DE69836643T2

DE69836643T2 - Zusammensetzungen für die zufuhr von genen an antigen-präsentierende zellen der haut

Info

Publication number: DE69836643T2
Application number: DE69836643T
Authority: DE
Inventors: Julianna Bethesda LISZIEWICZ; Franco Bethesda LORI
Original assignee: Genetic Immunity LLC
Current assignee: Genetic Immunity LLC
Priority date: 1997-09-15
Filing date: 1998-09-15
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2018-09-16
Also published as: EP1024836B1; DE69836643D1; BR9813202A; US7910562B2; ATE347911T1; NZ503334A; IL134842A0; CN1278739A; KR20010030598A; EA200000325A1; EP1024836A1; EP1024836A4; NO20001244L; OA11612A; BR9813202B1; US6420176B1; KR100615117B1; AP2000001762A0; NO327491B1; AU9398098A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen zur Zufuhr von fremdem genetischem Material in Zellen. Speziell betrifft die Erfindung eine Technik zur rezeptorvermittelten Zufuhr von Genen in Zellen. Ein Gen-Zufuhrkomplex, der mit einem spezifischen Typ einer Zielzelle verträglich ist, wird aus dem fremden genetischen Material, einem Vektor und gegebenenfalls einem Träger gebildet. Der Komplex wird sodann den Zellen unter Bedingungen ausgesetzt, die eine rezeptorvermittelte Endozytose ermöglichen, was zur funktionellen Aufnahme oder zur Transduktion des fremden genetischen Materials führt. Die Komplexe eignen sich nicht nur für die in vitro- sondern auch für die in vivo-Genzufuhr in ein Antigen präsentierende Zellen, speziell zur transkutanen Gen-Übertragung auf Haut-Langerhans-Zellen. Diese Technik eignet sich insbesondere zur prophylaktischen und therapeutischen genetischen Immunisierung, wenn es sich beim fremden genetischen Material um ein Immunogen, wie eine DNA, die für einen wesentlichen Teil der Antigene kodiert, und Teilchen, die mit einem infektiösen Virus assoziiert sind, handelt, wobei eine Zufuhr durch Injektion unerwünscht ist.
Hintergrund der Erfindung
Das Immunsystem von Tieren weist zwei unterschiedliche, jedoch verwandte Reaktionen auf, die zelluläre Immunreaktion und die humorale Immunreaktion. Die zelluläre Immunreaktion erzeugt T-Lymphozyten, die Zellen mit fremden Identifikationsmarkern an ihrer Oberfläche abtötet. Bei Zellen mit derartigen Identifikationsmarkern auf ihrer Oberfläche spricht man davon, dass sie ein Antigen "präsentieren"; demnach werden sie als ein Antigen präsentierende Zellen (APCs) bezeichnet. Ferner stimulieren T-Lymphozyten auch die humorale Reaktion durch Helfer-B-Zellen, die Vorläufer von Plasmazellen.
Die humorale Immunreaktion führt zur Bildung von Antikörpern durch Plasmazellen, wobei die Antikörper auf spezifische Moleküle in Lösung einwirken. Antikörper (oder Immunoglobuline) sind Proteine, die von einem Tier in Reaktion auf die Anwesenheit einer fremden Substanz synthetisiert werden. Sie werden durch Plasmazellen sezerniert, die sich von B-Lymphozyten (B-Zellen) ableiten. Diese löslichen Proteine stellen die Erkennungselemente der humoralen Immunreaktion dar. Jeder Antikörper besitzt eine spezifische Affinität für die fremde Substanz, die seine Synthese stimuliert hat. Dies bedeutet, dass der Antikörper ein Segment oder eine Stelle mit der Bezeichnung "Antigen- Bindungsstelle" aufweist, die sich an die fremde Substanz anheftet. Ein fremdes Makromolekül, das die Bildung von Antikörpern gegen sich selbst herbeiführen kann, wird als Antigen bezeichnet. Proteine und Polysaccharide sind üblicherweise wirksame Antigene. Die spezifische Affinität eines Antikörpers besteht nicht für das gesamte makromolekulare Antigen, sondern auch für eine bestimmte Stelle daran, die als die antigene Determinante oder Epitop bezeichnet wird. Antikörper erkennen fremde Moleküle in Lösung und auf Membranen unabhängig von der molekularen Umgebung. Die humorale Immunreaktion ist besonders wirksam bei der Bekämpfung von Bakterien und Viren in extrazellulären Medien (der Ausdruck "Humor" ist der lateinische Ausdruck für Flüssigkeit.) Eine Strategie, um Immunität gegen eine Krankheit zu verleihen, besteht darin, das Individuum einem oder mehreren Antigenen, die mit einem Virus oder Bakterium assoziiert sind, auszusetzen, statt das tatsächliche Virus oder Bakterium zu verwenden. Ein derartiger Impfstoff ist als ein Untereinheit-Impfstoff bekannt. Er erweist sich als besonders günstig in Bezug auf die Stimulation der Bildung von Antikörpern.
T-Zellen vermitteln die zelluläre Immunreaktion. Im Gegensatz zur humoralen Immunreaktion zerstört die zelluläre Immunreaktion virusinfizierte Zellen, Parasiten und Krebszellen. Die Oberfläche von T-Zellen enthält Transmembranproteine mit der Bezeichnung T-Zellrezeptoren, die fremde Moleküle auf der Oberfläche von anderen Zellen erkennen. Dies bedeutet, dass T-Zellen ein Antigen präsentierende Zellen (APCs) erkennen. T-Zellrezeptoren erkennen isolierte fremde Moleküle nicht. Die fremde Einheit muss sich auf der Oberfläche einer Zelle befinden und muss der T-Zelle von einem bestimmten Membranprotein präsentiert werden, einem Protein, das durch eine hochgradig variable chromosomale Region des Wirts kodiert wird, die als Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) bekannt ist. Der MHC kodiert für drei Klassen von Transmembranproteinen. MHC-Klasse I-Proteine, die in nahezu allen Typen von Zellen exprimiert werden, präsentieren den zytotoxischen T-Zellen fremde Epitope. MHC-Klasse II-Proteine, die in Immunsystemzellen und Phagozyten exprimiert werden, präsentieren den Helfer T-Zellen fremde Epitope. MHC-Klasse III-Proteine sind Komponenten des Prozesses, der als Komplementkaskade bekannt ist.
Es gibt eine Vielzahl von T-Zellen, einschließlich zytotoxische T-Lymphozyten (CTL oder Killer-T-Zellen), die Zellen zerstören, die ein fremdes Epitop, das an ein MHC-Protein gebunden ist, aufweisen. Wenn das fremde Epitop-plus-MHC-Protein an den T-Zellrezeptor bindet, sezerniert die T-Zelle Granalien mit einem Gehalt an Perforin, das unter Bildung von Transmembranporen polymerisiert, wodurch die Zelle aufgebrochen wird oder die Zelllysis induziert wird. Weitere Klassen von T-Zellen mit der Bezeichnung Helfer-T-Zellen sezernieren Peptide und Proteine mit der Bezeichnung Lymphokine. Diese hormonartigen Moleküle dirigieren die Bewegungen und Aktivitäten von anderen Zellen. Zu einigen Beispielen hierfür gehören Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4), Interferone, Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-Stimulationsfaktor (GM-CSF) und Tumor-Nekrosefaktor (TNF). Die T-Zellen sind an der Komplementkaskade beteiligt, einer präzise regulierten, komplizierten Reihe von Ereignissen, die zur Zerstörung von Mikroorganismen und infizierten Zellen führt. Mehr als 15 lösliche Proteine arbeiten unter Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen mit zahlreichen Einheiten zusammen, die der Bildung von großen Löchern in der Plasmamembran der Zellen vorausgehen.
Die Expression von fremden Genen in Antigen-präsentierenden Zellen (APC) kann zur Erzeugung einer wirksamen CTL-Reaktion in Tieren herangezogen werden. Daher besitzt ein Gentransfer und eine genetische Modifikation von APC das Potential zur Schaffung von wirksamen Impfstoffen und therapeutischen Wegen gegen verschiedene Krankheiten, einschließlich virale Infektionen und Krebs. Lebende, rekombinante Virus-Vektoren, die verschiedene fremde Antigene, wie Pockenviren, Adenoviren und Retroviren, exprimieren, können zur Herbeiführung sowohl einer humoralen als auch einer zellulären Immunreaktion herangezogen werden, indem man eine virale Infektion nachahmt. Ferner wurden lebende, attenuierte (abgeschwächte) Viren als Impfstoffe vorgeschlagen. Eine DNA-Impfstrategie wird ebenfalls untersucht. Verschiedene virale Gene wurden zu Plasmid-DNA kloniert und in Muskeln, Haut oder subkutane Bereiche injiziert. Diese Konstrukte sind dazu befähigt, Proteine zu exprimieren und sowohl eine zelluläre als auch eine humorale Immunreaktion herbeizuführen.
Es wurde die Auffassung vertreten, dass virale Krankheiten für die Technik der genetischen Immunisierung verantwortlich sein könnten. Von bestimmten Zellen, z. B. von dendritischen Zellen, ist bekannt, dass sie Antigene aufnehmen und aus Körpergeweben in die lymphoiden Gewebe wandern. Dabei präsentieren diese Zellen die Antigene in den lymphoiden Organen: d. h. sie weisen ein fremdes Epitop auf, das an ein MHC-Protein gebunden ist. Von derartigen, ein Antigen präsentierenden Zellen (APCs) ist bekannt, dass sie Bestandteil des Immunreaktionsmechanismus sind. Wenn Zellen, wie dendritische Zellen (DC), so modifiziert werden, dass sie DNA enthalten, die für ein Virus kodiert, das infektiös ist, jedoch nicht die Fähigkeit zur wirksamen Reproduktion besitzt, könnten diese Zellen nicht nur Antigene im klassischen Sinn präsentieren, sondern könnten auch so manipuliert werden, dass sie virale Teilchen und eine große Vielzahl von viralen Proteinen erzeugen oder exprimieren. In WO-97/31119 ("Methods and Compositions for Protective and Therapeutic Genetic Immunization") wurde eine neue Technik beschrieben. Diese Druckschrift führt aus, dass Gene eines replikationsinkompetenten Virus in ein Antigen präsentierende Zellen eingebaut werden können, die dann in die lymphoiden Organe wandern und das vollständige Komplement von viralen Antigenen und viralen Teilchen erzeugen, wodurch sie sowohl humorale als auch zelluläre Immunreaktionen auslösen. Aus der Druckschrift geht hervor, dass DCs in den lymphoiden Organen anschließend sämtliche viralen Antigene exprimieren und "authentisch aussehende" virale Teilchen erzeugen können. Diese viralen Teilchen sollten eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von zusätzlichen Immunreaktionen spielen.
