DE69428984T2

DE69428984T2 - Stimulierung der immunantwort durch virales protein

Info

Publication number: DE69428984T2
Application number: DE69428984T
Authority: DE
Inventors: Christian Ertel; Volker Schirrmacher; Paul Von Hoegen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-03-16
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2014-03-12
Also published as: WO1994021798A1; DE69428984D1; EP0689596A1; EP0689596B1; AU675703B2; KR960701208A; ATE208421T1; CA2158461A1; JPH08508641A; AU6247794A; ZA941853B

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immunologie und betrifft die Verwendung eines bestimmten viralen Proteins, wie aus viraler cDNA exprimiert, zur Stimulierung einer bestimmten Form von Immunantwort, nämlich zur Verbesserung einer Antigen-spezifischen zytotoxischen Lymphozyten(CTL)-Antwort.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Eine zellvermittelte Immunantwort auf ein pathogenes Antigen umfasst mehrere Stufen. In der ersten Stufe wird der Erreger von einem Makrophagen verschlungen. Der Makrophage verarbeitet das Antigen in kleinen Fragmenten und präsentiert es einer T-Zelle. Solche Makrophagen sind als Antigenpräsentierende Zellen (APCs) bekannt. Die T-Zelle erkennt durch die Intervention eines major Histokompatibilitäts- Komplexantigens zum gegenwärtigen Zeitpunkt das Antigen als fremd. Die T-Zelle, die ein Lymphozyt ist, wird durch Interleukin-1 unterstützt, das von dem Makrophagen produziert wird, um die Bildung von funktionell spezialisierten T-Zellen anzuregen. Diese umfassen Helfer-T-Zellen, welche einen Phänotyp haben, der als CD4&spplus; beschrieben wird. Die Helferzellen stimulieren mit Hilfe von Interleukin-2 die Herstellung von Killer-T-Zellen, die auch als zytotoxische T- Lymphoyzyten (CTLs) bekannt sind. Sie besitzen einen Phänotyp, der als CD8&spplus; beschrieben wird. Die CTLs sind Antigen-spezifisch. Wenn sie das fremde Antigen erkennen, töten sie die Zelle, die es enthält, durch Lyse.
Die natürlichen Feedback-Mechanismen des menschlichen Körpers erhöhen die Anzahl an funktionellen CTLs, die zur Verfügung stehen, um das spezielle fremde Antigen abzuwehren, das in den Körper eingedrungen ist. Es ist bei der Therapie aber manchmal wünschenswert, die zellvermittelte Antwort auf ein spezielles Antigen zu erhöhen.
Antigen-spezifische CTL-Antworten können verstärkt werden durch Zytokine, wie beispielsweise gamma-Interferon [M.M. Simon u. a., J. Immunol., 136, 2755-2762 (1986)] oder alpha/beta-Interferon (L.K. Chen u. a., Eur. J. Immunol. 16, 767-770 (1986); P. von Hoegen u. a., Cellular Immunology 126, 80-90 (1990)] oder durch Modifikation der Antigenpräsentierenden Zellen (APCs), durch die Immunisierung von Mäusen mit Antigen-enthaltenden Zellen, infiziert mit dem Geflügelvirus, Newcastle Disease Virus (NDV) [P, von Hoegen und V. Schirmacher, Annals N.Y. Acad, Sci. 532, 468-471 (1988); P. von Hoegen u. a., J. Immunol. 18, 1169-1166 (1988)). Die Behandlung von Patienten, die an kolorektalem Krebs erkrankt sind, mit Krebszellen, die dem Patienten entnommen und mit NDV behandelt wurden, wird von W. Liebrich u. a., Eur. J. Cancer 21. 703-710 (1991) und P. Schlag u. a., Cancer Immunology und Immunotherapy, 35, 325-330 (1992) offenbart.
