DE69534946T2

DE69534946T2 - Verwendung von nackten Polynukleotiden zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Tumoren

Info

Publication number: DE69534946T2
Application number: DE69534946T
Authority: DE
Inventors: A. Dennis Del Mar CARSON; Eyal San Diego RAZ
Original assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 1994-11-03
Filing date: 1995-11-01
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2015-11-02
Also published as: DE69534946D1; US5679647A; EP0789574B1; EP0789574A1; WO1996014074A1; EP0789574A4; CA2203991C; AU4198196A; JPH10509702A; CA2203991A1; ATE323496T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines nackten Polynucleotids, das operativ für ein therapeutisch wirksames, Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, das Klasse-I-MHC-Moleküle an Antigen-präsentierenden Zellen bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Wirt, worin
das nackte Polynucleotid an die Haut des Wirts verabreicht wird;
die Haut eine hohe Konzentration an darin enthaltenen, Antigen-präsentierenden Zellen im Vergleich zu anderen Wirtgeweben aufweist;
das Tumor-assoziierte Antigen in den Antigen-präsentierenden Zellen ohne wesentliche Sekretion daraus exprimiert wird; und
die Zufuhr des Tumor-assoziierten Antigens im Wirt eine Th1-Antwort bevorzugt gegenüber einer Th2-Antwort induziert.
2. Stand der Technik
Das direkte Einführen eines biologisch aktiven Peptids oder Proteins in die Zellen eines Patienten kann von signifikantem therapeutischem Wert sein. Dieser Ansatz birgt jedoch auch mehrere Nachteile. Ein vordergründiges Problem ist das Risiko potenzieller Toxizitäten, insbesondere bei Dosierungen, die ausreichend sind, um eine biologische Antwort auf das Peptid hervorzurufen. Praktisch gesehen besteht auch das Problem der Kosten, die durch das Isolieren und Reinigen oder Synthetisieren der Peptide entstehen. Darüber hinaus ist die klinische Wirkung der Peptide auch durch ihre relativ kurze Halbwertszeit in vivo eingeschränkt, die üblicherweise aus ihrem Abbau durch jegliche Protease, die im Targetgewebe vorhanden ist, resultiert.
Aus diesen Gründen ist das Einführen eines Proteins in einen Patienten durch die Zufuhr eines Gens, das das Protein im Patienten/Wirt exprimiert, eine interessante Alternative zur Verabreichung des Proteins.
Im Jahr 1984 wurde am NIH eine Studie veröffentlicht, die zeigte, dass intrahepatische Injektion von nackter klonierter Plasmid-DNA für Eichhörnchen-Hepatitis in Eichhörnchen sowohl eine Virusinfektion als auch die Bildung von antiviralen Antikörpern in den Eichhörnchen förderte (Seeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5849-5852 (1984)). Mehrere Jahre später berichteten Felgner et al., dass sie Expression von Protein aus "nackten" Polynucleotiden (d.h. DNA oder RNA, die nicht mit Liposomen oder einem viralen Expressionsvektor assoziiert ist), die in Skelettmuskelgewebe injiziert wurden, erzielten (Felgner et al., Science 247, 1465 (1990); siehe auch die PCT-Anmeldung WO 90/11092). Felgner et al. vermuteten, dass Muskelzellen aufgrund der einmaligen Struktur von Muskelgewebe, das aus mehrkernigen Zellen, Sarkoplasmatischem Retikulum und einem Transversalsystem besteht, das sich bis tief in die Muskelzelle erstreckt, Polynucleotide effizient aufnehmen und exprimieren.
Auch wenn bisher angenommen wurde, dass Zellen anderer Gewebe auch in der Lage sein können, nackte Polynucleotide aufzunehmen, wurde Expression in anderen Geweben bis heute nur identifiziert, wenn die Zufuhr des exprimierten Gens über ein Zufuhrsystem, z.B. über liposomale Transformation der Zellen, erfolgte. Tatsächlich schlugen andere Forscher vor, dass Aufnahme und Expression nackter Polynucleotide in Geweben, die nicht Skelettmuskel sind, nicht auf nachweisbaren oder biologisch aktiven Niveaus stattfinden (siehe z.B. Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11277-11281 (1992) [Expression nach Aerosolzufuhr eines Gens trat unter Verwendung eines liposomalen Zufuhrsystems auf, jedoch nicht bei Einführung von DNA alleine]; und Tang et al., Nature 356, 162-154 (1992) [Injektion mit einer Vakzinen-"Kanone" eines hGH-Plasmids, gebunden an kolloidale Goldperlen, in die Haut von Mäusen rief keine Immunantwort hervor]).
Auch wenn sie im Allgemeinen für Genexpression innerhalb von Muskelzellen wirksam ist, erfordert Injektion von DNA oder RNA in Muskelzellen im Rahmen einer langfristigen Therapie den Einsatz wiederholter Injektionen, um Expressionsverlust durch Genabbau auszugleichen. Dieser Ansatz kann nicht nur zeitaufwendig und kostenintensiv, sondern aufgrund von Entzündungen, die an und nahe der Injektions stelle hervorgerufen werden, auch unpraktisch sein. Solche Entzündungsreaktionen können dazu führen, dass Muskel- oder andere Somazellen, in die Nucleotide eingeführt werden, selbst eine Immunantwort auf sich ziehen (siehe z.B. Beispiel I), und können zu schwerwiegender Myonekrose führen. Darüber hinaus besteht durch intramuskuläre Injektion von DNA nicht nur das Risiko einer Verletzung von Muskelgewebe, sondern auch, dass die Verletzung die Wirksamkeit der Therapie eindeutig beeinträchtigt. Forscher, die an der University of Ottawa arbeiten, beobachteten, dass Skelettmuskel das einzige Gewebe ist, für das erkannt wurde, dass es in der Lage ist, Reportergene aufzunehmen und zu exprimieren, die in Form von Plasmid-DNA transferiert werden, wobei jedoch die Erkenntnisse der Forscher darauf hinweisen, dass Fasern, die durch das Injektionsverfahren geschädigt wurden, Plasmid-DNA weder aufnehmen noch exprimieren (Davis et al., Human Gene Therapy 4, 151-159 (1993)).
Obwohl weiters die Verwendung von intramuskulären Injektionen zumindest kurzfristig in Therapien wirksam sein kann, die auf Erkrankungen im Muskelgewebe selbst abzielen, ist sie wahrscheinlich zur Stimulierung einer gewebespezifischen Immun- oder anderen biologischen Antwort auf das exprimierte Peptid an einer anderen Stelle im Körper des Patienten weniger wirksam. Folglich ist intramuskuläre Injektion kein besonders günstiger Weg zur Erreichung der Expression von Peptiden an den primären Eintrittspunkten für zahlreiche Infektionen; d.h. Haut und Schleimhaut.
Weiters scheint es, dass intramuskuläre Injektionen von Polynucleotiden aufgrund der Freisetzung von jeglichem kodierten Protein durch Target-Muskelzellen zur Bildung sowohl von Antikörpern als auch zytotoxischen T-Zellen im Gewebe führt. Hingegen induziert die Injektion von Protein (z.B. in einem Impfschema) üblicherweise keine zytotoxische T-Zellbildung, da exogene Proteine nicht effizient in den Klasse-I-Processingstoffwechselweg eintreten.
In der PCT-Anmeldung WO 90/11092 (oben erläutert) schlagen die Erfinder vor, dass die Injektion von nackter DNA in Skelettmuskel oder andere somatischen Gewebe zu direkter Genexpression im Zytoplasma der injizierten Zellen führt. Die Erfin der schlagen weiters vor, dass das kodierte Protein anschließend in den Klasse-I-Processingstoffwechselweg eintreten, um zytotoxische T-Zellbildung zu induzieren (die für die Kontrolle entwickelter Virusinfektionen und Krebsarten erforderlich ist). Wie zuvor bereits erläutert, scheint es jedoch, dass anstelle dessen jegliche Somazelle, die Antigen exprimiert, zuerst das Antigen in den extrazellulären Raum zur Aufnahme durch Antigen-präsentierende Zellen freisetzen muss, bevor eine eingeschränkte zytotoxische Klasse-I-T-Zellantwort auf das Antigen induziert werden kann. Diese Schlussfolgerung wird durch jüngste Forschungsarbeiten in Bezug auf Antigen-Präsentation untermauert, im Rahmen derer die Beobachtung gemacht wurde, dass das Primen einer Immunantwort gegen eingeschränktes Klasse-I-Antigen, das ausschließlich in nicht-blutbildenden Zellen exprimiert wird, den Transfer dieses Antigens vor seiner Präsentation zu einer aus Wirtknochenmark abgeleiteten Zelle umfasst. Die Autoren schlossen daraus, dass "professionelle" Antigen-präsentierende Zellen (d.h. jene, deren erstrangiger Zweck Antigen-Präsentation ist) zur Induktion der eingeschränkten zytotoxischen Klasse-I-MHC-T-Lymphozyten ("CTLs"), die für die Behandlung von Tumoren in Krebserkrankungen notwendig sind, erforderlich waren (Huang et al., Science 264, 961-965 (1994)). Somit ist zumindest eine Voraussetzung, auf der das Verfahren zum Einführen von genetischem Material in Muskelzellen für Proteinexpression der PCT-Anmeldung WO 90/11092 basierte, möglicherweise nicht zutreffend.
Die Verwendung von intramuskulären Injektionen kann jedoch relativ hohe Konzentrationen an Proteinexpression, systemisch betrachtet vor dem Abbau des injizierten Gens, erzielen. Während diese Reaktion in Therapien wünschenswert ist, in denen Proteinersetzung das Ziel ist, kann sie in Immunisierungsprotokollen zu unerwünschten Toxizitäten führen, in denen relativ rasche Clearance oder geringere Expressionsniveaus optimal sind. Folglich wäre das Einführen des Gens in Gewebe, die regelmäßig abschuppen oder sich neu bilden (wie Haut z.B.) und/oder in Zellen mit einer relativ hohen Abnützungsrate in vivo (wie Antigen-präsentierende Zellen z.B.) ein nützlicherer Weg für Genimmunisierung.
Hinsichtlich Zufuhrsysteme für Gene bringen Mittel wie Virusvektoren, die das Gen in das Wirtsgenom einführen, potenzielle Gesundheitsrisiken in Verbindung mit Schädigungen des genetischen Materials in der Wirtszelle mit sich. Die Verwendung kationischer Liposomen oder einer biolistischen Vorrichtung (d.h. einer Vakzinen-"Kanone", die an Perlen gebundene Polynucleotide in Gewebe "schießen") zur Zufuhr von Genen in vivo ist intensiv in der Vorbereitung und erfordert auch gewisses Experimentieren, um geeignete Partikelgrößen für die Transmission in Targetzellen auszuwählen. Weiters bringen jegliche invasiven Mittel zum Einführen von Nucleotiden (z.B. Injektion) die Probleme von Gewebetraumata (insbesondere bei Langzeittherapien) mit sich und haben auch nur eingeschränkten Zugang zu bestimmten Targetgeweben wie beispielsweise Organen.
Mittel für nichtinvasive Zufuhr pharmazeutischer Präparate von Peptiden, wie Iontophorese und andere Mittel zur transdermalen Transmission, haben zumindest den Vorteil, das Problem des Gewebetraumas zu minimieren. Dennoch wird angenommen, dass die Bioverfügbarkeit von Peptiden nach transdermaler oder mukosaler Transmission durch die relativ hohe Konzentration von Proteasen in diesen Geweben eingeschränkt ist. Leider sind bis heute keine zuverlässigen Mittel zur Zufuhr von Peptiden (wie von Tumor-assoziierten Antigenen) durch transdermale oder mukosale Transmission von Genen, die für diese kodieren, verfügbar.
Die möglichen Vorteile einer erfolgreichen Verabreichung von Peptiden über In-vivo-Expression nackter Polynucleotide kann durch einen Vergleich mit dem aktuellen Entwicklungsstand der Allergenimmuntherapie veranschaulicht werden, worin einem Patienten sogenannte "Tumorantigene" verabreicht werden, um Krebs zu behandeln.
Herkömmliche Krebsimmuntherapieverfahren konnten bisher im Allgemeinen noch keine CTL-Antwort induzieren, die ausreichend gewesen wäre, um die Genesung von einer Malignität zu bewirken. Die meisten solcher Ansätze umfassten Injektion in den Patienten von getöteten, chemisch modifizierten Krebszellen in Adjuvans (siehe Quan et al., Cancer Treat. Res. 65, 257-277 (1993)). Was ein Problem darstellt, ist, dass die exogenen Proteinantigene, die in solchen Zellen vorhanden sind, durch Antigen-präsentierende Zellen aufgenommen werden und somit in lysosomale Vesikel eintreten, sodass auf Proteinantigen basierende Krebsvakzinen eingeschränkte Klasse-I-Immunantworten nicht induzieren können.
Ein anderes zentrales Problem für die Entwicklung eines wirksamen Verfahrens für Proteinvakzinen basierte Krebsimmuntherapie liegt im mangelhaften Wissen über die Identifikation von "echten Tumorantigenen", d.h. von Antigenen, die nur mit Zellen eines Tumors und keinen anderen Zellen assoziiert sind. Bis heute wurden keine solche echten Tumorantigene identifiziert. Jene, die angeblich am ehesten Tumorantigene sind, sind entweder embryonale Proteine, die durch transformierte Zellen neuerlich exprimiert wurden, oder Autoantigene, die nicht wirklich tumorspezifisch sind.
Jüngste Versuche zur Krebsimmuntherapie versuchten, Expression von immunstimulierenden Cytokin-Kodiergenen in Krebszellen zu stimulieren. Für das Einführen von Cytokingenen in Krebszellen wurde jedoch gezeigt, dass es zwar ihre Fähigkeit erhöhte, sekundäre Immunantworten zu stimulieren, dass es jedoch nicht die anfängliche Funktion von Antigen-Processing und -Präsentation ersetzen konnte, die durch professionelle, Antigen-präsentierende Zellen ausgeführt wurde. Somit war, außer bei einer geringen Zahl an Patienten, die an malignem Melanom erkrankt waren, Cytokin-basierte Immuntherapie bei der Erzielung einer wirksamen Behandlung von Malignitäten nicht erfolgreich (siehe z.B. Pandoll, Curr. Opin. Immunol. 5, 719-725 (1993)).
CTLs, die sich als eingeschränkte Klasse-I-Lymphozyten entwickelt haben, lysieren Targetzellen, die "Fremd"-Peptide, gebunden an ihre Klasse-I-MHC-Moleküle, exprimieren. Die primäre Funktion von Klasse-I-MHC-Molekülen ist offensichtlich, als Kanäle für das Display endogener Proteine an der Oberfläche von APCs als Peptid/MHC-Liganden für geeignete T-Zellrezeptoren zu wirken. Das Display endogener Peptid/MHC-Komplexe an Zelloberflächen ist für Targeting lytischer Aktivität von CTLs, spezifisch auf Zellen, die neue intrazelluläre Proteine nach Virusinfektion oder kanzerogener Transformation von Zellen synthetisieren, sowie für das Deletieren von selbstreaktiven T-Zellen im Thymus essenziell (siehe z.B. Shastri & Gonzalez, J.
Immunol. 150, 2724-2736 (1993)). Wie jedoch bereits an anderer Stelle hierin erwähnt, lassen jüngste Erkenntnisse darauf schließen, dass primäre T-Lymphozyten-Immunantworten nur durch professionelle Artigen-präsentierende Zellen induziert werden können. Weiters erfordert die Bildung einer eingeschränkten zytotoxischen Klasse-I-T-Lymphozytenantwort üblicherweise, dass das Antigen im Zytoplasma einer Zelle, d.h. von einer Antigen-präsentierenden Zelle, exprimiert wird (Huang et al., s.o., S. 964). Solche intrazelluläre Expression und Antigen-Präsentation wird durch extrazelluläre Verabreichung eines Tumor-assoziierten Antigens an einen Wirt nicht wirksam erreicht (wie im Verfahren, das von Quan et al., s.o., beschrieben wird) und würde auch nicht durch Einführen eines Tumor-assoziierten, Antigen-kodierenden Polynucleotids in Gewebezellen, wie z.B. Muskelzellen, wirksam erreicht werden (wie beispielsweise im Verfahren, das von Felgner et al., Science, s.o., und in der PCT-Anmeldung WO 90/11092 vorgestellt wird).
Ein anderes Problem bei Krebsimmuntherapie, die auf Immunisierung des Wirts gegenüber Tumor-assoziierten Antigenen beruhl, ist die Toleranz des Immunsystems des Wirts gegenüber solchen Antigenen. Jüngste Versuche schlugen vor, dass T-Lymphozyten-Immuntoleranz gegenüber einen Selbstantigen durch Immunisieren des Wirts mit einem Gemisch aus Selbstantigenen und fremden molekularen Mimetika solcher Antigene gebrochen werden kann (Mamula et al., J. Immunol. 152, 1453-1460 (1994)). Solche Gemische induzieren jedoch keine eingeschränkten Klasse-I-CTL-Antworten im Wirt, da die Antigene extrazelluläre, und nicht im Zytoplasma von APCs, exprimiert werden.
Es besteht daher Bedarf an einem Verfahren zur Behandlung von Krebs, das die Entwicklung von Tumor-assoziierten, Antigen-spezifischen eingeschränkten Klasse-I-CTLs induziert. Auch weisen diese Erkenntnisse auf einen Bedarf an einem Mittel zum Einführen eines Gens, das für ein biologisch aktives Peptid kodiert, in einen Wirt auf gewebespezifische Weise ohne signifikantes Gewebetrauma hin.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit all diesen Anforderungen.
Die Erfindung stellt die Verwendung eines nackten Polynucleotids, das operativ für ein therapeutisch wirksames, Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, das Klasse-I-MHC-Moleküle an Antigen-präsentierende Zellen bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Wirt bereit, worin
das nackte Polynucleotid an die Haut des Wirts verabreicht wird;
die Haut eine hohe Konzentration an darin enthaltenen Antigen-präsentierenden Zellen im Vergleich zu anderen Wirtsgeweben aufweist;
das Tumor-assoziierte Antigen in den Antigen-präsentierenden Zellen ohne nennenswerte Sekretion daraus exprimiert wird; und
die Zufuhr des Tumor-assoziierten Antigens im Wirt eine Th1-Antwort bevorzugt gegenüber einer Th2-Antwort induziert.
Die Details der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind in den beiliegenden Zeichnungen und der nachstehenden Beschreibung erläutert. Sind die Details der Erfindung bekannt, so ergeben sich für Fachleute zahlreiche zusätzliche Neuerungen und Änderungen.
DEFINITIONEN
Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um die Erläuterung der Erfindung zu vereinfachen. Fachleute werden jedoch erkennen, dass diese Definitionen auf Äquivalente erweitert werden können, ohne vom begründeten Schutzumfang oder von der grundlegenden Idee der Erfindung abzuweichen.