Diese Druckschrift beschreibt in Beispiel 13 eine "in vivo-Transduktion" von Zellen, einschließlich APCs. In diesem Beispiel werden verschiedene bekannte Verfahren, einschließlich eine virale und nicht-virale Genzufuhr aufgeführt. In Beispiel 14 wird die "in vivo-Transduktion" von Zellen, einschließlich APC, beschrieben. Hierfür werden folgende Maßnahmen herangezogen: (1) direkte DNA-Injektion; (2) Injektion von Liposomen oder Virosomen mit einem Gehalt an der DNA; (3) direkte Injektion von Klasse 4-Pockenviren in die Milz; und (4) rektale und vaginale Suppositorien, die Gen-Zufuhrträger aufweisen. Jedoch beschreibt diese Druckschrift nicht die Einzelheiten der Verfahren einer in vitro- und in vivo-Genzufuhr. Diese Zufuhr ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Es gibt bestimmte Hinweise, die darauf schließen lassen, dass eine genetische Modifikation von APCs zur Impfung sowohl neonataler als auch erwachsener Tiere und Menschen wirksam sein könnte. Ridge et al. (Science, Bd. 271 (1996), S. 1723-1726) verabreichten DCs, die ein fremdes Antigen exprimierten und von einem anderen Tier isoliert worden waren, durch intravenöse Injektion an Mäuse. Sowohl neonatale als auch erwachsene Mäuse, denen diese DCs injiziert worden waren, waren dazu befähigt, eine einwandfreie CTL-Abtötung von Zielzellen vorzunehmen. Diese Experimente belegten ferner, dass DCs, die ein fremdes Antigen exprimieren, eine schützende, zellvermittelte Immunreaktion induzieren können, die im Fall von viralen Infektionen zur Beseitigung infizierter Zellen befähigt ist. Ferner zeigten diese Experimente, dass eine DC-vermittelte Immunisierung von Neugeborenen möglich sein kann. Bei diesen Experimenten wurden weder genetisch modifizierten Zellen eingesetzt, noch bediente man sich mehrerer fremder Antigene oder eines Virus, wie es erfindungsgemäß beschrieben wird.
Sarzotti et al. (Science, Bd. 271 (1996), S. 1726-1728) zeigten, dass eine Inokulation mit Viren in geringer Dosis zu einer schützenden Immunreaktion (Th1-Typ) führt, die eine CTL-Reaktion erzeugt, dass aber eine Inokulation in hoher Dosis zu einer nicht-schützenden (Th2-Typ) Immunreaktion führt, die vorwiegend Antikörper erzeugt. Diese CTL-Reaktionen hielten sehr lange an und konnten auch in Neugeborenen erzeugt werden. Hohe Dosen des Virus führen möglicherweise zu einer Überwältigung und Entwaffnung von T-Zellen, bevor DCs die T-Zellen aktivieren können. Auch hier ist der Verabreichungsweg von Bedeutung, und zwar nicht durch eine Injektion, sondern durch Präsentation durch DCs. Diese Befunde stimmen mit anderen Ergebnissen überein, die zeigen, dass eine Belastung mit einer niedrigen Dosis von Viren vorwiegend eine zelluläre (Th1-Typ) Immunreaktion hervorruft. Bei Makaken löste eine geringe Dosis an SIV die Reaktion vom Th1-Typ ohne Antikörperbildung aus und schützte die Tiere gegen eine Belastung in hoher Dosis (Clerici et al., AIDS, Bd. 8 (1994), S. 1391-1395). Bei Menschen wurden ähnliche Ergebnisse von Rowland-Jones et al. (Nature Med., Bd. 1 (1995), S. 59-64) dargelegt.
Nature Medicine, Bd. 2 (1996), S. 1122-1128, beschreibt die bloße DNA-Immunisierung unter Durchführung einer biolistischen Abgabe von DNA-beschichteten Goldteilchen in die Haut.
Das Verfahren zur Modifikation von Zellen mit dem Ziel, dass sie fremdes genetisches Material enthalten, wird als Gen-Transfer, -Transfektion oder -Transduktion bezeichnet. Keine der hier zitierten Literaturstellen gibt Hinweise auf einen wirksamen Transfer von Genen auf ein Antigen präsentierende Zellen, und zwar weder in vitro noch in vivo. Als Hintergrund für den Gen-Transfer auf ein Antigen präsentierende Zellen, wie DC, wurden verschiedene "wenig effiziente" in vitro-Verfahren beschrieben, einschließlich der durch Liposomen vermittelte Gen-Transfer; die Elektroporation; und die durch Retrovirus-Vektoren und Adenovirus-Vektoren vermittelten Gen-Transfers (J. F. Arthur et al., Cancer Gene Therapy, Bd. 4 (1) (1997), S. 17-21; E. S. Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 94 (5) (1997), S. 1943-1948). Alle diese in vitro-Verfahren beinhalten die Isolierung von großen Populationen von Zellen, die im Laboratorium mit einem Gen-Zufuhrvehikel behandelt werden. Sämtliche Anwendungen auf Menschen oder Tiere beinhalten die Wiedereinführung dieser genetisch modifizierten Zellen. Daher sind in vitro-Gen-Zufuhrverfahren nicht für die Impfung oder Behandlung einer großen Anzahl von Individuen geeignet. Bekannte in vivo-Verfahren beinhalten eine intradermale oder intramuskuläre Injektion von rekombinanten Virusvektoren und eine intradermale, subkutane und intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA. Keines dieser Verfahren hat sich als wirksam zur Zufuhr von Genen in ein Antigen präsentierende Zellen, wie dendritische Zellen, erwiesen, und noch viel weniger für die Zufuhr von Genen durch die Haut in die Langerhans-Zellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die durch Antikörper vermittelte Gen-Zufuhr in Zellen, die Fc-Rezeptoren exprimieren.
2 zeigt die Gen-Zufuhr in dendritische Zellen und Langerhans-Zellen über den Mannose-Rezeptor unter Verwendung des PEI-man-DNA-Komplexes.
3. zeigt den Weg der transkutanen Gen-Zufuhr.
4 vergleicht die Wirksamkeit einer in vitro-Transfektion von humanem DCs-unter Verwendung von zwei verschiedenen erfindungsgemäßen Komplexen.
5 zeigt einen CTL-Test, der erläutert, dass transduzierte DCs zur Erzeugung von zytotoxischen T-Zellen aus naiven T-Zellen befähigt sind: es wird die prozentuale Zytotoxizität von DCs, die mit Integrase-HIV-Plasmid transfiziert sind, mit der Zytotoxizität von Kontroll-DCs verglichen.
6 erläutert die CTL-Reaktion nach genetischer ex vivo-Immunisierung; es wird ein Vergleich mit der CTL-Reaktion, die in vivo unter Verwendung von transfizierten DCs erhalten wird, vorgenommen.
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
In 1 wird das Verfahren zur antikörpervermittelten Gen-Zufuhr in Zellen, die Fc-Rezeptoren exprimieren, als Konzept erläutert. Zielzellen (1), die einen oder mehrere Rezeptoren (2 a, b, c, d) aufweisen, werden einem Gen-Zufuhrkomplex (3) ausgesetzt, der einen Träger (4) und einen Vektor (5), der das fremde genetische Material einschließt, umfasst. Der Gen-Zufuhrkomplex (3) bindet an die Rezeptoren (2 a, b, c, d) der Zelle (1) und der Vektor (4) wird in die Zelle über eine Endozytose oder Phagozytose in ein Endosom (6) eingebaut. Der Vektor (4) weist die Eigenschaft zum Aufbrechen des Endosoms (6) auf, was es ermöglicht, dass das fremde genetische Material in die Zelle freigesetzt wird.
In 2 wird das Verfahren zur zuckervermittelten Gen-Zufuhr in Zellen, die Mannose-Rezeptoren exprimieren, als Konzept erläutert. Zielzellen (10), in diesem Fall unreife Langerhans-Zellen, mit einem oder mehreren Mannose-Rezeptoren (12) werden einem Gen-Zufuhrkomplex (13) ausgesetzt, der einen Polyethylenimin-Zucker (Mannose), der mit dem fremden genetischen Material komplexiert ist, umfasst. Der Gen-Zufuhrkomplex (13) bindet an die Rezeptoren (12) der Zelle (10) und die PEI-man-DNA wird in die Zelle über Endozytose in ein Endosom (14) eingebaut. Der Vektor (PEI-man) weist die Eigenschaft zum Aufbrechen (15) des Endosoms auf, was es ermöglicht, dass das fremde genetische Material in die Zelle freigesetzt wird. Die Zelle reift (16) und exprimiert Proteine (17), die durch das fremde genetische Material kodiert werden.
In 3 wird das Experiment zum Nachweis der durch Zucker vermittelten in vivo-Genzufuhr in Zellen, die Mannose-Rezeptoren exprimieren, dargestellt. Bei den Zielzellen handelt es sich um Langerhans-Zellen der Haut, von denen bekannt ist, dass sie Mannose-Rezeptoren exprimieren. Mäuse (21) wurden betäubt und ein Bereich am Rücken jeder Maus wurde rasiert (22). Die rasierte Oberfläche wurde mit Ethanol gereinigt. PEI-man-DNA-Gen-Zufurkomplex in 8% Glucose (23) wude auf den rasierten Bereich (22) jeder Maus aufgebracht. Langerhans-Zellen (24), die im rasierten Bereich der Haut (22) auftreten, nehmen den in 2 beschriebenen Komplex auf, werden aktiviert und wandern (24) zum ableitenden Lymphknoten (25). Während der Wanderung reifen die Langerhans-Zellen (24) zu dendritschen Zellen (26) und exprimieren das durch die DNA kodierte Protein (27).