Es wäre wünschenswert, weitere Mittel zum Verstärken der Antigen-spezifischen CTL-Antworten zu finden. Zytokine müssten in großer Menge verabreicht werden, was Probleme bezüglich der Toxizität mit sich bringt. Die Infektion mit ganzem NDV bringt Schwierigkeiten bezüglich der Sicherheit und Reproduzierbarkeit mit sich, unter Berücksichtigung der Tatsache, dass der Virus in Hühnereiern wachsen gelassen wird, und auch der möglichen Wirkmechanismen von verschiedenen Komponentenproteinen. Weiterer Stand der Technik, dessen Relevanz nur durch die Kenntnis der Erfindung deutlich wird, wird nach dem Abschnitt "Zusammenfassung der Erfindung" erwähnt.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue medizinische Verwendung für DNA zur Verfügung gestellt, kodierend das Hämagglutinin-Neuraminidase(HN)-Protein eines Paramyxovirus, insbesondere von NDV, frei von dessen nativen Paramyxovirus und frei von jedem assoziierten spezifischen Antikörper für das HN-Protein, zum Zwecke der Verstärkung der Stimulation von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten beim Menschen. Die gleiche Verwendung von DNA, die für ein Peptid kodiert, das aus dem HN-Protein abgeleitet werden kann und die stimulationsverstärkende Wirkung hat, wird auch von der Erfindung umfasst. Die Erfindung kann auf verschiedene Arten gemäß den Erfordernissen des Patentgesetzes des betreffenden Landes dargestellt werden, was in Europa die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments für den obigen Zweck und in den Vereinigten Staaten ein Verfahren zum Bereitstellen der Stimulationsverstärkung, umfassend das Verabreichen einer Menge an für diesen Zweck wirksamer DNA an einen menschlichen Patienten, beinhaltet. Normalerweise würde die HN-DNA in Form von Zellen, die mit fremdem Antigen infiziert sind oder es bereit exprimieren und durch die HN-DNA infiziert sind, verabreicht werden. Der Ausdruck "Infektion" wird in diesem Zusammenhang in einem weiten Sinne verwendet, der Verfahren, wie beispielsweise die Elektroporation oder Kalziumphosphat- Präzipitation, die oft auch als "Transfektion" bezeichnet wird, sowie die Infektion mittels viralem Vektor für die DNA, wie beispielsweise bei einem Retrovirus oder Pockenvirus, umfasst. Die Terminologie "frei von dessen nativem Paramyxovirus" verdeutlicht einfach nur, dass es nicht beabsichtigt ist, die Verwendung von ganzen Partikeln von NDV oder einem anderen Paramyxovirus abzudecken.
Bei einer ersten Möglichkeit werden einem an einer Krankheit leidenden Patienten Zellen, zum Beispiel Tumorzellen, entnommen. Diese Zellen werden, z. B. mittels Bestrahlung, inaktiviert, mit der HN-DNA infiziert und dann dem Patienten wieder verabreicht. Bei einer zweiten Möglichkeit wird die Erfindung allgemeiner zur Impfung verwendet. Makrophagen oder andere APCs, beispielsweise irgendwelche HLA-Klasse I oder II-exprimierende Zellen, werden von dem Patienten isoliert oder in Kultur wachsen gelassen und an das MHC des Patienten angepasst, mit einem ein T-Zell-Epitop tragendes Peptid oder ein anderes geeignetes Antigen inkubiert und mit der HN-DNA infiziert. Die Erfindung stellt daher weiterhin eine Vakzine zur Verfügung, der zur Verwendung bei der Abwehr einer Krankheit in einem menschlichen Patienten geeignet ist, in dem eine T- Zell-vermittelte Immunantwort erzeugt werden kann, wobei die Vakzine Antigen-präsentierende Zellen (APCs) umfasst, die für den Patienten verträglich sind, ein Antigen hoher Spezifität für die Krankheit präsentiert und eine Komponente enthält, die ein HN-Protein zur Verfügung stellt und DNA umfasst, die für das HN-Protein eines Paramyxovirus kodiert, oder ein die T-Zellen-Stimulation verbesserndes Peptid davon, wobei die in-vivo-Stimulation von zytotoxischen T-Zellen hoher Spezifität für die Zytolyse von erkrankten Zellen durch die ein HN-Protein bereitstellende Komponente verstärkt wird. Bei einem Aspekt werden die APCs durch inaktivierte erkrankte Zellen, die zuvor dem zu behandelnden Patienten oder einem Spenderpatienten mit passendem MHC-Typ entnommen wurden, bereitgestellt.

