DE60222529T2

DE60222529T2 - Herstellungsverfahren für kombinationsimpfstoffe

Info

Publication number: DE60222529T2
Application number: DE60222529T
Authority: DE
Inventors: Kyu-Wan Kim; Hyi-Jeong Ji; Youn-Kyeong Lee; Wan-Kyu Kim; Hee-ku Yuseong-Gu LEE; Won-Kyum Kim
Original assignee: LG Life Sciences Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 2001-01-10
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2022-01-10
Also published as: AU2002219693B2; RU2003124660A; CN1228086C; UY27118A1; RU2264226C2; EP1349572B1; CN1484531A; MXPA03006154A; PL211005B1; CA2434421C; ATE373485T1; EP1349572A1; JP2004517866A; BR0206391A; PL369433A1; KR100401423B1; EP1349572A4; WO2002055105A1; KR20020060298A; US20090181050A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für eine kombinierte Vakzine, die zum gleichzeitigen Verhindern verschiedener Erkrankungen von Kleinkindern bzw. Säuglingen, wie Diphtherie, Tetanus, Pertussis, Hepatitis B und andere Erkrankungen, welche bei Kleinkindern bzw. Säuglingen verhindert werden sollten, befähigt ist.
HINTERGRUND DES STANDS DER TECHNIK
Eine kombinierte Vakzine ist auf eine Vakzine gerichtet, die durch Kombinieren protektiver Antigene für jede Erkrankung bezüglich verschiedener anderer Infektionserkrankungen hergestellt wurde, oder auf eine Vakzine, die durch Kombinieren verschiedener verwandter Antigene, um eine Infektionserkrankung zu verhindern, hergestellt wurde.
Als Beispiele für das Vorgenannte gibt es eine DTP-Vakzine, die zum Erhöhen einer Immunität bezüglich Diphtherie, Tetanus und Pertussis befähigt ist, eine MMR-Vakzine, die zum Erhöhen einer Immunität bezüglich Maser, Mumps und Röteln befähigt ist, usw. Die obigen Vakzinen wurden 20 Jahre lang verwendet. Als Beispiele für die Letzteren gibt es eine Pneumokokkenvakzine, die durch Kombinieren von 14 oder 23 Pneumokokken-Polysacchariden hergestellt wurde und die zum Erhöhen einer Immunität gegen Pneumonie befähigt ist, und eine Meningokokkenvakzine, die durch Kombinieren von 4 Meningokokken-Polysacchariden hergestellt wurde und die zum Erhöhen einer Immunität zum Schutz (vor) Meningitis befähigt ist, usw. Die obigen Vakzinen wurden für einige Jahre verwendet.
Die obigen Vakzinen wurden seit ihrer Entwicklung viele Jahre lang verwendet und sie sind mit ihren hohen immunogenen Wirkungen und der geringen Nebenwirkung hinsichtlich jeder Infektionserkrankung und mit ihrer guten Anpassung zum Schutz (vor) verschiedenen Erkrankungen gut anerkannt bzw. verstanden. Vakzinentwickler entwickeln neuerdings verschiedene Typen kombinierter Vakzinen aus den obigen Gründen. Als die obigen kombinierten Vakzinen gibt es eine Vakzine (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 99/13906 ), die durch Kombinieren einer DTP-Vakzine, einer Vakzine gegenüber bakterieller Meningoenzephalitis (Hib-Vakzine), inaktivierte Polio-Vakzine und Hepatitis B-Vakzine hergestellt wurde. Eine bestimmte kombinierte Vakzine wird entwickelt bzw. entsteht durch die Kombination von Pneumokocken- und Meningokokken-Polysacchariden, konjugiert mit Protein. Eine kombinierte Vakzine, die zum Verhindern einer Intestinuminfektion im Hinblick auf jedwede verursachende Bakterien von Cholera, Typhus(erkrankungen) („typhoid"), Dysenterie und Diarrhöe befähigt ist, wird bald entwickelt werden.
Die kombinierte Vakzine, die in der Weise hergestellt wurde, dass jedes Antigen zum Verhindern verschiedener anderer infektiöser Erkrankungen kombiniert wurde, hat dahingehend Vorteile, dass die Anzahl der Vakzinierungen abnimmt und die Bereitstellung der Vakzinen einfach ist, wobei dadurch die Kosten verringert werden. Gemäß dem Säuglings- bzw. Kleinkind-Vakzinierungszeitplan, der von der Vereinigung der Kinderärzte („Pediatrics Association") empfohlen wurde (1997), erhalten die Säuglinge viele Male eine Injektion innerhalb eines Jahres nach der Geburt und die Injektion der Vakzine überlappt manchmal bei verschiedenen Vakzinen aufgrund von Zweckmäßigkeit oder Krankheit. Daher ist es wichtig, die Säuglinge bzw. Kleinkinder basierend auf einem geeigneten Verfahren zu impfen, wodurch eine gewisse Zweckmäßigkeit bzw. Bequemlichkeit sowohl für die impfenden Personen als auch für die geimpften Personen bereitgestellt wird. Insbesondere werden gemäß dem standardisierten Vakzinierungszeitplan die DTP- und die Hepatitis B-Vakzinierungen so geleitet, dass dreimal primäre Injektion innerhalb des ersten Jahres der Säuglinge und Auffrischungsinjektionen („boost shots") durchgeführt werden. Da die empfohlenen Vakzinierungszeitpläne ähnlich sind, kann zusätzlich das Problem der überlappenden Injektionen auftreten.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten eine Untersuchung durch, um eine bestimmte Zweckmäßigkeit bei der Vakzinierung sowohl für die impfenden Personen als auch für die geimpften Personen bereitzustellen, indem die kombinierte Vakzine von DTP- und Hepatitis B-Vakzinen entwickelt wurde und der Bestand bzw. Vorrat der Vakzine stabilisiert wurde, wodurch ein Vakzinierungsnutzen für mehr Leute bereitgestellt wurde.
Da die Forschung bzw. Untersuchung zu der kombinierten Vakzine hauptsächlich auf das Kombinieren jedes Komponentenantigens aus den Vakzinprodukten, welches bei der Immunität und Stabilität bereitgestellt wird, gerichtet ist, ist die Entwicklung des Kombinierungsverfahrens wichtig, um eine Variation bei der Reaktion und der Immunität, die aufgrund einer Wechselwirkung zwischen jedem protektiven Antigen und Adsorptionsmittel auftritt, zu minimieren (und sie) ist (daher) wichtig für die obige Untersuchung. Mit dem Abschluss der Entwicklung wurden die Homogenität und die Stabilität der erfindungsgemäßen kombinierte Vakzine-Formulierungen überprüft. In der vorliegenden Erfindung wurde Forschung bzw. eine Untersuchung, basierend auf der DTP-Vakzine und der Hepatitis B-Vakzine durchgeführt, deren Immunität und Stabilität geprüft bzw. belegt sind.
Als ein Verfahren zum Kombinieren jeder Komponentenvakzine gibt es ein Verfahren (Internationale Veröffentlichung Nrn. WO 99/13906 und WO 00/7623 ) des einfachen Kombinierens der Produkte jeder Komponentenvakzine, ein Verfahren (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 99/13906 ) des simultanen Verabreichens bei Durchführung der Vakzinierung wobei der speziell konstruierte Behälter verwendet wird, und ein Herstellungsverfahren für die kombinierte Vakzine durch Mischen jeder Komponente der Vakzine und der Inhaltsstoffe in einer Formulierung. Betreffend die Vakzinbereitstellung bzw. -bevorratung ist die Verwendung der kombinierten Vakzine, die mittels der ersten zwei Verfahren hergestellt wurde, ähnlich zu der Verwendung jeder monovalenten Vakzine einzeln, benötigt sie mehr Aufmerksamkeit bzw. mehr Vorsicht, um die Vakzinen zu handhaben, als jede monovalente Vakzine, so dass es beim Verwenden dieses Typs der kombinierten Vakzine keinen Vorteil gibt. Zusätzlich ist es unmög lich, eine Untersuchung hinsichtlich der Variation der Immunität und des Auftretens der Nebenwirkungen durchzuführen. Es ist daher zu bevorzugen, dass jede Vakzinkomponente in einer Formulierung als ein Produkt bei der Untersuchung der kombinierten Vakzine gemischt wird.
Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein Herstellungsverfahren für eine kombinierte Vakzine bereitzustellen, die zum Verhindern verschiedener Erkrankungen bei Säuglingen bzw. Kleinkindern einschließlich Diphtherie, Tetanus, Pertussis und Hepatitis B, welche bei Kleinkindern bzw. Säuglingen verhindert werden sollten, befähigt ist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Herstellungsverfahren für eine kombinierte Vakzine zum gleichzeitigen Verhindern verschiedener Erkrankungen von Säuglingen bzw. Kleinkindern, wie Diphtherie, Tetanus, Pertussis und Hepatitis B, welche bei Säuglingen bzw. Kleinkindern verhindert werden sollten, bereitzustellen.
Um das obige Ziel zu erreichen, wird ein Herstellungsverfahren für eine kombinierte Vakzine, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert, bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen besser verstanden werden, welche nur zur Veranschaulichung angeführt sind und somit die vorliegende Erfindung nicht einschränken, wobei:
1 eine Ansicht ist, die ein Adsorptionsverhältnis jedes Komponentenantigens, basierend auf der Konzentration an Adsorptionsmittel, veranschaulicht. Diphtherietoxoid, Tetanustoxoid und Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen sind Komponenten von Diphtherie-Antigen, Tetanus-Antigen und Hepatitis B-Antigen, und Pertussis-Toxoid und Pertussis-FHA-Antigen (fadenförmiges Pertussis-Blut-Agglutinin-Korpuskel („pertussis thready shape blond agglutinin corpuscle")) sind jeweils Komponente eines gereinigten Pertussis-Antigens.
2a bis 2d Ansichten sind, die eine Antigenität und Immunität, basierend auf dem Adsorptionsverfahren, veranschaulichen, wobei Probe 1 eine Probe ist, in welcher ein Überschuss an Aluminiumhydroxidgel zugegeben wird, nachdem eine Kombination jeder Komponentenvakzine abgeschlossen ist, und Probe 2 eine Probe ist, in welcher das Adsorptionsmittel in der gleichen Konzentration vorher zugegeben wird, nämlich bevor die Kombination abgeschlossen ist; 2a und 2b Ansichten sind, die die relative Antigenität der Proben 1 bzw. 2 veranschaulichen und 2c und 2d Ansichten sind, die die relativen Level der Antikörperbildung gegen jedes Antigen der Proben 1 bzw. 2 veranschaulichen.
3 eine Ansicht ist, die den Level der Antikörperbildung gegen jedes Antigen in dem Serum, erhalten von Affen, denen eine kombinierte Vakzine, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, oder gleichzeitig jeweils das DTP- und das Hepatitis B-Vakzinprodukt verabreicht wurde, veranschaulicht und zwar basierend auf den Daten von abgenommenen Blutproben jedes Affen. Es wird bestimmt, dass der Gruppe 1 jeweils die DTP- und die Hepatitis B- Vakzine gleichzeitig verabreicht wird, und es wird bestimmt, dass der Gruppe 2 eine kombinierte Vakzine verabreicht wird.
DURCHFÜHRUNGSWEISEN DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Als das Verfahren zum Herstellen der kombinierten Vakzine, die jede Vakzinkomponente als ein Produkt enthält, wird das obige Verfahren in zwei Schritte unterteilt: ein Verfahren für den Schritt des Kombinierens der Antigene, welche jede Komponentenvakzine bilden, und des Durchführens einer Adsorption unter Verwendung eines Adsorptionsmittels und ein Verfahren für den Schritt des Kombinierens der zuvor adsorbierten Antigene, in dem Fall, dass ein Adsorptionsmittel als eine Komponente in dem Verfahren verwendet wird. In dem Fall jedoch, dass jegliche Komponentenantigene zuerst gemischt werden, kann ein Adsorptionsvermögen hinsichtlich des Adsorptionsmittels jedes Antigens aufgrund der Wechselwirkung zwischen den Antigenen und den Inhaltsstoffen in Lösung abnehmen. Zusätzlich wird die Adsorption zwischen dem Adsorptionsmittel und dem Komponentenantigen unter jeder unabhängigen Bedingung optimiert. Wenn die obigen Adsorptionsverfahren gleichzeitig durchgeführt werden, kann das Adsorptionsverhältnis aufgrund eines Unterschieds bei der Adsorptionsbedingung jedes Komponentenantigens verringert sein. Da der Zusammenhang zwischen dem Adsorptionsverhältnis hinsichtlich des Adsorptionsmittels des Komponentenantigens und der Immunität der Vakzine umgekehrt proportional ist, kann die Immunität der kombinierten Vakzine, welche bei dem Verfahren, das als gleichzeitiges durchgeführt wird, hergestellt wird, verglichen mit der Immunität jeder monovalenten Vakzine, verringert sein.
Daher urteilten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass es sachdienlich ist, eine kombinierte Vakzine durch Herstellen einer Bulk-Lösung jeden Komponentenantigens, unabhängiges Durchführen einer Adsorption jedes Antigens und Kombinieren der adsorbierten Antigene miteinander herzustellen.
In dem Fall, dass jedes Komponentenantigen in jedem Adsorptionstyp kombiniert wird, sollte zusätzlich die Endkonzentration jedes Komponentenantigens in der kombinierten Vakzine die gleiche sein wie die Konzentration des Komponentenantigens in jeder konventionellen monovalenten Vakzine, um die Immunität und die Charakteristika der Vakzinantigene in den Vakzinprodukten zu vergleichen. Um die kombinierte Vakzine herzustellen, wird daher das Komponentenantigen in konzentrierterer Form als bei einer Einzelvakzine adsorbiert und anschließend kombiniert. Die DTP-Vakzine wird basierend auf einer Adsorption unter Verwendung des Antigens, welches 1,5- bis 2fach konzentriert ist, hergestellt und die Hepatitis B-Vakzine wird unter Verwendung des Antigens, welches 2- bis 3fach konzentriert ist, hergestellt. Die Endkonzentration jedes Komponentenantigens der kombinierten Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung wird mit der Konzentration jeder Einzelvakzine zur Übereinstimmung gebracht, wobei das Kombinationsverhältnis jedes Antigens angepasst wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung führten die Erfinder die verschiedenen Studien von Kombinationen zum Entwickeln der kombinierten Vakzine durch. In diesem Fall ist der Endge halt jeder Immunkomponente in einem Vakzinprodukt der gleiche wie der Gehalt der monovalenten Vakzine. Zusätzlich wird die Änderung des Adsorptionsverhältnisses jedes Antigens überwacht, indem die Gehalte der Adsorptionsmittel und der anderen Komponenten kontrolliert werden. Jede Probe, welche eine kleinere Veränderung in dem Adsorptionsverhältnis aufweist, wird zur Immunisierung bei kleinen Tieren verwendet („immunized into"), um den Level der Antikörperbildung zu vergleichen. Ein geeignetes Kombinationsverfahren wurde durch Prüfen des Ergebnisses der Antikörperbildung bei kleinen Tieren ausgewählt.
Zusätzlich wurden als ein Ergebnis der Überprüfung bzw. der Durchsicht hinsichtlich der Adsorbenzien der gegenwärtigen kommerziellen DTP-Vakzine und der Hepatitis B-Vakzine Aluminiumhydroxidgel und Aluminiumphosphatgel hauptsächlich verwendet. Es ist bekannt, dass die Adsorption des Proteins an jedes Aluminiumgel durch eine elektrische Ladung der Oberfläche jedes Proteins und einer Gelkomponente verursacht wird. Und es ist auch bekannt, dass das Aluminiumhydroxidgel eine positive elektrische Ladung der Oberflächen in einem physiologischen pH-Bereich hat und dass das Aluminiumphosphatgel eine negative elektrische Ladung der Oberfläche hat („Vaccine Design – The subunit and adjuvant approach", hrsg. von M.F. Powell & M.J. Newman, 1995, S. 229-239). In dem Fall, dass die obigen zwei Typen von Aluminiumgelen gleichzeitig verwendet werden, tritt eine bestimmte Wechselwirkung auf, so dass die Größe der Partikel in der Lösung erhöht sein kann und die Adsorptionskapazität gegenüber Protein verringert sein kann. Zusätzlich hat die elektrische Ladung der Oberfläche jedes Komponentenantigens der Hepatitis B-Vakzine und der kombinierten Vakzine allgemein eine negative elektrische Ladung der Oberflächen in einem physiologischen pH-Bereich. Daher ist das Aluminiumhydroxidgel als Adsorptionsmittel geeignet.