In 4 werden die experimentellen Ergebnisse, die die in vitro-Gen-Zufuhr mit PEI-DNA- im Vergleich zu PEI-man-DNA-Komplexen zeigen, dargestellt. Humane DCs wurden gemäß den Angaben in der Beschreibung gezüchtet und mit Komplexen transfiziert. Ein Markergen, das für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, wurde als DNA verwendet. Bei diesen Experimenten wurden die Komplexe in einer Lösung von NaCl gelöst. Das Experiment zeigte, dass PEI-man in wirksamerer Weise gezüchtete DCs transfiziert als PEI.
Die 5-6 zeigen experimentelle Ergebnisse und werden im nachstehenden Beispielteil ausführlich erläutert.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel zur Verbesserung des Wirkungsgrads des Gen-Transfers auf Zellen bereitzustellen, und zwar in vitro und in vivo. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Mittel zur genetischen Immunisierung bereitzustellen, indem man den Wirkungsgrad des Gen-Transfers auf ein Antigen präsentierende Zellen erhöht. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Mitteln zur Stimulation sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunreaktion auf das Proteinprodukt des übertragenen genetischen Materials. Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung einer wirksamen Immunreaktion auf virale Krankheiten. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Impfstoffes für virale Krankheiten, der wirksam ist und eine verbesserte Sicherheit aufweist.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass Mittel zu einem in vivo-Gen-Transfer bereitgestellt werden, die für die Immunotherapie und Impfung bei einer Vielzahl von Krankheiten verwendet werden können.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass beliebige Typen von DNAs oder RNAs, einschließlich Plasmid-DNAs, die für Immunogene, wie Onkogene, kodieren, (allergieverursachende) Immunogene, virale Proteine oder unterschiedliche Typen von Viren mit Replikationsdefekt, defekten viralen Teilchen sowie Plasmid-DNA, verwendet werden können.
Diese und weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den vorgelegten Beispielen.
Die Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden erreicht, indem man einen Gen-Zufuhrkomplex bildet, der einen Vektor (der das gewünschte fremde genetische Material enthält) und einen Träger (der sowohl an die Zellen als auch an das Gen-Zufuhrteilchen binden kann) umfasst, wonach man die Zielzellen dem Komplex unter Bedingungen, die eine Endozytose ermöglichen, aussetzt. Der Vektor hat die charakteristische Eigenschaft, dass er es dem genetischen Material ermöglicht, einem endosomalen Abbau zu entkommen, so dass er das gewünschte fremde genetische Material entweder an das Zytoplasma oder an den Nucleus abgibt. Fremde Proteine können durch die genetisch modifizierten Zellen exprimiert und dem Immunsystem präsentiert werden. Wenn das fremde genetische Material für ein replikationsdefektives Virus gemäß den Angaben in WO-97/31119 ("Methods and Compositions for Protective and Therapeutic Genetic Immunization") kodiert, können die veränderten Zielzellen sodann virale Antigene präsentieren und ferner virale Teilchen und Proteine in die lymphoiden Organe exprimieren, wodurch eine wirksame zelluläre Immunreaktion sowie eine humorale Immunreaktion herbeigeführt werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Mittel und Zusammensetzungen zur Zufuhr von fremdem genetischen Material in Zellen. Sie eignet sich insbesondere zur Verstärkung des Wirkungsgrads der genetischen Immunisierung durch Erhöhung des Wirkungsgrads des Gen-Transfers in bestimmte Zellen, die am Immunsystem beteiligt sind, wie ein Antigen präsentierende Zellen (APCs).
Die vorliegende Erfindung nutzt einige der natürlichen Wege, die bei Tieren zur Verfügung stehen, aus.
Es ist beispielsweise bekannt, dass spezifische Proteine durch ein Verfahren, das als rezeptorvermittelte Endozytose bezeichnet wird, in Zellen importiert werden. Bei diesem Verfahren binden spezifische Proteine oder Liganden an spezifische Rezeptoren in der Plasmamembran einer Zelle. Die Membran bildet eine Vesikel oder Tasche rund um das Protein und schließt schließlich den Liganden ein. Dies bedeutet, dass er das Protein in die Zelle importiert. Anschließend gibt das Endosom typischerweise diese Komplexe an ein Lysosom ab, wo sie in ihre Bestandteile, nämlich Peptide, verdaut werden. In den Zellen, in denen die MHC-Expression erfolgt, reichern sich Peptid-MHC-Komplexe im Lysosom an und erreichen sodann die Oberfläche der Zelle in einem Prozess, der als Antigen-Präsentation bezeichnet wird. Die rezeptorvermittelte Endozytose stellt das Mittel zur Zufuhr von großen Molekülen, wie essentiellen Metaboliten, Hormonen und Wachstumsfaktoren, in Zellen dar. Es handelt sich um einen Weg, der von zahlreichen Viren und Toxinen eingeschlagen wird, um sich Zutritt in Zellen zu verschaffen. Er spielt auch eine Rolle bei der Immunreaktion. Beispielsweise besitzen phagozytische Zellen Rezeptoren, die es ihnen ermöglichen, Antigen-Antikörper-Komplexe aufzunehmen.
Teilchen, die mit Antikörpern, wie IgG oder Komplementen, wie C3b, oder mit beiden komplexiert sind, können in wirksamer Weise in Zellen über eine rezeptorvermittelte Endozytose und Phagozytose eintreten. Antikörper oder Immunoglobuline haben verschiedene Bereiche, die es ihnen ermöglichen, verschiedene Funktionen auszuüben. Beispielsweise handelt es sich bei Immunoglobulin G (IgG) um ein Y-förmiges Molekül mit zwei Fab-Segmenten, die Antigen-Bindungsstellen aufweisen, und einem F_C-Segment, das Effektorfunktionen vermittelt. Multivalente Antigene können an Antikörper binden und Immunkomplexe bilden. Die Größe dieser Immunkomplexe ist eine Funktion der relativen Konzentration von Antigen und Antikörper.
Eine Endozytose kann durch einen Prozess, der als Opsonisierung bekannt ist, verstärkt werden. Bei der Opsonisierung handelt es sich um ein Verfahren, bei dem Antikörper Antigene beschichten, wodurch ein Mittel bereitgestellt wird, mit dem andere Komponenten des Immunsystems die Antigene erkennen und darauf reagieren. Immunoglobuline mit den entsprechenden F_ab-Stellen können zur Beschichtung der Antigenteilchen verwendet werden und anschließend können Zellen, die die entsprechenden F_C-Rezeptoren exprimieren, den F_C-Teil der opsonisierten Antigene erkennen und sie leicht der Endozytose unterziehen. Komplemente, wie C3b, C4b und C3bi, besitzen ebenfalls Opsonisierungsaktivität. Größere Immunkomplexe unterliegen im Vergleich zu kleinen Komplexen einer wirksameren Phagozytose durch Zellen, wie B-Zellen, mononukleare Phagozyten, Granulozyten, neutrophile und dendritische Zellen, die Rezeptoren für die F_C-Teile von Immunoglobulinmolekülen exprimieren.
IgG-Antikörper können in Tieren erzeugt werden, indem man das Antigen mit oder ohne Adjuvantien injiziert. Ferner können Antikörper unter Anwendung molekulargenetischer Techniken kloniert und humanisiert werden. Weitere Rezeptoren, die sich üblicherweise auf Membranen von Immunsystemzellen befinden, umfassen beispielsweise Transferrin-, Mannose- und Asialoglycoprotein-Rezeptoren, die leicht für die Transduktion von Immunsystemzellen verwendet werden können. Der F_C-Rezeptorteil des Antikörpers kann auch durch andere rezeptorbindende Domänen unter Anwendung molekulargenetischer Techniken ersetzt werden. Für die erfindungsgemäß gestellte Aufgabe sind die F_C-Rezeptoren und die entsprechenden IgG-Moleküle zweckmäßig, da sie die weitere Funktion des Transports von Genen zu dendritischen Zellen erfüllen.
Nachdem ein Molekül oder ein Teilchen über Endozytose oder Phagozytose in eine Zelle aufgenommen worden ist, ist es in einem Protein-Rezeptor-Komplex, der als ein Endosom bezeichnet wird, enthalten. Bei Endosomen handelt es sich um intrazelluläre saure Kompartimente, die eine Sortierfunktion ausüben. Phagosomen, die sich durch Phagozytose ergeben, sind große Endosomen (10×-20×). Endosomen fusionieren sodann mit Lysosomen, wo das Material zu kleineren Produkten, wie Peptiden, Nucleotiden und Zuckern, verdaut wird. Erfindungsgemäß besteht die Rolle des Vektors in der Bereitstellung des fremden Gens für die Zelle und in einer Vermeidung eines Abbaus des Gens. Dies bedeutet, dass der Vektor dazu befähigt sein muss, das Endosom aufzubrechen und das Gen in die intrazelluläre Flüssigkeit, das Zytosol oder in den Nucleus freizusetzen. Eine Anzahl von Teilchen sind bekannt, die die Fähigkeit zum Aufbrechen des Endosoms nach der rezeptorvermittelten Endozytose aufweisen, einschließlich virale Gen-Zufuhrteilchen, wie Adenovirus-Vektoren, Retrovirus-Vektoren, Pockenvirus-Vektoren und SV-40-Virus. Nicht-virale Gen-Zufuhrteilchen umfassen Konjugate von DNA mit Polylysin, Polyethylenimin und deren Derivaten, Liposomen, Virosomen und Chemikalien, die den pH-Wert im Endosom erhöhen, wie Chlorochin.