Weitere Beschreibung des Standes der Technik

Unter vielen möglichen Betrachtungsweisen haben sich die Erfinder dazu entschlossen, mit der auf NDV basierenden fortzufahren. NDV ist ein Geflügel-Paramyxovirus mit einer einsträngigen RNA negativer Polarität mit einer Länge von ungefähr 15 kb, die für sechs Gene kodiert (3'-NP-P-M-F-HN-L- 5'). Das HN von NDV ist ein 74 kD Membran-Glycoprotein, das aus der viralen Hülle hervorsteht und sowohl hämagglutinierende (HA) wie auch Neuraminidase-Aktivität (NA) besitzt [N.S. Millar u. a., J. Gen. Virol. 67, 1917-1927 (1986)]). Das HN-Protein spielt eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung der Anlagerung eines Virus an die Rezeptoren einer Wirtszelle. Es dient aber nicht als Hauptziel für die zelluläre Immunantwort des Wirts, der höchstwahrscheinlich gegen das NP gerichtet ist, wie man am Influenza-Virus sehen kann.
Es gibt Vermutungen, dass Neuraminidase in Immunantworten verwickelt ist. R.L. Simmons und A. Rios, Cancer, 34, 1541-1547 (1974) haben berichtet, dass fest etablierte Tumoren in syngenen Mäusen regredieren, wenn sie mit lebenden Tumorzellen konfrontiert werden, die in vitro Vibrio cholerae-Neuramidase (VCN) ausgesetzt waren. Es wurde vermutet, dass Neuraminidase auf die Zelloberflächen einwirkt, um terminale Sialinsäurereste zu entfernen. Die Autoren konnten jedoch nicht in zufriedenstellender Weise einen ähnlichen Effekt auf die Tumoren erklären, wenn Conconavalin A anstelle von VCN verwendet wurde. Fünfzehn Jahre später stellte sich heraus, dass Hühnerzellen, die mit das NDV-HN-Gen enthaltendem Retrovirus transfiziert waren, gegen eine Infektion durch NDV und durch Influenza-Virus resistent waren. Es wurde wieder spekuliert, dass dies aus der Zerstörung von Zellrezeptoren durch die Neuraminidase herrührte; T.G. Morrison und L.W. McGinnes, Virology 171, 10- 17 (1989). Allerdings vermuteten diese Autoren nicht mehr eine allgemeine Wirkung des HN-Gens zur Erhöhung der Immunoantwort.
Das US-Patent 5 124 148 (Osatary und Massey, Übertragende an United Cancer Research Institute) beansprucht ein Verfahren zum signifikanten Steigern der Anzahl von T-4- Helfer-T-Zellen, weißen Blutzellen und Plättchen bei Menschen, die AIDS haben, indem man ihnen 1000 Einheiten attenuiertes Geflügel-Paramyxovirus, wie beispielsweise NDV ("Stamm H") durch intramuskuläre Injektion einmal wöchentlich für mindestens vier Wochen verabreichte. Über die Aktivitätszunahme der T-Zellen wird nichts gesagt. Die Beschreibung beschreibt auch andere immunologische Wirkungen von Geflügel-Paramyxoviren, einschließlich der Überlebensrate von Mäusen, die mit einem pathogenen Lymphom-Virus infiziert und begleitend mit NDV inokuliert waren. Die Beschreibung macht geltend, dass andere virale Formen außer ganzen attenuierten Viruspräparaten verwendbar sind und bezieht sich auf "virale Komponenten, wie beispielsweise gereinigte RNA", allerdings werden keine Einzelheiten angegeben. Es gibt also keinen Hinweis darauf, dass das HDf-Gen von NDV die Immunantwort verstärken würde, noch ist allein durch die obengenannte vorherige Spekulation, dass Neuraminidase bestimmte Zellrezeptoren zerstören könnte, offensichtlich, dass es das tun würde.
R.E. Randall und D.F. Young, J. Gen. Virol. 69, 2505- 2516 (1988) beschreiben ein Verfahren zum Herstellen von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für ein Simian- Virus-SV5-Protein sind, einschließlich das HN-Protein, Komplexieren dieser Antikörper auf eine feste Matrix (eine Suspension von Staphylococcus aureus Stamm Cowan A) und Verwenden des Komplexes zur Immunreinigung des SV5-Proteins. Die resultierenden Festmatrix-Antikörper-SV5-HN- Antigen(SMAA)-Komplexe wurden zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Sie induzierten sowohl humorale wie auch zellvermittelte Antworten. Die zellvermittelte Antwort wurde nicht mit der verglichen, die von nicht komplexiertem SV5-HN erhalten werden könnte. Der Aufsatz interpretiert die Ergebnisse als dem SMAA-Verfahren der Präsentation zuzurechnend und legt keineswegs nahe, dass das HN-Protein selbst ein T-Zell-Stimulator sein könnte. Es ist nicht sehr praktisch, das SV5-HN als einen Komplex mit einem spezifischen Antikörper daran zu präsentieren, und zwar wegen zusätzlicher Probleme bezüglich der Anwendungssicherheit solcher Antikörper, und wird daher von dem Umfang der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht das Verfahren zum Einführen einer zusätzlichen BamHI-Schnittstelle, um die Verwendung des Plasmids pSVL-HN.1 zu erleichtern (das ohne weiteres aus den gekannten Plasmiden abgeleitet wird), und zu dessen Einfügung in die BamHI-Stelle eines Expressionsplasmids p36/7;
Fig. 2 veranschaulicht in näheren Einzelheiten das Plasmid p36/7-HN.2, welches das Plasmid ist, in das NDV-HN-cDNA eingefügt worden ist;
Fig. 3A bis 3C zeigt Ergebnisse der Messung der Expression von HN und von Neuraminidaseaktivität in Maus-Ltk&supmin;-Zellen, transfiziert mit NDV-HN-cDNA.
Fig. 4 zeigt die Peptid-spezifische zytotoxische Wirkung im Vergleich zur nichtspezifischen zytotoxischen Wirkung bei mehreren unterschiedlichen Verhältnissen von Effektorzellen (Maus-Ltk&supmin;-Zellen vorinkubiert mit einem Peptid und mit NDV- HN) zu Target-Maus-Ltk&supmin;-Zellen, vorinkubiert mit Peptidzellen; und