a. "Nackte(s) Polynucleotid(e)" bezieht sich auf DNA oder RNA und kann, je nach Eignung für den jeweiligen Zweck der Therapie, die gemäß der Erfindung praktiziert wird, Sense- und Antisense-Stränge umfassen. Polynucleotid in diesem Zusammenhang kann Oligonucleotide umfassen. Nackt in diesem Zusammenhang beschreibt Polynucleotide, die nicht mit kolloidalen Materialien (einschließlich liposomaler Präparate) Komplexe bilden und nicht in einem Vektor enthalten sind, der die Integration des Polynucleotids in das Wirtsgenom verursachen würde.
b. "Operativ kodierend" bezieht sich auf ein Polynucleotid, das modifiziert wurde, um Promotor- und andere Sequenzen, die für Expression und, sofern erwünscht, Sekretion des erwünschten Translationsprodukts, z.B. eines Peptids oder Proteins, erforderlich sind, zu umfassen. Alle Ausführungsformen der Erfindung können unter Verwendung bekannter Plasmidexpressionsvektoren praktiziert werden. Vorzugsweise umfassen diese Vektoren cDNA(s), die für das erwünschte Translationsprodukt kodiert/kodieren. Daher wird, außer der Kontext erfordert es anders, angenommen, dass sich "Polynucleotid" oder "nacktes Polynucleotid" auf operativ kodierende Sequenzen bezieht, die in einem geeigneten Plasmidexpressionsvektor enthalten sind, wofür hierin Beispiele bereitgestellt werden.
c. "Polynucleotidgemisch" soll sich auf mehr als eine und bis zu 200 Polynucleotidspezies beziehen, die unter der Steuerung desselben Promotors stehen.
d. "Synthese" bezieht sich auf durchwegs bekannte Mittel zum Synthetisieren von Polynucleotidsequenzen und kann das Isolieren und Reinigen nativer Polynucleotide umfassen.
e. "Peptid" bezieht sich auf kleine Peptide, Polypeptide, Oligopeptide und Proteine, die in vivo eine erwünschte biologische Wirkung zeigen.
f. "Iontophorese" bezieht sich auf ein bekanntes Mittel transdermaler Transmission, das zur Zeit verwendet wird, um Peptide auf kontinuierliche Weise einem Wirt zuzuführen. Insbesondere ist dies ein Verfahren, das den Transport ionischer Spezies durch Anlegen eines physiologisch annehmbaren elektrischen Stroms erleichtert. Dieses Verfahren und andere transdermale Transmissionsmittel werden in Chien et al., Transdermal Drug Delivery, "Novel Drug Delivery Systems", K. 7, Teil C, Marcel Dekker (1992), beschrieben, wovon die relevanten Offenbarungen durch diesen Verweis zum Zwecke der Veranschaulichung des Standes der Technik bezüglich Verfahren zur Wirkstoffzufuhr hierin aufgenommen sind.
g. "Detergenzien/Absorptionspromotoren" beziehen sich auf chemische Mittel, die zur Zeit auf dem Gebiet der Erfindung dafür bekannt sind, Absorption und Transfektion bestimmter kleiner Moleküle sowie Peptide zu erleichtern.
h. "Antigen-präsentierende Zellen" oder "APCs" umfassen bekannte APCs wie Langerhanssche Zellen, verschleierte Zellen afferenter Lymphgefäße, dendritische Zellen und ineinander verzahnte Zellen aus Lymphorganen. Die Definition umfasst auch einkernige Zellen wie (1) Lymphozyten und Makrophagen, die Polynucleotide gemäß der Erfindung in Haut aufnehmen und exprimieren, und (2) einkernige Zellen, die in hierin enthaltenen, histologischen Aufnahmen dargestellt werden. Diese Zellen sind keine Gewebezellen, sind jedoch wahrscheinlich Antigen-präsentierende Zellen. Die Wichtigsten unter diesen in Hinblick auf die vorliegende Erfindung sind jene APCs, die dafür bekannt sind, in mit Epithel und Thymus zusammenhängenden Bereichen der Lymphgewebe zahlreich vorhanden zu sein, einschließlich Epidermis und Schleimhaut-Plattenepithel der Mundschleimhaut, Vagina, Zervix und Speiseröhre (Bereiche mit "relativ hohen" Konzentrationen an APCs). Zusätzlich zu ihren nachstehend bereitgestellten Definitionen beziehen sich daher "Haut" und "Schleimhaut", wie hierin verwendet, insbesondere auf diese Stellen hoher Konzentration von APCs. Darüber hinaus sollen sich "professionelle APCs" auf Zellen beziehen, deren primärer Zweck Antigen-Präsentation ist; d.h. aus Knochenmark stammende Zellen.
i. "Wirt" bezieht sich auf den Rezipienten der Therapie, die gemäß der Erfindung durchzuführen ist. Der Wirt kann jedes beliebige Wirbeltier sein, ist jedoch vorzugsweise ein Säugetier. Ist er ein Säugetier, so ist der Wirt vorzugsweise ein Mensch, kann jedoch auch ein Nutztier oder Haustier sein.
j. "Zielgewebe" bezieht sich auf das Gewebe des Wirts, in dem Expression des nackten Polynucleotids angestrebt wird.
k. "Haut" wie hierin verwendet bezieht sich auf die epidermalen, dermalen und subkutanen Gewebe eines Wirts.
l. "Schleimhaut" bezieht sich auf Schleimhautgewebe eines Wirts, unabhängig davon, wo im Körper sie angeordnet sind, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Atemwege (einschließlich Bronchialwege, Lungenepithel und Nasenepithel), Genitalwege (einschließlich Vaginal-, penile und Analschleimhaut), Harnwege (z.B. Harnröhre, Blase), Mund, Augen und Stimmbänder.
m. "Eintrittspunkt" bezieht sich auf die Stelle, an der das nackte Polynucleotid in einen Wirt eingeführt wird, einschließlich unmittelbar benachbarter Gewebe.
n. "Dermale" und "Epidermale Verabreichung" bezeichnet Wege der Verabreichung, bei denen das/die nackte(n) Polynucleotid(e) auf die Haut aufgetragen oder durch die Haut verabreicht wird/werden. Dermale Verabreichung umfasst intradermale und subkutane Injektionen sowie transdermale Transmission. Epidermale Verabreichung umfasst jegliches Mittel zur Reizung der äußersten Hautschichten, die ausreichend ist, um eine Immunantwort auf den Reizstoff hervorzurufen. Der Reizstoff kann ein mechanischer oder chemischer (vorzugsweise topischer) Stoff sein.
o. "Epitheliale Verabreichung" umfasst im Wesentlichen dasselbe Verfahren wie chemische epidermale Verabreichung, außer dass der chemische Reizstoff auf Schleimhautepithel aufgetragen wird.
p. "IL" bezieht sich auf Interleukin.
q. "TH1-Antwort(en)" bezieht sich auf eine zelluläre Immunantwort, die vorzugsweise durch Antigene induziert wird, die sich an bestimmte APCs, d.h. Makrophagen und dendritische Zellen, binden und diese aktivieren.
r. "Biologisch aktive(s) Peptid(e)" bezieht sich auf ein Peptid, das, wenn es einem Wirt verabreicht wird, einen therapeutischen Nutzen bewirkt oder in ihm eine Immunantwort induziert.
s. "Aktivierender Ligand" bezieht sich auf einen Liganden, der, wenn er an einen Kernrezeptor gebunden ist, Aktivität an dem Teil des Rezeptors induziert.
t. "Tumor-assoziierte(s) Antigen(e)" bezieht sich auf embryonale Proteine, die durch transformierte Zellen oder Autoantigene neuerlich exprimiert wurden, die nicht wirklich tumorspezifisch sind, jedoch in Säugetier-Tumorgewebe vorhanden sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung besteht in der Verwendung eines nackten Polynucleotids, das operativ für ein therapeutisch wirksames, Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, das Klasse-I-MHC-Moleküle an Antigen-präsentierenden Zellen bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Wirt, worin
das nackte Polynucleotid an die Haut des Wirts verabreicht wird;
die Haut eine hohe Konzentration an darin enthaltenen, Antigen-präsentierenden Zellen im Vergleich zu anderen Wirtgeweben aufweist;
das Tumor-assoziierte Antigen in den Antigen-präsentierenden Zellen ohne nennenswerte Sekretion daraus exprimiert wird; und
die Zufuhr des Tumor-assoziierten Antigens im Wirt eine Th1-Antwort bevorzugt gegenüber einer Th2-Antwort induziert.
Das nackte Polynucleotid wird vorzugsweise an die Haut verabreicht, die im Vergleich zu anderen Geweben des Körpers eine relativ hohe Konzentration an Antigen-präsentierenden Zellen enthält. Auch wenn nicht beabsichtigt wird, dass die gesamte Erfindung auf eine bestimmte Theorie bezüglich der eingebundenen Expressionsmechanismen eingeschränkt ist, wird angenommen, dass eine biologische Antwort in der Haut nach Verabreichung des nackten Polynucleotids erreicht wird, da das Polynucleotid intrazellulär im Zytoplasma einkerniger Zellen, am wahrscheinlichsten Antigen-präsentierender Zellen des Wirts, exprimiert wird. Auch wird angenommen, dass die einkernigen Zellen in eine Entzündungsimmunantwort auf das nackte Polynucleotid eingebunden sein können, sobald die Zellen in das Lymphsystem migriert sind und das exprimierte Peptid als Antigen aufweisen.
Auf Grundlage histologischer Studien scheinen die nackten Polynucleotide nicht direkt von Fibroblasten oder anderen Gewebezellen in signifikanten Mengen aufgenommen zu werden (siehe Beispiel IV und 6). Diese Schlussfolgerung beruht auf Studien, die zeigen, dass (1) intradermale Verabreichung von sogar geringen Mengen an nackten Polynucleotiden in Mäuse eine maßgebende TH1-Antwort induzierte (was ein Hinweis auf Antigen-Präsentation durch Makrophagen und dendritische Zellen ist; siehe Beispiel XI und die 13-14); (2) intradermale Verabreichung nackter Polynucleotide an Mäuse die Bildung von zytotoxischen T-Zellen induzierte, ohne die Bildung nachweisbarer Konzentrationen an Antikörper zu stimulieren (siehe Beispiel IX und 11); und zeigen (3) die Induktion von verlängertem immunologischem Gedächtnis hinsichtlich des Polynucleotid-Expressionsprodukts als ein Antigen (Beispiel X und 12-13). Es scheint daher, dass die Immunogenität nackter Polynucleotide nicht von der Menge an dadurch exprimiertem Protein abhängt, sondern anstelle dessen vom Typ der transfizierten Zelle (z.B. Antigen-präsentierende Zellen gegenüber Gewebezellen).
In Anbetracht der offensichtlichen Rolle von Entzündung in einem der Erfindung zugrundeliegenden Mechanismus wird Fachleuten auch verständlich sein, dass erhöhte Durchlässigkeit von Zellmembranen des Zielgewebes, das von der Entzündung betroffen ist, die Aufnahme der nackten Polynucleotide steigern kann (insbesondere über Barrieren wie Haut).
Das Zielgewebe ist Haut, worin etwa 1 % bis 2 % der Zellpopulation aus Antigen-präsentierenden Zellen bestehen. Dieses Gewebe ist besonders geeignet, wenn die Therapie auf Erkrankungen abzielt, bei denen es wünschenswert ist, eine örtliche therapeutische oder Immunantwort zu induzieren. Haut wird auch aufgrund ihrer Regenerationsfähigkeit bevorzugt, die die Zeitspanne reduziert, innerhalb derer eingeführte Materialien am Eintrittspunkt verweilen.
Da die Antigen-präsentierenden Zellen, die im Zielgewebe vorhanden sind, dazu dienen können, die Expression des nackten Polynucleotids zu vermitteln, kann die Erfindung zur Induktion systemischer Antworten auf das exprimierte Peptid nicht so nütz lich sein wie zur Induktion einer örtlichen Antwort. Bei ausreichender Dosierungshöhe kann jedoch auch eine vorübergehende systemische Wirkung induziert werden. Eine nützliche Anwendung für diesen Aspekt der Erfindung zur Induktion systemischer Antworten auf das exprimierte Peptid kann daher als ein Adjuvans für andere systemische Therapien sein.
In einem anderen Aspekt der Erfindung dienen die APCs als Vehikel, um das nackte Polynucleotid zu lymphatischen Organen und zu Schleimhautgeweben, die nicht jene des Eintrittspunktes sind, zuzuführen. Diese Ausführungsform wird durch Verweis auf die folgende Hypothese veranschaulicht; der beschriebene Mechanismus sollte jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung verstanden werden.
In dieser Ausführungsform wird angenommen, dass die APCs das nackte Polynucleotid am Eintrittspunkt oder in der Nähe dieses Punktes aufnehmen und es dann in den lymphatischen Kreislauf tragen. Sobald sie an einem Lymphknoten angelangt ist, präsentiert die APC das intrazellulär exprimierte Protein als ein Antigen und stimuliert dadurch eine Immunantwort. Von hier ausgehende können jene APCs, die "Homing"-Rezeptoren für z.B. Schleimhaut aufweisen, neuerlich in den lymphatischen Kreislauf eintreten, bis sie sich in einem Zielgewebe, das nicht das Gewebe am Eintrittspunkt ist, niederlassen. Sofern erwünscht, können Homing-Rezeptoren (spezifische Membranproteine, die sich an Target-Zellliganden binden) sequenziert und in das nackte Polynucleotid inkorporiert werden. Hinsichtlich der Expression im Lymphsystem stellt diese Ausführungsform durch Zuführen von Cytokinen, um die Konzentration an spezifischen Cytokinen im Wirt zu steigern, auch ein Mittel zur Steigerung der Reaktionsfähigkeit des Immunsystems des Wirts bereit. Insbesondere in den lymphatischen Organen können Steigerungen der Konzentrationen an zirkulierenden Cytokinen in Wirten (verabreicht gleichzeitig mit oder kurz nach Antigen-Challenge) die Immunantwort des Wirts auf pathogene Antigene steigern und (1) als Adjuvans für Vakzinen dienen, (2) die Immunantwort auf Selbstantigene bei Autoimmunerkrankungen senken, oder (3) die Immunantwort auf Fremdantigene (beispielsweise nach Gewebe- oder Organtransplantation gebildet) senken.
Migrieren die APCs, die das Gen von Interesse tragen, aus Lymphknoten hinaus und zirkulieren zu Geweben, für die sie einen Homing-Rezeptor aufweisen, so kann das Gen an einem zugänglichen Eintrittspunkt zur Expression an einer weniger praktischen oder zugänglichen Stelle verabreicht werden.
Eine andere Verwendung für die Erfindung wäre das Mäßigen einer Immunantwort auf ein Antigen (wie z.B. ein Tumor-assoziiertes Antigen) durch Immunisieren des Wirts gegen das Antigen. Der Verabreichungsweg über die Haut ist in dieser Hinsicht besonders nützlich.
Zur Verwendung bei Krebsimmuntherapie würde das Verfahren vorzugsweise die folgenden Schritte umfassen:

1. Selektion oder Identifikation eines Tumor-assoziierten Antigens von Interesse und eines Polynucleotids, das für das Antigen kodiert.
2. Sofern das Antigen ein Selbstantigen (im Gegensatz zu einem Tumor-assoziierten Antigen aus einer anderen Säugetierspezies) ist, Modifikation eines Polynucleotids, das für das Tumor-assoziierte Antigen von Interesse kodiert zu einem Selbstantigen, das das Selbstantigen nachahmen, jedoch nicht identisch damit sein soll. Vorzugsweise substituiert oder deletiert die Mutation ein einzelnes Nucleotid, das der Region des Selbstantigens entspricht, die am stärksten immunogen ist.
3. Verleihen der Fähigkeit an das Polynucleotid, operativ zu kodieren; d.h. durch Insertion in einen rekombinanten Expressionsvektor.
4. Verabreichung des operativ kodierenden Polynucleotids als ein nacktes Polynucleotid gemäß der Erfindung.
5. Gegebenenfalls Co-Immunisieren des Wirts mit Protein-Tumor-assoziiertes-Antigen-Vakzinen, um die Unterstützung durch Helfer-T-Lymphozyten zu stimulieren, und/oder mit für Cytokin kodierenden Polynucleotiden, um die Leistung des Wirts immunsystems zu steigern. Da jedoch die Entwicklung von Anti-Tumor-assoziiertes-Antigen-Antikörpern mit der Freisetzung von löslichem Antigen einhergeht (was das Risiko mit sich bringt, CTL-Aktivität zu stören und Immunkomplexkrankheit zu fördern), werden bei der bevorzugten Ausführung der Erfindung CTLs induziert, ohne Antikörperbildung zu induzieren (durch Vermeiden der extrazellulären Freisetzung von löslichem Antigen).

