrunde liegende Krankheit und die Verwendung einer Antibiotika-Therapie werden als Risikofaktoren für eine C. difficile-Infektion angesehen (McFarland et al., J. Infect. Dis. 162: 678–684, 1990; Bennett, Aging, Immunity, and Infection, 216–229, 1994). Eine häufige Komplikation einer C. difficile-Infektion ist eine Rückfall-Erkrankung, die in bis zu 20% aller Individuen auftritt, die sich von einer C. difficile-Erkrankung erholen. Ein Rückfall kann klinisch als AAD, AAC oder PMC gekennzeichnet sein. Es gibt keine spezifischen Risikofaktoren oder prädisponierende Faktoren für einen Rückfall, jedoch ist es bei Patienten, die einmal einen Rückfall erlitten haben, eher wahrscheinlich erneut einen Rückfall zu erleiden.
C. difficile produziert zwei Exotoxine, Toxin A und Toxin B, die den durch C. difficile verursachten Krankheitsprozess vermitteln. Toxin A und Toxin B sind große (~300 kDa) extrazelluläre Proteine, von denen angenommen wird, dass deren aktive Formen Homodimere sind. Die Toxine werden in ungefähr gleichen Mengen von einem einzelnen chromosomalen Locus stabil exprimiert (Mitty et al., The Gastroenterologist 2: 61–69, 1994). Die Toxine besitzen eine nahezu 50%ige Aminosäuresequenz-Homologie, sind jedoch immunologisch verschieden. Die 100 kDa Carboxyl-Termini der zwei Toxine enthalten repetitive Oligopeptide und sind bei der Kohlenhydrat-Rezeptorbindung in vivo beteiligt. Von der Rezeptorspezifität wird angenommen, dass sie eine Gewebe- und Wirtsspezifität der Toxinwirkung vermittelt. Diese Region ist immunogener als der Aminoterminus. Die aminoterminale 200 kDa-Region enthält die enzymatische Domäne, von der angenommen wird, dass sie GTP-Bindungsproteine Rho, Rac, und Cdc42 glykosyliert, und dadurch deren Phosphorilierung verhindert und zu einem Verlust der Actinpolymerisation und cytoskelettalen Integrität führt (Eichel-Streiber, Trends Micro, 4: 375–382, 1996). Als eine Folge der cytoskelettalen Veränderungen gehen die "tight junctions" zwischen den Epithelzellen verloren. Die Beschädigung des Epithels in Verbindung mit lokalen Entzundungsereignissen verursacht eine Flüssigkeitsabsonderung in den Darm, die sich als Diarrhöe bemerkbar macht (Mitty et al., supra).
Aufgrund ihrer Inhibition der Cytoskelettstruktur führen beide Toxine zu einem Abrunden von Zellen in Gewebekultur bei sehr niedrigen Konzentrationen. Die Dosis, die eine morphologische Veränderung von 50% der Zellen (MC₅₀) für Toxin A auf IMR90-Zellen verursacht, beträgt 0,4 ng/ml und für Toxin B 3,5 pg/ml (Torres et al., Infect. & Immun. 63: 4619–4727, 1995). Toxin A ist ein Enterotoxin, das zu einer Flüssigkeitsanhäufung in verbundenen Darmschleifen bei Tieren führt. Obwohl Toxin B keine Flüssigkeitssekretion in Darmschleifen von Tieren induziert, kann es wie Toxin A inflammatorische Veränderungen in vivo und in vitro auslösen (Mitty et al., supra). Beide Toxine sind für Tiere letal, wenn sie auf systemische Weise verabreicht werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung von humanem Toxin-neutralisierenden polyklonalen Immunglobulin von Clostridium difficile für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Clostridium difficile-Infektion in einem humanen Patienten durch perkutane Verabreichung, wobei das polyklonale Immunglobulin ein polyklonales Hyperimmun-Serum ist, das aus Menschen, die mit Toxoiden aus C. difficile geimpft worden sind, gewonnen wurde und das Antikörper enthält, die die Cytotoxizität und in vivo-Wirkungen von Toxin A und Toxin B neutralisieren. Die Erfindung stellt weiter Verfahren zur Behandlung einer Clostridium difficile-Krankheit in menschlichen Patienten zur Verfügung. Diese Verfahren beinhalten eine perkutane (z.B. intramuskuläre, intravenöse oder intraperitoneale) Verabreichung von menschlichem polyklonalen C. difficile-Immunglobulin, das sowohl Toxin A als auch Toxin B neutralisiert (hier als "Immunglobulin" bezeichnet) (z.B. 0,01–100 mg/kg Körpergewicht) an einen Patienten. Diese Verfahren können auch eine perkutane Verabreichung von einem Clostridium-Toxin oder -Toxoid an einen Patienten einschließen, um eine Anti-C. difficile-Immunantwort in dem Patienten zu stimulieren. Wenn das injizierte Immunglobulin zur Behandlung an die betroffenen Individuen verabreicht wird, wird es auch einen Rückfall verhindern. Auch sind in der Erfindung die Verwendung der hier beschriebenen Zusammensetzungen in den hier beschriebenen Verfahren eingeschlossen, sowie die Verwendung dieser Zusammensetzungen für die Herstellung von Arzneimitteln, um die hier beschriebenen Verfahren durchzuführen.
Auch sind in der Erfindung Verfahren zur Vorbeugung einer C, difficile-Krankheit in menschlichen Patienten eingeschlossen. In diesen Verfahren wird ein Toxin-neutralisierender Antikörper gegen ein C. difficile-Toxoid (z.B. ein polyklonales C. difficile-Immunglobulin (z.B. 0,01–100 mg/kg Körpergewicht)) perkutan (z.B. intramusku1är, intravenös oder intraperitoneal) an einen Menschen verabreicht, bei dem ein Risiko besteht, dass er mit C. difficile infiziert werden wird. Das in diesem Verfahren verwendete C. difficile-Immunglobulin kann beispielsweise in einem Menschen hergestellt werden. Diese Verfahren können auch eine perkutane Verabreichung von einem Clostridium-Toxin oder -Toxoid, das Toxin A- und Toxin B-Epitope enthält, an den Patienten einschließen.
Weiter sind Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung einer Clostridium-Erkrankung des Darms in menschlichen Patienten offenbart, welche eine perkutane Verabreichung eines Clostridiums (z.B. C. difficile)-Toxins oder -Toxoids an einen Patienten in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Adjuvans, wie Alum, beinhalten. Ein weiteres Verfahren, das von der Erfindung umfasst ist, beinhaltet die Verabreichung eines C. difficile-Immunglobulins, wie zuvor beschrieben, um einen Patienten schnell zu behandeln oder zu schützen, während gleichzeitig ein Toxoid für einen langfristigen, aktiven Schutz durch eine Stimulation des Immunsystems des Patienten verabreicht wird.
Sämtliche oben beschriebene prophylaktischen und therapeutischen Verfahren können, in Verbindung mit einer perkutanen Verabreichung, eine mukosale Verabreichung, beispielsweise eine orale oder rektale Verabreichung, beinhalten.
Auch sind Verfahren zur Herstellung von C. difficile-Toxoid offenbart. Diese Verfahren beinhalten die Bereitstellung von C. difficile-Bakterien; die Kultivierung der Bakterien in Medien, die geeignete Tierprodukte enthalten (z.B. Casein-Produkte), um eine Kultur zu erzeugen; die Co-Reinigung von Clostridium-Toxin A und Clostridium-Toxin B aus der Kultur, um ein Gemisch von co-gereinigtem Toxin A und Toxin B zu erzeugen; und die Inaktivierung des co-gereinigten Toxin A und Toxin B durch Inkubation in Formaldehyd bei einer Temperatur von ungefähr 25°C oder weniger (z.B. 15°C oder weniger oder 5°C oder weniger), um das Clostridium-Toxoid zu erzeugen. Das co-gereinigte Toxin A und Toxin B kann in einem Gemisch bei einem Verhältnis im Bereich von 0,1:1 bis 10:1 vorliegen, beispielsweise bei 2:1. Die Erfindung umfasst auch ein C. difficile-Toxoid, das durch dieses Verfahren hergestellt wurde, und eine Vakzin-Zusammensetzung, die dieses Toxoid sowie 0,012 bis 0,020% Formaldehyd enthält. Gegebenenfalls kann diese Zusammensetzung ein Adjuvans, wie Alum, enthalten.
Weiter offenbart sind Verfahren zur Herstellung eines menschlichen, Toxin-neutralisierenden C. difficile-Immunglobulins. Bei diesem Verfahren wird C. difficile-Toxoid, das beispielsweise Toxin A und/oder Toxin B enthält, an einen Menschen verabreicht und C. difficile-Immunglobulin wird aus dem Menschen isoliert. Ein C. difficile-Immunglobulin, das unter Verwendung von diesem Verfahren hergestellt worden ist, ist auch offenbart.