Fig. 5 zeigt den Stimulationsindex in lytischen Einheiten pro 10&sup6; Zellen, wenn Mäuse mit verschiedenen spezifischen Zellen mit diesen Zellen inokuliert werden, mit und ohne vorausgehender Transfektion mit NDV.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Gemäß einem Aspekt erfordert die Erfindung die Verwendung von viraler cDNA, die ein HN-Protein kodiert. Dies kann einfach eine Kopie der genomischen RNA sein, oder kleine Variationen aufweisen, entweder im Rahmen der Degeneriertheit des genetischen Kodes, so dass es für die gleiche Sequenz von Aminosäuren kodiert, oder Variationen, die zu kleinen Änderungen für Aminosäuren führen, wodurch die Proteinfunktionen nicht nachteilig geändert werden. Es wird in Erwägung gezogen, normalerweise die DNA voller Länge zu verwenden, d. h. diejenige, die für das gesamte HN-Gen kodiert, es ist aber natürlich einfach, kürzere aber noch verwendbare Längen des Gens experimentell zu finden. Es wäre auch möglich, ein Fusionsprotein herzustellen, bei dem das HN-Protein oder ein gewisser Teil davon an ein Protein fusioniert wird, das eine Zelloberflächen-Bindungskapazität aufweist, zum Beispiel zum Binden an ausgewählte Zellen, insbesondere solche, die nicht in ausreichenden Mengen Sialinsäure exprimieren. Zum Beispiel könnte es an ein epidermales Wachstumsfaktor(EGF)-Protein fusioniert werden, der an den EGF-Rezeptor von mammären Zellen binden könnte.
Nachfolgend wird die Erfindung großteils durch Bezug auf das HN-Protein von NDV beschrieben, es ist aber bewußt, dass es andere Paramyxoviren gibt, die in ihrem HN-Protein einen hohen Grad an Homologie zu dem von NDV haben. Die Erfindung umfasst die Verwendung von solchen Proteinen und die sie kodierende DNA. Beispiele sind das Sendai-Virus, deren HN-cDNA von N. Miura u. a., FEBS 188 (1), 112-126 (1985) kloniert wurde, und das menschliche Paramxyovirus oder Parainfluenza-Virus.
Insbesondere umfasst die Erfindung die Verwendung von HN-Proteinen, die einen Grad an Homologie (Identität mit dem HN-Protein des NDC-Beaudette-C-Stamms von mindestens 70% auf der Aminosäureebene und vorzugsweise auf der Ebene der cDNA, die das Protein kodiert, haben. Diese Definition weist natürlich praktisch alle Stämme von NDV, wie beispielsweise Hitchin, Ulster 2C, Victoria, Italien usw., auf.
Die Immunisierung kann dadurch durchgeführt werden, dass man dem Patient eine Inokulation, z. B. durch intravenöse Injektion, mit den eigenen Zellen des Patienten, insbesondere mit Zellen, die Makrophagen umfassen, verabreicht, und zwar zur Vermeidung einer Transplantat/Wirts-Abstoßung, oder anderen Zellen, die für den Patienten tolerierbar sind, welche das interessante Antigen und die HN-DNA enthalten. Vorzugsweise wird die HN-DNA zusammen mit einem retroviralen Vektor, der die HN-DNA enthält, eingeführt, siehe J. Price u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 156-160 (1987). Alternativ werden die Zellen durch DNA von einem geeigneten Plasmid transfiziert. Zu diesem Zweck wird die DNA in einen eukaryontischen Zellexpressionsvektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, zum Beispiel eines Metallothionein-Promotors, eingefügt. Vorzugsweise enthält der Vektor auch mindestens einen Arnzeimittelresistenzmarker zur Verwendung in eukaryontischen Zellen. Die tolerierbaren Zellen werden dann mit der HN-DNA durch das Kalziumphosphat- Fällungsverfahren transfiziert. Alternativ könnte die HN-DNA in einen Adenovirus-Vektor eingefügt werden, der direkt in einen Tumor oder ein anderes infiziertes Gebiet des Körpers injiziert werden könnte, siehe B. Quantin u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2581-2584 (1992).
Die Vakzinen der Erfindung können auf jede übliche Art formuliert werden und ein Adjuvant aufweisen. Die Erfindung umfasst auch die Herstellung von Vakzinen durch geeignete Infektion von APCs mittels DNA oder Inkubation mit dem relevanten Antigen, wie oben und/oder in den Beispielen beschrieben.
Eine Dosis von das HN-Protein exprimierende DNA im Bereich von 10-100, vorzugsweise 20-60, HU/10&sup7; APCs wird vorgeschlagen. Dies stimmt mit der Dosis von 32 HU/10&sup7; Zellen überein, die in einem Phase II-Versuch ganzer NDV verwendet wird, siehe P. Schlag u. a., oben angegeben.
Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen eine neue Erkenntnis, nämlich dass die Expression des HN-Gen-Produkts in APCs ihre Antigen-präsentierende Kapazität vergrößern kann. Dies wird insbesondere anwendbar bei schwachen Immunantworten, wie beispielsweise sekundären Antworten gegen Peptide und Tumorantigene.
Die Erfindung ist primär von Interesse bezüglich Krebsantigenen, von denen einige eine schlechte Wirkung als Antigene bei der Stimulierung von Immunantworten haben. Ein Beispiel ist das Tumorassoziierte Antigen, analog zu dem in Mäusen durch hochmetastisches ESb-Lymphom erzeugten. Ein anderes ist das menschliche Melanom-Antigen, das von P. von der Bruggen u. a., Science 254, 1643-1647 (1991) beschrieben wird. Weitere Beispiele für Antigene, die von Punktmutationen nichtkarzinogener Proteine entstehen, sind auch dieser Studie zu entnehmen. Unter den nichtkarzinogenen Antigenen sind Listeria-Antigene und virale Antigene, insbesondere gp 120 oder 160 von HIV-1, von besonderem Interesse.
Eine andere Verwendung der Erfindung besteht darin, Peptide nach deren Fähigkeit als Antigen zu screenen, indem die APCs mit der HN-DNA gepulst werden und dann ihre Fähigkeiten, Immunzellen zu stimulieren, die ein spezielles interessierendes Antigen erkennen, getestet werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