Ein verwandter Aspekt des oben beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung in vitro oder in einem Tiermodell (vorzugsweise einem Primaten oder Nagetier), um für Tumor-assoziiertes Antigen kodierende Polynucleotide, die gemäß Schritt 2 mutiert sind, auf ihre Fähigkeit, für Tumor-assoziiertes Antigen spezifische CTLs in einem Wirt zu produzieren, zu screenen.
Ein anderer besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass sie die Verabreichung von relativ kleinen Dosen an Antigen einbindet. Insbesondere ist, da ein Polynucleotid, das operativ für ein Antigen kodiert, anstelle des Antigens selbst verabreicht wird, die Menge an Fremdmaterial, das in den Wirt eingeführt wird, relativ gesehen minimal. Darüber hinaus erfordert die Verabreichung von nackten Polynucleotiden durch die Haut eine geringe Konzentration an DNA, um dasselbe Ausmaß an Immunantwort hervorzurufen, wie dies bei intramuskulärer Verabreichung der Fall ist (z.B. etwa 10-50fach geringer; siehe z.B. Beispiel X und die 12-13). Folglich eignet sich die Erfindung durchwegs zur Verabreichung nackter Polynucleotide, die für bis zu mehreren hundert verschiedenen Antigene kodieren, zur Verwendung als eine polyvalente Vakzine beispielsweise.
Die bevorzugten Arten der Verabreichung zur Induktion lokaler Immunität in oder nahe der Haut sind transdermale Transmission, intradermale Injektion oder oberflächliches Kratzen oder Reizen der äußersten Schicht an Epidermiszellen (d.h. epidermale Verabreichung), wobei in bestimmten Anwendungen auch subkutane Injektion nützlich sein kann.
Werden die nackten Polynucleotide in die Haut eingeführt, so wird die Zufuhr des Polynucleotids vorzugsweise, ohne Bedarf an einer Injektion, durch die Verwendung von Detergenzien, Absorptionspromotoren, chemischen Reizstoffen (wie keratinolytischen Mitteln) oder mechanischen Reizstoffen erleichtert. Detergenzien und Absorptionspromotoren, die die Aufnahme kleiner Moleküle, die keine Gene sind, erleichtern, sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und können, ohne übermäßiges Experimentieren, an die Verwendung zur Erleichterung der Aufnahme von Genen angepasst werden. Ein anderer, im Wesentlichen nicht invasiver Ansatz zum Einführen der nackten Polynucleotide arbeitet mit transdermaler Transmission (vorzugsweise Iontophorese), die bereits erfolgreich zur transdermalen Transmission von Peptiden verwendet wurde.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen das Stimulieren der Produktion von Cytokinen und verwandten Peptiden im Blutkreislauf. Das Einführen des/der nackten Polynucleotids/e in einen Körperbereich, der regenerativ ist und der in der vorliegenden Erfindung die Haut ist, wird aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, Zeilen, die durch mit jeder Dosierung assoziierte Traumata direkt beeinträchtigt sind, zu ersetzen. Sofern erwünscht, werden, um Sekretion der zu exprimierenden Proteine sicherzustellen, Sequenzen, die Sekretion steuern und Fachleuten bekannt sind, in das verabreichte nackte Polynucleotid eingebunden, sofern sie nicht bereits im Gen voller Länge vorhanden sind. Für die Verwendung zur Immunisierung eines Wirts gegenüber einem Antigen wird jedoch bevorzugt, dass das Antigen nicht von APCs sekretiert wird, in denen es exprimiert wird, sondern eher an der Zelloberfläche vorhanden ist. Für die Verwendung in Ausführungsformen der Erfindung, die darauf abzielen, den Wirt gegenüber einem Antigen zu immunisieren, stehen somit die nackten Polynucleotide vorzugsweise unter der Steuerung von Sequenzen, die Sekretion des exprimierten Proteins unterbinden, wobei diese Sequenzen Fachleuten bekannt sind.
Die Verwendung von Liposomen zur Zufuhr der nackten Polynucleotide der Erfindung ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Solch eine Verwendung führt wahrscheinlich eher zu reduzierten Expressionsniveaus. Dieses Phänomen ist wahr scheinlich das Resultat schlechterer Erkennung eines Liposoms als antigenes Material durch APCs.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Schnitte von Muskelgewebe, das chronische Entzündung (Schautafel A) und Myonekrose (Schautafel B) aufweist, nach intramuskulären Injektionen von pREVk3 und pRSVIL-2. Schautafel C zeigt Schnitte von ähnlichem Muskelgewebe nach subkutanen Injektionen von pREVK3 oder pRSVIL-2.
2A zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in Serum nach intradermaler Injektion von nacktem pCMVRNP; 2B zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in Serum nach intramuskulärer Injektion von nacktem pCMVRNP.
3 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG vor intranasaler Einführung von nacktem pCMVRNP in Balb/c-Mäuse.
4 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in einer nicht anästhesierten Gruppe von Balb/c-Mäusen.
5 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in einer anästhesierten Gruppe von Balb/c-Mäusen.
6 ist eine Photographie der Resultate histologischer Studien von Haut an einem Eintrittspunkt für pCMVRNP in Balb/c-Mäusen, die die Aufnahme des Plasmids durch einkernige Zellen (APCs) zeigt. Eine APC ist durch einen Pfeil angezeigt; eine Gewebezelle (die kein Plasmid enthält) ist durch eine strichlierte Linie angezeigt.
7 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG nach mechanischer epidermaler Verabreichung von nacktem pCMVRNP an Balb/c-Mäuse.
8 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG nach chemischer epidermaler Verabreichung von nacktem pCMVRNP an Balb/c-Mäuse.
9 enthält eine Kaplan-Meyer-Überlebenskurve, die die Zeitspanne darstellt, die Balb/c-Mäuse, denen intradermal nacktes pCMVRNP verabreicht wurde, nach dem Virus-Challenge überlebten.
10 vergleicht in einem Diagramm NP-Genexpression nach separaten intradermalen Injektionen von nackten Plasmiden, die entweder eine CMV- oder eine RSV-Promotorsequenz enthielten.
11 zeigt die Konzentrationen zytotoxischer T-Zellen, die in Mäusen nach Injektion von Ovalbumin-cDNA und Ovalbumin, das durch intradermale Injektion verabreicht wurde, nachgewiesen wurden.
12 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-Ovalbumin-Antikörper in Seren aus den in Bezug auf 12 beschriebenen Mäusen.
13 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-β-Galactosidase-Antikörper nach Verabreichung (1) eines Polynucleotids, das für das Enzym kodiert, durch intramuskuläre oder intradermale Injektion und (2) des Enzyms durch intradermale Injektion.
14 zeigt die Resultate aus eines ELISA für Anti-β-Galactosidase-Antikörper in Seren aus den in Bezug auf 13 beschriebenen Mäusen nach einer Booster-Injektion von Antigen.
15 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in Seren aus Mäusen, denen (1) intradermal oder intramuskulär ein Polynucleotid, das für β-Galactosidase kodiert, verabreicht wurde, oder (2) das Enzym durch intradermale Injektion verabreicht wurde.
16 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in Seren aus Mäusen, denen (1) intradermal oder intramuskulär ein Polynucleotid, das für β-Galactosidase kodiert, verabreicht wurde, oder (2) das Enzym durch intradermale Injektion verabreicht wurde.
17 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in Seren der in Bezug auf 25 beschriebenen Mäuse nach einer Booster-Injektion von Antigen.
18 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in Seren der in Bezug auf 24 beschriebenen Mäuse nach einer Booster-Injektion von Antigen.
19 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in Seren aus Mäusen, die (1) durch Kratzen der Haut mit Zinken, die mit einem für β-Galactosidase kodierenden Polynucleotid beschichtet waren, eingeführt wurden, oder (2) in die das Enzym durch intradermale Injektion eingeführt wurde.
20 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in Seren aus Mäusen, die (1) durch Kratzen der Haut mit Zinken, die mit einem für β-Galactosidase kodierenden Polynucleotid beschichtet waren, eingeführt wurden, oder (2) in die das Enzym durch intradermale Injektion eingeführt wurde.
21 ist eine Karte des eukaryotischen pGREtk-Expressionsvektors.
22 ist eine Karte des eukaryotischen pVDRtk-Expressionsvektors.
23 zeigt die Resultate eines ELISA für die Konzentrationen von IL-2 und INFγ nach Immunisierung von Mäusen mit einem für Antigen kodierenden Plasmid (pCMV-Lac-Z) oder dem Antigen selbst (β-Galactosidase).
24 zeigt die Resultate eines Tests zur Detektion von Antigen-spezifischer Zelllyse durch T-Lymphozyten aus Mäusen, die durch epidermale Verabreichung von pCMV-NP-Plasmid immunisiert wurden.
25 zeigt die Resultate eines Tests zur Detektion von Antigen-spezifischer Zelllyse durch T-Lymphozyten aus Mäusen, die in 24 beschrieben wurden, ohne Pulsen der Zellen mit dem Antigen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1. EINFÜHRUNG NACKTER POLYNUCLEOTIDE IN ZIELGEWEBE, DIE WESENTLICHE KONZENTRATIONEN AN ANTIGEN-PRÄSENTIERENDEN ZELLEN AUFWEISEN
A. Herstellung nackter Polynucleotide
Die in der Erfindung zu verwendenden Polynucleotide können DNA oder RNA sein, sind jedoch vorzugsweise eine komplementäre DNA-(cDNA-)Sequenz. Die in der Erfindung verwendeten Polynucleotidsequenzen müssen (a) exprimierbar und (b) entweder nicht-replizierend oder durch Mittel, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gentechnisch verändert sein, sodass sie nicht in das Wirtsgenom replizieren. Nun folgen Veranschaulichungen der Herstellung von Polynucleotiden, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, und spezifische Beispiele, die zeigen, wie bestimmte Polynucleotidzusammensetzungen hergestellt wurden, werden nachstehend bereitgestellt. Fachleuten ist jedoch klar, dass auch andere bekannte Mittel zur Herstellung nichtreplizierender Polynucleotide geeignet sein können.
Polynucleotide zur Verwendung in der Erfindung können unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Hybridisierungsverfahren gewonnen werden. DNA und RNA können auch unter Verwendung automatisierter Nucleinsäuresynthesevorrichtungen, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, synthetisiert werden. Die Verwendung der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) wird zur Herstellung von Polynucleotidgemischen besonders bevorzugt. Genomische Nucleinsäure kann durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Mittel, wie beispielsweise unter Einsatz der in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Kap. 2 und 4, Wiley Interscience (1989), beschriebenen Arbeitsvorschriften, hergestellt werden. cDNA kann gemäß nach dem Stand der Technik bekannten Mitteln synthetisiert werden (siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab, New York (1982)). Eine cDNA-Expressionsbibliothek, die Polynucleotide von Interesse enthält, kann auch durch Mittel, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gescreent werden. Bezug genommen kann hierzu auf die Beispiele für solche Mittel, die in der nachstehenden Erläuterung veranschaulicht werden.
Polynucleotide zur Verwendung in der vorliegenden Anwendung sind in der vorangehenden Zusammenfassung der Erfindung angegeben.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Polynucleotid" auf ein Polymer von Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden in Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren Konstrukts. DNA, die für ein therapeutisches und/oder immunogenes Peptid der Erfindung kodiert, kann aus DNA-Fragmenten oder aus Oligonucleotiden assembliert werden, die ein synthetisches Gen liefern, das in der Lage ist, in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden. Polynucleotidsequenzen der Erfindung umfassen DNA-, RNA- und cDNA-Sequenzen. Eine Polynucleotidsequenz kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, wobei jedoch die Degeneration des Codes in Betracht gezogen werden muss. Polynucleotide der Erfindung umfassen Sequenzen, die als ein Resultat des genetischen Codes degeneriert sind, worin die Sequenzen von Fachleuten leicht bestimmt werden können.
Polynucleotidsequenzen, die für das Peptid kodieren, können entweder in Eukaryoten oder in Prokaryoten exprimiert werden. Wirte können Mikroben-, Hefe-, Insekten- und Säugetierorganismen umfassen. Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen mit eukaryotischen oder viralen Sequenzen in Prokaryoten sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Biologisch funktionelle Virus- und Plasmid-DNA-Vek toren, die zur Expression und Replikation in einem Wirt in der Lage sind, sind ebenfalls auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Solche Vektoren werden verwendet, um DNA der Erfindung aufzunehmen.
DNA-Sequenzen zur Verwendung bei der Herstellung von Peptiden der Erfindung können auch durch mehrere Verfahren gewonnen werden. Die DNA kann beispielsweise unter Verwendung von Hybridisierungsverfahren isoliert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: 1) Hybridisierung von Sonden an genomische oder cDNA-Bibliotheken, um gemeinsame Nucleotidsequenzen nachzuweisen; 2) Antikörper-Screening von Expressionsbibliotheken, um gemeinsame strukturelle Eigenschaften nachzuweisen; und 3) Synthese durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Entwicklung von spezifischen kodierenden DNA-Sequenzen oder Fragmenten davon kann auch durch: 1) Isolieren von doppelsträngigen DNA-Sequenzen aus der genomischen DNA; 2) chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, um die erforderlichen Codons für das Polypeptid von Interesse bereitzustellen; und 3) In-vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch reverse Transkription von mRNA, die aus einer eukaryotischen Donorzelle isoliert ist, erreicht werden. Im letztgenannten Fall wird schließlich ein doppelsträngiges DNA-Komplement von mRNA gebildet, das im Allgemeinen als cDNA bezeichnet wird.
Hybridisierungsverfahren sind zum Screenen rekombinanter Klone unter Verwendung markierter gemischter synthetischer Oligonucleotidsonden nützlich, worin jede Sonde potenziell das vollständige Komplement einer spezifischen DNA-Sequenz in der Hybridisierungsprobe ist, die ein heterologes Gemisch von denaturierter doppelsträngiger DNA umfasst. Für solches Screenen erfolgt Hybridisierung vorzugsweise entweder an einzelsträngiger DNA oder denaturierter doppelsträngiger DNA. Hybridisierung ist besonders zur Detektion von cDNA-Klonen nützlich, die aus Quellen stammen, in denen eine äußerst geringe Menge an mRNA-Sequenzen, die mit dem Polypeptid von Interesse zusammenhängen, vorhanden ist. In anderen Worten ist es durch die Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen, die darauf abzielen, nichtspezifische Bindung zu vermeiden, möglich, beispielsweise die autoradiogra phische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Klons durch die Hybridisierung der Target-DNA an jene einzelne Probe im Gemisch zu ermöglichen.
Eine cDNA-Bibliothek, von der angenommen wird, dass sie ein Polynucleotid von Interesse enthält, kann durch Injizieren verschiedener mRNA, die aus cDNAs stammt, in Eizellen, wodurch ausreichend Zeit zur Verfügung gestellt wird, dass Expression der cDNA-Genprodukte eintreten kann, und Testen auf die Gegenwart des erwünschten cDNA-Expressionsprodukts, beispielsweise unter Verwendung von Antikörper, der für ein Peptid spezifisch ist, für das das Polynucleotid von Interesse kodiert, oder unter Verwendung von Sonden für die Wiederholungsmotive und ein Gewebeexpressionsmuster, das für ein Peptid charakteristisch ist, für das das Polynucleotid von Interesse kodiert, gescreent werden. Alternativ dazu kann eine cDNA-Bibliothek indirekt auf Expression der therapeutischen und/oder immunogenen Peptide, die zumindest ein Epitop aufweisen, unter Verwendung von Antikörpern, die für die Peptide spezifisch sind, gescreent werden. Solche Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal abgeleitet werden und verwendet werden, um Expressionsprodukt nachzuweisen, das auf die Gegenwart der cDNA von Interesse hinweist.
Screening-Verfahren, die auf Nucleinsäurehybridisierung beruhen, ermöglichen es, jegliche Gensequenz aus jeglichem Organismus zu isolieren, vorausgesetzt, die geeignete Sonde ist verfügbar. Oligonucleotidsonden, die einem Teil der Sequenz entsprechen, die für das betreffende Protein kodiert, können chemisch synthetisiert werden. Dies erfordert, dass kurze Oligonucleotidabschnitte von Aminosäuresequenz bekannt sein müssen. Die für das Protein kodierende DNA-Sequenz kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, wobei jedoch die Degeneration des Codes berücksichtigt werden muss. Es ist möglich, eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen, wenn die Sequenz degeneriert ist. Dies induziert ein heterogenes Gemisch von denaturierter doppelsträngiger DNA. Für solches Screening erfolgt Hybridisierung vorzugsweise entweder an einzelsträngiger DNA oder denaturierter doppelsträngiger DNA.
Die nackten Polynucleotide können an andere Polynucleotide konjugiert werden oder in Verbindung mit anderen Polynucleotiden verwendet werden, die operativ für Regulationsproteine kodieren, die die Expression dieser Polypeptide steuern oder Erkennungs-, Promotor- und Sekretionssequenzen enthalten können. Fachleute sind in der Lage, Regulationspolynucleotide ohne übermäßiges Experimentieren zu selektieren und sie in die nackten Polynucleotide der Erfindung (sofern sie darin nicht schon vorhanden sind) zu inkorporieren. Geeignete Promotoren zur Verwendung in murinen oder menschlichen Systemen und ihre Verwendung werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, s.o., Kap. 1, beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Form eines nackten Polynucleotids zur Verwendung in der Erfindung ist eine, die in einen Plasmidvektor inkorporiert wurde. Die Verwendung eines Plasmidvektors, insbesondere eines, der einen Replikator umfasst, verlängert die Expression des Gens in Targetgeweben. Bestimmte Plasmidvektoren sind auch gute Vermittler von Immunantworten auf immunogene Peptide, da hohe Expressionsniveaus erzielt werden, wenn das für die Peptide kodierende Gen in den Vektor inkorporiert ist.
Geeignete Plasmidvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und umfassen die in Current Protocols in Molecular Biology, s.o., Kap. 1, beschriebenen Vektoren. Zwei besonders bevorzugte Plasmidvektoren sind die pRSV-(Rous-Sarkom-Virus-) und pCMV-(Zytomegalie-Virus-)Promotorvektoren. Von diesen Promotoren wird CMV für Polynucleotide, die es in Gewebe, die nicht Muskel sind, einzuführen gilt, bevorzugt. Diese Präferenz basiert auf Beobachtungen, dass höhere Expressionsniveaus in diesem Zusammenhang erreicht werden, wenn der CMV-Promotor verwendet wird.
Eine geeignete Arbeitsvorschrift für das Isolieren des RSV-Promotors und seine Verwendung bei der Konstruktion eines Plasmidvektors wird in Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777 (1982), beschrieben. Andere bevorzugte Plasmidvektoren sind pREP7 und pREV, die im Handel bei Invitrogen aus San Diego, Kalifornien, erhältlich sind. Zum Klonieren von Polynucleotiden ist ein besonders geeignetes Plas mid zur Herstellung von mRNA der pSP64T-Kloniervektor, der von Kreig et al., Nucleic Acids Res. 12, 7057-7070 (1984), beschrieben wird. Jegliche cDNA, die ein Initiationscodon enthält, kann in dieses Plasmid eingeführt werden, und mRNA kann aus den exprimierten DNA-Matrices unter Verwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt werden.
Besonders nützliche Vektoren zur Verabreichung jeglichen nackten Polynucleotids gemäß der Erfindung sind jene, die einen Promotor enthalten, der "an-" oder "ab-" geschaltet werden kann, nachdem der Vektor dem Patienten verabreicht wurde.
Besonders wirksame Beispiele für solche Promotoren sind die Liganden-induzierbaren Kernrezeptorpromotoren. Kernrezeptoren stellen eine Familie von Transkriptionsenhancerfaktoren dar, die durch Binden an spezifische DNA-Sequenzen, die in als Reaktionselemente bekannten Targetpromotoren zu finden sind, wirken. Spezifische Elemente der Kernrezeptorfamilie umfassen die primären intrazellulären Targets für kleine, in Lipid lösliche Liganden, wie Vitamin D₃ und Retinoide, sowie Steroid- und Thyroidhormone ("aktivierende Liganden").
Kernrezeptoren, die durch spezifische aktivierende Liganden aktiviert werden, sind zur Verwendung als Promotoren in eukaryotischen Expressionsvektoren gut geeignet, da Expression von Genen einfach durch Steuern der Konzentration an Ligand, der für den Rezeptor verfügbar ist, reguliert werden kann. Glucocorticoid-induzierbare Promotoren wie beispielsweise jene der langen terminalen Wiederholung des Maus-Brusttumor-Virus (MMTV) wurden in diesem Zusammenhang umfassend verwendet, da die Glucocorticoid-Reaktionselemente in zahlreichen verschiedenen Zelltypen exprimiert werden. Ein Expressionssystem, das Glucocorticoid-Reaktionselemente, die auf zahlreiche verschiedene Steroidhormone (z.B. Dexamethason und Progesteron) reaktiv sind, nutzt, ist ein pGREtk-Plasmid (das ein oder mehrere Ratten-Tyrosinaminotransferase-Glucocorticoid-Reaktionselemente stromauf des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(tk-)Promotors in pBLCAT8+ enthält), transfiziert in HeLa-Zellen (siehe Mader & White, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 5603-5607 (1993) [pGRE2tk]; und Klein-Hitpass et al., Cell 46, 1053-1061 (1986) [pBLCAT8+]; deren Offenbarung durch diesen Verweis hierin aufgenommen sind, um das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich des Einführens geeigneter Promotoren, die aus Kernrezeptor-Reaktionselementen stammen ["NRRE-Promotoren"] zu veranschaulichen). Der pGREtk-Promotor (siehe Karte in 20) ist zur Stimulierung gesteuerter Überexpression klonierter Gene in eukaryotischen Zellen besonders wirksam (Mader & White, s.o., 5607).