Im konventionellen Stand der Technik wurde die Komponente des Adsorptionsmittels, wie das Aluminiumhydroxidgel und das Aluminiumphosphatgel, in Kombination verwendet („co-used") (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/24148 ), aber basierend auf dem obigen Grund urteilten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass das Adsorptionsmittel der kombinierten Vakzine den gleichen Salztyp aufweisen sollte und das Aluminiumhydroxidgel, welches als ein Adsorptionsmittel verwendet wird, ein wichtiger Faktor zum Erhalten eines bestimmten Adsorptionsverhältnisses jedes Komponentenantigens ist.
Außerdem schließen anderen Komponentenantigene außer dem Hepatitis B-Antigen in der kombinierten Vakzine, hergestellt mittels der vorliegenden Erfindung, Proteine als eine Hauptkomponente ein, wohingegen im Fall der Hepatitis B-Vakzine das Antigen allgemein als Partikel-Typ, welcher eine Phospholipidschicht einschließt, vorliegt. Es ist daher bevorzugt, dass, wenn die Hepatitis B-Vakzine für eine kombinierte Vakzine, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, hergestellt wird, ein neutrales oberflächenaktives Mittel, wie Polysorbat 20 (Tween 20), Polysorbat 80 (Tween 80) und Triton X-100, zugegeben werden, um eine gewisse Interferenz bzw. Beeinflussung durch die anderen Antigene hinsichtlich der Phospholipidkom ponente des Hepatitis B-Vakzine-Antigens, welches eine Phospholipidschicht einschließt, zu verringern.
Da der Titer der Hepatitis B-Vakzine in dem Fall, dass die Menge des neutralen oberflächenaktiven Mittels hoch ist, dazu neigt, abzunehmen, ist es bevorzugt, dass das neutrale oberflächenaktive Mittel in einem Massenverhältnis unterhalb von 50% hinsichtlich der Proteinmenge des Hepatitis B-Oberflächenantigens zugegeben wird, aber die obige Menge ist nicht darauf beschränkt.
In der vorliegenden Erfindung wird Corynebacterium diphtheria, PW Nr. 8, als ein Antigen der Diphtherie hergestellt und in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. Das Diphtherietoxoid ist bevorzugt, welches durch Entgiften des Diphtherietoxins, welches mittels eines konventionellen Verfahrens gereinigt wird, erhalten wird. Die Menge des Antigens ist vorzugsweise 10 bis 25 Lf, basierend auf der pädiatrischen Dosis. Als ein Tetanus-Antigen wird Clostridium tetanii, Harvard, in einem geeigneten Kulturmedium unter anaerober Bedingung kultiviert. Das Tetanustoxoid, welches durch Entgiften des Tetanustoxins erhalten wird, gereinigt mittels des konventionellen Verfahrens, ist geeignet. Die Menge des Antigens ist vorzugsweise 1 bis 5 Lf, basierend auf der pädiatrischen Dosis. Zusätzlich wird das Pertussis-Antigen in einem geeigneten Kulturmedium unter Verwendung von Bordetella Pertussis, Tohama-Phase I, kultiviert bzw. erzeugt und mehrere Arten von Antigenprotein, einschließlich eines Pertussistoxoids, werden mittels eines konventionellen Verfahrens aus einem Kulturüberstand aufgereinigt und entgiftet. Gereinigte Pertussis-Antigene oder ein Ganzzell-Pertussis-Antigen sind geeignet. Hierin wird das Herstellungsverfahren einer kombinierten Vakzine bereitgestellt, in welchem im Fall mehrerer Arten von Antigenen die Gesamtmenge der Antigene unterhalb 20 μgPN, basierend auf der pädiatrischen Dosis, liegt und im welchem im Fall des Ganzzell-Pertussis-Antigens die Menge des Antigens vorzugsweise unter 20 OU ("OE"), basierend auf der pädiatrischen Dosis, liegt. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren zum Herstellen einer kombinierten Vakzine gerichtet, in welcher die mehreren gereinigten Antigenproteine ein entgiftetes Pertussistoxoid und ein filamentöses Hämagglutinin(FHA)-Antigen einschließen.
Vorzugsweise ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen einer kombinierten Vakzine in einer derartigen Weise gerichtet, dass die Menge des rekombinanten Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens, welches mittels eines gentechnologischen Verfahrens als ein Hepatitis B-Antigen hergestellt wurde, 5 bis 10 μg, basierend auf der pädiatrischen Dosis, beträgt. Stärker bevorzugt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen in einer derartigen Weise gerichtet, dass das Hepatitis B-Oberflächenantigen durch Mischen mittels Rühren bei 2 bis 8°C für 3 bis 20 Stunden an ein Adsorptionsmittel adsorbiert wird. Um den optimalen Gehalt an Adsorptionsmittel zum Herstellen der kombinierten Vakzine zu finden, wurde das Adsorptionsverhältnis für jede Antigenkomponente bei jeder Adsorptionsmittelkonzentration analysiert. Wenn die Aluminiumionen-Endkonzentration zu dem Zeitpunkt, wenn die finale Kombination abgeschlossen ist, unterhalb von 0,5 mg/ml liegt, war als ein Ergebnis das Adsorp tionsverhältnis jedes Antigens relativ verringert (wie in 1 gezeigt). Zusätzlich ist durch Regulierung (WHO, „Requirements for diphtheria, tetanus, Pertussis and combined vaccines" in Technical Report Series Nr. 800, 1990, S. 87 bis 179) festgelegt, dass die Aluminiumionenkonzentration unter 1,25 mg/ml in dem Aluminiumgel, das für die Vakzine verwendet wird, liegen soll. Daher liegt bei dem Aluminiumhydroxidgel die Aluminiumionen-Endkonzentration vorzugsweise in dem Bereich von 0,5 bis 1,25 mg/ml und stärker bevorzugt in dem Bereich von 0,7 mg/ml.
Um eine Möglichkeit zu vermeiden, dass das Adsorptionsverhältnis jedes Komponentenantigens durch eine Abstoßungskraft, die bei jedem Komponentenantigen verursacht wird, verringert wird – sogar nachdem die Kombination jeder Komponente vervollständigt ist – werden zusätzlich die Antigenität und die Level der Antikörperbildung jedes Komponentenantigens in den relativen Prozentsatz konvertiert, um jene Werte zwischen zwei Proben zu vergleichen: eine Probe, in der die andere Komponente außer Aluminiumhydroxid zuvor kombiniert wurde und bei der dann Aluminiumhydroxidgel im Überschuss („suplus") zusätzlich zugegeben wird, und eine Probe, bei der das Adsorptionsmittel in der gleichen Konzentration zuvor zugegeben wurde, bevor die Kombination vervollständigt ist. Die Veränderung der Antigenität und der Level der Antikörperbildung nimmt ab, wenn das überschüssige Adsorptionsmittel zugegeben wird, sogar nachdem die Kombination jeder Komponente vervollständig ist (wie in 2 gezeigt).
In dem Fall der Probe, in welcher das Polysorbat 80 (Tween 80) zugegeben wird, wurden zusätzlich die Antigenität und der Titer hinsichtlich der Hepatitis B aufrechterhalten (wie in 2 gezeigt). Es wird erwartet, dass ein ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, sogar wenn neutrale oberflächenaktive Mittel, wie Polysorbat 20 und Triton X-100, innerhalb geeigneter Konzentrationen verwendet werden. Wie in 2 gezeigt, werden die Probe 1 und die Probe 2 in der Weise hergestellt, dass Aluminiumhydroxidgel im Überschuss zusätzlich zugegeben wird, nachdem die Kombination jeder Komponente vervollständigt ist, bzw. dass das Adsorptionsmittel in der gleichen Konzentration zuvor zugegeben wird, bevor die Kombination vervollständigt ist.