BEISPIEL 1

(a) Konstruktion des eukarvontischen Plasmidvektors p 36/7- HN.2

Die Konstruktion eines Klons des Voll-Längen- NDV(Beaudette-C.-Staiwm)-HN-Gens im Plasmid pUC19 in E. coli ist vorbeschrieben worden [P. Chambers u.a., J. Gen. Virol. 69, 2115-2122 (1988); europäisches Patent EP-B 227 414 (British Technology Group Ltd.)]. Dieser Klon in E. coli eines Plasmids (pUC19), enthaltend die HN-NDV-DNA voller Länge, ist beim National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland nach der Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren am 1. Juli 1986 unter der Nummer NCIMB 12278 hinterlegt worden. Diese Hinterlegung ist bereits über das Europäische Patentamt in Verbindung mit dem EP-B 227 414 zugänglich. Der Klon, der von viraler genomischer RNA abgeleitet wurde, enthält die 3'- Region des NDV-F-Gens oberhalb des HN-Gens. Am 5'-Ende des Klons gibt es eine SphI-Stelle [Position 1610-1615 in der in EP-B 227 414 berichteten Sequenz oder 1-6 in N. S. Millar u. a., J. Gen. Virol. 67, 1917-1927 (1986)], die 304 Nukleotide oberhalb des HN-Starterkodons liegt. Der Klon erstreckt sich zu einer SstI-Stelle [Position 3733-3738 in EP-B 227 414 oder 2124-2129 in Millar u. a. (1986)], die 87 Nukleotide unterhalb des Endes der HN-kodierenden Sequenz liegt. Die 3'-nichtkodierende Sequenz und F-kodierende Sequenz dieses Klons enthält sieben zusätzliche potentielle Startkodons. Um die wirksame Expression des HN-Gens zu ermöglichen, wurde diese oberhalb gelegene Sequenz durch Exonucleaseverdau entfernt. Das Plasmid wurde an seiner einzigen SphI-3'-Klonierungsstelle linearisiert, und 25 ul des linearisierten Plasmids wurde bei 37ºC mit 1 Einheit BaI31 in 200 ul Puffer, enthaltend 0,6 M NaCl, 12 mM CaCl&sub2;, 12 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, inkubiert. Aliquote (20 ul) wurden zu Zeiten vor 30 Sekunden bis 15 Minuten entfernt, und die Reaktion wurde durch die Zugabe von jedem Aliquot zu 2 ul 200 mM EDTA gestoppt, und dann durch Erwärmen auf 65ºC während 5 Minuten inaktiviert. Die Enden der verdauten DNA wurden durch Einfüllen mit den Klenow- Fragmenten von DNA-Polymerase 1 (1 Einheit) in Anwesenheit aller vier dNTPs (jeweils 5 uM) repariert. Nach der Wärmeinaktivierung wurde das gekürztes Plasmid mit SstI geschnitten. Die deletierten Fragmente jedes der Zeitpunkte wurden getrennt in M13mp18 an die SmaI- und SstI-Stellen in der M13-Mehrfach-Klonierungsstelle ligiert. Nach der Transformation in E.coli, wurden einzelne Plaques von jedem Zeitpunkt isoliert und ihre Einfügung wurde sequenziert. Es wurde eine Reihe von Deletionen von der 3'-SphI-Stelle zu Punkten über das HN-Gen hinweg erhalten. Eine M13- Rekombinante (M13-HN10) wurde identifiziert, die zu einem Punkt von 101 Nukleotiden oberhalb der HN- Translationsstartsstelle deletiert war und von der alle oberhalb gelegenenden potentiellen Starterkodons entfernt worden waren. Die Einfügung von M13-HN10 wurde mit XbaI (in der M13-Mehrfach-Klonierungsstelle) und SstI (am 5'-Ende der HN-cDNA) gespalten und in die XbaI- und SacI (SstI)-Stellen in der Mehrfach-Klonierungsstelle des 4,9 kb Plasmidexpressionsvektors pSVL (Parmacia) subkloniert, um das Plasmid pSVL-HN zu erhalten, das schematisch in Fig. 1 der Zeichnungen gezeigt ist und eine Größe von ungefähr 6,7 kb hat.
Mit Bezug auf Fig. 1 wurde zur besseren Expression das pSVL-HN-Plasmid mit XbaI verdaut, das das Plasmid gerade oberhalb der HN-Sequenz schneidet. Die XbaI-Stelle wurde eingefüllt und in eine BamHI-Stelle umgewandelt. Das HN-Gen wurde dann von dem Plasmid durch BamHI abgespalten, das oberhalb und unterhalb des HN-Gens schneidet, und an ein BamHI-geschnittenes Plasmid p36/7 ligiert und wieder rund gemacht, um so das Plasmid p36/7-HN.2 herzustellen, das aus einem SV40E-Promotor, einem Neomycin-Reaistenzgen (aus einem pSV-neo-Plasmid), einem Metallothionein(MTII)-Promotor, dem HN-Gen und einem poly-A-Signal gebildet wird. Die Fig. 2 zeigt dieses Plasmid p36/7-DN.2 im größeren Maßstab und detaillierter.

b) Demonstration, dass Maus-Fibroblastzellen, die mit NDV- HN-cDNA transfiziert sind, HA und NA exprimieren