Ein anderer, besonders geeigneter NRRE-Promotor zur Verwendung in der Erfindung ist einer, der durch die Vitamin-D₃-Verbindung 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ und durch nicht-hyperkalzämische Analoga davon (zusammengefasst als "Vitamin-D₃-aktivierende Liganden") induzierbar ist. NRRE-Promotoren, die durch Vitamin-D₃-aktivierende Liganden induzierbar sind, enthalten die Vitamin-D₃-Rezeptor-(VDR-)Reaktionselemente PurG(G/T)TCA, die direkte Wiederholungen, die durch 3 Basenpaare voneinander getrennt sind, erkennen. Vitamin-D₃-Reaktionselemente sind stromauf von menschlichen Osteocalcin- und Maus-Osteopontin-Genen zu finden; Transkription von diesen Genen wird bei Bindung des VDR aktiviert (siehe z.B. Morrison & Eisman, J. Bone Miner. Res. 6, 893-899 (1991); und Ferrara et al., J. Biol. Chem. 269, 2971-2981 (1994), deren Offenbarungen durch diesen Verweis hierin aufgenommen sind, um das auf dem Gebiet der Erfindung vorhandene Wissen zu Vitamin-D₃-reaktiven, induzierbaren Promotoren zu veranschaulichen). Jüngste Resultate aus Versuchen zum Testen eines rekombinanten Expressionsvektors, der den Maus-Osteopontin-VDR stromauf eines trunkierten Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(tk-)Promotors enthält, ließen darauf schließen, dass 9-cis-Retinsäure die Reaktion von VDR auf 1,25-Hydroxyvitamin D₃ steigern kann (siehe Carlberg et al., Nature 361, 657-660 (1993)).
Ferrara et al. beschrieben auch Vitamin-D₃-induzierbare Promotoren in rekombinanten Expressionsvektoren, die unter Verwendung von Mehrfachkopien eines starken VDR; insbesondere unter Verwendung des Maus-Osteopontin-VDR (zusammengesetzt aus einer direkten Wiederholung von PurGTTCA-Motiven, getrennt durch 3 Basenpaare); konstruiert wurden. Dieser VDR passt sich an die PurGG/TTCA-Consensusmotive an, für die bereits gezeigt wurde, dass sie nicht nur auf Vitamin D₃ reaktiv sind, sondern auch auf Thyroidhormon und/oder Retinsäure. Drei Kopien des Maus-VDR wurden in pBLCAT8+ insertiert; unmittelbar stromauf des Herpes-Simplex-Virus-tk-Promotors (siehe z.B. 21 [Karte von pVDREtk]). Transfektion des resultierenden VDREtk-Vektors in COS-Zellen (wodurch ein "VDR-Expressionssystem" gebildet wurde) erwies sich insofern als besonders nützlich, als dass COS-Zellen den Kernretinoid-X-Rezeptor (RXR) enthalten, für den gezeigt wurde, dass er als ein Hilfsfaktor für Bindung von VDR an sein Reaktionselement wirkt.
Das VDR-Expressionssystem (und funktionell äquivalente Expressionssysteme unter der Steuerung von beispielsweise menschlichem Osteocalcin-Genpromotor) ist für die Verwendung in der Erfindung einmalig geeignet. Insbesondere Expression eines nackten Polynucleotids, das einem Säugetier gemäß der Erfindung mittels epidermaler oder dermaler Zufuhr (besonders Ersteres) in einem Vitamin-D₃-reaktiven Expressionssystem verabreicht wird, kann durch topische Verabreichung eines 1,25-Dihydroxyvitamin-D₃-Präparats am Eintrittspunkt angeschaltet werden (und durch Entzug des Vitamin-D₃-Präparats abgeschaltet und/oder durch Zusatz oder Entzug einer Quelle von Retinsäure am oder aus dem Eintrittspunkt moduliert werden). Praktischerweise wurden 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ und nicht-hyperkalzämische Analoga davon von der United States Food and Drug Administration für die Verwendung in topischen Präparaten zur Behandlung von Psoriasis bereits genehmigt und sind im Handel erhältlich.
In-vivo-Tests der NRRE-Promotoren weisen darauf hin, dass sie bei systemischer Aussetzung gegenüber ihren entsprechenden Reaktionselementen induzierbar sind (siehe Tsou et al., Exp. Cell Res. 214, 27-34). Unter Anbetracht der erwarteten Retention von Polynucleotiden, die dermal oder epidermal am Eintrittspunkt verabreicht werden (was sie für Aussetzung gegenüber topisch absorbierten Reaktionselementen verfügbar macht; siehe die Erläuterung auf den Seiten 15-16 und die Daten aus Beispiel IV), kann in angemessener Weise vorhergesagt werden, dass die Verwendung von NRRE-Promotoren zur Expression solcher Polynucleotide auch ihre Invivo-Steuerung durch topische Verabreichung geeigneter, NRRE-Promotor-aktivierender Liganden (z.B. 1,25-Dihydroxyvitamin-D₃-Transkriptionsaktivatoren mit einem VDR-Expressionsvektor zur Expression des Polynucleotids von Interesse) ermöglicht.
Somit ermöglicht die Verwendung eines rekombinanten NRRE-Promotor-Expressionsvektors zur Verabreichung und Expression nackter Polynucleotide gemäß der Erfindung die Steuerung von Expression, um beispielsweise Expression anzuschalten, wenn Dosierung erforderlich ist, oder im Fall einer negativen Reaktion auf das exprimierte Protein oder Peptid Expression abzuschalten.
B. Pharmazeutische Präparate nackter Polynucleotide
Zusammensetzungen nackter Polynucleotide und Gemische von Polynucleotiden können in eine pharmazeutisch annehmbare Suspension, Lösung oder Emulsion übergeführt werden. Geeignete Medien umfassen Kochsalzlösung.
Insbesondere können pharmazeutisch annehmbare Träger sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen umfassen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und gepufferte Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringerlaktat oder fixierte Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeit und Nährstoffergänzungsmittel, Elektrolytenergänzungsmittel (wie jene, die auf Ringer-Dextrose basieren) und dergleichen. Konservierungsmittel und andere Additive können auch vorhanden sein, wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien, Chelatbildner und Inertgase und dergleichen. Weiters kann eine Zusammensetzung nackter Polynucleotide unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Mitteln zur darauf folgenden Rekonstitution und Verwendung gemäß der Erfindung lyophilisiert werden.
Fachleuten ist klar, dass die Vorteile der Verwendung der vorliegenden Erfindung, nackte Polynucleotide zu verabreichen, und der Verabreichung jener Nucleotide an Gewebe, die relativ hohe Konzentrationen an Antigen-präsentierenden Zellen aufweisen, so beschaffen sind, dass die Verwendung kolloidaler Dispersionssysteme zur Zufuhr von Polynucleotiden nicht im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt. Die nachstehende Erläuterung in Bezug auf solche Systeme wird daher allgemein als Bezugsmaterial bereitgestellt.
Kolloidale Dispersionssysteme umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Perlen und lipidbasierte Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischte Micellen und Liposomen.
Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die als Zufuhrvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es wurde gezeigt, dass große einschichtige Vesikel (LUV), die in einem Größenbereich von 0,2-4,0 μm liegen, einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers, der große Makromoleküle enthält, einkapseln können. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Innenraums eingekapselt und Zellen in einer biologisch aktiven Form zugeführt werden (Fraley et al., Trends Biochem. Sci 6, 77 (1981)). Zusätzlich zu Säugetierzellen wurden Liposomen auch zur Zufuhr von Polynucleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein wirksames Gentransfervehikel ist, sollten die folgenden Eigenschaften zutreffen: (1) Einkapselung der Gene, die für die Antisense-Polynucleotide kodieren, bei hoher Effizienz, während sie nicht ihre biologische Aktivität umfassen; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Targetzelle im Vergleich zu Nicht-Targetzellen; (3) Zufuhr der wässrigen Inhalte des Vesikels zum Target-Zellzytoplasma mit hoher Effizienz; und (4) exakte und wirksame Expression von genetischer Information (Mannino et al., Biotechniques 6, 682 (1988)).
Die Zusammensetzung des Liposoms ist üblicherweise eine Kombination von Phospholipiden, insbesondere Phospholipiden mit hoher Phasenübergangstemperatur, üblicherweise mit Steroiden, insbesondere Cholesterin. Andere Phospholipide oder andere Lipide können auch verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Liposomen hängen von pH, Ionenstärke und der Gegenwart von zweiwertigen Kationen ab.
Beispiele für Lipide, die zur Liposomenproduktion nützlich sind, umfassen Phosphatidylverbindungen, wie Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerine, worin die Lipidgruppierung 14-18 Kohlenstoffatome, insbesondere 16-18 Kohlenstoffatome, enthält und gesättigt ist. Veranschaulichende Phospholipide umfassen Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
Das Targeting von Liposomen kann basierend auf anatomischen und mechanistischen Faktoren klassifiziert werden. Anatomische Klassifizierung basiert auf der Ebene der Selektivität, beispielsweise organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch. Mechanistisches Targeting kann darauf basierend unterschieden werden, ob es passiv oder aktiv geschieht. Passives Targeting arbeitet mit der natürlichen Neigung von Liposomen, sich auf Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen zu verteilen, die sinusförmige Kapillaren enthalten. Aktives Targeting andererseits umfasst die Veränderung des Liposoms durch Binden des Liposoms an einen spezifischen Liganden wie einen monoklonalen Antikörper, Zucker, Glykolipid oder Protein oder durch Verändern der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms, um Targeting auf Organe und Zelltypen zu erreichen, die andere sind, als die natürlich vorkommenden Lokalisierungssteilen.
Die Oberfläche des gerichteten Zufuhrsystems kann auf zahlreiche verschiedene Arten modifiziert werden. Im Fall eines gerichteten Liposomen-Zufuhrsystems können Lipidgruppen in die Lipid-Bilayer des Liposoms inkorporiert werden, um den Target-Liganden in stabiler Assoziation mit der Liposomen-Bilayer zu halten. Verschiedene Verbindungsgruppen können zum Binden der Lipidketten an den Target-Ligand verwendet werden. Isotonisch gepufferte Lösung ist das bevorzugte Medium für maximale Aufnahme der nackten Polynucleotide in Ausführungsformen der Erfindung, die auf APC-Expression beruhen. Weiters wird auch die Verwendung von Absorptions promotoren, Detergenzien, chemischen Reizstoffen oder mechanischen Reizstoffen bevorzugt, um Transmission der Nacktpolynucleotid-Zusammensetzung durch den Eintrittspunkt zu steigern. Allgemeine Prinzipien in Bezug auf Promotoren und Detergenzien, die bereits erfolgreich zur Schleimhautzufuhr organischer und peptidbasierter Wirkstoffe verwendet wurden sind in Chien, Novel Drug Delivery Systems, Kap. 4, Marcel Dekker (1992), nachzulesen. Spezifische Information bezüglich bekannter Mittel und Prinzipien zur nasalen Wirkstoffzufuhr werden in Chien, s.o., Kap. 5, erläutert. Beispiele für geeignete nasale Absorptionspromotoren werden in Kap. 5, Tabelle 2 und 3, beschrieben; mildere Mittel werden bevorzugt. Darüber hinaus werden bekannte Mittel und Prinzipien zur transdermalen Wirkstoffzufuhr auch in Chien, s.o., Kap. 7, erläutert. Geeignete Mittel zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung für mukosale/nasale Zufuhr werden auch in Chang et al., Nasal Drug Delivery, "Treatise on Controlled Drug Delivery", Marcel Dekker, Kap. 9 sowie Tabellen 3-4B darin (1992), beschrieben. Geeignete Mittel, die dafür bekannt sind, Absorption von Wirkstoffen durch die Haut zu steigern, werden in Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Kap. 5, "Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery", Marcel Dekker (1992), sowie an anderen Stellen im Text beschrieben.
Es wird angenommen, dass diese Verfahren (und andere, die auf herkömmliche Weise verwendet werden, um Wirkstoffzufuhr zu erleichtern) von durchschnittlichen Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren an die Herstellung von nackten Polynucleotiden zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung angepasst werden können. Obwohl die in den vorangehenden Absätzen erläuterten Verfahren, soweit den Erfindern bekannt ist, bisher noch nicht für Polynucleotidzufuhr verwendet wurden, wird insbesondere angenommen, dass sie zur Verwendung zu diesem Zweck geeignet sind. Spezifische Beispiele, die diese Eignung veranschaulichen, werden nachstehend beschrieben.
C. Mittel zur und Arten der Verabreichung von nackten Polynucleotiden
Zur dermalen Verabreichung können die Zufuhrmittel epidermale Verabreichung, subkutane oder intradermale Injektion umfassen. Von diesen Mitteln wird für größere Konzentrationen an APCs, die in intradermalem Gewebe erwartet werden, epidermale Verabreichung bevorzugt.
Die Zufuhrmittel für dermale Verabreichung, die am meisten bevorzugt sind, sind jedoch jene, die am wenigsten invasiv sind. Bevorzugt unter diesen Mitteln sind transdermale Transmission und epidermale Verabreichung.
Für transdermale Transmission ist Iontophorese ein geeignetes Verfahren. Iontophoretische Transmission kann unter Verwendung von handelsüblichen "Pflastern", die ihr Produkt kontinuierlich durch unverletzte Haut über mehrere Tage hinweg oder länger zuführen, erfolgen. Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht gesteuerte Transmission pharmazeutischer Zusammensetzungen in relativ hohen Konzentrationen, ermöglicht die Infusion von Kombinationswirkstoffen und erlaubt die gleichzeitige Verwendung eines Absorptionspromotors.
Ein beispielhaftes Pflasterprodukt zur Verwendung in diesem Verfahren ist das Produkt mit dem geschützten Warenzeichen LECTRO PATCH von General Medical Company aus Los Angeles, CA. Dieses Produkt hält Reservoir-Elektroden elektronisch bei neutralem pH aufrecht und kann so angepasst werden, dass es Dosierungen mit unterschiedlichen Konzentrationen bereitstellt, kontinuierlich Dosen abgibt und/oder regelmäßig Dosen abgibt. Vorbereitung und Verwendung des Pflasters sollten gemäß den schriftlichen Anweisungen des Herstellers, die mit dem LECTRO PATCH-Produkt mitgeliefert werden, erfolgen; diese Anweisungen sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Epidermale Verabreichung umfasst im Wesentlichen mechanisches oder chemisches Reizen der äußersten Schicht der Epidermis in ausreichender Weise, um eine Immunantwort auf den Reizstoff zu provozieren. Insbesondere sollte die Reizung aus reichend sein, um APCs zur gereizten Stelle hin anzuziehen. Wie zuvor erläutert wird angenommen, dass die APCs dann das verabreichte nackte Polynucleotid aufnehmen und exprimieren.
Ein beispielhaftes mechanisches Reizmittel verwendet zahlreiche kurze Zinken mit sehr geringem Durchmesser, die verwendet werden können, um die Haut zu reizen und APCs zur gereizten Stelle hin anzuziehen, sodass diese nackte Polynucleotide, die aus den Enden der Zinken transferiert werden, aufnehmen. Der MONO-VACC-Kochsches-Tuberculin-Test, hergestellt von Pasteur Merieux, Lyon, Frankreich, beispielsweise enthält eine Vorrichtung, die zur Einführung nackter Polynucleotide geeignet ist.
Die Vorrichtung (die in den Vereinigten Staaten von Connaught Laboratories, Inc. aus Swiftwater, PA, vertrieben wird) besteht aus einem Kunststoffbehältnis, das einen Spritzenkolben an einem Ende und eine Zinkenscheibe am anderen Ende aufweist. Die Zinkenscheibe trägt zahlreiche Zinken mit geringem Durchmesser und mit einer Länge, die gerade die äußerste Schicht von Epidermiszellen ankratzt. Jede Zinke im MONO-VACC-Set ist mit Kochschem Tuberculin beschichtet; in der vorliegenden Erfindung wird jede Nadel mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung aus nacktem Polynucleotid oder einem Gemisch davon beschichtet. Die Verwendung der Vorrichtung erfolgt gemäß den schriftlichen Anweisungen des Herstellers, die mit dem Vorrichtungsprodukt geliefert werden; diese Anweisungen bezüglich Verwendung und Verabreichung sind hierin durch Verweis aufgenommen, um die herkömmliche Verwendung der Vorrichtung zu veranschaulichen. Ähnliche Vorrichtungen, die in dieser Ausführungsform auch verwendet werden können, sind jene, die zur Zeit verwendet werden, um Allergietests durchzuführen.
Ein anderer geeigneter Ansatz zur epidermalen Verabreichung nackter Polynucleotide arbeitet mit der Verwendung einer Chemikalie, die die äußersten Zellen der Epidermis reizt und dadurch eine ausreichende Immunantwort hervorruft, um APCs in den jeweiligen Körperbereich zu locken. Ein Beispiel hierfür ist ein keratinolytisches Mittel wie beispielsweise die Salicylsäure, die in der im Handel erhältlichen, topi schen Enthaarungscreme verwendet wird, welche von Noxema Corporation unter der Handelsmarke NAIR verkauft wird. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um epitheliale Verabreichung in die Schleimhaut zu erreichen. Der chemische Reizstoff kann auch in Verbindung mit dem mechanischen Reizstoff aufgetragen werden (was beispielsweise eintreten würde, wenn die Zinken vom MONO-VACC-Typ auch mit dem chemischen Reizstoff beschichtet wären). Das nackte Polynucleotid kann in einem Träger suspendiert werden, der auch den chemischen Reizstoff enthält, oder zusammen damit verabreicht werden.
Die Dosierung von jedem nackten Polynucleotid oder Gemisch davon, das unter Verwendung der Erfindung zugeführt werden soll, variiert je nach der erwünschten Reaktion durch den Wirt und dem verwendeten Polynucleotid. Im Allgemeinen wird erwartet, dass bis zu 100-200 μg DNA in einer einzelnen Dosierung verabreicht werden können, auch wenn bereits nur etwa 0,3 μg DNA, die durch die Haut verabreicht wird, langandauernde Immunantworten induzieren können.
Für die Zwecke der Erfindung ist es jedoch ausreichend, wenn die nackten Polynucleotide in einer Dosierung zugeführt werden, die ausreichend ist, um Expression des biologisch aktiven Peptids, für das das Polynucleotid kodiert, auszulösen. Dosierungen, die für bestimmte Indikationen (z.B. zum Zuführen einer subtherapeutischen Dosierung von Cytokin) geeignet sind, werden durch die nachstehend bereitgestellte(n) Erläuterung und Beispiele veranschaulicht.
Diese Dosierungen können modifiziert werden, um therapeutische, subtherapeutische oder immunogene Expressionsniveaus zu erzielen. Mittel zur Bestätigung der Gegenwart und Menge exprimierter Peptide sind Fachleuten durchwegs bekannt und werden daher nicht im Detail beschrieben. Bestimmte solche Mittel werden in den nachstehend bereitgestellten Beispielen veranschaulicht; im Allgemeinen umfassen sie Immuntests (wie enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung), PCR-Verfahren und immunhistologische Analysen, die gemäß Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Dosierungen der verabreichten Poly nucleotide können basierend auf der Information, die durch diese Detektions- und Quantifizierungsmittel geliefert wird, sowie auf klinischen In-vivo-Zeichen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Medizin bekannt sind, so eingestellt werden, dass das erwünschte Expressionsniveau erreicht wird.
II. VERABREICHUNG VON MISCHUNGEN NACKTER POLYNUCLEOTIDE
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verabreichung einer Peptidmischung (d.h. eines Gemisches aus Polynucleotiden) über Expression von Genkonstrukten, die beispielsweise bis zu 200 Polynucleotidsequenzen enthalten, unter der Steuerung eines einzigen Promotors.
Die Verabreichung von Gemischen aus Polynucleotiden könnte auch dazu dienen, Peptide zuzuführen, die mehr als eine biologische Aktivität aufweisen. Ein nacktes Polynucleotid, das operativ für ein immunogenes Peptid kodiert, kann an ein nacktes Polynucleotid, das operativ für einen Antikörper kodiert, auf solch eine Weise gebunden oder mit diesem verabreicht werden, dass sowohl Peptid als auch Antikörper exprimiert werden. Um dies zu veranschaulichen, kann Verabreichung von Genen, die zusammen IL-2 und anti-gp71 exprimieren, (basierend auf Resultaten, die mit dem IL-2-Protein erzielt wurden) zur Lokalisierung des Antikörpers im Tumorgewebe, das sich in Reaktion auf murines Leukämievirus (MuLV) in Mäusen entwickelte, führen (siehe die Resultate, die mit gleichzeitiger Verabreichung von IL-2/anti-gp71-mAbs erzielt wurden, Schultz et al., Cancer Res. 50, 5421-5425 (1990)).
III. INDUKTION VON TUMOR-ASSOZIIERTEN, ANTIGEN-SPEZIFISCHEN ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN
A. Produktion von rekombinanten, immunreaktiven, Tumor-assoziierten Antigenmimetika
Diese Ausführungsform der Erfindung basiert auf dem Prinzip, dass Peptide, für die nackte Polynucleotide kodieren, die an Gewebe mit relativ hohen Konzentrationen an APCs gemäß der Erfindung aufweisen, intrazellulär in den APCs exprimieren (die dann in lymphatisches Gewebe wandern und eine Immunantwort stimulieren). Somit ist das Verfahren der Erfindung besonders gut geeignet, um intrazelluläre Expression von immunreaktiven Target-Antigenen zu erreichen, die die Entwicklung von eingeschränkten, Antigen-spezifischen Klasse-I-CTLs stimulieren, die wiederum für Krebsimmuntherapie nützlich sind.
(1) Selektion oder Identifikation eines Tumor-assoziierten Antigens von Interesse und eines Polynucleotid, das für das Antigen kodiert
Auch wenn die Erfindung angewandt werden könnte, um CTLs gegen Tumor-assoziierte Antigene an Zellen eines intakten Tumors zu bilden, kann erwartet werden, dass das Verfahren seine größte Wirksamkeit zeigt, wenn es zur Induktion von CTL-Aktivität gegen verbleibende Krebszellen nach Entfernung des Primärtumors oder eines Organs, das mit dem Tumor assoziiert war, (worin Letzteres kein lebensnotwendiges Organ darstellt, wie beispielsweise endokrine oder exokrine Drüsen, Geschlechtsorgane, Regionen des Magendarmtrakts und Haut) eingesetzt wird.