Vorzugsweise ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen einer kombinierten Vakzine gerichtet, in welcher die Aluminiumionenkonzentration des Aluminiumhydroxidgels in dem Bereich von 0,5 bis 1,25 mg/ml liegt. Stärker bevorzugt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen einer kombinierten Vakzine gerichtet, welche einen Schritt des Zugebens von überschüssigem Adsorptionsmittel in dem Bereich einschließt, der den Konzentrationsbereich an Aluminiumionen von 0,5 bis 1,25 mg/ml nicht überschreitet, nachdem die protektiven Antigene, die an das Adsorptionsmittel adsorbiert sind, kombiniert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine inhärente Adsorption jedes Komponentenantigens in der kombinierten Vakzine aufrechtzuerhalten und eine Immunität zu erhöhen.
Was das Pertussis-Antigen angeht, wird allgemein in Korea und einigen anderen Ländern ein gereinigtes Pertussis-Antigen verwendet. Da einige amerikanische Länder und die Länder der Dritten Welt das Ganzzell-Pertussis-Antigen verwenden, welches entgiftet ist. Daher wird in der vorliegenden Erfindung der anwendbare Bereich der kombinierten Vakzine durch die Untersuchung über das Kombinationsverfahren unter Verwendung des Ganzzell-Pertussis-Antigens erweitert. In diesem Fall wurde die Kombination in dem gleichen Verfahren durchgeführt wie bei dem Verwenden des erwähnten gereinigten Pertussis-Antigens, wobei dadurch eine Probe erhalten wird, die zum Aufrechterhalten einer Immunität jeder Komponente befähigt ist (wie in Tabelle 1 gezeigt).
In dem Fall der DTP-Vakzine, welche ein Ganzzell-Pertussis-Antigen einschließt, wird allgemein ein Aluminiumphosphatgel als Adsorptionsmittel verwendet. Um eine kombinierte Vakzine hinsichtlich des Hepatitis B-Antigens herzustellen, wird die DTP-Vakzine jedoch unter Verwendung des Aluminiumhydroxidgels hergestellt. In diesem Fall war die Immunität hinsichtlich der Pertussis verringert, aber wenn Aluminiumhydroxidgel im Überschuss zusätzlich zugegeben wurde, nachdem die Kombination jeder Komponentenvakzine vervollständigt war (Probe A), war es möglich, eine gewünschte Immunität aufrechtzuerhalten. Als eine Referenz wird die Probe B in der Weise hergestellt, dass das Adsorptionsmittel in der gleichen Konzentration zuvor zugegeben wurde, bevor die Kombination vervollständigt war.
Die Sicherheit und Wirksamkeit der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten kombinierten Vakzine wurde basierend auf den folgenden Verfahren bewiesen. Zuerst wurde eine Überdosis der kombinierten Vakzine an einen Nager verabreicht und es wurde geprüft, dass als Ergebnis der Biopsie (das Ergebnis derselben wird nicht bereitgestellt) keine Läsion beobachtet wurde. Zusätzlich wurde der Antikörperspiegel gegen jedes Antigen in einer Gruppe (Gruppe 2), bei welcher eine kombinierte Vakzine an einen Affen verabreicht wurde, und in einer Gruppe (Gruppe 1), in welcher jede Vakzine von DTP und Hepatitis B gleichzeitig verabreicht wurde, gemessen. Als ein Ergebnis des t-Tests hinsichtlich der Antikörpermenge zwischen den zwei Gruppen wurde beim Vergleich des Ergebnisses der Gruppe 2 mit dem Ergebnis der Gruppe 1 evaluiert, dass die kombinierte Vakzine eine gleichwertige oder bessere Immunität gegen jedes Antigen im Vergleich zur Gruppe mit gleichzeitiger Injektion jeder Vakzine zeigte (wie in 3 gezeigt). (Das Ergebnis der Statistik wird nicht bereitgestellt).
Als Schlussfolgerung wurde das Kombinationsverfahren in der vorliegenden Erfindung entwickelt, bei welchem eine Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Immunkomponenten eliminiert wurde und keine immunogene Wirkung abnahm. Beim Unterteilen jeder Immunkomponente, die für die kombinierte Vakzine verwendet wurde, basierend auf physikalischen und chemischen Eigenschaften, können die immunogenen Komponenten in ein Proteinantigen (Diphtherie-Antigen, Tetanus-Antigen, gereinigtes Pertussis-Antigen), ein Antigen, bestehend aus Protein und Phospholipidschicht (Hepatitis B-Antigen), und ein Antigen, bestehend aus einer abgetöteten ganzen Zelle (ein Ganzzell-Pertussis-Antigen), etc. unterteilt werden. Es kann daher vorhergesagt werden, dass eine Kombination mit einem anderen Antigen einer Einzelvakzine, basierend auf den physikalischen und chemischen Charakteristika der Komponenten, implementiert werden kann. Eine Kombination einer zusätzlichen Vakzine kann hinsichtlich der Erkrankungen (Haemophilus influenza, Polio), welche bei den Säuglingen bzw. Kleinkindern durch die kombinierten Vakzinen, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, verhindert werden sollten, möglich sein.
Die Körpervakzinierungsperiode („body vaccination period") des kombinierten Vakzinmittels gemäß der vorliegenden Erfindung kann (wie) die früheren Vakzinierungsperioden der DTP-Vakzine oder der Hepatitis B-Vakzine sein. In dem Fall, dass es das Hepatitis B-Antigen in dem Körper der Mutter gibt, ist es bevorzugt, dreimal bei dem zweiten, vierten und sechsten Monat zu impfen. In dem Fall, dass es kein Hepatitis-B(Antigen) im Körper der Mutter gibt, wird als geeignete Vakzinierungsperiode die Hepatitis B-Vakzine singulär nach der Geburt geimpft und anschließend wird die zusätzliche Vakzinierung unter Verwendung einer kombinierten Vakzine durchgeführt. Eine geeignete Vakzinierung bzw. Vakzination hinsichtlich der Säuglinge bzw. Kleinkinder kann über ein Muskel- oder Subkutaninjektionsverfahren erfolgen. Die Dosis („doze") des Antigens von Diphtherie, Tetanus, Pertussis bzw. Hepatitis B in der kombinierten Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung ist die gleiche wie die Antigendosis jeder Einzelvakzine für den Säugling bzw. das Kleinkind.
Beispiel 1
Herstellung von Hepatitis B-Antigen
Die Hefezelle, welche zum Exprimieren des Hepatitis B-Oberflächenantigens durch ein gentechnologisches Verfahren befähigt ist, wird intensiv kultiviert. 1 kg des Präzipitats von Hefezellen, welches durch die Zentrifugation erhalten wird, wird in einem Verhältnis von 1:2 in einer Pufferlösung (0,5M NaCl, 10mM EDTA, 0,01% Thimerosal, 0,1 M Phosphat, pH 7,0) verdünnt. Die verdünnte Lösung fließt durch eine Mühle mit Glasperlen bzw. Glaskügelchen („glass bead beator") (oder Dynomill), um dadurch die Zellwände usw. aufzubrechen. Die erhaltene Lösung wird mit einem neutralen oberflächenaktiven Mittel (Tween-Gruppe oder Triton-Gruppe) mit 0,5% versetzt und gleichförmig durch Rühren bei 4°C gemischt. Natriumhydroxid wird zu der resultierenden Lösung zugegeben, um dadurch pH 11 zu erhalten, und anschließend wird durch Rühren bei 4°C 5 Stunden lang gemischt. Eine verdünnte Salzsäure wurde zu der resultierenden Lösung zugegeben, um dadurch pH 4 zu erhalten. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation bei 6000 UpM für 15 Minuten unter Verwendung der Zentrifuge (ROTOR: JA-14, Beckman Inc., USA) entfernt und die obere Lösung, einschließlich des Hepatitis B-Oberflächenantigens, wurde erhalten. Der pH der oberen Lösung wurde auf 7 eingestellt und anschließend wurde Siliciumdioxid dazu zugegeben und es wurde bei 4 bis 25°C 3 bis 16 Stunden lang gemischt, so dass das Hepatitis B-Oberflächenantigen an das Siliciumdioxid adsorbiert wurde. Das Silicagel, welches vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist Aerosil 380 (Degussa, USA), welches feines Kieselsäuregel („fine hydration silica") oder was serfreies Siliciumdioxid einschließt, mit einem wirksamen („valid") Oberflächeninhalt von 10 bis 500 mm²/g. Um die Kontaminanten von dem Siliciumdioxid, an welches das Hepatitis B-Oberflächenantigen adsorbiert ist, zu entfernen, wird die resultierende Lösung zweimal unter Verwendung von Natriumphosphat/Natriumchlorid-Pufferlösung mit pH 7 gewaschen. Das gewaschene Siliciumdioxid wurde mit der Natriumcarbonat-Pufferlösung mit pH 9,6 für etwa 2 Stunden in Kontakt gebracht, um dadurch ein Oberflächenantigen zu desorbieren. Das somit abgetrennte Oberflächenantigen hatte eine Proteinreinheit von über 90% in der Lösung. Die resultierende Lösung wurde in die DEAE-Sepharose (PHARMACIA, Schweden) fließen gelassen, welche unter Verwendung der genannten Natrium-Pufferlösung äquilibriert war, um dadurch ein Oberflächenantigen spezifisch zu binden und die in der Säule abgetrennten Substanzen unter Verwendung der genannten Pufferlösung zu entfernen. Kontaminanten, die schwach an die Säule gebunden waren, wurden unter Verwendung der Pufferlösung, die 0,05 bis 0,1M Natriumchlorid beinhaltete, eluiert. Danach wurde das Hepatitis B-Oberflächenantigen unter Verwendung der genannten Pufferlösung, die 0,2M Natriumchlorid beinhaltete, eluiert. Die somit eluierte Lösung wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, welche zum Abtrennen von Substanzen mit einem Molekulargewicht über 100.000 befähigt ist, konzentriert und das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation abgetrennt und entfernt und die obere Lösung wurde gesammelt und es wurde eine Gelpermeationschromatographie (Sepharose CL-4B, PHARMACIA, Schweden) bezüglich der gesammelten oberen Lösung durchgeführt. Die Fraktionen, welche ein reines Oberflächenantigen einschlossen, wurden durch Elektrophorese bestätigt und sie wurden als das Hepatitis B-Antigen verwendet. Um eine Wechselwirkung mit jedem des Hepatitis-Oberflächenantigens zu verringern, wurde zusätzlich Tween 80 mit 0, 5, 10 μg pro 1 ml zugegeben und anschließend wurde die Wirkung von Tween 80 beobachtet (wie in 2 gezeigt).
