DE69624726T2

DE69624726T2 - Chitosan-impfstoff-zusammensetzungen zur intranasalen verabreichung und anwendungen

Info

Publication number: DE69624726T2
Application number: DE69624726T
Authority: DE
Inventors: Lisbeth Illum
Original assignee: West Pharmaceutical Services Drug Delivery and Clinical Research Center Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Services Ltd
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2003-09-18
Anticipated expiration: 2016-12-10
Also published as: NZ323973A; ES2186809T3; US6391318B1; CA2237529A1; CA2237529C; NO982497L; JP4063876B2; AU1102597A; ATE227134T1; DE69624726D1; US7323183B2; NO323084B1; GB2322801A; EP0865297B1; AU705452B2; GB9811810D0; EP0865297A1; NO982497D0; GB2322801B; US20030039665A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoffzusammensetzung für eine intranasale Verabreichung, wobei diese Zusammensetzung ein oder mehrere Antigene und einen wirksamen Hilfsstoff bzw. ein wirksames Adjuvans umfaßt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Immunisierung eines Säugetieres oder Menschen gegen Krankheiten durch Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an das Säugetier oder den Menschen, Verfahren zur Verstärkung der Immunogenizität von intranasal verabreichten Antigenen und die Verwendung von Antigenen in Verbindung mit einem Hilfsstoff für die Herstellung einer Impfstoff-Zusammensetzung für eine intranasale Verabreichung zum Immunisieren eines Säugetieres oder Menschen gegen spezielle Erkrankungen.
Impfstoffe sind Zubereitungen von Antigen-Materialien, die Empfängern unter dem Gesichtspunkt verabreicht werden, ihre Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion dadurch zu erhöhen, daß eine aktive Immunität gegen spezifische Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien oder Viren induziert wird.
Impfstoffe, die eine einzelne Komponente oder mehrere Komponenten umfassende Impfstoffe sein können, werden in einer Vielzahl von Formen angeboten. Beispielsweise bestehen zur Zeit gängige Influenza-Impfstoffe entweder aus einem deaktivierten ganzen Virus, Virenbruchstücken (gesplittete Impfstoffe) oder gereinigten Zubereitungen von Antigenpoteinen.
Impfstoffe werden typischerweise parenteral durch Injektionen verabreicht. Es ist bekannt, daß herkömmliche, parenterale Immunisierungen eine Reihe von Nachteilen aufweisen. Beispielsweise haben viele Personen eine natürliche Furcht vor Injektionen und können in Folge hiervon ein psychologisches Unwohlbefinden erfahren. Darüberhinaus finden viele Personen Injektionen physisch unangenehm. Weiterhin ist eine parenterale Impfung (zum Beispiel intramuskulär, subkutan usw.) keine wirksame Methode um eine örtliche Antikörper-Produktion hervorzurufen, wenn zuvor keine lokale Exposition stattgefunden hat (beispielsweise durch eine Infektion).
Ein wirksames lokales und/oder aktuelles Verabreichungsverfahren ist daher wünschenswert.
Im Fall mancher Erkrankungen wäre es vorteilhaft, das Schleimhaut-Immunsystem zu stimulieren. Zu diesem Zweck muß der Impfstoff aktuell an eine Schleimhaut-Oberfläche verabreicht werden. Daher wäre es in gewissen Fällen (zum Beispiel im Fall von Infektionen des oberen Atmungstraktes) vorteilhaft, eine wirksamere Stimulation des örtlichen Schleimhaut-Immunsystems des Atmungstraktes zu erzielen.
Demgemäß wurde eine Reihe von Versuchen unternommen, Schleimhaut-Impfstoffe zu entwickeln. Ein Nachteil ist jedoch, dass deaktivierte Impfstoffe häufig nur eine geringe Immunogenizität besitzen, wenn sie über eine Schleimhaut verabreicht werden. Zur Überwindung dieses Problems haben eine Reihe von Versuchen zur Verbesserung der Immunogenizität von oral oder intranasal verabreichten Impfstoffen die Verwendung von Hilfsmitteln (siehe unten), die Einkapselung der Impfstoffe in eine Vielzahl von Mikrokügelchen und die Verwendung von lebenden abgeschwächten Stämmen umfasst.
Es wurde gezeigt, dass gewisse Hilfsstoffe dann, wenn sie gleichzeitig mit Impfstoff-Antigenen verabreicht werden, die Wirksamkeit der Impfstoffzusammensetzung dadurch weiterhin steigern, dass sie die Immunreaktion stimulieren (siehe z. B. Hibbered et al. Ann. Intern. Med., 110, 955, 1989). Beispiele von Hilfsstoffen, von denen gezeigt wurde, dass sie wirksam sind, umfassen Interferon Alpha, Klebsiella Pneumoniae, Glycoprotein und Interleukin-2.
Verschiedene intranasale Zubereitungen, die Antigene sowie auch andere Bestandteile umfassen, von denen sich gezeigt hat, dass sie die Immunantwort verstärken, sind in Vaccine, 12, 1994, Seite 1255, Vaccine, 13, 1995, Seite 155 und in FEMS Microbiology Letters, 107, 1993, Seite 211 beschrieben. Keines dieser Dokumente deutet an, dass Chitosan einen Hilfsstoff-Effekt zeigen könnte.
Chitosane sind Chitinderivate oder Poly-N-Acetyl-D-Glucosamine, bei denen der größere Teil der N-Acetyl-Gruppen durch Hydrolyse entfernt worden ist.
In Vaccine, 3, 1985, Seite 379 wird beschrieben, dass Chitinderivate einen Hilfsstoff- Effekt besitzen können, wenn sie durch Injektion (beispielsweise intraperitoneal oder subkutan) verabreicht werden. Die europäische Patentanmeldung EP 183 556 beschreibt wasserlösliche Chitin- oder Chitosan-Oligomere, die als wässrige Lösungen injiziert werden können, bei denen der aktive Bestandteil in Form von Liposomen vorliegen kann. Keines dieser Dokumente regt die Verwendung von Chitosan zusammen mit einem Antigen für die Verabreichung an eine Schleimhautoberfläche an.
Die europäische Patentanmeldung 460 020 beschreibt pharmazeutische Zubereitungen, die Chitosan als Schleimhauf-Absorptionsverstärker umfassen. Dass das Chitosan einen Hilfsstoff-Effekt zeigen könnte, wenn es in einer Impfstoff-Zusammensetzung verabreicht wird, wird weder offenbart noch nahegelegt.