Auch offenbart sind Verfahren zur Identifizierung eines Menschen, der ein C. difficile-Immunglobulin produziert. Diese Verfahren beinhalten die Entnahme einer Blutprobe von einem Menschen, der mit einem C. difficile-Toxoid geimpft worden ist; das Bestimmen des Spiegels von Antikörpern gegen die Toxine A und B von C. difficile in der Blutprobe durch einen Enzym-gekoppelten Immuno-Assay (ELISA) und das Bestimmen des Spiegels der neutralisierenden Aktivität der Cytotoxizität in vitro gegenüber den Toxinen A und B von C. difficile in der Blutprobe. Der Nachweis von steigenden Antikörperspiegeln gegenüber den Toxinen A und B von C. difficile in der Blutprobe und der Nachweis einer neutralisierenden Cytotoxizitäts-Aktivität in vitro gegenüber den Toxinen A und B von C. difficile in der Blutprobe weisen auf einen Menschen hin, in dem ein C. difficile-Immunglobulin produziert wird. Zusätzlich zu den Menschen, die mit einem C. difficile-Toxoid geimpft worden sind, kann dieses Verfahren mit ungeimpften Menschen durchgeführt werden, um taugliche Kandidaten für eine Impfung festzustellen.
Der Ausdruck "C. difficile-Immunglobulin" wird hier verwendet, um ein polyklonales Hyperimmunserum zu beschreiben, das in Subjekten herangezogen wurde (z.B. in freiwilligen Menschen), die mit C. difficile-Toxoiden geimpft worden sind. Das Immunglobulin enthält Antikörper, die die Cytotoxizität und die in vivo-Wirkungen von Toxin A und Toxin B neutralisieren.
Der Ausdruck "C. difficile-Toxoid" wird verwendet, um ein C. difficile-Toxin (Toxin A oder Toxin B) oder ein Gemisch von C. difficile-Toxine zu beschreiben, die teilweise oder vollständig inaktiviert sind, beispielsweise durch eine chemische Behandlung (z.B. Formaldehyd). Ein Toxin wird als "inaktiviert" bezeichnet, wenn es eine geringe Toxizität aufweist (z.B. eine um 100%, 99%, 95%, 90%, 80%, 75%, 60%, 50%, 25% oder 10% geringere Toxizität) als das unbehandelte Toxin, was beispielsweise an hand eines in vitro-Cytotoxizitäts-Assay oder mittels Toxizität für Tiere gemessen wird. Andere chemische Mittel zur Inaktivierung von Toxin können verwendet werden, einschließlich, z.B., einer Peroxyd- oder Glutaraldehyd-Behandlung. Es können auch Toxoide durch genetische Veränderungen erzeugt werden, die zu einer Toxininaktivierung führen.
Die Erfindung besitzt mehrere Vorteile. Zum Beispiel bewirkt eine Behandlung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere eine Inaktivierung der bakteriellen Toxine von C. difficile, ohne die normale Darmflora zu beeinflussen. Es sind sowohl das Toxin A als auch das Toxin B von C. difficile bei der menschlichen Erkrankung beteiligt und die erfindungsgemäßen immuntherapeutischen Verfahren können eingesetzt werden, um sie auf diese beiden Moleküle zu richten. Die Erholung erfolgt bei Verwendung einer Immuntherapie schneller als bei einer antimikrobiellen Therapie, die statt einer Toxinneutralisation vegetative Bakterien zum Ziel hat. Die spezifische Neutralisation der Toxinaktivität hat den Vorteil, dass die Ursache der Gewebebeschädigung spezifisch und schnell beseitigt wird. Zusätzlich kann eine Einzeldosis von C. difficile-Immunglobulin, das perkutan verabreicht wurde (z.B. intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal), in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, anstelle der sich wiederholenden Dosen, die für eine orale Verabreichung erforderlich sind (Lyerly et al., Infect. & Immun. 59: 2215–2218, 1991). Die Gesamtdosis von C. difficile-Immunglobulin, das perkutan verabreicht wurde, ist geringer als die Dosis, die bei oralen Verfahren benötigt wird, da die injizierten Antikörper eine längere Halbwertszeit im Vergleich zu den oral verabreichten Antikörpern besitzen (Stunden vs. Wochen oder Monate). Eine spezifische Antikörpertherapie ermöglicht auch die Weiterführung der Behandlung der zugrunde liegenden Zustände mit Antikörpern, die ansonsten hätte abgebrochen werden müssen, um eine Wiederherstellung der Darmflora und Erholung von der C. difficile-Infektion zu ermöglichen. Auch verhindert eine Behandlung, bei der die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, das Auftreten von Antibiotikaresistenten Bakterien. Eine C. difficile-Erkrankung wurde traditionell mit Vancomycin und Metronidizol behandelt und die Verwendung von Vancomycin führte zu dem Auftreten von Vancomycin-resistentem Enterococcus. Ähnliche Probleme können auch durch eine Metronidizol-Behandlung auftreten. Schließlich wird C. difficile in den erfindungsgemäßen Verfahren in einem Medium kultiviert, dem komplexe Tierprodukte fehlen, beispielsweise Produkte des Nervensystems, z.B. die Tierprodukte im Gehirn-Herz-Infusionsmedium. Bei Medien, die solche komplexe Tierprodukte enthalten, wurde festgestellt, dass sie das Bovine Spongiforme Encepha lopathie(BSE)-Prion enthalten. Indem solche Medien nicht verwendet werden, bietet die Erfindung Sicherheit gegenüber einer Infektion durch solche Agenzien.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aufgrund der folgenden detaillierten Beschreibung, den Zeichnungen und den Patentansprüchen ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt ein Chromatogramm dar, das das Elutionsprofil eines C. difficile-Ammoniumsulfatpräzipitats von einer Sephacryl S-300-Säule verfolgt.
2 stellt ein Diagramm dar, das die Inaktivierungsgenetiken von C. difficile-Toxin, Charge 144, zeigt.
3 ist eine schematische Darstellung eines Ablaufplans zur aktiven Immunisierung von Hamstern mit einem C. difficile-Toxoid-Vakzin zum Schutz gegen eine Induktion nach einer Immunisierung.
4 stellt ein Diagramm dar, das zeigt, dass Hamster, die intramuskulär mit einem Toxoid-Vakzin immunisiert wurden, vor dem Ableben und einer Diarrhöe nach einer C. difficile-Induktion geschützt sind.
5 ist eine schematische Darstellung eines Ablaufplans zur passiven Immunisierung von Hamstern mit C. difficile-Toxin-neutralisierenden Antikörpern.
6 stellt ein Diagramm dar, das zeigt, dass Hamster, die intraperitoneal mit Toxin-neutralisierenden Antikörpern behandelt wurden, von einem Ableben und Diarrhöe nach einer C. difficile-Induktion geschützt sind.
7 ist eine schematische Darstellung eines Ablaufplans zur passiven Immunisierung von Hamstern mit Diarrhöe unter Verwendung von C. difficile-Toxin-neutralisierenden Antikörpern von.
8 stellt ein Diagramm dar, das zeigt, dass ein Ableben und Diarrhöe in Hamstern, die mit C. difficile-Toxin-neutralisierenden Antikörpern behandelt wurden, verhindert wird.
9 ist eine schematische Darstellung von Experimenten, welche die Sicherheit und Immunogenität des C. difficile-Toxoid-Vakzins in Rhesusaffen zum Bestandteil haben.
10 stellt ein Diagramm dar, das den Durchschnittswert der Titer von Toxinneutralisierenden Antikörpern in Rhesusaffen zeigt, die mit einem C. difficile-Toxoid-Vakzin immunisiert worden sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Vorbeugung und Behandlung einer C. difficile-Krankheit in Säugetieren, beispielsweise in Menschen, bereit. Die Verfahren umfassen passive und aktive Immunisierungsmethoden, die eine perkutane (z.B. intramuskuläre, intravenöse oder intraperitoneale) Verabreichung von Antikörpern (z.B. polyklonales Toxin-neutralisierendes Immunglobulin) gegenüber Toxoiden von C. difficile, C. difficile-Toxoide selbst oder Kombinationen davon umfasst. Die Erfindung umfasst C. difficile-Toxoide, Vakzin-Zusammensetzungen, die C. difficile-Toxoide enthalten, Verfahren zur Herstellung von polyklonalem C. difficile-Toxin-neutralisierenden Immunglobulin, im Wesentlichen aufgereinigtes polyklonales Toxin-neutralisierendes Immunglobulin von C. difficile und Verfahren zur Identifizierung von Spendern von polyklonalem C. difficile-Toxin-neutralisierenden Immunglobulin. Diese Verfahren und Zusammensetzungen sind weiter wie folgt beschrieben.