Zielzellen
Die Erfindung kann mit beliebigen Zellen, die zur rezeptorvermittelten Endozytose oder Phagozytose befähigt sind, angewendet werden. Die Zielzellen müssen eine Rezeptorstelle exprimieren, die bei Bindung mit einem komplementären Molekül das gewünschte Molekül in das Endosom oder Phagosom bringen kann. Für den erfindungsgemäßen Zweck handelt es sich bei derartigen Zellen vorzugsweise um Zellen, die an der Immunreaktion teilnehmen können. Sie umfassen Zellen, die sich an der rezeptorvermittelten Endozytose und Phagozytose von Antigenen beteiligen können. Zu derartigen Zellen gehören beispielsweise B-Zellen, mononukleare Phagozyten, Granulozyten und dendritische Zellen. Diese Zellen exprimieren Rezeptoren für den F_C-Teil von Immunoglobulinen und/oder Komplement-Rezeptoren. Dendritische Zellen und Makrophagen werden besonderes bevorzugt, da sie in wirksamer Weise fremde Antigene präsentieren können, wodurch sie eine zelluläre Immunreaktion oder eine CTL-Reaktion hervorrufen. Auf die Zellen kann man auch über andere Rezeptoren, wie Transferrin- und Mannose-Rezeptoren, abzielen.
Dendritische Zellen befinden sich in den lymphoiden Geweben, wie in Milz, Mandeln und Lymphknoten; sie können aber auch im Blut, der Epidermis, den Schleimhäuten und anderen peripheren Geweben auftreten. Diese Zellen nehmen Antigene auf und wandern mit den Antigenen in die lymphoiden Gewebe. In der Haut treten dendritische Zellen mit der Bezeichnung Langerhans-Zellen in der Epidermis auf. Wenn sie ein Antigen der Endozytose unterziehen, wandern sie in die regionalen Lymphknoten. Im Lymphknoten werden sie als ineinandergreifende Zellen bezeichnet und sie präsentieren naiven T-Zellen das Antigen, wobei sie die zelluläre Immunreaktion hervorrufen. Zur Steigerung des Wirkungsgrads des Gentransfers sollte die Anzahl an verfügbaren dendritischen Zellen auf ein Maximum gebracht werden. Die Wahl der Position kann einen Faktor darstellen. Hohe Konzentrationen an dendritischen Zellen treten beispielsweise in der Haut und auf Schleimhäuten, wie im Mund, der Vagina und dem Rektum, auf. Unreife DCs in den Geweben können in wirksamer Weise eine Endozytose ausführen, weswegen sie ein günstiges Ziel des Gen-Zufuhrkomplexes sind, der Gene durch eine rezeptorvermittelte Endozytose zuführt. Um jedoch eine wirksame Expression von MHC-Molekülen und eine Antigen-Präsentation vorzunehmen, müssen die DCs ferner aktiviert werden. In vitro können unreife DCs aus dem peripheren Blut mit GM-CSF und IL-4 oder aus Knochenmarkvorläufern mit GM-CFS erzeugt werden. Die Aktivierung dieser unreifen DCs kann in vitro und in vivo durch bakterielle Produkte, wie Lipolysaccharid und TNF-alpha induziert werden (C. Watts, Nature, Bd. 338 (1997), S. 724-725).
Dendritische Zellen können in eine spezifische Position angezogen und durch ein Ereignis, an dem das Immunsystem beteiligt ist, z. B. durch eine Zell- oder Gewebeverletzung, aktiviert werden. Für die vorliegenden Zwecke können die Anziehung und Aktivierung von ein Antigen präsentierenden Zellen, einschließlich dendritischen Zellen, durch eine Immunreaktion vermittelt werden, die nicht im Zusammenhang mit einer Impfung oder viralen Infektion steht. Ein Beispiel ist der Hautausschlag als Folge einer Kontaktempfindlichkeit gegenüber Chemikalien, wie Arzneistoffen und Toxinen, Kosmetika und Umweltantigenen. Wenn ein chemisches Reizmittel auf die Haut aufgetupft wird, erscheint ein Ausschlag oder eine Läsion üblicherweise 24 bis 48 Stunden nach der Belastung. Die Läsion ist auf die Neoantigene zurückzuführen, die durch die Bindung der Chemikalien an den Oberflächenproteinen von Langerhans-Zellen entstehen. Neoantigene sind kovalent modifizierte "normale" Proteine (z. B. phosphorylierte Proteine), die von Antikörpern erkannt werden. An diesem Ort können dendritische Zellen in Mengen, die über den normalen Mengen liegen, auftreten, und es besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass sie aktiviert werden, d. h. sie sind für eine unmittelbare Endozytose eines Antigens empfänglicher. Die Wahl des Reizmittels hängt von dessen Wirkungsgrad zur Anziehung von DCs und von dessen Nebenwirkungen ab. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine durch einen Immunkomplex vermittelte Verletzung erzeugt werden. In diesem Fall können Immunkomplexe sowohl mit Antigen- als auch mit Antikörperkomponenten verwendet werden, um B-Zellen und die Komplement-Kaskade mit der sich daraus ergebenden Gewebeverletzung zu aktivieren.
Da auf die Zellen durch eine spezifische Klasse von Rezeptoren abgezielt wird, besteht ein besonderer Vorteil der Erfindung darin, dass der Gen-Zufuhrkomplex so ausgestaltet werden kann, dass er auf spezifische Zellen abzielt. Wenn der Gen-Zufuhrkomplex mit IgG oder einem Polyethylenimin, das mit einer geeigneten Stärke oder einem Zucker modifiziert ist, hergestellt wird, wird er vorwiegend durch ein Antigen präsentierende Zellen aufgenommen. Dies stellt einen großen Vorteil bei der Entwicklung von Impfstoffen auf Genbasis dar. Ein Abzielen auf andere Zellen, die beispielsweise Komplement-Rezeptoren oder Transferrin-Rezeptoren exprimieren, ist auf die vorstehend beschriebene Weise ebenfalls möglich.
Gen-Zufuhrkomplex
Der erfindungsgemäße Gen-Zufuhrkomplex kann dazu verwendet werden, in vitro oder in vivo Zellen, die einen bestimmten Rezeptor tragen, Gene zuzuführen. Der Gen-Zufuhrkomplex ist aus zwei Teilen aufgebaut: das genetische Material und ein Zufuhrpartikel, wobei er zusätzlich einen Träger umfassen kann (vergl. 1). Bei einer Ausführungsform leitet sich das genetische Material von einem abgeschwächten HIV-Virus ab und beim Zufuhrpartikel handelt es sich um einen nicht-viralen Vektor.
Genetisches Material
Das genetische Material, entweder DNA oder RNA, wird vom Zufuhr-Komplex transportiert. Ein oder mehr Gene können an einem Strang von Plasmid-DNA, an doppelsträngiger DNA oder an RNA kodiert werden. Alternativ kann das genetische Material in rekombinante Viren eingebaut werden, wenn diese als Gen-Zufuhrpartikel verwendet werden. Wenn die Aufgabe des Gentransfers dazu besteht, eine Immunreaktion zu induzieren, muss das genetische Material ein oder mehr immunogene Proteine exprimieren. Transduzierte Zellen exprimieren anschließend in ausreichendem Maße die immunogenen Proteine (verschiedene virale Antigene und erzeugen ausreichend authentische virale Teilchen), um eine ausreichende Immunreaktion hervorzurufen (z. B. zum Schutz des Individuums vor einer Infektion durch das Wildtyp-Virus).
Die Wahl des Gen-Zufuhrpartikels hängt von der Krankheit und der Wahl des oder der zu übertragenden Gene ab. Wenn es angestrebt wird, einen Impfstoff für ein von reverser Transkriptase abhängiges Virus, wie HIV, zu bilden, kodiert die DNA vorzugsweise für mindestens einen erheblichen Teil eines replikations- oder integrationsdefekten Virus oder das replikations- oder integrationsdefekte Virus selbst. Zu Beispielen gehören (ohne Beschränkung hierauf) integrase-negative Mutanten eines dual-tropischen, primären Isolats, wie HIV-1/LW und Derivate davon mit einer Deletion in der Protease-Spaltungsstelle des gag-Gens (vergl. WO-97/31119). Wenn es angestrebt wird, einen Impfstoff für Krebs zu bilden, handelt es sich beim Immunogen vorzugsweise um DNA, die für ein oder mehr Onkogene kodiert. Bei weiteren DNA-Konstrukten kann es sich um DNA handeln, die für replikationsdefektes humanes Papilloma-Virus (Verursacher von Zervikalkrebs), replikationsdefekte Hepatitis A-, B- und C-Viren (Verursacher von Hepatitis und Leberkrebs) und um DNA, die für replikationsdefektive tierische Viren, wie Rinder-Leukämievirus oder Katzen-Immunschwächevirus, kodiert, handeln. Die Wahl eines Zufuhrpartikels, die das fremde genetische Material aufnimmt, kann folgendes umfassen: (a) replikationsdefektes HIV oder andere Retroviren; (b) rekombinantes Adenovirus; (c) Plasmid- oder lineare DNA oder RNA, komplexiert mit PEI oder einem Derivat von PEI; (d) ein Virosom mit einem Gehalt an einer beliebigen DNA oder RNA; (e) ein Liposom mit einem Gehalt an DNA oder RNA; (f) Plasmid-DNA-Polylysin-Virus-Komplex; (g) mit einer beliebigen DNA oder RNA komplexierter Zucker.
Zufuhrsystem
Um die Gene in wirksamer Weise der Zelle zuzuführen, muss das Gen-Zufuhrsystem das oder die zuzuführenden Gene enthalten und muss auch die Fähigkeit besitzen, das Endosom (oder Phagosom) aufzubrechen, statt dass es an ein Lysosom abgegeben wird oder an der äußeren Oberfläche einer Zelle isoliert wird und ein Ziel für eine Zerstörung darstellt. Ferner muss das Gen-Zufuhrsystem den Einbau des fremden genetischen Materials in das genetische Material der Zelle erleichtern.
Beim Gen-Zufuhrsystem handelt es sich um einen nicht-viralen Vektor. Nicht-virale-Gen-Zufuhrsysteme umfassen DNA-Konjugate mit Zucker, Polylysin, Polyethylenimin, Polyethyleniminderivaten und Liposomen, zusammen mit deren Derivaten.
Nicht-virale Gen-Zufuhrsysteme, wie solche, bei denen Zucker, Zuckerderivate, Liposomen, Liposomenderivate und Polyethylenimin oder Polyethyleniminderivate verwendet werden, werden bevorzugt. Darunter werden Zucker- und Polyethyleniminderivate, die zum Abzielen auf die Mannose-Rezeptoren von Immunsystemzellen geeignet sind, besonders bevorzugt.