Beispiel 2
Herstellung von Diphtherietoxoid
Das Corynebacterium diphtheria PW Nr. 8 wurde bei 35°C 24 Stunden lang in dem Nähragar-Kulturmedium (DIFCO, USA) kultiviert und es wurden zweimal Subkultivierungen durchgeführt („subcultured"). Eine der Kolonien wurden bei 35°C 24 Stunden lang in 2 ml Hirn-Herz-Bouillon-Kulturmedium („brain heart infusion culture medium") (DIFCO, USA) kultiviert und 1,2 ml von diesem wurden zum Inokulieren von 300 ml des modifizierten Muller-Kulturmediums (Literaturverweis: Stainer, et al., Canadian J. Microbiol., 14:155, 1968) verwendet und es wurde 36 Stunden lang bei 35°C kultiviert. Nach der Kultur wurden die Zellen aus der Kultivierungslösung entfernt und die Toxinlösung wurde gesammelt und bei 4°C mit Ammoiumsulfat versetzt. Die Endkonzentration wurde auf 25% (G/V) eingestellt und der pH wurde auf 8,0 eingestellt. Die Kultivierungslösung, bei der pH und Salzkonzentration eingestellt waren, wurde in die Phenyl-Sepharose-Säule getropft, welche zuvor unter Verwendung von 10M Tris-Pufferlösung pH 8,0, die 25% (G/V) Ammoniumsulfat beinhaltete, äquilibriert worden war. Die gleiche Pufferlösung, die als Säulen-Äquilibrierungslösung verwendet worden war, und 10mM Tris-Pufferlösung (pH 8,0), die 15% (G/V) Ammoniumsulfat beinhaltete, wurden sequentiell durch die Säule fließen gelassen, um dadurch Verunreinigungen zu entfernen. Das Toxin wurde unter Verwendung von 10mM Tris-Pufferlösung (pH 8,0), welches kein Salz beinhaltete, eluiert. Die eluierte Diphtherietoxoid-Lösung wurde gesammelt und gegen 10mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4), die 150mM Natriumchlorid beinhaltete, dialysiert. Nachdem das Dialyseverfahren abgeschlossen war, wurde Formalin zugegeben, so dass die Endkonzentration 0,05% (G/V) betrug, und die resultierende Lösung wurde bei 37°C 1 Stunde lang umgesetzt und Lysin wurde zugegeben, wobei dadurch die Endkonzentration von 0,05M erhalten wurde, und anschließend wurde die resultierende Lösung 4 Wochen lang bei 37°C entgiftet. Die Toxoidlösung wurde gegen 10mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) mit Natriumchlorid dialysiert, um dadurch das Formalin vollständig zu entfernen, und Thimerosal wurde bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,01% (G/V) zugegeben. Die resultierende Lösung wurde als Diphtherietoxoid-Lösung verwendet.
Beispiel 3
Herstellung von Tetanustoxoid
Clostridium tetanii (Harvard-Stamm) wurde mittels der Methode mit geschmolzenem Agar mit sterilisiertem Leber/Galle-Agarmedium („liver-bile agar medium") (DIFCO, USA) kultiviert. Wenige Kolonien aus der obigen Kultur wurden zum Inokulieren von 2 ml Hirn-Herz-Bouillon-Kulturmedium (DIFCO, USA), das 0,3% (G/V) Hefeextrakt (DIFCO, USA) beinhaltete, mit einem verringerten Sauerstoffspiegel verwendet und sie wurden 24 Stunden lang im anaeroben Zustand bei 35°C kultiviert. Und dann wurde die Kulturlösung zum Inokulieren von 500 ml eines vollständig Stickstoff-gesättigten Hirn-Herz-Bouillon-Kulturmediums (DIFCO, USA), das 0,3% (G/V) Hefeextrakt beinhaltete, verwendet und es wurde 7 Tage lang im anaeroben Zustand bei 35°C kultiviert. Nach der Kultes wurden die Zellen aus der Kulturlösung entfernt, die Toxinlösung wurde gesammelt und mit Ammoniumsulfat bei 4°C versetzt, wobei dadurch die Endkonzentration von 60% (G/V) erhalten wurde, und es wurde 24 Stunden lang gemischt und es wurde vollständig gemischt, um dadurch mittels Zentrifugation ein Präzipitat zu erhalten. Das Präzipitat wurde in einer kleinen Menge destillierten Wassers gelöst und das unlösliche Material wurde entfernt. Die resultierende Lösung wurde in die Sephacryl („Sephacryl") S-100-Säule getropft, welche zuvor unter Verwendung von 10mM Tris-Pufferlösung (pH 8,0), die 0,5M Natriumchlorid beinhaltete, äquilibriert worden war. Die gleiche Pufferlösung wurde hindurchfließen gelassen, wobei dadurch das getrennte Toxin eluiert wurde. Die Tetanustoxin-Lösung wurde gesammelt und gegen 10mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4), die 150mM Natriumchlorid beinhaltete, dialysiert. Nach der Dialyse wurde Formalin zum Erhalt der Endkonzentration von 0,025% (G/V) zugegeben und 1 Stunde lang bei 37°C umgesetzt. Danach wurden Lysin und Natriumhydrogencarbonat bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,05mM bzw. 0,04M zugegeben und es wurde 4 Wochen lang bei 37°C reifen gelassen und entgiftet. Nach der Entgiftung wurde die Toxoidlösung gegen 10mM Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4), die 150mM Natriumchlorid beinhaltete, dialysiert und das Formalin wurde vollständig entfernt. Thimerosal wurde zum Erhalt der Endkonzentration von 0,01% (G/V) zugegeben und (dies) wurde als Tetanustoxoid-Lösung verwendet.