Die Mausfibroblastzelllinie Ltk&supmin;, die von S. Kit u. a., Exp. Cell. Res. 37, 291-312 (1963) beschrieben wurde, stellt Zellen zur Verfügung, die als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) fungieren, die den zutreffenden major Histokompatibilitätskomplex (MHC) zur Erkennung durch die T- Zellen der Mäuse, die in nachfolgenden Versuchen verwendet wurden, haben. Ltk&supmin;-Zellen wurden bei einer Dichte von 10&sup6; Zellen pro Schale 24 Stunden vor ihrer Verwendung zur Transfektion ausplattiert. Kalziumphosphat-Ausfällungen von DNA (20 ug) von dem Plasmid p36/7-HN.2 wurden wie von M. Wigler u. a., Cell 14, 725-731 (1978) beschrieben hergestellt. Die Ltk&supmin;-Zellen wurden der ausgefällten DNA 6 Stunden lang ausgesetzt und dann 3 Minuten mit gepuffertem salzhaltigem (HBS) Medium nach Hank, das 15% Glycerol enthielt, geschockt. Nach 24 Stunden wurden die transfizierten Zellen mit G418 bei 600 ug/ml ausgewählt. Nach 2-3 Wochen waren die G418-resistenten Kolonien durch begrenzte Verdünnung kloniert.
Die mittels NDV-HN-cDNA transfizierten Zellen wurden von den Kulturplatten durch Behandlung mit EDTA abgelöst, zweimal gewaschen und 20 Minuten lang bei 4ºC mit monoklonalen Antikörpern (8C11), die spezifisch für NDV-HN-Protein sind, oder, als Kontrollen, mit monoklonalen Antikörpern (12C4), die spezifisch für das NDV-F-Protein sind, oder mit PBS inkubiert. Beide monoklonalen Antikörper wurden freundlicherweise von D. Meulemans (Brüssel) zur Verfügung gestellt, siehe L. Long u. a., J. Virol. 57, 1198-1202 (1986). Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS/2% fötalen Kälberserum (FCS) gewaschen. Fluoresceinisothiocyanat(FITC)- konjugierte Ziegenantikörper für Maus Ig, verdünnt 1/100 in 50 ul PBS/2% FCS, wurden über 30 Minuten bei 4ºC zugegeben. Die Zellen wurden zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit einem FACscan Fluoreszenzanalysator (Becton Dickinsona) analysiert. Bei dieser Analyse wurde die relative Fluoreszenzintensität pro Zelle aus 10.000 Zellen unter Verwendung der Software LYSIS II errechnet.
Zur Untersuchung auf Neuraminidase wurde ein neues fluorimetisches Verfahren entwickelt. Die Neuraminidaseexprimierenden Ltk&supmin;-Zellen wurden entwickelt. Die Zellen, die Neuraminidase exprimieren, wurden bei 10&sup7; Zellen/ml zusammen mit roten Blutzellen vom Schaf (SRBC) (0,1%) in PBS 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die unmaskierten Neuraminidaserezeptoren für Erdnuß-Agglutinin (PNA) finden sich auf der Oberfläche von SRBC ein. Zur Erkennung der unmaskierten Rezeptoren wurden die Zellen zweimal gewaschen und mit FITC-markiertem PNA (3,125 mg/ml) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die SRBC mittels Durchflußzytometrie in den oben beschriebenen Analysator analysiert. Ltk&supmin;-Zellen wurden aus der Analyse durch eine Kombination von Vorwärts- und Seitenstreulichtgatter [forward and side scatter gating] ausgeschlossen.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 3 gezeigt. Um das Verhältnis zwischen HN-Expression (Fig. 3A) und Neuraminidaseaktivität (Fig. 3B) zu zeigen, werden die Ergebnisse der HN-Expressionsanalyse von Fig. 3A noch einmal in Fig. 3C bezüglich der Fluoreszenz, ausgedrückt als Verhältnis der mittleren Fluoreszenz der Versuchsgruppen (anti-HN) zu der der geeigneten Kontrollen, dargestellt. Die Kontrollen waren (a) die mit PBS behandelte für das Ltk&supmin;-NDV (ganzes Virus) und (b) die Ltk&supmin;-Zellen, die mit anti-F- Protein-Antikörper für die Ltk&supmin;-NDV-HN-cDNA-transfizierte Gruppe inkubiert waren. Die Expression beider Parameter wurde mit scheininfizierten Ltk&supmin;-Zellen (Ltk&supmin;-neo.A4) und Ltk&supmin;-Zellen verglichen, die mit 100 Hämagglutinineinheiten (HU)/10&sup7; Zellen von ganzem NDV des Stamms Ulster 2C, gewachsen in der Allantoishöhle von angebrüteten Hühnereiern (Ltk&supmin;-NDV), infiziert waren. Drei Klone, Ltk&supmin;-HN.A2, A3, und A4, die aus der Zytometrieanalyse ausgewählt wurden, exprimierten sowohl HN als auch NA, wie aus den relativen Aktivitäten, die in der Fig. 3B und 3C gezeigt sind, ersichtlich ist, Der Klon Ltk&supmin;- HN.A2 zeigt die höchste Expression von HN und NA, die sogar oberhalb der Aktivität liegt, die mit ganzen NDV-infizierten Ltk&supmin;-Zellen sichtbar ist. Die beiden anderen Klone (Ltk&supmin;-HN.A3 und Ltk&supmin;-HN.A4) zeigen eine schwächere aber noch signifikante Expression.

c) Herstellung von Antigen(Peptid)-spezifischen Antigen präsentierenden Zellen

Die Maus-Ltk-Zellen wurden aus der Kultur durch Behandlung mit EDTA entfernt und bei 10&sup7; Zellen/ml in RPMI- Medium (Gibco BRL), enthaltend 10% FCS (Gibco BRL), enthaltend 10 ug/ml Influenza-Nukloproteinpeptid 50-63 (NP 50-63), suspendiert. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen zweimal mit frischem Medium gewaschen.

d) Demonstration, dass die Expression von NDV-HN-cDNA eine Antigen(Peptid)-spezifische Stimulation von CTL verstärkt