Nicht-virale Gen-Zufuhrsysteme bieten gegenüber viralen Gen- Zufuhrsystemen mehrere Vorteile: 1) Erstens wird der nicht-virale Vektor nicht vom Immunsystem erkannt, so dass keine Immunreaktion gegen ihn erzeugt wird. Infolgedessen ist es wahrscheinlicher, dass Individuen, die mit dem fertigen Impfstoff behandelt werden, den Impfstoff vertragen und eine angemessene Immunreaktion im Fall einer wiederholten Immunisierung entwickeln; 2) nicht-virale Systeme sind potentiell sicherer als virale Systeme, da keine Möglichkeit besteht, dass das System in unerwarteter Weise mutiert; 3) nicht-virale Systeme können chemisch in großen Mengen synthetisiert werden und sind daher potentiell billiger.
Die bevorzugte Ausführungsform beruht auf einem kationischen Polymeren, nämlich Polyethylenimin (PEI). PEI bindet an DNA und bildet den Komplex. Der PEI-DNA-Komplex kann in das Endosom der ein Antigen präsentierenden Zellen der Haut, die Langerhans-Zellen, über eine durch den Asialoglycoprotein-Rezeptor vermittelte Endozytose gelangen. Anschließend nützt die PEI-Komponente dieses Komplexes die Endosomen-Pufferung und -Quellung als einen Mechanismus zum Entweichen in das Zytoplasma aus (H. Pollard, J. S. Remy, G. Loussouarn, S. Demolombe, J. P. Behr, J. Biol. Chem., Bd. 273 (13) (27. März 1998), S. 7507-7511). PEI kann auch so modifiziert werden, dass es auf andere Rezeptoren abzielt. Beispielsweise erzielt ein PEI-Derivat, z. B. ein zuckermodifiziertes PEI ähnliche Ergebnisse, mit der Ausnahme, dass es durch den Mannose-Rezeptor der Zellen aufgenommen wird. Derartige Derivate können im Laboratorium hergestellt werden. Beispielsweise kann ein Isothiocyanatophenyl-phenylmannose-Derivat an PEI mit 25 kDa gekuppelt werden, wodurch man einen Liganden erhält (oder ein Mannoserest von geringer Affinität für den Mannose-Rezeptor, 1 mM). Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung eines linearen, mit Mannopentaose derivatisierten PEI-22 kDa-Liganden. (Diese Materialien wurden freundlicherweise von Dr. Jean-Paul Behr, Laboratoire de Chimie Génétique, Faculté de Pharmacie, CNRS-UMR 7514, 74 route du Rhin, 67401 Illkirch, Frankreich, zur Verfügung gestellt.)
Beim Mannose-Rezeptor handelt es sich um ein 175-kDa-Transmembran-Glycoprotein, das spezifisch an der Oberfläche von Makrophagen und Langerhans-Zellen exprimiert wird. Die Ectodomäne des Mannose-Rezeptors weist acht Kohlenhydrat-Erkennungsdomänen auf. Der Mannose-Rezeptor erkennt die Muster von Zuckern, mit denen eine Reihe von Bakterien, Parasiten, Hefen, Pilzen und mannosylierten Liganden versehen sind (K. Takahashi, M. J. Donovan, R. A. Rogers, R. A. Ezekowitz, Cell Tissue Res., Bd. 292 (2) (Mai 1998), S. 311-323). Im Gegensatz zum F_C-Rezeptor rekonstituiert der Mannose-Rezeptor selbständig, wobei er seine Fracht freisetzt (Stahl et al., Cell, Bd. 19 (1980), S. 207). Er kann Liganden in aufeinanderfolgenden Runden auf ähnliche Weise wie der Transferrin-Rezeptor einschließen, woraus sich eine anhaltende Fähigkeit zum Einfangen von Antigenen ergibt (Goldstein et al., Annu. Rev. Cell Biol., Bd. 1 (1985), S. 1). Es wurde kürzlich festgestellt, dass die durch den Mannose-Rezeptor vermittelte Aufnahme von Antigenen zu einer etwa 100-fach wirksameren Antigen-Präsentation für T-Zellen führt, verglichen mit Antigenen, die über eine flüssige Phase eingeschlossen sind (Engering et al., Eur. J. Immunol., Bd. 27 (1997), S. 2417-2425). Diese verstärkte Antigen-Präsentation ist auf eine hochwirksame Aufnahme von Antigenen über den Mannose-Rezeptor zurückzuführen. Aus diesen Gründen nehmen wir an, dass die zielgerichtete Wirkung des Mannose-Rezeptors sowohl zu einer Spezifität für ein Antigen präsentierende Zellen als auch zu einem verbesserten Wirkungsgrad der funktionellen Aufnahme des Komplexes in das Endosom führen kann.
Träger
Der erfindungsgemäße Träger stellt den Teil des Gen-Zufuhrkomplexes dar, der ein Gen-Zufuhrsystem mit einem zellulären Rezeptor verbindet. Bei einer Ausführungsform handelt es sich beim Träger um ein Immunoglobulin G (IgG). IgG ist ein Y-förmiges Molekül mit zwei F_ab-Segmenten, die Antigen-Bindungsstellen aufweisen, und einem F_C-Segment, das an den zellulären Rezeptor mit der Bezeichnung F_C-Rezeptor bindet. Immunsystemzellen, wie B-Zellen, mononukleare Phagozyten, Granulozyten und dendritische Zellen, weisen F_C-Rezeptoren auf. Wenn IgG als Träger verwendet wird, zielt es auf spezifische Zellen mit F_C-Rezeptoren ab.
Zur Veränderung der Spezifität des Trägers, damit er auf andere Zellen abzielt, kann der F_C-Teil des Antikörpers durch andere Rezeptor-Bindungsdomänen, wie Komplement, Zucker oder Transferrin, ersetzt werden.
Sofern es sich beim Träger um einen Antikörper handelt, werden große Komplexe gebildet, wobei der Träger und das Gen-Zufuhrsystem vorzugsweise in gleichen Anteilen kombiniert werden. Wenn es erstrebenswert ist, das Partikel zu opsonisieren, übersteigt die Menge des Trägers in starkem Maße die Menge der Gen-Zufuhrpartikel. Sowohl die Endozytose als auch die Phagozytose werden im Fall von großen Komplexen und opsonisierten Partikeln verstärkt. Der Gen-Zufuhrkomplex wird vorzugsweise mit dem Träger opsonisiert. Wenn ein opsonisierter Gen-Zufuhrkomplex, der aus einem Antikörper unter Komplexbildung mit einem fremdes genetisches Material enthaltenden Zufuhrpartikel hergestellt worden ist, einem Individuum verabreicht wird, erreicht die zelluläre Immunreaktion ihr Maximum gegenüber der humoralen Immunreaktion. Die dendritischen Zellen werden durch die opsonisierten Komplexe aktiviert und es ergibt sich eine wirksamere Endozytose. Ferner blockieren die mehrfachen Antikörper die antigenen Determinanten (Epitope) des Zufuhrpartikels. Daher wäre keine direkte Antikörper-Reaktion auf das Zufuhrpartikel zu erwarten. Ferner binden einige mit Antigenen komplexierte Antikörper an die F_C-Rezeptorstelle von B-Zellen, wodurch sie deren Antikörper-Reaktion weiter hemmen. Jedoch würde die zelluläre Immunität stimuliert, da der Komplex durch verschiedene Arten von ein Antigen präsentierenden Zellen, einschließlich dendritischen Zellen und Makrophagen, der Endozytose oder Phagozytose unterworfen werden würde.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger kovalent mit dem nicht-viralen Gen-Zufuhrsystem verbunden. PEI kann chemisch mit Zuckern (z. B. Mannose, Glucose, Galactose und dergl.) modifiziert werden. Beim Träger handelt es sich in diesem Fall um den Zuckerliganden, der vom Mannose-Rezeptor erkannt wird. Um die Spezifität des Trägers zu verändern, kann der Zucker durch andere Rezeptor-Bindungsdomänen ersetzt werden.
In vivo-Genzufuhr
Der Gen-Zufuhrkomplex kann direkt in das Blut, die Haut oder eine andere Stelle injiziert werden, wo sich Zellen, die der Träger-Bindungsspezifität entsprechen, befinden. Der Komplex kann direkt auf die Haut- oder Schleimhautoberflächen aufgetragen werden. In diesem Fall ist es bevorzugt, dass die Langerhans-Zellen an der Oberfläche aktiviert werden. Eine Aktivierung kann durch eine Rezeptor-Stimulation (z. B. Mannose-Rezeptor), Toxin-Aktivierung (Cholera-Toxin), eine Gewebe- oder Zellschädigung, z. B. eine Entzündung, erreicht werden und kann die Folge einer anderen antigenen Stimulation sein.
Der Komplex kann oral unter Verwendung einer pädiatrischen Magensonde. vaginal oder rektal im Fall von erwachsenen oder neugeborenen Menschen oder Tieren infundiert werden. Neugeborene reagieren möglicherweise besser auf eine orale Verabreichung als Erwachsene. Alternativ kann der Gen-Zufuhrkomplex in einem Suppositorium abgepackt und in die Vagina oder das Rektum eingeführt werden.
Sofern ein virales Zufuhrpartikel verwendet wird, kann das Zufuhrpartikel in Gegenwart oder Abwesenheit von Adjuvantien direkt in den Muskel oder die Haut des Subjekts zu zwei verschiedenen Gelegenheiten injiziert werden, um einen hohen Titer der in vivo-Antikörper-Erzeugung zu erreichen. Die erste Injektion führt vorwiegend zu einer humoralen Immunreaktion. Dies bedeutet, es ergibt sich die Fähigkeit zur Erzeugung einer großen Anzahl von Antikörpern. Sofern eine Konzentration von IgG-Antikörpern, die zur Opsonisierung der Zufuhrpartikel ausreichen, verfügbar ist (sie kann gemessen oder aufgrund von Erfahrungswerten bestimmt werden), kann das Zufuhrteilchen ein zweites Mal verabreicht werden, wie es in den vorstehenden Abschnitten 1-3 beschrieben worden ist. Die Stelle der zweiten Verabreichung muss sorgfältig ausgewählt werden, um zu gewährleisten, dass Zellen vorhanden sind, die die opsonisierten Antigene einer Phagozytose oder Endozytose unterziehen können.