Beispiel 4
Herstellung von gereinigtem Pertussis-Antigen-Protein
Bordetella Pertussis, Tohama-Phase I, wurde in Bodet-Gengo-Agar-Kulturmedium (DIFCO, USA), das 15% Kaninchenblut beinhaltete, bei 35°C 72 Stunden lang kultiviert und es wurde zweimal passagiert. Wenige Kolonien wurden zum Inokulieren in 50 ml Stanor-Sholte-Kulturmedium verwendet und sie wurden bei 35°C 48 Stunden lang kultiviert. Die auf diese Weise kultivierte Lösung wurde zum erneuten Inokulieren in 500 ml geändertem Stanor-Sholte-Kulturmedium (Literaturverweis, Imazumi et al., INFECT.-IMMUN., 1983, Bd. 41, S. 1138) verwendet („re-inoculated") und es wurde 36 Stunden lang bei 35°C kultiviert. 10%ige wässrige Thimerosal-Lösung wurde zu der Kultivierungslösung zum Erhalt der Endkonzentration von 0,01% zugegeben, um dadurch das Wachstum der Pertussis-Bakterien zu verhindern, und anschließend wurden die Zellen mittels Zentrifugation entfernt. Das dreifache Volumen an destilliertem Wasser wurde zu der resultierenden Lösung zugegeben und es wurde gut gemischt. Der gegenwärtige pH wurde unter Verwendung von 1N Schwefelsäure auf pH 6,0 verringert. Die resultierende Lösung wurde in eine CM-Sepharose-Säule getropft, welche zuvor unter Verwendung von 10mM Natriumphosphat-Puffer mit pH 6,0 äquilibriert worden war. Die gleiche Pufferlösung wie die Säulen-Äquilibrierungslösung wurde durch die Säule fließen gelassen, um dadurch die Substanzen zu entfernen, welche nicht an die Säule gebunden waren, und die Verunreinigungen, welche schwach an die Säule gebunden waren, wurden unter Verwendung der gleichen Pufferlösung wie bei der Säulen-Äquilibrierungslösung, die 100mM Natriumchlorid beinhaltete, entfernt. Als keine Verunreinigungen mehr aus der Säule eluierten, wurden die gebundenen Materialien mit einem linearen Gradienten eluiert, gebildet mittels der Säulen-Äquilibrierungslösung, die 100mM Natriumchlorid und 600 mM Natriumchlorid beinhaltete, und zwar mit dem gleichen Volumen, so dass eine Fraktion, die Pertussis-Antigen-Protein, wie Pertussis-Toxin und FHA (filamentöses Hämagglutinin) beinhaltete, abgetrennt wurde. Die Antigenfraktion wurde unter Verwendung von 10mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 8,0) mit dem zweifachen Volumen, um pH 8,0 zu erhalten, verdünnt. Die resultierende Lösung wurde in eine Hydroxyapatitsäule getropft, welche zuvor unter Verwendung von 10mM Natriumphosphat-Pufferlösung mit pH 8,0 äquilibriert worden war. Die gleiche Pufferlösung wie die Säulen-Äquilibrierungslösung, die 100mM Natriumchlorid beinhaltete, wurde durch die Säule fließen gelassen, um dadurch die Substanzen, welche nicht an die Säule gebunden waren, zu entfernen. Eine 80mM Natriumphosphat-Pufferlösung mit pH 8,0, die 100mM Natriumchlorid beinhaltete, wurde mit der gleichen Geschwindigkeit bzw. Rate wie die Tropfgeschwindigkeit durch die Säule fließen gelassen, um dadurch die Pertussistoxin-Fraktion abzutrennen. Als das Pertus sistoxin abgetrennt war, wurde 250mM Natriumphosphat-Pufferlösung mit pH 8,0, die 100mM Natriumchlorid beinhaltete, mit der gleichen Geschwindigkeit wie Tropfgeschwindigkeit fließen gelassen, um dadurch die FHA (filamentöses Hämagglutinin)-Fraktion abzutrennen. Das abgetrennte Pertussistoxin und FHA (filamentöses Hämagglutinin) wurden in 10mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,4), die 0,15% Natriumchlorid beinhaltete, bei 4°C dialysiert. Glycerin und Glutaraldehyd wurden zu der dialysierten Pertussistoxin-Probenlösung bis zum Erhalt der Endkonzentration von 50% (G/V) und 0,05% (G/V) zugegeben und es wurde 4 Stunden lang bei 37°C entgiftet. Natriumaspartat wurde bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,025M zugegeben, um dadurch den Entgiftungsprozess zu vervollständigen. Glycerin und Formalin wurden in die dialysierte FHA (filamentöses Hämagglutinin)-Probenlösung zum Erhalt von 50% (G/V) und 0,025% (G/V) zugegeben und es wurde 24 Stunden lang bei 37°C entgiftet. Lysin wurde bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,025M zugegeben, so dass der Entgiftungsprozess vervollständigt wurde. Jede Probenlösung wurde in 10mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,4), die 0,15% Natriumchlorid beinhaltete, bei Raumtemperatur dialysiert. Thimerosal wurde bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,01% (G/V) zugegeben. Anschließend wurden die entgiftete Pertussistoxin-Probenlösung und die entgiftete FHA (filamentöses Hämagglutinin)-Probenlösung mit einem Verhältnis von 1:4 gemischt und als ein Pertussis-Antigen-Protein verwendet.
Beispiel 5
Herstellung eines Ganzzell-Pertussis-Antigens
Pertussis-Bakterien, Bordetella Pertussis, Tohama-Phase I, wurden in Bodet-Gengo-Agar-Kulturmedium (DIFCO, USA), das 15% Kaninchenblut beinhaltete, 72 Stunden lang bei 35°C kultiviert und zweimal passagiert. Einige der Kolonien wurden zum Inokulieren von 50 ml Stanor-Sholte-Kulturmedium verwendet und 48 Stunden lang bei 35°C kultiviert. Die resultierende Lösung wurde wiederum zum Inokulieren von 500 ml des geänderten Stanor-Sholte-Kulturmediums (Literaturverweis: Imazumi et al., INFECT.-IMMUN., 1983, Bd. 41, S. 1138) verwendet und es wurde 36 Stunden lang bei 35°C kultiviert. 10%ige wässrige Thimerosal-Lösung wurde bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,01% in die Kulturlösung zugegeben, um dadurch das Wachstum der Pertussis-Bakterien zu verhindern und die somatischen bzw. ganzen Zellen („somatic"), basierend auf der Zentrifugation, zu sammeln. Die gesammelte somatische bzw. Ganzzell-Lösung („somatic solution") wurde in 10mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,4), die 0,15% Natriumchlorid beinhaltete, bei 4°C dialysiert. Formalin wurde zu der dialysierten somatischen Pertussis-Lösung bzw. Pertussis-Ganzzell-Lösung („Pertussis somatic solution") bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,025% (G/V) zugegeben und es wurde 4 Wochen lang bei 37°C entgiftet. Lysin wurde bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,025M zugegeben, um dadurch den Entgiftungsprozess zu vervollständigen. Die Probelösung wurde gegen 10mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,4), die 0,15% Natriumchlorid bein haltete, dialysiert und Thimerosal wurde bis zum Erhalt der Endkonzentration von 0,01% (G/V) zugegeben und dies wurde als das Ganzzell-Pertussis-Antigen verwendet.
Beispiel 6
Herstellung einer kombinierten Vakzine, die gereinigtes Pertussis-Antigen enthält
Schritt 1: Herstellung der Hepatitis B-Vakzine
Die Hepatitis B-Vakzine wurde unter Verwendung des Hepatitis B-Oberflächenantigens, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, hergestellt. Aluminiumhydroxidlösung wurde hergestellt, indem Aluminiumhydroxidgel zu der Phosphat-Pufferlösung zugegeben wurde. Die resultierende Lösung wurde langsam gemischt und die obige Antigenlösung wurde eingetropft und es wurde durch Rühren langsam 15 Stunden lang bei 4°C gemischt, wobei dadurch die Hepatitis B-Vakzine hergestellt wurde. Zu diesem Zeitpunkt betrug die Menge des Hepatitis-Oberflächenantigens 60 μg/ml, was im Vergleich zu der Menge des gewöhnlichen Hepatitis B-Oberflächenantigens dreimal höher konzentriert ist. Im Fall des ersten Beispiels betrug die Menge an Aluminiumionen in dem Aluminiumhydroxidgel 0,9 mg/ml. Im Fall des zweiten Beispiels betrug die Menge an Aluminiumionen im Aluminiumhydroxidgel 1,5 mg/ml (wie in 2 gezeigt).