Die internationalen Patentanmeldungen WO 96110421 und WO 97/16208 sind frühere gleichzeitig anhängige Anmeldungen im Sinne der Artikel 54(3) und 54(4) EPC. Sie beschreiben Influenza-Impf-Verbindungen, die Chitosan enthalten. Die internationale Patentanmeldung WO 97/01330, die ebenfalls eine im Sinne der Artikel 54(3) und 54(4) EPC frühere gleichzeitig anhängige Anmeldung ist, beschreibt die Verwendung von Polysaccharid-Phospholipid-Konjugaten als Hilfsstoffe bei Impfstoff-Zusammensetzungen. Die Verwendung von Chitosan als Hilfsstoff ist nicht beschrieben.
Es hat sich nun überraschender Weise gezeigt, dass bei einer intranasalen gleichzeitigen Verabreichung Chitosan die Immunreaktion auf Antigene verstärkt und somit einen Hilfsstoff-Effekt bewirkt.
Somit wird gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung eine Impfstoff-Zusammensetzung geschaffen, die für eine intranasale Verabreichung geeignet ist, wobei diese Zusammensetzung ein Antigen und eine wirksame Hilfsstoff-Menge aus Chitosan umfasst, vorausgesetzt, dass das Antigen kein Influenza-Virus-Antigen ist (diese Zusammensetzungen werden im folgenden als "die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung" bezeichnet).
Der Ausdruck "wirksame Hilfsstoff-Menge" wird vom Fachmann ohne weiteres verstanden und umfasst eine Menge von Chitosan, die in der Lage ist, die Immunreaktion auf nasal verabreichte Antigene zu stimulieren, d. h. eine Menge, die die Immunantwort auf nasal verabreichte Antigen-Zusammensetzungen erhöht, wenn diese in IgA-Pegeln in der Nasenspülung gemessen wird. Geeignete wirksame Erhöhungen der IgA-Pegel sind solche, von mehr als 5%, vorzugsweise von mehr als 25% und insbesondere von mehr als 50% im Vergleich zur gleichen Antigen-Zusammensetzung ohne den Hilfsstoff.
Bevorzugte Konzentrationen des Chitosans in den Zusammensetzungen gemäß der Erfindung liegen im Bereich von 0,02 bis 10%, bevorzugter Weise zwischen 0,1 und 5% und insbesondere zwischen 0,25 und 2%.
Es hat sich gezeigt, dass es durch eine Verabreichung eines Antigens zusammen mit einem speziellen Chitosan-Derivat in einer intranasalen Verbindung möglich ist, eine Immunreaktion (beispielsweise IgG und IgA) zu erzielen. Wir haben auch gefunden, dass dann, wenn ein Chitosan in den intranasalen Impfstoff-Zusammensetzungen enthalten ist, die ein Antigen umfassen, gute systemische und örtliche Immunreaktionen erzeugt werden. Insbesondere wurde gefunden, dass die intranasale Verabreichung der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung sowohl eine schützende IgA-Schleimhaut- Immunreaktion als auch eine systemische IgG-Immunreaktion verstärkt.
Somit schafft die Erfindung weiterhin eine Zusammensetzung der hier beschriebenen Art für die Verwendung in einem Verfahren zur Verstärkung einer schützenden IgA- Schleimhaut-Immunreaktion und einer systemischen IgG-Immunreaktion durch die intranasale Verabreichung an ein Säugetier oder einen Menschen einer Impfstoff-Zusammensetzung, die ein Antigen und eine wirksame Hilfsstoff-Menge von Chitosan umfasst, vorausgesetzt, dass das Antigen kein Influenza-Virus-Antigen ist.
Das Antigen kann als Untereinheit eines Zellwand-Proteins oder Polysaccharids oder als DNA bereitgestellt werden, welche das Antigen in den Zellen nach der Einführung der DNA (beispielsweise durch Transfektion) erzeugt. Genau genommen ist die DNA selbst kein "Antigen" aber sie kodiert das Antigen und wird hier als Antigen bezeichnet.
Das Antigen kann weiterhin in einer gereinigten oder ungereinigten Form bereitgestellt werden. Bevorzugter Weise wird das Antigen jedoch in einer gereinigten Form bereitgestellt.
Die Erfindung kann auf Antigene angewendet werden, die Proteine von Pathogenen, rekombinierte Proteine, Peptide, Polysaccharide, Glycoproteine, Lipopolysaccharide und DNA-Moleküle (Polynucleotide) umfassen.
Die folgende Antigen-Liste dient nur zur Erläuterung und ist nicht einschränkend zu verstehen: Bordetellapertussis-Antigene (wie z. B. Pertussis-Toxin, filamentöses Haemagglutenin, Peractin), Human-Papilloma-Virus-Antigene (HPV), Helicobacter-Pylori-Antigene, Tollwut-Antigene, Tick-Borne-Encephalitis-Antigene (TBE), Meningococcal-Antigene (wie z. B. kapsuläre Polysaccharide der Sero-Gruppen A, B, C, Y und W-135), Tetanus-Antigene (wie z. B. Tetanus-Toxoid), Diphtherie-Antigene wie z. B. Diphtherie- Toxoid), Pneumococcal-Antigene (wie z. B. Streptococcus Pneumoniae Typ 3, kapsuläre Polysaccharide), Tuberkulose-Antigene, menschliche Immundefizienz-Virus-Antigene (HIV) (wie z. B. GP-120, GP-160), Cholera-Antigene (wie z. B. Cholera-Toxin-B-Untereinheit), Staphylococcen-Antigene (wie z. B. Staphylococcen-Enterotoxin B), Shigella- Antigene (wie z. B. Shigella-Polysaccharide), versikuläre Stomatitis-Virus-Antigene (wie z. B. Versikulär-Stomatitisch-Virus-Glycoprotein), Cytomegalo-Virus-Antigene (CMV), Hepatitis-Antigene (wie z. B. Hepatitis A (HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) und G(HGV)- Virus-Antigene), Atmungs-Syncytial-Virus-Antigene (RSV), Herpessimplex-Antigene, oder Kombinationen hiervon (beispielsweise Kombinationen von Diphtherie, Keuchhusten und Tetanus (DPT)). Geeignete Antigene umfassen auch solche, die für die Induktion von Toleranz verabreicht werden, wie z. B. retinale Antigene.
Bevorzugte Antigene umfassen Bordetellapertussis-Antigene, Meningococcal-Antigene, Tetanus-Antigene, Diphtherie-Antigene, Pneumococcal-Antigene, Tuberkulose-Antigene und RSV-Antigene.
Vorzugsweise ist das Chitosan wasserlöslich und kann in vorteilhafter Weise aus Chitin durch Deacetylierung bis zu einem Grad von mehr als 40%, vorzugsweise zwischen 50 % und 90% und in besonders bevorzugter Weise zwischen 70% und 95% der Deacetylierung hergestellt werden.