Behandlung von aktiven Infektionen
Der erfindungsgemäße Impfstoff kann auch bei einem Verfahren zur Behandlung einer aktiven HIV-Infektion eingesetzt werden. HIV repliziert reichlich und mutiert rasch, so dass zwar das Immunsystem dazu befähigt ist, eine wirksame Reaktion auf einen gegebenen Typ eines HIV-Partikels hervorzurufen, aber eine ausreichende Menge an neuen Varianten des Partikels erzeugt wird, die einen Vorsprung gegenüber dem Immunsystem haben. Wenn die Replikation des Wildtyp-Virus entweder vor einer wesentlichen Schädigung des Immunsystems oder lange genug, um eine Erholung des Immunsystems zu ermöglichen, unterdrückt werden kann, kann der erfindungsgemäße Impfstoff zur Stärkung der Fähigkeit des Immunsystems, neue Varianten des Virus zu erkennen, verwendet werden, wodurch ein Mittel zur Bekämpfung der viralen Replikation in Individuen, die bereits infiziert sind, bereitgestellt wird.
Arzneistoffkombinationen, die zumindest eine zeitweilige Hemmung der HIV-Replikation bewirken, sind bekannt. Die Erfinder haben gezeigt, dass Arzneistoffkombinationen unter Einschluss von Hydroxyharnstoff, einem oder mehreren Inhibitoren der reversen Transkriptase und gegebenenfalls einem oder mehreren Protease-Inhibitoren besonders wirksam sind und bei einigen Patienten die Möglichkeit eröffnen, die Arzneistoffbehandlung über längere Zeiträume hinweg einzustellen; vergl. US-5 977 086, "Method of Inhibiting HIV by Combined Use of Hydroxyurea, a Nucleoside Analog, and a Protease Inhibitor". Die vorliegende Erfindung umfasst die Behandlung eines Patienten, der eine aktive HIV-Infektion aufweist, mit einer geeigneten Arzneistoffkombination, bis die virale Belastung im Blut einen geeigneten niedrigen Spiegel von weniger als etwa 50 000 Kopien pro ml, vorzugsweise weniger als 10 000 Kopien pro ml und insbesondere weniger als 200-500 Kopien pro ml erreicht hat. Der Patient wird sodann unter Anwendung der vorliegenden Erfindung geimpft, während die Arzneistoffkombination die Replikation des Wildtyp-Virus unterdrückt.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
Beispiele
1. Expression von Plasmid-DNA, die für ein replikationsdefektes HIV in gezüchteten DCs kodiert.
Es gibt verschiedene Quellen für DCs. DCs können aus hämatopoetischen Knochenmark-CD34+-Progenitorzellen isoliert werden. Mononukleare Knochenmarkzellen werden durch Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation getrennt. Diese Zellen werden einer positiven Selektion mit humanen CD34-Antikörpern, die mit magnetischen Kügelchen (Dynal Detachabeads) konjugiert sind, unterworfen und CD34+-Zellen werden von den magnetischen Kügelchen unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers von hoher Affinität gegen monoklonale CD34-Antikörper verdrängt. Diese Zellen können zu DCs differenzieren, wenn sie mit einem Stammzellfaktor, GM-CSF und TNF-alpha, gezüchtet werden (B. Canque, M. Rosenzwajg et al., "The effect of in vitro human immunodeficiency virus infection on dendritic-cell differentiation and function", Blood, Bd. 88 (11) (1996), S. 4215-4228).
Von Monozyten abgeleitete DCs wurden aus peripheren mononuklearen Blutzellen in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 erzeugt (A. Bender, M. Sapp et al., "Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood", J. Immunol. Methods, Bd. 196 (2) (1996), S. 121-135). Am 4. Tag wurden die Zellen mit Lipofectamin transfiziert, das mit Plasmid-DNA komplexiert war, die für HIV-1/LWint- (ein integrations- und replikationsdefektes HIV, das in WO-97/31119 beschrieben ist) kodiert. Lipofectamin ist ein handelsübliches, kationisches Liposom, das als Transfektionsreagenz geeignet ist (erhältlich von der Fa. Gibco BRL Life Technology, PM. Gaithersburg, Md., USA). 48 Stunden später wurden die Zellen gewaschen und analysiert. Die Reinheit der DCs, bestimmt durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter Messung von Oberflächenmarkern (FACS) betrug 90,6 %. Durch FACS-Analyse wurde festgestellt, dass es sich bei den DC-Zelltypen um CD3-, CD19-, CD56-, CD14- und HLA DR+ handelte. Die Expression von HIV-1-Gag- und -Env- und -Tat-Proteinen wurde ebenfalls durch FACS in permeabilisierten Zellen gemessen. Der Grad der nicht-spezifischen Bindung von isotopem Kontroll-Ig war bei der Kontrolltransduktion und der spezifischen Plasmidtransduktion gleich. Wir stellten in drei unabhängigen Experimenten fest, dass 25-37 % von HIV-1/LWint-transduzierten DCs Env-, Gag- und Tat-Proteine exprimierten. Dies bedeutet, dass 25-37 % der Zellen in den transduzierten Proben HIV-Proteine exprimierten. Transduzierte und Kontrollzellproben wurden auch einer Doppelfärbung mit p24- und B7-2-Antikörpern unterzogen, um nachzuweisen, dass DCs und nicht Makrophagen das Antigen exprimierten. Diese Ergebnisse waren überraschend gut, da bei Anwendung der gleichen Verfahren mit einer anderen Plasmid-DNA (CMV-gesteuertes Hämagglutinin des Influenza-Virus-Gens) nur 5-8 % der transfizierten Zellen Proteine exprimierten. Diese Ergebnisse zeigten, dass defektes HIV in wirksamer Weise durch transduzierte DCs exprimiert werden kann.
2. Für replikationsdefekte DNAs kodierende Virenstellen wirksamere Antigene dar als DNAs, die für ein oder mehrere Proteine kodieren.
In einem unabhängigen Experiment verglichen wir die Expression von zwei verschiedenen HIV-Plasmiden in DC: HIV-1/LWint- und LTR-tat. Beide Konstrukte werden durch den gleichen Promotor gesteuert: HIV-1-LTR; und die Expression von beiden Konstrukten hängt von der Transaktivierung von Tat ab. Eine Transfektion wurde gemäß den Angaben in Beispiel 1 durchgeführt und 48 Stunden später wurde die Expression des Tat-Proteins durch FACS analysiert. Wir stellten fest, dass 32 % der mit dem HIV-1/LWint-Plasmid transfizierten DCs das Tat-Protein exprimierten. Im Gegensatz dazu exprimierten nur 10 % der LTR-tat-transfizierten DCs das gleiche Tat-Protein. Dieses Ergebnis war überraschend, da wir bei dieser vergleichenden Studien den gleichen Wirkungsgrad mit den beiden verschiedenen Konstrukten erwarteten. Replikationsdefekte Viren besitzen definitiv die Fähigkeit zur Bildung von viralen Partikeln, die aus der Zelle freigesetzt werden können. Da die Antigen-Präsentation von der Genexpression in DCs abhängt, belegt dieses Experiment in klarer Weise, dass DNAs, die für defekte Viren kodieren, wirksamere Antigene als DNAs, die für ein oder mehr Proteine kodieren, darstellen.
3. Transduzierte, gezüchtete DCs aktivieren in vitro naives CTL.
Nach der Transduktion wurden DCs mit autologen T-Zellen in einem Verhältnis von 1:10 gezüchtet. Nach 7 Tagen wurden diese T-Zellen als Effektor zur Lysis (Abtötung) einer Monozyten/Makrophagen-Zellpopulation vom gleichen Spender, die mit p55, einem zweckmäßigerweise als Markierung verwendeten HIV-Protein, behandelt worden war, verwendet. Diese CTL-Aktivität wurde unter Anwendung eines Cr-Freisetzungstests gemessen. Wie 5 belegt, bewirkten CTLs, die durch transduzierte DCs induziert worden waren, eine Lysis der Zielzellen in spezifischer und wirksamer Weise. Da die Erzeugung von CTLs in vitro schwieriger als in vivo ist, zeigen diese Experimente, dass Zellen, die einer genetischen Immunisierung unterzogen worden sind, naive CTLs aktivieren können, so dass sie in wirksamer Weise zur in vivo-Lysis von infizierten Zellen befähigt sind. Ferner belegt das Experiment, dass DNA, die für ein defektes Virus kodiert, nicht nur in wirksamer Weise HIV-Gene exprimiert, sondern auch eine wirksame Immunreaktion erzeugen kann.
4. Genetische ex vivo-Immunisierung mit transduzierten DCs.
Zum Nachweis der in vivo-Wirksamkeit einer genetischen Immunisierung bei Affen wurden dendritische Zellen aus 40 ml peripherem Blut von Schweinsaffen ("pigtail macaques") erzeugt. Die Zellen wurden unter Verwendung von Polyethylenimin gemäß den Angaben in Beispiel 5 mit LW/int-Plasmid transfiziert. Die transfizierten DCs wurden gewaschen und 36-48 Stunden nach der Transfektion juvenilen Schweinsaffen injiziert. Ein Teil der transfizierten DCs wurde subkutan und der andere Teil intravenös injiziert. Nach 4 Wochen und nur einem Immunisierungsversuch zeigte ein Affe bereits eine CTL-Reaktion (6), was darauf schließen lässt, dass das in vitro-Ergebnis in vivo bei Tieren reproduziert werden kann. Im Gegensatz dazu wurde von HIV-Untereinheit-Impfstoffen, die derzeit für klinische Humanstudien der Phase III zugelassen sind, nicht gezeigt, dass sie irgendeine CTL-Reaktion erzeugen, auch nicht nach mehrfachem Immunisierungsversuch.