Die erfindungsgemäßen prophylaktischen und therapeutischen Verfahren umfassen eine Impfung mit C. difficile-Toxoiden, entweder indem die Behandlung selbst durchgeführt wird oder indem das C. difficile-Immunglobulin zur nachfolgenden Verwendung einer passiven Immunisierung hergestellt wird. C. difficile-Toxoide werden hergestellt, indem Toxine (Toxin A, Toxin B oder vorzugsweise eine Kombination von Toxin A und Toxin B) aus Kulturen von C. difficile aufgereinigt werden und die Toxine durch eine chemische Behandlung, z.B. mit Formaldehyd (siehe unten), Glutaraldehyd, Peroxyd oder Sauerstoff inaktiviert werden (siehe z.B. Relyveld et al., Methods in Enzymology 93: 24, 1983; Woodrow und Levine, Hrsg., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, 1990). Alternativ können Mutanten-Toxine von C. difficile, die keine oder eine reduzierte Toxizität aufweisen unter Verwendung von rekombinanten Verfahren hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Toxoiden durch genetische Verfahren sind auf dem Gebiet bekannt (siehe z.B. US-Patent Nrn. 5,085,862; 5,221,618; 5,244,657; 5,332,583; 5,358,868 und 5,433,945). Beispielsweise können Deletions-Mutationen, welche die aminoterminale, enzymatische Region des Toxins entfernen, hergestellt werden. Es können auch Deletions- oder Punkt-Mutationen in der aktiven Stelle des Toxins hergestellt werden. Zusätzlich können Deletions- oder Punkt-Mutationen hergestellt werden, die eine Rezeptor- oder Kohlenhydratbindung verhindern.
Vakzin-Zusammensetzungen, die C. difficile-Toxoide enthalten, können zur Verabreichung hergestellt werden, indem die Toxoide in einem pharmazeutisch annehm baren Verdünnungsmittel (z.B. physiologische Kochsalzlösung) suspendiert werden oder indem die Toxoide mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verbunden werden. Die Toxoide können in der Gegenwart oder in der Abwesenheit eines Adjuvans verabreicht werden, in Mengen, die von einem Fachmann bestimmt werden können. Adjuvanzien, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen Aluminium-Verbindungen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxyphosphat. Das Antigen kann mit der Aluminiumverbindung unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert werden oder daran adsorbiert werden. Es kann als ein spezifisches Beispiel Alum verwendet werden (z.B. Rehydragel LV^®, Reheis, Inc., Berkeley Heights, New Jersey; bis zu 2 mg AlOH/Dosis, z.B. ungefähr 1,5 mg AlOH/Dosis). Zusätzliche Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT), QS21 (Aquila), Bay (Bayer) und Polyphosphazen (Virus Research Institute, Cambridge, MA; WO 95/2415).
Die erfindungsgemäßen Vakzin-Zusammensetzungen können über den perkutanen (z.B. intramuskulären, intravenösen oder intraperitonealen) Verabreichungsweg in Mengen und in Kuren verwendet werden, die von dem Fachmann als zweckmäßig erachtet werden. Zum Beispiel können 100 ng bis 500 μg, 1 bis 250 μg oder 10 bis 100 μg Toxoid verabreicht werden. Für die Zwecke einer Prophylaxe oder einer Therapie kann das Vakzin beispielsweise 1-, 2-, 3- oder 4-mal verabreicht werden. Vorzugsweise werden lediglich 1 oder 2 Verabreichungen vorgenommen. Wenn mehrere Dosen verabreicht werden, können zwischen den Dosen beispielsweise eine Woche bis zu einem Monat liegen. Für die Zwecke einer Stimulation von Spendern von C. difficile-Immunglobulin kann eine höhere Anzahl von Dosen verabreicht werden. Beispielsweise können bis zu 6 Dosen verabreicht werden, die voneinander einen Abstand von beispielsweise einer Woche bis zu einem Monat haben.
Wenn eine Impfung durchgeführt wird, um polyklonales Immunglobulin von C. difficile zu erzeugen, z.B. humanes polyklonales Immunglobulin von C. difficile, werden die Serumproben von den immunisierten Spendern zuerst auf das Vorliegen von Toxin A und Toxin B von C. difficile durch eine Analyse mittels eines Enzymgekoppelten Immuno-Assays (ELISA) untersucht. Im Wesentlichen werden ELISA-Platten mit Carbonat/Bicarbonat, pH 8,5 und 1 μg/ml Protein (aufgereinigtes Toxin A oder Toxin B) beschichtet und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Vertiefungen werden mit Serumproben, die in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) verdünnt sind, in Kontakt gebracht, gewaschen und mit einem anti-humanen Antikörper, an dem eine detektierbare Markierung gekoppelt ist, wie eine Alkaline-Phosphatase in Kon takt gebracht. Die Detektion von einem Signal, das mehr als doppelt so stark ist als der Hintergrund, wird als positiv angesehen. Das Signal wird durch eine optische Dichtemessung bei 405 nm detektiert.
Proben, die in dem ELISA-Assay als positiv getestet wurden, werden dann in einem Toxinneutralisierungs-Assay getestet. Dabei werden im Wesentlichen Serumproben (100 μl) zweifach in MEM seriell verdünnt und mit einem gleichen Volumen von Toxin A, das 10 MC₅₀ enthält, für eine Stunde bei 37°C prä-inkubiert. Die Toxin A-Konzentration ist für eine Induktion der Zellen standardisiert. Beispielsweise wird eine 10-mal höhere Konzentration, die auf 50% der Zellen wirkt, für die Induktion verwendet. Der für Toxin A verwendete Bereich beläuft sich auf 10 bis 100 ng. Die Toxin A-/Serumgemische (100 μl) werden dann zu konfluenten IMR90-Zell-Monolayern zugegeben (American Type Culture Collection, (ATCCC, Rockville, Maryland); Torres et al., supra). Die überlagerten Zellen werden für 16 bis 18 Stunden bei 37°C inkubiert und dann auf Cytotoxizität ausgewertet. Wenn mindestens 50% der Zellen von einer Abrundung geschützt sind, werden die Seren als "schützend" eingestuft. Der Wirksamkeitstest für Toxin B wird mit den selben Verfahrenabläufen wie oben für Toxin A beschrieben, durchgeführt, außer dass die Serumproben vor der Bestimmung der Cytotoxizität mit Toxin B in dem IMR90-Zell-Assay prä-inkubiert werden. Die Menge von Toxin B, die eine Wirkung auf 50% der IMR90-Zellen besitzt, beträgt 10 bis 100 pg.
Die oben beschriebenen Screening-Verfahren können auch verwendet werden, um Testpersonen zu identifizieren, die nicht mit C. difficile-Toxoide geimpft worden sind, aber höhere Serumspiegel von Antikörpern als normal gegenüber C. difficile-Toxine aufweisen. Diese Testpersonen stellen taugliche Kandidaten für eine Impfung mit den Toxoiden dar, um C. difficile-Immunglobulin herzustellen.
Wenn ein annehmbarer Spender gefunden worden ist, wird das Immunglobulin von dem Spender unter Verwendung von Standard-Plasmapherese-Verfahren erhalten. Das Immunglobulin wird unter Verwendung von Standard-Verfahren aufgereinigt, beispielsweise durch die Fraktionierung mit kaltem Ethanol nach Cohn oder durch Standard-Chromatographie-Verfahren, Größen-Säulenchromatographie oder Antikörper-Affinitätschromatographie (z.B. indem Protein A verwendet wird). Bis zu zweimal pro Woche wird Vollblut (500 ml bis 1 l) von den Spendern erhalten, das Plasma wird durch Zentrifugation isoliert und die Zellen werden an die Spender zurückgegeben. Vorzugsweise enthält die aufgereinigte Probe alle oder überwiegend IgG, es können jedoch auch Gemische, die beispielsweise IgG, IgA und IgM enthalten, in der Erfindung verwendet werden.