Schritt 2: Herstellung der DTP-Kombinationsvakzine
Die DTP-Kombinationsvakzine wurde unter Verwendung des jeweiligen Antigens, das in den Beispielen 2, 3 und 4 hergestellt worden war, hergestellt. Die Aluminiumhydroxidlösung wurde hergestellt, indem Aluminiumhydroxidgel zu der Phosphat-Pufferlösung in dem konventionellen Verfahren zugegeben wurde. Während die resultierende Lösung langsam gemischt wurde, wurde jede Antigenlösung in die jeweilige Aluminiumhydroxidlösung getropft und es wurde durch Rühren langsam gemischt, um dadurch eine gleichförmige Adsorption zu realisieren, so dass die DTP-Kombinationsvakzine hergestellt wurde. Zu diesem Zeitpunkt war die Menge jedes Antigens im Vergleich zu der Menge jedes Komponentenantigens einer herkömmlichen DTP-Vakzine 1,5fach höher konzentriert. Die Menge an Aluminiumionen in dem Aluminiumhydroxidgel betrug 0,3 mg/ml.
Schritt 3: Herstellung der DTP-Hepatitis B-Kombinationsvakzine
Jede DTP-Vakzine und Hepatitis B-Vakzine, hergestellt in den Schritten 1 und 2, wurden langsam in einem Volumenverhältnis von 2:1 gemischt. Im Fall der ersten Probe wurde zusätzliches („surplus") Aluminiumhydroxidgel zugegeben, so dass die Menge der Aluminiumionen in dem Aluminiumhydroxidgel schließlich 0,7 mg/ml betrug, und es wurde kontinuierlich durch Rühren bei 25°C 1 Stunde lang gemischt, wobei dadurch eine stabile kombinierte Vakzine bzw. Kombinationsvakzine hergestellt wurde, welche nicht mit anderen Komponenten wechselwirkt. Im Fall der zweiten Probe wurde kein zusätzliches Aluminiumhydroxidgel zugegeben und es wurde kontinuierlich durch Rühren bei 25°C 1 Stunde lang gemischt, um dadurch die kombinierte Vakzine herzustellen. Die Mengen an Aluminiumionen in dem Aluminiumhydroxidgel der kombinierten Vakzinen der ersten und der zweiten Probe betrugen 0,7 mg/ml. Für die Unter suchung des Antikörpertiters war die Zusammensetzung der kombinierten Vakzine 20 μg des Hepatitis B-Oberflächenantigens, 25 Lf Diphtherietoxoid, 3 Lf Tetanustoxoid, 2,5 μgPN Pertussistoxoid und 10 μgPN Pertussis-FHA-Antigen (Pertussis-FHA (filamentöses Hämagglutinin)-Antigen), bezogen auf 1 ml (wie in 2 gezeigt).
Beispiel 7
Herstellung einer kombinierten Vakzine, die ein Ganzzell-Pertussis-Antigen enthält
Schritt 1: Herstellung der Hepatitis B-Vakzine
Die Hepatitis B-Vakzine wurde unter Verwendung des Hepatitis B-Oberflächenantigens, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, hergestellt. Ein Aluminiumhydroxidgel wurde zu Phosphat-Pufferlösung zugegeben, wobei dadurch die Aluminiumhydroxidlösung hergestellt wurde. Während die Lösung langsam gemischt wurde, wurde die obige Antigenlösung eingetropft und 15 Stunden lang bei 4°C vollständig durchmischt, wobei dadurch die Hepatitis B-Vakzine hergestellt wurde. Zu diesem Zeitpunkt betrug die Menge des Hepatitis B-Oberflächenantigens 60 μg/ml, was im Vergleich zu der Menge der gewöhnlichen Hepatitis B-Vakzine dreimal höher konzentriert war. Im Fall des ersten Beispiels betrug die Menge an Aluminiumionen 0,9 mg/ml in dem Aluminiumhydroxidgel. Im Fall des zweiten Beispiels betrug die Menge an Aluminiumionen 1,5 mg/ml in dem Aluminiumhydroxidgel (wie in 2 gezeigt).
Schritt 2: Herstellung der DTP-Kombinationsvakzine
Die DTP-Kombinationsvakzine wurde unter Verwendung jedes Antigens, das in den Beispielen 2, 3 und 5 hergestellt worden war, hergestellt. Das Aluminiumhydroxidgel wurde zu der Phosphat-Pufferlösung in dem konventionellen Verfahren zugegeben, um dadurch eine Aluminiumhydroxidlösung herzustellen. Während die resultierende Lösung langsam gemischt wurde, wurde jede obige Antigenlösung in die jeweilige Aluminiumhydroxidlösung eingetropft und es wurde vollständig gemischt. Eine gleichförmige Adsorption wurde realisiert, wobei dadurch eine DTP-Kombinationsvakzine hergestellt wurde. Zu diesem Zeitpunkt war die Menge jedes Antigens im Vergleich zu der Menge jedes Komponentenantigens der gewöhnlichen DTP-Vakzine 1,5fach höher konzentriert. Die Menge an Aluminiumionen betrug 0,3 mg/ml in dem Aluminiumhydroxidgel.
Schritt 3: Herstellung der DTP-Hepatitis B-Kombinationsvakzine
Jede DTP-Vakzine und Hepatitis B-Vakzine, hergestellt in den Schritten 1 und 2, wurden langsam mit einem Volumenverhältnis von 2:1 gemischt. Im Fall der ersten Probe wurde zusätzliches Aluminiumhydroxidgel zugegeben, so dass die Menge an Aluminiumionen letztendlich 0,7 mg/ml in dem Aluminiumhydroxidgel betrug, und die resultierende Lösung wurde kontinuierlich 1 Stunde lang bei 25°C gemischt, wobei dadurch eine stabile kombinierte Vakzine hergestellt wurde, welche nicht mit anderen Komponenten wechselwirkt. Im Fall der zweiten Probe wurde kein zusätzliches Aluminiumhydroxidgel zugegeben und die Lösung wurde kontinuierlich 1 Stunde lang bei 25°C gemischt, um dadurch eine kombinierte Vakzine herzustellen. Die Mengen an Aluminiumionen in dem Aluminiumhydroxidgel der kombinierten Vakzinen der Beispiele 1 und 2 betrugen 0,7 mg/ml. Für die Untersuchung des Antikörpertiters war die Zusammensetzung der kombinierten Vakzine 20 μg des Hepatitis B-Oberflächenantigens, 50 Lf Diphtherietoxoid, 10 Lf Tetanustoxoid und 20 OU ("OE") eines Ganzzell-Pertussis-Antigens, bezogen auf 1 ml (wie in 2 gezeigt).
Beispiel 8. Untersuchung der Antigenität in der kombinierten Vakzine
Die Untersuchung der Antigenität in der kombinierten Vakzine, hergestellt mittels der Beispiele 6 und 7, wurde über den Enzymimmunoassay (EIA) unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers und eines polyklonalen Antikörpers durch Vergleich mit dem Standard jedes Antigens bezüglich jedes Antigengehalts durchgeführt.
Zusätzlich wurde das Antigen, das an das Aluminiumsalz adsorbiert war, durch die Zentrifugation entfernt, um das Adsorptionsverhältnis jedes Antigens zu messen, und die Menge an abgetrenntem Antigen wurde unter Verwendung der oberen Lösung gemessen.
Der Mittelwert jedes Ergebnisses wurde in 1 und 2 gezeigt, und zeigt die relative Antigenität jedes Antigens.
Beispiel 9. Untersuchung der Antikörperbildung durch die kombinierte Vakzine
Test der Antikörperbildung bei dem Hepatitis B-Oberflächenantigen Die kombinierte Vakzine und die Hepatitis B-Vakzine, hergestellt in den Beispielen 6 und 7, wurden ICR-Mäusen geimpft, wobei 16 Mäuse in Gruppe 1 eingruppiert wurden, und den ICR-Mäusen wurde nach 18 Tagen Blut abgenommen. Das Serum wurde aus dem Blut abgetrennt. Der Antikörperspiegel gegen das Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde, bezogen auf die Einheit von IU/ml unter Verwendung des EIA (Enzymimmunoassay) gemessen und als geometrisches Mittel („geomean") des Antikörpertiters berechnet. Danach wurde der Titer der kombinierten Vakzine bezüglich der Hepatitis B-Vakzine berechnet.
2c und 2d zeigen die relativen Antikörpertiter der kombinierten Vakzine hinsichtlich jedes Antigens und Tabelle 1 zeigt die Werte jedes Titers.