Spezielle deacetylierte Chitosane, die erwähnt werden können, umfassen das "Sea Cure&spplus;"-Chitosanglutamat, das von Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norwegen geliefert wird.
Das Molekulargewicht des Chitosans kann zwischen 10 kD und 500 kD, vorzugsweise zwischen 50 kD und 300 kD und in besonders bevorzugter Weise zwischen 100 kD und 300 kD liegen.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können zur Immunisierung eines Empfängers gegen Erkrankungen verwendet werden, wie dies beispielsweise in den unten erläuterten Versuchen der Fall war.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Verwendung einer hier definierten Zusammensetzung in einem Verfahren zum Immunisieren eines Empfängers gegen eine Infektionskrankheit geschaffen, wobei dieses Verfahren die intranasale Verabreichung einer Impfstoff-Zusammensetzung an den Empfänger umfasst, die ein Antigen zusammen mit einer wirksamen Hilfsstoff-Menge eines Chitosans in der oben definierten Weise umfasst, vorausgesetzt, dass das Antigen kein Influenza-Virus-Antigen ist.
Darüber hinaus wird gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung die Verwendung einer hier beschriebenen Zusammensetzung in einem Verfahren zur Verstärkung der Immunreaktion auf ein intranasal verabreichtes Antigen geschaffen, wobei dieses Verfahren die gemeinsame Verabreichung des Antigens und des Chitosans in der zuvor beschriebenen Weise umfasst, vorausgesetzt, dass das Antigen kein Influenza-Virus- Antigen ist.
Die intranasal zu verabreichenden Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können als Flüssigkeiten oder trockene Pulver zubereitet werden, um als Aerosole, Tropfen oder Insuflationen verabreicht zu werden.
Bevorzugter Weise werden die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung als trockene Pulver oder in der Form von Mikrokügelchen zubereitet.
Zusammensetzungen für die Verabreichung als nasale Tropfen können einen oder mehrere Bestandteile derart enthalten, wie sie üblicherweise in solchen Zusammensetzungen vorhanden sind, beispielsweise Konservierungsmittel, Mittel zur Einstellung der Viskosität, Mittel zur Einstellung der Tonizität, Puffermittel und dergleichen.
Um sicherzustellen, dass das Chitosan in einem wässrigen Medium löslich bleibt und um sicherzusteifen, dass auch das Antigen durch einen zu sauren pH-Wert nicht nachteilig beeinflusst wird, besitzt eine Lösung für eine intranasale Verabreichung vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich 5,5 bis 6,5 und in besonders bevorzugter Weise einen pH-Wert von ungefähr 6.
Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Produkt, das Mittei zur intranasalen Abgabe der Verbindung aus einem gereinigten Oberflächenantigen und Chitosan umfasst. Eine Abgabevorrichtung kann beispielsweise die Form eines Aerosol-Abgabesystems besitzen und kann so ausgebildet sein, dass es nur eine einzige Dosis oder mehrere Dosen abgibt.
Der Impfstoff wird dem Patienten in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um im Patienten eine schützende Immunantwort zu stimulieren. Beispielsweise kann der Impfstoff an Menschen in einer oder mehreren Dosen verabreicht werden, wobei jede Dosis 1 bis 250 Mikrogramm und in bevorzugter Weise 2 bis 50 Mikrogramm Protein oder Polysaccharid-Antigen umfasst, das aus jedem viralen oder bakteriellen Stamm zubereitet ist. Wenn Bordetellapertussis-Antigene verwendet werden, kann eine Gesamtdosis des bakteriellen Proteins, das als FHA verabreicht wird, Keuchhusten-Toxin (Toxoid) oder Pertactin, entweder einzeln oder in Kombination im Bereich von 5 bis 150 Mikrogramm liegen.
Die Erfindung wird, ohne darauf beschränkt zu sein, durch die folgenden Beispiele erläutet Wenn irgendwelche Beispiele und/oder Tabellen oder Figuren, die sich auf die Beispiele beziehen, nicht in den Rahmen der beigefügten Ansprüche fallen, so ist klar, dass sie hier zum Zweck des Verständnisses der Erfindung aufgenommen wurden und somit in einem erläuternden Sinn zu verstehen sind. Die beschriebenen Untersuchungen zeigen deutlich, dass Chitosan, das als Hilfsmittel für eine Schleimhaut-Impfung verwendet wird, das Potential besitzt, sowohl systemische als auch humorale Schleimhaut-Reaktionen auf eine Reihe von Antigenen zu verstärken.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Serum-IgG-Anti-Haemagglutenin-Reaktion bei Mäusen, die mit gereinigten Influenza-Oberflächen-Antigen (PSA) immunisiert wurden. Jede Säule stellt dem geometrisch gemittelten Titer von 4 Mäusen dar. Die Fehlersäulen stellen den 1-Standardfehler des Mittelwerts dar. Der Grenzwert beträgt 50, wobei es sich um die untere Grenze der Messbarkeit handelt.
Fig. 2 zeigt die nasale IgA-Anti-Haemagglutenin-Reaktion von Mäusen, die mit gereinigtem Oberflächen-Antigen (PSA) immunisiert wurden. Wie in Fig. 1 stellt jede Säule den geometrisch gemittelten Titer von 4 Mäusen dar und die Fehlersäulen gegen den 1- Standardfehler des Mittelwerts wieder.
Fig. 3a und 3b zeigen die Ermittlung von nasalen und pulmonaren Anti-Haemaggluteninabscheidenden Zellen von Mäusen, die mit gereinigtem Oberflächen-Antigen (PSA) immunisiert wurden, unter Verwendung von ELISPOT. Fig. 3a verwendet eine logarithmische Skala während in Fig. 3b eine lineare Skala Verwendung findet.
Fig. 4a, 4b und 4c zeigen die Anti-Bordetella-Keuchhusten-Filament-Haemagglutenin- Serum-Ig-Reaktion (Anti-FHA), die sekretorische Anti-FHA-IgA-Reaktion in Lungengewebe bzw. die sekretorische Anti-FHA-IgA-Reaktion in der Nasenspülung von Mäusen, die mit FHA immunisiert worden waren.
Fig. 5a, 5b und 5c zeigen die Anti-FHA- und Anti-Keuchhusten-Toxin-Serum-IgG-Reaktion (Toxoid; Anti-PT), die sekretorische Lungengewebe-IgA-Reaktion und die sekretorische Nasenspülungs-IgA-Reaktion von Mäusen, die mit FHA und PT immunisiert worden waren.