Zu diesem Zweck werden organspezifische oder carcinoembryonale, Tumor-assoziierte, Antigen-kodierende Polynucleotide selektiert oder, sofern nicht bekannt, identifiziert. Beispiele für organspezifische, Tumor-assoziierte Antigene, deren cDNA-Kodiersequenzen durchschnittlichen Fachleuten bekannt sind, umfassen das Prostataspezifische Transmembranprotein (PSM) (siehe Israeli et al., Cancer Res. 54, 1807-1811 (1994), und 53, 227-230 (1993)); Brustepithelantigene (siehe Ceriani et al., Anal. Biochem. 201, 178-184 (1992)); menschliches Magendarmkrebs-Antigen, Schistosoma-mansoni-assoziiertes Antigen und Melanom-spezifisches Antigen (siehe Bellacosa et al., Mol. Cell Biol. 11, 2864-1874 (1991)). Carcinoembryonales Antigen (das am Epithel des Darmlumens angeordnet ist; siehe Benchimol et al., Cell 57, 327-324 (1989)) und das Antigen, das mit Wilms-Tumor assoziiert ist (der an der Niere angeordnet ist; siehe Roth et al., Verh. Dtsch. Ges. Pathol. 73, 372-387 (1989)), sind Beispiele für carcinoembryonale, Tumor-assoziierte Antigene, für die cDNA-Ko diersequenzen bekannt sind und die zur Verwendung im Verfahren der Erfindung geeignet sind.
Mittel zur Identifikation zusätzlicher, Tumor-assoziierter Antigene unter Anwendung bekannter Hybridisierungs- und/oder Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Verfahren werden im Abschnitt I(A), s.o., beschrieben. Ein Verfahren zur Identifikation von Antigen-kodierenden Polynucleotiden, die von besonderem Nutzen bei der Identifikation von Tumor-assoziierten Antigenen zur Verwendung in der Erfindung sein können, ist Subtraktionshybridisierung, die erst jüngst als Werkzeug eingesetzt wurde, um Gene zu identifizieren, die in einer Population vorhanden sind, nicht aber in einer anderen, wie beispielsweise Polymorphismen zwischen dem Genom oder bestimmte Gene zweier Individuen (siehe Lisitsyn et al., Science 259, 946-951 (1993), dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist, um das auf dem Gebiet der Erfindung vorhandene Wissen bezüglich der Durchführung und Verwendung von cDNA-Subtraktionshybridisierungsverfahren zu veranschaulichen). Lisityn et al. berichten, dass ihr Subtraktionshybridisierungsverfahren durch die Verwendung von "kinetischer Anreicherung" bessere Resultate als herkömmliche Subtraktionshybridisierungsverfahren erzielt; d.h. durch die Verwendung von PCR, um nur ein doppelsträngiges "Tester"-DNA-Fragment, das in geringeren Mengen als Target-DNA-Stränge in einer Population von DNA-Fragmenten vorhanden ist, zu schmelzen und wiederherzustellen. Das Verfahren wird als Ermöglichung "der Entdeckung genomischer Veränderungen, die in Krebszellen auftreten" beschrieben (siehe Lisityn, S. 949).
Ein anderes Verfahren, das zur Identifikation von Genen geeignet ist, verwendet PCR, um unterschiedlich exprimierte RNAs zu identifizieren, wie in Liang & Pardee, Science 257, 967-971 (1992), beschrieben wird. Dieses Verfahren verwendet eine Reihe von Oligonucleotidprimern, wobei einer am Polyadenylatende einer Untergruppe von mRNAs verankert ist und der andere eine kurze und willkürliche Sequenz aufweist, sodass er im Vergleich zum ersten Primer an unterschiedlichen Positionen anelliert. Die mRNA-Subpopulationen, die durch diese Primerpaare definiert sind, werden durch reverse Transkription amplifiziert und an einem DNA-Sequenzierungsgel aufgelöst. Nach der Verwendung von Mehrfachprimersets berichteten die Auto ren, dass sie in der Lage waren, reproduzierbare Muster amplifizierter komplementärer DNA-Fragmente zu erhalten, die starke Abhängigkeit von Sequenzspezifität in beiden Primern eines Primerpaars zeigten.
Einen Überblick zur Konstruktion von cDNA-Bibliotheken, um Klone zu isolieren, die mRNAs entsprechen, die in einem Zell- oder Gewebetyp vorhanden sind, jedoch nicht in einem anderen, können Fachleute in den Standard-Arbeitsvorschriften finden, die in Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Abschnitt 5.8B, Wiley & Sons (1994), beschrieben werden und deren Offenbarung durch diesen Verweis hierin aufgenommen ist, um das auf dem Gebiet der Erfindung vorhandene Wissen bezüglich der Konstruktion subtrahierter cDNA-Bibliotheken zu veranschaulichen. Ein kurzer Überblick über geeignete Detektionsverfahren, die mit PCR arbeiten, ist nachstehend bereitgestellt.
Allgemeinen umfasst die Detektion von Target-Polynucleotiden in Proben oder Bibliotheken durch PCR die Verwendung von Primern, die Oligonucleotide mit ausreichender Länge und geeigneter Sequenz umfassen, um spezifische Polymerisationsinitiation einer beträchtlichen Anzahl an Nucleinsäuremolekülen, die die Target-Nucleinsäure enthalten, unter den stringenten Bedingungen für die Reaktion unter Verwendung der Primer bereitzustellen. Auf diese Weise ist es möglich, die die Nucleinsäure von Interesse enthaltende, spezifische Target-Nucleinsäuresequenz selektiv zu amplifizieren. Insbesondere bezieht sich die Bezeichnung "Primer" wie hierin verwendet auf eine Sequenz, die zwei oder mehr Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide, vorzugsweise zumindest acht, umfasst, worin die Sequenz in der Lage ist, Synthese eines Primer-Extensionsprodukts zu initiieren, das zu einem Target-Nucleinsäurestrang im Wesentlichen komplementär ist.
Der Oligonucleotidprimer enthält typischerweise 15-22 oder mehr Nucleotide, wobei er auch weniger Nucleotide enthalten kann, solange der Primer ausreichend spezifisch ist, um im Wesentlichen nur die Amplifikation der spezifisch erwünschten Target-Nucleotidsequenz zu ermöglichen (d.h. der Primer ist im Wesentlichen komplementär).
Versuchsbedingungen, die Primersynthese dienlich sind, umfassen die Gegenwart von Nucleosidtriphosphaten und einem Mittel für Polymerisation, wie DNA-Polymerase, sowie geeignete(n) Temperatur und pH. Der Primer ist für maximale Effizienz bei der Amplifikation vorzugsweise einzelsträngig, kann jedoch auch doppelsträngig sein. Sofern er doppelsträngig ist, wird der Primer zuerst behandelt, um seine Stränge zu trennen, bevor er verwendet wird, um Extensionsprodukte herzustellen. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in der Gegenwart des Polymerisationsinduktionsmittels zu primen. Die exakte Primerlänge hängt von zahlreichen Faktoren ab, einschließlich Temperatur, Puffer und Nucleotidzusammensetzung.
Primer, die für PCR-Detektion von Tumor-assoziierten Antigenen verwendet werden, werden als "im Wesentlichen" komplementär zu jedem Strang der zu amplifizierenden Nucleotidsequenz bezeichnet. Im Wesentlichen komplementär bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen unter Bedingungen zu hybridisieren, die ermöglichen, dass das Polymerisationsmittel funktioniert. Anders gesagt sollten die Primer ausreichend Komplementarität mit den flankierenden Sequenzen, die damit hybridisieren sollten, aufweisen und Amplifikation der mutierten Nucleotidsequenz ermöglichen. Vorzugsweise weist der 3'-Terminus des Primers, der verlängert wird, perfekt basengepaarte Komplementarität mit dem komplementären flankierenden Strang auf.
Oligonucleotidprimer werden in jeglichem Amplifikationsverfahren verwendet, das erhöhte Mengen an Target-Nucleinsäure bildet. Typischerweise ist ein Primer komplementär zum negativen (–) Strang der mutierten Nucleotidsequenz, und der andere ist komplementär zum positiven (+) Strang. Anellieren der Primer an denaturierte Nucleinsäure, gefolgt von Extension mit einem Enzym, wie beispielsweise dem große Fragment von DNA-Polymerase I (Klenow) oder Taq-DNA-Polymerase und Nucleotiden oder Ligasen, resultiert in neu synthetisierten + und – Strängen, die die Target-Nucleinsäure enthalten. Da diese neu synthetisierten Nucleinsäuren auch Matrices sind, führen wiederholte Zyklen von Denaturieren, Primer-Anellieren und Extension zur exponentiellen Produktion der Region (d.h. der mutierten Target-Nucleotidse quenz), die durch den Primer definiert ist. Das Produkt der Amplifikationsreaktion ist ein einzelner Nucleinsäureduplex mit Termini, die den Enden der spezifischen verwendeten Primer entsprechen. Fachleuten werden andere Amplifikationsverfahren bekannt sein, die auch verwendet werden können, um die Kopienanzahl von Target-Nucleinsäure zu steigern.
Die Oligonucleotidprimer zur Verwendung in der Erfindung können unter Verwendung jeglichen geeigneten Verfahrens, wie beispielsweise herkömmliche Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren oder automatisierte Ausführungsformen davon hergestellt werden. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können wie von Beaucage et al. (Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981)) beschrieben synthetisiert werden. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem modifizierten festen Träger wird im US-Patent Nr. 4.458.066 beschrieben. Ein Amplifikationsverfahren, das gemäß dieser Erfindung verwendet werden kann, ist Polymerasekettenreaktion (PCR), die in den US-Patenten Nr. 4.683.202 und 4.683.195 beschrieben wird.
Die Nucleinsäure aus jeglichem histologischen Gewebemuster, in gereinigter oder nichtgereinigter Form, kann als Ausgangsnucleinsäure oder -säuren verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthält die spezifische Nucleinsäuresequenz, die die Target-Nucleinsäure enthält, oder es wird von ihr angenommen, dass sie diese enthält. Somit kann das Verfahren beispielsweise DNA oder RNA, einschließlich Messenger-RNA (mRNA), verwenden, worin DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann. Sofern RNA als Matrix verwendet wird, würden Enzyme und/oder Bedingungen, die für reverse Transkription der Matrix zu DNA optimal sind, verwendet werden. Darüber hinaus kann ein DNA-RNA-Hybrid, das jeweils einen Strang von DNA und RNA enthält, verwendet werden. Ein Gemisch aus Nucleinsäuren kann auch verwendet werden, oder es können auch die Nucleinsäuren verwendet werden, die in einer vorigen Amplifikationsreaktion hierin unter Verwendung derselben oder unterschiedlicher Primer gebildet wurden. Die zu amplifizierende Nucleotidsequenz kann ein Teil eines größeren Moleküls sein oder kann anfänglich als separates Molekül vorliegen, sodass die spezifische Sequenz die gesamte Nucleinsäure bildet. Es ist nicht erforderlich, dass die zu amplifizierende Sequenz anfänglich in reiner Form vorhanden ist; sie kann ein geringer Teil eines komplexen Gemisches, wie er in menschlicher Gesamt-DNA enthalten ist, sein.
Enthält die Target-Nucleotidsequenz der Probe zwei Stränge, so ist es erforderlich, die Stränge der Nucleinsäure zu trennen, bevor sie als Matrix verwendet werden kann. Strangtrennung kann entweder als separater Schritt erfolgen oder gleichzeitig mit der Synthese der Primer-Extensionsprodukte stattfinden. Diese Strangtrennung kann unter Verwendung verschiedener geeigneter Denaturierungsbedingungen erfolgen, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel; das Wort "Denaturierung" umfasst alle solche Mittel. Ein physikalisches Verfahren zur Trennung von Nucleinsäuresträngen umfasst das Erhitzen der Nucleinsäure, bis sie denaturiert ist. Typische Hitzedenaturierung kann Temperaturen im Bereich von etwa 80 °C bis 105 °C für Zeitspannen im Bereich von etwa 1 bis 10 min umfassen. Strangtrennung kann auch durch ein Enzym aus der Klasse von Enzymen, die als Helicasen bekannt sind, oder durch das Enzym RecA, das Helicase-Aktivität aufweist, und in der Gegenwart von riboATP, das bekannt dafür ist, DNA zu denaturieren, induziert werden. Die für Strangtrennung von Nucleinsäuren mit Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen werden von Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology 43, 63 (1978)) beschrieben, und ein Überblick zu Verfahren zur Verwendung von RecA wird in C. Radding (Ann. Rev. Genetics 16, 405-437 (1982)) bereitgestellt.
Ist die Nucleinsäure, die die zu amplifizierende Target-Nucleinsäure enthält, einzelsträngig, so wird ihr Komplement durch Zusetzen von einem oder zwei Oligonucleotidprimer(n) synthetisiert. Wird ein einzelner Primer verwendet, so wird ein Primer-Extensionsprodukt in Gegenwart von Primer, einem Polymerisationsmittel und den vier Nucleosidtriphosphaten, wie nachstehend beschrieben, synthetisiert. Das Produkt ist komplementär zur einzelsträngigen Nucleinsäure und hybridisiert mit einer einzelsträngigen Nucleinsäure, um einen Duplex mit ungleich langen Strängen zu bilden, die dann zu Einzelsträngen geteilt werden können, um zwei einzelne, getrennte, komplementäre Stränge zu bilden. Alternativ dazu können zwei Primer zur einzelsträngigen Nucleinsäure hinzugefügt werden und kann die Reaktion wie beschrieben durchgeführt werden.
Werden komplementäre Stränge von Nucleinsäure oder -säuren getrennt, unabhängig davon, ob die Nucleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig war, so sind die getrennten Stränge bereit, als Matrix für die Synthese zusätzlicher Nucleinsäurestränge verwendet zu werden. Diese Synthese erfolgte unter Bedingungen, die Hybridisierung von Primern an Matrices ermöglichten. Im Allgemeinen tritt Synthese in einer gepufferten wässrigen Lösung ein, vorzugsweise bei einem pH von 7-9, am bevorzugtesten von etwa 8. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuss (für genomische Nucleinsäure üblicherweise etwa 10⁸:1 Primer:Matrix) der zwei Oligonucleotidprimer zum Puffer, der die getrennten Matrixstränge enthält, zugesetzt. Es gilt jedoch zu verstehen, dass die Menge an komplementärem Strang unbekannt sein kann, wenn das Verfahren der Erfindung für diagnostische Anwendungen verwendet wird, sodass die Menge an Primer in Bezug auf die Menge an komplementärem Strang nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Aus praktischen Gründen weist jedoch die Menge an zugesetztem Primer im Allgemeinen einen molaren Überschuss gegenüber der Menge an komplementärem Strang (Matrix) auf, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch aus komplizierten langkettigen Nucleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuss wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
In manchen Amplifikations-Ausführungsformen werden die Substrate, beispielsweise die Desoxyribonucleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP, entweder getrennt oder zusammen mit den Primern in adäquaten Mengen zum Synthesegemisch zugesetzt, und die resultierende Lösung wird auf etwa 90 °C – 100 °C etwa 1 bis 10 min lang, vorzugsweise 1 bis 4 min lang, erhitzt. Nach dieser Wärmephase wird die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, was für die Primerhybridisierung bevorzugt wird. Zum gekühlten Gemisch wird ein geeignetes Mittel (hierin als "Polymerisationsmittel" bezeichnet) zugesetzt, um die Primer-Extensionsreaktion zu bewirken, und die Reaktion wird unter Bedingungen, die auf dem Gebiet der Erfin dung bekannt sind, eintreten gelassen. Das Polymerisationsmittel kann auch zusammen mit den anderen Reagenzien zugesetzt werden, sofern es wärmestabil ist. Diese Synthese-(oder Amplifikations-)reaktion kann bei Raumtemperatur bis hin zu einer Temperatur, über der das Polymerisationsmittel nicht mehr funktioniert, eintreten. Somit liegt beispielsweise, wenn DNA-Polymerase als Mittel verwendet wird, die Temperatur im Allgemeinen nicht über etwa 40 °C.
Das Polymerisationsmittel kann jegliche Verbindung oder jegliches System sein, die/das so funktioniert, dass die Synthese von Primer-Extensionsprodukten, einschließlich Enzymen, zu einem Abschluss gebracht wird. Geeignete Enzyme für diesen Zweck umfassen beispielsweise E.-coli-DNA-Polymerase I, Taq-Polymerase, Klenow-Fragment von E.-coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, andere verfügbare DNA-Polymerasen, Polymerasemuteine, reverse Transkriptase, Ligase und andere Enzyme, einschließlich wärmestabiler Enzyme (d.h. jene Enzyme, die Primerextension vollbringen, nachdem sie Temperaturen ausgesetzt wurden, die ausreichend hoch sind, um Denaturierung zu verursachen). Geeignete Enzyme erleichtern die Kombination der Nucleotide auf geeignete Weise, um die Primer-Extensionsprodukte zu bilden, die zu jedem mutierten Nucleotidstrang komplementär sind. Im Allgemeinen beginnt die Synthese am 3'-Ende von jedem Primer und verläuft in der 5'-Richtung entlang des Matrixstrangs, bis die Synthese endet und Moleküle verschiedener Länge hervorbringt. Es kann jedoch Polymerisationsmittel geben, die die Synthese am 5'-Ende beginnen und sie unter Verwendung desselben Verfahrens wie zuvor beschrieben genau in entgegengesetzter Richtung ablaufen lassen.
Der neu synthetisierte, mutierte Nucleotidstrang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang bilden unter den zuvor beschriebenen Bedingungen ein doppelsträngiges Molekül, und dieses Hybrid wird in darauffolgenden Schritten des Verfahrens verwendet. Im nächsten Schritt wird das neu synthetisierte, doppelsträngige Molekül unter Verwendung jedes beliebigen der zuvor beschriebenen Verfahren denaturierenden Bedingungen unterzogen, um einzelsträngige Moleküle bereitzustellen.
Das oben beschriebene Verfahren wird an den einzelsträngigen Molekülen wiederholt. Zusätzliche Polymerisationsmittel, Nucleoside und Primer können zugesetzt werden, sofern dies erforderlich ist, um die Reaktion unter den zuvor vorgeschriebenen Bedingungen fortzusetzen. Die Synthese wird wiederum an einem Ende von jedem der Oligonucleotidprimer begonnen und wird entlang der einzelnen Stränge der Matrix fortlaufen gelassen, um zusätzliche Nucleinsäure zu bilden. Nach diesem Schritt besteht die Hälfte des Extensionsprodukts aus der spezifischen Nucleinsäuresequenz, die durch die zwei Primer gebunden ist.
Die Schritte der Denaturierung und Extensionsproduktsynthese können so oft wie nötig wiederholt werden, um die mutierte Target-Nucleotidsequenz zu dem Ausmaß zu amplifizieren, das für Detektion erforderlich ist. Die Menge der produzierten mutierten Nucleotidsequenz akkumuliert sich auf exponentielle Weise.
Das amplifizierte Produkt kann durch Southern-Blot-Analyse ohne Einsatz radioaktiver Sonden nachgewiesen werden. In solch einem Verfahren wird beispielsweise eine kleine DNA-Probe, die eine sehr geringe Konzentration an Target-Nucleotidsequenz enthält, amplifiziert und über ein Southern-Blotting-Verfahren analysiert. Die Verwendung von nicht-radioaktiven Sonden oder Markierungen wird durch das hohe Ausmaß des amplifizierten Signals erleichtert.
Polynucleotide, die wie zuvor beschrieben nachgewiesen wurden, können, entweder in Lösung oder nach Bindung an einen festen Träger, durch jedes beliebige Verfahren, das üblicherweise zur Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz verwendet wird, wie PCR, Oligomerrestriktion (Saiki et al., Bio/Technology 3, 1008-1012 (1985)), Allel-spezifische Oligonucleotid-(ASO-)Sondenanalyse (Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 278 (1983)), Oligonucleotidligationstests (OLAs (Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)) und dergleichen weiter evaluiert, detektiert, kloniert, sequenziert und dergleichen werden. Über Molekularverfahren für DNA-Analyse wurde bereits berichtet und sie sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (Landegren et al., Science 242, 229-237 (1988)).
(2) Sofern das Antigen ein Selbstantigen (im Gegensatz zu einem Tumor-assoziierten Antigen aus einer anderen Säugetierspezies) ist, Modifikation eines Polynucleotids, das für das Tumor-assoziierte Antigen von Interesse als Selbstantigen kodiert, um das Selbstantigen nachzuahmen, nicht jedoch identisch damit zu sein
Um ein rekombinantes Selbstantigen "fremd" zu machen, um Immuntoleranz gegenüber dem Selbstantigen zu vermeiden, ist es im Allgemeinen ausreichend, ein einzelnes Nucleotid in der Kodierregion des Gens zu modifizieren, das für das Selbstantigen kodiert. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Identifikation bereit, welche Mutationen in einem Tumor-assoziierten, Antigen-kodierenden Polynucleotid zur Modifikation eines Tumor-assoziierten Selbstantigens zu einem ausreichenden Ausmaß wirksam sind, um T-Lymphozyten-Toleranz hier gegenüber in einem Wirt zu brechen (d.h. Mutationen, die immunreaktive "mimische" Antigene zur Stimulierung spezifischer Autoimmun-T-Lymphozyten-Antworten produzieren).
Um geeignete mimische Antigene zur Verwendung in der Erfindung zu identifizieren, werden Tumor-assoziierte, für Selbstantigen kodierende Polynucleotide wie nachstehend beschrieben mutiert. Vorzugsweise erfolgt die Mutation in der Region des Polynucleotids, die für eine immunogene Region des Selbstantigens kodiert; d.h. für das/die T-Zellepitop(e) im Selbstantigen.
Wenn auch arbeitsintensivere Mittel zur Kartierung von T-Zellepitopen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können auf praktische Weise epitopische Regionen eines Proteins unter Verwendung des Algorithmus nach Berzofsky vorhergesagt werden (siehe Margalit et al., J. Immunol. 138, 2213-2229 (1987), dessen Offenbarung durch diesen Verweis hierin aufgenommen ist, um das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich der Verwendung des Algorithmus nach Berzofsky zu veranschaulichen). Der Algorithmus filtert sich überlappende Aminosäurereste in einem Protein heraus und sagt die Gegenwart und Position von T-Zellepitop(en), basierend auf der Fähigkeit von Restreihen, eine amphipathische α-Helixkonfiguration zu bilden, vorher. Je höher das amphipathische Ergebnis für ein vorhergesagtes Epitop ist, desto größer ist dessen wahrscheinliche Immunreaktivität. Ein Software-Pro gramm zur Anwendung des Algorithmus auf Aminosäuresequenzen in einem Protein ist im Handel unter dem Handelsnamen AMPHI-Programm erhältlich und wird üblicherweise auf dem Gebiet der Erfindung verwendet, um T-Zellepitope vorherzusagen. Rotzschike und Mitarbeiter beschrieben jüngst auch ein Verfahren, das sie beschreiben als eines, das die "exakte" Vorhersage eines T-Zellepitops ermöglicht (Rotzschike et al., Eur. J. Immunol. 21, 2431 (1991)). Nachdem T-Zellepitope in einem Tumor-assoziierten Antigen identifiziert wurden, können isolierte oder sequenzierte und synthetisierte Peptide, die das mutmaßliche T-Zellepitop enthalten, in einem T-Zell-Proliferationstest getestet werden, um die Gegenwart und Reaktivität des Epitops im Peptid zu bestätigen.