Untersuchung der Antikörperbildung bei dem Diphtherie-Antigen
Die kombinierte Vakzine und die DTP-Vakzine, hergestellt in den Beispielen 6 und 7, wurden ICR-Mäusen geimpft, wobei 16 Mäuse in Gruppe 1 eingruppiert wurden. Den ICR-Mäusen wurde nach 28 Tagen Blut abgenommen. Das Serum wurde aus dem Blut abgetrennt. Der Antikörperspiegel gegen das Diphtherie-Antigen des Serums wurde, bezogen auf die Einheit von IU/ml unter Verwendung des EIA (Enzymimmunoassay) gemessen und als geometrisches Mittel („geomean") des Antikörpertiters berechnet. Danach wurde der Titer der kombinierten Vakzine bezüglich der DTP-Vakzine berechnet.
2c und 2d zeigen die relativen Antikörpertiter der kombinierten Vakzine hinsichtlich jedes Antigens und Tabelle 1 zeigt die Werte jedes Titers.
Untersuchung der Antikörperbildung bei dem Tetanus-Antigen
Die kombinierte Vakzine und die DTP-Vakzine, hergestellt in den Beispielen 6 und 7, wurden ICR-Mäusen geimpft, wobei 16 Mäuse in Gruppe 1 eingruppiert wurden. Den ICR- Mäusen wurde nach 28 Tagen Blut abgenommen. Das Serum wurde aus dem Blut abgetrennt.
Der Antikörperspiegel gegen das Tetanus-Antigen des Serums wurde, bezogen auf die Einheit von IU/ml unter Verwendung des EIA (Enzymimmunoassay) gemessen und als geometrisches Mittel („geomean”) des Antikörpertiters berechnet. Danach wurde der Titer der kombinierten Vakzine bezüglich der DTP-Vakzine berechnet.
2c und 2d zeigen die relativen Antikörpertiter der kombinierten Vakzine hinsichtlich jedes Antigens und Tabelle 1 zeigt die Werte jedes Titers.
Untersuchung der Antikörperbildung bei dem Pertussis-Antigen
Die kombinierte Vakzine und die DTP-Vakzine, hergestellt in den Beispielen 6 und 7, wurden ICR-Mäusen geimpft, wobei 16 Mäuse in Gruppe 1 eingruppiert wurden. Den ICR-Mäusen wurde nach 28 Tagen Blut abgenommen. Das Serum wurde aus dem Blut abgetrennt.
Der Antikörperspiegel gegen das Pertussis-Antigen des Serums wurde, bezogen auf die Einheit von IU/ml unter Verwendung des EIA (Enzymimmunoassay) gemessen und zwar als geometrisches Mittel („geomean) des Antikörpertiters. Danach wurde der Titer der kombinierten Vakzine bezüglich der DTP-Vakzine berechnet.

2c und 2d zeigen die relativen Antikörpertiter der kombinierten Vakzine hinsichtlich jedes Antigens und Tabelle 1 zeigt die Werte jedes Titers. Tabelle 1

	DTwP-Vakzine (Aluminiumphosphat als ein Adsorptionmittel)	DTwP-Vakzine (Aluminiumhydroxid als ein Adsorptionsmittel)	DTwP-HepB-Kombinationvakzine (Probe A)	DTwP-HepB-Kombinationsvakzine (Probe B)	Titerkriterium
Diphtherie Wirksamkeit (IU/ml)	>800	249,7	601,1	128,1	Über 30 IU/ml
Tetanus Wirksamkeit (IU/ml)	176,5	196,0	216,9	230,7	Über 40 IU/ml
Pertussis Wirksamkeit (IPU/ml)	20,2	3,2	25,4	5,5	Über 8 IPU/ml
Hepatitis B Relative Wirksamkeit (%)	-	-	196,8	103,9	Gleich oder über dem Wert der Standardprobe

Beispiel 10.
Vergleichende Wirksamkeitsuntersuchung beim Affen
Eine Untersuchung wurde durchgeführt, um die Immunogenität der kombinierten Vakzine bei einem Primaten zu beweisen und sie mit der konventionellen Einzelvakzine zu vergleichen. Sechs Affen (Gruppe 2), gebildet aus der gleichen Anzahl männlicher und weiblicher Affen, wurden mit der in Beispiel 6 hergestellten kombinierten Vakzine geimpft und 6 Affen (Gruppe 1), gebildet aus der gleichen Anzahl männlicher und weiblicher Affen, wurden mit jeder Komponentenvakzine gleichzeitig geimpft. Die gleichen Produkte wie die Produkte, mit denen jede Gruppe geimpft worden war, wurden erneut am 30. und 60. Tag geimpft. Von jedem Versuchstier wurde am 1., 29., 58. und 86. Tag, ausgehend vom initialen Vakzinierungsdatum, Blut abgenommen und der Antikörpertiter gegen jede Erkrankung wurde basierend auf dem ELISA-Verfahren, das für das Serum des Affen geeignet ist, gemessen.
3 zeigt das geometrische Mittel („geomean") des Antikörpertiters gegen jedes Antigen jeder Gruppe.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist sie auf ein Verfahren zum Herstellen einer kombinierten Vakzine zum gleichzeitigen Verhindern der Erkrankungen, wie Diphtherie, Tetanus, Pertussis und Hepatitis B etc., welche bei einem Säugling bzw. Kleinkind verhindert werden sollten, gerichtet. Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Erkrankungen, wie Diphtherie, Tetanus, Pertussis und Hepatitis B, welche bei einem Säugling bzw. Kleinkind verhindert werden sollten, unter Verwendung der kombinierten Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung gleichzeitig zu verhindern.
Da die vorliegende Erfindung in mehreren Formen ausgeführt werden kann, ohne den Geist oder die wesentlichen Charakteristika davon zu verlassen, sollte auch verstanden werden, dass die oben beschriebenen Ausführungsformen nicht durch irgendwelche Details der voranstehenden Beschreibung, soweit nichts anderes angegeben ist, beschränkt sind, sondern sie sollen eher breit innerhalb ihres Geistes und Rahmens, wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, ausgelegt werden und daher sollen alle Änderungen und Modifikationen, die innerhalb der Erfordernisse und Grenzen der Ansprüche liegen, oder Äquivalente derartiger Erfordernisse und Grenzen von den beigefügten Ansprüchen umfasst werden.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer kombinierten Vakzine, umfassend: (a) Bereitstellen individueller protektiver Antigene von Diphtherie-Antigen, Tetanus-Antigen, Pertussis-Antigen und Hepatitis-B-Antigen, (b) unabhängiges Adsorbieren jedes protektiven Antigens auf ein Adsorptionsmittel aus Aluminiumhydroxidgel und (c) Kombinieren jedes unabhängig adsorbierten protektiven Antigens.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend einen Schritt: Zugeben von zusätzlichem Aluminiumhydroxidgel nach dem Kombinieren jedes unabhängig adsorbierten protektiven Antigens.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aluminiumionenendkonzentration des Aluminiumhydroxidgels in dem Bereich von 0,5-1,25 mg/ml liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kombinierte Hepatitis-B-Antigen ein rekombinantes Hepatitis-B-Oberflächenantigen in einer Menge von 5-10 μg pro Dosis ist.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend einen Schritt: Zugeben eines neutralen oberflächenaktiven Mittels, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polysorbat 20, Polysorbat 80 und Triton^® X-100.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Hepatitis-B-Antigen durch Rühren mit einem Aluminiumhydroxid bei 2-8°C für 3-20 Stunden kombiniert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Diphtherie-Antigen ein Diphtherietoxoid in einer Menge von 10-25 Lf pro Dosis ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Tetanus-Antigen ein Tetanustoxoid in einer Menge von 1-5 Lf pro Dosis ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pertussis-Antigen ein gereinigtes Pertussis-Antigen in einer Menge unterhalb von 20 μgPN pro Dosis oder ein Ganzzell-Pertussis-Antigen in einer Menge unterhalb von 20 OU pro Dosis ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das gereinigte Pertussis-Antigen Pertussistoxoid, Pertussis-FHA (filamentöses Hämagglutinin) oder ein Gemisch davon ist.
Kombinierte Vakzine, wie gemäß einem der in den Ansprüchen 1 bis 10 beanspruchten Verfahren hergestellt.