Das C. difficile-Immunglobulin, das wie oben beschrieben hergestellt worden ist, kann perkutan (z.B. intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal) an Patienten verabreicht werden, die eine C. difficile-Infektion haben oder ein Risiko dafür haben, diese zu entwickeln. Diese Patientenpopulationen umfassen z.B. Patienten, die Antibiotika mit einem breiten Spektrum erhalten haben, wie im Krankenhaus eingewiesene ältere Patienten, Bewohner von Altenpflegeheimen, chronisch kranke Patienten, Krebspatienten, AIDS-Patienten, Patienten in Intensivbehandlung und Patienten, die eine Dialysebehandlung erhalten. Das C. difficile-Immunglobulin wird in Mengen verabreicht, die im Bereich von 100 μg/kg bis 100 mg/kg oder 1 bis 50 mg/kg liegen, beispielsweise ungefähr 15 mg/kg, was von dem Spendertiter abhängt: je höher der Neutralisierungstiter des Immunglobulin ist, umso geringer ist die Menge, die verabreicht werden muss. Das Immunglobulin kann z.B. in einer oder in zwei Dosen verabreicht werden. Beispielsweise kann im Falle einer therapeutischen passiven Immunisierung eine Anfangsdosis zur Behandlung verabreicht werden und eine zweite Dosis kann verabreicht werden, um einen Rückfall zu verhindern.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen und der experimentelle Nachweis, der die Erfindung stützt, sind genauer im Folgenden beschrieben.
Vakzinherstellung
Übersicht
Toxin A und Toxin B von C. difficile werden in anaeroben Kulturen von C. difficile, die in Kulturflaschen (10 bis 20 l) wachsen gelassen worden sind, hergestellt. Die Haupt- und Arbeitszellbanken von C. difficile werden von einer lyophilisierten Forschungszellbank hergestellt, die beim ATCC aus dem C. difficile-Stamm ATCC 43255 erzeugt worden ist. Zur Vakzinproduktion werden Toxine durch C. difficile-Kulturen hergestellt, die in Dialyse-Beuteln wachsen gelassen und in Wachstumsmedium suspendiert worden sind. Es werden mehrere Beutelkulturen gepoolt und lebende C. difficile und Sporen werden durch Zentrifugation entfernt, mit einer anschließenden Submicron-Filtration. Das entstehende Filtrat wird konzentriert und diafiltriert, die Toxine werden bei 4°C mit 60% gesättigtem Ammoniumsulfat präzipitiert und die Pellets werden gefroren gelagert. Die Ammoniumsulfat-Pellets werden in Phosphatpuffer erneut gelöst, und auf eine S-300 Sephacryl-Größenaus schluss-Säule aufgetragen. Der Peak, der Toxin A und Toxin B enthält, wird gesammelt und konzentriert (50 bis 60% Toxin, mit einem Verhältnis von Toxin A zu Toxin B von 2:1). Die Toxinherstellung wird dann für 18 Tage mit 4,25 mg/ml Formaldehyd bei 4°C bis 6°C in einer Lösung, die 4,25 mg/ml Lysin enthält, inaktiviert. Nach der Inaktivierung wird die Formaldehydkonzentration durch Diafiltration auf 0,016% zur Verwendung als ein Stabilisator reduziert. Das Endprodukt wird bei einer Konzentration von 2,5 mg/ml in Glasgefäße bei einem Füllvolumen von 0,6 ml gefüllt.
Der derzeitige Prozess ergibt 15 bis 20 mg/l oder 150 bis 200 Dosen des Toxoids. Es wurden Chargenfreisetzungs-Test-Assays zur Identifizierung, Wirksamkeit und Sicherheit von präklinischen Chargen eingesetzt. Es wurden GMP-Haupt- und Produktionszellbanken erzeugt, bestimmt und in einem stabilen Zustand gelagert. Die C. difficile-Toxoid-Vakzinpräparation wird im weiteren Detail wie folgt beschrieben.
Haupt- und Arbeitszellbanken
Es wurde ein Forschungssamen hergestellt und über den Auftrag durch die ATCC durch deren Standardverfahren unter Verwendung einer Ampulle des Stamms ATCC 43255 lyophilisiert. Es wurde Oxoid-verstärktes Clostridium-Medium (RCM) verwendet, um den Samenstock wachsen zu lassen (Oxoid Ltd., Hampshire, England). Die von Rindern stammenden Stoffe in Medien wurden aus Australien, Neuseeland, Holland und von den USA aus gesunden Tieren, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind, erhalten. Die Kulturen wurden in RCM unter Verwendung von 5% Dextran und Trehalose als Konservierungsmittel stabilisiert.
Herstellung einer C. difficile-Hauptzellbank (Master Cell Bank, MCB) und Arbeitszellbank (Working Cell Bank, WCB)
Die MCB von C. difficile wurde hergestellt, indem ein lyophilisiertes Gefäß des Forschungssamenstocks in RCM (die selbe Charge, die von der ATCC verwendet wurde) re-suspendiert und inkubiert wurde, gefolgt von zwei Expansionen in Trypton (0,48%)-Hefeextrakt (0,24%)-Mannitol (0,1%) (TYM)-Medium. Glycerol wurde als Gefrierschutzmittel zugegeben und 250 Aliquote bestehend aus jeweils ~1 ml wurden schockgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Arbeitszellbank wurde auf gleiche Weise hergestellt, indem ein Gefäß des MCB als Inokulum verwendet wurde.
Zellbanktest
Die Haupt- und Arbeitszellbanken wurden auf deren Viabilität, Reinheit, Identität und Toxinexpression getestet. Die Viabilität wurde anhand des Wachstums sowohl auf festem als auch in flüssigem Medium gezeigt. Die Reinheit wurde getestet durch Gram-Färbung und anhand der Kolonie-Morphologie bei anaerober Kultivierung und durch fehlendes aerobes Wachstum. Die C. difficile-Identität wurde durch Gaschromatographie-Analyse von Fettsäuren und durch einen klinischen anaeroben Identitätstest gezeigt. Die Toxinexpression und -Identität wurden bestätigt, indem die Zellbanken in Dialysebeuteln kultiviert wurden und die Kultur auf die Expression von beiden Toxinen durch eine gekreuzte Immunelektrophorese getestet wurde. Die Toxin A-Expression und -Identität wurden auch durch ELISA bestätigt. Die Toxin B-Expression wurde bestätigt, indem auf Cytotoxizität und spezifischer Neutralisierung der Cytotoxizität getestet wurde. Die Toxin-Expression wurde parallel mit ATCC 43255-Standards gemessen und stellte sich als vergleichbar heraus.
Kultur und Toxin-Expression
Toxine werden in anaeroben Kulturen von C. difficile, die in Dialysebeuteln (13 bis 14 000 MW Ausschlussgrenze) wachsen, hergestellt und in einem Medium suspendiert, das eine Stickstoffquelle (z.B. Trypton bei einer Konzentration von 1 bis 100 g/l, 5 bis 20 g/l oder 12 g/l), Hefeextrakt (1 bis 100 g/l, 15 bis 35 g/l oder 24 g/l), Phosphatpuffer, eine Kohlenstoffquelle (z.B. Mannitol (1 bis 50 g/l, z.B. 8 g/l)), Glukose, Glycerol (1 bis 50 g/l, z.B. 4 g/l) oder Mannitol + Glycerol (z.B. in den oben genannten Mengen) enthält. Die Herstellung wird eingeleitet, indem ein Gefäß der Arbeitszellbank in einer kleinen statischen Kultur expandiert wird und indem Aliquote der Kultur verwendet werden, um die Dialysebeutel zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C für ungefähr 5 Tage wurde das Material in dem Beutel geerntet. Das geerntete Produkt wird zentrifugiert und filtriert (0,5 μm gefolgt von 0,2 μm), um vegetative Zellen und Sporen zu entfernen. Das Filtrat wird gewaschen, konzentriert und mit Ammoniumsulfat präzipitiert.
Herstellung von Kultureinheiten
Eine Kultureinheit besteht aus einem 8 Liter- oder 16 Liter-Spinner-Kolben mit zwei Seitenarmanschlüssen, einem Dialysebeutel und einem 1 Liter- oder 2 Liter-Kolben mit Phosphatpuffer. Es werden bis zu 25 8 Liter- oder 16 Liter-Einheiten für jeden Herstellungsgang angeimpft. Die Kultureinheit wird hergestellt, indem Medium in einem Spinner-Kolben gelöst wird, der Dialysebeutel zwischen den Seitenarmanschlüssen aufgeschoben wird, die Enden der Anschlüsse abgedeckt werden und ein Kolben mit 100 mM Phosphatpuffer an einem Anschluss angebracht wird. Die gesamte Einheit wird zur Mediensterilisierung und zur Erzeugung von Anaerobiose autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf unterhalb von 50°C wird der Phosphatpuffer in den Dialysebeutel gepumpt und die Einheit wird über Nacht bei 37°C äquilibriert, vor der Animpfung, während der Wachstumsnährstoffe in den Dialysebeutel diffundieren, was Bedingungen erzeugt, die für das bakterielle Wachstum förderlich sind.