5. Polyethylenimin-vermittelter Gentransfer auf gezüchtete dendritische Zellen
Dendritische Zellen wurden gemäß Beispiel 1 mit Plasmid, das für HIV-1/LWint- kodiert, transduziert, mit der Ausnahme, dass Polyethylenimin (PEI wurde freundlicherweise von Dr. Behr zur Verfügung gestellt) anstelle von Lipofectamin verwendet wurde. Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 getestet. Mehr als 60 % der unter Verwendung von Polyethylenimin transduzierten dendritischen Zellen exprimierten HIV-1-Proteine im Gegensatz zu 25-37 % der unter Verwendung von Lipofectamin transduzierten Zellen. Da bisher die Lipofection das beste Gen-Transferverfahren zur Einführung von Plasmid-DNA in DCs darstellte, belegt dieses Experiment, dass PEI das wirksamste, nicht-virale Gen-Zufuhrsystem zur Übertragung von Genen auf DCs darstellt. Jedoch zeigten sowohl PEI als auch Lipofectamin eine erhebliche Toxizität gegenüber dendritischen Zellen, gemessen durch Färbung mit Tripanblau.
6. Spezifisches Abzielen auf DCs über den Mannose-Rezeptor
Unreife DCs wurden gemäß den vorstehenden Angaben in Beispiel 1 erzeugt und mit DNA, die für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, transfiziert. Wir verwendeten diese DNA als einen Marker für die Genexpression, da Zellen, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, nach der fluoreszierenden Stimulation grün aufleuchten. Daher können transfizierte Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie und Fließzytometrie (FACS) sichtbar gemacht werden.
Mit verschiedenen Zuckern modifiziertes PEI wurde ausgewählt, um auf den Mannose-Rezeptor auf der Oberfläche von dendritischen Zellen abzuzielen, da der Mannose-Rezeptor sämtliche Muster von Zuckern auf der Oberfläche von Bakterien, Parasiten, Hefen und Pilzen erkennt. DNA wurde mit PEI und verschiedenen, einen Zucker tragenden Polyethyleniminen (auf Bestellung erhältlich von Dr. Jean-Paul Behr, Laboratoire de Chimie Genetique, Faculte de Pharmacie, CNRS-UMR 7514, 74 route du Rhin, 67401 Illkirch, Frankreich) komplexiert. 2 μg DNA wurden mit verschiedenen Derivaten von PEI in 150 mM NaCl (N:P-Verhältnis 10:1) etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden DCs mit den Komplexen transduziert und 6 Stunden gewaschen. Grün fluoreszierende Zellen wurden nach 48 Stunden analysiert. Wir stellten fest, dass es sich bei der wirksamsten PEI-Zuckermodifikation um PEI-Mannose handelte (Tabelle 1).
Tabelle 1 Verschiedene Komplexe für die in vitro-Transduktion von dendritischen Zellen
7. PEI-Mannose-vermittelter in vitro-Gentransfer in gezüchtete dendritische Zellen
Das Mannose tragende Polyethylenimin (PEI-man) ist ein Isothiocyanatophenylphenylmannose-Derivat, das an PEI-25 kDa gekuppelt ist. Es ergibt sich ein Ligand (oder ein Mannoserest mit geringer Affinität für den Mannose-Rezeptor, 1 mM). Es wurde früher gezeigt, dass der Zutritt über den Asialoglycoprotein-Rezeptor (durch PEI eingesetzt) es erforderlich macht, dass der Komplex geladen ist. Dies bedeutet, dass mehr PEI als DNA verwendet werden muss. Wenn der Komplex neutralisiert ist, d. h. das PEI ist durch die DNA neutralisiert, kann der Komplex nicht über den Asialoglycoprotein-Rezeptor eintreten (M. A. Zanta, O. Boussif, A. Adib, J. P. Behr, Bioconjug. Chem., Bd. 8 (6) (November-Dezember 1997), S. 839-844). Diese Autoren entwickelten einen auf Hepatozyten abgestellten Komplex, der verschiedene Schlüsselmerkmale umfasst, von denen angenommen wird, dass sie die in vivo-Genzufuhr in die Leber begünstigen: 1) elektrostatisch neutrale Partikel, die eine unspezifische Bindung an andere Zellen vermeiden, und 2) Vermeidung der durch den Asialoglycoprotein-Rezeptor vermittelten Endozytose. Dieses System beruhte auf einem 5 % Galactose aufweisenden Polyethylenimin-Polymeren (PEI-gal), das mit Plasmid-DNA bis zur neutralen Beschaffenheit kondensiert ist.
Wir stellten fest, dass bei PEI-man-DNA-Komplexen weniger DNA zur Neutralisation von PEI-man im Vergleich zu PEI erforderlich ist. Gelelektrophorese-Experimente unter Anwendung verschiedener N:P-Verhältnisse von PEI-DNA-Komplexen belegten, dass ein 5:1 (N:P)-PEI-man:DNA-Komplex neutral geladen ist, im Gegensatz zum 3:1 (N:P) PEI-DNA-Komplex. (Das Neutralisationsverhältnis von PEI mit der DNA hängt vom Stickstoff:Phosphat-Verhältnis (N:P) ab. 1 μg DNA = 3 × 109 molar P und 1 mM PEI = 109 molar N/μl. Dies bedeutet, dass es sich bei einem 10:1-Verhältnis um ein Gemisch von 3 μl 10 mM PEI und 1 μg DNA handelt.)
Humane DCs wurden gemäß den vorstehenden Angaben isoliert. Die durch FACS bestimmte Reinheit der DCs betrug mehr als 99 %. Durch Messung der Zelllebensfähigkeit mit Tripanblau-Färbung stellten wir fest, dass PEI-man wesentlich weniger toxisch als PEI war. Wir stellten ferner fest, dass sowohl PEI als auch PEI-man zur Einführung von DNA in die DCs befähigt waren, wobei jedoch PEI-Mannose wirksamer ist. Bei einem 5:1 (N:P)-Verhältnis ist der PEI-man-DNA-Komplex neutral, so dass der Komplex nur über den Mannose-Rezeptor in DCs gelangen kann. Unter diesen Bedingungen exprimierten 30 % der DCs das grün fluoreszierende Protein. Im Gegensatz dazu ist ein PEI-DNA-Komplex mit einem 5:1 (N:P)-Verhältnis geladen und der Komplex tritt über den Asialoglycoprotein-Rezeptor ein. Unter diesen Bedingungen exprimierten 14 % der DCs das grün fluoreszierende Protein (4).
8. In vivo-Genzufuhr in Langerhans-Zellen der Haut
In der Haut handelte es sich bei den einzigen Zellen, die mannosylierte Liganden einer Endozytose unterziehen können, um die Langerhans-Zellen. Daher bestand die Hauptfrage darin, ob der PEI-(man)-Komplex in die Haut eindringen und in vivo Langerhans-Zellen transfizieren kann. PEI-(man) wurde mit Plasmid-DNA, die für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, komplexiert. Experimente mit verschiedenen Gen-Zufuhrkomplexen wurden gemäß 3 durchgeführt. Der Komplex enthielt 50 μg DNA und 8,25 μl 100 mM PEI-man in einer 5-10%igen Glucoselösung (Optimum = 8 %). BALB/c-Mäuse wurden betäubt. Die Mäuserücken wurden rasiert. 0,1 ml der Komplexe wurden gemäß den Angaben in Tabelle 2 1 Stunde auf die Haut aufgetragen oder subkutan verabreicht. Die Mäuse wurden 6 Stunden nach der Immunisierung getötet. Hautproben wurden in DMEM-Medium, das mit 10 % fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt war, gebracht. Unter diesen Bedingungen wandern Zellen, einschließlich Langerhans-Zellen, aus der Haut heraus. 1 Tag später wurden die wandernden Zellen gewonnen und durch Fließzytometrie (FACS) analysiert, da durch diese Analyse Zellen, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, erkannt werden können. Bei unserer Analyse wurde nur die große und dichte Zellpopulation analysiert, da bekannt ist, dass es sich sowohl bei dendritischen Zellen als auch bei Langerhans-Zellen um große, dichte Zellen handelt.
Tabelle 2 In vivo-Transduktion von Langerhans-Zellen der Haut
Diese Experimente zeigen folgendes: 1) eine transkutane Genzufuhr ergibt einen wirksameren Gentransfer in Langerhans-Zellen als eine subkutane Zufuhr (vergl. die Experimente 2 & 4 oder 3 & 5). Dies ist wichtig, da eine der besten derzeitigen Impftechniken sich einer subkutanen Injektion bedient. 2) Der Zugang über Mannose-Rezeptoren ist zur in vivo-Transfektion von Langerhans-Zellen wirksamer als der Zugang über den Asialoglycoprotein-Rezeptor (vergl. die Experimente 4 & 6). Diese in vivo-Experimente bestätigen unser in vitro-Experiment (vergl. 4). Daher wird das mit Zucker modifizierte Gen-Zufuhrsystem zur Transduktion von ein Antigen präsentierenden Zellen bevorzugt.
9. Transduzierte Langerhans-Zellen wandern zu den Lymphknoten
BALB/c-Mäuse wurden gemäß Beispiel 8 vorbereitet. 0,1 ml-Proben des PEI-man-DNA-Komplexes wurden 1 Stunde auf ihre Haut aufgetragen. 2 Tage später wurden die Tiere getötet und ihre Lymphknoten (LN) wurden entnommen. Hilfs-LN wurden untersucht, da es sich um die ableitenden LN des Rückens handelt und dort möglicherweise wandernde Langerhans-Zellen auftreten. Die LN wurden eingefroren, geschnitten und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die LN der experimentellen Mäuse wurden mit den LN einer Kontrollmaus verglichen. Wir konnten etwa 15 grün fluoreszierende Zellen in den Proben der experimentellen LN und keine in den Kontroll LN nachweisen. Diese Ergebnisse belegen, dass der Komplex in die in der Haut befindlichen Zellen gelangt ist und die Zellen dazu befähigt waren, in die LN zu wandern und das grün fluoreszierende Protein zu exprimieren. Die Morphologie dieser grünen Zellen gleicht der DC-Morphologie: es handelt sich um große Zellen und die Position der grünen Fluoreszenz zeigt ein "unebenes" Muster, das für DC charakteristisch ist. (Andere Zellen, z. B. 293-Zellen zeigen ein diffuses grünes Muster im Zytoplasma.) Ferner handelt es sich beim einzigen Zelltyp, der zur Aufnahme von Antigenen und zur Wanderung in die LN fähig ist, um die Langerhans-Zelle. Diese Zellen stellen die einzigen Zellen in der Haut dar, die den Mannose-Rezeptor tragen, um den Komplex aufzunehmen. Es ist bekannt, dass sie nach ihrer Aktivierung in die ableitenden LN wandern.