BEISPIEL 1

Herstellung einer Zusammensetzung mit gereinigtem Oberflächen-Influenza-B-Ahtigen und Chitosanglutamat

1A. Eine Lösung von 1%-igem Chitosanglutamat, einem deacetylierten Chitin mit mittlerer Viskosität, das ungefähr 11% restliche N-Acetyl-Gruppen aufwies, wurde dadurch zubereitet, dass das Chitosanglutamat in 0,8%-igem Natriumchlorid gelöst wurde. Die Sorte des verwendeten Chitosanglutamats war "Sea Cure + 210", das von Protan Biopolymer A/S, Drammen, Norwegen lieferbar ist.
1B. Gereinigtes Oberflächen-Influenza-Antigen (PSA), das sowohl Influenza-A- als auch Influenza-B-Protein enthielt und von Evans Medical Limited, Speke, Merseyside, Großbritannien unter dem Warenzeichen "Fluvirin" im Handel erhältlich ist, wurde in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung aufbereitet, so dass sich eine Proteinkonzentration von ungefähr 1 mg/ml ergab. Das PSA besteht nahezu vollständig aus dem Spike-Protein Haemagglutenin (HA) obwohl es auch etwas Neuraminidase enthält.
1C. Eine 1 : 1-Mischung der Chitosanglutamat-Lösung und der PSA-Lösung wurde zubereitet, um eine intranasal zu verabreichende Impfstoffzusammensetzung zu ergeben, die 0,5% Chitosanglutamat (zu 11% acetyliert), 0,8% NaCl, 0,05% PSA und Phosphatpuffer enthielt, so dass sich eine Lösung mit einem pH-Wert von 6 ergab.
1D. Kontroll-Lösungen, welche die gleichen PSA-Konzentrationen aber kein Chitosanglutamat enthielten und solche, die die gleichen Konzentrationen von Chitosanglutamat aber kein PSA enthielten, wurden ebenfalls zubereitet. Darüber hinaus wurde eine Zusammensetzung zubereitet, welche die gleiche Konzentration von PSA enthielt, das an den bekannten Hilfsstoff Alhydrogel (Aluminiumhydroxid) adsorbiert war. Das PSA wurde an das Alhydrogel über Nacht bei 40ºC adsorbiert.

BEISPIEL 2

Immunisierungsstudien an Mäusen

2A. Die vier gemäß Beispiel 1 zubereiteten Zusammensetzungen wurden Gruppen von 12 erwachsenen (6-8 Wochen) weiblichen BALB/c-Mäusen in der folgenden Weise verabreicht:
Gruppe 1 20 ul (10 ul pro Nasenloch) PSA/Chitosan-Lösung intranasal verabreicht. PSA-Dosis = 10 ug.
Gruppe 2 20 ul PSA intranasal verabreicht (Gesamt-PSA-Dosis = 10 ug).
Gruppe 3 200 ul PSA/Alhydrogel subkutan verabreicht (PSA-Dosis = 10 ug).
Gruppe 4 20 ul Chitosan-Lösung intranasal verabreicht.
Gruppe 5 20 ul PSA (10 ul pro Nasenloch) täglich 3 Tage lang verabreicht (für diese Untersuchung wurden Gruppen von 4 Mäusen verwendet).
2B. Das Immunisierungsverfahren wurde in monatlichen Intervallen dreimal mit der Ausnahme durchgeführt, dass in Gruppe 5 die Mäuse mit drei aufeinanderfolgenden täglichen Dosen immunisiert wurden. Das Immunisierungs- und Probenentnahme-Verfahren ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

Immunisierungs- und Probenentnahme-Verfahren

An jedem Probenentnahmepunkt wurden vier Mäuse aus jeder Gruppe durch eine Herzpunktierung vollständig ausgeblutet, ihre Köpfe wurden entfernt und ihre Nasengänge mit 1 ml PBS + 1%-igem Bovinserum-Albumin gewaschen. Gruppe 5 umfasste nur vier Mäuse, so dass das Blut durch eine Schwanzpunktierung für die beiden ersten Probenentnahmen erhalten wurde und die Nasenwaschungen erst beim dritten Probenentnahmepunkt durchgeführt wurden.

Antikörper-Studien

In allen Studien wurden ganze Influenza-Impfstoffe (WIV) als Antigen verwendet. Obwohl WIV nur ungefähr 50% HA aufweist, wurde angenommen, dass die Untersuchungen primär die Anti-HA-Antikörper maßen. Diese Annahme wurde dadurch bestätigt, dass WIV durch PSA ( 100% HA) ersetzt und einige Untersuchungen wiederholt wurden. Die Ergebnisse waren mit beiden Antigenen ähnlich. Die HA-spezifischen Serum- IgG- und nasalen IgA-Antikörper wurden durch Enzym Linked Immunabsorbant Assey (ELISA) gemessen. Nach einer Hintergrundskorrektur wurden die einzelnen Optische- Dichte-Verdünnungskurven (OD) aufgetragen und die titrierten Werte ermittelt. Der Titer wurde als die Verdünnung des Serums ermittelt, die zu einer OD-Ablesung von 0,2 führte oder als die Verdünnung der Nasenspülung, die zu einer OD-Ablesung von 0,1 führte.
Ebenso wie die Durchführung der Nasenspülung beim dritten Probenpunkt wurden Lymphozyten aus den Schleimhautmembranen des Nasenhohlraums und der Lungen isoliert und die örtliche Immunreaktion durch ELISPOT analysiert.