Animpfung und Kultur
Es wird ein Gefäß der Arbeitszellbank aufgetaut und verwendet, um 50 ml von anaerobem TY-Startermedium (Trypton (0,48%) und Hefeextrakt (0,24%)) anzuimpfen. Der Kolben wird in eine anaerobe Kammer bei 37°C für 14 bis 16 Stunden platziert. Es werden ungefähr 2 ml des Inokulums in ein geeignetes Volumen des Verdünnungsmittels zu jedem Dialysebeutel zugegeben. Die Kultureinheiten werden dann zurück in den Inkubator gegeben und für 5 Tage ungestört gelassen. Die Anaerobiose wird nach dem Autoklavieren erhalten, indem eine unnötige Bewegung vermieden wird.
Ernte, Filtration und Präzipitation
Nach der Inkubation werden die Kultureinheiten von dem Inkubator entfernt und die Inhalte der Dialysebeutel werden ausgepumpt, gepoolt und auf deren Kulturreinheit und -identität getestet. Es werden lebensfähige C. difficile-Organismen und Sporen durch Zentrifugation entfernt, gefolgt von einer Filtration über einen Vorfilter mit 0,5 μm und dann über einen Sterilisationsfilter mit 0,2 μm. Das Filtrat wird auf eine Toxin A- und Toxin B-Konzentration sowie auf Sterilität getestet und durch Ultrafiltration mit einem Hohlfasereinsatz mit 30 000 MW Ausschlussgrenze 10-fach konzentriert. Das Filtrat wird mit 25 mM Tris, pH 7,5 gewaschen, was eine Verminderung von Medienbestandteilen mit niedrigem Molekulargewicht bewirkt. Die filtrierte, gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung wird zu dem Konzentrat zugegeben, um eine Endlösung mit 60% Sättigung zu ergeben. Die Lösung wird bei 4°C für 48 Stunden oder länger inkubiert und das Toxin-enthaltende Präzipitat wird durch Zentrifugation geerntet und der Überstand dekantiert. Das Ammoniumsulfat-Pellet wird bei –10°C oder kälter gefroren gelagert, bis es weiter verarbeitet wird.
Aufreinigung und Inaktivierung
Das Pellet wird aufgetaut, indem es mit 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, bei Raumtemperatur gemischt wird. Das gelöste Toxin wird durch Zentrifugation geklärt und unter Verwendung eines Filters mit 0,45 μm filtriert. Das geklärte Material wird dann auf einer hochauflösenden Sephacryl S-30-Gelfiltrationssäule fraktioniert (Pharmacia Biotechnology). Ein typisches chromatographisches Profil ist in 1 gezeigt. Der Toxin-Peak wird gesammelt und auf 5,0 ± 0,5 mg/ml konzentriert. Die Sammlung beginnt mit dem aufsteigenden Ast des Toxin-Peaks und wird bis zu dem Wendepunkt auf dem absteigenden Ast weitergeführt, was visuell anhand des Chromatogramms bestimmt werden kann.
Nach der Aufreinigung wird die Toxinlösung für 18 Tage bei 4 bis 6°C unter Verwendung von 4,25 mg/ml Formaldehyd inaktiviert. Die Inaktivierung wird bei einem pH von 7,0 ± 0,2 in 100 mM Phosphatpuffer, der 4,25 mg/ml Lysinhydrochlorid enthält, durchgeführt. Der Inaktivierungszeitraum wird so bemessen, dass er dreimal den Zeitraum übersteigt, der erforderlich ist, damit keine Letalität in Mäusen vorhanden ist. Daher zeigt bis zum Tag 6 der Inaktivierung eine intraperitoneale Inokulation mit 0,5 mg Toxoid keine Letalität oder Gewichtsveränderung in Mäusen. Dies entspricht einer Verringerung bei dem Cytotoxizitätstiter in IMR90-Zellen von ungefähr 6 log₁₀. Nach 18 Tagen Inaktivierung ist die biologische Aktivität typischerweise um 2 bis 3 Größenordnungen bis zu einem Gesamtinaktivierungsgrad von 8 bis 9 log₁₀ verringert, was anhand der Wirkungen auf IMR90-Zellen beurteilt werden kann.
Nach einer 18tägigen Inaktivierung wird das inaktivierte Toxin in Puffer gewechselt, in 50 mM Phosphat, 100 mM NaCl, pH 7,4, was die Formaldehydkonzentration auf 0,16 ± 0,04 mg/ml verringert. Das lösliche, inaktivierte Toxin wird bei 2,5 mg/ml sterilfiltriert und in 2 ml Typ I-Borsolicat-Glasgefäße mit grauen Butylkunststoffverschlüssen gefüllt.
Untersuchungen, welche die Inaktivierungsbedingungen und Formulierung stützen

Es wurden intensive Untersuchungen durchgeführt, um die optimalen Bedingungen für eine Toxin-Inaktivierung mit Formaldehyd festzustellen. Um den Verlust der biologischen Aktivität zu verfolgen, wurde in diesen Untersuchungen das IMR90-Gewebekultursystem eingesetzt, was einen hochsensitiven Indikator der biologischen Aktivität von C. difficile-Toxin darstellt (Torres et al., supra). Die untersuchten Parameter umfassten die Konzentration von Formaldehyd und Toxin, die Puffer-Zusammensetzung, pH, Zeit, Temperatur und die Wirkung von zugegebenem L-Lysin, das gebildet wurde, um eine vollständige Toxoid-Erfassung zu ermöglichen (Tabelle 1). Tabelle 1: getestete Parameter

Parameter	Getesteter Bereich
PH	6,5; 7,0; 7,4; 8,0
Temperatur (°C)	5; 14; 28; 37
Toxin-Konzentration (mg/ml)	1; 5
Formaldehyd-Konzentration (mg/ml)	0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 4,25; 10; 15; 20
Lysin-HCl-Konzentration (mg/ml)	1; 2; 4,25

Im Allgemeinen waren C. difficile-Toxine gegenüber einer Inaktivierung bei 37°C bei allen Bedingungen sehr empfindlich, wobei die Inaktivierung extrem schnell vonstatten ging (z.B. Verlust von 7 log₁₀ der Aktivität in 8 Stunden). Um die Kontrolle und Reproduzierbarkeit der Inaktivierung zu maximieren, wählten wir daher eine Inaktivierung bei 4°C. Toxoide, die bei 4°C inaktiviert wurden, induzierten höhere Antikörpertiter als Toxoide, die mit Formaldehyd bei 37°C inaktiviert wurden. Unter diesen spezifischen ausgewählten Bedingungen tritt ein vollständiger Verlust der nachweisbaren biologischen Aktivität in vivo innerhalb von sechs Tagen der Inaktivierung auf, was einem Verlust von ungefähr 5 bis 6 log₁₀ in vitro entspricht. Um einen ausreichenden Sicherheitsrahmen bereitzustellen, wird die Inaktivierung für zusätzliche 12 Tage fortgeführt, während denen weitere 2 bis 3 log₁₀ der Cytotoxizität verloren gehen. Am Ende der Inaktivierungsperiode ist die Aktivität in dem Zellkultursystem bei der Nachweisschwelle kaum mehr nachweisbar. Die Kinetiken für eine typische Inaktivierung sind in 2 gezeigt.
Es sind niedrige Konzentrationen von Formalin in der Formulierung des Vakzins eingeschlossen, um eine Toxoid-Reversion zu verhindern. Es wurde eine Reversion nachgewiesen, obwohl Lys in die Aktivierungsstelle eingebaut worden ist, was dafür bekannt ist, eine Reversion mit anderen Toxinen zu verringern (Relyveld, Prog. Immunobiol. Stand. 3: 258, 1969). Die Wahl der Formulierung basiert auf zahlreichen Untersuchungen, die durchgeführt wurden, um die Stabilität des Toxoids ein schließlich der Möglichkeit einer Reversion unter verschiedenen Bedingungen zu bestimmen. Im Allgemeinen war das Toxoid bei 4°C stabil, mit oder ohne niedrigen Konzentrationen von restlichem Formalin. Wenn restliches Formalin nicht vorhanden ist, fand eine partielle Reversion bei höheren Temperaturen statt (28 bis 37°C), wobei das Toxoid eine detektierbare biologische Aktivität über Tage bis Wochen wie dererlangte (Tabelle 2). Tabelle 2: Partielle Reversion des C. difficile-Toxoids in der Abwesenheit von Formalin

* geschätzte Daten

Wie erwähnt, wurde nur eine partielle Reversion nachgewiesen, selbst bei einem Aussetzen gegenüber optimalen Reversionsbedingungen (37°C) für längere Zeiträume (über zwei Monate). Nach dieser Zeit konnte man eine Wiedererlangung von ungefähr 5 log₁₀ der ursprünglich inaktivierten 8 bis 9 log₁₀ feststellen.