C3H-Mäuse wurden mit 100 ug Peptid NP 50-63 in 50 ul Freunds inkomplettem Adjuvans (FIA) fin die Schwanzbasis immunisiert. Nach 10 Tagen wurden die Milzzellen erneut in vitro mit Ltk&supmin;-Zellen stimuliert, die 1 Stunde lang bei 37ºC in Medium vorinkubiert worden waren, das 10 ug/ml Peptid NP 50-63 enthielt und mit NDV-HN-cDNA transfiziert oder wie vorher beschrieben mit ganzem NDV infiziert wurde. Die erneut stimulierten Milzzellen enthalten T-Zellen, die zytotoxische T-Zellen, die spezifisch für das Peptid NP 50-63 gemacht worden sind, aufweisen. Diese Zellen werden als "Effektorzellen" bezeichnet. Die Peptid-spezifische Zytotoxizität der Effektorzelleit wurde in einer standardmäßigen 4-h-&sup5;¹Cr-Freisetzungsuntersuchung gegen Ltk&supmin;- "Targetzellen" gemessen, die mit &sup5;¹Cr markiert und dann mit oder ohne das Peptid NP 50-63 vorinkubiert worden waren, wie oben in Abschnitt (c) für die APCs beschrieben. Mehrere unterschiedliche Verhältnisse von Zellzahlen von Effektor zu Targetzellen wurden verwendet, nämlich 50:1, 25:1, 12:1 und 6:1.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 4 der Zeichnungen gezeigt, in der die Zelllyse für mehrere unterschiedliche Versuche gezeigt wird. Alle drei HN-exprimierenden Ltk&supmin;-HN- Klone induzierten eine stärkere Aktivierung der Peptidspezifischen CTL-Aktivität als die Ltk&supmin;- und Ltk&supmin;-neo- Kontrollen. Für Ltk&supmin;-HN.A2 war die Verstärkung nicht zu unterscheiden von der der ganzen NDV-infizierten Ltk&supmin;-Zellen, und die Antwort war streng abhängig vom Peptid. Ein Vergleich der verschiedenen Ltk&supmin;-HN-Klone zeigte einen Zusammenhang zwischen der Ebene der HN-Expression und der Verstärkung der spezifischen CTL-Aktivität (Fig. 3 und 4). Ein quantitativer Vergleich zwischen der Fluoreszenzintensität der HN-Transfektanten und der von Zellen, die mit steigenden Mengen an NDV infiziert waren, zeigte, dass die 2 schwach färbenden Klone Ltk&supmin;-HN.A3 und Ltk&supmin;-HN.A4 mit einer Infektion mit 90 bzw. 100 Hämagglutinineinheiten (HU)/10&sup7; Zellen von NDV vergleichbar waren, während die des Klons Ltk&supmin;-HN.A2 200 (HU)/10&sup7; Zellen entsprach. Der Mengenbereich von HN, exprimiert in den Ltk&supmin;-HN-Klonen, lag damit innerhalb der optimalen Konzentration, die mit ganzer NDV-Infektion in der tumorspezifischen Immunantwort, gefunden werden konnte, P. von Hoegen u. a., Invasion and Metastatis 9, 117, 133 (1989). Die Funktionsanalyse für die durch CTL-Stimulation hervorgerufene Kapazität zeigte, dass das exprimierte HN etwas weniger wirksam war als das intakte Virus, das für die Infektion verwendet wurde, da Ltk&supmin;-HN.A2-Zellen nur bezüglich der lytischen Wirkung mit den mit NDV infizierten Ltk&supmin;-Zellen vergleichbar waren [100 (HU/ml)], obwohl sie eine höhere HN- Expression und NA-Aktivität zeigten. Die beiden anderen Klone (Ltk&supmin;-HN.A3 und Ltk&supmin;-HN.A4), die nur zweifach erhöhte relative Fluoreszenz für die HN-Expression aufwiesen, zeigten eine signifikante Verstärkung der CTL-Aktivität, was anzeigt, dass relativ geringe Mengen an exprimiertem HN ausreichten, um die Antigen-spezifische Aktivierung von CTL zu erhöhen.