Ergebnisse

1. Serum-Anti-HA-Serum-Reaktion

Gereinigte Oberflächen-Antigene (Fig. 1 und Tabelle 2)

Wie erwartet, wurde durch die subkutane (SIC) Immunisierung mit PSA + Alhydrogel eine gute Serumsreaktion hervorgerufen. Alle untersuchten Tiere hatten nach der Primärimmunisierung serokonvertiert und der geometrisch gemittelte Titer (GMT) war gut. Die Reaktion stieg nach jeder Verstärkung an, wobei der GMT nach der dritten Dosis sehr hoch war (ungefähr 800.000). Im Gegensatz hierzu war die Serumsreaktion auf das nasal allein verabreichte PSA schlecht: Nur zwei der vier Mäuse hatten nach der ersten Dosis serokonvertiert, keine der untersuchten Mäuse hatte nach der zweiten Dosis Serum-HA-Antikörper (hierbei handelte es sich um andere Mäuse als diejenigen, die nach der ersten Immunisierung untersucht wurden) und obwohl alle untersuchten Tiere nach der dritten Dosis serokonvertiert hatten, war der GMT niedriger als der von Tieren, die eine Dosis von PSA + Alhydrogel erhalten hatten. Chitosan erhöhte die Serumsreaktion von intranasal verabreichtem PSA: Nach der dritten Impfung war die Antikörper- Reaktion bei Mäusen, die PSA + Chitosan erhielten, 360 mal stärker als die von Mäusen, die PSA nur I/N erhalten hatten. Die Stärke der Serumsreaktion in den PSA + Chitosan-Mäusen war sehr ähnlich zu der von SIC-immunisierten Mäusen; tatsächlich ergab sich kein statistischer Unterschied in den GMT-Werten der beiden Gruppen an jedem Probeentnahmepunkt (Students t-Test p > 0,01).
Einige Mäuse wurden drei Mal an aufeinanderfolgenden Tagen dadurch immunisiert, dass lediglich PSA intranasal verabreicht wurde, um zu untersuchen, ob diese Vorgehensweise Vorteile gegenüber einer ein Mal pro Monat erfolgenden Immunisierung hatte. Obwohl alle diese Mäuse in dieser Gruppe messbare Serum-Antikörper 21 Tage nach der ersten Dosis aufwiesen und der GMT zu diesem Zeitpunkt höher war als bei Mäusen, die intranasal eine einzige Dosis PSA erhalten haften, nahm die Anzahl von seropositiven Mäusen während des Verlaufs der Studie ab, obwohl dies der GMT nicht tat (in dieser Gruppe wurden zu jedem Zeitpunkt von den gleichen Mäusen Proben genommen). Am zeitlichen Endpunkt war der GMT der Mäuse mit der monatlichen Verabreichung um eine Größenordnung höher als bei den Mäusen mit der täglichen Verabreichung. Tabelle 2 Serum-IgG-Anti-HA-Reaktion in Mäusen, die mit PSA immunisiert wurden
a Anzahl positiv/Anzahl getestet

2. IgA-Anti-HA-Reaktion bei nasaler Spülung

Gereinigtes Oberflächen-Antigen (PSA) (Fig. 2 und Tabelle 3)

Subkutan verabreichtes PSA + Alhydrogel zeigte eine sehr schlechte Induzierung einer nasalen IgA-Reaktion was mit Feststellungen übereinstimmt, die bereits früher von uns und anderen getroffen wurden. Nasal allein verabreichtes PSA war ebenfalls ein schlechtes Schleimhaut-Immunogen obwohl es ausgedrückt in der Anzahl von reagierenden Tieren etwas besser war als die subkutane Immunisierung. Das Hinzufügen von Chitosan verstärkte die IgA-Reaktion sehr stark, obwohl die Reaktion nach der ersten Dosis gering war; eine HA-spezifische IgA konnte bei drei von vier Mäusen festgestellt werden. Die IgA-Reaktion wurde bei diesen Mäusen durch die zweite Immunisierung stark erhöht. Die abschließende Immunisierung hatte einen geringen Effekt; tatsächlich hatten die mittleren spezifischen IgA-Werte geringfügig abgenommen. Tabelle 3 Nasale IgA-Anti-HA-Reaktion bei mit PSA immunisierten Mäusen
a Anzahl positiv/Anzahl getestet

Reaktionen auf Chitosan allein

Die Seren und die Nasenspülungsflüssigkeit bei den allein mit Chitosan immunisierten Kontrollmäusen waren in allen Untersuchungen negativ.

Lokale Reaktion durch Anti-HA-Antikörper abscheidende Zellen (ASC) in nasalen und pulmonaren Geweben

Lymphozyten wurden aus der nasalen Schleimhaut und der Lungenparenchyma von Gruppen von vier Mäusen am dritten Probenentnahmepunkt isoliert. Lymphozyten von einzelnen Mäusen wurden gepoolt und auf Zellen untersucht, die IgA-, IgG- und IgM- Anti-Influenza-Antikörper abschieden, wobei ELISPOT verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3a und 3b dargestellt.
B Zellen, die HA-spezifische Antikörper abschieden, waren in den Nasen- und Lungengeweben aller Gruppen messbar. Es war eine wesentlich größere Anzahl derartiger Zellen in der PSA + Chitosan-Gruppe vorhanden, und dies ergibt sich am deutlichsten, wenn die Ergebnisse über einem linearen Maßstab aufgetragen werden (Fig. 3b). In allen Fällen mit Ausnahme der subkutan immunisierten Mäuse herrschten IgA-Antikörper abgebende Zellen (ASC) im Nasenhohlraum vor, während entweder IgG oder IgM in den Lungen vorherrschte. Die Stärke der Reaktion ist ähnlich in den Lungen und Nasen von PSA + Chitosan-Mäusen.

BEISPIEL 3

Zubereitung einer Bordetella-Keuchhusten-Filament-Haemagglutenin-Chitosanglutamat-Zusammensetzung

3A. Eine Lösung von 1% (10 mg/ml) Chitosanglutamat (CSN) wurde wie im obigen Beispiel 1 beschrieben zubereitet.
3B. Bordetella-Keuchhusten-Filament-Haemaggiutenin (FHA), das vom National Institute for Biological Sciences, South Mimms, Potters Bar, London, Großbritannien erhalten worden war, wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) aufbereitet, so dass sich eine Proteinkonzentration von ungefähr 1 mg/ml ergab.
3C. Eine 1 : 1-Mischung der CSN-Lösung und der FHA-Lösung wurde zubereitet, so dass sich ein intranasal zu verabreichender Impfstoff ergab, der 0,5% CSN, 0,5 mg/ml FHA, 0,8% Natriumchlorid und Phosphatpuffer enthielt und einen pH-Wert von 6,0 aufwies.
3D. Es wurde auch eine Kontroll-Lösung für eine intranasale Impfung zubereitet, die die gleiche Konzentration von FHA aber kein CSN enthielt. Zusätzlich wurde eine Mischung zubereitet, die ungefähr 0,1 mg/ml FHA enthielt, das an das bekannte Adjuvanz Alhydrogel (Aluminiumhydroxid) adsorbiert war. Das FHA wurde an das Alhydrogel dadurch adsorbiert, dass die Mischung 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur gerührt wurde.