Diese Experimente zeigen, dass PEI-(Man)-DNA-Komplexe zum Eindringen in die Haut und zur Abgabe der DNA in die Langerhans-Zellen befähigt sind. Die Langerhans-Zellen wurden aktiviert und wanderten in die ableitenden LN und exprimierten Gene, die durch das DNA-Konstrukt in den LN kodiert worden waren. Es ist bekannt, dass gezüchtete DCs, die erneut in den Körper injiziert werden, in die LN wandern und eine wirksame Immunreaktion erzeugen. Die Erfindung belegt, dass eine in vitro-Isolierung von DCs nicht erforderlich ist, um Gene in Langerhans-Zellen zu übertragen oder um eine Genexpression in den lymphoiden Organen vorzunehmen. Ferner haben wir gezeigt, dass eine Expression eines replikationsdefekten Virus in DCs zu einer wirksamen Induktion einer in vitro- und in vivo-CTL-Reaktion führt (vergl. die vorstehenden Ausführungen). Somit haben wir gezeigt, dass eine transkutane Genzufuhr mit Komplexen (wie PEI-man-DNA) dazu herangezogen werden kann, Immunreaktionen gegen Proteine, die durch die DNA kodiert werden, zu erzeugen.
10. Zucker-DNA-Komplexe zur Transduktion von Haut-Langerhans-Zellen
Die in Tabelle 2 wiedergegebenen experimentellen Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass ein Zucker-DNA-Komplex in Abwesenheit von PEI-man Langerhans-Zellen in vivo transduzieren kann. Mit Zucker komplexierte DNA in Abwesenheit von PEI ist wirksamer zur Verwendung sowohl bei subkutanen als auch bei transkutanen Verfahren als mit PEI komplexierte DNA (vergl. Tabelle 2, Experimente 3 & 5). Dies stellt ein sehr überraschendes Ergebnis dar. Es ist bekannt, dass Zucker (z. B. 8 % Glucose bei diesen Experimenten) ebenfalls DNA komplexieren und die DNA in die Langerhans-Zellen über den Mannose-Rezeptor zuführen kann. Wichtig ist, dass die wirksamste Genzufuhr in vivo zu den Langerhans-Zellen in der Verwendung der mit Zucker komplexierten DNA auf dem transkutanem Weg bestand.
Wir erwarten, dass die Immunisierung mit dem Zucker-DNA-Komplex ebenfalls zur Wanderung der Langerhans-Zellen zu den ableitenden Lymphknoten führt. Der Grund besteht darin, dass der gleiche Mechanismus für den Eintritt in die Langerhans-Zellen herangezogen wird: durch den Mannose-Rezeptor vermittelte Aufnahme. Der Vorteil der Verwendung von Zuckern als Adjuvantien bei den derzeit eingesetzten Impftechniken besteht darin, dass höhere prozentuale Anteile an Langerhans-Zellen an der Erzeugung der Immunreaktion beteiligt sind. Es ist zu erwarten, dass dies in signifikantem Umfang die Wirksamkeit der vorliegenden Impfstrategien steigert. Beispielsweise kommt ein Vermischen von Impfstoffen mit Zucker für die subkutane, intradermale und intramuskuläre Injektion von DNA- und Protein-Antigenen in Frage.
11. Bedeutung der transkutanen Immunisierung
Diese Technik würde die Immunisierungsverfahren revolutionieren, da keine Nadeln mehr erforderlich sind. Die beschriebe transkutane Immunisierung stellt eine sehr einfache Technik dar, die für eine billige Impfung sowohl in hoch entwickelten Ländern als auch in Entwicklungsländern eingesetzt werden kann.
Die Einfachheit der Methodik und die Tatsache, dass die ein Antigen präsentierenden Zellen in wirksamer Weise transduziert werden, macht es uns möglich, beliebige DNA-Sequenzen, die zur Erzeugung eines immunogenen Proteins befähigt sind, zu verwenden. Damit wird ein sehr breites Spektrum von Krankheiten zum Ziel einer Immunisierung, z. B. infektiöse Krankheiten und Krebs.
Der einzige Weg zum Auslöschen von infektiösen Krankheiten, wie HIV-Infektionen, Hepatitis und Malaria, besteht in einer einfachen, billigen Impfung.
Impfstoffe ohne Nadelstiche sind vor allem für Eltern von Kleinkindern sehr willkommen.
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung eröffnet die Möglichkeit zur Entwicklung von sichereren Impfstoffen. Die wenigen negativen Reaktionen gegenüber klassischen Impfstoffen sind gelegentlich auf eine allergische Reaktion gegen Nebenprodukte, die beim Verfahren zur Herstellung der Impfstoffe anfallen, zurückzuführen. Wenn derartige zusätzliche Materialien (z. B. Eialbumin) weggelassen werden können, lässt sich die Rate an negativen Reaktionen gleichzeitig vermindern.
Die Erfindung kann zur Immunisierung für die Behandlung von Krankheiten in Kombination mit einer Chemotherapie oder ohne eine Chemotherapie eingesetzt werden.

Claims

Verwendung eines Gen-Zufuhrkomplexes, umfassend fremdes Genmaterial und einen nicht-viralen Vektor, wobei der Vektor eine erste Stelle mit spezifischer Affinität für das fremde genetische Material und eine zweite Stelle mit spezifischer Affinität für einen Rezeptor an einer ein Antigen präsentierenden Zelle aufweist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der transkutanen, präventiven oder therapeutischen Immunisierung von Tieren, indem das Tier dem Arzneimittel ausgesetzt wird, indem man die Haut- oder Schleimhautoberfläche des Tiers dem Arzneimittel aussetzt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das fremde genetische Material aus der Gruppe, die aus RNA und DNA besteht, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das fremde genetische Material für ein von reverser Transkriptase abhängiges Virus oder für eine Mutante eines von reverser Transkriptase abhängigen Virus kodiert.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem fremden genetischen Material um DNA handelt, die für mindestens einen wesentlichen Teil eines replikationsdefekten humanen Immunschwächevirus kodiert.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei es sich bei dem fremden genetischen Material um DNA handelt, die für mindestens einen wesentlichen Teil eines integrationsdefekten humanen Immunschwächevirus kodiert.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem fremden genetischen Material um DNA handelt, die für mindestens einen wesentlichen Teil einer Integrase-negativen Mutante eines dual-tropischen primären Isolats eines humanen Immunschwächevirus kodiert.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die DNA ferner ein oder mehrere Stoppkodons in einem oder mehreren der Leseraster des Integrase-Gens umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Komplex aus der Gruppe, die aus DNA-Konjugaten von Zuckern, Polyethylenimin, Polyethylenimin-Derivaten und Gemischen davon besteht, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Komplex um ein DNA-Konjugat von mit einem Zucker modifiziertem Polyethylenimin, insbesondere von mit Mannose, Galactose oder Glucose modifiziertem Polyethylenimin, handelt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Komplex um ein DNA-Konjugat von Glucose handelt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Komplex eine spezifische Affinität für den Mannose-Rezeptor aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der ein Antigen präsentierenden Zelle um eine Langerhans-Zelle handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der ein Antigen präsentierenden Zelle um eine dendritische Zelle handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich beim Rezeptor um einen Mannose-Rezeptor handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Immunisierung um eine therapeutische Immunisierung gegen eine aktive Virusinfektion handelt, und die Immunisierung folgendes umfasst: das Behandeln eines behandlungsbedürftigen Patienten mit einer Arzneistoffkombination, die sich zur Unterdrückung der viralen Belastung eignet, das Immunisieren des Patienten mit dem Produkt unter fortgesetzter Behandlung mit einer Arzneistoffkombination, die sich zur Unterdrückung der viralen Belastung eignet, bis sich eine Immunreaktion entwickelt, und das Überwachen auf einen Rebound der viralen Belastung des Patienten; und im Fall von Rebounds von viraler Belastung das erneute Beginnen der Behandlung mit der Arzneistoffkombination oder einer anderen Arzneistoffkombination, die sich zur Unterdrückung der viralen Belastung eignet, und das Immunisieren des Patienten mit dem Produkt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei es sich bei der aktiven Virusinfektion um eine HIV-Infektion handelt.
Gen-Zufuhrkomplex, umfassend fremdes genetisches Material mit einem nicht-viralen Vektor, bei dem es sich um ein Polyethylenimin-Zucker-Derivat handelt.
Komplex nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem fremden genetischen Material um RNA oder DNA handelt.
Komplex nach Anspruch 17, wobei das fremde genetische Material für ein von reverser Transkriptase abhängiges Virus oder für eine Mutante eines von reverser Transkriptase abhängigen Virus kodiert.
Komplex nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem fremden genetischen Material um DNA handelt, die für mindestens einen wesentlichen Teil eines replikationsdefekten humanen Immunschwächevirus kodiert.
Komplex nach Anspruch 19 oder 20, wobei es sich bei dem fremden genetischen Material um DNA handelt, die für mindestens einen wesentlichen Teil eines integrationsdefekten humanen Immunschwächevirus kodiert.
Komplex nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem fremden genetischen Material um DNA handelt, die für mindestens einen wesentlichen Teil einer Integrase-negativen Mutante eines dual-tropischen primären Isolats eines humanen Immunschwächevirus kodiert.
Komplex nach Anspruch 22, wobei die DNA ferner ein oder mehrere Stoppkodons in einem oder mehreren der Leseraster des Integrase-Gens umfasst.
Komplex nach Anspruch 17, wobei das Derivat aus Mannose-, Galactose- und Glucose-modifiziertem Polyethylenimin ausgewählt ist.
Zusammensetzung, umfassend einen Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 24.