Beispiel 2

Allgemeine Verstärkung der CTL-Aktivität

Um zu beweisen, dass die verstärkende Wirkung von NDV auf die Aktivierung von CTL nicht ein spezifisches Phänomen war, das nur mit dem Influenza-NP-Peptid gefunden wurde, wurde die Wirkung der NDV-Infektion von APCs bei anderen Antigen-spezifischen CTL-Antworten in gemischten Leukozyten- Zellkulturen untersucht. Unterschiedliche getestete Antworten waren (A) anti-ESb-Tumorantigen, (B) Anti-minor-H-Antigen, (C) Anti-allo-MHC-Antigen und (D) anti-Influenza-NP50-63- Peptid.
Obwohl bei diesen Versuchen das ganze Virus verwendet wurde, gibt es dabei auch einen Versuch, bei dem die mit HN- cDNA transfizierten Ltk&supmin;-Zellen verwendet: wurden, und zwar mit einem Ergebnis, das ähnlich dem war, wenn ganzes Virus verwendet wird. Durch vernünftige Interferenz zeigt daher das Beispiel die Wahrscheinlichkeit, das HN-cDNA in bezug auf die anderen Antigen-spezifischen APCs so wirksam wie ganzes NDV ist.
[0034] Mäuse wurden in vivo geprimt, und ihre Milzzellen oder Tumorzellen wurden nach 9 Tagen entnommen. Die entnommenen Zellen wurden einer 5-tägigen in-vitro-Stimulation gemäß der unten gezeigten Tabelle unterworfen. Dia stimulierten Zellen wurden, außer in dem Experiment D2, wo die Ltk&supmin;-Zellen mit der HN-cDNA wie oben beschrieben transfiziert waren, so wie sie waren (Kontrollen) oder nach Infektion mit 100 HU/10&sup7; Zellen NDV verwendet. Die Zytotoxizität dieser Effektorzellen wurde in einem 4-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungsassay bestimmt, wobei die spezifisichen Targetzellen ESb (A,B,C), EL-4 (C) und Peptid-beladene Ltk&supmin;-Zellen (D) waren. ESb-Zellen sind eine spontane äußerst metastatische Variante der Methylcholantreninduzierten Lymphom-Zelllinie Eb (Professor V. Schirmacher, DKFZ, Heidelberg). EL-4-Zellen sind von der American Type Culture Collection (ATCC) als "TIB 39" erhältlich. Die Werte sind ausgedrückt als "Stimulationsindex" auf der Grundlage von lytischen Einheiten (LU)/10&sup6; Zellen. Ein LU ist die Zahl der Effektorzellen, die 30% Lyse der Targetzellen (5 · 10³) bewirkt. LU mit Stimulatorzellen ohne NDV-Modifikation wurden auf einen Stimulationsindex von 1 gesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Tabelle:
A Antitumor (Targetzelle: ESb)
B Anti-minor-H-Antigen: tc: ESb)
C Anti-allo-MHC-Antigen (tc: EL4, ESb)
D Antipeptid (tc: Ltk&supmin; + Peptid)
* jeder Versuch A, B, C und D1 wurde mit und ohne Infektion der Stimulatorzellen durch ganzes NDV durchgeführt.
Bei der Immunantwort von DBA/2-Mäusen gegen den syngenen ESb-Tumor (A) gab es einen elffachen Anstieg bei der CTL-Antwort, wenn NDV-infizierte ESb-Zellen anstatt ESb als Stimulatorzellen in vitro verwendet wurden. Eine ähnliche Erhöhung konnte nach in-vivo-Immunisierung gefunden werden (Primen mit NDV-infiziertem ESb anstelle von ESb). Wenn durch Viren infizierte Tumorzellen sowohl für das Primen als auch die erneute Stimulierung verwendet wurden, ließ sich ein Synergismus zwischen den beiden verstärkenden Wirkungen feststellen, so dass ein mehr als 100facher Anstieg des Stimulationsindexes beobachtet wurde. Bei der minor-H-Antwort wurde kein Erhöhungseffekt nach dem Primen mit durch Viren infizierte Zellen beobachtet, was von der Tatsache herrühren könnte, dass die Immunantwort bereits optimal war. Optimale CTL-Antworten könnten in vitro auch nicht durch NDV-Infektion von Stimulatorzellen erhöht werden (Daten nicht gezeigt). Die Kulturbedingungen waren daher beschränkt auf stärkere Immunantworten gegen minor-H (Figur EB) und Alloantigene (Fig. 5C) unter Verwendung von nur 10% der standardmäßigen Stimulatorzellen. Bei solchen nicht so optimalen Bedingungen auch bei den minor-H- und Alloantigen-Antworten, wurde nach Virusinfektion der Stimulatorzellen ein 6-facher Anstieg bei den CTL-Antworten beobachtet.

Claims

1. Verwendung einer DNA kodierend für ein HN-Protein eines Paramyxovirus oder ein T-Zell-Stimulation-verbesserndes Peptid davon, jedenfalls frei von nativem Paramyxovirus und frei von einem assoziierten spezifischen Antikörper für das HN-Protein, zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der antigen-spezifischen Stimulation von zytotoxischen T-Zell (CTL)-Antworten in Menschen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Paramyxovirus Newcastle Disease Virus ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das HN-Protein mindestens 10% Aminosäurenidentität mit dem von Newcastle Disease Virus Stamm Beaudette C hat.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die DNA kodierend für das HN-Protein mindestens 70% Identität mit der von Newcastle Disease Virus Stamm Beaudette C hat.

5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Antigen ein Krebsantigen ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Krebsantigen ein Tumorantigen ist.

7. Vakzine geeignet zur Verwendung bei der Abwehr einer Erkrankung in einem menschlichen Patienten, in dem eine T- Zell vermittelte Immunantwort erzeugt werden kann, wobei die Vakzine für den Patienten verträgliche Antigenpräsentierende Zellen (APCs) enthält, ein Antigen hoher Spezifität für die Erkrankung präsentiert und eine HN- Protein bereitstellende Komponente enthält, welche eine DNA kodierend für ein HN-Protein eines Paramyxovirus oder ein T-Zell-Stimulation-verbesserndes Peptid davon, jedenfalls frei von nativem Paramyxovirus und frei von einem assoziierten spezifischen Antikörper für das HN-Protein, aufweist, wobei die in-vivo Stimulation zytotoxischer T- Zellen hoher Spezifität für die Zytolyse einer erkrankten Zelle durch die HN-Protein bereitstellende Komponente vergrößert ist.

8. Vakzine nach Anspruch 7, wobei die APCs durch inaktivierte erkrankte Zellen, die dem zu behandelnden Patienten vorher entnommen worden waren oder von einem Spenderpatienten mit passendem MHC-Typ bereitgestellt sind.

9. Vakzine nach Anspruch 7, wobei die APCs Makrophagen, HLA- Klasse I exprimierende Zellen oder HLA-Klasse II exprimierende Zellen sind.