Eine Reversion wurde vollständig bei allen Temperaturen verhindert, wenn Formalin bei Konzentrationen von 0,010% oder höher enthalten war (Tabelle 3). Daher wurde bei den Beschreibungen des formulierten Toxoid-Vakzins darauf geachtet, dass eine Formalin-Konzentration von 0,012 bis 0,020% sichergestellt wird.
Tabelle 3: Vorbeugung einer Reversion durch niedrige Formalin-Konzentrationen
Charakterisierung von C. difficile-Toxin (vor der Inaktivierung)
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die partiell aufgereinigte Toxinpräparation nach einer Größenausschlusschromatographie und vor einer Formaldehydbehandlung zu charakterisieren. Toxin A und Toxin B sind nicht gut in einer Tris-Glycin-reduzierenden SDS-PAGE auftrennbar. Jedoch kann das Gesamttoxin (Toxin A und Toxin B) durch ein densitometrisches Durchmustern von Coomassiegefärbten, Tris-Glycin-reduzierenden SDS-PAGE-Gelen abgeschätzt werden. Das Gesamttoxin macht ungefähr 50 bis 60% des Gesamtproteins aus. Immunoblots von diesen reduzierenden Gelen zeigen eine reaktive Antitoxin A-Hauptbande und eine reaktive Antitoxin B-Haupt- und mehrere Antitoxin B-Nebenbanden.
Wir haben eine Identifizierung der hauptsächlich vorkommenden Unreinheiten in dem Vakzin durchgeführt. SDS-PAGE-Gele wurden mit einer aufgereinigten Toxin-Masse geladen und die Proteine wurden unter reduzierenden SDS-PAGE-Bedingungen aufgetrennt. Das Gel wurde knapp unterhalb des vorgefärbten 244 kDa-Markers geschnitten, um die Toxin-Bande abzuschneiden. Die Proteine unterhalb der Toxin-Bande wurden dann auf eine PVDF-Membran überführt und einer Aminosäuresequenzierung für einen Homologievergleich mit Sequenzdatenbanken unterzogen. Anhand der N-terminalen Sequenzierung mit 18 bis 25 Zyklen haben wir die Unreinheit mit 35 kDa als 3-Hydroxybutryl-CoA-Dehydrogenase von C. difficile und die Unreinheit bei 45 bis 47 kDa als Glutamat-Dehydrogenase von C. difficile und das Protein mit 60 bis 70 kDa als ein Homolog von groEL oder der bakteriellen hsp60-Proteinfamilie (~70% Homologie) identifiziert.
Eine gute Auftrennung von Toxin A- und Toxin B-Proteinen wird unter Verwendung von nativen PAGE-Gelen erreicht, was anhand von Western-Blots mit Antitoxin A- und Antitoxin B-Antikörpern bestätigt worden ist. Wie bei den reduzierenden Gelen wurde eine Anzahl von reaktiven Antitoxin B-Banden mit niedrigem Molekulargewicht festgestellt.
Toxin A kann auch von Toxin B aufgetrennt werden, indem eine Ionenaustauscher-HPLC als eine DEAE-5PW-Säule verwendet wird. Das Toxin A/Toxin B-Verhältnis beträgt ungefähr 2,2, was durch ELISA gemessen worden ist, und ungefähr 1,9, was durch eine Ionenaustauschchromatographie gemessen worden ist.
Alum-adsorbiertes Toxoid-Vakzin
Wir stellen Alum her für eine Toxoid-Adsorption von kommerziell erhältlichem sterilen Rehydragel LV^®, das 20 mg/ml Alumiumoxid enthält (Reheis, Inc., Berkeley Heights, New Jersey). Dieses Material wird als erstes auf 3 mg/ml Aluminiumoxid mit 50 mM Phosphatpuffer bei einem pH von 7,4, 100 mM NaCl, 100 mg/ml Formaldehyd verdünnt. Das verdünnte Alum wird aseptisch in sterile, pyrogenfreie Glasgefäße mit 10 ml Kapazität mit grauen Butylkunststoffstopper unter Klasse 100-Bedingungen gefüllt.
Identifizierung von Kandidaten für eine Impfung, um C. difficile-Immunglobulin-Spender hervorzubringen
Wie oben diskutiert, können C. difficile-Immunglobulin-Spender durch eine perkutane Verabreichung des Toxoid-Vakzins von C. difficile hervorgebracht werden. Bevorzugte Kandidaten zur Impfung sind Testpersonen, die bereits neutralisierende Antikörper des C. difficile-Toxoids besitzen. Diese Spender sind dem Toxin ausgesetzt worden und würden geringere Booster-Dosen benötigen, um verwendbare Titer zu erreichen. Wir haben 9 kommerzielle Chargen von intravenösem Immunglobulin getestet und haben bei diesen festgestellt, dass sie sehr niedrige Spiegel von neutralisierenden Antikörpern gegen Toxin A und Toxin B von C. difficile enthalten. Die Antitoxin-Titer in diesen Präparationen betragen < 1:50 für beide Toxine, wobei der Titer für Toxin B höher ist als der von Toxin A. Wir führten auch eine Erfassung von 100 professionellen Plasmaspendern von einem Zentrum in Nevada durch. Die Ergebnisse zeigen, dass 2% und 13% dieser Individuen neutralisierende Antikörper gegen Antitoxin A bzw. Antitoxin B besitzen, allerdings bei nur sehr niedrigem Titer. Diese Daten zeigen, dass eine Auswahl des Plasmas von nicht-stimulierten, seropositiven Plasmaspendern für den Zweck der Herstellung von humanem Hyperimmun-Antitoxin zur Behandlung von C. difficile nicht effektiv sein würde und dass es notwendig ist, Spender durch eine Immunisierung mit einem Toxoid-Vakzin zu stimulieren, um ein therapeutisches humanes Immunglobulin herzustellen.
Tabelle 4: Antitoxin-Antikörper-Spiegel in Plasmaspendern (n = 100)
Präklinische Beurteilung von aktiven und passiven Immunisierungsverfahren
Aktive Immunisierung von Mäusen
Gruppen aus 8 weiblichen "Swiss Webster"-Mäusen wurden intraperitoneal (IP) mit 2 Dosen von Alum-adsorbiertem Toxoid-Vakzin mit einem Abstand von einer Woche immunisiert. Das Toxoid wurde an Alum adsorbiert, um der humanen Formulierung gleichzukommen (Verhältnis von 0,144 mg Protein pro mg Aluminium). Die Dosen wurden über einen Bereich von 10-fachen Verdünnungen von adsorbiertem Vakzin verabreicht. Die Tiere erhielten Dosen mit 4 unterschiedlichen Toxoid-Chargen zum Vergleich der Immunogenität: eine Forschungscharge (Charge 27 bis 33) und drei Vakzin-Chargen (Chargen 133, 135 und 144), hergestellt nach dem Verfahren zur Herstellung des klinischen Produkts. Eine Woche nach der zweiten Immunisierung wurden die Seren auf deren Gesamtantikörpergehalt durch ELISA getestet und auf Antikörper gegen Toxin A und Toxin B durch eine Cytotoxizitätsneutralisierung. In dem Cytotoxizitätsneutralisierungs-Assay werden Toxine (10 × MC₅₀) mit zweifachen Antikörperverdünnungen für eine Stunde bei 37°C inkubiert und dann auf Monolayer-Kulturen aus IMR90-Zellen angeimpft. Der Neutralisierungstiter wird ausgedrückt als die höchste Antikörperverdünnung, die 50% der Zellen vor einer Abrundung schützt.
Die ELISA-Daten zeigen, dass sich die Antitoxin-Immunität in einer dosisabhängigen Weise entwickelt. Toxin A erscheint geringfügig immunogener zu sein als Toxin B, wenn der Grad der Antwort auf eine bestimmte Verdünnung des Toxoids verglichen wird. Das Toxoid brachte auch neutralisierende Antikörperantworten hervor. Die Toxoid-Dosis, die zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern erforderlich ist, die Zellen vor einer Abrundung schützen, ist für Toxin B höher als für Toxin A, was auch die höhere Immunogenität von Toxin A in Mäusen zeigt.
Zum Bestimmen, ob ein Toxoid-Vakzin Mäuse gegen die letalen Wirkungen der Toxine A und B schützt, wurden Gruppen von Mäusen intraperitoneal mit zwei wöchentlichen Vakzindosen immunisiert. Sie wurden dann mit 5 LD₅₀ Toxin A (100 ng, IP) oder Toxin B (200 ng, IV) induziert. Die Tiere wurden auf Krankheit und Ableben für 14 Tage beobachtet. Nicht-immunisierte Tiere starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Induktion.