Nachdem Epitope in einem Tumor-assoziierten Selbstantigen identifiziert wurden, können mutierte Polynucleotide, die operativ für nachahmende Antigene kodieren, gemäß den Verfahren der Erfindung zur Verwendung in Krebsimmuntherapie gebildet, getestet und/oder verabreicht werden. Beispiele für geeignete Mutationen umfassen die Bildung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), einer Nucleotiddeletion, einer Nucleotidsubstitution oder jeder beliebigen anderen Säugetier-Nucleinsäuresequenz von Interesse. Daher soll, wie hierin verwendet, die Bezeichnung "Mutante oder mutiert" in Verbindung mit einer Polynucleotidsequenz eine Mutation, einen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, eine Nucleinsäuredeletion oder eine Nucleinsäuresubstitution umfassen, die ein Tumor-assoziiertes Antigen im Wirt immunreaktiv machen. Besonders bevorzugte Mutationen sind jene, die auf Primärstrukturebene eine Ähnlichkeit zwischen ein Selbstantigen und einem kreuzreaktiven Antigen aus einer anderen Säugetierspezies (z.B. murine und menschliche Ribonucleoproteine) schaffen (siehe z.B. Mamula et al., J. Immunol. 152, 1453-1461 (1994)). Für die Zwecke dieser Offenbarung werden nachahmende, Tumor-assoziierte Antigene, die durch Modifikation von Selbstantigenen gebildet werden, als "homogene, Tumor-assoziierte Antigenmimetika" bezeichnet, während Tumor-assoziierte Antigene aus einer Spezies, die nicht die Wirtspezies ist (die immunologisch betrachtet den Tumor-assoziierten Antigenen, die an Tumorzellen in der Wirtsspezies vorhanden sind, ähnlich sind), als "heterogene, Tumor-assoziierte Antigenmimetika" bezeichnet werden.
Verfahren zur Mutation von Polynucleotiden, um modifizierte Genprodukte zu bilden, gibt es, und sie sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Ein Tumorassoziiertes, Antigen-kodierendes Polynucleotid mit einer wünschenswerten Mutation kann beispielsweise durch ortspezifische Mutagenese unter Verwendung einer herkömmlichen Polymerasekettenreaktion (PCR) und eines Primerpaars, das den 3'- und 5'-Regionen der cDNA entspricht, gebildet werden. Ein bevorzugtes Verfahren der Mutations-bildenden PCR-Amplifikation ist das Überlappungs-Extensions-PCR-Verfahren, das von Ho et al., Gene 77, 51-59 (1989), beschrieben wird, dessen Offenbarung durch diesen Verweis hierin aufgenommen ist. Im Allgemeinen führt dieses Verfahren zu ortspezifischer Mutagenese des Klons durch Verwendung eines 3'-Primers, um die fehlgepaarten mutierenden Basen zuzusetzen (Primer B im Artikel von Ho, der mit dem 5'-Primer A im ersten beschriebenen PCR-Zyklus verwendet wird). Amplifikation unter Verwendung der A- und B-Primer ergibt ein AB-Fragment. Ein zweiter PCR-Zyklus verwendet einen Primer (D) vom 3'-Ende des Gens und einen 5'-mutierten Primer (C), der komplementär zu Primer B ist. Das resultierende Amplifikationsprodukt (Fragment CD) überlappt das AB-Fragment. Werden die AB- und CD-Fragmente denaturiert, wiederhergestellt und unter Verwendung der A- und D-Primer amplifiziert, so enthält das resultierende Fusionsprodukt (AD) die cDNA-Sequenz voller Länge und die erwünschte Mutation.
Zur Bildung von zufälligen Mutationen in Genen ist ein PCR-Verfahren, das modifiziert ist, um die Zuverlässigkeit von Taq-Polymerase während DNA-Synthese zu reduzieren, besonders nützlich. Insbesondere wird die PCR unter Bedingungen durchgeführt, die im Allgemeinen eine kumulative Fehlerhäufigkeit von 2 % über die gesamte DNA-Nucleotidsequenz und eine Mutantenausbeute (für Targets mit über 300 bp) von mehr als 90 % ergeben; das heißt, Bedingungen hoher und Pool-vorgegebener dNTP-Konzentrationen (1 mM jeweils von dTTP, dCTP, dGTP, 200 μM dATP), eine hohe Konzentration an MgCl₂ in Gegenwart von MnCl₂ (0,5 mM) und 25 PCR-Zyklen, beginnend mit 1 ng kloniertem Plasmidtarget. Einen weiteren Überblick zu dieser Arbeitsvorschrift zu randomisierter PCR-Mutagenese können Fachleute in Leung et al., Technique 1, 11-15 (1989), finden; eine Modifikation des Verfahrens, um zufällige Punktmutationen zu erzielen, ist auch in Cadwell & Joyce, PCR Methods and Applications 2, 28-33 (1992), zu finden; und Information zur Bildung einer PCR-abgeleiteten Bibliothek an zufälligen Punktmutationen sind in Kirchoff & Desrosiers, PCR Methods and Applications 2, 301-304 (1993) zu finden, deren Offenbarungen durch diesen Verweis hierin aufgenommen sind, um PCR-Mutageneseverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zu veranschaulichen.
Ein anderer geeigneter Ansatz zur Herstellung einzelner Basensubstitutionen oder -deletionen wird von Shaw im US-Patent Nr. 4.904.584 ("Site-Specific Homogenous Modification of Polypeptides") beschrieben, dessen Offenbarung durch diesen Verweis zur Veranschaulichung des Wissens auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf Verfahren zur Erreichung spezifischer Mutationen in einer Nucleinsäuresequenz hierin aufgenommen ist.
3. Verleihen der Fähigkeit an das nackte, Tumor-assoziierte Antigen-Gen, operativ zu kodieren; d.h. durch Insertion in einen rekombinanten Expressionsvektor
Geeignete Verfahren und Vektoren zur Verwendung in diesem Schritt der Erfindung sind durchschnittlichen Fachleuten durchwegs bekannt oder können ohne übermäßiges Experimentieren ermittelt werden; siehe z.B. den Überblick und die Erläuterung der Abschnitte I(A) und II, oben.
B. Verfahren zum Screenen therapeutisch wirksamer, Tumor-assoziierter Antigenmimetika.
Nachdem Tumor-assoziierte Antigenmimetika (a) gemäß Schritt 1 oben identifiziert; und (b) durch Expression unter Verwendung der Polynucleotide und rekombinanten Expressionsvektoren, die gemäß Schritt 2 und 3 oben konstruiert wurden, hergestellt wurden; oder (b') unter Verwendung herkömmlicher Peptidsyntheseverfahren synthetisiert wurden, werden die Mimetika vorzugsweise auf ihre Fähigkeit gescreent, autoimmunreaktive CTLs zu stimulieren, die Tumorzellen lysieren, die das Target-Tumorantigen an der Zelloberfläche aufweisen.
Wie zuvor erläutert hängt CTL-Lyse von Targetzellen von der Präsentation von "Fremd-"Peptiden, die an Klasse-I-MHC-Moleküle gebunden sind, ab. Somit sind Tumor-assoziierte Antigenmimetika, die zur Verwendung bei Krebsimmuntherapie geeignet sind, jene, die Peptid/MHC-Komplexe an der Oberfläche von APCs in vivo bilden.
Von Peptiden, die an Klasse-I-MHC-Moleküle an APCs gebunden sind, wird angenommen, dass sie durch eine Länge von etwa 8 bis 10 Aminosäureresten charakterisiert sind (siehe z.B. Falk et al., Nature 351, 290 (1991); und Jardetzky et al., Nature 353, 326 (1991)). Es wurde gezeigt, dass, wenn solche Peptide in transfizierten APCs rekombinant exprimiert werden, sie Klasse-I-MHC binden können (siehe z.B. Townsend et al., Cell 42, 457 (1985); Townsend et al., Nature 324, 575 (1986); und Shastri et al., J. Immunol. 150, 2724-2736 (1993)).
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Tumor-assoziiertes, Antigen-kodierendes Kandidaten-Polynucleotid "therapeutische Wirksamkeit" aufweist, bereit; d.h. dieses Polynucleotid exprimiert ein Tumor-assoziiertes Antigenmimetikum im Zytoplasma von APCs, und dieses Antigen (a) wird seinerseits an Klasse-I-MHC-Moleküle an der APC-Zelloberfläche gebunden; und (b) stimuliert CTL-Lyse von Wirtstumorzellen, die das Tumor-assoziierte Targetantigen in sich tragen.
Um zu bestimmen, ob ein Tumor-assoziiertes Targetantigenmimetikum, das in APCs rekombinant exprimiert wird, an Klasse-I-MHC gebunden wird, können herkömmliche Verfahren wie Massenspektrometrieanalyse transfizierter APCs verwendet werden. Ein anderes Verfahren jedoch, das aufgrund seiner praktischen Anwendung bevorzugt wird, umfasst die Transfektion von MHC-exprimierenden CHO-(Chinahamster-Eierstock-)Zellen als Modell-APC mit einem Tumor-assoziierten Kandidaten-Antigenmimetikum, das für Polynucleotid kodiert. Nachdem Expression des Mimetikums in transfizierten APCs bestätigt wurde (beispielsweise durch Western-Blotting), kann Bindung des exprimierten Mimetikums an Klasse-I-MHC-Moleküle in einem Antigenspezifischen In-vitro-T-Zellaktivitätstest bestätigt werden.
Arbeitsvorschriften für solche Tests sind durchwegs bekannt und werden daher hierin nicht im Detail beschrieben. Einen Überblick hierzu können Fachleute jedoch in Coligan et al., "Current Protocols in Immunology", Abschnitt 3.11, Wiley & Sons (1994) (insbesondere im Abschnitt 3.11.2, der grundlegenden Arbeitsvorschrift zum Testen von lytischer Aktivität von T-Zellen als Reaktion auf Stimulierung durch MHC-Antigene), finden. Bezüglich einer Quelle von Antwortzellen, die Antigen-Processing und Präsentationsmechanismen in menschlichen APCs vorhersagen, gilt festzuhalten, dass für solche Mechanismen gezeigt wurde, dass sie zwischen murinen und simianen Spezies hoch konserviert sind (siehe z.B. Shastri et al., s.o., 2727-2728), sodass Maus- oder nicht menschliche Primatenzellen geeignete Modelle zur Verwendung in T-Zellaktivitätstests sind, um Tumor-assoziierte Antigen-nachahmende Präsentation durch menschliche APCs vorherzusagen.
In ähnlicher Weise sind murine und nicht-menschliche Primatenmodelle für die Vorhersage von In-vivo-CTL-Antworten auf APCs, die in vivo gemäß dem Verfahren der Erfindung transfiziert wurden, geeignet; d.h. für die Vorhersage, ob solche APCs CTL-Antworten gegen Tumor-assoziierte Antigene an Tumorzellen im Wirt stimulieren können oder nicht. Am praktischsten ist, wenn ein Modell zur Bestimmung von Antigen-spezifischer CTL-Aktivität die Verwendung von Rezipienten-Mäusen ohne endogene aktive T-Lymphozyten umfasst; z.B. Nacktmäuse oder bestrahlte Mäuse. Passive Immunisierung von Tumor-assoziierten, Antigen-geprimten CTLs in Mäuse, in die Tumorzellen aus einem Wirt oder einer Zelllinie eingeführt wurden, ermöglicht In-vivo-Bewertung der lytischen Fähigkeit der transferierten CTLs gegenüber den Tumorzellen (siehe z.B. die Standard-Arbeitsvorschriften für passive Immunisierung, CTL-Erschöpfung und In-vivo-T-Zellaktivitätstests, die in Coligan et al., "Current Protocols in Immunology", s.o., Abschnitt 4.1, beschrieben werden; siehe auch Shastri et al., s.o., S. 2734 [basierend auf Schätzungen verarbeiteter Peptide, die aus APCs isoliert wurden, und der Anzahl an Peptid-gebundenen MHC daran, die aus Scatchard-Diagrammen extrapoliert wurde, liegt die minimale Anzahl an Peptid/MHC-Komplexen, die für T-Zellstimulierung in vivo erforderlich ist, im Bereich zwischen 100 und 1.000 Kopien/Zelle]).
Unter Verwendung des oben beschriebenen Screening-Verfahrens können Tumor-assoziierte, für Antigenmimetikum kodierende Polynucleotide zur Verwendung in Krebsimmuntherapie gemäß der Erfindung oder zur Bildung von Antikörpern für Verwendungen wie Affinitätsreinigung von Tumor-assoziierten Antigenen und Mimetika identifiziert und konstruiert werden.
C. Verfahren für Krebsimmuntherapie durch Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die operativ für Tumor-assoziierte Antigene und Tumor-assoziierte Antigenmimetika kodieren
(1) Verabreichung des operativ kodierenden Polynucleotids als nacktes Polynucleotid gemäß der Erfindung
Verfahren zur Verabreichung von operativ kodierenden, nackten Polynucleotiden gemäß der Erfindung werden in Abschnitt I(C), oben, beschrieben. Die Haut ist eine wirksame Stelle für die Verabreichung nackter Polynucleotide, die für die Antigene von Interesse kodieren, zur Behandlung einer bestimmten Malignität. Dieser Bereich des Körpers ist eine Stelle, an der die meisten Viren und andere Antigene, die CTL-Antworten induzieren, zuerst auf den Wirt treffen. Zufällig sind diese Stellen auch jene außerhalb des lymphatischen Systems, die dazu neigen, die höchsten Konzentrationen an APCs zu enthalten (z.B. etwa 1-2 % der Zellen in der Epidermis sind Makrophagen und dendritische Zellen).
Die nackten, Tumor-assoziierten, Antigen-kodierenden Polynucleotide der Erfindung werden gemäß medizinisch an Krebsimmuntherapie angepassten Parametern – z.B. den Verlauf der Behandlung und das Geringhalten von Nebenwirkungen betreffend – verabreicht. Vorzugsweise wird das Verfahren der Erfindung verwendet, um nach Entfernung des Organs oder Gewebes, in dem der Tumor vorhanden war, eine Tumor-assoziierte, Antigen-spezifische CTL-Antwort gegen restliche, das Antigen aufweisende Tumorzellen zu stimulieren. Am bevorzugtesten wird das Verfahren der Erfindung verwendet, um eine Tumor-assoziierte, Antigen-spezifische CTL-Antwort gegen Tumorzellen in Geweben des Wirts, die eine relativ hohe Konzentration an APCs in sich aufweisen, d.h. Haut im Fall der vorliegenden Erfindung, zu stimulieren.
Auf dem Gebiet der Erfindung wurde berichtet, dass T-Lymphozytentoleranz gegenüber Selbstantigenen wirksamer durch Co-Immunisierung des Wirts mit Selbstantigenen und Fremdantigenen, die Selbstantigenen ähnlich sind, gebrochen wird (siehe Mamula et al., J. Immunol., s.o., 1456). Somit wird der Wirt, um den Abbau von T-Lymphozytentoleranz gegenüber dem Tumor-assoziierten Antigen im Wirt zu optimieren, vorzugsweise mit Polynucleotiden behandelt, die sowohl für homologe als auch für heterologe, Tumor-assoziierte Antigene kodieren.
Gegebenenfalls wird der Wirt mit Tumor-assoziierten-Antigen-Protein-Vakzinen (gemäß medizinisch zugelassenen Parametern für Krebsimmuntherapie) co-immunisiert, um Unterstützung durch Helfer-T-Lymphozyten und/oder mit für Cytokin kodierenden Polynucleotiden zu stimulieren, um die Leistung des Immunsystems des Wirts zu steigern (siehe z.B. Abschnitt I, oben, und Caligiuri et al., J. Clin. Invest. 91, 123-132 (1993) [Infusionen von rekombinantem IL-2-Protein an Patienten mit fortgeschrittenen Krebserkrankungen]).
Da jedoch die Entwicklung von löslichen Anti-Tumor-assoziierten-Antigen-Antikörpern mit der Freisetzung von löslichem Antigen einhergeht (was das Risiko einer Störung der CTL-Aktivität und einer Förderung von Immunkomplexkrankheit birgt), induziert die bevorzugte praktische Ausführung der Erfindung CTLs, ohne Antikörperbildung zu induzieren (durch Vermeiden der extrazellulären Freisetzung von löslichem Antigen, wie zuvor erläutert).
In Beispiel IX wurden Antigen-kodierende Polynucleotide zur Expression in APCs gemäß der Erfindung Mäusen intradermal verabreicht. Wie in den 11 und 12 gezeigt, wurden Antigen-spezifische CTLs in Seren aus den Mäusen nach Injektion nachgewiesen, wobei jedoch keine Antikörper, die mit dem injizierten Antigen reaktiv sind, nachgewiesen wurden. Hierzu gilt anzumerken, dass die Erfinder zeigten, dass die Verabreichung von Antigenen gemäß dem Verfahren der Erfindung selektiv die Produktion von TH1-Lymphozyten bevorzugt gegenüber TH2-Lymphozyten verstärkt (siehe Beispiele XI und XII). Somit stimuliert das Verfahren der Erfindung die Tumor-assoziierte, Antigen-spezifische CTL-Antwort, die für wirksame Krebsimmuntherapie erforderlich ist, ohne Autoantikörperproduktion (d.h. gegen Tumor-assoziierte Selbstantigene im Wirt) zu stimulieren.
Insbesondere die Beispiele IX-XIII, die nachstehend bereitgestellt werden, sind Veranschaulichungen der vorliegenden Erfindung. Jene Beispiele, die, wie angemerkt, "zur Information" bereitgestellt werden, beziehen sich auf Inhalte, die nicht unmittelbar in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen.
BEISPIEL I (zur Information)
ÖRTLICHE VERZÖGERTE ÜBEREMPFINDLICHKEITSREAKTIONEN IN MÄUSEN TRETEN NACH INTRAMUSKULÄREN INJEKTIONEN VON NACKTEM POLYNUCLEOTID AUF
Obwohl (in Übereinstimmung mit früher berichteten Resultaten) intramuskuläre Injektion von nackter Plasmid-cDNA zu Expression von Peptiden, für die Polynucleotide kodieren, führt, ruft sie (im Gegensatz zu früher berichteten Resultaten) auch eine Immunantwort auf das Gen im Muskelgewebe hervor. Bei Co-Injektion von 2 Plasmiden wird diese Entzündungsreaktion chronisch und weist Myonekrose auf. Beide Reaktionen stimmen mit einer Diagnose einer örtlichen verzögerten Überempfindlichkeitsreaktion auf das Gen an seinem Eintrittspunkt, d.h. im Muskelgewebe, überein. Im Gegensatz zu früheren Annahmen ist es diese Entzündungsreaktion, und nicht die Aufnahme durch Muskelzellen, die wahrscheinlich (wenn auch nicht alleine) für Expression von nackten Polynucleotiden nach intramuskulären Injektionen davon verantwortlich ist.
Um die Immunantwort zu veranschaulichen, die durch intramuskuläre Injektion von nackter cDNA hervorgerufen wurde, wurden pREVk3 und pRSVIL2 wie folgt hergestellt.
Herstellung von Plasmiden. Ein neu angeordnetes κ-Leichtgen aus einem menschlichen Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie wurde isoliert, das ein Humkv 325 enthält (das für den 17.109-kreuzreaktiven Idiotyp kodiert, der üblicherweise von IgM-Autoantikörpern und chronischen lymphozytischen Leukämiezellen exprimiert wird). Dieses Gen ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und wird beispielsweise in Martin et al., J. Exp. Med. 175, 983 (1992), beschrieben, wobei dieser Artikel durch diesen Verweis hierin aufgenommen ist.
Ein 1040 bp umfassendes HindIII-XhoI-Fragment, das die V-J-Region dieses Gens enthielt, wurde ausgeschnitten und in die Polyklonierungsstelle des Säugetier-Expressionsvektors pREP7 (Invitrogen, San Diego, CA), stromab der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous-Sarkum-Virus (RSV) insertiert, um einen Vektor zu bilden, der als pREVk3 bezeichnet wurde. Stromab des neu angeordneten JK1-Segments ist ein natürliches Stoppcodon vorhanden, das Translation beendet.
Um einen IL-2-Expressionsvektor, bezeichnet als pRSVIL-2, zu bilden, wurde die Luciferase-cDNA im Vektor pRSVL (Wolff et al., Science 247, 1465 (1990)) durch ein 680 bp umfassendes HindIII-BamHI-Fragment aus pBC12/HIV/IL-2 (American Type Culture Collection, Nr. 67618) gemäß dem Verfahren, das in Cullen, Cell 46, 937 (1986), beschrieben wird, ersetzt. Die Quellenverweise auf Wolff et al. und Cullen sind hierin aufgenommen, um das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich der Konstruktion dieser Expressionsvektoren zu veranschaulichen.
Intramuskuläre Injektion von Plasmid-cDNA in Mäuse. Acht Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden mit Methoxyfluran anästhesiert. Plasmid-cDNA (100 μg pro Injektion) wurde in 100 μl Kochsalzlösung suspendiert und wurde dann durch eine 28-Gauge-Nadel in wöchentlichen Intervallen viermal in die Quadrizepsmuskeln injiziert. Eine Gruppe von sechs Mäusen erhielt 100 μg pREVk3. Eine andere Gruppe von sechs Mäusen erhielt 100 μg jeweils von pREVk3 und pRSVIL-2, während eine dritte Gruppe 100 μg Kochsalzlösung alleine erhielt. Kurz vor jeder Injektion wurden Blutproben aus den Orbitalarterien genommen.
ELISA zur Überprüfung von In-vivo-Genexpression durch die Plasmide. Antikörper gegen Humkv325-Produkte wurden durch ELISA (enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung) gemessen. Für den IgM-Rheumafaktor Glo kodiert das Humkv325-Gen, und dieser Faktor weist 17.109-Idiotyp-positive κ-Leichtketten auf. Das gereinigte Protein wurde bei 10 μg/ml in 0,1 M Borat, 0,2 M NaCl, pH 8,2 (d.h. in gepufferter Boratkochsalzlösung oder BBS) aufgelöst, und anschließend wurden 100 μl Aliquote zu den Wells der Kunststoff-Mikrotiterplatten zugesetzt. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden die Platten zweimal mit BBS, die 0,5 % Tween-20 enthielt, (BBS/Tween) gewaschen und mit BBS, ergänzt mit 1 % Rinderserumalbumin, (BBS/BSA) vier Stunden lang bei Raumtemperatur gequencht. Nach zweimaligem Waschen mit BBS/Tween wurden die in Serie in BBS/BSA verdünnten Proben in zweifacher Ausführung auf die Wells aufgeteilt. Nach dreistündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten viermal mit BBS/Tween gewaschen und wurden dann mit biotinyliertem Ziege-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD), verdünnt auf 1:2.000 in BBS/BSA, inkubiert. Eine Stunde später wurden die Platten viermal mit BBS/Tween gewaschen und mit 25 μl TMB-Peroxidasesubstrat (Kirkegaard & Perry) inkubiert. 30 min später wurde Absorption bei 450 nm in einem Mikroplattenleser (Molecular Devices, Menlo Park, CA) gemessen. Um den Antikörpergehalt in den Immunseren zu bewerten, wurden die Resultate mit einer Standardkurve verglichen, die mit monoklonalem Antikörper 17.109 erstellt wurde (siehe z.B. die Beschreibung dieses mAb von Carson et al., Mol. Immunol. 20, 1081-1087 (1983)).
Diese Tests zeigten, dass Produktion der Antikörper von Interesse gesteigert wurde, wodurch Expression der Gene durch die Plasmide bestätigt war.
Histologische Bewertung. An Tag 49 wurden die mittels intramuskulärer Injektion behandelten Mäuse getötet. Muskeln, in die die Gene injiziert worden waren, wurden in 10 % Formalin fixiert und für histologische Bewertung verarbeitet.
Schnitte von Muskeln, denen pREVk3 und pRSVIL2 co-injiziert wurden, zeigten chronische Entzündung und Myonekrose, was mit einer örtlichen, verzögerten Über empfindlichkeitsreaktion übereinstimmte (1A und B). Im Gegensatz dazu wiesen Muskel, denen pREVk3 oder pRSVIL2 alleine injiziert wurde, ein Lymphinfiltrat auf, das an der Stelle der subkutanen Injektion angeordnet war (1C).
BEISPIEL II (zur Information)
GENEXPRESSION NACH INTRADERMALER INJEKTION EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS
Um Alternativen zu intramuskulären Injektionen nackter Polynucleotide zu erforschen, wurde Mäusen ein nacktes cDNA-Plasmid intradermal injiziert. Genexpression wurde beobachtet und gemessen.
Das Gen für Influenza-Ribonucleoprotein (RNP) wurde in ein pCMV-Plasmid wie zuvor beschrieben subkloniert. RNP-Gene aus zahlreichen Influenza-Stämmen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind im Vergleich zu verschiedenen Stämmen bezüglich ihrer Sequenz hoch konserviert (siehe z.B. Gorman et al., J. Virol. 65, 3704 (1991)).
Vier acht Wochen alten Balb/c-Mäuse wurden dreimal 15 μg pCMV-RNP, suspendiert in 100 μl HBSS, injiziert. Injektionen erfolgten intradermal am Ansatz des Schwanzes in Intervallen von zwei Wochen. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) erkennen vorhandene Antigene durch Klasse-I-MHC-Moleküle und spielen eine wichtige Rolle in der Eliminierung von virusinfizierten Zellen. Intramuskuläre (i.m.) Immunisierung mittels cDNA-Expressionsvektoren sollte ein wirksames Verfahren zur Einführung von Antigen in Klasse-I-MHC-Moleküle und folglich zur Stimulierung von CTL-Antworten sein. In dieser Studie induzierte intradermale (i.d.) Injektion eines Plasmids, das das Influenza-Nucleoprotein-(NP)Antigengen enthält, sowohl NP-spezifische CTL als auch hohe Titer an Anti-NP-Antikörpern. Diese Antikörper erreichten ein Maximum sechs Wochen nach Injektion und blieben, ohne lokale Entzündung, zumindest 28 Wochen lang unverändert.
Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Bänderung in der Gegenwart von Ethidiumbromid gereinigt und wurde gefroren in 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0, gelagert. Vor der Injektion wurde das Plasmid in Ethanol ausgefällt und in normaler Kochsalzlösung, die 0,1 mM EDTA enthielt, aufgelöst.
Die Gegenwart von Anti-NP-IgG in Serum wurde mittels ELISA, im Wesentlichen wie in Viera et al., Int. Immunol. 2, 487 (1990), beschrieben, gemessen. Die Resultate dieses Tests sind in 2A gezeigt; alle Tiere entwickelten Anti-NP-Antikörper mit hohem Titer, der länger als 20 Wochen anhielt. Wie in 2B gezeigt, schienen die intradermalen Injektionen etwa vierfach höhere Antikörpertiter als intramuskuläre Injektionen (verabreicht wie in Beispiel I beschrieben) gleicher Mengen an Plasmid-DNA zu ergeben.
Die Achsen aus 2 stehen jeweils für den ELISA-Titer (Mittelwert, 1 Unze) über Zeit. Serumverdünnung für alle Diagrammpunkte beläuft sich auf 2.560.
BEISPIEL III (zur Information)
GENEXPRESSION NACH INTRANSALAER EINFÜHRUNG EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS
Unter Verwendung desselben Plasmids (pCMV-RNP) in derselben HBSS-Suspension wie in Beispiel II beschrieben wurde nacktes Polynucleotid, das für Influenza-Ribonucleoprotein kodierte, in Balb/c-Mäuse in 3 Gruppen mit 6 Tieren intranasal eingeführt. Konzentrationen von Anti-NP-IgG in peripherem Blut vor und nach Einführung des Plasmids bei verschiedenen Serumverdünnungen wurden mittels ELISA, wie in Beispiel II beschrieben, gemessen. Blut wurde jeder Maus nach intranasaler Einführung 6 Wochen später abgenommen.
3 zeigt in einem Diagramm die Resultate des ELISA-Tests vor und nach intranasaler Einführung des Plasmids. Die Diagramme zeigen ELISA-Titer über Serumverdünnung. In 3 sind Werte für einzelne Mäuse aus jeder Gruppe (Nr. 1-3) und ein Mittelwert für alle Mäuse aus jeder Gruppe (Nr. G1-G3) gezeigt.
Ohne Anästhesie zeigten Mäuse in einer zweiten Gruppe, die 3 × 7,5 μg Plasmid erhielten, im Vergleich zu Hintergrund erhöhte Antikörpertiter (3). Diese Daten sind in 4 gezeigt.
Eine dritte Gruppe von Mäusen erhielt dasselbe Ausmaß an Plasmiden unter Anästhesie. Expression von RNP, wie durch die Titer von Anti-NP-IgG angezeigt wird, in diesen Mäusen war im Wesentlichen der Expression ähnlich, die in den nicht anästhesierten Mäusen erzielt wurde. Die Daten für die anästhesierten Mäuse sind in 5 gezeigt.
Expression kann durch zusätzliche Verwendung von Absorptionspromotoren gesteigert und durch zeitausgelöste Promotoren, deren Identität und Verwendung auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie jene, die in Chien, s.o., in Kap. 5 vorgeschlagen werden, verlängert werden.
BEISPIEL IV (zur Information)
HISTOLOGISCHE STUDIEN, DIE ZELLAUFNAHME NACKTER POLYNUCLEOTIDE DURCH EINKERNIGE ZELLEN AM EINTRITTSPUNKT DER HAUT ZEIGEN
Drei Tage nach intradermaler Injektion der Enden von nacktem pCMV/lacz in Balb/c-Mäuse wurden die Mäuse getötet. Gewebekulturen wurden am Eintrittspunkt für das Plasmid abgenommen und wurden auf E.-coli-β-Galactosidaseaktivität gefärbt. Eine Photographie (40fache Vergrößerung) eines Objektträgers aus der histologischen Untersuchung von diesen Kulturen ist in 6 zu sehen.
Wie in 6 gezeigt, wird für die Aufnahme des Plasmids (in Blau) gezeigt, dass sie durch einkernige Zellen erfolgt. Die Fibroblasten in den Gewebeproben sind nicht gefärbt, was darauf hinweist, dass das Plasmid durch diese Zellen nicht aufgenommen wurden. Die rundlichen, einkernigen Zellen, die das Plasmid aufnahmen, scheinen Makrophagen und/oder Antigen-präsentierende Zellen zu sein, was darauf hinweisen würde, dass die Aufnahme des Plasmids durch Phagozytose erfolgt.
BEISPIEL V (zur Information)
EPIDERMALE VERABREICHUNG EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS UNTER VERWENDUNG EINES MECHANISCHEN REIZSTOFFES, UM EINE IMMUNANTWORT HERVORZURUFEN
7 zeigt die Resultate einer ELISA, die wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt wurde, bezüglich Serumkonzentrationen an Anti-NP-IgG nach epidermaler Verabreichung von pCMVRNP über mechanische Mittel.
Das Plasmid wurde auf die Zinken einer unbeschichteten MONO-VACC^®-Vorrichtung, wie oben beschrieben, aufgeschichtet. (Es gilt anzumerken, dass es alternativ für die nackten Polynucleotide auch möglich ist, für längere Lagerstabilität, auf die Zinken der Vorrichtung lyophilisiert zu werden.) Die gesamte Plasmidkonzentration an allen Vorrichtungszinken betrug etwa 50 μg in einem isotonischen normalen Kochsalzlösungsträger (etwa 150 μg Plasmid pro ml). Der Rücken einer Balb/c-Maus wurde geschoren, und die geschorene Haut wurde mit der Zinkenvorrichtung leicht angekratzt. Wie in 7 gezeigt, wurde Anti-NG-IgG daraufhin in Serum nachgewiesen (an Tag 42 z.B. enthielt das Serum aus dieser Maus Antikörper als einen Titer von 1:10.240.).
BEISPIEL VI (zur Information)
EPIDERMALE VERABREICHUNG EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS UNTER VERWENDUNG EINES CHEMISCHEN MITTELS, UM EINE IMMUNANTWORT HERVORZURUFEN
8 zeigt die Resultate einer ELISA, die wie in Beispiel I beschrieben für Serumkonzentrationen von Anti-NP-IgG nach epidermaler Verabreichung von pCMVRNP in Verbindung mit der Anwendung eines chemischen Mittels durchgeführt wurde.
Das Plasmid wurde in 40 μg einer isotonischen normalen Kochsalzlösung, die etwa 150 μg Plasmid pro ml enthielt, suspendiert. Diese Lösung wurde am nichtadhäsiven Kissen eines BAND-AID-Brandverbandes (Johnson & Johnson) absorbiert.
Eine Balb/c-Maus wurde wie in Beispiel V beschrieben geschoren, und ein handelsübliches keratinolytisches Mittel (hierein die zuvor beschriebene Enthaarungscreme, die unter dem Handelsnamen NAIR verkauft wird) wurde auf die geschorene Haut aufgetragen. Nach mehreren Minuten wurde das keratinolytische Mittel von der Haut abgewaschen, und der plasmidhältige Verband wurde darüber angelegt. Wie in 8 gezeigt entwickelte das behandelte Tier Serum-Anti-NP-IgG bei einem Titer von 1:640.
BEISPIEL VII (zur Information)
IMMUNANTWORT AUF VIRUS-CHALLENGE VON MÄUSEN, DENEN INTRADERMAL NACKTES pCMVRNP VERABREICHT WURDE
Um zu testen, ob die durch Impfung mit geeigneten nackten Polynucleotiden entstandene Immunität Tiere vor einem letalen Virus-Challenge schützen konnte, wurde Gruppen von 10 Balb/c-Mäusen intradermal dreimal 15 μg eines pCMVRNP-Plasmids injiziert, das das NP-Gen aus einem H1N1-Stamm von Influenza-Virus (A/PR/8/34; bereitgestellt von Dr. Inocent N. Mbawuike vom Baylor College of Medicine, USA) enthielt. Kontrollgruppen umfassten Tiere, denen nichts injiziert wurde, sowie Tiere, denen ein irrelevantes Plasmid (pnBL3) injiziert wurde.
Sechs Wochen nach den anfänglichen Plasmidinjektionen wurden die Tiere mit einer LD₉₀-Dosis eines H3N2-Influenza-Stamms (A/HK/68; ebenfalls von Dr. Mbawuike bereitgestellt) provoziert. Intradermal geimpfte Mäuse waren vor dem Challenge im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollmäusen (P<0,01) signifikant geschützt; siehe 9 (eine Kaplan-Meyer-Überlebenskurve).
BEISPIEL VIII (zur Information)
RELATIVE KONZENTRATIONEN AN GENEXPRESSION NACH INTRADERMALEN INJEKTIONEN VON NACKTES-ZYTOMEGALIE-VIRUS- ODER ROUS-SARKOM-VIRUS-PROMOTOR-HÄLTIGEN, NACKTEN PLASMIDEN
Die mögliche Wirkung der in einem Expressionsvektor verwendeten Promotorregion wurde durch Testen von zwei Plasmiden, die das RNP-Gen wie in Beispiel II beschrieben enthalten, bewertet. Ein Plasmid, pCMVRNP, enthielt den unmittelbar frühen Promotor, die Enhancer- und Intronregion von Zytomegalie-Virus. Das andere Plasmid enthielt den Promotor aus der Rous-Sarkom-Virus-LTR-Region (pRSVRNP). Wie in 10 gezeigt waren Antikörperantworten des NP-Protein, das von den Plasmiden exprimiert wurde, nach intradermalen Injektionen mit dem CMV-Promotor konstant höher. Dies steht im Gegensatz zu den Anfworten, die nach intramuskulärer Injektion des NP-Gens beobachtet wurden, worin die durch die zwei Plasmide produzierten Antikörperkonzentrationen äquivalent waren (Daten nicht dargestellt).
BEISPIEL IX
SELEKTIVE INDUKTION VON ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN-ANTWORTEN NACH INTRADERMALER VERABREICHUNG VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN
Mäusen des C57/B6-Stamms wurden intradermal in den Schwanz 100 μg nackte DNA, gereinigt aus einem CDM8-Ova-Plasmid (im Detail in Shastri et al., J. Immunol. 150, 2724-2736 (1993), beschrieben), in Intervallen von zwei Wochen verabreicht. Das CDM8-Ova-Plasmid enthält die cDNA voller Länge (1,8 kb) für Ovalbumin.
Zwei Wochen nach der zweiten Genverabreichung wurden die Milzen der Mäuse entfernt und in vitro mit letal bestrahlten (3.000 Rad) syngenetischen Splenozyten, die mit einem synthetischen Ovalbuminpeptid (SIIMFEKL) gepulst wurden waren, kultiviert. Dieses Peptid ist ein eingeschränktes Klasse-I-Target für zytotoxische T-Zellen in Mäusen mit dem Histokompatibilitätshaplotyp K^b, der von Shastri et al. beschrieben wird. Nach fünf Tagen Kultur wurden die Zellen mit Targets zweier Typen inku biert, um auf die Bildung zytotoxischer T-Zellen durch die Mäuse, die das für Ovalbumin kodierende Gen erhalten hatten, zu testen. Die Targets waren Maus-EL-4-Lymphozyten, die mit dem synthetischen Ovalbuminpeptid gepulst worden waren, oder EL-4-Zellen, die mit der cDNA für Ovalbumin stabil transfiziert worden waren (siehe 11; die cDNA für Ovalbumin ist in der Figur als "EG7" bezeichnet). Die prozentuelle Lyse der zwei Targets wurde für verschiedene Effektor:Target-Verhältnisse (in 11 als "E:T-Verhältnis" bezeichnet) bestimmt. Wie in 11 gezeigt, hatten die Tiere, die das nackte CDM8-Ova-Plasmid erhalten hatten, zytotoxische T-Zellen produziert, die für die Ovalbumintargets (d.h. für EL-4 mit dem Ovalbuminpeptid und für EG7) spezifisch waren, jedoch für die Kontroll-EL-4-Zellen (d.h. jene ohne das Ovalbuminpeptid) nicht spezifisch waren.
C57/B6-Mäuse, die intradermal mit CDM8-Ova-Plasmiden geimpft worden waren, wurden auch auf Antikörper gegen Ovalbumin gescreent. Seren, die sechs Wochen nach Verabreichung der CDM8-Ova-Plasmide abgenommen wurden, enthielten keine nachweisbaren Konzentrationen an Antikörper (wie unter Verwendung von enzymgekoppelter Immunadsorptionsbestimmung an Mikrotiterplatten, die mit Ovalbumin beschichtet waren, gemessen wurde; siehe 12). Insgesamt zeigen diese Daten auf, dass die Verfahren zur Verabreichung nackter Polynucleotide der Erfindung eingeschränkte zytotoxische MHC-Klasse-I-T-Zellen (hierin gegen Ovalbumin) induzieren, ohne jedoch Antikörperproduktion zu induzieren.
BEISPIEL X
VERLÄNGERTES IMMUNOLOGISCHES GEDÄCHTNIS NACH INTRADERMALER VERABREICHUNG NACKTER POLYNUCLEOTIDE, INDUZIERT DURCH ANTIGENSTIMULIERUNG VON T-ZELLEN
0,1, 1, 10 und 100 μg nackte Polynucleotide in Plasmidform (0,5-5 ng/1 mg DNA-Endotoxingehalt), die unter der Steuerung des CMV-Promotors ("pCMV Lac-Z") für die E.-coli-Enzym-β-Galactosidase kodierten, wurden Gruppen von 4 Mäusen (nach Dosierung und Art der Verabreichung eingeteilt) entweder intramuskulär ("IM") oder intradermal ("ID") verabreicht. Zu Vergleichszwecken erhielt eine andere Dosierungsgruppe von 4 Mäusen 100 μg β-Galactosidaseprotein ("PR") intradermal verabreicht. Alle Injektionen wurden unter Verwendung von 50 μl normaler Kochsalzlösung als Träger hergestellt. IM- und ID-Injektionen wurden mit einer 0,5-ml-Spritze und einer 28,5-Gauge-Nadel verabreicht. Antikörper wurden hiernach durch enzymgekoppelten Immunadsorptionstest in Intervallen von zwei Wochen gemessen.
Kurz zusammengefasst wurden Gesamt-Antikörper unter Verwendung von β-Galactosidase (Calbiochem, CA) als Festphasenantigen gemessen. Mikrotiterplatten (Costar, Cambridge, MA) wurden mit 5 μg Antigen, aufgelöst in 90 mM Borat (pH 8,3) und 89 mM NaCl (d.h. gepufferter Boratkochsalzlösung; BBS), über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet und über Nacht mit 10 mg/ml Rinderserunalbumin in BBS blockiert.
Serumproben wurden seriell in BBS verdünnt, beginnend bei einer 1:40-Verdünnung in den ersten 8 Wochen und anschließend mit einer 1:320-Verdünnung. Diese Proben wurden zu den Platten zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gelagert. Platten wurden in BBS + 0,05 % Polysorbat 20 gewaschen und dann mit einer 1:2.000-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Jackson Immunoresearch Labs., West Grove, PA) 1 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt, oder sie wurden mit einer 1:2.000-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-Anti-Maus-IgG1-Antikörper (Southern Biotech, AL) umgesetzt, oder sie wurden mit einer 1:500-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatse markiertem Ratte-Anti-Maus-IgG-2A-Antikörper (Pharmingen, CA) unter denselben Bedingungen umgesetzt. Die Platten wurden wiederum gewaschen, und anschließend wurde eine Lösung von 1 mg/ml p-Nitrophenolphosphat (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) in 0,05 M Carbonatpuffer (pH 9,8), der 1 mM MgCl₂ enthielt, zugesetzt. Absorption bei 405 nm wurde 1 h nach Zusatz von Substrat zu den Platten abgelesen.
Wie in 13 gezeigt, wurden Antikörperantworten von äquivalenter Größenordnung in den Tieren induziert, die die pCMV-Lac-Z-Plasmide durch ID-Injektion erhalten hätten, und in den Tieren, die das PR erhalten hatten, während schwächere Antikörperantworten in den Tieren gemessen wurden, die die pCMV-Lac-Z-Plasmide durch IM-Injektion erhalten hatten.
Um sie auf T-Zell-Gedächtnis zu bewerten, wurden die Tiere mit 0,5 μg PR an einer anderen Stelle durch ID-Injektion geboostet. Hätten diese Tiere Gedächtnis-T-Zellen entwickelt, um die Produktion von Antikörper gegen β-Galactosidase zu steuern, so wäre anzunehmen, dass sie eine stärkere Immunantwort nach dem Boosten mit löslichem Proteinantigen als in Reaktion auf die erste Dosis Antigen zeigen würden.
Wie in 14 gezeigt, ist eindeutig, dass die Tiere, die ID-Injektionen von pCMV-Lac-Z-Plasmid erhalten hatten, ein wesentlich besseres immunologisches Gedächtnis entwickelt hatten als Tiere, die entweder IM-Injektionen von Plasmid oder PR erhalten hatten. Darüber hinaus hielt das Gedächtnis, das die ID-injizierten Tiere entwickelt hatten, mindestens etwa 12 Wochen an.
BEISPIEL XI
SELEKTIVE INDUKTION EINER TH1-ANTWORT NACH INTRADERMALER VERABREICHUNG NACKTER POLYNUCLEOTIDE
In Mäusen sind IgG-2A-Antikörper serologische Marker für eine TH1-Typ-Immunantwort, während IgG-1-Antikörper ein Hinweis auf eine TH2-Typ-Immunantwort sind. TH2-Antworten umfassen die Klasse der Allergie-assoziierten IgE-Antikörper; lösliche Proteinantigene neigen dazu, relativ starke TH2-Antworten zu stimulieren. Hingegen werden TH1-Antworten durch Antigenbindung an Makrophagen und dendritische Zellen induziert. TH1-Antworten sind bei der Behandlung von Allergien und AIDS von besonderer Bedeutung.
Um zu bestimmen, welche Antwort, sofern es überhaupt eine gäbe, von Mäusen produziert werden würde, die nackte Polynucleotide gemäß der Erfindung erhielten, wurden Mäuse mit pCMV-Lac-Z-Protein wie im vorangehenden Beispiel beschrieben geimpft. In Intervallen von zwei Wochen wurden jegliche IgG 2A und IgG 1 gegen β-Galactosidase durch enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (unter Verwendung von Antikörpern, die für die IgG-1- und IgG-2A-Unterklassen spezifisch waren) auf Mikrotiterplatten, die mit dem Enzym beschichtet waren, gemessen.
Wie in 15 gezeigt, produzierten nur zwei Mäuse, die das Plasmid durch ID-Injektion erhielten, hohe Titer an IgG-2A-Antikörper. Wie in 16 gezeigt, induzierte die Immunisierung der Mäuse mit dem Enzym selbst ("PR") die Produktion von relativ hohen Titern an IgG-1-Antikörpern. In den IM injizierten Mäusen wurden geringe Titer sowohl an IgG-2A- als auch an IgG-1-Antikörpern ohne eindeutige Selektivität produziert. Die in den Figuren gezeigten Daten umfassen Mittelwerte der für jede Gruppe an 4 Mäusen erhaltenen Werte.
Um die Stabilität der Antikörperantwort im Laufe der Zeit zu bestimmen, wurde dieselbe Gruppe an Tieren mit 0,5 μg Enzym, das intradermal injiziert wurde, geboostet. Wie in den 17 und 18 gezeigt, induzierte das Boosten von mittels ID-Injektion geprimten Tieren mit dem Enzym einen beinahe 10fachen Anstieg der IgG-2A-Antikörperantworten (d.h. der Antikörpertiter stieg von 1:640 auf 1:5120), stimulierte jedoch keine IgG-1-Antwort. Diese Daten weisen darauf hin, dass die selektive TH1-Antwort, die durch ID-Verabreichung nackter Polynucleotide induziert wurde, trotz der darauf folgenden Aussetzung gegenüber Antigen im Wirt aufrechterhalten wird.
BEISPIEL XII
TH1-ANTWORTEN IN MÄUSEN NACH VERABREICHUNG NACKTER POLYNUCLEOTIDE MIT EINEM MECHANISCHEN REIZSTOFF
Die in Beispiel XI beschriebenen Versuche wurden in getrennten Gruppen von Mäusen wiederholt, außer dass (1) nur eine Priming-Dosis getestet wurde und (2) das pCMV-Lac-Z-Plasmid einer Gruppe von 4 Mäusen unter Verwendung der in Beispiel V beschriebenen Zinkenvorrichtung verabreicht wurde, während β-Galactosidaseprotein (10 μg) einer anderen Gruppe von 4 Mäusen durch intradermale (ID) Injektion verabreicht wurde.
Wie in 19 gezeigt, produzierten die Mäuse, die Plasmid erhielten, im Vergleich zu den Mäusen, die das Protein erhielten, relativ geringe Titer an IgG-1-Antikörper. Hingegen produzierten, wie in 20 gezeigt wird, die Mäuse, die Plasmid erhielten, im Vergleich zu den Mäusen, die Protein erhielten, wesentlich höherer Titer an IgG-2A-Antikörper.
Diese Resultate sind jenen ähnlich, die in Beispiel XI erzielt wurden, mit der Ausnahme, dass interessanterweise die Mäuse, die das Plasmid über Ankratzen ihrer Haut mit der Zinkenvorrichtung erhielten, sogar noch höhere Titer an IgG-2A-Antikörper als die Mäuse produzierten, die dasselbe Plasmid mittels ID-Injektion erhielten (wobei beide Gruppen höhere Titer an IgG-2A-Antikörper als die Mäuse produzierten, die das Plasmid mittels IM-Injektion erhielten). Diese Resultate weisen darauf hin, dass ein Ankratzen der Haut mit der Zinkenvorrichtung mehr APCs zum "verletzten" Eintrittspunkt für die nackten Polynucleotide hin anzieht, und stimmen mit der Theorie überein, dass APCs für Genverabreichung und -expression effizientere Targets als Muskel- oder andere Somazellen sind.
Die in den Figuren gezeigten Daten umfassen Mittelwerte der für jede Gruppe aus 4 Mäusen erhaltenen Werte.
BEISPIEL XIII
IL-4 UND INFγ-KONZENTRATIONEN IN MÄUSEN NACH IMMUNISIERUNG MIT ANTIGEN ODER ANTIGEN-KODIERENDEN POLYNUCLEOTIDEN
Um zu bestätigen, dass die durch die in den Beispielen XI und XII präsentierten Daten gezeigten Resultate der selektiven Induktion von TH1-Antworten (z.B. INFγ-Sekretion) in Plasmid-injizierten Mäusen zugeschrieben werden können, wurden Konzentrationen von IL-2 (Hinweis auf eine TH2-Antwort) und INFγ in den Seren der Plasmid- und Protein-injizierten Mäuse aus Beispiel XI nach einer Booster-Injektion von Antigen getestet. IL-2-Konzentrationen wurden wie in Beispiel I beschrieben getestet; INFγ-Konzentrationen wurden mit einem Anti-INFγ-Murin-Antikörper-Test getestet (siehe z.B. Coligan, "Current Protocols in Immunology", Abschnitt 6.9.5, Bd. 1, Wiley & Sons (1994)).
Wie in 23 gezeigt, waren die Konzentrationen an IL-4 in Protein-injizierten Mäusen wesentlich höher als in Plasmid-injizierten Mäusen (etwa um ein 9:1-Verhältnis). Umgekehrt waren die Konzentrationen an INFγ in den Plasmid-injizierten Mäusen wesentlich höher als in den Protein-injizierten Mäusen (um ein Verhältnis von etwa 11:1).
BEISPIEL XIV (zur Information)
IN-VIVO-PRODUKTION UND AUFRECHTERHALTUNG VON ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN NACH IMMUNISIERUNG MIT ANTIGEN ODER ANTIGEN-KODIERENDEN POLYNUCLEOTIDEN
Um zu bestätigen, ob die Plasmid-injizierten Mäuse CTLs entwickelten und den dadurch geleisteten Anti-Antigen-Schutz aufrechterhielten, wurden CTL-Konzentrationen in Plasmid-inijizierten Mäusen und in Kontrollmäusen gemessen.
Die Mäuse wurden wie in Beispiel V beschrieben immunisiert, außer dass sie pCMV-NP (in Beispiel I beschrieben) anstelle von Ovalbumin-DNA erhielten. Kontrollmäuse erhielten pCMV-BL (ein Plasmid mit einem nicht-kodierenden Insert). Die Gesamtmenge an pDNA, die auf die Zinkenvorrichtung pro Inokulation geladen wurde, betrug 50 μg pCMV-NP und 25 μg pCMV-BL.
36 Wochen nach Immunisierung wurden die Mäuse getötet, und Splenozyten wurden zur Verwendung in gemischten Standard-Lymphozytenkulturen entnommen. Die Kulturen wurden in der Gegenwart eines bekannten synthetischen Peptids gezüchtet, das das eingeschränkte Haupt-H-2^d-CTL-Epitop des NP-Proteins aufwies. Die Kulturen wurden 5-6 Tage später unter Verwendung von NP-Peptid-gepulsten, syngenetischen P815-Tumorzellen (ATCC-Nr. TIB64, Rockville, MD) als Targets auf Anti-NP-CTL-Aktivität getestet.
Wie in 24 gezeigt, wiesen gemischte Lymphozytenkulturen, die aus den pCMV-NP-injizierten Tieren hergestellt wurden, höhere Konzentrationen an spezifischer zytolytischer Anti-NP-Aktivität auf und erreichten 10 %, 30 % und 80 % spezifische Lyse bei einem Effektor:Target-Verhältnis (E:T-Verhältnis) von 5:1, 15:1 bzw. 45:1. Kontrollmäuse zeigten nur 1 %, 1 % und 9 % unter denselben Bedingungen. Darüber hinaus gab es bei keiner Aussetzung gegenüber dem H-2^d-Epitoppeptid keine signifikanten Unterschiede in der CTL-Aktivität zwischen den pCMV-NP-injizierten Mäusen und den Kontrollmäusen (25). Diese Daten sind ein Hinweis auf selektive Aktivierung von TH1-Zellen in den pCMV-NP-injizierten Mäusen.
FIGUREN ...
3/18