Immunisierungsstudien an Mäusen

3E. Die drei in der oben beschriebenen Weise zubereiteten Zusammensetzungen (Abschnitte 3C und 3D) wurden Gruppen von 13 erwachsenen männlichen Balb/c-Mäusen in folgender Weise verabreicht:
Gruppe 1: 20 ul (10 ul pro Nasenloch) FHA-Lösung, die intranasal verabreicht wurde (FHA-Dosis = 10 ug).
Gruppe 2: 20 ul (10 ul pro Nasenloch) FHA/CSN-Lösung wurde intranasal verabreicht (FHA-Dosis = 10 ug und Chitosan = 100 ug).
Gruppe 3: 500 ul FHA/Alhydrogel-Mischung wurde subkutan verabreicht (FHA-Dosis = 5 ug und Alhydrogel = 0,25 mg).

Immunisierungs- und Probenentnahme-Regime

3D. Das Immunisierungsverfahren wurde drei Mal in monatlichen Intervallen durchgeführt. Das Immunisierungs- und Probenentnahme-Regime ist in Tabelle 4 dargestellt.
3E. 4 Mäuse einer jeden Gruppe wurden an den Probeentnahmepunkten 1 und 2 und 5 Mäuse einer jeden Gruppe am Probenentnahmepunkt 3 durch eine kardiale Punktur voll ausgeblutet. Nach der Entnahme der Blutproben wurden die Tiere durch eine intravenöse Überdosis von Pentobarbitonnatrium getötet und die Nasendurchgänge bzw. die Lungen jeweils mit 1 ml PBS gespült, das 1% bovines Serum Albumin enthielt. Tabelle 4

Antikörper-Analyse

3F. Es wurden die Anti-FHA-IgG-Antikörper in den Serumsproben und die sekretorischen Anti-FHA-IgA-Antikörper in den Nasenspülungs- und Lungenspülungs-Proben durch Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) gemessen. Um die durch die verschiedenen Zusammensetzungen in den einzelnen Tieren hervorgerufenen Antikörper- Reaktionen zu vergleichen, wurden bestimmte Werte den positiven Serums-Kontrollproben und den positiven Lungenspülungs-Kontrollproben zugewiesen, die für die Erstellung der Standardkurven während der Analyse der Testproben verwendet wurden. Den positiven Serum-Kontrollproben und den positiven Lungenspülungs-Proben wurden die Werte 106 IgG Eq. Einheiten/ml bzw. 104 IgA Eq. Einheiten/ml zugeordnet.

Ergebnisse

3G. Die Serum-IgG-Konzentrationen (Tabelle 5 und Fig. 4a) zeigen, dass die nasal verabreichte FHA/Chitosan-Zusammensetzung ein stetiges Anwachsen der Reaktion an den Tagen 22, 43 und 70 hervorrief. Im Vergleich rief auch die nasal verabreichte FHA- Lösung eine gewisse Reaktion am Tag 70 hervor, doch war sie nur ein Fünftel der entsprechenden Reaktion, die durch die FHA/Chitosan-Lösung erzeugt worden war. Wie erwartet, rief die subkutan verabreichte FHA/Alhydrogel-Zusammensetzung eine hohe Sekundärreaktion (Tag 43) hervor. Diese Reaktion war sieben Mal so hoch wie die entsprechende durch die nasal verabreichte FHA/Chitosan-Zusammensetzung erzeugte Reaktion. Die Reaktion auf die subkutane Verabreichung nahm jedoch bis zum Tag 70 ab und war nur drei Mal so hoch wie der entsprechende Wert für die nasal verabreichte FHA/Chitosan-Zusammensetzung.
3H. Die sekretorischen IgA-Konzentrationen in den Lungenspülungen (Tabelle 5, Fig. 4b) zeigen deutlich, dass die nasal verabreichte FHA/Chitosan-Zusammensetzung die stärkste Reaktion sowohl am Tag 43 als auch am Tag 70 im Vergleich zu den Reaktionen hervorrief, die entweder durch die nasal verabreichte FHA-Lösung oder die subkutan verabreichte FHA/Alhydrogel-Zusammensetzung hervorgerufen worden waren. Am Tag 43 war die Reaktion 100 Mal und 250 Mai so hoch wie die Reaktionen, die durch die nasale FHA-Lösung bzw. die subkutan verabreichte FHA/Alhydrogel-Zusammensetzung hervorgerufen worden waren.
31. Die sekretorische IgA-Konzentrationen in den Nasenspülungen (Tabelle 5 und Fig. 4c) zeigen ebenfalls an den Tagen 43 und 70, dass die nasal verabreichte FHA/Chitosan-Zusammensetzung ein stetiges Anwachsen der Reaktion hervorrief. Im Vergleich hierzu erzeugte die subkutane Verabreichung überhaupt keine Reaktion, während die nasal verabreichte FHA-Lösung am Tag 70 eine gewisse Reaktion erzeugte, die nur ein Drittel der Reaktion betrug, die durch die nasal verabreichte FHA/Chitosan- Zusammensetzung erzeugt worden war. Tabelle 5 Serum-IgG-, sekretorische Lungenspülungs-IgA- und sekretorische Nasenspülungs-IgA-Antikörper-Konzentrationen nach der nasalen Verabreichung von FHA (10 ug/Maus) entweder allein oder in Kombination mit Chitosan in Lösungszubereitungen und nach der sub-kutanen Verabreichung von FHA (5 g/Maus) in Kombination mit Alhydrogel in einer Lösungszubereitung bei Mäusen
Für Kontroll-IgG angenommen: 1000000 IgG Eq.-Einheiten/ml
Für Kontroll-IgA angenommen: 10000 IgA Eq.-Einheiten/ml
Die Zahl der pro Zubereitung an den Tagen 22 und 43 analysierten Proben war 4.
Die Zahl der am Tag 70 pro Zubereifung analysierten Proben war 5.
Serokonversion: Anzahl von Tieren, die eine positive Reaktion zeigten (2,5 · Hintergrundwert) in jeder Gruppe

BEISPIEL 4

Zubereitung von einer Bordetella-Keuchhusten-Filament-Naemagglutenin/Keuchhustentoxin(Toxoid)/Chitosan-Glutamat-Zusammensetzung)