Die Ergebnisse zeigten, dass Mäuse gegenüber Toxin A geschützt waren bei einer Dosis von adsorbiertem Toxoid, die > 50 ng Protein enthielt, und die Mäuse waren gegenüber Toxin B bei einer Dosis von > 5 mg geschützt. Wie in dem oben beschrie benen Immunogenitätsexperiment war Toxin A bei einer Dosis schützend, die 10- bis 100-fach geringer war als die, die für einen Schutz von Tieren gegenüber einer Toxin B-Induktion erforderlich ist.
Die Wirkung von Alum auf die Immunogenität des Toxoids wurde in Mäusen getestet. Gruppen aus 10 Tieren wurden mit drei wöchentlichen Dosen von löslichem Toxoid oder Toxoid, das an Alum adsorbiert war, intraperitoneal immunisiert. Alum-Adsorptionen wurden unmittelbar vor der Dosierung durchgeführt, indem 0,144 mg Toxoid-Protein pro mg Aluminium gemischt wurden. Die Tiere erhielten 10 μg Toxoid alleine oder 10 μg Toxoid, das an Alum adsorbiert war. Antitoxin-Immunantworten wurden durch ELISA und einer Cytotoxizitätsneutralisierung in Serumproben gemessen. Die Gesamtantikörpertiter, die durch ELISA bestimmt wurden, waren vergleichbar mit denen des löslichen Toxoids und des mit Alum adsorbierten Toxoids. Die Titer der neutralisierenden Antikörper gegen beide Toxine waren höher in Gruppen, die Alum-adsorbiertes Toxoid erhielten.
Mäuse sind sehr empfindlich gegenüber parenteral verabreichtes gereinigtes Toxin A und Toxin B und können daher verwendet werden, um eine Toxoid-Inaktivierung zu beobachten. Der LD₅₀ von gereinigtem Toxin A und Toxin B, der individuell getestet worden ist, beträgt ungefähr 50 ng. Die partiell gereinigte Toxin-Präparation hat vor der Inaktivierung einen LD₅₀ von weniger als 20 ng Gesamtprotein, was ungefähr 4 bis 8 ng von jedem Toxin entspricht, was nahe legt, dass die Toxine in synergistischer Weise agieren können, wenn sie zusammen verabreicht werden.
Nach einer Inaktivierung mit Formalin wird keine Toxizität in Mäusen beobachtet, wenn die Tiere die höchsten Dosen des inaktivierten Toxoids, das verabreicht worden ist, das 1,25 mg Gesamtprotein enthält, was ungefähr 500 mg von Toxin A-Toxoid und 250 μg von Toxin B-Toxoid entspricht, erhalten. Diese Daten zeigen eine minimale Verringerung bei der Letalität um mehr als das 6,25 × 10⁴-fache. Der tatsächliche Inaktivierungsgrad beträgt mindestens 8 Größenordnungen, was durch sensitivere Gewebekultur-Assays bestimmt werden kann. Das Toxoid (0,5 mg) wird typischerweise vollständig an den Tagen 5 bis 6 toleriert. Die Inaktivierung wird nach einem Zeitraum, der dreimal so lang ist wie die Inaktivierung, die erforderlich ist, damit keine Letalität in Mäusen nach einer intraperitonealen Induktion mit 0,5 mg auftritt, gestoppt.
Da eine Impfung die Maus von den biologischen Wirkungen von Toxin A und Toxin B schützt, wurden solche Mausmodelle angepasst, um als grundlegender Wirksamkeits-Assay für das hergestellte Toxoid-Vakzin zu dienen. In diesem Assay werden Mäuse immunisiert und dann ausgeblutet, um Serum zu gewinnen, das auf eine Toxinneutralisierungsaktivität in vitro in dem IMR90-Gewebekultursystem getestet wird.
Um diesen Assay einzusetzen, bestimmten wir zuerst, dass ein Schutz in Mäusen mit einer Neutralisierungsaktivität in vitro korreliert, was in dem IMR90-System gemessen worden ist. Vier Chargen des Toxoid-Vakzins wurden verwendet, um Mäuse intraperitoneal mit zwei wöchentlichen Dosen anzuimpfen. Das Toxoid wurde wie oben beschrieben an Alum adsorbiert und über einen Bereich von 10-fach-Dosen getestet. Die Tiere wurden sieben Tage nach der zweiten Vakzin-Dosis ausgeblutet und die Seren von den einzelnen Mäusen wurden auf deren Fähigkeit getestet, die Wirkungen der Toxine A und B auf IMR90-Zellen zu neutralisieren. Es wurde den Tieren ermöglicht, sich für vier Tage zu erholen und dann wurden sie mit letalen Dosen entweder mit Toxin A oder Toxin B induziert. Die Korrelation der Titer von neutralisierenden Antikörpern und dem Überleben nach der Induktion mit beiden Toxinen war hoch signifikant (p < 0,0001 durch den Wilcoxon-Rang-Summen-Test).
Aktive Immunisierung von Hamstern
Der Hamster stellt ein hervorragendes Modell einer C. difficile-Infektion dar, da diese Spezies gegenüber den Wirkungen von Toxin A und Toxin B hoch empfindlich ist. Nach einer Einzeldosis von Clindamycin in der Gegenwart von C. difficile sterben die Hamster innerhalb von zwei bis drei Tagen mit einer fulminanten Diarrhöe und einer hemorrhagischen Cecitis. Hamster, die mit dem Toxoid-Vakzin intramuskulär immunisiert worden sind, sind vor einem Ableben und Diarrhöe geschützt, wenn sie anschließend mit C. difficile induziert werden. Diese Immunisierungsroute induziert Serumantikörper (IgG), aber induziert nicht detektierbare Mukosa-Antikörper, was darauf hinweist, dass hohe Titer von IgG vor der Darmkrankheit, die durch C. difficile verursacht wurde, schützen können.
Um den Grad des Schutzes vor einem Leben und Diarrhöe zu quantifizieren, wurden Gruppen von Hamstern intramuskulär an den Tagen 0, 14 und 21 mit ungefähr 100 μg Toxoid (A und B) in Lösung (n = 15) oder Placebo (n = 10) geimpft. Zwei Wochen nach der Enddosis wurden Hamster intrangastrikal (IG) mit 1,0 mg Clindamycin gefolgt von 1 × 10⁵ C. difficile (ATCC-Stamm 43255) induziert. Die Tiere wurden hinsichtlich Gewichtsverlust, Diarrhöe und Überleben für 14 Tage nach der Induktion beobachtet (3). Hamster, die mit Toxoid-Vakzin immunisiert worden sind, waren vor einem Ableben (p ≥ 0,0001) und Diarrhöe (p = 0,0057) geschützt, im Vergleich zu Schein-immunisierten Kontrollen (4). Wenn Seren von jedem individuellen Tier analysiert wurden, lagen Toxin-neutralisierende Antikörperspiegel vor und korrelierten mit dem Schutz.
Passive Immunisierung in Hamstern und Mäusen
Experimente in zwei Tiermodellen bestätigen die therapeutische Wirksamkeit einer passiven Immunisierung. Die Behandlung mit Toxin-neutralisierenden Antikörperpräparationen schützen Mäuse vor einer letalen Induktion. Unter Einsatz des oben beschriebenen Clindamycin-Induktionsmodells wurde bei Hamster, denen Toxinneutralisierende Antikörper verabreicht wurden, gezeigt, dass sie vor einem Ableben und Diarrhöe geschützt sind. Hamster, die Diarrhöe entwickeln, können durch eine parenterale Verabreichung von Toxin-neutralisierenden Antikörpern geheilt werden. Eine protektive therapeutische Aktivität von passiv verabreichten Antikörpern ist dosisabhängig und korreliert mit Serumspiegeln von passiven neutralisierenden Antikörpern, die in Tieren erreicht werden, die mit der Antikörper-enthaltenden Präparation behandelt worden sind.