AVERAGE ersetzen durch MITTEL
TIME (WEEKS) ersetzen durch ZEIT (WOCHEN)
WEEK ersetzen durch WOCHE

4/18, 5/18

DILUTION ersetzen durch VERDÜNNUNG

6/18

BLAUFÄRBUNG (2x)

7/18

DILUTION ersetzen durch VERDÜNNUNG
DAY ersetzen durch TAG

8/18

SURVIVAL (MICE) ersetzen durch ÜBERLEBENDE (MÄUSE)
CONTROL ersetzen durch KONTROLLE
DAY ersetzen durch TAG
WEEK ersetzen durch WOCHE

9/18

LYSIS ersetzen durch LYSE
E:T RATIO ersetzen durch E:T-VERHÄLTNIS

10/18

KORRIGIERTE ABSORPTION (senkrecht)
WOCHE 5 SERUM
WOCHE 10 SERUM
KONTROLLE SERUM
VERDÜNNUNGSFAKTOR (unten)

11/18

WEEK ersetzen durch WOCHE
WEEK (POST BOOSTING) ersetzen durch WOCHE (NACH BOOST)

12/18

WEEK ersetzen durch WOCHE

13/18

WEEK (POST BOOSTING) ersetzen durch WOCHE (NACH BOOST)

14/18

WEEK ersetzen durch WOCHE

15/18

RESTRICTION SITE ersetzen durch RESTRIKTIONSSTELLE
PROMOTER ersetzen durch PROMOTOR

16/18

Tyne ersetzen durch Zinke
CYTOKINE ersetzen durch CYTOKIN

17/18, 18/18

SPECIFIC LYSIS ersetzen durch SPEZIFISCHE LYSE
E/T RATIO ersetzen durch E:T-VERHÄLTNIS

Claims

Verwendung eines nackten Polynucleotids, das operativ für ein therapeutisch wirksames tumorassoziiertes Antigen kodiert, das Klasse-I-MHC-Moleküle an Antigen aufweisenden Zellen bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Wirt, worin das nackte Polynucleotid an die Haut des Wirts verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das nackte Polynucleotid unter der Steuerung eines Kernrezeptorpromotors steht.
Verwendung nach Anspruch 2, worin der Promotor einer ist, der durch Auftragen eines aktivierenden Liganden, der für den Kernrezeptor spezifisch ist, auf die Haut des Wirts am Eintrittspunkt des Polynucleotids aktiviert wird.
Verwendung nach Anspruch 3, worin der Ligand aus der aus 1,2,5-Dihydroxyvitamin D₃, Steroidhormonen, Schilddrüsenhormon und Retinoiden bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, weiters umfassend die Verwendung eines tumorassoziierten Antigens bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors.
Verwendung nach Anspruch 1, weiters umfassend die Verwendung eines nackten Polynucleotids, das operativ für ein immunstimulierendes Cytokin kodiert.