4A. Eine Lösung von 2% 20 mg/ml) Chitosanglutamat (CSN) wurde dadurch zubereitet, dass 200 mg Chitosan in 10 ml Wasser gelöst wurden.
4B. Bordetella-Keuchhusten-Filament-Haemagglutenin (FHA), das von CAMR, Salisbury, Wiltshire, Großbritannien erhalten worden war, wurde unter Verwendung einer Aquacide-II-Säule konzentriert und in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) aufbereitet, so dass sich eine Proteinkonzentration von 267 ug/ml ergab. Ein nicht-toxischer Mutant von Pertussis-Toxin (PT), der von IRIS, Siena, Italien erhalten worden war, wurde unter Verwendung einer Aquacide-II-Säule konzentriert und in 0,5 M Natriumchlorid aufbereitet, so dass sich eine Endkonzentration von 267 ug/ml ergab. Gleiche Volumina dieser beiden Antigenlösungen wurden gemischt, so dass sich eine Lösung ergab, die jedes Antigen in einer Protein-Endkonzentration von 133 ug/ml enthielt.
4C. Eine 1 : 3 Mischung von 2% CSN-Lösung und einer FHA/PT-Lösung wurde zubereitet, so dass sich ein intranasal zu verabreichender Impfstoff ergab, der 0,5% CSN, ungefähr 100 ug/ml FHA, 100 ug/ml PT, 0,8% Natriumchlorid und Phosphatpuffer enthielt.
4D. Eine Kontroll-Lösung für eine intranasale Impfung, welche die gleiche Konzentration von FHA und PT aber kein CSN enthielt, wurde zubereitet. Eine negative Kontroll- Lösung für eine intranasale Impfung, die 0,5% CSN aber weder FHA noch PT enthielt, wurde dadurch zubereitet, dass ein Teil der 2%-igen CSN-Lösung mit 3 Teilen PBS verdünnt wurden, die 0,0014 M Kaliumchlorid und 0,3185 M Natriumchlorid enthielten. Zusätzlich wurde eine Mischung zubereitet, die ungefähr 10 ug/ml FHA und 10 ug/ml PT enthielt, die an den bekannten Hilfsstoff Alhydrogel (200 ~ g/ml) adsorbiert waren. Die Antigene wurden an Alhydrogel dadurch adsorbiert, dass die Mischung 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur gerührt wurde.

Immunisierungsstudien an Mäusen

4E. Die vier Zusammensetzungen, die in der oben beschriebenen Weise zubereitet worden waren (Abschnitte 3C und 3D) wurden Gruppen von 10 erwachsenen weiblichen Balb/c-Mäusen in der folgenden Weise verabreicht:
Gruppe 1: 20 ul (10 ul pro Nasenloch) FHA/PT/CSN-Lösung wurde intranasal verabreicht (FHA-Dosis = 2 ug, PT-Dosis = 2 ug, Chitosan-Dosis = 100 ug).
Gruppe 2: 20 ul (10 ul pro Nasenloch) PT/FHA-Lösung wurden intranasal verabreicht (FHA-Dosis = 10 ug, PT-Dosis = 2 ug)
Gruppe 3: 20 ul (10 ul pro Nasenloch) CSN-Lösung wurden intranasal verabreicht (CSN-Dosis = 100 ~ g)
Gruppe 4: 200 ul FHA/PT/Alhydrogel-Mischung wurde intraperitoneal verabreicht (FHA-Dosis = 2 ug, PT-Dosis = 2 ug, Alhydrogel = 40 ug).

Immunisierungs- und Probenentnahme-Regime

4D. Das Immunisierungsverfahren wurde zwei Mal mit einem einmonatigen Abstand ausgeführt. Das Immunisierungs- und Probenentnahme-Regime ist in Tabelle 6 dargestellt.
4E. 5 Mäuse einer jeden Gruppe wurden durch kardiale Punktur an den Probeentnahmepunkten 1 und 2 voll ausgeblutet. Nach der Entnahme der Blutproben wurden die Tiere durch eine intravenöse Überdosis von Pentobarbitonnatrium getötet und die Nasengänge und die Lungen wurden jeweils mit 1 ml PBS gespült, das 1% bovines Serum Albumin enthielt. Tabelle 6

Antikörperanalyse

4F. Es wurden Anti-FHA-IgG-, Anti-PT-IgG-Antikörper in den Serumsproben und sekretorische Anti-FHA-IgA- und sekretorische Anti-PT-IgA-Antikörper in den Nasenspülungs- und Lungenwasch-Proben durch Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) gemessen. Die Testproben wurden in geeigneter Weise mit dem Probenpuffer auf vier verschiedene Konzentrationen verdünnt und zweifach auf jeden Antikörper analysiert. Es wurden Titrationskurven erzeugt, der y-Achsen-Wert wurde auf das 2,5-fache des Hintergrundswertes festgelegt und der Interpolationswert für jede Probe wurde unter Verwendung des Kineticalc-Programms KC3 berechnet. Der geometrische Titrations-Mittelwert (GMT) für jede Probe wurde dann dadurch erhalten, dass das Inverse des Interpolationswertes berechnet wurde.