Passiver Schutz von Mäusen gegenüber einer letalen Induktion
Um die schützende Kapazität von Toxin-neutralisierenden Antikörpern zu testen, wurde Mäusen hyperimmunes Bauchwasser der Maus, das Antikörper gegen Toxin A und Toxin B enthält, über die intraperitoneale (IP) Route verabreicht und dann mit Toxin A oder Toxin B induziert. Die Mäuse erhielten eine Einzeldosis gepoolten Bauchwassers bei Dosen von 100, 10 oder 1 μl und wurden täglich geblutet, um den Spiegel von neutralisierenden Antikörpern, der passiv aus dem Serum erhalten wurde, zu bestimmen. Die Tiere wurden dann mit Toxin A (5 × LD₅₀ IP) oder Toxin B (5 × LD₅₀ IV) induziert und für sieben Tage beobachtet. Eine direkte Verabreichung von Toxin A und Toxin B führt zu einem Ableben der Mäuse. Die 100 μl-Dosis des Bauchwassers schützte 60% der Tiere gegenüber einer Toxin A- und 80% der Tiere gegenüber einer Toxin B-Letalität. Die Mäuse waren vor einer Toxin A-Induktion für bis zu 23 Tage nach einer Antikörperverabreichung geschützt. Die Antikörper mussten innerhalb von 30 Minuten einer Toxin-Injektion verabreicht werden, um diesen Grad des Schutzes gegen eine Letalität zu erhalten. Labormessungen zeigten, dass alle überlebenden Tiere reziproke Serumneutralisierungstiter von ≥ 200 aufwiesen als ein Ergebnis der Infusion mit Bauchwasser. Die Halbwertszeit von Toxin-neutralisierenden Antikörpern wurde unter den Bedingungen der Untersuchung auf zwei Wochen geschätzt.
Passiver Schutz von Hamstern nach einer Clindamycin-Induktion
Gruppen von weiblichen Hamstern wurde eine Einzeldosis von Hyperimmun-Maus-Bauchwasserflüssigkeit IP verabreicht. Es wurden abgestufte Dosen verabreicht (6, 2, 0,6 oder 0,2 ml Bauchwasser pro Tier). Bauchwasser von nicht-immunisierten Mäusen diente als eine Negativkontrolle. Tiere wurden geblutet, um die passiven Antikörperserumspiegel am Tag nach der Verabreichung des Bauchwassers zu messen und wurden zwei Tage später mit Clindamycin induziert. Die Tiere wurden für 3 Wochen nach der Induktion hinsichtlich Überleben, Diarrhöe und Gewichtsverlust beobachtet (5). Ein Schutz gegen Ableben wurde in den Gruppen mit den drei höchsten Dosen erreicht und ein Schutz gegen ein Ableben und Diarrhöe wurde in Tieren beobachtet, die die höchste Antikörperdosis erhielten (6). Die Spiegel der neutralisierenden Antikörper korrelierten mit einem Schutz gegen ein Ableben und Diarrhöe. Vollständig geschützte Tiere besaßen reziproke Serum-neutalisierende Antikörper von ~800, wobei der am wenigsten wirksame Titer 200 war. Die Halbwertszeit der neutralisierenden Antikörper in Hamsterserum wurde bei dieser Untersuchung auf 14 Tage geschätzt.
Behandlung von Diarrhöe in Hamstern unter Verwendung von neutralisierenden Antikörpern
Das Hamstermodell der Antibiotika-assoziierten Diarrhöe ist für die Bewertung von prophylaktischen Strategien gegen C. difficile verwendbar. Jedoch ist eine C. difficile-Erkrankung in Hamstern mit akuter Cititis sehr schwer und ein Ableben erfolgt sehr schnell nach einer Clindamycin-Induktion. Die Schwere der Infektion kann verringert werden, indem eine vorbestimmte Menge von neutralisierenden Antikörpern gegen Toxin A und Toxin B verabreicht wird, die so bemessen ist, dass sie vor einem Ableben aber nicht vor einer Diarrhöe schützt. Die Dosis, die ein Ableben aber keine Diarrhöe schützt, wurde in Dosisbereichexperimenten bestimmt. Während des Zeitraums, in dem die Tiere Diarrhöe hatten, könnten zusätzliche neutralisierende Antikörper die Diarrhöe auflösen. Tieren, denen Bauchwasser von nicht-immunisierten Tieren verabreicht worden ist, litten weiter an Diarrhöe und die. meisten von ihnen starben schließlich. Behandelte Tiere erholten sich von einer Diarrhöe innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung ohne Rückfall. Das experimentelle Design und das Ergebnis auf die Diarrhöe sind in den 7 und 8 gezeigt. Dieses Experiment zeigt, dass Toxin-neutralisierende Antikörper verwendet werden können, um eine C. difficile-assoziierte Diarrhöe zu behandeln. Die Erholung erfolgte schnell.
Immunigenität von Toxoid-Vakzin in nicht-menschlichen Primaten
Neutralisierende Antikörper gegen Toxin A und Toxin B wurden in Rhesusaffen nach einer Immunisierung mit unserem Toxoid-Vakzin induziert. Gruppen von drei Tieren wurde ein flüssiges Vakzin verabreicht, wobei entweder das Vakzin an Alum oder einem Placebo adsorbiert war. Die Untersuchung wurde so angelegt, dass die Fähigkeit des Vakzins den hohen Titer von neutralisierenden Antikörpern in nicht-humanen Primaten zu erhöhen, gezeigt werden konnte. Placebo-Kontrollen wurden primär für Sicherheitsvergleiche eingeschlossen. Die Tiere erhielten 5 Dosen von Vakzin (110 μg) in Lösung, das an Alum oder einem Placebo adsorbiert war. Das Vakzin wurde an den Tagen 0, 8, 29, 65 und 118 in einem Volumen von 0,5 ml über die intramuskuläre Route im Glutealbereich verabreicht. Die Immunantwort und die klinische Pathologie wurden beobachtet (9). Es wurde keine schädliche Pathologie oder Empfindlichkeiten nach den verabreichten 5 Dosen festgestellt. Alle immunisierten Tiere reagierten sowohl mit bindenden als auch neutralisierenden Antikörpern. Es waren mehrere Vakzindosen erforderlich, um signifikante neutralisierende Antikörper zu induzieren; eine Booster-Dosis an den Tagen 65 und 118 erhöhte die Spiegel der neutralisierenden Antikörper weiter. Alum-adsorbiertes Vakzin induzierte schnellere und höhere Antworten in einigen Tieren (10). Die Untersuchungen zeigten die Durchführbarkeit von induzierenden Spiegeln von neutralisierenden Vakzin-induzierten Antikörpern, die für eine Verarbeitung in eine Immunglobulin-Präparation geeignet sind und zeigten die Fähigkeit von Booster-Dosen in initiierten Tieren zur Auslösung von hohen Titern von schützenden Antikörpern. Dieses Experiment zeigt auch, dass eine Hyperimmunisierung mit mehreren Booster-Dosen von Toxoid in nicht-menschlichen Primaten sicher war.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung fallen innerhalb der folgenden Patentansprüche.

Claims

Verwendung von humanem Toxin-neutralisierenden polyklonalen Immunglobulin von Clostridium difficile für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Clostridium difficile-Infektion in einem humanen Patienten durch perkutane Verabreichung, wobei das polyklonale Immunglobulin ein polyklonales Hyperimmun-Serum ist, das aus Menschen, die mit Toxoiden aus C. difficile geimpft wurden, gewonnen wurde und das Antikörper enthält, die die Cytotoxizität und in-vivo-Wirkungen von Toxin A und Toxin B neutralisieren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei 0,01–100 mg/kg Körpergewicht des Toxin-neutralisierenden polyklonalen Immunglobulins von Clostridium difficile an den humanen Patienten verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 1, weiter umfassend die Verwendung eines Clostridium-Toxins oder eines Toxoids für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Clostridium difficile-Infektion in einem humanen Patienten durch perkutane Verabreichung.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die perkutane Verabreichung intramuskulär, intravenös oder subkutan erfolgt.
Verwendung eines humanen Toxin-neutralisierenden polyklonalen Antikörpers für ein Clostridium difficile-Toxin oder -Toxoid für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung von Clostridium difficile-Infektion in einem humanen Patienten durch perkutane Verabreichung, wobei der Toxin-neutralisierende Antikörper ein polyklonales Hyperimmun-Serum ist, das aus Menschen, die mit Toxoiden aus C. difficile geimpft wurden, gewonnen wurde und der die Cytotoxizität und in-vivo-Wirkungen von Toxin A und Toxin B neutralisiert.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Antikörper ein Toxin-neutralisierendes polyklonales Immunglobulin von Clostridium difficile ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei 0,01–100 mg/kg Körpergewicht des Toxin-neutralisierenden polyklonalen Immunglobulins von Clostridium difficile an den humanen Patienten verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 5, weiter umfassend die Verwendung eines Clostridium-Toxins oder eines Toxoids für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung von Clostridium difficile-Infektion in einem humanen Patienten durch perkutane Verabreichung.
Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 8, wobei die perkutane Verabreichung intramuskulär, intravenös oder subkutan erfolgt.