Ergebnisse

4G. Die GMT-Werte sowohl für die Anti-FHA- als auch die Anti-PT-Serums-IgG-Antikörper (Tabellen 7, 8 und Fig. 5a) zeigen, dass die intranasal verabreichte FHA/PT/Chitosan-Zusammensetzung (Gruppe 1) eine primäre systemische Reaktion und eine beträchtlich erhöhte sekundäre Reaktion hervorrief. Im Vergleich rief die nasal verabreichte FHA/PT-Lösung (Gruppe 2) ebenfalls eine gewisse primäre systemische Reaktion und eine erhöhte Sekundärreaktion hervor. Die Sekundärreaktionen die von der ersten Gruppe sowohl in Bezug auf FHA als auch PT erzeugt wurden, waren jedoch fünf Mal höher als die entsprechenden von der Gruppe 2 erzeugten Reaktionen.
4H. Wie erwartet, rief die intraperitoneal verabreichte FHA/PT-Lösung (Gruppe 4) hohe primäre und sekundäre Reaktionen auf FHA und PT hervor (Tabellen 7, 8 und Fig. 5a). Die sekundären Reaktionen auf FHA und PT waren jedoch ungefähr 30 bzw. 10 Mal höher als die primären Reaktionen. Es wurde gefunden, dass die negativen Kontrollgruppen-Serumsproben (Gruppe 3) sowohl in Bezug auf Anti-FHA- als auch Anti-PT-IgG-Antikörper negativ waren (Tabellen 7, 8).
4I. Die GMT-Werte für die sekretorischen IgA-Antikörper in den Lungenspülungen (Tabellen 7, 8 und Fig. 5b) zeigen deutlich, dass sowohl die nasal verabreichten Zusammensetzungen FHA/PT/Chitosan (Gruppe 1) als auch FHA/PT (Gruppe 2) eine sekundäre Reaktion auf FHA und PT hervorriefen, dass jedoch kein Antigen eine primäre Reaktion bewirkte. Die sekundären Reaktionen auf PT, die von der Gruppe 1 und der Gruppe 2 erzeugt wurden, waren ähnlich, während diese Reaktion auf FHA, die von der Gruppe 1 erzeugt wurde, ungefähr 15 Mal höher war als die Reaktion auf FHA, die von der Gruppe 2 erzeugt wurde.
4J. Die GMT-Werte für die sekretorischen IgA-Antikörper in den Nasenspülungen (Tabellen 7, 8 und Fig. 5c) zeigen ebenfalls, dass die beiden nasal verabreichten Zusammensetzungen in den Gruppen 1 und 2 Sekundärreaktionen auf beide Antigene hervorriefen, dass aber nur PT eine kleine primäre Reaktion erzeugte. Die von Gruppe 1 erzeugte sekundäre Reaktion auf FHA war ungefähr 15 Mai höher als die von der Gruppe 2 erzeugte, während die entsprechende von der Gruppe 1 auf PT erzeugte Reaktion nur doppelt so hoch war wie die von der Gruppe 2 erzeugte.
4K. Es zeigte sich, dass die Lungenspülungs- und Nasenspülungs-Proben der Chitosan-Kontrollgruppe (Gruppe 3) negativ sowohl in Bezug auf Anti-FHA- als auch Anti-PT- IgA-Antikörper waren (Tabellen 7, 8). Es zeigte sich, dass die intraperitoneal verabreichte FHA/PT/Alyhdrogel-Zusammensetzung (Gruppe 4) keine Schleimhautreaktion (IgA-Antikörper) auf beide Antigene in den Lungenspülungen oder Nasenspülungen erzeugte. Tabelle 7 Zusammenstellung von geometrischen Titrations-Mittelwerten (GMT) für Anti-FHA-Serum-IgG- und sekretorischen Anti-FHA-IgA-Antikörpern (Lungenwaschung und Nasenspülung) nach der intraperitonealen oder nasalen Verabreichung von FHA (2 ug/Maus) und PT (2 ug/Maus) in verschiedenen Lösungszubereitungen bei Mäusen
Serkonversion: Anzahl von Tieren, die eine positive Reaktion zeigten (2,5 · Hintergrundwert) in jeder Gruppe Tabelle 8 Zusammenfassung der geometrischen Titrations-Mittelwerte (GMT) von Anti-PT-Serum-IgG- und sekretorischen Anti-PT-IgA-Antikörpern (Lungenwaschung und Nasenspülung) nach der intraperitonealen oder nasalen Verabreichung von FHA (2 ug/Maus) und PT (2 ug/Maus) in verschiedenen Lösungszubereitungen bei Mäusen
Serkonversion: Anzahl von Tieren, die eine positive Reaktion zeigten (2,5 · Hintergrundwert) in jeder Gruppe

Claims

1. Impfstoff-Zusammensetzung, die für die intranasale Verabreichung geeignet ist, wobei die Zusammensetzung ein Antigen und eine wirksame Hilfsstoff-Menge eines Chitosans enthält, unter der Bedingung, daß das Antigen kein Influenza- Virus-Antigen ist.

2. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Antigen ein Protein von einem Pathogen, ein rekombiniertes Protein, ein Glycoprotein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Lipopolysaccharid oder ein Polynukleotid ist.

3. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Antigen eine ganze Zelle oder ein Virus ist.

4. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Antigen als DNA vorgesehen ist, die das Antigen kodiert.

5. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Antigen ein Bordetella-Keuchhusten-Antigen, ein Meningokokken-Antigen, ein Tetanus-Antigen, ein Dipftherie-Antigen, ein Pneumokokken-Antigen, ein Tuberkulose-Antigen oder ein RSV-Antigen ist.

6. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Antigen ein Antigen ist, das für eine Toleranz-Induktion verabreicht wird.

7. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Antigen in einer gereinigten Form vorliegt.

8. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Konzentration des Chitosans im Bereich von 0,02 bis 10% liegt.

9. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 8, bei der die Konzentration des Chitosans im Bereich von 0,1 bis 5% liegt.

10. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 9, bei der die Konzentration des Chitosans im Bereich von 0,25 bis 2% liegt.

11. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Chitosan wasserlöslich ist.

12. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Chitosan aus Chitin durch Deacetylierung bis zu einem Deacetylierungsgrad von mehr als 40% erzeugt wird.

13. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 12, bei der der Deacetylierungsgrad zwischen 50% und 90% liegt.

14. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 12, bei der der Deacetylierungsgrad zwischen 70% und 95% liegt.

15. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Molekulargewicht des Chitosans zwischen 10 kD und 500 kD (Kilodalton) liegt.

16. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 15, bei der das Molekulargewicht des Chitosans zwischen 50 kD und 300 kD liegt.

17. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 16, bei der das Molekulargewicht des Chitosans zwischen 100 kD und 300 kD liegt.

18. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Zusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 6,5 aufweist.

19. Impfstoff-Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der der pH-Wert ungefähr gleich 6 ist.

20. Impfstoff-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die als trockenes Pulver oder in der Form von Mikrokügelchen zubereitet ist.

21. Pharmazeutisches Produkt, das eine Abgabevorrichtung umfaßt, die geeignet ist, eine Zusammensetzung intranasal abzugeben, in Kombination mit einer Impfstoff-Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche:

22. Pharmazeutisches Produkt nach Anspruch 21, bei dem die Abgabevorrichtung ein Aerosol-Abgabesystem ist.

23. Verwendung eines Chitosans für die Herstellung einer intranasalen Hilfsstoff- Zusammensetzung zur Verstärkung der Immunogenizität von intranasal verabreichten Antigenen unter der Bedingung, daß das Antigen kein Influenza-Virus- Antigen ist.

24. Verwendung eines Antigens und einer wirksamen Hilfsstoff-Menge von Chitosan zur Herstellung einer intranasalen Zusammensetzung zur Verstärkung einer schützenden Schleimhaut-IgA-Immunreaktion und einer systemischen IgG-Immunreaktion unter der Bedingung, daß das Antigen kein Influenza-Virus-Antigen ist.

25. Verwendung eines Antigens und einer wirksamen Hilfsstoff-Menge eines Chitosans zur Herstellung einer intranasalen Zusammensetzung zur Immunisierung eines Empfängers gegen eine Infektion durch eine Erkrankung unter der Bedingung, daß das Antigen kein Influenza-Virus-Antigen ist.